シトロネラールの酵素的調製方法
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有するエノエートレダクターゼの存在下での還元により、式（１）のα，β−不飽和アルデヒドから、式（２）の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコールを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α，β−不飽和アルデヒドから式の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコールを調製する酵素的方法に関し、特にシトロネラールを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｒ）−（＋）シトロネラールは、例えば、メントールの調製において用いられる重要な化学中間体である。
【０００３】
シトラールから始まる、（Ｒ）−（＋）シトロネラールを調製する化学的方法では、工業的合成において高コストとなる非常に複雑な方法（酸素と水を排除する）が必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、シトラールのエナンチオ選択的還元によるシトロネラールの製造方法を提供することを目的とし、該方法は、最大のエナンチオマー純度を持つ、高い化学収率のシトロネラールを供給する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、エノエートレダクターゼ存在下での還元により、式（１）のα，β−不飽和アルデヒドから式（２）の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコール
【化１】
【０００６】
（Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ４−アルキルであり、Ｒ３は、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはアルケニルである。）
を調製する方法であって、エノエートレダクターゼが、
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは
（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、
上記方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の方法は、式（１）のα，β−不飽和アルデヒド（Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ４−アルキルであり、Ｒ３は、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはアルケニルである。）を用いて行うことができる。また、アルキル基およびアルケニル基は、一置換または多置換されていてもよい。
【０００８】
本発明の方法において、特に好適な基質は、式（１）に示され、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ３であり、およびＲ３が−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝（ＣＨ３）２である上記α，β−不飽和アルデヒド（シス型またはトランス型シトラール）、およびＲ１がＣＨ３であり、Ｒ２がＨであり、およびＲ３がＣＨ３である上記α，β−不飽和アルデヒド（２−メチル−ペント−２−エン−１−アール）である。
【０００９】
本発明で用いられるエノエートレダクターゼは、カルボニル官能基に対してα，β位の二重結合に加えて、たまにはある程度カルボニル官能基自体も還元し、この場合、それに対応するアルコールが生じる。
【００１０】
本発明の方法に好適なエノエートレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ依存性反応で２−メチル−ペント−２−エン−１−アールを還元し、（Ｓ）−２−メチル−ペンタン−１−アールを生じることができる酵素である。以下、この反応をモデル反応ともいう。
【００１１】
さらに、本発明の方法に好適なエノエートレダクターゼは、配列番号１または２のポリペプチド配列、または配列番号１または２の配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。
【００１２】
配列番号１を有するポリペプチドは、パン酵母由来のＯＹＥ２遺伝子（Saccharomyces cerevisiae遺伝子座ＹＨＲ１７９Ｗ）である。
【００１３】
配列番号２を有するポリペプチドは、パン酵母由来のＯＹＥ３遺伝子（Saccharomyces cerevisiae遺伝子座ＹＰＬ１７１Ｃ）である。
【００１４】
本明細書に記載された目的において、配列同一性は、ウイスコンシン大学のGenetics Computer Group (ＧＣＧ)の「ＧＡＰ」コンピュータープログラムによって決定されるものであり、ＧＣＧによって推奨されるスタンダードパラメーターを用いたVersion 10.3を使用することを意図する。
【００１５】
上記のようなエノエートレダクターゼは、配列番号１または２から始めて、当業者に公知の特異的突然変異法またはランダム突然変異法によって得ることができる。あるいは、上記モデル反応を触媒するエノエートレダクターゼであって、かつそのアミノ酸配列が、配列番号１または２に対して上記の求められる配列同一性をすでに有しているか、もしくは突然変異法で得られるエノエートレダクターゼについて、微生物をスクリーニングしてもよく、好ましい微生物は、Alishewanella属、Alterococcus属、Aquamonas属、Aranicola属、Arsenophonus属、Azotivirga属、Brenneria属、Buchnera属（aphid P-endosymbionts）、Budvicia属、Buttiauxella属、Candidatus Phlomobacter属、Cedecea属、Citrobacter属、Dickeya属、Edwardsiella属、Enterobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Ewingella属、Grimontella属、Hafnia属、Klebsiella属、Kluyvera属、Leclercia属、Leminorella属、Moellerella属、Morganella属、Obesumbacterium属、Pantoea属、Pectobacterium属、Photorhabdus属、Plesiomonas属、Pragia属、Proteus属、Providencia属、Rahnella属、Raoultella属、Salmonella属、Samsonia属、Serratia属、Shigella属、Sodalis属、Tatumella属、Trabulsiella属、Wigglesworthia属、Xenorhabdus属、Yersinia属、およびYokenella属である。
【００１６】
エノエートレダクターゼは、精製された形で、または部分的に精製された形で、あるいは微生物自体の形で用いることができる。微生物からデヒドロゲナーゼを回収し精製する方法は、当業者に十分に知られている。
【００１７】
上記エノエートレダクターゼを用いたエナンチオ選択的還元は、好ましくは適切な補因子（補助基質ともいう）の存在下で行う。ケトンを還元するために通常用いられる補因子は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。さらに、補因子を本質的に含む細胞系としてエノエートレダクターゼを用いること、または代替のレドックスメディエーターを加えることが可能である(A. Schmidt, F. Hollmann and B. Buhler "Oxidation of Alcohols" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim)。
【００１８】
さらに好ましくは、エナンチオ選択的還元は、還元の過程で酸化された補因子を再生する適切な還元剤の存在下でエノエートレダクターゼを用いて行う。適切な還元剤の例は、糖、特にヘキソース、例えばグルコース、マンノース、フルクトースであり、および／または酸化可能なアルコール、特にエタノール、プロパノールまたはイソプロパノールであり、及びギ酸塩、亜リン酸塩、または水素分子である。還元剤を酸化するため、それに関連して、補酵素を再生するため、第２のデヒドロゲナーゼ（例えば、用いる還元剤がグルコースの場合、グルコースデヒドロゲナーゼ、または用いる還元剤がギ酸塩の場合、ギ酸デヒドロゲナーゼ）を添加してもよい。第２のデヒドロゲナーゼは、遊離型または固定化酵素として、あるいは遊離型または固定化細胞の形で用いることができる。その調製は、別々に行ってもよいし、（組換え）レダクターゼの菌株での共発現により行ってもよい。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態は、酵素系により補因子を再生することであり、ここで第２のデヒドロゲナーゼ、特に好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼが用いられる。
【００２０】
さらに本発明は、シトロネラールを調製するためのエノエートレダクターゼの使用に関する。
【００２１】
本実施形態に用いられる好ましい補因子は、それぞれ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋であり、適切な補助基質（酸化剤）で再び再生することができる。ここで用いることができる好ましい補助基質はアセトンであり、アセトンは、すでに存在するＡＤＨおよび／または追加して用いられるデヒドロゲナーゼとともに、補因子を再生し、その工程でイソプロパノールに還元される。
【００２２】
「エナンチオ選択性」とは、本発明の目的において、以下の公知の方法で計算されるＳ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率、つまりｅｅ（％）：
ｅｅ（％）＝Ｓ-エナンチオマー−Ｒ-エナンチオマー/（Ｓ-エナンチオマー−Ｒ-エナンチオマー）×１００
が、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、および特に少なくとも９７％であることを意味する。
【００２３】
本発明において使用されるエノエートレダクターゼは、遊離型または固定化された形で用いることができる。固定化酵素は、不活性な支持体に固定された酵素を意味する。好適な支持体材料およびそれに固定化される酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1069183、DE-A 100193773、およびそこで引用されている文献に開示されている。これに関し、これらの刊行物の開示はそのまま参照される。好適な支持体材料の例は、粘土、粘土鉱物（例えばカオリナイト、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム）、セルロース粉末、陰イオン交換体材料、合成ポリマー（例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィン）である。支持体材料は、担持された酵素を調製するために細かく分割された、好ましくは多孔性である微粒子の形で通常用いられる。支持体材料の粒径は、通常５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（シーブグレード）である。同様に、全細胞触媒（whole cell catalyst）としてデヒドロゲナーゼを用いる場合も、遊離型または固定化された形態を選択できる。支持体材料の例は、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。細胞と同様、酵素もグルタールアルデヒドで直接架橋し得る（架橋してＣＬＥＡを生ずる）。これに対応する固定化方法および他の固定化方法は、例えば、J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載されている。
【００２４】
上記反応は、水性もしくは非水性反応媒体中、または２相系もしくは（マイクロ）エマルジョンで行うことができる。水性反応媒体は、好ましくは、通常ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ５〜８の緩衝液である。水性溶媒は、水のほかに、少なくとも１種類のアルコール、例えばエタノールまたはイソプロパノール、またはジメチルスルホキシドをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
非水性反応媒体は、反応媒体の全質量に基づいて、１ｗｔ％未満、好ましくは０．５ｗｔ％未満の水を含む反応媒体を意味する。反応は、好ましくは有機溶媒中で行う。
【００２６】
適切な溶媒の例は、好ましくは５〜８炭素原子を有する、脂肪族炭化水素、例えばペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、へプタン、オクタンまたはシクロオクタン、好ましくは１つまたは２つの炭素原子を有する、ハロゲン化脂肪族炭化水素、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタンまたはテトラクロロエタン、芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエン、キシレン（類）、クロロベンゼンまたはジクロロベンゼン、好ましくは４〜８炭素原子を有する、脂肪族非環状および環状エーテルまたはアルコール、例えばジエチルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、エチルtert-ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、またはエステル、例えばエチルアセテートまたはn-ブチルアセテート、またはケトン、例えばメチルイソブチルケトンまたはジオキサン、またはそれらの混合物である。特に好ましくは、上記エーテル、特にテトロヒドロフランを用いる。
【００２７】
エノエートレダクターゼによる還元は、水性−有機の反応媒体、特に水性の反応媒体中で行うことが好ましい。
【００２８】
基質（１）は、好ましくは０．１ｇ／ｌ〜５００ｇ／ｌ、特に好ましくは１ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌの濃度で酵素還元に用い、その後、連続的にまたはバッチ式で供給してもよい。
【００２９】
酵素還元は通常、用いるレダクターゼの失活温度よりも低く、−１０℃よりも高い反応温度で行う。該温度は、具体的には、好ましくは０〜１００℃、特に１５〜６０℃、特に２０〜４０℃の範囲であり、例えば約３０℃である。
【００３０】
手順としては、例えば、基質（１）と、エノエートレダクターゼ、溶媒、適切であれば補酵素（適切であれば該補酵素を再生するための第２のデヒドロゲナーゼと共に）、および／またはさらに還元剤を最初に導入し、該混合物を、例えば攪拌または振とうにより混合することができる。しかし、例えばカラムなどの反応器にレダクターゼを固定化し、その反応器に、基質と、適切であれば補酵素および／または補助基質を含む混合物を通すことも可能である。このため、混合物を、所望の変換が達成されるまで反応器に循環させることができる。
【００３１】
上記工程において、カルボニル官能基に対してα，β位の二重結合が単結合に還元される；たまに、カルボニル官能基自体がアルコール官能基に還元される。該還元は通常、混合物中に存在する基質に基づいて少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、特に少なくとも９５％変換するまで行われる。反応の進行、すなわち二重結合の連続的な還元は、ガスクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーなどの常法により、その場でモニタリングすることができる。
【００３２】
本発明の目的において、具体的に開示された酵素の「機能的同等物」すなわちアナログは、それらとは異なるポリペプチドであって、さらに、例えば基質特異性などの所望の生物学的活性を有するポリペプチドである。従って、例えば「機能的同等物」とは、上記モデル反応を触媒し、かつ配列番号１または２として挙げられたアミノ酸配列のいずれかを含む酵素の少なくとも２０％、好ましくは５０％、特に好ましくは７５％、極めて好ましくは９０％の活性を有する酵素を意味する。さらに、機能的同等物は、好ましくはｐＨ４〜１０で安定であり、有利には、至適ｐＨが５〜８であり、至適温度が２０〜８０℃の範囲である。
【００３３】
本発明における「機能的同等物」は、特に、上記生物学的活性のうちの１つを有しているが、上記アミノ酸配列の少なくとも１箇所に、具体的に記載されたアミノ酸以外のアミノ酸を有する突然変異体も意味する。従って「機能的同等物」は、１つ以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得られる突然変異体を含み、本発明の特性プロフィールを有する突然変異体がもたらされる限り、該改変は、配列のどの位置で生じてもよい。また、突然変異体と非改変ポリペプチドの反応性パターンが質的に一致すれば、すなわち、例えば同じ基質が異なる速度で反応しても、機能的同等物が具体的に存在する。
【００３４】
適切なアミノ酸置換の例を以下の表に挙げる。
【表１】
【００３５】
上記の意味の「機能的同等物」は、記載されたポリペプチドの「前駆体」でもあり、「機能的誘導体」でもある。
【００３６】
これに関連して「前駆体」は、所望の生物学的活性を有するか、または有しない、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【００３７】
同様に、本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は、公知の技術を用いて、機能的アミノ酸の側鎖またはそのＮ末端側もしくはＣ末端側の終端に調製することができる。この種の誘導体は、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド（該アミドはアンモニアまたは第１もしくは第２アミンとの反応によって得られる）；遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（該誘導体はアシル基との反応によって調製される）；または遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体（該誘導体はアシル基との反応によって調製される）を含む。
【００３８】
タンパク質のグリコシル化が可能な場合、本発明の「機能的同等物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化された形、およびグリコシル化のパターンを変えることによって得ることができる改変された形の上記タイプのタンパク質を含む。
【００３９】
当然ながら「機能的同等物」は、他の生物から得られるポリペプチドも含み、天然に生じた変異体も含む。例えば、相同配列領域の範囲は、配列比較により定めることができ、同等な酵素を、本発明の具体的なガイドラインに基づいて決定することができる。
【００４０】
また「機能的同等物」は、本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含み、該断片は、例えば所望の生物学的機能を有する。
【００４１】
さらに「機能的同等物」は、上記ポリペプチド配列またはそれに由来する機能的同等物のいずれか、およびそれらとは機能的に異なる異種配列であって、かつＮ末端またはＣ末端に機能的に結合した（すなわち、融合タンパク質部分のいかなる実質的な相互的機能障害がない）少なくとも１つの上記異種配列を含む、融合タンパク質である。このような異種配列の限定されない例は、例えばシグナルペプチドまたは酵素である。
【００４２】
本発明のタンパク質のホモログは、例えばトランケーション変異体などの突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、同定することができる。例えば、タンパク質変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることにより、作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのライブラリーを調製するのに使用できる方法が数多くある。縮重遺伝子配列は、ＤＮＡ合成機で化学的に合成することができ、次に、その合成遺伝子を、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。遺伝子の縮重セットを用いることにより、所望の潜在的なタンパク質配列のセットをコードする混合物中の配列をすべて提供することができるようになる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に公知である（例えばNarang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００４３】
点突然変異またはトランケーションにより調製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技術、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術が、いくつか先行技術で知られている。これらの技術を、本発明のホモログのコンビナトリアル突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーを迅速にスクリーニングするために適合させることができる。ハイスループット分析される大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最もよく用いられる技術には、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、得られたベクターライブラリーを用いて適切な細胞に形質転換し、所望の活性の検出により、その検出された遺伝子産物の遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることが含まれる。再帰的アンサンブル突然変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis：ＲＥＭ）、すなわち、ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術を、ホモログを同定するためにスクリーニングテストと組合せて用いてもよい(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【００４４】
さらに本発明は、本発明のレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）に関する。好ましくは、例えば配列番号１または２のアミノ酸配列、またはその特徴のある部分の配列をコードする核酸配列である。
【００４５】
本明細書に記載されたすべての核酸配列は、ヌクレオチド・ビルディング・ブロックからの化学的合成によるそれ自体公知の方法で、例えば、二重らせんの個々の重複する相補的な核酸ビルディング・ブロックのフラグメント縮合により、調製することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、公知の方法で、即ちホスホアミダイト法を用いて化学的に合成することができる(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897)。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片とライゲーション反応を用いた、合成オリゴヌクレオチドの組立て、ギャップの穴埋め、また一般的なクローニング方法が、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００４６】
＜本発明の酵素的還元方法を行うさらなる実施形態＞
エノエートレダクターゼは、本発明の方法において、遊離型または固定化酵素として用いることができる。
【００４７】
本発明の方法は、有利には、０〜９５℃、好ましくは１０〜８５℃、特に好ましくは１５〜７５℃の温度で行う。
【００４８】
本発明の方法において、ｐＨは、有利には、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ４．５〜９、特に好ましくはｐＨ５〜８に維持される。
【００４９】
本発明の方法において、エナンチオマー的に純粋なまたはキラルな生成物（２）は、エナンチオマー富化を示すエナンチオマーを意味する。好ましくは、該方法において少なくとも７０％ｅｅ、好ましくは少なくとも８０％ｅｅ、特に好ましくは少なくとも９０％ｅｅ、極めて好ましくは少なくとも９８％ｅｅのエナンチオマー純度が達成される。
【００５０】
本発明の方法において、本発明の核酸、核酸構築物またはベクターを含む増殖細胞を用いることが可能である。静止細胞または破壊細胞を用いることも可能である。破壊細胞とは、例えば溶媒で処理することにより透過性になった細胞、または、例えば酵素で処理することにより、機械的処理（例えばフレンチプレスまたは超音波処理）により、あるいは他の方法により破壊された細胞を意味する。該方法で得られた粗抽出物は、本発明の方法に有利に適している。本方法において、精製された酵素または部分的に精製された酵素を使用することも可能である。同様に、本反応に有利に適用することができる固定化された微生物または酵素も適している。
【００５１】
本発明の方法は、バッチ式、セミバッチ式、または連続的に実施することができる。
【００５２】
本方法は、例えばBiotechnology, volume 3, 2nd edition, Rehm et al. Eds., (1993)、特にchapter IIに記載されたバイオリアクターで有利に行うことができる。
【００５３】
以下の実施例により本発明を説明するが、本実施例は本発明を限定するものではない。これに関し、添付された図が参照される。
【実施例】
【００５４】
＜実験セクション＞
Saccharomyces cerevisiaeを用いた２−メチル−ペント−２−エン−１−アールの生体内変換
邪魔板を備えた５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコで生体内変換を行った。該フラスコのいずれにも１２６ｍｌの変換溶液を入れた。これらには、いずれにも２１ｇのＤ−グルコースを加えた。所望のｐＨ（６〜８．５）に調整した。フラスコあたりの基質量を、２−メチルペント−２−エン−１−アール２００ｍｇとした。本実験を、２１ｇのパン酵母を添加することにより開始し、その反応混合物を所望の温度（２８〜３７℃）のインキュベーターに入れた（２４０ｒｐｍで攪拌した）。６、１２、１８、２４、３６、４８時間後にサンプルを採取し、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５５】
最も高い変換率（４０〜７０％）は、ｐＨ７．５〜８．５の間で達成された。ｐＨ＝８．５、Ｔ＝３７℃での光学純度は、６６．６％の変換でｅｅ＝９２．１であった。
【００５６】
Saccharomyces cerevisiaeを用いたシトラールの生体内変換
邪魔板を備えた５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコで生体内変換を行った。該フラスコのいずれにも１２６ｍｌの変換溶液を入れた。これらには、いずれにも２１ｇのＤ−グルコースを加えた。所望のｐＨ（６〜８．５）に調整した。フラスコあたりの基質量をシトラール２１０ｍｇとした（シトラールは７０：３０のシス／トランス混合物であった）。本実験を、２１ｇのパン酵母を添加することにより開始し、その反応混合物を所望の温度（２８〜３７℃）のインキュベーターに入れた（２４０ｒｐｍで攪拌した）。６、１２、１８、２４、３６、４８時間後にサンプルを採取し、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５７】
（Ｒ）−（＋）シトロネラールに加えて、ネロールおよびゲラニオールと、（Ｒ）−（＋）−β−シトロネロールも得られた。
【００５８】
変換溶液
５３．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、２１ｇのＤ−グルコースおよび１２６ｍｌの蒸留水（ｐＨは６〜８．５に調整）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α，β−不飽和アルデヒドから式の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコールを調製する酵素的方法に関し、特にシトロネラールを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｒ）−（＋）シトロネラールは、例えば、メントールの調製において用いられる重要な化学中間体である。
【０００３】
シトラールから始まる、（Ｒ）−（＋）シトロネラールを調製する化学的方法では、工業的合成において高コストとなる非常に複雑な方法（酸素と水を排除する）が必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、シトラールのエナンチオ選択的還元によるシトロネラールの製造方法を提供することを目的とし、該方法は、最大のエナンチオマー純度を持つ、高い化学収率のシトロネラールを供給する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、エノエートレダクターゼ存在下での還元により、式（１）のα，β−不飽和アルデヒドから式（２）の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコール
【化１】
【０００６】
（Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ４−アルキルであり、Ｒ３は、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはアルケニルである。）
を調製する方法であって、エノエートレダクターゼが、
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは
（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、
上記方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の方法は、式（１）のα，β−不飽和アルデヒド（Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ４−アルキルであり、Ｒ３は、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはアルケニルである。）を用いて行うことができる。また、アルキル基およびアルケニル基は、一置換または多置換されていてもよい。
【０００８】
本発明の方法において、特に好適な基質は、式（１）に示され、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ３であり、およびＲ３が−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝（ＣＨ３）２である上記α，β−不飽和アルデヒド（シス型またはトランス型シトラール）、およびＲ１がＣＨ３であり、Ｒ２がＨであり、およびＲ３がＣＨ３である上記α，β−不飽和アルデヒド（２−メチル−ペント−２−エン−１−アール）である。
【０００９】
本発明で用いられるエノエートレダクターゼは、カルボニル官能基に対してα，β位の二重結合に加えて、たまにはある程度カルボニル官能基自体も還元し、この場合、それに対応するアルコールが生じる。
【００１０】
本発明の方法に好適なエノエートレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ依存性反応で２−メチル−ペント−２−エン−１−アールを還元し、（Ｓ）−２−メチル−ペンタン−１−アールを生じることができる酵素である。以下、この反応をモデル反応ともいう。
【００１１】
さらに、本発明の方法に好適なエノエートレダクターゼは、配列番号１または２のポリペプチド配列、または配列番号１または２の配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。
【００１２】
配列番号１を有するポリペプチドは、パン酵母由来のＯＹＥ２遺伝子（Saccharomyces cerevisiae遺伝子座ＹＨＲ１７９Ｗ）である。
【００１３】
配列番号２を有するポリペプチドは、パン酵母由来のＯＹＥ３遺伝子（Saccharomyces cerevisiae遺伝子座ＹＰＬ１７１Ｃ）である。
【００１４】
本明細書に記載された目的において、配列同一性は、ウイスコンシン大学のGenetics Computer Group (ＧＣＧ)の「ＧＡＰ」コンピュータープログラムによって決定されるものであり、ＧＣＧによって推奨されるスタンダードパラメーターを用いたVersion 10.3を使用することを意図する。
【００１５】
上記のようなエノエートレダクターゼは、配列番号１または２から始めて、当業者に公知の特異的突然変異法またはランダム突然変異法によって得ることができる。あるいは、上記モデル反応を触媒するエノエートレダクターゼであって、かつそのアミノ酸配列が、配列番号１または２に対して上記の求められる配列同一性をすでに有しているか、もしくは突然変異法で得られるエノエートレダクターゼについて、微生物をスクリーニングしてもよく、好ましい微生物は、Alishewanella属、Alterococcus属、Aquamonas属、Aranicola属、Arsenophonus属、Azotivirga属、Brenneria属、Buchnera属（aphid P-endosymbionts）、Budvicia属、Buttiauxella属、Candidatus Phlomobacter属、Cedecea属、Citrobacter属、Dickeya属、Edwardsiella属、Enterobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Ewingella属、Grimontella属、Hafnia属、Klebsiella属、Kluyvera属、Leclercia属、Leminorella属、Moellerella属、Morganella属、Obesumbacterium属、Pantoea属、Pectobacterium属、Photorhabdus属、Plesiomonas属、Pragia属、Proteus属、Providencia属、Rahnella属、Raoultella属、Salmonella属、Samsonia属、Serratia属、Shigella属、Sodalis属、Tatumella属、Trabulsiella属、Wigglesworthia属、Xenorhabdus属、Yersinia属、およびYokenella属である。
【００１６】
エノエートレダクターゼは、精製された形で、または部分的に精製された形で、あるいは微生物自体の形で用いることができる。微生物からデヒドロゲナーゼを回収し精製する方法は、当業者に十分に知られている。
【００１７】
上記エノエートレダクターゼを用いたエナンチオ選択的還元は、好ましくは適切な補因子（補助基質ともいう）の存在下で行う。ケトンを還元するために通常用いられる補因子は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨである。さらに、補因子を本質的に含む細胞系としてエノエートレダクターゼを用いること、または代替のレドックスメディエーターを加えることが可能である(A. Schmidt, F. Hollmann and B. Buhler "Oxidation of Alcohols" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim)。
【００１８】
さらに好ましくは、エナンチオ選択的還元は、還元の過程で酸化された補因子を再生する適切な還元剤の存在下でエノエートレダクターゼを用いて行う。適切な還元剤の例は、糖、特にヘキソース、例えばグルコース、マンノース、フルクトースであり、および／または酸化可能なアルコール、特にエタノール、プロパノールまたはイソプロパノールであり、及びギ酸塩、亜リン酸塩、または水素分子である。還元剤を酸化するため、それに関連して、補酵素を再生するため、第２のデヒドロゲナーゼ（例えば、用いる還元剤がグルコースの場合、グルコースデヒドロゲナーゼ、または用いる還元剤がギ酸塩の場合、ギ酸デヒドロゲナーゼ）を添加してもよい。第２のデヒドロゲナーゼは、遊離型または固定化酵素として、あるいは遊離型または固定化細胞の形で用いることができる。その調製は、別々に行ってもよいし、（組換え）レダクターゼの菌株での共発現により行ってもよい。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態は、酵素系により補因子を再生することであり、ここで第２のデヒドロゲナーゼ、特に好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼが用いられる。
【００２０】
さらに本発明は、シトロネラールを調製するためのエノエートレダクターゼの使用に関する。
【００２１】
本実施形態に用いられる好ましい補因子は、それぞれ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋であり、適切な補助基質（酸化剤）で再び再生することができる。ここで用いることができる好ましい補助基質はアセトンであり、アセトンは、すでに存在するＡＤＨおよび／または追加して用いられるデヒドロゲナーゼとともに、補因子を再生し、その工程でイソプロパノールに還元される。
【００２２】
「エナンチオ選択性」とは、本発明の目的において、以下の公知の方法で計算されるＳ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率、つまりｅｅ（％）：
ｅｅ（％）＝Ｓ-エナンチオマー−Ｒ-エナンチオマー/（Ｓ-エナンチオマー−Ｒ-エナンチオマー）×１００
が、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、および特に少なくとも９７％であることを意味する。
【００２３】
本発明において使用されるエノエートレダクターゼは、遊離型または固定化された形で用いることができる。固定化酵素は、不活性な支持体に固定された酵素を意味する。好適な支持体材料およびそれに固定化される酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1069183、DE-A 100193773、およびそこで引用されている文献に開示されている。これに関し、これらの刊行物の開示はそのまま参照される。好適な支持体材料の例は、粘土、粘土鉱物（例えばカオリナイト、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム）、セルロース粉末、陰イオン交換体材料、合成ポリマー（例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィン）である。支持体材料は、担持された酵素を調製するために細かく分割された、好ましくは多孔性である微粒子の形で通常用いられる。支持体材料の粒径は、通常５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（シーブグレード）である。同様に、全細胞触媒（whole cell catalyst）としてデヒドロゲナーゼを用いる場合も、遊離型または固定化された形態を選択できる。支持体材料の例は、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。細胞と同様、酵素もグルタールアルデヒドで直接架橋し得る（架橋してＣＬＥＡを生ずる）。これに対応する固定化方法および他の固定化方法は、例えば、J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載されている。
【００２４】
上記反応は、水性もしくは非水性反応媒体中、または２相系もしくは（マイクロ）エマルジョンで行うことができる。水性反応媒体は、好ましくは、通常ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ５〜８の緩衝液である。水性溶媒は、水のほかに、少なくとも１種類のアルコール、例えばエタノールまたはイソプロパノール、またはジメチルスルホキシドをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
非水性反応媒体は、反応媒体の全質量に基づいて、１ｗｔ％未満、好ましくは０．５ｗｔ％未満の水を含む反応媒体を意味する。反応は、好ましくは有機溶媒中で行う。
【００２６】
適切な溶媒の例は、好ましくは５〜８炭素原子を有する、脂肪族炭化水素、例えばペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、へプタン、オクタンまたはシクロオクタン、好ましくは１つまたは２つの炭素原子を有する、ハロゲン化脂肪族炭化水素、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタンまたはテトラクロロエタン、芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエン、キシレン（類）、クロロベンゼンまたはジクロロベンゼン、好ましくは４〜８炭素原子を有する、脂肪族非環状および環状エーテルまたはアルコール、例えばジエチルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、エチルtert-ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、またはエステル、例えばエチルアセテートまたはn-ブチルアセテート、またはケトン、例えばメチルイソブチルケトンまたはジオキサン、またはそれらの混合物である。特に好ましくは、上記エーテル、特にテトロヒドロフランを用いる。
【００２７】
エノエートレダクターゼによる還元は、水性−有機の反応媒体、特に水性の反応媒体中で行うことが好ましい。
【００２８】
基質（１）は、好ましくは０．１ｇ／ｌ〜５００ｇ／ｌ、特に好ましくは１ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌの濃度で酵素還元に用い、その後、連続的にまたはバッチ式で供給してもよい。
【００２９】
酵素還元は通常、用いるレダクターゼの失活温度よりも低く、−１０℃よりも高い反応温度で行う。該温度は、具体的には、好ましくは０〜１００℃、特に１５〜６０℃、特に２０〜４０℃の範囲であり、例えば約３０℃である。
【００３０】
手順としては、例えば、基質（１）と、エノエートレダクターゼ、溶媒、適切であれば補酵素（適切であれば該補酵素を再生するための第２のデヒドロゲナーゼと共に）、および／またはさらに還元剤を最初に導入し、該混合物を、例えば攪拌または振とうにより混合することができる。しかし、例えばカラムなどの反応器にレダクターゼを固定化し、その反応器に、基質と、適切であれば補酵素および／または補助基質を含む混合物を通すことも可能である。このため、混合物を、所望の変換が達成されるまで反応器に循環させることができる。
【００３１】
上記工程において、カルボニル官能基に対してα，β位の二重結合が単結合に還元される；たまに、カルボニル官能基自体がアルコール官能基に還元される。該還元は通常、混合物中に存在する基質に基づいて少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、特に少なくとも９５％変換するまで行われる。反応の進行、すなわち二重結合の連続的な還元は、ガスクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーなどの常法により、その場でモニタリングすることができる。
【００３２】
本発明の目的において、具体的に開示された酵素の「機能的同等物」すなわちアナログは、それらとは異なるポリペプチドであって、さらに、例えば基質特異性などの所望の生物学的活性を有するポリペプチドである。従って、例えば「機能的同等物」とは、上記モデル反応を触媒し、かつ配列番号１または２として挙げられたアミノ酸配列のいずれかを含む酵素の少なくとも２０％、好ましくは５０％、特に好ましくは７５％、極めて好ましくは９０％の活性を有する酵素を意味する。さらに、機能的同等物は、好ましくはｐＨ４〜１０で安定であり、有利には、至適ｐＨが５〜８であり、至適温度が２０〜８０℃の範囲である。
【００３３】
本発明における「機能的同等物」は、特に、上記生物学的活性のうちの１つを有しているが、上記アミノ酸配列の少なくとも１箇所に、具体的に記載されたアミノ酸以外のアミノ酸を有する突然変異体も意味する。従って「機能的同等物」は、１つ以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得られる突然変異体を含み、本発明の特性プロフィールを有する突然変異体がもたらされる限り、該改変は、配列のどの位置で生じてもよい。また、突然変異体と非改変ポリペプチドの反応性パターンが質的に一致すれば、すなわち、例えば同じ基質が異なる速度で反応しても、機能的同等物が具体的に存在する。
【００３４】
適切なアミノ酸置換の例を以下の表に挙げる。
【表１】
【００３５】
上記の意味の「機能的同等物」は、記載されたポリペプチドの「前駆体」でもあり、「機能的誘導体」でもある。
【００３６】
これに関連して「前駆体」は、所望の生物学的活性を有するか、または有しない、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【００３７】
同様に、本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は、公知の技術を用いて、機能的アミノ酸の側鎖またはそのＮ末端側もしくはＣ末端側の終端に調製することができる。この種の誘導体は、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド（該アミドはアンモニアまたは第１もしくは第２アミンとの反応によって得られる）；遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（該誘導体はアシル基との反応によって調製される）；または遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体（該誘導体はアシル基との反応によって調製される）を含む。
【００３８】
タンパク質のグリコシル化が可能な場合、本発明の「機能的同等物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化された形、およびグリコシル化のパターンを変えることによって得ることができる改変された形の上記タイプのタンパク質を含む。
【００３９】
当然ながら「機能的同等物」は、他の生物から得られるポリペプチドも含み、天然に生じた変異体も含む。例えば、相同配列領域の範囲は、配列比較により定めることができ、同等な酵素を、本発明の具体的なガイドラインに基づいて決定することができる。
【００４０】
また「機能的同等物」は、本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含み、該断片は、例えば所望の生物学的機能を有する。
【００４１】
さらに「機能的同等物」は、上記ポリペプチド配列またはそれに由来する機能的同等物のいずれか、およびそれらとは機能的に異なる異種配列であって、かつＮ末端またはＣ末端に機能的に結合した（すなわち、融合タンパク質部分のいかなる実質的な相互的機能障害がない）少なくとも１つの上記異種配列を含む、融合タンパク質である。このような異種配列の限定されない例は、例えばシグナルペプチドまたは酵素である。
【００４２】
本発明のタンパク質のホモログは、例えばトランケーション変異体などの突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、同定することができる。例えば、タンパク質変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることにより、作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのライブラリーを調製するのに使用できる方法が数多くある。縮重遺伝子配列は、ＤＮＡ合成機で化学的に合成することができ、次に、その合成遺伝子を、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。遺伝子の縮重セットを用いることにより、所望の潜在的なタンパク質配列のセットをコードする混合物中の配列をすべて提供することができるようになる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に公知である（例えばNarang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００４３】
点突然変異またはトランケーションにより調製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技術、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術が、いくつか先行技術で知られている。これらの技術を、本発明のホモログのコンビナトリアル突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーを迅速にスクリーニングするために適合させることができる。ハイスループット分析される大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最もよく用いられる技術には、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、得られたベクターライブラリーを用いて適切な細胞に形質転換し、所望の活性の検出により、その検出された遺伝子産物の遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることが含まれる。再帰的アンサンブル突然変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis：ＲＥＭ）、すなわち、ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術を、ホモログを同定するためにスクリーニングテストと組合せて用いてもよい(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【００４４】
さらに本発明は、本発明のレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）に関する。好ましくは、例えば配列番号１または２のアミノ酸配列、またはその特徴のある部分の配列をコードする核酸配列である。
【００４５】
本明細書に記載されたすべての核酸配列は、ヌクレオチド・ビルディング・ブロックからの化学的合成によるそれ自体公知の方法で、例えば、二重らせんの個々の重複する相補的な核酸ビルディング・ブロックのフラグメント縮合により、調製することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、公知の方法で、即ちホスホアミダイト法を用いて化学的に合成することができる(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897)。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片とライゲーション反応を用いた、合成オリゴヌクレオチドの組立て、ギャップの穴埋め、また一般的なクローニング方法が、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００４６】
＜本発明の酵素的還元方法を行うさらなる実施形態＞
エノエートレダクターゼは、本発明の方法において、遊離型または固定化酵素として用いることができる。
【００４７】
本発明の方法は、有利には、０〜９５℃、好ましくは１０〜８５℃、特に好ましくは１５〜７５℃の温度で行う。
【００４８】
本発明の方法において、ｐＨは、有利には、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ４．５〜９、特に好ましくはｐＨ５〜８に維持される。
【００４９】
本発明の方法において、エナンチオマー的に純粋なまたはキラルな生成物（２）は、エナンチオマー富化を示すエナンチオマーを意味する。好ましくは、該方法において少なくとも７０％ｅｅ、好ましくは少なくとも８０％ｅｅ、特に好ましくは少なくとも９０％ｅｅ、極めて好ましくは少なくとも９８％ｅｅのエナンチオマー純度が達成される。
【００５０】
本発明の方法において、本発明の核酸、核酸構築物またはベクターを含む増殖細胞を用いることが可能である。静止細胞または破壊細胞を用いることも可能である。破壊細胞とは、例えば溶媒で処理することにより透過性になった細胞、または、例えば酵素で処理することにより、機械的処理（例えばフレンチプレスまたは超音波処理）により、あるいは他の方法により破壊された細胞を意味する。該方法で得られた粗抽出物は、本発明の方法に有利に適している。本方法において、精製された酵素または部分的に精製された酵素を使用することも可能である。同様に、本反応に有利に適用することができる固定化された微生物または酵素も適している。
【００５１】
本発明の方法は、バッチ式、セミバッチ式、または連続的に実施することができる。
【００５２】
本方法は、例えばBiotechnology, volume 3, 2nd edition, Rehm et al. Eds., (1993)、特にchapter IIに記載されたバイオリアクターで有利に行うことができる。
【００５３】
以下の実施例により本発明を説明するが、本実施例は本発明を限定するものではない。これに関し、添付された図が参照される。
【実施例】
【００５４】
＜実験セクション＞
Saccharomyces cerevisiaeを用いた２−メチル−ペント−２−エン−１−アールの生体内変換
邪魔板を備えた５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコで生体内変換を行った。該フラスコのいずれにも１２６ｍｌの変換溶液を入れた。これらには、いずれにも２１ｇのＤ−グルコースを加えた。所望のｐＨ（６〜８．５）に調整した。フラスコあたりの基質量を、２−メチルペント−２−エン−１−アール２００ｍｇとした。本実験を、２１ｇのパン酵母を添加することにより開始し、その反応混合物を所望の温度（２８〜３７℃）のインキュベーターに入れた（２４０ｒｐｍで攪拌した）。６、１２、１８、２４、３６、４８時間後にサンプルを採取し、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５５】
最も高い変換率（４０〜７０％）は、ｐＨ７．５〜８．５の間で達成された。ｐＨ＝８．５、Ｔ＝３７℃での光学純度は、６６．６％の変換でｅｅ＝９２．１であった。
【００５６】
Saccharomyces cerevisiaeを用いたシトラールの生体内変換
邪魔板を備えた５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコで生体内変換を行った。該フラスコのいずれにも１２６ｍｌの変換溶液を入れた。これらには、いずれにも２１ｇのＤ−グルコースを加えた。所望のｐＨ（６〜８．５）に調整した。フラスコあたりの基質量をシトラール２１０ｍｇとした（シトラールは７０：３０のシス／トランス混合物であった）。本実験を、２１ｇのパン酵母を添加することにより開始し、その反応混合物を所望の温度（２８〜３７℃）のインキュベーターに入れた（２４０ｒｐｍで攪拌した）。６、１２、１８、２４、３６、４８時間後にサンプルを採取し、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５７】
（Ｒ）−（＋）シトロネラールに加えて、ネロールおよびゲラニオールと、（Ｒ）−（＋）−β−シトロネロールも得られた。
【００５８】
変換溶液
５３．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、２１ｇのＤ−グルコースおよび１２６ｍｌの蒸留水（ｐＨは６〜８．５に調整）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エノエートレダクターゼ存在下での還元により、式（１）のα，β−不飽和アルデヒドから、式（２）の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコール
【化１】
（Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ４−アルキルであり、Ｒ３は、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはアルケニルである。）を調製する方法であって、エノエートレダクターゼが、
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは
（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、
上記方法。
【請求項２】
還元を、補因子としてＮＡＤＰＨを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いられる補因子を酵素的に再生する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
補因子をグルコースデヒドロゲナーゼによって再生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
還元を水系で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エノエートレダクターゼが固定化された形で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
シトラールから（Ｒ）−（＋）シトロネラールを調製する方法におけるエノエートレダクターゼの使用であって、エノエートレダクターゼが、
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは
（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、
上記使用。
【請求項１】
エノエートレダクターゼ存在下での還元により、式（１）のα，β−不飽和アルデヒドから、式（２）の光学活性飽和アルデヒドまたはアルコール
【化１】
（Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ４−アルキルであり、Ｒ３は、Ｈ、または分岐状および非分岐状のＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはアルケニルである。）を調製する方法であって、エノエートレダクターゼが、
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは
（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、
上記方法。
【請求項２】
還元を、補因子としてＮＡＤＰＨを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いられる補因子を酵素的に再生する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
補因子をグルコースデヒドロゲナーゼによって再生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
還元を水系で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エノエートレダクターゼが固定化された形で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
シトラールから（Ｒ）−（＋）シトロネラールを調製する方法におけるエノエートレダクターゼの使用であって、エノエートレダクターゼが、
（ｉ）配列番号１または２のポリペプチド配列を有し、あるいは
（ｉｉ）配列番号１または２の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、
上記使用。
【公表番号】特表２００９−５２１９１５（Ｐ２００９−５２１９１５Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４７９４６（Ｐ２００８−５４７９４６）
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６９８９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７７１２１
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０８０２０１５５）ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア (2,842)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６９８９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７７１２１
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０８０２０１５５）ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア (2,842)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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