【課題】シロ−イノシトールの製造方法を提供する。
【解決手段】シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD⁺またはNADP⁺存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）とを共存させた溶液中、ｐH6.0〜8.5で、かつNAD⁺またはNADP⁺存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させる、シローイノシトールの製造方法。シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、特定のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
反応：下記反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
【化１】

【請求項２】
さらに、下記の理化学的性質を有する、請求項１に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
（１）分子量および会合特性 ： 38〜46ｋダルトン、２または３量体を形成する。
（２）補酵素 ： NAD⁺若しくはNADP⁺又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
（３）活性化重金属 ： Co²⁺イオンの存在下で活性化される。
（４）阻害重金属 ： Sn²⁺イオンの存在下で阻害される。
（５）至適ｐＨ ： ｐH５〜９で活性を有する。
【請求項３】
以下の（A）または（B）のタンパク質。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の（A）または（B）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項４または５に記載のＤＮＡ、または請求項６に記載のベクターを保持する形質転換微生物。
【請求項８】
形質転換する宿主が大腸菌である請求項７に記載の形質転換微生物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の形質転換微生物を培養し、培養物からシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD⁺またはNADP⁺存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）とを共存させた溶液中、ｐH6.0〜8.5で、かつNAD⁺またはNADP⁺存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シローイノシトールの製造方法。
【請求項１１】
溶液中に、シロ−イノソースを0.01〜3％になるように添加することを特徴とする、請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項１２】
溶液中に、シロ−イノソースを0.2〜0.5％になるように添加することを特徴とする、請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項１３】
溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.01〜5.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項１４】
溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.2〜2.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項１５】
溶液中のミオ−イノシトール濃度が5〜22％になるように調製し、酵素反応で生成したシロ−イノシトールを反応溶液中で結晶化させ、シロ−イノシトールを系外に結晶として、ろ別することを特徴とする、請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項１６】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
（Ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１８】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列において、
１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項１０に記載のシローイノシトールの製造方法。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【図１】

【公開番号】特開２０１２−２２８２６４（Ｐ２０１２−２２８２６４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６０３８４（Ｐ２０１２−１６０３８４）
【出願日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【分割の表示】特願２０１０−８６４５９（Ｐ２０１０−８６４５９）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】