ジアセチルポリアミンの分解防止法
【課題】溶液中におけるジアセチルポリアミンの分解を防止する方法を提供する。
【解決手段】アセチルポリアミンを含む溶液中にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加する方法、あるいはジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを低くする方法を提供する。本発明を用いれば、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解を抑制し、より正確な測定値を知ることが可能である。また、本発明はプロテイナーゼ又はペプチダーゼを含む試料、たとえば尿や細胞破砕液や、意図せずプロテイナーゼあるいはペプチダーゼが混入してしまう可能性のある測定反応液等にも幅広く適用可能であり、ジアセチルポリアミン測定上、きわめて有用な方法である。
【解決手段】アセチルポリアミンを含む溶液中にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加する方法、あるいはジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを低くする方法を提供する。本発明を用いれば、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解を抑制し、より正確な測定値を知ることが可能である。また、本発明はプロテイナーゼ又はペプチダーゼを含む試料、たとえば尿や細胞破砕液や、意図せずプロテイナーゼあるいはペプチダーゼが混入してしまう可能性のある測定反応液等にも幅広く適用可能であり、ジアセチルポリアミン測定上、きわめて有用な方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解を防止する方法、該方法を利用したジアセチルポリアミンの分解が抑制された溶液、及び該溶液を用いたジアセチルポリアミンの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジアセチルポリアミンは癌の悪性度と相関するマーカーとして知られており（非特許文献１）、たとえばジアセチルポリアミンの一つであるジアセチルスペルミンは腫瘍の悪性度を評価する診断マーカーとして用いられている（特許文献１）。
【０００３】
これらのジアセチルポリアミンは物理化学的に安定な物質である上に、アセチル化されたポリアミンの代謝を主に行う特異的なオキシダーゼ（非特許文献２）活性は通常の生体由来の試料中では高くないことから、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解には、これまで特段の注意は払われてこなかった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８１５６９号公報
【非特許文献１】Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） ２００６， １３９：３１５−３２２
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８１， １３：２８７−２９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者はジアセチルポリアミンの安定性を詳細に検討した結果、生体由来の試料中におけるジアセチルポリアミンは、従来いわれているような特異的なオキシダーゼではなく、より不偏的に存在するプロテイナーゼあるいはペプチダーゼによって分解されるため、ジアセチルポリアミンの測定において正しい値を得られない可能性があることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法を見出すべく、鋭意検討を重ねた結果、ジアセチルポリアミンを含む溶液中にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加すること、あるいはジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にすることによって溶液中のジアセチルポリアミンの分解を減弱させうることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。
【０００７】
（１）ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
（２）ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
（３）ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、かつｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法でジアセチルポリアミンの分解が抑制されたジアセチルポリアミン含有溶液。
（５）ジアセチルポリアミンを測定するために調製した生体由来の試料である、上記（４）記載の溶液。
（６）上記（４）記載の溶液を用いて、溶液中のジアセチルポリアミンを測定する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法を用いることにより、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解を抑制し、より正確な測定値を知ることが可能である。また、本発明はプロテイナーゼまたはペプチダーゼを含むもしくはその可能性の高い試料、たとえば尿や細胞破砕液、あるいは意図せずプロテイナーゼ又はペプチダーゼが混入してしまう可能性のある測定反応液等にも幅広く適用可能であり、ジアセチルポリアミン測定上、きわめて有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、以下の用語は次の意味を有するものである。
「ジアセチルポリアミン」とは、ジアセチルスペルミン及び／又はジアセチルスペルミジンを意味し、具体的には、Ｎ1，Ｎ12−ジアセチルスペルミン、Ｎ1，Ｎ8−ジアセチルスペルミジンなどを例示することができる。
【００１０】
「ジアセチルポリアミンを含む溶液」とは、ジアセチルポリアミンを含む溶液であれば特に限定されない。具体的には、尿、血清、血漿、細胞破砕液等の生体由来の試料、ジアセチルポリアミンを測定する時の反応溶液等を例示することができる。
【００１１】
「分解を防止する」とは、後述実施例に示すように、ジアセチルポリアミンを含む溶液を３７℃で２時間インキュベーションしたときのジアセチルポリアミンの分解率が１５％以下あることを意味し、「分解が抑制された」も同様の意味を意図している。なお、ジアセチルポリアミンの測定上、ジアセチルポリアミンの分解率は小さいほど好ましいものの、分解率が１５％以下であれば、測定値、特にイムノアッセイ法における測定値にそれほど大きな影響は与えない。
【００１２】
上述したように、本発明方法は、ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加するか、ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にするか、あるいはその両方を併用する方法に関するものである。
【００１３】
本発明で用いるプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤とは、プロテイナーゼ及び／又はペプチダーゼの活性を阻害するものであれば特に限定されない。具体的には、プロテアーゼインヒビターカクテルＰ２７１４あるいはＰ８３４０（シグマ社）、ベスタチン、カルボキシペプチダーゼインヒビター等を例示することができる。
【００１４】
上記阻害剤の添加法、使用濃度などについては、それぞれの阻害剤に添付されている説明文書あるいは既に報告されている方法をそのまま適用すればよい。
【００１５】
また、ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを下げる方法としては、測定に影響を与えない方法であれば特に限定されない。具体的には、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などの目的のｐＨを有する緩衝液を添加し、ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下、好ましくは６以下に調整すればよい。
【００１６】
このようにして調製した、ジアセチルポリアミンの分解が抑制されたジアセチルポリアミン含有溶液は、ジアセチルポリアミンの濃度を測定する際のサンプルとして好適であり、このようなサンプルを用いることで、ジアセチルポリアミンのより正確な測定値を得ることが可能である。
【００１７】
ジアセチルポリアミンの測定法としては、既に多くの方法が報告されているが、その中でも、イムノアッセイ法は特に簡便で好適である。イムノアッセイによる具体的な測定手順に関しては、公知の文献（例えば、特開２０００−０７４９１７号公報、ＷＯ２００４−８１５６９号公報、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２３（１９９７），５３９−５４５、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３２（２００２），７８３−７８８）を参照することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。なお、試料中のジアセチルスペルミンの分解量（％）は、ＥＬＩＳＡ法によりジアセチルスペルミンを定量し、算出した。
【００１９】
実施例１：プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤の溶液への添加によるジアセチルスペルミン分解の減弱
マウスの血球を洗浄後、凍結融解にて破壊したものを５％の濃度となるように生理食塩水に溶解させた。当該マウス血球破砕液に、ジアセチルスペルミンを８０μＭになるよう添加し、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いてｐＨ７．４に調整した。この反応液に、プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤として、２ｍｌに溶解したプロテアーゼインヒビターカクテルＰ２７１４（シグマ社）を０．２％（容量パーセント濃度、以下同様）、Ｐ８３４０（シグマ社）を１％になるようにそれぞれ添加した。この反応液を３７℃で２時間反応させた。
【００２０】
３７℃で反応させる前、阻害剤を添加して反応させた後、阻害剤を添加せずに反応させた後のそれぞれの試料中におけるジアセチルスペルミンの量をＥＬＩＳＡ法によって測定し、反応によって分解されたジアセチルスペルミンの量を、当初の量で割った比を算出した。
【００２１】
下表１は各プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤を添加したときの相対的なジアセチルスペルミン分解量を表したものである。この表から明らかなように、プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤を添加することで、ジアセチルスペルミンの分解を防止することが可能である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
実施例２：溶液ｐＨによるジアセチルスペルミン分解の減弱
実施例１と同様にして作製したマウス血球破砕液に、ジアセチルスペルミンを４０μＭになるように添加し、５０ｍＭリン酸緩衝液を用いてｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０となるようにそれぞれｐＨを調整した。その後、反応液を３７℃で２時間反応させた。
【００２４】
３７℃で反応させる前、反応させた後のそれぞれの試料中におけるジアセチルスペルミンの量を実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて測定し、反応によって分解されたジアセチルスペルミンの量を、当初の量で割った比を算出した。
【００２５】
下表２は、反応液のｐＨを低くしたときの相対的なジアセチルスペルミン分解量を表したものである。この表から明らかなように、ｐＨを６．５以下、好ましくは６以下することで、ジアセチルスペルミンの分解を防止することが可能である。
【００２６】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解を防止する方法、該方法を利用したジアセチルポリアミンの分解が抑制された溶液、及び該溶液を用いたジアセチルポリアミンの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジアセチルポリアミンは癌の悪性度と相関するマーカーとして知られており（非特許文献１）、たとえばジアセチルポリアミンの一つであるジアセチルスペルミンは腫瘍の悪性度を評価する診断マーカーとして用いられている（特許文献１）。
【０００３】
これらのジアセチルポリアミンは物理化学的に安定な物質である上に、アセチル化されたポリアミンの代謝を主に行う特異的なオキシダーゼ（非特許文献２）活性は通常の生体由来の試料中では高くないことから、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解には、これまで特段の注意は払われてこなかった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８１５６９号公報
【非特許文献１】Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） ２００６， １３９：３１５−３２２
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８１， １３：２８７−２９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者はジアセチルポリアミンの安定性を詳細に検討した結果、生体由来の試料中におけるジアセチルポリアミンは、従来いわれているような特異的なオキシダーゼではなく、より不偏的に存在するプロテイナーゼあるいはペプチダーゼによって分解されるため、ジアセチルポリアミンの測定において正しい値を得られない可能性があることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法を見出すべく、鋭意検討を重ねた結果、ジアセチルポリアミンを含む溶液中にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加すること、あるいはジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にすることによって溶液中のジアセチルポリアミンの分解を減弱させうることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。
【０００７】
（１）ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
（２）ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
（３）ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、かつｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法でジアセチルポリアミンの分解が抑制されたジアセチルポリアミン含有溶液。
（５）ジアセチルポリアミンを測定するために調製した生体由来の試料である、上記（４）記載の溶液。
（６）上記（４）記載の溶液を用いて、溶液中のジアセチルポリアミンを測定する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法を用いることにより、ジアセチルポリアミンを含む溶液中のジアセチルポリアミンの分解を抑制し、より正確な測定値を知ることが可能である。また、本発明はプロテイナーゼまたはペプチダーゼを含むもしくはその可能性の高い試料、たとえば尿や細胞破砕液、あるいは意図せずプロテイナーゼ又はペプチダーゼが混入してしまう可能性のある測定反応液等にも幅広く適用可能であり、ジアセチルポリアミン測定上、きわめて有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、以下の用語は次の意味を有するものである。
「ジアセチルポリアミン」とは、ジアセチルスペルミン及び／又はジアセチルスペルミジンを意味し、具体的には、Ｎ1，Ｎ12−ジアセチルスペルミン、Ｎ1，Ｎ8−ジアセチルスペルミジンなどを例示することができる。
【００１０】
「ジアセチルポリアミンを含む溶液」とは、ジアセチルポリアミンを含む溶液であれば特に限定されない。具体的には、尿、血清、血漿、細胞破砕液等の生体由来の試料、ジアセチルポリアミンを測定する時の反応溶液等を例示することができる。
【００１１】
「分解を防止する」とは、後述実施例に示すように、ジアセチルポリアミンを含む溶液を３７℃で２時間インキュベーションしたときのジアセチルポリアミンの分解率が１５％以下あることを意味し、「分解が抑制された」も同様の意味を意図している。なお、ジアセチルポリアミンの測定上、ジアセチルポリアミンの分解率は小さいほど好ましいものの、分解率が１５％以下であれば、測定値、特にイムノアッセイ法における測定値にそれほど大きな影響は与えない。
【００１２】
上述したように、本発明方法は、ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加するか、ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にするか、あるいはその両方を併用する方法に関するものである。
【００１３】
本発明で用いるプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤とは、プロテイナーゼ及び／又はペプチダーゼの活性を阻害するものであれば特に限定されない。具体的には、プロテアーゼインヒビターカクテルＰ２７１４あるいはＰ８３４０（シグマ社）、ベスタチン、カルボキシペプチダーゼインヒビター等を例示することができる。
【００１４】
上記阻害剤の添加法、使用濃度などについては、それぞれの阻害剤に添付されている説明文書あるいは既に報告されている方法をそのまま適用すればよい。
【００１５】
また、ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを下げる方法としては、測定に影響を与えない方法であれば特に限定されない。具体的には、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などの目的のｐＨを有する緩衝液を添加し、ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下、好ましくは６以下に調整すればよい。
【００１６】
このようにして調製した、ジアセチルポリアミンの分解が抑制されたジアセチルポリアミン含有溶液は、ジアセチルポリアミンの濃度を測定する際のサンプルとして好適であり、このようなサンプルを用いることで、ジアセチルポリアミンのより正確な測定値を得ることが可能である。
【００１７】
ジアセチルポリアミンの測定法としては、既に多くの方法が報告されているが、その中でも、イムノアッセイ法は特に簡便で好適である。イムノアッセイによる具体的な測定手順に関しては、公知の文献（例えば、特開２０００−０７４９１７号公報、ＷＯ２００４−８１５６９号公報、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２３（１９９７），５３９−５４５、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３２（２００２），７８３−７８８）を参照することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。なお、試料中のジアセチルスペルミンの分解量（％）は、ＥＬＩＳＡ法によりジアセチルスペルミンを定量し、算出した。
【００１９】
実施例１：プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤の溶液への添加によるジアセチルスペルミン分解の減弱
マウスの血球を洗浄後、凍結融解にて破壊したものを５％の濃度となるように生理食塩水に溶解させた。当該マウス血球破砕液に、ジアセチルスペルミンを８０μＭになるよう添加し、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いてｐＨ７．４に調整した。この反応液に、プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤として、２ｍｌに溶解したプロテアーゼインヒビターカクテルＰ２７１４（シグマ社）を０．２％（容量パーセント濃度、以下同様）、Ｐ８３４０（シグマ社）を１％になるようにそれぞれ添加した。この反応液を３７℃で２時間反応させた。
【００２０】
３７℃で反応させる前、阻害剤を添加して反応させた後、阻害剤を添加せずに反応させた後のそれぞれの試料中におけるジアセチルスペルミンの量をＥＬＩＳＡ法によって測定し、反応によって分解されたジアセチルスペルミンの量を、当初の量で割った比を算出した。
【００２１】
下表１は各プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤を添加したときの相対的なジアセチルスペルミン分解量を表したものである。この表から明らかなように、プロテイナーゼ阻害剤またはペプチダーゼ阻害剤を添加することで、ジアセチルスペルミンの分解を防止することが可能である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
実施例２：溶液ｐＨによるジアセチルスペルミン分解の減弱
実施例１と同様にして作製したマウス血球破砕液に、ジアセチルスペルミンを４０μＭになるように添加し、５０ｍＭリン酸緩衝液を用いてｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０となるようにそれぞれｐＨを調整した。その後、反応液を３７℃で２時間反応させた。
【００２４】
３７℃で反応させる前、反応させた後のそれぞれの試料中におけるジアセチルスペルミンの量を実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて測定し、反応によって分解されたジアセチルスペルミンの量を、当初の量で割った比を算出した。
【００２５】
下表２は、反応液のｐＨを低くしたときの相対的なジアセチルスペルミン分解量を表したものである。この表から明らかなように、ｐＨを６．５以下、好ましくは６以下することで、ジアセチルスペルミンの分解を防止することが可能である。
【００２６】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
【請求項２】
ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
【請求項３】
ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、かつｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法でジアセチルポリアミンの分解が抑制されたジアセチルポリアミン含有溶液。
【請求項５】
ジアセチルポリアミンを測定するために調製した生体由来の試料である、請求項４記載の溶液。
【請求項６】
請求項４記載の溶液を用いて、溶液中のジアセチルポリアミンを測定する方法。
【請求項１】
ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
【請求項２】
ジアセチルポリアミンを含む溶液のｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
【請求項３】
ジアセチルポリアミンを含む溶液にプロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチダーゼ阻害剤を添加し、かつｐＨを６．５以下にし、ジアセチルポリアミンの分解を防止する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法でジアセチルポリアミンの分解が抑制されたジアセチルポリアミン含有溶液。
【請求項５】
ジアセチルポリアミンを測定するために調製した生体由来の試料である、請求項４記載の溶液。
【請求項６】
請求項４記載の溶液を用いて、溶液中のジアセチルポリアミンを測定する方法。
【公開番号】特開２００９−２３６７８９（Ｐ２００９−２３６７８９Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８５０９８（Ｐ２００８−８５０９８）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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