ジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質
【課題】耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ジアホラーゼを提供する。
【解決手段】補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼを提供する。また、分子動力学シミュレーションを用いて、補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼをスクリーニングする方法を提供する。
【解決手段】補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼを提供する。また、分子動力学シミュレーションを用いて、補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼをスクリーニングする方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型ジアホラーゼに関する。より詳しくは、耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ジアホラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、生命の維持に係わる多くの反応を生体内の温和な条件下で円滑に進める生体内触媒である。この酵素は、生体内で代謝回転し、生体内で必要に応じて生産されて、その触媒機能を発揮する。
【０００３】
現在、この酵素を生体外で利用する技術が、既に実用化されたり、あるいは実用化に向けた検討が行われたりしている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野において、酵素の利用技術が進展している。比較的近年では、燃料電池の一種である酵素電池（例えば、特許文献１参照）、酵素電極、酵素センサー（酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー）などの技術も提案されている。
【０００４】
この酵素の化学的本体はタンパク質であるので、酵素は、熱やｐＨの程度によって変性する性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、環境の変化に対して酵素をより安定的に働かせて、その活性を持続させるようにすることが重要である。
【０００５】
酵素を生体外で利用する場合、酵素自体の性質や機能を人工的に改変させる方法や酵素の働く場所の環境を工夫する方法などのアプローチが採用されることになる。前者の方法では、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変化させ、この変化させた遺伝子を大腸菌等の生物の中で発現させることによって人工的に変異したタンパク質を作製し、そして、利用目的にあった機能や性質を備える変異型タンパク質を選別（スクリーニング）することが一般的に行われている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００４−７１５５９号公報。
【特許文献２】特開２００４−２９８１８５号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ジアホラーゼの生体外での広範な利用可能性を視野に入れ、耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ジアホラーゼを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼを提供する。
これらの変異型ジアホラーゼは、例えば、好熱性バチルス属細菌、特にバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来とすることができる。
また、本発明は、分子動力学シミュレーションを用いて、補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼをスクリーニングする方法をも提供するものである。
【０００８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【０００９】
「ジアホラーゼ（Diaphorase）」は、NADH又はNADPHをフェリシアン化カリウム、メチレンブルー、2,6-ジクロルインドフェノール、テトラゾリウム塩等の色素で酸化する反応を触媒する活性（即ち、ジアホラーゼ活性）を持つ酵素であり、細菌、酵母等の微生物から哺乳類動物まで広く分布する。このジアホラーゼは、生体内の電子伝達系において重要な役割を果たし、このジアホラーゼによって、NAD+又はNADP+依存性の脱水素酵素類による基質からの脱水素反応により生成されるNADH又はNADPHは、電子受容体で酸化され、電子受容体は還元型となる。
【００１０】
「フラビンモノヌクレオチド（Flavin Mononucleotide、以下「ＦＭＮ」という）」は、生体内においてフラビン酵素と呼ばれる酸化還元酵素の補酵素として働く。「補酵素」とは、酵素反応の化学基の授受に機能する低分子量の有機化合物をいう。補酵素とアポ酵素（補酵素を欠く酵素タンパク質部分）は、それぞれ単独では化学反応触媒として機能せず、両者が結合しホロ酵素となって、初めて酵素として機能する。ＦＭＮを補酵素とするフラビン酵素には、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素やグリコラートオキシダーゼなどが含まれる。
【００１１】
「変異型タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基の並び順を人工的に変えることにより得られた遺伝子から発現させたタンパク質である。より具体的には、野生型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００１２】
「分子動力学シミュレーション」とは、系(気体、液体、固体)を構成する原子個々の動きをコンピュータ上で再現するものである。原子、分子それぞれに対してニュートンの運動方程式を解くことにより、目的とする系の状態の時間発展をシミュレーションすることが可能である。これにより、タンパク質の高次構造について、実験では得られないような高い解像度で情報を得ることができる。本発明で用いた具体的なシミュレーション方法は、実施例４において詳しく説明するが、これに限定されず、一般に用いられているプログラム及び力場を用いてよい。
【００１３】
分子はできるだけエネルギー的に安定な状態（平衡状態）に戻ろうとするから、自然な結合状態からずれた状態ではエネルギー的に不安定で余分なエネルギーをもつことになる。このエネルギーを「ポテンシャルエネルギー」という。ポテンシャルエネルギーは、古典力学で表現される関数（ポテンシャル関数）として表される。分子動力学シミュレーションに用いられるポテンシャル関数は、プログラム及び力場に応じて異なる。本発明で用いたポテンシャル関数は、実施例４において詳しく説明する
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る変異型ジアホラーゼは、耐熱性の程度が所定レベル以上である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本願発明者は、今回新たに、ジアホラーゼが２量体で存在すること、さらにこの２量体のサブユニット間の界面に２分子のＦＭＮが結合して複合体を形成していることを見出した。そこで、種々の変異型ジアホラーゼについて、ＦＭＮとの複合体形成時のポテンシャルエネルギーと耐熱性について検討した結果、以下のような注目すべき事実を発見し、本願発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、ジアホラーゼの耐熱性はポテンシャルエネルギーに依存し、ポテンシャルエネルギーが小さいほどジアホラーゼの耐熱性が向上することを発見した。
【００１７】
以下実験データを参照しながら説明する。
【実施例】
【００１８】
（実施例１）
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ（Diaphorase）のクローニングと発現及び精製。
【００１９】
（１-１）Bacillus stearothermophilusからゲノムDNAの単離・精製。
Bacillus stearothermophilusは、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）から分譲を受けた（JCM No.2501,NCBIのdiaphorase geneのaccession number:AF112858）。Bacillus stearothermophilusの凍結乾燥体を寒天培地Ａ上、55℃で一晩培養した。
【００２０】
このようにして得られたコロニーを新しい寒天培地Ａ上にて同様に培養して、清浄なコロニーとして、ここから一部を取り出して液体培地Ａ中55℃で一晩培養した。遠心分離により集菌し、Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega社)を使用して、ゲノムDNAを単離した(方法の詳細は製品添付の取扱説明書)。なお、培地Ａの組成は次の「表１」のとおり(１Ｌ中、pH7.0-7.2に調整)。
【００２１】
【表１】
【００２２】
（１-２）ジアホラーゼ（Diaphorase）遺伝子のクローニング。
前記（１-１）で得られたゲノムDNAからPCRによりジアホラーゼ遺伝子を増幅した。DNA polymeraseにはPfu DNA polymerase (Stratagene社)を使用し、プライマーとしては、以下の「表２」の配列のものを使用した。なお、下線部は、Nde I配列（sense_DI）、BamH I配列（antisense_DI）を示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】
次に、ＰＣＲ産物のジアホラーゼ遺伝子をPCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製し、アガロース電気泳動により確認した。また、ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列の確認を行った。
【００２５】
（１-３）ジアホラーゼ遺伝子のベクターへの導入。
ジアホラーゼ遺伝子の増幅断片をBamH IとNde Iにより処理し、PCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製した。また、ベクターpET12a (Novagen社)をBamH IとNde Iにより処理し、同様に精製した。これら２種類の断片をT4 ligaseによりligationし、産物によってXL1-blue electrocompetent cell (Stratagene社)を形質転換してLB-amp培地で培養を行い、増産した。
【００２６】
得られたプラスミドをBss Iで処理し、アガロース電気泳動でジアホラーゼ遺伝子の挿入を確認し、塩基配列を解析した。すると、データベース(ＮＣＢＩ)の塩基配列との間に若干の差があった。これは、理化学研究所の微生物系統保存施設より取得した株とデータベースの株に若干の違いがあったために、クローニングしたDIとデータベースのDIの遺伝子配列に不一致があったためと思われる。遺伝型（塩基配列）については１１箇所、そのうち表現型（アミノ酸配列）において２残基にて不一致があった（表３参照）。
【００２７】
【表３】
【００２８】
そこで、この２箇所のアミノ酸残基をデータベースのもの同様に修正した遺伝子を、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を使って作成した。なお、この遺伝子を「pET12a-BsDI」と命名した。
【００２９】
（１-４）大腸菌の形質転換。
前記pET12a-BsDIをE. coli BL21 (DE3) (Novagen社)にヒートショック法により導入、形質転換を行った。SOC中で１hr、37℃で前培養後、LB-amp寒天培地に展開、コロニーの一部を液体培養し、ジアホラーゼの発現をSDS-PAGEで確認した。
【００３０】
（１-５）形質転換体の凍結保存サンプル。
前記（１-４）で得られた形質転換体培養液３ｍＬを遠心分離し、大腸菌ペレットに2xYT培地を加えて分散させて-80℃で保存した。
【００３１】
（１-６）大量培養とタンパク質精製。
BL21 (DE3)/pET12a-BsDIの凍結サンプルから、LB-amp agar培地に展開し、コロニーをピックアップして100mL LB-ampでOD600が１程度になるまで前培養し、これを18LのLB-ampに展開して、37℃でOD600が２程度で飽和するまでしんとう培養した。この培養液から菌体を遠心分離(5kG)により回収した（ウェットで収量20 g）。菌体ペレットを-80℃で凍結した後溶解し、0℃で200mLの50mM Tris-HCl, pH7.8, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF溶液中で超音波処理して溶菌し、遠心分離(9.5 kG)により溶液画分を回収した。
【００３２】
次に、硫安沈殿法による精製を行った。35%飽和溶液になるまで撹拌しながら徐々に粉状の硫酸アンモニウムを添加し、一晩静置した。沈殿物を遠心分離(9.5 kG)により取り除き、透析膜チューブを使って脱塩処理した（最終溶液：5 mM Tris-HCl, pH 7.8）。限外濾過法で濃縮したサンプル50 mLを陰イオン交換カラム(Sepharose Q FastFlow, Amersham Bioscience)にかけ、diaphorase含有画分を回収して限外濾過法で濃縮した(溶液量20 mL、Centriplus 遠心式フィルターユニット YM-30、Millipore)。次いで、このサンプルをゲル濾過カラム(Sephacryl S-200, AmershamBioscience)にかけ、diaphorase含有画分を集めた。
【００３３】
（実施例２）
Bacillus stearothermophilus由来のジアホラーゼのランダムミューテーションによる変異体ライブラリーの作成と耐熱性変異体のスクリーニング。
【００３４】
まず、本実施例２で行った実験の流れを図１に示す。Error-prone PCRによるdiaphoraseミュータントの遺伝子ライブラリー作成を行い、この遺伝子をベクターDNAに導入して大腸菌中で発現させた。このライブラリーを耐熱性スクリーニングにかけ、目的とする耐熱性diaphorase変異体を抽出した。
【００３５】
（２-１）GeneMorph（登録商標）によるError-Prone PCR。
「Error-prone PCR法」とは、PCRによるDNA断片複製反応の際に、DNA polymeraseが塩基配列の読み間違いを起こすことを利用して、複製されたDNA断片に変異をランダムに起こす方法である。種々の方法が報告されているが、ここでは製品化されているものの中から、Stratagene社のGeneMorph（登録商標）を選択した。Template DNAは、Bacillus stearothermophilusのジアホラーゼ遺伝子を組み込んだ上記pET12a-BsDIを用いた。プライマーもこの遺伝子のクローニングに用いたものを使用した。
【００３６】
プライマーの配列は、以下の「表４」に示すとおりであり、sense_DIの5’端にNde I配列を、antisense_DIの5’端にBamH I配列をそれぞれ有している(下線部)ため、error-prone PCR産物をこれら制限酵素処理によりpET12aのマルチクローニングサイトに挿入することができる(野生型ジアホラーゼのクローニングと同様)。
【００３７】
【表４】
【００３８】
GeneMorph（登録商標）のマニュアルにしたがって、以下の「表５」に示すような反応液の調製、温調サイクルに基づいてPCRを行った。
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
（２-２）ベクターへのジアホラーゼ遺伝子の導入。
Error-prone PCR産物はアガロースゲル電気泳動に用いた分以外全量をNde IとBamH Iによる制限酵素処理に用いた。37℃で2時間反応を行ったのち、反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。一方、ベクターはpET12aをPCR産物同様、Nde IとBamH Iによる制限酵素処理した（37℃で2時間）。
【００４２】
これら制限酵素処理反応産物を低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、対応する開環状態のベクターDNAをQiaquickGel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。次いで、精製したベクターの制限酵素処理産物をアルカリフォスファターゼで処理することにより、5’末端を脱リン酸化した。反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。このようにして得られたerror-prone PCR産物（即ち、ジアホラーゼ変異体遺伝子ライブラリー）を制限酵素・脱リン酸化処理されたベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はLigation Kit Mighty Mix(タカラバイオ社)を使用した。反応生成物は、エタノール沈殿法により精製した。
【００４３】
（２-３）Competent Cellの作成と形質転換。
Competent Cellは自前で調製したBL21(DE3)のelectrocompetent cell (competency 〜108/ng)を用いた。40 μLのcompetent cell凍結サンプルを氷上にて融解し、1μg/μL程度の濃度のDNAサンプルを0.5μL混合し、0.1 cmギャップのelelctroporationcuvetteに全量をセットし、1800 kVの電圧を印加することにより形質転換した。これに960μLのSOC培地を加え、１時間37℃でしんとうして前培養を行い、この培養液を5〜50μL LB-amp寒天培地へ植菌し、37℃で一晩インキュベーションを行った。
【００４４】
（２-４）スクリーニング方法。
前記（２-３）で得られた寒天培地上のシングルコロニーをそれぞれ96ウェルプレートのLB-amp液体培地（150μL）に爪楊枝を使って植菌した。２ウェルを、野生型を産生する大腸菌株に当てた。ウェルプレート上面をガスパーマブル粘着シート(ABgene)でシールし、さらに付属のふたをして37℃で一晩（〜14時間）しんとう培養を行った。この培養液25μLずつを新しいウェルプレートで同量の0.2N NaOH aq(あらかじめ分注)とピペッティングによりよく混合した後プレートにふたをし、37℃で15分インキュベーション（インキュベーター）することにより溶菌した。
【００４５】
次に室温で100μLの0.1M K-pi, pH6.8を加え、液を中和した。このとき非加熱のコントロールサンプルとして野生型のサンプル２つのうち１つをマイクロチューブに取り分けて室温でとりおいた。プレートを市販のOPPテープでシールし、80℃で75分加熱処理を行い（恒温器）、室温に静置して冷まして取り分けておいた野生型のサンプルをプレートに戻した。各サンプルに10μLの20mM anthraquinone sulfonicacid(AQS) 20% DMSO溶液、直前に調製した80 mM NADH水溶液を50 μLを順次加え、プレートをOPPテープでシールしてvortex mixerで5秒攪拌した。顕色する様子をカメラで記録し、野生型サンプルと比
較して前記AQSの還元による発色が強いものを耐熱性候補として選択した。
【００４６】
（２-５）サンプル保存。
スクリーニングをくぐり抜けた検体については、96ウェルプレートに残っている培養液の一部を4.5mLのLB培地に植菌して１晩培養しプラスミドを精製し冷凍庫で保存した。また、別途4mLのLB培地に植菌してO.D.600が0.4程度にまで培養し、遠心分離により集菌し、2mLの2xYT培地に懸濁させて液体窒素により凍結して-80℃で保存した。
【００４７】
（２-６）ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製。
ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製は以前に報告した方法により行った。ただし、大量発現におけるE.coliの培養は1L LB-ampで行い、培養スケールに合わせて、その後の精製の各段階における容積等を調整した。
【００４８】
（２-７）活性評価試験。
Nicotinamide dinucleotide, reduced form (NADH)による2-amino-1,4-naphthoquinone(ANQ)の還元反応により、Nicotinamide dinucleotide, oxidized form (NAD+)及び2-amino-1,4-dihidroxynaphtheneを生じる反応の触媒反応速度（単位時間当たり1molの酵素が触媒する反応によって生じる生成物のmol数（したがって単位はsec-1））によりジアホラーゼの活性評価を行った。評価は以下の条件で行った。反応溶液は100mM K-pi, pH8.0で、[ANQ]=0.3 mM、[NADH]=40mM、[diaphorase]=48nMである。測定前にアルゴンバブリングにより十分除酸素を行い、反応は25℃、アルゴン雰囲気で行った。ジアホラーゼの添加により反応を開始し、反応進行を520ｎｍにおけるANQの吸光度(モル吸光係数680M-1cm-1)の減少によりモニターし、反応速度を算出した。
【００４９】
（２-８）耐熱性試験。
精製したジアホラーゼ変異体サンプルの5 0mM Tris-HCl, pH 7.8, 300 mM NaCl溶液を限外濾過法による濃縮／バッファー交換を行って、0.1 M K-pi, pH 8.0溶液とした。この溶液を適宜薄めてジアホラーゼの460 nm の吸光度が0.1となるように調製した(酵素濃度8.3μMの溶液となる)。この溶液をアルミブロックヒーター等で、80℃・10分インキュベートし、すぐに氷上で冷却し、十分冷ましてから活性測定を行った。また、前記インキュベーションを行わなかったサンプルで対照実験を行った。「酵素活性残存率」は、加熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、加熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した。
【００５０】
（２−９）結果。 総計約8000コロニーを上記の方法にそってスクリーニングにかけた。実際例としてウェルプレートの写真の一部を図２に示す。なお、図２には、スクリーニングにおける活性を維持しているジアホラーゼの検出例が示されており、矢印(Ａ、Ａ)がこのプレートで検出された耐熱性変異体候補の検体、対照実験として矢印(Ｂ)が野生型検体、矢印(Ｃ)が加熱処理を行っていない野生型検体をそれぞれ示している。
【００５１】
プレート間の誤差、株間のジアホラーゼ発現量の違いなど、可能性のある誤差を考慮して、選択された検体を一度にまとめて再スクリーニングを行った。即ち、凍結保存した大腸菌サンプルをLB寒天培地上に画線培養し、得られたコロニーを96ウェルプレートに植菌して同様に加熱実験を行った。但し、誤差を極力小さくするために、一つの検体につき、８つのコロニーを取り上げスクリーニングにかけた。
【００５２】
このダブルチェック実験の結果の写真の一部を図３に示す。この図３は、縦列に同一の変異体サンプルを配置し、参照として、列番号１１及び２４の上４ウェルが熱処理後の野生型、列番号１２及び２４の下４ウェルが熱処理を加えていない野生型サンプルである。この図３に示す写真の例では、列番号７、１４、１７、１９、２０、２１を陽性として、耐熱性変異体候補として選出した。
【００５３】
上で得た耐熱性ジアホラーゼ変異体候補について耐熱性試験を行った結果を表７から表１２に示す。
【００５４】
【表７】
【００５５】
【表８】
【００５６】
【表９】
【００５７】
【表１０】
【００５８】
【表１１】
【００５９】
【表１２】
【００６０】
その結果、例えば、配列番号２〜７、９、１２、１５、１６、１８、１９、２２、２５、２６、２９、３０、３２〜４０、４２〜５６などのアミノ酸配列からなる変異型ジアホラーゼでは、野生型（ＷＴ）と比較して、酵素活性（反応速度）が特に向上した。また、例えば、配列番号２、３、１８、２３、２６、２７、３２〜３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５〜４９、５１、５３〜５５などのアミノ酸配列からなる変異型タンパク質では、野生型（ＷＴ）と比較して、加熱処理後の酵素残存活性率が特に優れていた。
【００６１】
その他、本実験系では、目的とする耐熱性の向上したジアホラーゼ変異体を得ることに成功した。よって、今回用いたerror-prone PCRによるランダムミューテーションで生じさせた変異体ライブラリーの作成と熱処理によるスクリーニングのための方法が実際に有効であるということが確認できた。
【００６２】
（実施例３）
ジアホラーゼ耐熱性変異体に関する詳細な検討。
【００６３】
上記の研究によって得られた変異体のうち、野生型に比べて酵素活性が向上したＧ１２２Ｄについて、酵素反応速度論に基づいた検討を行った。
【００６４】
まず、NADH 40mM という条件においてANQの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。また、ANQ 2.2 mMという条件においてNADHの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。それらの結果はMichaelis-Mentenの式によく一致した。その式に基づいてkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)を求めた。
【００６５】
比較として野生型ジアホラーゼ（ＤＩ（ＤＨ“Ａｍａｎｏ”３）のkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)をあわせて示す。ジアホラーゼは、いわゆるping-pong型の反応形式をとる。ここで、kcatは触媒反応の単位時間当たりのターンオーバー数、KM(NADH)、KM(ANQ)はそれぞれの基質に対するMichaelis定数であり、酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のし易さを反映するファクターである。以上をまとめると、添付した図４（図面代用表）のようになる。
【００６６】
この結果から、変異体のミディエーターANQの結合部位が野生型に比べてより結合し易い性質を有することがわかり（図４のANQ関連表参照）、一方、NADHの結合サイトに関しては野生型と比較して特に変化がないか、むしろ低下していると考えられる（図４のNADH関連表参照）。したがって、これら変異体（変異型ジアホラーゼ）に置けるより高い触媒能は、基質ANQに対する親和性の獲得によるものと予測できる。
【００６７】
このことは、高濃度におけるより高い触媒活性を示さないが、低濃度において優位性を示すことを意味しており、例えば、酵素電池においてミディエーターANQの濃度をおさえることができるというメリットにつながると考えられる。
【００６８】
（実施例４）
分子動力学シミュレーションによる検討。
【００６９】
本実施例では、野生型ジアホラーゼ、変異型ジアホラーゼ（Ｇ１２２Ｄ（配列番号４）及びＲ１４７Ｈ（配列番号７））について、分子動力学シミュレーションにより、その立体構造を推定した。そして、野生型と変異型のポテンシャルエネルギーを計算、比較し、ポテンシャルエネルギーと耐熱性の関係について検討した。
【００７０】
分子動力学シミュレーションの計算方法及び計算モデルの概略を以下に示す。
【００７１】
このシミュレーションでは、市販のタンパク質モデリングソフトウエアである「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ（以下、「ＤＳ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ」とする。）」を用いた。力場を用いた計算及び解析には「ＤＳ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ １．６」を、それぞれ用いた。
【００７２】
初期構造はX線結晶構造解析で得られた構造（図５参照）を使用した。
【００７３】
次に、その初期構造について、ＣＨＡＲＭｍ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）力場を各原子に割り当て、分子力学計算による構造最適化を行った。ＣＨＡＲＭｍについては、次の参考文献に詳細な説明がなされている。「CHARMM: A Program for Macromolecular Energy Minimization, and Dynamics Calculations.」(Brooks et. al. 1983, Journal of Computational Chemistry, 4: 187-217)
【００７４】
構造の最適化は、まず、Ｓｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｃｅｎｔ法（最急降下法）で１０００ステップ（１ステップは１フェムト秒）、次に、Ａｄａｐｔｅｄ Ｂａｓｉｓ Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法で５０００ステップ、それぞれ計算を行うことにより行った。
【００７５】
次に、熱力学的条件を考慮するため、設定条件を５０Ｋから３００Ｋまで２０００ステップでもっていき、３００Ｋにおける構造を計算した。
【００７６】
次に、粒子数ｎ、体積Ｖ、温度Ｔを一定に設定し（ＮＶＴアンサンブル）、３００Ｋでの平衡化計算を１０００ステップ（１ステップは１フェムト秒）行った。
【００７７】
次に、ＭＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）計算を、ＮＶＴアンサンブルで、１００００００ステップ行い、各原子の運動を追跡してエネルギー解析を行った。
【００７８】
ここで、本発明で用いたＣＨＡＲＭｍ力場で定義されるポテンシャルエネルギーについて説明する。なお、詳細については上述の参考文献に記載されている。ＣＨＡＲＭｍ力場において、ポテンシャルエネルギー（Ｅtotal）は、次の式（１）によって示される。すなわち、ポテンシャルエネルギーは、結合伸縮ポテンシャル項（Ｅbond）、結合変角ポテンシャル項（Ｅangle）、ねじれ角ポテンシャル項（Ｅtorsion）、面外変形ポテンシャル項（Ｅimpr）、非結合ポテンシャル項（Ｅnonbond）の各関数の和として表される。
【００７９】
【数１】
【００８０】
さらに、各ポテンシャル関数は、式（２）〜（１０）によって記述される。
【００８１】
【数２】
【００８２】
各関数のパラメーターを以下に簡単に説明する。
（１） Ｅbond（Bond potential energy）
kb：力の定数、r：結合距離（r0は平衡値）
（２） Ｅθ（Bond angle potential energy）
kθ：力の定数、θ：結合角（θ0は平衡値）
（３） ＥUB（Urey-Bradley angle potential energy）
KUB：力の定数、S：非結合原子間距離（S0は平衡値）
（４） Ｅtorsion（Dihedral angle potential energy）
Kφ：ねじれ障壁、n：周期性、φ：ねじれ角、δ：位相
（５） Ｅimpr（Impoper tortion angle potential energy）
kω：力の定数、ω：二面角（ω0は平衡値）
（６） Ｅelec（Electrostatic energy）
q：電荷、ε：誘電率、rij：原子ｉとｊの距離
（７） Ｅwdw（van der Waals energy）
ε：原子対のポテンシャルの井戸の深さ、Rminij：原子ｉとｊのエネルギー最安定距離、rij：原子ｉとｊの距離
【００８３】
図５は、Ｘ線結晶構造解析で得られた野生型ジアホラーゼの構造を示す図面代用写真である。解析の結果、ジアホラーゼが２量体で存在することが明らかになった。図では、各サブユニットのＣ−Ｃ結合の色を、それぞれ緑と灰色で示した。
【００８４】
さらに解析により、この２量体のサブユニット間の界面には、２分子のＦＭＮが結合して、ジアホラーゼ２分子及びＦＭＮ２分子からなる複合体を形成していることも明らかになった。図中ＦＭＮはスペースフィルによって示した。
【００８５】
図６は、シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの立体構造の一部を示す図面代用写真である。この立体構造は、ＭＤ計算後の最終構造である。図６中「ＦＭＮ」はＦＭＮの位置を、「Ｒ１４７」及び「Ｇ１２２」はそれぞれ変異型タンパク質において置換したアミノ酸残基の位置を示す。
【００８６】
表１３に、野生型及び各変異型ジアホラーゼのポテンシャルエネルギーについて、先に説明した力場によってＭＤ計算を行った結果を示す。
【００８７】
【表１３】
【００８８】
野生型ジアホラーゼのポテンシャルエネルギー（-2688.9kcal/mol）に比べて、Ｇ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼではよりポテンシャルエネルギーが低かった（-2717.6kcal/mol）。逆に、Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼでは、野生型ジアホラーゼに比べてポテンシャルエネルギーが高くなっていた（-2591.7kcal/mol）。
【００８９】
ここで、上述実施例２の耐熱性試験による野生型及び各変異型ジアホラーゼの酵素残存活性率を表１３右欄に示す。
【００９０】
野生型ジアホラーゼの耐熱性（酵素残存活性率２３％）に比べて、Ｇ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼでは耐熱性が向上しており（同２８％）、逆に、Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼでは顕著に低下している（同４％）。
【００９１】
これらの結果は、ジアホラーゼの耐熱性がポテンシャルエネルギーに依存し、ポテンシャルエネルギーが小さいほどジアホラーゼの耐熱性が向上することを強く示唆している。
【００９２】
以上の知見により、ポテンシャルエネルギーを低くした変異型ジアホラーゼが、野生型ジアホラーゼに比して優位な耐熱性を示すことが明らかにされた。そして、このことは、種々のアミノ酸変異を導入した変異型タンパク質について、分子動力学シミュレーションを用いてポテンシャルエネルギーを計算し、ポテンシャルエネルギーが野生型ジアホラーゼよりも小さくなる変異体をスクリーニングすることにより、耐熱性を向上させた変異型ジアホラーゼを取得できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明に係るジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質は、例えば、NADHあるいはNADPHのアッセイキット、NADHあるいはNADPHのセンサー、NADHあるいはNADPHの測定方法、酵素を固定化して電極に用いた燃料電池、キノン類などの色素の還元反応触媒などの分野において利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】実施例２に係わる実験の流れ（ランダムミューテーションによるライブラリー作成とスクリーニング）を示す模式図である。
【図２】総計約8000コロニーをスクリーニングにかけたときのウェルプレートの写真（図面代用写真）の一部である。
【図３】ダブルチェック実験の結果のウェルプレート写真の一部である。
【図４】野生型とＧ１２２Ｄ変異型のジアホラーゼ酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のしやすさを反映するファクターをまとめた図面代用表である。
【図５】Ｘ線結晶構造解析で得られた野生型ジアホラーゼの構造を示す図面代用写真である。
【図６】シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの立体構造の一部を示す図面代用写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型ジアホラーゼに関する。より詳しくは、耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ジアホラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、生命の維持に係わる多くの反応を生体内の温和な条件下で円滑に進める生体内触媒である。この酵素は、生体内で代謝回転し、生体内で必要に応じて生産されて、その触媒機能を発揮する。
【０００３】
現在、この酵素を生体外で利用する技術が、既に実用化されたり、あるいは実用化に向けた検討が行われたりしている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野において、酵素の利用技術が進展している。比較的近年では、燃料電池の一種である酵素電池（例えば、特許文献１参照）、酵素電極、酵素センサー（酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー）などの技術も提案されている。
【０００４】
この酵素の化学的本体はタンパク質であるので、酵素は、熱やｐＨの程度によって変性する性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、環境の変化に対して酵素をより安定的に働かせて、その活性を持続させるようにすることが重要である。
【０００５】
酵素を生体外で利用する場合、酵素自体の性質や機能を人工的に改変させる方法や酵素の働く場所の環境を工夫する方法などのアプローチが採用されることになる。前者の方法では、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変化させ、この変化させた遺伝子を大腸菌等の生物の中で発現させることによって人工的に変異したタンパク質を作製し、そして、利用目的にあった機能や性質を備える変異型タンパク質を選別（スクリーニング）することが一般的に行われている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００４−７１５５９号公報。
【特許文献２】特開２００４−２９８１８５号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ジアホラーゼの生体外での広範な利用可能性を視野に入れ、耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ジアホラーゼを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼを提供する。
これらの変異型ジアホラーゼは、例えば、好熱性バチルス属細菌、特にバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来とすることができる。
また、本発明は、分子動力学シミュレーションを用いて、補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼをスクリーニングする方法をも提供するものである。
【０００８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【０００９】
「ジアホラーゼ（Diaphorase）」は、NADH又はNADPHをフェリシアン化カリウム、メチレンブルー、2,6-ジクロルインドフェノール、テトラゾリウム塩等の色素で酸化する反応を触媒する活性（即ち、ジアホラーゼ活性）を持つ酵素であり、細菌、酵母等の微生物から哺乳類動物まで広く分布する。このジアホラーゼは、生体内の電子伝達系において重要な役割を果たし、このジアホラーゼによって、NAD+又はNADP+依存性の脱水素酵素類による基質からの脱水素反応により生成されるNADH又はNADPHは、電子受容体で酸化され、電子受容体は還元型となる。
【００１０】
「フラビンモノヌクレオチド（Flavin Mononucleotide、以下「ＦＭＮ」という）」は、生体内においてフラビン酵素と呼ばれる酸化還元酵素の補酵素として働く。「補酵素」とは、酵素反応の化学基の授受に機能する低分子量の有機化合物をいう。補酵素とアポ酵素（補酵素を欠く酵素タンパク質部分）は、それぞれ単独では化学反応触媒として機能せず、両者が結合しホロ酵素となって、初めて酵素として機能する。ＦＭＮを補酵素とするフラビン酵素には、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素やグリコラートオキシダーゼなどが含まれる。
【００１１】
「変異型タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基の並び順を人工的に変えることにより得られた遺伝子から発現させたタンパク質である。より具体的には、野生型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００１２】
「分子動力学シミュレーション」とは、系(気体、液体、固体)を構成する原子個々の動きをコンピュータ上で再現するものである。原子、分子それぞれに対してニュートンの運動方程式を解くことにより、目的とする系の状態の時間発展をシミュレーションすることが可能である。これにより、タンパク質の高次構造について、実験では得られないような高い解像度で情報を得ることができる。本発明で用いた具体的なシミュレーション方法は、実施例４において詳しく説明するが、これに限定されず、一般に用いられているプログラム及び力場を用いてよい。
【００１３】
分子はできるだけエネルギー的に安定な状態（平衡状態）に戻ろうとするから、自然な結合状態からずれた状態ではエネルギー的に不安定で余分なエネルギーをもつことになる。このエネルギーを「ポテンシャルエネルギー」という。ポテンシャルエネルギーは、古典力学で表現される関数（ポテンシャル関数）として表される。分子動力学シミュレーションに用いられるポテンシャル関数は、プログラム及び力場に応じて異なる。本発明で用いたポテンシャル関数は、実施例４において詳しく説明する
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る変異型ジアホラーゼは、耐熱性の程度が所定レベル以上である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本願発明者は、今回新たに、ジアホラーゼが２量体で存在すること、さらにこの２量体のサブユニット間の界面に２分子のＦＭＮが結合して複合体を形成していることを見出した。そこで、種々の変異型ジアホラーゼについて、ＦＭＮとの複合体形成時のポテンシャルエネルギーと耐熱性について検討した結果、以下のような注目すべき事実を発見し、本願発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、ジアホラーゼの耐熱性はポテンシャルエネルギーに依存し、ポテンシャルエネルギーが小さいほどジアホラーゼの耐熱性が向上することを発見した。
【００１７】
以下実験データを参照しながら説明する。
【実施例】
【００１８】
（実施例１）
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ（Diaphorase）のクローニングと発現及び精製。
【００１９】
（１-１）Bacillus stearothermophilusからゲノムDNAの単離・精製。
Bacillus stearothermophilusは、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）から分譲を受けた（JCM No.2501,NCBIのdiaphorase geneのaccession number:AF112858）。Bacillus stearothermophilusの凍結乾燥体を寒天培地Ａ上、55℃で一晩培養した。
【００２０】
このようにして得られたコロニーを新しい寒天培地Ａ上にて同様に培養して、清浄なコロニーとして、ここから一部を取り出して液体培地Ａ中55℃で一晩培養した。遠心分離により集菌し、Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega社)を使用して、ゲノムDNAを単離した(方法の詳細は製品添付の取扱説明書)。なお、培地Ａの組成は次の「表１」のとおり(１Ｌ中、pH7.0-7.2に調整)。
【００２１】
【表１】
【００２２】
（１-２）ジアホラーゼ（Diaphorase）遺伝子のクローニング。
前記（１-１）で得られたゲノムDNAからPCRによりジアホラーゼ遺伝子を増幅した。DNA polymeraseにはPfu DNA polymerase (Stratagene社)を使用し、プライマーとしては、以下の「表２」の配列のものを使用した。なお、下線部は、Nde I配列（sense_DI）、BamH I配列（antisense_DI）を示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】
次に、ＰＣＲ産物のジアホラーゼ遺伝子をPCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製し、アガロース電気泳動により確認した。また、ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列の確認を行った。
【００２５】
（１-３）ジアホラーゼ遺伝子のベクターへの導入。
ジアホラーゼ遺伝子の増幅断片をBamH IとNde Iにより処理し、PCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製した。また、ベクターpET12a (Novagen社)をBamH IとNde Iにより処理し、同様に精製した。これら２種類の断片をT4 ligaseによりligationし、産物によってXL1-blue electrocompetent cell (Stratagene社)を形質転換してLB-amp培地で培養を行い、増産した。
【００２６】
得られたプラスミドをBss Iで処理し、アガロース電気泳動でジアホラーゼ遺伝子の挿入を確認し、塩基配列を解析した。すると、データベース(ＮＣＢＩ)の塩基配列との間に若干の差があった。これは、理化学研究所の微生物系統保存施設より取得した株とデータベースの株に若干の違いがあったために、クローニングしたDIとデータベースのDIの遺伝子配列に不一致があったためと思われる。遺伝型（塩基配列）については１１箇所、そのうち表現型（アミノ酸配列）において２残基にて不一致があった（表３参照）。
【００２７】
【表３】
【００２８】
そこで、この２箇所のアミノ酸残基をデータベースのもの同様に修正した遺伝子を、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を使って作成した。なお、この遺伝子を「pET12a-BsDI」と命名した。
【００２９】
（１-４）大腸菌の形質転換。
前記pET12a-BsDIをE. coli BL21 (DE3) (Novagen社)にヒートショック法により導入、形質転換を行った。SOC中で１hr、37℃で前培養後、LB-amp寒天培地に展開、コロニーの一部を液体培養し、ジアホラーゼの発現をSDS-PAGEで確認した。
【００３０】
（１-５）形質転換体の凍結保存サンプル。
前記（１-４）で得られた形質転換体培養液３ｍＬを遠心分離し、大腸菌ペレットに2xYT培地を加えて分散させて-80℃で保存した。
【００３１】
（１-６）大量培養とタンパク質精製。
BL21 (DE3)/pET12a-BsDIの凍結サンプルから、LB-amp agar培地に展開し、コロニーをピックアップして100mL LB-ampでOD600が１程度になるまで前培養し、これを18LのLB-ampに展開して、37℃でOD600が２程度で飽和するまでしんとう培養した。この培養液から菌体を遠心分離(5kG)により回収した（ウェットで収量20 g）。菌体ペレットを-80℃で凍結した後溶解し、0℃で200mLの50mM Tris-HCl, pH7.8, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF溶液中で超音波処理して溶菌し、遠心分離(9.5 kG)により溶液画分を回収した。
【００３２】
次に、硫安沈殿法による精製を行った。35%飽和溶液になるまで撹拌しながら徐々に粉状の硫酸アンモニウムを添加し、一晩静置した。沈殿物を遠心分離(9.5 kG)により取り除き、透析膜チューブを使って脱塩処理した（最終溶液：5 mM Tris-HCl, pH 7.8）。限外濾過法で濃縮したサンプル50 mLを陰イオン交換カラム(Sepharose Q FastFlow, Amersham Bioscience)にかけ、diaphorase含有画分を回収して限外濾過法で濃縮した(溶液量20 mL、Centriplus 遠心式フィルターユニット YM-30、Millipore)。次いで、このサンプルをゲル濾過カラム(Sephacryl S-200, AmershamBioscience)にかけ、diaphorase含有画分を集めた。
【００３３】
（実施例２）
Bacillus stearothermophilus由来のジアホラーゼのランダムミューテーションによる変異体ライブラリーの作成と耐熱性変異体のスクリーニング。
【００３４】
まず、本実施例２で行った実験の流れを図１に示す。Error-prone PCRによるdiaphoraseミュータントの遺伝子ライブラリー作成を行い、この遺伝子をベクターDNAに導入して大腸菌中で発現させた。このライブラリーを耐熱性スクリーニングにかけ、目的とする耐熱性diaphorase変異体を抽出した。
【００３５】
（２-１）GeneMorph（登録商標）によるError-Prone PCR。
「Error-prone PCR法」とは、PCRによるDNA断片複製反応の際に、DNA polymeraseが塩基配列の読み間違いを起こすことを利用して、複製されたDNA断片に変異をランダムに起こす方法である。種々の方法が報告されているが、ここでは製品化されているものの中から、Stratagene社のGeneMorph（登録商標）を選択した。Template DNAは、Bacillus stearothermophilusのジアホラーゼ遺伝子を組み込んだ上記pET12a-BsDIを用いた。プライマーもこの遺伝子のクローニングに用いたものを使用した。
【００３６】
プライマーの配列は、以下の「表４」に示すとおりであり、sense_DIの5’端にNde I配列を、antisense_DIの5’端にBamH I配列をそれぞれ有している(下線部)ため、error-prone PCR産物をこれら制限酵素処理によりpET12aのマルチクローニングサイトに挿入することができる(野生型ジアホラーゼのクローニングと同様)。
【００３７】
【表４】
【００３８】
GeneMorph（登録商標）のマニュアルにしたがって、以下の「表５」に示すような反応液の調製、温調サイクルに基づいてPCRを行った。
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
（２-２）ベクターへのジアホラーゼ遺伝子の導入。
Error-prone PCR産物はアガロースゲル電気泳動に用いた分以外全量をNde IとBamH Iによる制限酵素処理に用いた。37℃で2時間反応を行ったのち、反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。一方、ベクターはpET12aをPCR産物同様、Nde IとBamH Iによる制限酵素処理した（37℃で2時間）。
【００４２】
これら制限酵素処理反応産物を低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、対応する開環状態のベクターDNAをQiaquickGel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。次いで、精製したベクターの制限酵素処理産物をアルカリフォスファターゼで処理することにより、5’末端を脱リン酸化した。反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。このようにして得られたerror-prone PCR産物（即ち、ジアホラーゼ変異体遺伝子ライブラリー）を制限酵素・脱リン酸化処理されたベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はLigation Kit Mighty Mix(タカラバイオ社)を使用した。反応生成物は、エタノール沈殿法により精製した。
【００４３】
（２-３）Competent Cellの作成と形質転換。
Competent Cellは自前で調製したBL21(DE3)のelectrocompetent cell (competency 〜108/ng)を用いた。40 μLのcompetent cell凍結サンプルを氷上にて融解し、1μg/μL程度の濃度のDNAサンプルを0.5μL混合し、0.1 cmギャップのelelctroporationcuvetteに全量をセットし、1800 kVの電圧を印加することにより形質転換した。これに960μLのSOC培地を加え、１時間37℃でしんとうして前培養を行い、この培養液を5〜50μL LB-amp寒天培地へ植菌し、37℃で一晩インキュベーションを行った。
【００４４】
（２-４）スクリーニング方法。
前記（２-３）で得られた寒天培地上のシングルコロニーをそれぞれ96ウェルプレートのLB-amp液体培地（150μL）に爪楊枝を使って植菌した。２ウェルを、野生型を産生する大腸菌株に当てた。ウェルプレート上面をガスパーマブル粘着シート(ABgene)でシールし、さらに付属のふたをして37℃で一晩（〜14時間）しんとう培養を行った。この培養液25μLずつを新しいウェルプレートで同量の0.2N NaOH aq(あらかじめ分注)とピペッティングによりよく混合した後プレートにふたをし、37℃で15分インキュベーション（インキュベーター）することにより溶菌した。
【００４５】
次に室温で100μLの0.1M K-pi, pH6.8を加え、液を中和した。このとき非加熱のコントロールサンプルとして野生型のサンプル２つのうち１つをマイクロチューブに取り分けて室温でとりおいた。プレートを市販のOPPテープでシールし、80℃で75分加熱処理を行い（恒温器）、室温に静置して冷まして取り分けておいた野生型のサンプルをプレートに戻した。各サンプルに10μLの20mM anthraquinone sulfonicacid(AQS) 20% DMSO溶液、直前に調製した80 mM NADH水溶液を50 μLを順次加え、プレートをOPPテープでシールしてvortex mixerで5秒攪拌した。顕色する様子をカメラで記録し、野生型サンプルと比
較して前記AQSの還元による発色が強いものを耐熱性候補として選択した。
【００４６】
（２-５）サンプル保存。
スクリーニングをくぐり抜けた検体については、96ウェルプレートに残っている培養液の一部を4.5mLのLB培地に植菌して１晩培養しプラスミドを精製し冷凍庫で保存した。また、別途4mLのLB培地に植菌してO.D.600が0.4程度にまで培養し、遠心分離により集菌し、2mLの2xYT培地に懸濁させて液体窒素により凍結して-80℃で保存した。
【００４７】
（２-６）ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製。
ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製は以前に報告した方法により行った。ただし、大量発現におけるE.coliの培養は1L LB-ampで行い、培養スケールに合わせて、その後の精製の各段階における容積等を調整した。
【００４８】
（２-７）活性評価試験。
Nicotinamide dinucleotide, reduced form (NADH)による2-amino-1,4-naphthoquinone(ANQ)の還元反応により、Nicotinamide dinucleotide, oxidized form (NAD+)及び2-amino-1,4-dihidroxynaphtheneを生じる反応の触媒反応速度（単位時間当たり1molの酵素が触媒する反応によって生じる生成物のmol数（したがって単位はsec-1））によりジアホラーゼの活性評価を行った。評価は以下の条件で行った。反応溶液は100mM K-pi, pH8.0で、[ANQ]=0.3 mM、[NADH]=40mM、[diaphorase]=48nMである。測定前にアルゴンバブリングにより十分除酸素を行い、反応は25℃、アルゴン雰囲気で行った。ジアホラーゼの添加により反応を開始し、反応進行を520ｎｍにおけるANQの吸光度(モル吸光係数680M-1cm-1)の減少によりモニターし、反応速度を算出した。
【００４９】
（２-８）耐熱性試験。
精製したジアホラーゼ変異体サンプルの5 0mM Tris-HCl, pH 7.8, 300 mM NaCl溶液を限外濾過法による濃縮／バッファー交換を行って、0.1 M K-pi, pH 8.0溶液とした。この溶液を適宜薄めてジアホラーゼの460 nm の吸光度が0.1となるように調製した(酵素濃度8.3μMの溶液となる)。この溶液をアルミブロックヒーター等で、80℃・10分インキュベートし、すぐに氷上で冷却し、十分冷ましてから活性測定を行った。また、前記インキュベーションを行わなかったサンプルで対照実験を行った。「酵素活性残存率」は、加熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、加熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した。
【００５０】
（２−９）結果。 総計約8000コロニーを上記の方法にそってスクリーニングにかけた。実際例としてウェルプレートの写真の一部を図２に示す。なお、図２には、スクリーニングにおける活性を維持しているジアホラーゼの検出例が示されており、矢印(Ａ、Ａ)がこのプレートで検出された耐熱性変異体候補の検体、対照実験として矢印(Ｂ)が野生型検体、矢印(Ｃ)が加熱処理を行っていない野生型検体をそれぞれ示している。
【００５１】
プレート間の誤差、株間のジアホラーゼ発現量の違いなど、可能性のある誤差を考慮して、選択された検体を一度にまとめて再スクリーニングを行った。即ち、凍結保存した大腸菌サンプルをLB寒天培地上に画線培養し、得られたコロニーを96ウェルプレートに植菌して同様に加熱実験を行った。但し、誤差を極力小さくするために、一つの検体につき、８つのコロニーを取り上げスクリーニングにかけた。
【００５２】
このダブルチェック実験の結果の写真の一部を図３に示す。この図３は、縦列に同一の変異体サンプルを配置し、参照として、列番号１１及び２４の上４ウェルが熱処理後の野生型、列番号１２及び２４の下４ウェルが熱処理を加えていない野生型サンプルである。この図３に示す写真の例では、列番号７、１４、１７、１９、２０、２１を陽性として、耐熱性変異体候補として選出した。
【００５３】
上で得た耐熱性ジアホラーゼ変異体候補について耐熱性試験を行った結果を表７から表１２に示す。
【００５４】
【表７】
【００５５】
【表８】
【００５６】
【表９】
【００５７】
【表１０】
【００５８】
【表１１】
【００５９】
【表１２】
【００６０】
その結果、例えば、配列番号２〜７、９、１２、１５、１６、１８、１９、２２、２５、２６、２９、３０、３２〜４０、４２〜５６などのアミノ酸配列からなる変異型ジアホラーゼでは、野生型（ＷＴ）と比較して、酵素活性（反応速度）が特に向上した。また、例えば、配列番号２、３、１８、２３、２６、２７、３２〜３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５〜４９、５１、５３〜５５などのアミノ酸配列からなる変異型タンパク質では、野生型（ＷＴ）と比較して、加熱処理後の酵素残存活性率が特に優れていた。
【００６１】
その他、本実験系では、目的とする耐熱性の向上したジアホラーゼ変異体を得ることに成功した。よって、今回用いたerror-prone PCRによるランダムミューテーションで生じさせた変異体ライブラリーの作成と熱処理によるスクリーニングのための方法が実際に有効であるということが確認できた。
【００６２】
（実施例３）
ジアホラーゼ耐熱性変異体に関する詳細な検討。
【００６３】
上記の研究によって得られた変異体のうち、野生型に比べて酵素活性が向上したＧ１２２Ｄについて、酵素反応速度論に基づいた検討を行った。
【００６４】
まず、NADH 40mM という条件においてANQの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。また、ANQ 2.2 mMという条件においてNADHの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。それらの結果はMichaelis-Mentenの式によく一致した。その式に基づいてkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)を求めた。
【００６５】
比較として野生型ジアホラーゼ（ＤＩ（ＤＨ“Ａｍａｎｏ”３）のkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)をあわせて示す。ジアホラーゼは、いわゆるping-pong型の反応形式をとる。ここで、kcatは触媒反応の単位時間当たりのターンオーバー数、KM(NADH)、KM(ANQ)はそれぞれの基質に対するMichaelis定数であり、酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のし易さを反映するファクターである。以上をまとめると、添付した図４（図面代用表）のようになる。
【００６６】
この結果から、変異体のミディエーターANQの結合部位が野生型に比べてより結合し易い性質を有することがわかり（図４のANQ関連表参照）、一方、NADHの結合サイトに関しては野生型と比較して特に変化がないか、むしろ低下していると考えられる（図４のNADH関連表参照）。したがって、これら変異体（変異型ジアホラーゼ）に置けるより高い触媒能は、基質ANQに対する親和性の獲得によるものと予測できる。
【００６７】
このことは、高濃度におけるより高い触媒活性を示さないが、低濃度において優位性を示すことを意味しており、例えば、酵素電池においてミディエーターANQの濃度をおさえることができるというメリットにつながると考えられる。
【００６８】
（実施例４）
分子動力学シミュレーションによる検討。
【００６９】
本実施例では、野生型ジアホラーゼ、変異型ジアホラーゼ（Ｇ１２２Ｄ（配列番号４）及びＲ１４７Ｈ（配列番号７））について、分子動力学シミュレーションにより、その立体構造を推定した。そして、野生型と変異型のポテンシャルエネルギーを計算、比較し、ポテンシャルエネルギーと耐熱性の関係について検討した。
【００７０】
分子動力学シミュレーションの計算方法及び計算モデルの概略を以下に示す。
【００７１】
このシミュレーションでは、市販のタンパク質モデリングソフトウエアである「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ（以下、「ＤＳ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ」とする。）」を用いた。力場を用いた計算及び解析には「ＤＳ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ １．６」を、それぞれ用いた。
【００７２】
初期構造はX線結晶構造解析で得られた構造（図５参照）を使用した。
【００７３】
次に、その初期構造について、ＣＨＡＲＭｍ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）力場を各原子に割り当て、分子力学計算による構造最適化を行った。ＣＨＡＲＭｍについては、次の参考文献に詳細な説明がなされている。「CHARMM: A Program for Macromolecular Energy Minimization, and Dynamics Calculations.」(Brooks et. al. 1983, Journal of Computational Chemistry, 4: 187-217)
【００７４】
構造の最適化は、まず、Ｓｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｃｅｎｔ法（最急降下法）で１０００ステップ（１ステップは１フェムト秒）、次に、Ａｄａｐｔｅｄ Ｂａｓｉｓ Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法で５０００ステップ、それぞれ計算を行うことにより行った。
【００７５】
次に、熱力学的条件を考慮するため、設定条件を５０Ｋから３００Ｋまで２０００ステップでもっていき、３００Ｋにおける構造を計算した。
【００７６】
次に、粒子数ｎ、体積Ｖ、温度Ｔを一定に設定し（ＮＶＴアンサンブル）、３００Ｋでの平衡化計算を１０００ステップ（１ステップは１フェムト秒）行った。
【００７７】
次に、ＭＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）計算を、ＮＶＴアンサンブルで、１００００００ステップ行い、各原子の運動を追跡してエネルギー解析を行った。
【００７８】
ここで、本発明で用いたＣＨＡＲＭｍ力場で定義されるポテンシャルエネルギーについて説明する。なお、詳細については上述の参考文献に記載されている。ＣＨＡＲＭｍ力場において、ポテンシャルエネルギー（Ｅtotal）は、次の式（１）によって示される。すなわち、ポテンシャルエネルギーは、結合伸縮ポテンシャル項（Ｅbond）、結合変角ポテンシャル項（Ｅangle）、ねじれ角ポテンシャル項（Ｅtorsion）、面外変形ポテンシャル項（Ｅimpr）、非結合ポテンシャル項（Ｅnonbond）の各関数の和として表される。
【００７９】
【数１】
【００８０】
さらに、各ポテンシャル関数は、式（２）〜（１０）によって記述される。
【００８１】
【数２】
【００８２】
各関数のパラメーターを以下に簡単に説明する。
（１） Ｅbond（Bond potential energy）
kb：力の定数、r：結合距離（r0は平衡値）
（２） Ｅθ（Bond angle potential energy）
kθ：力の定数、θ：結合角（θ0は平衡値）
（３） ＥUB（Urey-Bradley angle potential energy）
KUB：力の定数、S：非結合原子間距離（S0は平衡値）
（４） Ｅtorsion（Dihedral angle potential energy）
Kφ：ねじれ障壁、n：周期性、φ：ねじれ角、δ：位相
（５） Ｅimpr（Impoper tortion angle potential energy）
kω：力の定数、ω：二面角（ω0は平衡値）
（６） Ｅelec（Electrostatic energy）
q：電荷、ε：誘電率、rij：原子ｉとｊの距離
（７） Ｅwdw（van der Waals energy）
ε：原子対のポテンシャルの井戸の深さ、Rminij：原子ｉとｊのエネルギー最安定距離、rij：原子ｉとｊの距離
【００８３】
図５は、Ｘ線結晶構造解析で得られた野生型ジアホラーゼの構造を示す図面代用写真である。解析の結果、ジアホラーゼが２量体で存在することが明らかになった。図では、各サブユニットのＣ−Ｃ結合の色を、それぞれ緑と灰色で示した。
【００８４】
さらに解析により、この２量体のサブユニット間の界面には、２分子のＦＭＮが結合して、ジアホラーゼ２分子及びＦＭＮ２分子からなる複合体を形成していることも明らかになった。図中ＦＭＮはスペースフィルによって示した。
【００８５】
図６は、シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの立体構造の一部を示す図面代用写真である。この立体構造は、ＭＤ計算後の最終構造である。図６中「ＦＭＮ」はＦＭＮの位置を、「Ｒ１４７」及び「Ｇ１２２」はそれぞれ変異型タンパク質において置換したアミノ酸残基の位置を示す。
【００８６】
表１３に、野生型及び各変異型ジアホラーゼのポテンシャルエネルギーについて、先に説明した力場によってＭＤ計算を行った結果を示す。
【００８７】
【表１３】
【００８８】
野生型ジアホラーゼのポテンシャルエネルギー（-2688.9kcal/mol）に比べて、Ｇ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼではよりポテンシャルエネルギーが低かった（-2717.6kcal/mol）。逆に、Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼでは、野生型ジアホラーゼに比べてポテンシャルエネルギーが高くなっていた（-2591.7kcal/mol）。
【００８９】
ここで、上述実施例２の耐熱性試験による野生型及び各変異型ジアホラーゼの酵素残存活性率を表１３右欄に示す。
【００９０】
野生型ジアホラーゼの耐熱性（酵素残存活性率２３％）に比べて、Ｇ１２２Ｄ変異型ジアホラーゼでは耐熱性が向上しており（同２８％）、逆に、Ｒ１４７Ｈ変異型ジアホラーゼでは顕著に低下している（同４％）。
【００９１】
これらの結果は、ジアホラーゼの耐熱性がポテンシャルエネルギーに依存し、ポテンシャルエネルギーが小さいほどジアホラーゼの耐熱性が向上することを強く示唆している。
【００９２】
以上の知見により、ポテンシャルエネルギーを低くした変異型ジアホラーゼが、野生型ジアホラーゼに比して優位な耐熱性を示すことが明らかにされた。そして、このことは、種々のアミノ酸変異を導入した変異型タンパク質について、分子動力学シミュレーションを用いてポテンシャルエネルギーを計算し、ポテンシャルエネルギーが野生型ジアホラーゼよりも小さくなる変異体をスクリーニングすることにより、耐熱性を向上させた変異型ジアホラーゼを取得できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明に係るジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質は、例えば、NADHあるいはNADPHのアッセイキット、NADHあるいはNADPHのセンサー、NADHあるいはNADPHの測定方法、酵素を固定化して電極に用いた燃料電池、キノン類などの色素の還元反応触媒などの分野において利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】実施例２に係わる実験の流れ（ランダムミューテーションによるライブラリー作成とスクリーニング）を示す模式図である。
【図２】総計約8000コロニーをスクリーニングにかけたときのウェルプレートの写真（図面代用写真）の一部である。
【図３】ダブルチェック実験の結果のウェルプレート写真の一部である。
【図４】野生型とＧ１２２Ｄ変異型のジアホラーゼ酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のしやすさを反映するファクターをまとめた図面代用表である。
【図５】Ｘ線結晶構造解析で得られた野生型ジアホラーゼの構造を示す図面代用写真である。
【図６】シミュレーションにより得られた野生型ジアホラーゼの立体構造の一部を示す図面代用写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼ。
【請求項２】
前記ポテンシャルエネルギーが、−２６８８kcal/molよりも小さいことを特徴とする請求項１記載の変異型ジアホラーゼ。
【請求項３】
好熱性バチルス属細菌由来の請求項１記載の変異型ジアホラーゼ。
【請求項４】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来の請求項３記載の変異型ジアホラーゼ。
【請求項５】
分子動力学シミュレーションを用いて、
補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼをスクリーニングする方法。
【請求項１】
補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼ。
【請求項２】
前記ポテンシャルエネルギーが、−２６８８kcal/molよりも小さいことを特徴とする請求項１記載の変異型ジアホラーゼ。
【請求項３】
好熱性バチルス属細菌由来の請求項１記載の変異型ジアホラーゼ。
【請求項４】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来の請求項３記載の変異型ジアホラーゼ。
【請求項５】
分子動力学シミュレーションを用いて、
補酵素フラビンモノヌクレオチドとの複合体形成時において、配列番号１の野生型ジアホラーゼよりも小さいポテンシャルエネルギーをとりうる変異型ジアホラーゼをスクリーニングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２８９４１９（Ｐ２００８−２８９４１９Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３８６４３（Ｐ２００７−１３８６４３）
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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