スタヒロコッカス・アウレウスＯＲＦ０６５７Ｎを標的とする抗原結合性タンパク質
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御をもたらすために標的化されうるエピトープを有することが判明している領域に結合する抗原結合性タンパク質に関する。該領域は本明細書においては「ＣＳ−Ｄ７」標的領域と称される。ＣＳ−Ｄ７標的領域は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の可能性または重症度を減少させるために標的化されうるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎエピトープを与える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウスＯＲＦ０６５７ｎを標的とする抗原結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の全体にわたって引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であると自認するものではない。
【０００３】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、多種多様な疾患および状態を引き起こす病原体である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる疾患および状態の具体例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、インペチゴ、水疱性インペチゴ、フレグモーネ、ボトリオミセス症、毒性ショック症候群、火傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性および炎症性眼疾患、骨髄炎ならびに関節および骨の他の感染症、ならびに気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【０００４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の広がりを抑制するためには、免疫学に基づく方法が用いられうる。免疫学に基づく方法には受動免疫化および能動免疫化が含まれる。受動免疫化は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を標的とする免疫グロブリンを使用する。能動免疫化はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７
【発明の概要】
【０００６】
発明の摘要
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御をもたらすために標的化されうるエピトープを有することが判明している領域に結合する抗原結合性タンパク質に関する。該領域は本明細書においては「ＣＳ−Ｄ７」標的領域と称される。ＣＳ−Ｄ７標的領域は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の可能性または重症度を減少させるために標的化されうるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎエピトープを与える。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、第１可変領域および第２可変領域を含んでなる単離された抗原結合性タンパク質に関する。これらの可変領域はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する。ＣＳ−Ｄ７標的領域はモノクローナル抗体ＣＳ−Ｄ７（ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７）により特異的に標的化される。ＭＡｂ ＣＳ−Ｄ７は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する２本の重鎖とを有する免疫グロブリンである。
【０００８】
「単離（された）」なる語は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。そのような異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度および／または天然で見出されない構造体でありうる。天然で見出されない構造体には、異なる領域が一緒になった組換え構造体、例えば、１以上のマウス相補性決定領域がヒトフレームワークスカフォールド上に挿入された又はヒト抗体の表面残基を模倣するためにマウス抗体の表面が修飾されたヒト化抗体、抗原結合性タンパク質由来の１以上の相補性決定領域が別のフレームワークスカフォールド内に挿入されたハイブリッド抗体、ならびに軽可変ドメインおよび重可変ドメインをコードする遺伝子が互いにランダムに組合された天然ヒト配列に由来する抗体が含まれる。
【０００９】
単離されたタンパク質は、好ましくは、血清タンパク質を実質的に含有しない。血清タンパク質を実質的に含有しないタンパク質は、ほとんど又は全ての血清タンパク質を欠く環境中に存在する。
【００１０】
「可変領域」は重鎖または軽鎖からの抗体可変領域の構造を有する。抗体重鎖および軽鎖の可変領域は、フレームワーク上に間隔をあけて存在する３つの相補性決定領域を含有する。該相補性決定領域は主として、特定のエピトープの認識をもたらす。
【００１１】
標的領域は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７が結合するＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号４７）に関して定義される。ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合するタンパク質は、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく抑制アッセイを用いて過剰量および等量の該競合タンパク質およびモノクローナル抗体を使用した場合、ＯＲＦ０６５７ｎへのｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の結合を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％軽減する。
【００１２】
「タンパク質」なる語は連続的アミノ酸配列を示し、最小または最大サイズ限界を示すものではない。該タンパク質中に存在する１以上のアミノ酸はグリコシル化またはジスルフィド結合形成のような翻訳後修飾を含有しうる。
【００１３】
好ましい抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」なる語は、同じ又は実質的に同じ構造を有する一群の抗体を示す。モノクローナル抗体における変異は、該抗体が同一構築物から製造された場合に生じるものである。
【００１４】
モノクローナル抗体は、例えば、特定のハイブリドーマから、および該抗体をコードする１以上の組換え遺伝子を含有する組換え細胞から製造されうる。該抗体は２以上の組換え遺伝子によりコードされることが可能であり、この場合、１つの遺伝子は重鎖をコードし、１つの遺伝子は軽鎖をコードする。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域またはＶｌ領域の一方または両方をコードする１以上の組換え遺伝子を含む核酸を記載し、ここで、該抗原結合性タンパク質はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する。例えば、１つの遺伝子が抗体重鎖、またはＶｈ領域を含有するそのフラグメントをコードし、もう１つの遺伝子が抗体軽鎖、またはＶｌ領域を含有するそのフラグメントをコードする、複数の組換え遺伝子が有用である。
【００１６】
組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にタンパク質をコードする組換え核酸を含有する。該組換え核酸は、その配列および／または形態の点で、天然では見出されない。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸を与える一緒になった２以上の核酸領域、互いに天然で付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域またはＶｌ領域の一方または両方をコードする１以上の組換え遺伝子を含む組換え細胞に関する。好ましくは、該組換え細胞はＶｈおよびＶｌ領域の両方を発現する。
【００１８】
本発明のもう１つの態様は、抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法を含む。該方法は、（ａ）該タンパク質が発現される条件下、該タンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え細胞を増殖させ、（ｂ）該タンパク質を精製する工程を含む。好ましくは、該タンパク質は完全な抗原結合性タンパク質である。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は医薬組成物を記載する。該組成物は、本明細書に記載されている抗原結合性タンパク質の治療的有効量および医薬上許容される担体を含む。
【００２０】
治療的有効量は、有用な治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者の場合、有効量は、以下の効果の１以上を達成するのに十分な量である：該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖能の軽減、または該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の量の減少。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していない患者の場合、有効量は、以下の１以上を達成するのに十分な量である：スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する感受性の軽減、または慢性疾患を招く持続感染を該感染細菌が確立する能力の軽減。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を（治療的または予防的に）治療するための医薬の製造における、抗原結合性タンパク質の治療的有効量の使用を記載する。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する患者の治療方法に関する。該方法は、本明細書に記載の抗原結合性タンパク質（その医薬組成物を含む）の有効量を患者に投与する工程を含む。治療される患者はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していても感染していなくてもよい。好ましくは、患者はヒトである。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、配列番号４７のアミノ酸４２−３４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（該ポリペプチドは３５０アミノ酸長以下である）に関する。
【００２４】
「含む（含んでなる）」のような非限定的用語に対する言及は追加的な要素または工程を許容する。場合によっては、「１以上」のような表現は、追加的な要素または工程の可能性を強調するために非限定的用語と共に又はそれを伴わずに用いられる。
【００２５】
明示的に示されていない限り、単数表現は単数を示すと限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外するものではない。場合によっては、可能な複数の存在を強調するために、１以上のような表現が用いられる。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例（具体例）を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例（具体例）は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の抗原結合性タンパク質は、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合するそれらの能力により、例えば、ＯＲＦ０６５７ｎに基づく抗原の製造、特徴づけ若しくは研究における手段として、および／またはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための物質として使用されうる。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の種々の株において良く保存されていることが判明している（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答を引き起こすために、種々のＯＲＦ０６５７ｎ誘導体が使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。
【００２８】
Ｉ．抗原結合性タンパク質
抗原結合性タンパク質は、エピトープへの特異的結合をもたらす抗体可変領域を含有する。該抗体可変領域は、例えば、完全抗体、抗体フラグメント、および抗体または抗体フラグメントの組換え誘導体において存在しうる。
【００２９】
抗体は、そのクラスによって異なる構造を有する。ＩｇＧに関して、種々の抗体領域が例示されうる（図１）。ＩｇＧ分子は４つのアミノ酸鎖（２つの、より長い重鎖、および２つの、より短い軽鎖）を含有する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域および可変領域を含有する。可変領域内には、抗原特異性をもたらす３つの超可変領域が存在する（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．およびＳｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。
【００３０】
超可変領域（相補性決定領域とも称される）は、より保存されたフランキング領域（フレームワーク領域とも称される）の間に介在している。フレームワーク領域および相補性決定領域に関連したアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているとおりに番号付けされ、整列（アライン）されうる。
【００３１】
２つの重鎖カルボキシル領域は、Ｆｃ領域を形成するようジスルフィド結合により連結された定常領域である。Ｆｃ領域はエフェクター機能をもたらすのに重要である（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６）。Ｆｃ領域を構成する２つの重鎖のそれぞれはヒンジ領域を介して異なるＦａｂ領域へと伸長している。
【００３２】
高等脊椎動物においては、２つのクラスの軽鎖および５つのクラスの重鎖が存在する。軽鎖はκまたはλである。重鎖は抗体クラスを定め、α、δ、ε、γまたはμである。例えば、ＩｇＧはγ重鎖を有する。異なるタイプの重鎖に関しては、ヒトγ１、γ２、γ３およびγ４のようなサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジおよびテイル（尾）領域に、特徴的なコンホメーションをもたらす（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
【００３３】
抗体可変領域を含有する抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域および定常領域から構成される軽鎖と、可変領域および定常領域を含有する重鎖領域とを含有する。軽鎖は定常領域を介してジスルフィド結合により重鎖に連結される。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を与える。
【００３４】
抗体可変領域は組換え誘導体中に存在しうる。組換え誘導体の具体例には、一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）が含まれる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００３５】
該抗原結合性タンパク質は、同じ又は異なるエピトープを認識する１以上の可変領域を含有しうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００３６】
ＩＩ．ＣＳ−Ｄ７標的領域に対する抗原結合性タンパク質の作製
ＣＳ−Ｄ７標的領域に対する抗原結合性タンパク質は、種々の技術（例えば、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する抗原結合性タンパク質を利用し、該標的領域に結合する追加的な結合性タンパク質に関してスクリーニングするもの）を用いて得られうる。ＣＳ−Ｄ７標的領域への抗体の結合能は、ＬｕｍｉｎｅｘアッセイおよびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７を用いて評価されうる（後記実施例２を参照されたい）。ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する抗原結合性タンパク質は、追加的な結合性タンパク質を得るための種々の方法（例えば、該抗原結合性タンパク質からの配列情報を用いる、および／または該抗原結合性タンパク質を修飾するもの）において使用されうる。
【００３７】
ＩＩ．Ａ．可変領域の設計
抗原結合性タンパク質に対する可変領域は、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する可変領域に基づいて設計されうる。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイに基づいて、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２と称されるｍＡｂは同一領域に結合することが判明した。図２は、これらの異なる抗体に関する軽鎖可変領域の配列比較を示す。図３は、これらの異なる抗体に関する、異なる重鎖可変領域の配列比較を示す。
【００３８】
図２および３における配列比較は、抗原結合性タンパク質に関する種々の可変領域ＣＤＲおよびフレームワーク配列の具体例を示す。図２および３に示す抗体可変領域は末梢血リンパ球ライブラリー（「ＢＭＶ」と称される）または脾臓リンパ球（「ＣＳ」と称される）のいずれかから誘導された。
【００３９】
ＣＤＲは、主として、個々のエピトープへの結合をもたらす。個々のＣＤＲ内には、エピトープへの結合に非常に重要な少数の特異性決定残基（ＳＤＲ）が存在する（Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６）。ＳＤＲは、例えば、抗原−抗体三次元構造および抗体結合部位の突然変異分析の助けにより特定されうる（Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４，２００５）。
【００４０】
フレームワーク領域は全体構造を与えるのを助け、ＣＤＲと比べて種々のアミノ酸変異に対する許容性がある。多種多様な天然に存在するフレームワーク領域が当技術分野でよく知られている（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）。
【００４１】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２の可変領域ならびに対応するＣＤＲ配列番号が図２および３の配列比較において示されている。表１はＣＤＲ配列番号の要約を示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
図２および３に例示されている配列比較はフレームワークおよびＣＤＲ領域内の種々のアミノ酸置換の具体例を示す。改変はフレームワーク領域およびＣＤＲの両方に施されることが可能であり、ＣＳ−Ｄ７結合領域に対する特異性を尚も保有する。
【００４４】
ＩＩ．Ｂ．追加的結合性タンパク質に関するスクリーニング
ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする追加的結合性タンパク質は、完全長ＯＲＦ０６５７ｎを使用して、またはｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により認識されるエピトープを与えるポリペプチドを使用して得られうる。ＣＳ−Ｄ７標的領域はＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号４７）のアミノ酸約４２−３４２内に位置するらしい。
【００４５】
抗原を認識するタンパク質を選択するためには、種々の技術が利用可能である。そのような技術の具体例には、ファージ提示技術およびハイブリドーマ産生の利用が含まれる。ヒト抗体は、ヒトファージ提示ライブラリーから出発して、あるいはゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）またはトランスクロモ（Ｔｒａｎｓ−Ｃｈｒｏｍｏ）マウスのようなキメラマウスを使用して製造されうる（例えば、Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。
【００４６】
非ヒト抗体、例えばマウス抗体も入手可能である。ヒト抗マウス抗体の潜在的生成は、マウス抗体のヒト化、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）およびキメラ抗体産生の技術を用いて軽減されうる（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｐ８１−１００，Ｆｒｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４；Ｇｏｎｚａｌｅｓら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２６：３１−４３，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５，Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４，２００４を参照されたい）。
【００４７】
抗原結合性タンパク質が標的に選択的に結合する能力を更に増強するために、アフィニティ成熟のような技術も用いられうる。アフィニティ成熟は、例えば、ＣＤＲ領域内に突然変異を導入し、結合に対する該突然変異の効果を判定することにより行われうる。該突然変異を導入するためには、種々の技術が用いられうる（Ｒａｊｐａｌら，ＰＮＡＳ １０２：８４６６−８４７１，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６）。
【００４８】
ＩＩ．Ｃ．追加的成分
抗原結合性タンパク質は、可変領域以外の成分、または有用な活性を付与する若しくは付与するのを助ける追加的可変領域（これらに限定されるものではない）を含む追加的成分を含有しうる。有用な活性には、抗体エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性、貪食、補体依存性細胞傷害性および半減期／消失速度が含まれる（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６）。他の有用な活性には、該結合性タンパク質によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に運搬されうる傷害性基の利用、およびＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする第１の抗原結合性タンパク質の安定性または活性を増強するための、宿主または外来抗原を標的とする第２の抗原結合性タンパク質の利用が含まれる。
【００４９】
抗体エフェクター機能は、Ｆｃγ受容体、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびＣ１ｑのような種々の宿主成分により媒介される（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６，Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：１１６１−１１７３，２００６）。エフェクター機能を増強するために、種々のタイプの抗体成分または改変が用いられうる。有用な成分または改変の具体例には、非フコシル化オリゴ糖、ＦｃＲｎへの増強された結合を伴うアミノ酸、およびＦｃγ受容体への増強された結合を伴うアミノ酸改変が含まれる（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６；Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３，２００６；Ｌａｚａｒら，米国特許出願公開ＵＳ ２００４／０１３２１０１；Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５：６５９１−６６０４，２００１；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７：２３５１４−２３５２４，２００６）。
【００５０】
本発明の１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は二重特異性である。ＣＳ−Ｄ７を標的とする二重特異性抗原結合性タンパク質は２以上の結合領域を含有し、ここで、１つの領域はＣＳ−Ｄ７標的部位を標的とし、もう１つの領域は別のエピトープを標的とする。追加的な領域が存在しうる。二重特異性抗原結合性タンパク質の一般的なタイプの具体例には、二重特異性抗体および異種重合体が含まれ、それらは共に、例えば二価、三価、四価などの多価の形態で提供されうる。
【００５１】
１つの実施形態においては、該二重特異性抗原結合性タンパク質は二重特異性抗体である（例えば、ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２６：６４９−６５８，２００５；Ｚｕｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７５：３６１−３６７，２０００；Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７−６２１，１９９６；Ａｌｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５４：９０−９４，１９９９；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７−１５，２００１を参照されたい）。もう１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする二重特異性抗体は宿主または外来抗原をも標的とする。宿主抗原は、例えば安定性または活性を増強するために標的化されうる。二重特異性抗体に関連した種々の実施形態に具体例には、以下の任意の組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない：抗体エフェクター機能をもたらしうるＦｃまたは修飾Ｆｃドメインを含有する二重特異性抗体；二価、三価または四価である二重特異性抗体；およびＣ３ｂ様受容体または別の外来抗原、例えばインビボ感染中に細菌表面上で発現されるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原（例えば、ＬＴＡ、莢膜；Ｏ’ＲｉｏｒｄａｎおよびＬｅｅ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．１７：２１８−２３４，２００４；Ｌｅｅｓ Ａ．，ＫｏＫａｉ−ｋｕｎ Ｊ．，ＬｏｐｅｚＡｃｏｓｔａ Ａ．，Ａｃｅｖｅｄｏ Ｊ．，Ｍｏｎｄ Ｊ．２００５．Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｉｎ：８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２００５ Ｍａｙ ８−１１；Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．Ｓ１：ｐ．５８；Ｆｉｓｃｈｅｒら，米国特許第６，６１０，２９３号；Ｓｔｉｎｓｏｎら，米国特許第７，２５０，４９４号）に特異的に結合する第２の抗原結合性タンパク質を含む二重特異性抗体。
【００５２】
もう１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする二重特異性抗原結合性タンパク質は、宿主または外来抗原を標的とする第２の抗原結合性タンパク質と共に異種重合体複合体内に含有されうる。宿主抗原は、該抗原結合性タンパク質の安定性または活性を増強するために標的化されうる。種々の実施形態の具体例には、以下の任意の組合せが含まれる：抗体エフェクター機能をもたらしうるＦｃまたは修飾Ｆｃドメインを含有する異種重合体；二価、三価または四価である二重特異性抗体；およびＣ３ｂ様受容体または別の外来抗原、例えばインビボ感染中に細菌表面上で発現されるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原に特異的に結合する第２の抗原結合性タンパク質を含む異種重合体。異種重合性複合体を形成させるために２つの抗体を化学的に架橋する方法は当技術分野で公知である（Ｔａｙｌｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３０５−３３０９，１９９１；Ｐｏｗｅｒｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３：１３２９−１３３５，１９９５）。
【００５３】
赤血球のＣ３ｂ様受容体への標的化は、該病原体を血流から排除するのを助けうる（Ｌｉｎｄｏｒｆｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８３：１０−２４，２００１；Ｍｏｈａｍｅｄら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７：１４４−１５０，２００５を参照されたい）。霊長類におけるＣ３ｂ様受容体はＣＲ１またはＣＤ３５および因子ＩＩ（他の哺乳類におけるもの）として公知である。正常な免疫粘着条件下、病原体に特異的に結合する抗体に結合した該病原体を含む免疫複合体（「ＩＣ」）は、補体タンパク質（例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ）で標識され、ついでこれは赤血球（「ＲＢＣ」）の表面上のＣＲ１に結合する。ＲＢＣは、Ｆｃ受容体（すなわち、ＦｃγＲ）を発現する貪食細胞（例えば、マクロファージ）にＩＣを運搬して、該ＩＣのＦｃ部分と該細胞表面上のＦｃ受容体との相互作用を介して該貪食細胞にＩＣを移す。該ＩＣは該貪食細胞により破壊され、一方、ＲＢＣは循環へと戻る。１つの抗原結合性タンパク質がＣＲ１に特異的である二重特異性抗原結合性タンパク質複合体を含む異種重合体は、補体カスケードを活性化する必要性を回避する。なぜなら、抗ＣＲ１抗体は、ＣＲ１の天然リガンドであるＣ３ｂの代用物として働くからである。これは、標的消失のための自然免疫粘着過程の効率を改善しうる。
【００５４】
他の実施形態においては、二重特異性抗体または異種重合体はＣＳ−Ｄ７標的領域およびＣＲ１の両方を標的とし、更にＦｃ定常領域を含有する。この実施形態における異種重合体は２つの異なる抗体を含有し、該抗体の一方または両方はＦｃ定常領域を含有する。本発明の１つの実施形態においては、該異種重合体の抗ＣＲ１抗体はマウスＣＲ１に特異的に結合する。もう１つの実施形態においては、該抗ＣＲ１抗体はヒトＣＲ１に特異的に結合する。ＣＲ１特異的抗体は当技術分野で公知である（例えば、Ｎｉｃｋｅｌｌｓら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：２７−３３，１９９８を参照されたい）。
【００５５】
本発明のもう１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は、該抗原結合性タンパク質の物理化学的特性を改変して有意な薬理学的利点をもたらす追加的成分を含む。例えば、分子へのポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）の結合は、治療用物質として使用された場合の該分子の安全性および効率を改善するのを助けうる。物理化学的改変には、該治療用物質の全身的保持を促進するよう一緒になって働きうる、コンホメーション、静電的結合および疎水性における変化が含まれる（これらに限定されるものではない）。また、ＰＥＧ部分を結合させることにより該抗原結合性タンパク質の分子量を増加させることによる薬理学的利点には、循環寿命の延長、安定性の増強、および宿主プロテアーゼからの保護が含まれる。また、ＰＥＧの結合は細胞受容体への該治療用部分の結合アフィニティに影響を及ぼしうる。ＰＥＧは、４０００〜１５，０００以上の分子量範囲の重合体（例えば、４００，０００までの分子量を有するＰＥＧ重合体が商業的に入手可能である）を形成する反復単位（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）から構成される非イオン性重合体である。
【００５６】
ＩＩ．Ｄ．種々の実施形態の具体例
ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は第１可変領域および第２可変領域を含有し、第１および第２可変領域は該標的領域に結合する。本明細書に記載されている指針に基づき、種々のＣＤＲおよびフレームワークアミノ酸を有する、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質が製造されうる。ヒンジ領域、Ｆｃ領域、毒性部分および／または追加的抗原結合性タンパク質もしくは結合性領域のような追加的成分（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）が存在しうる。
【００５７】
該抗原結合性タンパク質に関する第１の実施形態においては、第１可変領域は、以下のＣＤＲのいずれか１つ、２つ又は３つ全てを含むＶｈ領域である。
【００５８】
配列番号４６または配列番号４６と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲは配列番号３５および４０に基づく。配列番号４６は以下のアミノ酸配列ＧＧＳＩＸ１ＳＳＳＹＹＷＧ（ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸である）を有する。好ましくは、Ｘ１はセリンまたはアルギニンである。
【００５９】
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３もしくは配列番号４４または配列番号３６、３８、３９、４１、４３もしくは４４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ。好ましくは、第２ Ｖｈ ＣＤＲは配列番号３６、３８、３９、４１、４３または４４を含む。
【００６０】
配列番号３７、配列番号４２もしくは配列番号４５または配列番号３７、４２もしくは４５と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ。好ましくは、第３ Ｖｈ ＣＤＲは配列番号３７、４２または４５を含む。好ましくは、該Ｖｈ領域は第１ Ｖｈ ＣＤＲ（ＣＤＲ１）、第２ Ｖｈ ＣＤＲ（ＣＤＲ２）および第３ Ｖｈ ＣＤＲ（ＣＤＲ３）を含む。
【００６１】
第２の実施形態においては、第１可変領域は、
ａ）それぞれ配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７；
ｂ）それぞれ配列番号３５、配列番号３８および配列番号３７；
ｃ）それぞれ配列番号３５、配列番号３９および配列番号３７；
ｄ）それぞれ配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２；
ｅ）それぞれ配列番号４０、配列番号４３および配列番号４５；ならびに
ｆ）それぞれ配列番号４０、配列番号４４および配列番号４２
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む第１、第２および第３ ＣＤＲを含むＶｈ領域である。もう１つの実施形態においては、第１可変領域は、配列番号３５を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号３６を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および配列番号３７を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲを含むＶｈ領域である。
【００６２】
第３の実施形態においては、第２可変領域は、以下のＣＤＲのいずれか１つ、２つ又は３つ全てを含むＶｌ領域である。
【００６３】
配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９もしくは配列番号３２または配列番号１７、２０、２３、２６、２９もしくは３２と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ。好ましくは、第１ Ｖｌ ＣＤＲは配列番号１７、２０、２３、２６、２９または３２を含む。
【００６４】
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０もしくは配列番号３３または配列番号１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ。好ましくは、第２ Ｖｌ ＣＤＲは配列番号１８、２１、２４、２７、３０または３３を含む。
【００６５】
配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１もしくは配列番号３４または配列番号１９、２２、２５、２８、３１もしくは３４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ。好ましくは、第３ Ｖｌ ＣＤＲは配列番号１９、２２、２５、２８、３１または３４を含む。好ましくは、該Ｖｌ領域は第１ Ｖｌ ＣＤＲ（ＣＤＲ１）、第２ Ｖｌ ＣＤＲ（ＣＤＲ２）および第３ Ｖｌ ＣＤＲ（ＣＤＲ３）を含む。
【００６６】
第４の実施形態においては、第２可変領域は、
ａ）それぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９；
ｂ）それぞれ配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２；
ｃ）それぞれ配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５；
ｄ）それぞれ配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８；
ｅ）それぞれ配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；ならびに
ｆ）それぞれ配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む第１、第２および第３ ＣＤＲを含むＶｌ領域である。もう１つの実施形態においては、第１可変領域は、配列番号１７を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号１８を含む第２ ＶｈｌＣＤＲ、および配列番号１９を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲを含むＶｌ領域である。
【００６７】
第５の実施形態においては、該結合性タンパク質は、第１または第２の実施形態において記載されているＶｈ領域、および第３または第４の実施形態において記載されているＶｌ領域を含有する。
【００６８】
第６の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、第１、第２および第３ ＣＤＲをそれぞれが含むＶｈ領域およびＶｌ領域を含有し、ここで、第１、第２および第３ Ｖｈ ＣＤＲならびに第１、第２および第３ Ｖｌ ＣＤＲは、それぞれ、
ａ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９；
ｂ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２；
ｃ）配列番号３５、配列番号３８、配列番号３７、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５；
ｄ）配列番号３５、配列番号３９、配列番号３７、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８；
ｅ）配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；
ｆ）配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；
ｇ）配列番号４０、配列番号４４、配列番号４２、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；
ｈ）配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号の順序はＶｈ ＣＤＲ１、Ｖｈ ＣＤＲ２、Ｖｈ ＣＤＲ３、Ｖｌ ＣＤＲ１、Ｖｌ ＣＤＲ２およびＶｌ ＣＤＲ３に対応する。もう１つの実施形態においては、Ｖｈ ＣＤＲ１、Ｖｈ ＣＤＲ２、Ｖｈ ＣＤＲ３、Ｖｌ ＣＤＲ１、Ｖｌ ＣＤＲ２およびＶｌ ＣＤＲ３は、それぞれ、アミノ酸配列配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９を含む。
【００６９】
第７の実施形態においては、該結合性タンパク質は、前記の第１〜第６の実施形態に記載されている１以上の可変領域を有する抗体である。もう１つの実施形態においては、該抗体はＩｇＧである。
【００７０】
第８の実施形態においては、前記の第１〜第７の実施形態で提供される可変領域は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２軽鎖または重鎖フレームワークの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するフレームワーク領域を有する（図２および３を参照されたい）。
【００７１】
基準配列に対する配列同一性（同一性比率とも称される）は、配列を該基準配列とアライン（整列）させ、対応領域内の同一アミノ酸の数を決定することにより決定される。この数を該基準配列（例えば、配列番号１のフレームワーク領域）内のアミノ酸の総数で割り算し、ついで１００を掛け、最も近い整数に丸める。配列同一性は、当技術分野で認識されている多数の配列比較アルゴリズムにより、または目視検査により決定されうる（全般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．，Ａ．１Ｅ．１−Ａ．１Ｆ．１１，１９９６−２００４を参照されたい）。他の実施形態においては、該配列同一性はｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２のいずれかのフレームワークに対して少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であり、あるいは該ｍＡｂフレームワークのいずれかと０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸だけ異なる。
【００７２】
第９の実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸１−１２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＶｈ領域である第１可変領域を含む抗体である。もう１つの実施形態においては、該Ｖｈ領域は配列番号２のアミノ酸１−１２６を含む。
【００７３】
第１０の実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のアミノ酸１−１０８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＶｌ領域である第２可変領域を含む抗体である。もう１つの実施形態においては、該Ｖｌ領域は配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む。
【００７４】
第１１の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む軽鎖可変（Ｖｌ）領域、および配列番号２のアミノ酸１−１２６を含む重鎖可変（Ｖｈ）領域；
ｂ）配列番号３を含むＶｌ領域、および配列番号４を含むＶｈ領域；
ｃ）配列番号５を含むＶｌ領域、および配列番号６を含むＶｈ領域；
ｄ）配列番号７を含むＶｌ領域、および配列番号８を含むＶｈ領域；
ｅ）配列番号９を含むＶｌ領域、および配列番号１０を含むＶｈ領域；
ｆ）配列番号１１を含むＶｌ領域、および配列番号１２を含むＶｈ領域；
ｇ）配列番号１３を含むＶｌ領域、および配列番号１４を含むＶｈ領域；ならびに
ｈ）配列番号１５を含むＶｌ領域、および配列番号１６を含むＶｈ領域
のいずれかを含有する抗体である。もう１つの実施形態においては、Ｖｈ領域は配列番号２のアミノ酸１−１２６を含み、Ｖｌ領域は配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む。
【００７５】
第１２の実施形態においては、該結合性タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖、ならびにヒトカッパＣＨ１またはヒトラムダＣＨ１のいずれかを含む軽鎖を含む、前記の第７〜第１１の実施形態に記載されている抗体である。
【００７６】
第１３の実施形態においては、該結合性タンパク質は、軽鎖が配列番号１を含み、重鎖が配列番号２を含む抗体である。
【００７７】
第１４の実施形態においては、該結合性タンパク質は、以下の１以上を含有する前記の第７〜第１３の実施形態に記載されている抗体である：フコシル化されていない又は実質的にフコシル化されていない（すなわち、存在する炭水化物に対してモル換算で１０％未満）グリコシル化パターン；Ｆｃγ受容体結合を増強する１以上のアミノ酸改変；新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合を増強する１以上のアミノ酸改変；およびＣ１ｑ結合を増強する１以上のアミノ酸改変。
【００７８】
第１５の実施形態においては、前記の第１〜第１４の実施形態に記載されている示されている領域（例えば、可変領域、ＣＤＲ領域、フレームワーク領域）は、示されている配列からなる又は示されている配列から実質的になる。可変領域、ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のような領域に関する「から実質的になる」なる語は、アミノおよび／またはカルボキシル末端における１以上の追加的アミノ酸の、可能な存在を示し、ここで、そのようなアミノ酸は該標的への結合を有意に軽減しないものである。
【００７９】
第１６の実施形態においては、前記の第１〜第１５の実施形態に記載されている抗原結合性タンパク質は、該標的抗原に対する１００ｎＭまたはそれ未満のアフィニティＫＤ、または５００ｐＭまたはそれ未満のＫＤを与えるＶｈおよびＶｌ領域を有する。該標的抗原への結合は、実施例８に記載されているとおりに決定されうる。
【００８０】
第１７の実施形態においては、前記の第１〜第１６の実施形態に記載されている抗原結合性タンパク質は、毒性部分、該抗原結合性タンパク質の物理化学的および／または薬理学的特性を増強する分子（これらに限定されるものではない）ならびに第２の抗原結合性タンパク質（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）を含む少なくとも１以上の追加的成分に結合している。もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、第２の抗原結合性タンパク質（例えば、抗ＣＲ１抗体）に化学的に架橋されたＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質を含む異種重合体である。もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は１以上のＰＥＧ部分を有する。
【００８１】
種々の実施形態に記載されているアミノ酸相違（配列同一性における相違をもたらすものを含む）はアミノ酸の欠失、挿入または置換でありうる。活性を維持するアミノ酸置換においては、置換されるアミノ酸は、１以上の類似した特性、例えば、ほぼ同じ電荷、サイズ、極性および／または疎水性を有するべきである。ＣＤＲは、標的への結合をもたらしつつ様々なものであることが可能であり、尚も標的特異性を保有する。フレームワーク領域配列も様々でありうる。
【００８２】
図２および３に示す配列比較はＣＤＲおよびフレームワーク領域内の変異の例を示す。図２および３に例示されているもののほかの変異も生成されうる。アミノ酸相違に関する実施形態においては、追加的変異は保存的アミノ酸置換である。保存的置換はアミノ酸を、類似特性を有する別のアミノ酸で置換するものである。表２は、群内の１つのメンバーが別のメンバーに対する保存的置換であるアミノ酸群の一覧を示す。
【００８３】
【表２】
【００８４】
ＩＩ．Ｅ．抗原結合性タンパク質混合物
ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は、抗原結合性タンパク質混合物を形成させるために、異なるＯＲＦ０６５７ｎエピトープまたは異なるタンパク質を標的とする１以上の追加的結合性タンパク質と共に製剤化されうる。本発明の１つの実施形態は、少なくとも２つの抗原結合性タンパク質の組合せ又はそれらの複合体を含む抗原結合性タンパク質混合物に関するものであり（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）、この場合、該抗原結合性タンパク質の少なくとも１つは本明細書に記載のＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする。該追加的抗原結合性タンパク質は、好ましくは、インビボ感染中に細菌細胞表面上で発現される、以下のものを含む追加的なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原に特異的である：ＬＴＡおよび莢膜（Ｏ’ＲｉｏｒｄａｎおよびＬｅｅ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．１７：２１８−２３４，２００４；Ｌｅｅｓ Ａ．，ＫｏＫａｉ−ｋｕｎ Ｊ．，ＬｏｐｅｚＡｃｏｓｔａ Ａ．，Ａｃｅｖｅｄｏ Ｊ．，Ｍｏｎｄ Ｊ．２００５．Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｉｎ：８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２００５ Ｍａｙ ８−１１；Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．Ｓ１：ｐ．５８；Ｆｉｓｃｈｅｒら，米国特許第６，６１０，２９３号；Ｓｔｉｎｓｏｎら，米国特許第７，２５０，４９４号）；ｓａｉ−１関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／７９３１５）；ＯＲＦ０５９４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／０８６６６３）；ＯＲＦ０８２６関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／１１５１１３）；ＰＢＰ４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０６／０３３９１８）；ＡｈｐＣ関連ポリペプチドおよびＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物（Ｋｅｌｌｙら，国際公開番号ＷＯ ０６／０７８６８０）；スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型および８型莢膜多糖（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４９１−４９６，２００２）；コラーゲンアドヘシン、フィブリノーゲン結合性タンパク質およびクランピング因子（Ｍａｍｏら，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０：４７−５４，１９９４，Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６４０−２６４９，１９９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４：１５７２−１５８０，２００１）；ならびに多糖細胞間アドヘシンおよびその断片（Ｊｏｙｃｅら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：９０３−９２２，２００３）。
【００８５】
１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする該混合物中に含まれる抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体である。もう１つの実施形態においては、該抗体混合物中に含まれる各抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質混合物は、該混合物の治療的有効量および医薬上許容される担体を含有する医薬組成物の一部である。
【００８６】
したがって、該抗原結合性タンパク質の少なくとも１つがＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質複合体（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）の混合物が本発明のこの部分に含まれる。例えば、本発明は更に、少なくとも２つの異種重合体複合体（ここで、１つの異種重合体複合体は、ＣＲ１に特異的に結合する抗体に化学的に架橋された、本明細書に記載のＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質を含む）の組合せを含む、第ＩＩ．Ｃ節に記載されている異種重合体複合体の混合物に関する。この異種重合体は、ＣＲ１に特異的に結合する抗体に化学的に架橋されたインビボ感染中に細菌細胞表面上で発現される追加的なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原（例えば、ＬＴＡ、莢膜）に特異的に結合する抗原結合性タンパク質を含む第２の異種重合体複合体との抗原結合性タンパク質混合物の形態で組合されうる。
【００８７】
ＩＩＩ．タンパク質の製造
抗原結合性タンパク質およびその領域は、好ましくは、組換え核酸技術またはハイブリドーマの使用により製造される。Ｖｈ領域およびＶｌ領域を含有する一本鎖タンパク質、例えば一本鎖抗体、およびその抗体またはフラグメント、ならびに別のタンパク質の一部としてＶｈおよびＶｌ領域を含有する多鎖タンパク質を含む種々の抗原結合性タンパク質が製造されうる。
【００８８】
組換え核酸技術は、タンパク質合成のための核酸鋳型を構築することを含む。ハイブリドーマ技術は、該抗原結合性タンパク質を製造するために不死化細胞系を使用することを含む。適当な組換え核酸およびハイブリドーマ技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。
【００８９】
ＩＩＩ．Ａ．組換え核酸
抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸は、実際に該コード化タンパク質の生産工場として働く宿主細胞内で発現されうる。該組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する該抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を与えうる。
【００９０】
組換え遺伝子は、タンパク質の発現のための調節要素と共に、タンパク質をコードする核酸を含有する。一般には、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。抗体に関連するイントロンも存在しうる。抗体または抗体フラグメントの製造のための発現カセットの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０，２００１，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００９１】
遺伝暗号の縮重のため、特定のタンパク質をコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００９２】
細胞内の組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。好ましくは、発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および潜在的な高コピー数をも含有する。
【００９３】
所望により、当技術分野でよく知られた技術を用いて（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｍａｒｋｓら，国際出願番号ＷＯ９５／１７５１６（国際公開日１９９５年６月２９日）を参照されたい）、抗体をコードする核酸を宿主染色体内に組込むことが可能である。
【００９４】
ＩＩＩ．Ｂ．組み換え核酸の発現
組換え抗原結合性タンパク質の発現には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）およびストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（または放線菌属））および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類）に由来する細胞系を含む多種多様な細胞系が使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００９５】
組換え抗原結合性タンパク質の発現のための好ましい宿主は哺乳類翻訳後修飾をもたらす。翻訳後修飾には、化学的修飾、例えばグリコシル化およびジスルフィド結合形成が含まれる。もう１つのタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。
【００９６】
グリコシル化は抗体エフェクター機能に重要でありうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２、Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６，Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３，２００６）。
【００９７】
効率的な翻訳後修飾を得るために、哺乳類宿主細胞および非哺乳類細胞を含む種々のタイプの宿主細胞が使用されうる。哺乳類宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）および骨髄腫細胞が含まれうる。哺乳類宿主細胞は、例えば、グリコシル化をもたらすために修飾されうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７、Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６，Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３，２００６）。非哺乳類細胞は、所望のグリコシル化をもたらすために修飾されうる（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、そのような修飾された非哺乳類細胞の一例である（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。
【００９８】
ＩＩＩ．Ｃ．種々の実施形態の具体例
抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域もしくはＶｌ領域をコードする又はそれらの領域の両方をコードする１以上の組換え遺伝子を含む核酸は、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する完全な結合性タンパク質または該結合性タンパク質の成分を製造するために使用されうる。完全な結合性タンパク質は、例えば、一本鎖抗体のようなＶｈ領域およびＶｌ領域を含有する一本鎖タンパク質をコードする単一の組換え遺伝子を使用することにより、あるいは例えば、個々のＶｈおよびＶｌ領域を製造するために複数の組換え遺伝子を使用することにより得られうる。また、結合性タンパク質の領域は、例えば、別々の細胞内でＶｈ領域またはＶｌ領域を含有するポリペプチドを製造することにより得られうる。
【００９９】
したがって、本発明は、抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域またはＶｌ領域（該ＶｈまたはＶｌ領域を含むタンパク質はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する）をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含む。もう１つの実施形態においては、該核酸は２つの組換え遺伝子を含み、第１の組換え遺伝子は抗体結合性タンパク質Ｖｈ領域をコードし、第２の組換え遺伝子は抗原結合性タンパク質Ｖｌ領域をコードする。
【０１００】
種々の実施形態において、１以上の組換え遺伝子は該抗原結合性タンパク質、またはＶｈ領域もしくはＶｌ領域（前記第ＩＩ．Ｄに記載されているとおり）をコードする。好ましくは、該組換え遺伝子は、抗原結合性タンパク質を製造するために単一の宿主細胞内で発現される。該タンパク質は該細胞から精製されうる。
【０１０１】
ＩＶ．抗原結合性タンパク質の用途
適当なエピトープを認識する抗原結合性タンパク質は治療用途および他の用途を有しうる。他の用途には、ＯＲＦ０６５７ｎ抗原およびワクチンの製造、特徴づけ又は研究を促進するための、ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域を認識する抗原結合性タンパク質の使用が含まれる。あるＯＲＦ０６５７ｎ領域を含有する抗原は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答をもたらすために使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ２００５／００９３７９（国際公開日２００５年２月３日））。
【０１０２】
標的タンパク質の製造、特徴づけ又は研究においてモノクローナル抗体のような抗原結合性タンパク質を使用するための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗら，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，Ｌｉｐｍａｎら，ＩＬＡＲ Ｊｏｕｒｎａｌ ４６：２５８−２６８，２００５を参照されたい）。
【０１０３】
本発明の１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質を使用して、溶液中の又はミクロスフェアに結合した又は細胞上のＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在を確認する。溶液または細胞に存在するタンパク質への該結合性タンパク質の結合能は、ウエスタンブロット、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーおよびルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）イムノアッセイのような種々の技術を用いて測定されうる。
【０１０４】
ＶＩ．治療
適当な標的領域に結合する抗原結合性タンパク質を使用して、治療的および予防的治療が患者に対して行われうる。治療的治療は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した者に対して行われる。予防的治療は一般集団または一般集団の小集団に対して行われうる。一般集団の好ましい小集団としては、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者の小集団が挙げられる。
【０１０５】
治療的および予防的治療は、本明細書に記載の抗原結合性タンパク質またはその医薬組成物を患者に投与する工程を含む、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して患者を防御または治療する方法を含む。所望により、本発明で提供する抗原結合性タンパク質組成物は抗原結合性タンパク質の混合物の一部として提供されうる（例えば、前記第ＩＩ．Ｅ節を参照されたい）。また、該抗原結合性タンパク質組成物は、追加的医薬物質も与えられる組合せ療法（併用療法）計画の一部として投与されうる。したがって、該抗原結合性タンパク質の投与は、単独で又は追加的物質と組合されて、医薬的に活性な担体を含む組成物の形態をとりうる。
【０１０６】
組合せ療法は、医学的効果を有する１以上の追加的成分（限定的なものではないがワクチン抗原または抗生物質を含む）と共に、本明細書に記載されている抗原結合性タンパク質（例えば、前記第ＩＩ節を参照されたい）を使用して行われうる。治療の時機は、予防的および／または治療的治療が達成されるよう設計されうる。例えば、該追加的成分は、該抗原結合性タンパク質での治療と同時に、または該抗原結合性タンパク質での治療の前または後の短期間のうちに投与されうる。短期間のうちの投与は、患者のための最良の治療計画に応じて、抗原結合性タンパク質の投与から約２週間以内の期間を意味する。
【０１０７】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して有効な抗生物質の投与は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｎｓｔｅａｄら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３９１：２２７−２５８，２００７；Ｍｉｃｅｋ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４５：Ｓ１８４−Ｓ１９０，２００７；Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４６：１０３２−１０３７，２００８）を参照されたい）。組合せ治療のための可能な抗生物質には、例えば、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、リファンピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、キヌプリンチン−ダルフォプリスチン（ｑｕｉｎｕｐｒｉｎｔｉｎ−ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、オリタバンシン（ｏｒｉｔａｖａｎｃｉｎ）、ダルババンシン（ｄａｌｂａｖａｎｃｉｎ）、セフトビプロール（ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ）、テラバンシン（ｔｅｌａｖａｎｃｉｎ）およびイクラプリム（ｉｃｌａｐｒｉｍ）が含まれる。
【０１０８】
組合せ治療のための可能な抗原には、例えば、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／００９３７９）；ｓａｉ−１関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／７９３１５）；ＯＲＦ０５９４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／０８６６６３）；ＯＲＦ０８２６関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／１１５１１３）；ＰＢＰ４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０６／０３３９１８）；ＡｈｐＣ関連ポリペプチドおよびＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物（Ｋｅｌｌｙら，国際公開番号ＷＯ ０６／０７８６８０）；スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型および８型莢膜多糖（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４９１−４９６，２００２）；コラーゲンアドヘシン、フィブリノーゲン結合性タンパク質およびクランピング因子（Ｍａｍｏら，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０：４７−５４，１９９４，Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６４０−２６４９，１９９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４：１５７２−１５８０，２００１）；ならびに多糖細胞間アドヘシンおよびその断片（Ｊｏｙｃｅら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：９０３−９２２，２００３）が含まれる。
【０１０９】
「患者」は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる哺乳動物を意味する。好ましくは、患者はヒトである。しかし、他のタイプの哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ラットおよびマウスもスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる。非ヒト患者の治療は、ペットおよび家畜を防御するのに、ならびに特定の治療の効力を評価するのに有用である。
【０１１０】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者には、医療従事者、入院患者、低下した免疫系を有する患者、手術を受けている患者、カテーテルまたは血管装置のような異物インプラントを受け入れている患者、免疫低下を招く療法を受けている患者、および火傷または創傷のリスクの高い職業の者が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【０１１１】
１つの実施形態においては、手術または異物インプラントと共に、１以上の抗原結合性タンパク質を患者に投与する。「手術または異物インプラント」なる語は、異物インプラントの付与を伴う又は伴わない手術、および手術を伴う又は伴わない異物インプラントの付与を含む。投与の時機は、予防的治療および／または治療的治療が達成されうよう計画されうる。投与は、好ましくは、手術または移植とほぼ同時に開始されうる。
【０１１２】
医薬投与全般に関する指針は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【０１１３】
医薬上許容される担体は抗原結合性タンパク質の保存および投与を促進する。タンパク質溶液製剤を安定化するために使用される物質には、炭水化物、アミノ酸および緩衝化塩が含まれる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３７：３３−５８，１９９９）。
【０１１４】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の抗原結合性タンパク質を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。有効用量範囲は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇとなると予想される。投与頻度は該化合物の有効性および安定性によって異なりうる。投与頻度の具体例には、隔週、毎週、毎月および隔月が含まれる。
【０１１５】
ＶＩ．ＣＳ−Ｄ７標的断片
ＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号４７）内に存在しｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７が結合するＣＳ−Ｄ７標的断片は、例えば、前記ＩＩ．Ｂに記載されているとおり、追加的な抗体を生成させるために使用されうる。ＣＳ−Ｄ７標的断片は、免疫応答を惹起するためにも使用されうる。好ましくは、ＣＳ−Ｄ７標的断片はＣＳ−Ｄ７標的領域を含有する。したがって、ＣＳ−Ｄ７標的領域はＯＲＦ０６５７ｎにより提供される。ＣＳ−Ｄ７標的断片はＯＲＦ０６５７ｎ領域のアミノ酸約４２−３４２内に含有されているようであり（実施例６を参照されたい）、この領域に由来する、より小さな断片中に存在しうる。
【０１１６】
潜在的ＣＳ−Ｄ７標的断片は、以下に記載する種々の実施形態により提供される。第１の実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的断片は、配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、配列番号４７のアミノ酸４２−２８５および配列番号４７のアミノ酸１０３−２８５よりなる群から選ばれるＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号４７）の部分に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチドは３５０アミノ酸長以下である。該ポリペプチドの長さに関する追加的な実施形態においては、該ポリペプチドは２５０アミノ酸以下または２００アミノ酸以下である。追加的アミノ酸は、好ましくは、追加的ＯＲＦ０６５７ｎ領域である。
【０１１７】
第１の実施形態を更に詳しく記載する第２の実施形態においては、配列番号４７関連ポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、アミノ酸４２−２８５またはアミノ酸１０３−２８５に対して少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であり、あるいは配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、アミノ酸４２−２８５またはアミノ酸１０３−２８５と０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の改変だけ異なり、あるいは配列番号４７から実質的になる。各アミノ酸改変は、独立して、アミノ酸の置換、欠失または付加である。該改変は配列番号４７領域内に存在することが可能であり、あるいは配列番号４７領域に付加されうる。
【０１１８】
示されているアミノ酸の「から実質的になる」なる語は、言及されているアミノ酸が存在し、追加的なアミノ酸が存在しうることを示す。追加的なアミノ酸はカルボキシルまたはアミノ末端に存在しうる。種々の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加的なアミノ酸が配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、アミノ酸４２−２８５またはアミノ酸１０３−２８５付加される。追加的なアミノ酸の一例はアミノ末端メチオニンである。
【０１１９】
免疫応答の惹起は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療的または予防的に治療するのを助けるのに有用でありうる。当技術分野でよく知られた技術と共に本明細書に記載の指針を用いて、免疫原が製剤化され、患者に投与されうる。医薬投与全般に関する指針は、例えばＶａｃｃｉｎｅｓ，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【０１２０】
医薬上許容される担体は免疫原の保存および患者への免疫原の投与を促進する。医薬上許容される担体は、種々の成分、例えばバッファー、無菌注射用水、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートを含有しうる。
【０１２１】
免疫原は種々の経路（例えば、皮下、筋肉内または粘膜）で投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針またはジェット・インジェクターを使用して行われうる。
【０１２２】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の化合物を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。該免疫原は多用量ワクチン形態で使用されうる。用量は全ポリペプチド１．０μｇ〜１．０ｍｇの範囲よりなると予想される。種々の実施形態において、該範囲は５．０μｇ〜５００μｇ、０．０１ｍｇ〜１．０ｍｇ、または０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。
【０１２３】
投与の時機は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初回投与後、１以上の追加用量を投与して抗体価を維持または増強することが可能である。投与計画の一例としては、第１日、第１ヶ月、第３投与としての第４、６または１２ヶ月の投与、および必要に応じて行う、間隔をあけて投与する追加的な追加投与が挙げられるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１はＩｇＧ分子の構造を例示する。「Ｖｌ」は可変領域の軽鎖を意味する。「Ｖｈ」は重鎖可変領域を意味する。「Ｃｌ」は軽鎖定常領域を意味する。「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は重鎖定常領域である。点線はジスルフィド結合を示す。
【図２】図２は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７軽鎖可変領域（配列番号１のアミノ酸１−１０８）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｅ１１軽鎖可変領域（配列番号３）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０軽鎖可変領域（配列番号５）、ｍＡｂ ＣＳ−Ａ１０軽鎖可変領域（配列番号７）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１軽鎖可変領域（配列番号９）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｅ６軽鎖可変領域（配列番号１１）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４軽鎖可変領域（配列番号１３）およびｍＡｂ ＢＭＶ−Ｃ２軽鎖可変領域（配列番号１５）の配列比較を示す。相補性決定領域１、２および３が、異なるＣＤＲ配列を特定する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）と共に、太字で示されている。
【図３】図３は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７重鎖可変領域（配列番号２のアミノ酸１−１２６）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｅ１１重鎖可変領域（配列番号４）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０重鎖可変領域（配列番号６）、ｍＡｂ ＣＳ−Ａ１０重鎖可変領域（配列番号８）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１重鎖可変領域（配列番号１０）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｅ６重鎖可変領域（配列番号１２）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４重鎖可変領域（配列番号１４）およびｍＡｂ ＢＭＶ−Ｃ２重鎖可変領域（配列番号１６）の配列比較を示す。相補性決定領域１、２および３が、異なるＣＤＲ配列を特定する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）と共に、太字で示されている。
【図４】図４は、オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御をもたらしうることを例示する。
【図５】図５は、オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御をもたらしうることを例示する。
【図６】図６は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）菌血症を軽減しうることを例示する。
【０１２５】
ＶＩＩ．実施例
本発明の種々の特徴を更に詳しく例示する実施例を以下に記載する。該実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２６】
ｓｃＦｖライブラリーからの抗０６５７ｎ ｍＡｂの単離
ファージ提示ライブラリーを使用して、ＯＲＦ０６５７ｎに特異的なｓｃＦｖを特定した。該ライブラリーをＯＲＦ０６５７ｎＨでパンニングした。ついでｓｃＦＶを対抗スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎ）して、それらがＯＲＦ０６５７ｔに結合するかどうかを判定した。配列番号４７はＯＲＦ０６５７ｎスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）配列を示す。ＯＲＦ０６５７ｔはＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸４２−４８６に対応する。ＯＲＨ０６５７ｎＨはＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸４２−６０９に対応する。ＯＲＦ０６５７ｎＨおよびＯＲＦ０６５７ｔを酵母内で発現させた。
【０１２７】
固相パンニングを用いて、３つのケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）抗体ライブラリー（ＢＭＶ：末梢血リンパ球；ＣＳ：脾臓リンパ球；およびＤＰ４７：ＣＳライブラリーのＶｈ ＣＤＲ３およびＶｌを伴う生殖系列ＤＰ４７フレームワーク）をＯＲＦ０６５７ｎＨ（１０μｇ／ｍｌ）に対するｓｃＦＶに関してスクリーニングした。特定された２６４個中１９０個がＯＲＦ０６５７ｔに特異的であった。２６４個中１７２個は、可変領域ＤＮＡ配列決定から重複物を除去した後に特定された。ＤＮＡ配列分析は、重複配列および終止コドン含有配列の除去の後、ＤＰ４７スクリーニングからは４１個、ＢＭＶスクリーニングからは５７個、およびＣＳライブラリースクリーニングからは７４個の重複無し（ユニーク）の配列を特定した。
【０１２８】
ファージＥＬＩＳＡスクリーニング − 選択されたｓｃＦｖ−ファージクローンの抗原特異性を実証するために、ラウンド２における各ライブラリーからの１７２個のファージクローンおよびそれぞれの第３ラウンドのライブラリーからの８８個のクローンをＥＬＩＳＡにおいて試験した。ＥＬＩＳＡ陽性体の組をフローサイトメトリーにより及び競合ルミネックス（ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイにおいて更に試験した。フローサイトメトリーにより測定された、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細胞表面上のＯＲＦ０６５７ｎに結合したｓｃＦｖを、後記のとおりに完全ＩｇＧに変換した。
【０１２９】
フローサイトメトリースクリーニング − 種々のｓｃＦｖのＯＲＦ０６７５ｎ結合部位を決定するために、フローサイトメトリー分析を行った。この分析に使用したスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を鉄欠損規定培地（ＲＰＭＩ１６４０）内で増殖させた。固相ファージ提示パンニングのラウンド２から単離された１００個を超えるｓｃＦｖを、２×ＲＰＭＩ内で増殖させたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｂｅｃｋｅｒ細胞に対してフローサイトメトリーにより検査した。試験したｓｃＦｖのほとんどは種々の度合の結合を示した。これらの実験から得られたデータは、パンニングから単離されたｓｃＦｖがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合することを証明した。
【０１３０】
ＩｇＧ変換 − ＩｇＧ変換のために１２個のｓｃＦｖクローンを特定した。可変領域の配列をＰＣＲ増幅し、重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させ、一方、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、対応定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させた。得られた抗体発現ベクターのクローニング法を以下に説明する。
【０１３１】
軽鎖および重鎖の両方の発現をヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより駆動した。前方部のリーダー配列は培地内への抗体の分泌を引き起こした。重鎖リーダー配列はＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号４９）であった。軽鎖リーダー配列はＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号５０）であった。発現ベクターは、２９３ＥＢＮＡ細胞内での持続的発現のためのＥＢＶウイルスゲノム由来のｏｒｉＰ、およびカナマイシン選択マーカー用の細菌配列、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の複製起点を含有する。
【０１３２】
該可変領域をＰＣＲ増幅した。高忠実度ＰＣＲマスター混合物、１μｌの鋳型容量ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ１μｌ）を含有する２５μｌの容量中でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間の１サイクル；以下の２５サイクル：９４℃で１．５分間；６０℃で１．５分間；７２℃で１．５分間および７２℃で７分間；取り出し、ならびに５末端におけるリーダー配列および３’末端における定常領域へのインフレームでのクローニング（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を利用）まで４℃。例えば、以下のプライマー（軽鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴ（配列番号５１）；軽鎖リバース，５’−ＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＣＧＴＧＴＣＣＣ（配列番号５２）；重鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧ（配列番号５３）および重鎖リバース，５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴ（配列番号５４））を使用して、クローンＣＳ−Ｄ７抗体をクローニングした。
【０１３３】
該クローンの残りを同様にして変換した。それらの全てのクローンのＤＮＡ配列を配列決定により確認した。以下に更に詳しく説明するとおり、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｃ２、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０およびＣＳ−Ｅ１１は、Ｌｕｍｉｎｅｘ結合アッセイを用いた場合、同一エピトープへの結合に関して競合する。
【０１３４】
ＤＮＡ配列から推定された抗体ＣＳ−Ｄ７の完全長アミノ酸配列を以下の表３に示す。可変領域が太字で示されており、ＣＤＲが下線で示されている。
【０１３５】
ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＣＳ−Ｅ１１、ＢＭＶ−Ｅ６およびＢＭＶ−Ｃ２軽鎖および重鎖可変領域の配列比較を図２および３に示す。重鎖定常領域の配列は全て同一であり、軽鎖定常領域の配列はカッパまたはラムダのいずれかである。ＭＡｂ ＣＳ−Ｄ７はカッパ配列を含有し、これは、配列番号１のアミノ酸１０９−２１０に対応する。ＭＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＣＳ−Ｅ１１、ＢＭＶ−Ｅ６およびＢＭＶ−Ｃ２は、配列番号４８により示されるラムダ配列を含有する。
【０１３６】
該抗体を２９３ＥＢＮＡ単層細胞内で発現させた。ＰＥＩに基づくトランスフェクション試薬を使用して、該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地内でインキュベートし、プロテインＡ／Ｇアフィニティクロマトグラフィーを用いて、分泌された抗体を培地から精製した。精製された抗体の濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定し、純度をＬａｂＣｈｉｐキャピラリー電気泳動により決定した。
【０１３７】
【表３】
【実施例２】
【０１３８】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（ルミネックス）結合研究
ＣＡＴ ｓｃＦｖの選択物（実施例１を参照されたい）を、マウスｍＡｂ（２Ｈ２、１３Ｃ７、１Ｇ３および１３Ｇ１１）およびＣＡＴ ｍＡｂ（ＣＳ−Ｄ３、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ｅ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２）のパネルに対するスクリーニングにより特徴づけして、それらがＯＲＦ０６５７ｎ上の同一エピトープに関して競合するかどうか、または異なるエピトープに結合するかどうかを判定した。これらのアッセイにおいては、単一のＣＡＴ ｓｃＦｖ（またはＣＡＴ ｍＡｂ）を単一のｍＡｂ（マウスまたはＣＡＴ）に対して競合させた。
【０１３９】
マウス２Ｈ２、１Ｇ３、１３Ｃ７または１３Ｇ１１は２００７年１月２３日付け出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／０１６８７（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ０７／０１６８７（国際公開番号ＷＯ ２００７／０８９４７０）は、ブダペスト条約に従い２００５年９月３０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託されている、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生するハイブリドーマ細胞系に関するものである。該細胞系はＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２４（ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を産生する），ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２５（ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１を産生する）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２６（ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４を産生する）およびＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２７（ｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生する）と命名された。
【０１４０】
ＯＲＦ０６５７ｎ−ビーズの構築 − ９．４×１０６個のＲａｄｉｘマレイミドミクロスフェア（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＴＸ）を７５０μｇのＯＲＦ０６５７ｎ−Ｓｅ（カルボキシル末端システイン基を含有するＯＲＦ０６５７ｎ）に室温で２時間にわたって結合（カップリング）させた。ビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、ついで１Ｍ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ）で室温で２時間クエンチした。ミクロスフェアをＰＢＳ中で３回洗浄した。ビーズを計数し、５００ミクロスフェア／μｌの最終濃度で再懸濁させた。
【０１４１】
ＣＡＴ ｓｃＦｖとマウスＡｂとの競合の検出 − ＣＡＴ ｓｃＦｖをＰＢＳ−ＴＢＮ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウム）中、１：４、１：８、１：１６および１：３２で希釈し、５０００個のＯＲＦ０６５７ｎ結合ミクロスフェアと共にマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で室温で１時間１５分にわたってインキュベートした。ついで該ビーズを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。結合したＣＡＴ ｓｃＦｖを伴うＯＲＦ０６５７ｎ−ビーズをマウスモノクローナル抗体（２Ｈ２、１Ｇ３、１３Ｃ７または１３Ｇ１１）と共にインキュベートした。該マウスｍＡｂはＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート（Ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．）で商業的に標識されていた。該標識ｍＡｂをＰＢＳ−ＴＢＮ中で２μｇ／ｍｌの最終濃度に別々に希釈した。該希釈ｍＡｂ（５０μＬ／ウェル）をプレートに加え、これを室温で更に１時間１５分インキュベートした。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘルミノメーター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して中央値蛍光シグナルを読取った。
【０１４２】
ｓｃＦｖと該マウスＡｂとの結合競合に基づき、被験抗体の結合部位を以下の群に分類した：群１，ｓｃＦｖ ＢＭＶ−Ｃ２、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ａ１０、ＣＳ−Ｄ１０およびＣＳ−Ｄ７は該マウスｍＡｂのいずれとも競合しなかった；群２，２つのｓｃＦｖがマウスｍＡｂ ２Ｈ２と競合した；群３，２つのｓｃＦｖがｍＡｂ １Ｇ３と競合した；群４，該ｓｃＦｖのいずれもｍＡｂ １３Ｃ７と競合しなかった；ならびに群５，該ｓｃＦｖのいずれもｍＡｂ １３Ｇ１１と競合しなかった。ｓｃＦｖ ＣＳ−Ｄ１０およびＣＳ−Ｄ７に関しては、Ｂｉａｃｏｒｅを用いた結果は、Ｌｕｍｉｎｅｘを用いた本研究における分析と異なっていた（後記実施例５を参照されたい）。
【０１４３】
ＣＡＴ ｍＡｂとマウスｍＡｂとの間の競合の検出 − マウスｍＡｂ ２Ｈ２と競合するｓｃＦｖであるｓｃＦｖ ＢＭＶ−Ｄ４、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０およびＢＭＶ−Ｃ２ならびに１Ｇ３と競合する２つのｓｃＦｖを、実施例１に記載されているとおりにＩｇＧ抗体に変換した。ＣＡＴ ｍＡｂをＰＢＳ−ＴＢＮ中、２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０００個のＯＲＦ０６５７ｎ結合ミクロスフェアと共にマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で室温で１時間１５分にわたってインキュベートした。ついで該ビーズを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。結合したＣＡＴ ｍＡｂを伴うＯＲＦ０６５７ｎ−ビーズをマウスモノクローナル抗体（２Ｈ２、１Ｇ３、１３Ｃ７または１３Ｇ１１）と共にインキュベートした。該マウスｍＡｂはＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート（Ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．）で商業的に標識されていた。該標識ｍＡｂをＰＢＳ−ＴＢＮ中で２μｇ／ｍｌの最終濃度に別々に希釈した。該希釈ｍＡｂ（５０μＬ／ウェル）をプレートに加え、これらを室温で更に１時間１５分インキュベートした。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘルミノメーター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して中央値蛍光シグナルを読取った。
【０１４４】
マウスｍＡｂに対する競合に関してＣＡＴ ｍＡｂを試験した。前記のｓｃＦｖおよびマウスｍＡｂ競合の場合と同様にして、同じ５つの群を観察した。
【０１４５】
ＣＡＴ ｓｃＦｖとＣＡＴ ｍＡｂとの間の競合の検出 − Ｌｕｍｉｎｅｘ ｃＬＩＡアッセイにおいて、ＣＡＴ ｓｃＦｖをＣＡＴ抗体に対して個々に競合させた。ｓｃＦｖをＰＢＳ−ＴＢＮ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウム）中、１：４、１：８、１：１６および１：３２で希釈し、５０００個のＯＲＦ０６５７ｎ結合ミクロスフェアと共にマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で室温で１時間１５分にわたってインキュベートした。ついで該ビーズを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。それらの個々の抗体をＰＢＳ−ＴＢＮ中で２μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、別々のプレートに加えた。５０μＬ／ウェルの該希釈抗体を該プレートに加え、これらを室温で更に１時間１５分インキュベートした。該プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。Ｂｉｏｔｒｅｎｄの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体ＨＰ６０４３（Ｒ−フィコエリトリンで標識されたもの）を１：５０に希釈した。５０μＬ／ウェルの希釈抗体を該プレートに加えた。該プレートを室温で１時間１５分インキュベートした。該ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘルミノメーター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して中央値蛍光シグナルを読取った。少なくとも２つの希釈度で非競合的ｓｃＦｖに関して検出されたシグナルに対して該中央値蛍光シグナルが少なくとも３０％減少した場合、ｓｃＦｖは競合的であるとみなされた。
【０１４６】
個々のｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｅ６、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０およびＣＳ−Ｅ１１に対する個々のｓｃＦｖｓ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｃ２、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０およびＣＳ−Ｅ１１に関する競合の結果を表４に示す。第１列における各ｓｃＦｖは、第２列に示されているｍＡｂの全てに対して個々に競合することが判明した。
【０１４７】
【表４】
【実施例３】
【０１４８】
ＯＲＦ０６５７ｎへの結合のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）測定
ＯＲＦ０６５７ｎへの抗体結合をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標登録）は、カルボキシルメチルデキストランでコーティングされた（ＣＭ５）センサーチップの表面に直接照射される偏光の屈折率の変化をモニターすることにより質量変化を検出するために、ミクロフルイディクス技術および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を組合せたものである。応答単位（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）として測定される応答の変化は結合アナライト（例えば、抗原または抗体）の量に相関されうる。
【０１４９】
ＯＲＦ０６５７ｎへのアフィニティ結合を、抗スタヒロコッカス（ａｎｔｉ−Ｓｔａｐｈ）抗体ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した。該抗体を該ＣＭ５センサーチップの表面上に共有結合させた。該結合Ａｂを、まず、ＯＲＦ０６５７ｎにさらし、ついで、低濃度（５μｇ／ｍＬ）で試験される抗体にさらした。ＯＲＦ０６５７ｎ＋抗体の各サイクルの後、２０ｍＭ ＨＣｌを使用して、該センサーチップの表面を該固定化１３Ｃ７．Ｄ１２へと再生させた。
【０１５０】
各実施において最初に結合した（捕捉された）抗原の量を正規化するために、各試験抗体／抗原複合体に関する以下の比を計算する。
【０１５１】
【数１】
【０１５２】
結果を表５に示す。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ４およびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ６に関する有意な結合は示されなかった。ＩｇＧ結合の欠如の理由には、ＩｇＧタンパク質の非存在または不正確な値、抗体凝集、非常に低い結合活性、あるいは捕捉抗体との完全な重複（該抗原が単量体形態でのみ存在する場合）が含まれる。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ４およびｍＡｂ ＣＳ−Ｅ６の結合は、抗体濃度を有意に増加させるペア形態（ｐａｉｒｗｉｓｅ）結合研究において観察された（後記実施例４）。
【０１５３】
【表５】
【実施例４】
【０１５４】
ペア形態の競合結合
ＯＲＦ０６５７ｎへの抗体の相対結合を測定するために、ペア形態の結合実験を行った。抗スタヒロコッカス抗体ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２を該ＣＭ５センサーチップの表面上に共有結合（固定化）させた。該固定化Ａｂを、まず、該ＯＲＦ０６５７ｎにさらし、ついでマトリックス（行列）形態で抗体のペアにさらした。ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質＋抗体ペアの各サイクルの後、２０ｍＭ ＨＣｌを使用して、センサーチップの表面を固定化１３Ｃ７．Ｄ１２へと再生させた。各抗体ペアの全ての組合せが分析されうるよう、マトリックス形態でＯＲＦ０６５７ｎタンパク質に対して抗体を試験した。
【０１５５】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＤ−Ｄ１０、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｅ６に関するマトリックス設計を表６に要約する。
【０１５６】
【表６】
【０１５７】
各実施において最初に結合した（捕捉された）抗原の量を正規化するために、各試験抗体／抗原複合体に関する以下の比を計算する。
【０１５８】
【数２】
【０１５９】
各抗体に残存している利用可能なエピトープの割合（％）は、以下のとおりに、マッピングペアに関して計算されうる。
【０１６０】
【数３】
【０１６１】
モノクローナル抗体ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｅ６は、同じ又は有意に重複する領域に対するものであった。表７は該ペア形態結合研究の結果の要約を示す。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
該ｍＡｂの相対フットプリントサイズは以下のとおりである：ＣＳ−Ｄ７ ＞ ＣＳ−Ｄ１０ ＞ ＢＭＶ−Ｄ４ ＞ ＢＭＶ−Ｅ６。モノクローナル抗体ＣＳ−Ｄ７は最大の「フットプリント」（それが結合一次抗体である場合、最高比率のｍＲＵＡｂ／ＲＵＡｂ）を有していた。実施例３に記載されている結合研究とは対照的に、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４およびｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ６を使用した場合には、抗体濃度を有意に増加させ、結合を観察した。
【実施例５】
【０１６４】
追加的なエピトープ・フットプリント法
ＣＡＴ ｓｃＦｖおよびｍＡｂのサブセットに関して、ＢＩＡＣｏｒｅを用いて、追加的なエピトープ・フットプリント研究を行った。これらの研究においては、群１および群２結合競合は実施例２におけるものと同じであった。しかし、ＣＳ−Ｄ７およびＣＳ−Ｅ７はｍＡｂ １Ｇ３と競合することが判明した（群３）。
【０１６５】
特に示さない限り、ＢＩＡＣｏｒｅ ２０００でエピトープ重複に関して抗体をアッセイし、すべての試薬はＢＩＡＣｏｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から供給された。各実験において、フローセルをＥＤＣ／ＮＨＳ（ＮＨＳ，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＥＤＣ，（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド））混合物で活性化し、これらの活性化表面上に酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の種々のモノクローナル抗体を注入し、ついで該表面を１．０Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロッキングした。各実験サイクルにおいて、１５０μＬのＯＲＦ０６５７ｔを、共有的に固定化されたモノクローナル抗体上に１０μＬ／分で注入した。ついで、１２０μＬの別のモノクローナル抗体を該コンジュゲート上に１０μＬ／分で注入した。該実験の全体にわたって、表面プラズモン共鳴データを得、保存した。３０秒の接触時間で６０μＬ／分で流動する２０ｍＭ ＨＣｌの単一注入で再生を行った。すべての実験工程は２５℃の制御温度下で行った。後続の分析は、Ｍａｌｔｌａｂプラットフォーム（７．２．０．２３２ Ｒ２００６ａ，Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）上で実行する内部で開発されたソフトウェアを使用して行った。
【０１６６】
実施例２で示したとおり、競合的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにおいては、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７はｍＡｂ １Ｇ３と競合しない。該競合的Ｌｕｍｉｎｅｘおよび連続的ＢＩＡＣｏｒｅアッセイは、この不一致を可能にする相違を有する。第１に、ビーズに基づく該競合的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイは１つの抗体を別の抗体で置換させ、一方、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいては、１つの抗体が共有的（不可逆的）に結合している。第２に、該競合アッセイは、該抗体の１つに特異的な標識を使用し、一方、ＳＰＲアッセイは標識を使用せず、該表面上の物質の量のみに感受性である。該競合アッセイにおいては、予め結合している低アフィニティ抗体が、標識された高アフィニティ抗体により置換されて、無エピトープ重複の偽結果が生じうるであろう。いずれのアッセイにおいても、両方の抗体が干渉無しに結合する場合には、重複は存在しない。しかし、逆の場合、エピトープが異なりうる場合には、立体障害が見掛け上のエピトープ重複を引き起こしうるであろう。結合工程が連続的であり同時でない場合、どちらのアッセイにおいてもこの効果が増強されうる。
【０１６７】
実施例３および４における実験と実施例５における実験との相違は、実験３および４においては、ＯＲＦ０６５７ｎがまず、１３Ｃ７ ｍＡｂで捕捉され、ついで、もう１つのペアの抗体が、それらがＯＲＦ０６５７ｎに結合しうるかどうかを調べるために連続的に流される点にある。これらの抗体のいずれかがｍＡｂ １３Ｃ７とエピトープを共有する場合には、それはＯＲＦ０６５７ｎに結合できない。したがって、それは、有効に、ｍＡｂ １３Ｃ７、「一次抗体」および「二次抗体」の間の三者比較となる。これに対して、実施例５は二者比較である。
【実施例６】
【０１６８】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７エピトープマッピング
ＯＲＦ０６５７ｔの直鎖状配列の化学的切断、およびどの断片がｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に結合するのかの決定により、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７標的領域のエピトープマッピングを行った。ＯＲＦ０６５７ｔをＣＮＢｒで２時間にわたって化学的に切断した。得られた切断産物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、約４７、４４、３７、３５、３２、２６、１６、１３および１０ｋＤａの分子量を有する１０個のバンドを示した。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７でのウエスタンブロット分析は、４７、４４、３７、３５および３２ｋＤａのバンドのみがｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により認識されることを明らかに示した。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により認識される短い配列の非存在は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７がＯＲＦ０６５７ｎの直鎖状配列を認識しないことを示している。
【０１６９】
該ウエスタンブロットバンドを該ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから切り出し、ゲル内消化を行った。タンデム質量分析により特定された得られたペプチドは、ＯＲＦ０６５７ｎ内の対応配列に一致した。結果を表８に示す。
【０１７０】
【表８】
【０１７１】
表８に示されているＯＲＦ０６５７ｎは以下に基づくものである：ゲル内消化において特定されたペプチド、タンデム質量スペクトルにより特定されたＣ末端メチオニン残基、ＣＮＢｒ消化の全断片はメチオニン切断部位で始まり終わるという仮定、およびＳＤＳ ＰＡＧＥゲル内のバンドの見掛け分子量。ウエスタンブロット分析においてｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により特定可能であったＯＲＦ０６５７ｔの最小内部断片はアミノ酸４２−３４２であった。
【実施例７】
【０１７２】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７エピトープ切断
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７への結合のための、ＯＲＦ０６５７ｔの、より高い分子量の断片の要件を、エピトープ切断により確認した。詳細に説明すると、該エピトープ切断実験のそれぞれに関して、臭化シアン活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ ｎｏ １７ ０４３０ ０１）への化学的架橋により、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７を固定化した。ついで元のＯＲＦ０６５７ｔを該固定化抗体に結合させ、リン酸緩衝食塩水での十分な洗浄により未結合ＯＲＦ０６５７ｔを洗い落とした。該結合ＯＲＦ０６５７ｔにトリプシンを加えた。インキュベーション中に該プロテアーゼにより切り出されたペプチドを十分に洗い落とし、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に特異的に結合したＯＲＦ０６５７ｔ断片をＳＤＳローディングバッファーで遊離させた。
【０１７３】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に特異的に結合した断片をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。該エピトープ切断実験は、該ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析において約４８、２３および１９．５ｋＤａの分子量を有する３つのバンドを示した。該ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから全バンドを切り出し、ゲル内消化を行い、該バンドに対応するＯＲＦ０６５７ｎのペプチドをタンデム質量分析により特定した（表９）。タンデム質量分析により特定された各ＯＲＦ０６５７ｎペプチドの計算分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより特定された対応バンドの分子量より小さい（表９）（該実験計画の結果である）。したがって、この実験におけるｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に結合した断片は、実際には、質量分析により特定されたものより大きなＯＲＦ０６５７ｎポリペプチド領域にわたっている可能性がある。例えば、バンド３は、ＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸１１７−２２４に対応するものとして質量分析により特定され、１２．５ｋＤａの計算分子量を有する。それは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特定では、１９．５ｋＤａの分子量を有する。約７ｋＤａ（計算分子量とＳＤＳ ＰＡＧＥ特定分子量との差）に対応するアミノ酸領域が該質量分析特定ペプチドのＮおよびＣ末端部分の両方に付加されるとすると、ＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸約４２−２８５に対応する断片が生じるであろう。この場合、該特定断片のＮおよびＣ末端部分の両方に７ｋＤａの領域が付加されるため、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７結合を達成するのに必要なＯＲＦ０６５７ｎの最小部分はアミノ酸４２−２８５内の領域に対応する可能性がある。アミノ酸４２−２５４に対応する断片はｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に結合しないことを実施例６の化学的切断実験が示しているため、アミノ酸２５４−２８５に対応する領域またはその一部が、適切な抗体結合に重要である可能性がある。
【０１７４】
【表９】
【実施例８】
【０１７５】
アフィニティ測定
ｓｃＦｖ ＣＳ−Ｄ７および完全長ＩｇＧ ＣＳ−Ｄ７の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）評価を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて行った。該結合ドメインと該抗原との間の１：１相互作用を測定するために、抗体フラグメントを分析するのか又は完全長ＩｇＧを分析するのかに応じて、Ｂｉａｃｏｒｅの実験設定を変更した。ＩｇＧの測定の場合には、該ＩｇＧをリガンドとして該表面に捕捉させ、ＯＲＦ０６５７ｔをアナライトとして使用した。抗体フラグメントの分析の場合には、０６５７ｔをリガンドとして該表面に結合させ、該抗体フラグメントをアナライトとして使用した。それらの２つの方法の比較は同様の結果を示した（表１０）。それぞれに関して、２つの独立した実験から標準偏差を導き出した。
【０１７６】
【表１０】
【実施例９】
【０１７７】
留置カテーテルモデル
ラットにおける留置カテーテルモデル実施における効力に関して、モノクローナル抗体を試験した。頚静脈内に外科的に移植され縫合により適所に保持され該マウスの背側中央線上の出口から出る留置カテーテル（ＰＥ５０シリコーンゴム）を有するＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。実験開始前の＞７日間、該ラットを収容した。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による定着からの留置カテーテルの抗体防御を試験するために、チャレンジの１時間前に０〜４ｍｇのｍＡｂをラットに注射（ｉｐ）した。動物を尾静脈から４×１０９ ＣＦＵでチャレンジした。２４時間後、動物を犠死させ、無菌技術を用いてカテーテルを取り出した。定着の評価のために、カテーテル（外部口を伴うカテーテル全体を取り出した）をマンニトール塩寒天またはＴＳＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ）上に配置した。プレートを３７℃で２４〜４８時間培養した。コロニー成長のいずれかの徴候を培養陽性として評価した。５つの別々の実験の結果を表１１および１２に示す。表１１における、４ｍｇ用量のｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７を４ｍｇ用量のｍＡｂ ２０Ｃ２ＨＡ（イソタイプ対照）と比較するｐ値は、＜０．０００１である。表１１における、４ｍｇ用量のｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７をＰＢＳ対照と比較するｐ値は、＜０．０００１である。
【０１７８】
【表１１】
【０１７９】
【表１２】
【０１８０】
実験５（表１２）において調べたカニューレ挿入ラットに、チャレンジの１時間前に、４ｍｇのモノクローナル抗体（ＣＳ−Ｄ７またはイソタイプ対照）またはＰＢＳのみを注射（ｉｐ）した。ついでそれらを１〜２×１０９ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｂｅｃｋｅｒでチャレンジした。示されている時点で全てのラットから採血した。最終時点（３２時間）において、採血し、動物を犠死させ、該カテーテルを取り出した。ＴＳＡプレート上に５０μＬを広げ、一晩培養することにより、血液を細菌に関して評価した。マンニトール塩プレート上で一晩プレーティングすることにより、該カテーテルをスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関して評価した。図６に示すとおり、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の注射により血液ＣＦＵの減少が示された。
【実施例１０】
【０１８１】
エクスビボモデル
受動防御の方法を用いて、モノクローナル抗体を評価した。腹腔内（ｉｐ）経路による致死的注射の前に、細菌をエクスビボでｍＡｂで前オプソニン化した（エクスビボ法）。６匹のＢａｌｂ／ｃマウスに十分な細菌の量（６×ＬＤ１００）を、穏やかに振とうしながら、８００μｇのＩｇＧと共に４℃で１時間インキュベートした。ついで細菌をペレット化し、未結合ｍＡｂを除去した。抗体オプソニン化細菌を２．４ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、０．４ｍＬ（１×ＬＤ１００）を５匹のマウスのそれぞれに注射した。同等のＣＦＵが全群のマウスに与えられたこと、および該ｍＡｂが該細菌を凝集していなかったことを保証するために、チャレンジ後、ＴＳＡ上にプレーティングすることにより、各接種物を定量した。チャレンジ後の３日間、生存をモニターした。この方法が有効となるためには該標的抗原が該細菌の表面上に存在しなければならないため、オプソニン化の前に該細菌上でＯＲＦ０６５７ｎが発現されることが保証されるよう留意した。該チャレンジ株はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＲＮ４２２０であり、これを低鉄培地ＲＰＭＩ内で２継代した。各マウスに注射されたオプソニン化細菌の用量は１〜２×１０９ ＣＦＵ／マウスであった。結果を表１３に示す。
【０１８２】
【表１３】
【実施例１１】
【０１８３】
オプソニン貪食アッセイ
抗体のオプソニン貪食能を評価するために、オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを開発した。該アッセイは、顆粒球エフェクター細胞によるこれらの細菌の貪食のレベルの増加をもたらす、細菌表面への補体（Ｃ’）の結合および固定をもたらす抗体の能力を測定する。
【０１８４】
ＯＲＦ０６５７ｎは、ヘム／Ｆｅの獲得に関与していると思われるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面上の鉄調節タンパク質である。このアッセイにおいて使用するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、プロテインＡを産生しない株である。そのような株の一例はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＨ１０００である。このアッセイでは、ＯＲＦ０６５７ｎの発現を増強するために、該株を鉄枯渇させる。また、この株はプロテインＡの産生能を欠く。プロテインＡは任意のＩｇＧのＦｃ部分に結合することが可能であり、この非特異的結合性抗体の存在はＯＰＡ反応を妨げうるであろう。
【０１８５】
ＨＬ６０細胞を、より顆粒球性の表現型への該細胞の分化を誘導するために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に５〜６日間さらした。つぎに２％ Ｃ’−充足ノトバイオートブタ血清を該抗体結合細胞に加えた。最後に、該抗体およびＣ’曝露細胞を次いで、蛍光性化合物５’，６’−ＦＡＭ−ＳＥで標識した。
【０１８６】
オプソニン化蛍光標識細菌および未標識ＨＬ６０ ＤＭＦ細胞のインキュベーションの後、フローサイトメトリーにより、標識細菌を含有するＨＬ６０ ＤＭＦ細胞の比率を測定することにより、貪食のレベルを決定した。飲み込まれた細菌を含有するＨＬ６０細胞の比率は、該抗体により誘導されたオプソニン化の量に比例する。ＯＲＦ０６５７ｎに対するマウスおよびヒトの両方のｍＡｂをこのアッセイにおいて試験した。結果を図４および５に示す。
【０１８７】
ＯＲＦ０６５７ｎ特異的ｍＡｂは、このアッセイにおいて、力価測定可能な活性を示すことが可能であった。マウスｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１はマウスイソタイプ対照ｍＡｂ，６Ｇ６．Ａ８より大きな活性を有していた。ヒトｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７およびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０も、それらのＩｇＧ１イソタイプ対照より高いオプソニン活性を有していた。最高レベルの貪食をもたらすのに必要なｍＡｂの量はマウスｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１に関する０．５μｇからヒトｍＡｂに関する０．０６〜０．２５μｇまでの範囲であった。ヒトＡｂ ＣＳ−Ｄ７は、最高レベルの貪食をもたらすのに０．０６μｇを要したに過ぎず、これに対して、マウスｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１は０．５μｇを要した。
【実施例１２】
【０１８８】
追加的配列
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎ配列を示す配列番号４７は以下のとおりである。
【０１８９】
【化１】
【０１９０】
ヒトラムダ配列を示す配列番号４８は以下のとおりである。
【０１９１】
【化２】
【実施例１３】
【０１９２】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の治療投与
カニューレ挿入ラットを尾静脈から１〜２×１０９ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジした。１時間後、４ｍｇのモノクローナル抗体（ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７またはイソタイプ対照）またはＰＢＳのみをラットに注射（ｉｐ）した。チャレンジの２４時間後、該ラットを犠死させ、該カテーテルを取り出した。マンニトール塩プレート上で一晩プレーティングすることにより、該カテーテルをスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関して評価した。４つの異なる実験の結果を表１４に示す。
【０１９３】
【表１４】
【実施例１４】
【０１９４】
組合せ療法−バンコマイシンおよびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７
２〜４×１０９ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｂｅｃｋｅｒでのｉｖチャレンジの１時間（１Ｈ）前に、カニューレ挿入ラットにバンコマイシン（２０ｍｐｋ）を投与（ｓｕｂ．ｃｕ．）した。チャレンジの１時間後、６ｍｇ／ラットのｍＡｂ ＣＳ−Ｄ６、イソタイプ対照ｍＡｂ ２０Ｃ２ＨＡまたはＰＢＳのいずれかを該ラットに注射した。チャレンジの２４時間後、該動物を犠死させ、頚静脈カテーテルを回収し、カテーテル上の細菌負荷に関して評価した。選択的ブロス培地内への配置およびピッコロ（Ｐｉｃｃｏｌｏ）インキュベーション系上での増殖により、カテーテルの評価を行った。該実験カテーテル上のＣＦＵの数を計算するために、同一条件下のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）増殖の標準曲線に対して増殖を比較した。第１の実験においては（表１５）、該系を試験するために少数の動物を使用した。第２の実験においては（表１６）、多数のラットを使用した。どちらの場合も、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の存在下においては、イソタイプ対照ｍＡｂの存在下と比べて、バンコマイシンの活性の有意な増強が示された。これは、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７が、バンコマイシンのみの場合と比べて細菌消失を増強しうることを示している。患者が手術または他の侵襲的方法を受け経験的または予防的抗生物質投与を受ける臨床状況を模擬するように、このモデルを設計した。該モデルにおいては、手術中の感染に対する補助的ｍＡｂ治療を模擬するよう、細菌曝露後に該ｍＡｂを注射した。これらの非常に厳密な条件下、該ｍＡｂは有益な効果を示した。
【０１９５】
【表１５】
【０１９６】
他の実施形態も以下の特許請求の範囲の範囲内である。いくつかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウスＯＲＦ０６５７ｎを標的とする抗原結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の全体にわたって引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であると自認するものではない。
【０００３】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、多種多様な疾患および状態を引き起こす病原体である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる疾患および状態の具体例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、インペチゴ、水疱性インペチゴ、フレグモーネ、ボトリオミセス症、毒性ショック症候群、火傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性および炎症性眼疾患、骨髄炎ならびに関節および骨の他の感染症、ならびに気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【０００４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の広がりを抑制するためには、免疫学に基づく方法が用いられうる。免疫学に基づく方法には受動免疫化および能動免疫化が含まれる。受動免疫化は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を標的とする免疫グロブリンを使用する。能動免疫化はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７
【発明の概要】
【０００６】
発明の摘要
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御をもたらすために標的化されうるエピトープを有することが判明している領域に結合する抗原結合性タンパク質に関する。該領域は本明細書においては「ＣＳ−Ｄ７」標的領域と称される。ＣＳ−Ｄ７標的領域は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の可能性または重症度を減少させるために標的化されうるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎエピトープを与える。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、第１可変領域および第２可変領域を含んでなる単離された抗原結合性タンパク質に関する。これらの可変領域はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する。ＣＳ−Ｄ７標的領域はモノクローナル抗体ＣＳ−Ｄ７（ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７）により特異的に標的化される。ＭＡｂ ＣＳ−Ｄ７は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する２本の重鎖とを有する免疫グロブリンである。
【０００８】
「単離（された）」なる語は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。そのような異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度および／または天然で見出されない構造体でありうる。天然で見出されない構造体には、異なる領域が一緒になった組換え構造体、例えば、１以上のマウス相補性決定領域がヒトフレームワークスカフォールド上に挿入された又はヒト抗体の表面残基を模倣するためにマウス抗体の表面が修飾されたヒト化抗体、抗原結合性タンパク質由来の１以上の相補性決定領域が別のフレームワークスカフォールド内に挿入されたハイブリッド抗体、ならびに軽可変ドメインおよび重可変ドメインをコードする遺伝子が互いにランダムに組合された天然ヒト配列に由来する抗体が含まれる。
【０００９】
単離されたタンパク質は、好ましくは、血清タンパク質を実質的に含有しない。血清タンパク質を実質的に含有しないタンパク質は、ほとんど又は全ての血清タンパク質を欠く環境中に存在する。
【００１０】
「可変領域」は重鎖または軽鎖からの抗体可変領域の構造を有する。抗体重鎖および軽鎖の可変領域は、フレームワーク上に間隔をあけて存在する３つの相補性決定領域を含有する。該相補性決定領域は主として、特定のエピトープの認識をもたらす。
【００１１】
標的領域は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７が結合するＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号４７）に関して定義される。ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合するタンパク質は、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく抑制アッセイを用いて過剰量および等量の該競合タンパク質およびモノクローナル抗体を使用した場合、ＯＲＦ０６５７ｎへのｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の結合を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％軽減する。
【００１２】
「タンパク質」なる語は連続的アミノ酸配列を示し、最小または最大サイズ限界を示すものではない。該タンパク質中に存在する１以上のアミノ酸はグリコシル化またはジスルフィド結合形成のような翻訳後修飾を含有しうる。
【００１３】
好ましい抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」なる語は、同じ又は実質的に同じ構造を有する一群の抗体を示す。モノクローナル抗体における変異は、該抗体が同一構築物から製造された場合に生じるものである。
【００１４】
モノクローナル抗体は、例えば、特定のハイブリドーマから、および該抗体をコードする１以上の組換え遺伝子を含有する組換え細胞から製造されうる。該抗体は２以上の組換え遺伝子によりコードされることが可能であり、この場合、１つの遺伝子は重鎖をコードし、１つの遺伝子は軽鎖をコードする。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域またはＶｌ領域の一方または両方をコードする１以上の組換え遺伝子を含む核酸を記載し、ここで、該抗原結合性タンパク質はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する。例えば、１つの遺伝子が抗体重鎖、またはＶｈ領域を含有するそのフラグメントをコードし、もう１つの遺伝子が抗体軽鎖、またはＶｌ領域を含有するそのフラグメントをコードする、複数の組換え遺伝子が有用である。
【００１６】
組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にタンパク質をコードする組換え核酸を含有する。該組換え核酸は、その配列および／または形態の点で、天然では見出されない。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸を与える一緒になった２以上の核酸領域、互いに天然で付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域またはＶｌ領域の一方または両方をコードする１以上の組換え遺伝子を含む組換え細胞に関する。好ましくは、該組換え細胞はＶｈおよびＶｌ領域の両方を発現する。
【００１８】
本発明のもう１つの態様は、抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法を含む。該方法は、（ａ）該タンパク質が発現される条件下、該タンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え細胞を増殖させ、（ｂ）該タンパク質を精製する工程を含む。好ましくは、該タンパク質は完全な抗原結合性タンパク質である。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は医薬組成物を記載する。該組成物は、本明細書に記載されている抗原結合性タンパク質の治療的有効量および医薬上許容される担体を含む。
【００２０】
治療的有効量は、有用な治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者の場合、有効量は、以下の効果の１以上を達成するのに十分な量である：該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖能の軽減、または該患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の量の減少。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していない患者の場合、有効量は、以下の１以上を達成するのに十分な量である：スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する感受性の軽減、または慢性疾患を招く持続感染を該感染細菌が確立する能力の軽減。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を（治療的または予防的に）治療するための医薬の製造における、抗原結合性タンパク質の治療的有効量の使用を記載する。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する患者の治療方法に関する。該方法は、本明細書に記載の抗原結合性タンパク質（その医薬組成物を含む）の有効量を患者に投与する工程を含む。治療される患者はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染していても感染していなくてもよい。好ましくは、患者はヒトである。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、配列番号４７のアミノ酸４２−３４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（該ポリペプチドは３５０アミノ酸長以下である）に関する。
【００２４】
「含む（含んでなる）」のような非限定的用語に対する言及は追加的な要素または工程を許容する。場合によっては、「１以上」のような表現は、追加的な要素または工程の可能性を強調するために非限定的用語と共に又はそれを伴わずに用いられる。
【００２５】
明示的に示されていない限り、単数表現は単数を示すと限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外するものではない。場合によっては、可能な複数の存在を強調するために、１以上のような表現が用いられる。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例（具体例）を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例（具体例）は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の抗原結合性タンパク質は、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合するそれらの能力により、例えば、ＯＲＦ０６５７ｎに基づく抗原の製造、特徴づけ若しくは研究における手段として、および／またはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための物質として使用されうる。ＯＲＦ０６５７ｎはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の種々の株において良く保存されていることが判明している（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答を引き起こすために、種々のＯＲＦ０６５７ｎ誘導体が使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ２００５／００９３７９、国際公開日２００５年２月３日）。
【００２８】
Ｉ．抗原結合性タンパク質
抗原結合性タンパク質は、エピトープへの特異的結合をもたらす抗体可変領域を含有する。該抗体可変領域は、例えば、完全抗体、抗体フラグメント、および抗体または抗体フラグメントの組換え誘導体において存在しうる。
【００２９】
抗体は、そのクラスによって異なる構造を有する。ＩｇＧに関して、種々の抗体領域が例示されうる（図１）。ＩｇＧ分子は４つのアミノ酸鎖（２つの、より長い重鎖、および２つの、より短い軽鎖）を含有する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域および可変領域を含有する。可変領域内には、抗原特異性をもたらす３つの超可変領域が存在する（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．およびＳｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。
【００３０】
超可変領域（相補性決定領域とも称される）は、より保存されたフランキング領域（フレームワーク領域とも称される）の間に介在している。フレームワーク領域および相補性決定領域に関連したアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているとおりに番号付けされ、整列（アライン）されうる。
【００３１】
２つの重鎖カルボキシル領域は、Ｆｃ領域を形成するようジスルフィド結合により連結された定常領域である。Ｆｃ領域はエフェクター機能をもたらすのに重要である（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６）。Ｆｃ領域を構成する２つの重鎖のそれぞれはヒンジ領域を介して異なるＦａｂ領域へと伸長している。
【００３２】
高等脊椎動物においては、２つのクラスの軽鎖および５つのクラスの重鎖が存在する。軽鎖はκまたはλである。重鎖は抗体クラスを定め、α、δ、ε、γまたはμである。例えば、ＩｇＧはγ重鎖を有する。異なるタイプの重鎖に関しては、ヒトγ１、γ２、γ３およびγ４のようなサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジおよびテイル（尾）領域に、特徴的なコンホメーションをもたらす（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
【００３３】
抗体可変領域を含有する抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域および定常領域から構成される軽鎖と、可変領域および定常領域を含有する重鎖領域とを含有する。軽鎖は定常領域を介してジスルフィド結合により重鎖に連結される。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を与える。
【００３４】
抗体可変領域は組換え誘導体中に存在しうる。組換え誘導体の具体例には、一本鎖抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および小型抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）が含まれる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００３５】
該抗原結合性タンパク質は、同じ又は異なるエピトープを認識する１以上の可変領域を含有しうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４）。
【００３６】
ＩＩ．ＣＳ−Ｄ７標的領域に対する抗原結合性タンパク質の作製
ＣＳ−Ｄ７標的領域に対する抗原結合性タンパク質は、種々の技術（例えば、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する抗原結合性タンパク質を利用し、該標的領域に結合する追加的な結合性タンパク質に関してスクリーニングするもの）を用いて得られうる。ＣＳ−Ｄ７標的領域への抗体の結合能は、ＬｕｍｉｎｅｘアッセイおよびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７を用いて評価されうる（後記実施例２を参照されたい）。ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する抗原結合性タンパク質は、追加的な結合性タンパク質を得るための種々の方法（例えば、該抗原結合性タンパク質からの配列情報を用いる、および／または該抗原結合性タンパク質を修飾するもの）において使用されうる。
【００３７】
ＩＩ．Ａ．可変領域の設計
抗原結合性タンパク質に対する可変領域は、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する可変領域に基づいて設計されうる。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイに基づいて、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２と称されるｍＡｂは同一領域に結合することが判明した。図２は、これらの異なる抗体に関する軽鎖可変領域の配列比較を示す。図３は、これらの異なる抗体に関する、異なる重鎖可変領域の配列比較を示す。
【００３８】
図２および３における配列比較は、抗原結合性タンパク質に関する種々の可変領域ＣＤＲおよびフレームワーク配列の具体例を示す。図２および３に示す抗体可変領域は末梢血リンパ球ライブラリー（「ＢＭＶ」と称される）または脾臓リンパ球（「ＣＳ」と称される）のいずれかから誘導された。
【００３９】
ＣＤＲは、主として、個々のエピトープへの結合をもたらす。個々のＣＤＲ内には、エピトープへの結合に非常に重要な少数の特異性決定残基（ＳＤＲ）が存在する（Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６）。ＳＤＲは、例えば、抗原−抗体三次元構造および抗体結合部位の突然変異分析の助けにより特定されうる（Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４，２００５）。
【００４０】
フレームワーク領域は全体構造を与えるのを助け、ＣＤＲと比べて種々のアミノ酸変異に対する許容性がある。多種多様な天然に存在するフレームワーク領域が当技術分野でよく知られている（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）。
【００４１】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２の可変領域ならびに対応するＣＤＲ配列番号が図２および３の配列比較において示されている。表１はＣＤＲ配列番号の要約を示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
図２および３に例示されている配列比較はフレームワークおよびＣＤＲ領域内の種々のアミノ酸置換の具体例を示す。改変はフレームワーク領域およびＣＤＲの両方に施されることが可能であり、ＣＳ−Ｄ７結合領域に対する特異性を尚も保有する。
【００４４】
ＩＩ．Ｂ．追加的結合性タンパク質に関するスクリーニング
ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする追加的結合性タンパク質は、完全長ＯＲＦ０６５７ｎを使用して、またはｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により認識されるエピトープを与えるポリペプチドを使用して得られうる。ＣＳ−Ｄ７標的領域はＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号４７）のアミノ酸約４２−３４２内に位置するらしい。
【００４５】
抗原を認識するタンパク質を選択するためには、種々の技術が利用可能である。そのような技術の具体例には、ファージ提示技術およびハイブリドーマ産生の利用が含まれる。ヒト抗体は、ヒトファージ提示ライブラリーから出発して、あるいはゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）またはトランスクロモ（Ｔｒａｎｓ−Ｃｈｒｏｍｏ）マウスのようなキメラマウスを使用して製造されうる（例えば、Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。
【００４６】
非ヒト抗体、例えばマウス抗体も入手可能である。ヒト抗マウス抗体の潜在的生成は、マウス抗体のヒト化、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）およびキメラ抗体産生の技術を用いて軽減されうる（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｐ８１−１００，Ｆｒｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４；Ｇｏｎｚａｌｅｓら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２６：３１−４３，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５，Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４，２００４を参照されたい）。
【００４７】
抗原結合性タンパク質が標的に選択的に結合する能力を更に増強するために、アフィニティ成熟のような技術も用いられうる。アフィニティ成熟は、例えば、ＣＤＲ領域内に突然変異を導入し、結合に対する該突然変異の効果を判定することにより行われうる。該突然変異を導入するためには、種々の技術が用いられうる（Ｒａｊｐａｌら，ＰＮＡＳ １０２：８４６６−８４７１，２００５，Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６）。
【００４８】
ＩＩ．Ｃ．追加的成分
抗原結合性タンパク質は、可変領域以外の成分、または有用な活性を付与する若しくは付与するのを助ける追加的可変領域（これらに限定されるものではない）を含む追加的成分を含有しうる。有用な活性には、抗体エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性、貪食、補体依存性細胞傷害性および半減期／消失速度が含まれる（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６）。他の有用な活性には、該結合性タンパク質によりスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に運搬されうる傷害性基の利用、およびＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする第１の抗原結合性タンパク質の安定性または活性を増強するための、宿主または外来抗原を標的とする第２の抗原結合性タンパク質の利用が含まれる。
【００４９】
抗体エフェクター機能は、Ｆｃγ受容体、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）およびＣ１ｑのような種々の宿主成分により媒介される（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６，Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：１１６１−１１７３，２００６）。エフェクター機能を増強するために、種々のタイプの抗体成分または改変が用いられうる。有用な成分または改変の具体例には、非フコシル化オリゴ糖、ＦｃＲｎへの増強された結合を伴うアミノ酸、およびＦｃγ受容体への増強された結合を伴うアミノ酸改変が含まれる（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６４０−６５６，２００６；Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３，２００６；Ｌａｚａｒら，米国特許出願公開ＵＳ ２００４／０１３２１０１；Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５：６５９１−６６０４，２００１；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７：２３５１４−２３５２４，２００６）。
【００５０】
本発明の１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は二重特異性である。ＣＳ−Ｄ７を標的とする二重特異性抗原結合性タンパク質は２以上の結合領域を含有し、ここで、１つの領域はＣＳ−Ｄ７標的部位を標的とし、もう１つの領域は別のエピトープを標的とする。追加的な領域が存在しうる。二重特異性抗原結合性タンパク質の一般的なタイプの具体例には、二重特異性抗体および異種重合体が含まれ、それらは共に、例えば二価、三価、四価などの多価の形態で提供されうる。
【００５１】
１つの実施形態においては、該二重特異性抗原結合性タンパク質は二重特異性抗体である（例えば、ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２６：６４９−６５８，２００５；Ｚｕｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７５：３６１−３６７，２０００；Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７−６２１，１９９６；Ａｌｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５４：９０−９４，１９９９；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７−１５，２００１を参照されたい）。もう１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする二重特異性抗体は宿主または外来抗原をも標的とする。宿主抗原は、例えば安定性または活性を増強するために標的化されうる。二重特異性抗体に関連した種々の実施形態に具体例には、以下の任意の組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない：抗体エフェクター機能をもたらしうるＦｃまたは修飾Ｆｃドメインを含有する二重特異性抗体；二価、三価または四価である二重特異性抗体；およびＣ３ｂ様受容体または別の外来抗原、例えばインビボ感染中に細菌表面上で発現されるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原（例えば、ＬＴＡ、莢膜；Ｏ’ＲｉｏｒｄａｎおよびＬｅｅ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．１７：２１８−２３４，２００４；Ｌｅｅｓ Ａ．，ＫｏＫａｉ−ｋｕｎ Ｊ．，ＬｏｐｅｚＡｃｏｓｔａ Ａ．，Ａｃｅｖｅｄｏ Ｊ．，Ｍｏｎｄ Ｊ．２００５．Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｉｎ：８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２００５ Ｍａｙ ８−１１；Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．Ｓ１：ｐ．５８；Ｆｉｓｃｈｅｒら，米国特許第６，６１０，２９３号；Ｓｔｉｎｓｏｎら，米国特許第７，２５０，４９４号）に特異的に結合する第２の抗原結合性タンパク質を含む二重特異性抗体。
【００５２】
もう１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする二重特異性抗原結合性タンパク質は、宿主または外来抗原を標的とする第２の抗原結合性タンパク質と共に異種重合体複合体内に含有されうる。宿主抗原は、該抗原結合性タンパク質の安定性または活性を増強するために標的化されうる。種々の実施形態の具体例には、以下の任意の組合せが含まれる：抗体エフェクター機能をもたらしうるＦｃまたは修飾Ｆｃドメインを含有する異種重合体；二価、三価または四価である二重特異性抗体；およびＣ３ｂ様受容体または別の外来抗原、例えばインビボ感染中に細菌表面上で発現されるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原に特異的に結合する第２の抗原結合性タンパク質を含む異種重合体。異種重合性複合体を形成させるために２つの抗体を化学的に架橋する方法は当技術分野で公知である（Ｔａｙｌｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３０５−３３０９，１９９１；Ｐｏｗｅｒｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３：１３２９−１３３５，１９９５）。
【００５３】
赤血球のＣ３ｂ様受容体への標的化は、該病原体を血流から排除するのを助けうる（Ｌｉｎｄｏｒｆｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８３：１０−２４，２００１；Ｍｏｈａｍｅｄら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７：１４４−１５０，２００５を参照されたい）。霊長類におけるＣ３ｂ様受容体はＣＲ１またはＣＤ３５および因子ＩＩ（他の哺乳類におけるもの）として公知である。正常な免疫粘着条件下、病原体に特異的に結合する抗体に結合した該病原体を含む免疫複合体（「ＩＣ」）は、補体タンパク質（例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ）で標識され、ついでこれは赤血球（「ＲＢＣ」）の表面上のＣＲ１に結合する。ＲＢＣは、Ｆｃ受容体（すなわち、ＦｃγＲ）を発現する貪食細胞（例えば、マクロファージ）にＩＣを運搬して、該ＩＣのＦｃ部分と該細胞表面上のＦｃ受容体との相互作用を介して該貪食細胞にＩＣを移す。該ＩＣは該貪食細胞により破壊され、一方、ＲＢＣは循環へと戻る。１つの抗原結合性タンパク質がＣＲ１に特異的である二重特異性抗原結合性タンパク質複合体を含む異種重合体は、補体カスケードを活性化する必要性を回避する。なぜなら、抗ＣＲ１抗体は、ＣＲ１の天然リガンドであるＣ３ｂの代用物として働くからである。これは、標的消失のための自然免疫粘着過程の効率を改善しうる。
【００５４】
他の実施形態においては、二重特異性抗体または異種重合体はＣＳ−Ｄ７標的領域およびＣＲ１の両方を標的とし、更にＦｃ定常領域を含有する。この実施形態における異種重合体は２つの異なる抗体を含有し、該抗体の一方または両方はＦｃ定常領域を含有する。本発明の１つの実施形態においては、該異種重合体の抗ＣＲ１抗体はマウスＣＲ１に特異的に結合する。もう１つの実施形態においては、該抗ＣＲ１抗体はヒトＣＲ１に特異的に結合する。ＣＲ１特異的抗体は当技術分野で公知である（例えば、Ｎｉｃｋｅｌｌｓら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：２７−３３，１９９８を参照されたい）。
【００５５】
本発明のもう１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は、該抗原結合性タンパク質の物理化学的特性を改変して有意な薬理学的利点をもたらす追加的成分を含む。例えば、分子へのポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）の結合は、治療用物質として使用された場合の該分子の安全性および効率を改善するのを助けうる。物理化学的改変には、該治療用物質の全身的保持を促進するよう一緒になって働きうる、コンホメーション、静電的結合および疎水性における変化が含まれる（これらに限定されるものではない）。また、ＰＥＧ部分を結合させることにより該抗原結合性タンパク質の分子量を増加させることによる薬理学的利点には、循環寿命の延長、安定性の増強、および宿主プロテアーゼからの保護が含まれる。また、ＰＥＧの結合は細胞受容体への該治療用部分の結合アフィニティに影響を及ぼしうる。ＰＥＧは、４０００〜１５，０００以上の分子量範囲の重合体（例えば、４００，０００までの分子量を有するＰＥＧ重合体が商業的に入手可能である）を形成する反復単位（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）から構成される非イオン性重合体である。
【００５６】
ＩＩ．Ｄ．種々の実施形態の具体例
ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は第１可変領域および第２可変領域を含有し、第１および第２可変領域は該標的領域に結合する。本明細書に記載されている指針に基づき、種々のＣＤＲおよびフレームワークアミノ酸を有する、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質が製造されうる。ヒンジ領域、Ｆｃ領域、毒性部分および／または追加的抗原結合性タンパク質もしくは結合性領域のような追加的成分（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）が存在しうる。
【００５７】
該抗原結合性タンパク質に関する第１の実施形態においては、第１可変領域は、以下のＣＤＲのいずれか１つ、２つ又は３つ全てを含むＶｈ領域である。
【００５８】
配列番号４６または配列番号４６と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲは配列番号３５および４０に基づく。配列番号４６は以下のアミノ酸配列ＧＧＳＩＸ１ＳＳＳＹＹＷＧ（ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸である）を有する。好ましくは、Ｘ１はセリンまたはアルギニンである。
【００５９】
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３もしくは配列番号４４または配列番号３６、３８、３９、４１、４３もしくは４４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ。好ましくは、第２ Ｖｈ ＣＤＲは配列番号３６、３８、３９、４１、４３または４４を含む。
【００６０】
配列番号３７、配列番号４２もしくは配列番号４５または配列番号３７、４２もしくは４５と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ。好ましくは、第３ Ｖｈ ＣＤＲは配列番号３７、４２または４５を含む。好ましくは、該Ｖｈ領域は第１ Ｖｈ ＣＤＲ（ＣＤＲ１）、第２ Ｖｈ ＣＤＲ（ＣＤＲ２）および第３ Ｖｈ ＣＤＲ（ＣＤＲ３）を含む。
【００６１】
第２の実施形態においては、第１可変領域は、
ａ）それぞれ配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７；
ｂ）それぞれ配列番号３５、配列番号３８および配列番号３７；
ｃ）それぞれ配列番号３５、配列番号３９および配列番号３７；
ｄ）それぞれ配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２；
ｅ）それぞれ配列番号４０、配列番号４３および配列番号４５；ならびに
ｆ）それぞれ配列番号４０、配列番号４４および配列番号４２
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む第１、第２および第３ ＣＤＲを含むＶｈ領域である。もう１つの実施形態においては、第１可変領域は、配列番号３５を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号３６を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、および配列番号３７を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲを含むＶｈ領域である。
【００６２】
第３の実施形態においては、第２可変領域は、以下のＣＤＲのいずれか１つ、２つ又は３つ全てを含むＶｌ領域である。
【００６３】
配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９もしくは配列番号３２または配列番号１７、２０、２３、２６、２９もしくは３２と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ。好ましくは、第１ Ｖｌ ＣＤＲは配列番号１７、２０、２３、２６、２９または３２を含む。
【００６４】
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０もしくは配列番号３３または配列番号１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ。好ましくは、第２ Ｖｌ ＣＤＲは配列番号１８、２１、２４、２７、３０または３３を含む。
【００６５】
配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１もしくは配列番号３４または配列番号１９、２２、２５、２８、３１もしくは３４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ。好ましくは、第３ Ｖｌ ＣＤＲは配列番号１９、２２、２５、２８、３１または３４を含む。好ましくは、該Ｖｌ領域は第１ Ｖｌ ＣＤＲ（ＣＤＲ１）、第２ Ｖｌ ＣＤＲ（ＣＤＲ２）および第３ Ｖｌ ＣＤＲ（ＣＤＲ３）を含む。
【００６６】
第４の実施形態においては、第２可変領域は、
ａ）それぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９；
ｂ）それぞれ配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２；
ｃ）それぞれ配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５；
ｄ）それぞれ配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８；
ｅ）それぞれ配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；ならびに
ｆ）それぞれ配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む第１、第２および第３ ＣＤＲを含むＶｌ領域である。もう１つの実施形態においては、第１可変領域は、配列番号１７を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、配列番号１８を含む第２ ＶｈｌＣＤＲ、および配列番号１９を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲを含むＶｌ領域である。
【００６７】
第５の実施形態においては、該結合性タンパク質は、第１または第２の実施形態において記載されているＶｈ領域、および第３または第４の実施形態において記載されているＶｌ領域を含有する。
【００６８】
第６の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、第１、第２および第３ ＣＤＲをそれぞれが含むＶｈ領域およびＶｌ領域を含有し、ここで、第１、第２および第３ Ｖｈ ＣＤＲならびに第１、第２および第３ Ｖｌ ＣＤＲは、それぞれ、
ａ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９；
ｂ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２；
ｃ）配列番号３５、配列番号３８、配列番号３７、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５；
ｄ）配列番号３５、配列番号３９、配列番号３７、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８；
ｅ）配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；
ｆ）配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；
ｇ）配列番号４０、配列番号４４、配列番号４２、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；
ｈ）配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号の順序はＶｈ ＣＤＲ１、Ｖｈ ＣＤＲ２、Ｖｈ ＣＤＲ３、Ｖｌ ＣＤＲ１、Ｖｌ ＣＤＲ２およびＶｌ ＣＤＲ３に対応する。もう１つの実施形態においては、Ｖｈ ＣＤＲ１、Ｖｈ ＣＤＲ２、Ｖｈ ＣＤＲ３、Ｖｌ ＣＤＲ１、Ｖｌ ＣＤＲ２およびＶｌ ＣＤＲ３は、それぞれ、アミノ酸配列配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９を含む。
【００６９】
第７の実施形態においては、該結合性タンパク質は、前記の第１〜第６の実施形態に記載されている１以上の可変領域を有する抗体である。もう１つの実施形態においては、該抗体はＩｇＧである。
【００７０】
第８の実施形態においては、前記の第１〜第７の実施形態で提供される可変領域は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２軽鎖または重鎖フレームワークの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するフレームワーク領域を有する（図２および３を参照されたい）。
【００７１】
基準配列に対する配列同一性（同一性比率とも称される）は、配列を該基準配列とアライン（整列）させ、対応領域内の同一アミノ酸の数を決定することにより決定される。この数を該基準配列（例えば、配列番号１のフレームワーク領域）内のアミノ酸の総数で割り算し、ついで１００を掛け、最も近い整数に丸める。配列同一性は、当技術分野で認識されている多数の配列比較アルゴリズムにより、または目視検査により決定されうる（全般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．，Ａ．１Ｅ．１−Ａ．１Ｆ．１１，１９９６−２００４を参照されたい）。他の実施形態においては、該配列同一性はｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｃ２のいずれかのフレームワークに対して少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であり、あるいは該ｍＡｂフレームワークのいずれかと０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸だけ異なる。
【００７２】
第９の実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸１−１２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＶｈ領域である第１可変領域を含む抗体である。もう１つの実施形態においては、該Ｖｈ領域は配列番号２のアミノ酸１−１２６を含む。
【００７３】
第１０の実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のアミノ酸１−１０８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＶｌ領域である第２可変領域を含む抗体である。もう１つの実施形態においては、該Ｖｌ領域は配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む。
【００７４】
第１１の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む軽鎖可変（Ｖｌ）領域、および配列番号２のアミノ酸１−１２６を含む重鎖可変（Ｖｈ）領域；
ｂ）配列番号３を含むＶｌ領域、および配列番号４を含むＶｈ領域；
ｃ）配列番号５を含むＶｌ領域、および配列番号６を含むＶｈ領域；
ｄ）配列番号７を含むＶｌ領域、および配列番号８を含むＶｈ領域；
ｅ）配列番号９を含むＶｌ領域、および配列番号１０を含むＶｈ領域；
ｆ）配列番号１１を含むＶｌ領域、および配列番号１２を含むＶｈ領域；
ｇ）配列番号１３を含むＶｌ領域、および配列番号１４を含むＶｈ領域；ならびに
ｈ）配列番号１５を含むＶｌ領域、および配列番号１６を含むＶｈ領域
のいずれかを含有する抗体である。もう１つの実施形態においては、Ｖｈ領域は配列番号２のアミノ酸１−１２６を含み、Ｖｌ領域は配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む。
【００７５】
第１２の実施形態においては、該結合性タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖、ならびにヒトカッパＣＨ１またはヒトラムダＣＨ１のいずれかを含む軽鎖を含む、前記の第７〜第１１の実施形態に記載されている抗体である。
【００７６】
第１３の実施形態においては、該結合性タンパク質は、軽鎖が配列番号１を含み、重鎖が配列番号２を含む抗体である。
【００７７】
第１４の実施形態においては、該結合性タンパク質は、以下の１以上を含有する前記の第７〜第１３の実施形態に記載されている抗体である：フコシル化されていない又は実質的にフコシル化されていない（すなわち、存在する炭水化物に対してモル換算で１０％未満）グリコシル化パターン；Ｆｃγ受容体結合を増強する１以上のアミノ酸改変；新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合を増強する１以上のアミノ酸改変；およびＣ１ｑ結合を増強する１以上のアミノ酸改変。
【００７８】
第１５の実施形態においては、前記の第１〜第１４の実施形態に記載されている示されている領域（例えば、可変領域、ＣＤＲ領域、フレームワーク領域）は、示されている配列からなる又は示されている配列から実質的になる。可変領域、ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のような領域に関する「から実質的になる」なる語は、アミノおよび／またはカルボキシル末端における１以上の追加的アミノ酸の、可能な存在を示し、ここで、そのようなアミノ酸は該標的への結合を有意に軽減しないものである。
【００７９】
第１６の実施形態においては、前記の第１〜第１５の実施形態に記載されている抗原結合性タンパク質は、該標的抗原に対する１００ｎＭまたはそれ未満のアフィニティＫＤ、または５００ｐＭまたはそれ未満のＫＤを与えるＶｈおよびＶｌ領域を有する。該標的抗原への結合は、実施例８に記載されているとおりに決定されうる。
【００８０】
第１７の実施形態においては、前記の第１〜第１６の実施形態に記載されている抗原結合性タンパク質は、毒性部分、該抗原結合性タンパク質の物理化学的および／または薬理学的特性を増強する分子（これらに限定されるものではない）ならびに第２の抗原結合性タンパク質（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）を含む少なくとも１以上の追加的成分に結合している。もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、第２の抗原結合性タンパク質（例えば、抗ＣＲ１抗体）に化学的に架橋されたＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質を含む異種重合体である。もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は１以上のＰＥＧ部分を有する。
【００８１】
種々の実施形態に記載されているアミノ酸相違（配列同一性における相違をもたらすものを含む）はアミノ酸の欠失、挿入または置換でありうる。活性を維持するアミノ酸置換においては、置換されるアミノ酸は、１以上の類似した特性、例えば、ほぼ同じ電荷、サイズ、極性および／または疎水性を有するべきである。ＣＤＲは、標的への結合をもたらしつつ様々なものであることが可能であり、尚も標的特異性を保有する。フレームワーク領域配列も様々でありうる。
【００８２】
図２および３に示す配列比較はＣＤＲおよびフレームワーク領域内の変異の例を示す。図２および３に例示されているもののほかの変異も生成されうる。アミノ酸相違に関する実施形態においては、追加的変異は保存的アミノ酸置換である。保存的置換はアミノ酸を、類似特性を有する別のアミノ酸で置換するものである。表２は、群内の１つのメンバーが別のメンバーに対する保存的置換であるアミノ酸群の一覧を示す。
【００８３】
【表２】
【００８４】
ＩＩ．Ｅ．抗原結合性タンパク質混合物
ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質は、抗原結合性タンパク質混合物を形成させるために、異なるＯＲＦ０６５７ｎエピトープまたは異なるタンパク質を標的とする１以上の追加的結合性タンパク質と共に製剤化されうる。本発明の１つの実施形態は、少なくとも２つの抗原結合性タンパク質の組合せ又はそれらの複合体を含む抗原結合性タンパク質混合物に関するものであり（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）、この場合、該抗原結合性タンパク質の少なくとも１つは本明細書に記載のＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする。該追加的抗原結合性タンパク質は、好ましくは、インビボ感染中に細菌細胞表面上で発現される、以下のものを含む追加的なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原に特異的である：ＬＴＡおよび莢膜（Ｏ’ＲｉｏｒｄａｎおよびＬｅｅ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．１７：２１８−２３４，２００４；Ｌｅｅｓ Ａ．，ＫｏＫａｉ−ｋｕｎ Ｊ．，ＬｏｐｅｚＡｃｏｓｔａ Ａ．，Ａｃｅｖｅｄｏ Ｊ．，Ｍｏｎｄ Ｊ．２００５．Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｉｎ：８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２００５ Ｍａｙ ８−１１；Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．Ｓ１：ｐ．５８；Ｆｉｓｃｈｅｒら，米国特許第６，６１０，２９３号；Ｓｔｉｎｓｏｎら，米国特許第７，２５０，４９４号）；ｓａｉ−１関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／７９３１５）；ＯＲＦ０５９４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／０８６６６３）；ＯＲＦ０８２６関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／１１５１１３）；ＰＢＰ４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０６／０３３９１８）；ＡｈｐＣ関連ポリペプチドおよびＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物（Ｋｅｌｌｙら，国際公開番号ＷＯ ０６／０７８６８０）；スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型および８型莢膜多糖（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４９１−４９６，２００２）；コラーゲンアドヘシン、フィブリノーゲン結合性タンパク質およびクランピング因子（Ｍａｍｏら，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０：４７−５４，１９９４，Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６４０−２６４９，１９９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４：１５７２−１５８０，２００１）；ならびに多糖細胞間アドヘシンおよびその断片（Ｊｏｙｃｅら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：９０３−９２２，２００３）。
【００８５】
１つの実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする該混合物中に含まれる抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体である。もう１つの実施形態においては、該抗体混合物中に含まれる各抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質混合物は、該混合物の治療的有効量および医薬上許容される担体を含有する医薬組成物の一部である。
【００８６】
したがって、該抗原結合性タンパク質の少なくとも１つがＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質複合体（前記第ＩＩ．Ｃ節を参照されたい）の混合物が本発明のこの部分に含まれる。例えば、本発明は更に、少なくとも２つの異種重合体複合体（ここで、１つの異種重合体複合体は、ＣＲ１に特異的に結合する抗体に化学的に架橋された、本明細書に記載のＣＳ−Ｄ７標的領域を標的とする抗原結合性タンパク質を含む）の組合せを含む、第ＩＩ．Ｃ節に記載されている異種重合体複合体の混合物に関する。この異種重合体は、ＣＲ１に特異的に結合する抗体に化学的に架橋されたインビボ感染中に細菌細胞表面上で発現される追加的なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原（例えば、ＬＴＡ、莢膜）に特異的に結合する抗原結合性タンパク質を含む第２の異種重合体複合体との抗原結合性タンパク質混合物の形態で組合されうる。
【００８７】
ＩＩＩ．タンパク質の製造
抗原結合性タンパク質およびその領域は、好ましくは、組換え核酸技術またはハイブリドーマの使用により製造される。Ｖｈ領域およびＶｌ領域を含有する一本鎖タンパク質、例えば一本鎖抗体、およびその抗体またはフラグメント、ならびに別のタンパク質の一部としてＶｈおよびＶｌ領域を含有する多鎖タンパク質を含む種々の抗原結合性タンパク質が製造されうる。
【００８８】
組換え核酸技術は、タンパク質合成のための核酸鋳型を構築することを含む。ハイブリドーマ技術は、該抗原結合性タンパク質を製造するために不死化細胞系を使用することを含む。適当な組換え核酸およびハイブリドーマ技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。
【００８９】
ＩＩＩ．Ａ．組換え核酸
抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸は、実際に該コード化タンパク質の生産工場として働く宿主細胞内で発現されうる。該組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する該抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を与えうる。
【００９０】
組換え遺伝子は、タンパク質の発現のための調節要素と共に、タンパク質をコードする核酸を含有する。一般には、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。抗体に関連するイントロンも存在しうる。抗体または抗体フラグメントの製造のための発現カセットの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０，２００１，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００９１】
遺伝暗号の縮重のため、特定のタンパク質をコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００９２】
細胞内の組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。好ましくは、発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および潜在的な高コピー数をも含有する。
【００９３】
所望により、当技術分野でよく知られた技術を用いて（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｍａｒｋｓら，国際出願番号ＷＯ９５／１７５１６（国際公開日１９９５年６月２９日）を参照されたい）、抗体をコードする核酸を宿主染色体内に組込むことが可能である。
【００９４】
ＩＩＩ．Ｂ．組み換え核酸の発現
組換え抗原結合性タンパク質の発現には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）およびストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（または放線菌属））および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類）に由来する細胞系を含む多種多様な細胞系が使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９−６０，２００４，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）。
【００９５】
組換え抗原結合性タンパク質の発現のための好ましい宿主は哺乳類翻訳後修飾をもたらす。翻訳後修飾には、化学的修飾、例えばグリコシル化およびジスルフィド結合形成が含まれる。もう１つのタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。
【００９６】
グリコシル化は抗体エフェクター機能に重要でありうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２、Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６，Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３，２００６）。
【００９７】
効率的な翻訳後修飾を得るために、哺乳類宿主細胞および非哺乳類細胞を含む種々のタイプの宿主細胞が使用されうる。哺乳類宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）および骨髄腫細胞が含まれうる。哺乳類宿主細胞は、例えば、グリコシル化をもたらすために修飾されうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７、Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０−６５６，２００６，Ｓａｔｏｈら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３，２００６）。非哺乳類細胞は、所望のグリコシル化をもたらすために修飾されうる（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、そのような修飾された非哺乳類細胞の一例である（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。
【００９８】
ＩＩＩ．Ｃ．種々の実施形態の具体例
抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域もしくはＶｌ領域をコードする又はそれらの領域の両方をコードする１以上の組換え遺伝子を含む核酸は、ＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する完全な結合性タンパク質または該結合性タンパク質の成分を製造するために使用されうる。完全な結合性タンパク質は、例えば、一本鎖抗体のようなＶｈ領域およびＶｌ領域を含有する一本鎖タンパク質をコードする単一の組換え遺伝子を使用することにより、あるいは例えば、個々のＶｈおよびＶｌ領域を製造するために複数の組換え遺伝子を使用することにより得られうる。また、結合性タンパク質の領域は、例えば、別々の細胞内でＶｈ領域またはＶｌ領域を含有するポリペプチドを製造することにより得られうる。
【００９９】
したがって、本発明は、抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域またはＶｌ領域（該ＶｈまたはＶｌ領域を含むタンパク質はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する）をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含む。もう１つの実施形態においては、該核酸は２つの組換え遺伝子を含み、第１の組換え遺伝子は抗体結合性タンパク質Ｖｈ領域をコードし、第２の組換え遺伝子は抗原結合性タンパク質Ｖｌ領域をコードする。
【０１００】
種々の実施形態において、１以上の組換え遺伝子は該抗原結合性タンパク質、またはＶｈ領域もしくはＶｌ領域（前記第ＩＩ．Ｄに記載されているとおり）をコードする。好ましくは、該組換え遺伝子は、抗原結合性タンパク質を製造するために単一の宿主細胞内で発現される。該タンパク質は該細胞から精製されうる。
【０１０１】
ＩＶ．抗原結合性タンパク質の用途
適当なエピトープを認識する抗原結合性タンパク質は治療用途および他の用途を有しうる。他の用途には、ＯＲＦ０６５７ｎ抗原およびワクチンの製造、特徴づけ又は研究を促進するための、ＯＲＦ０６５７ｎ標的領域を認識する抗原結合性タンパク質の使用が含まれる。あるＯＲＦ０６５７ｎ領域を含有する抗原は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫応答をもたらすために使用されうる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ２００５／００９３７９（国際公開日２００５年２月３日））。
【０１０２】
標的タンパク質の製造、特徴づけ又は研究においてモノクローナル抗体のような抗原結合性タンパク質を使用するための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２００５，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗら，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，Ｌｉｐｍａｎら，ＩＬＡＲ Ｊｏｕｒｎａｌ ４６：２５８−２６８，２００５を参照されたい）。
【０１０３】
本発明の１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質を使用して、溶液中の又はミクロスフェアに結合した又は細胞上のＯＲＦ０６５７ｎ抗原の存在を確認する。溶液または細胞に存在するタンパク質への該結合性タンパク質の結合能は、ウエスタンブロット、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーおよびルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）イムノアッセイのような種々の技術を用いて測定されうる。
【０１０４】
ＶＩ．治療
適当な標的領域に結合する抗原結合性タンパク質を使用して、治療的および予防的治療が患者に対して行われうる。治療的治療は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染した者に対して行われる。予防的治療は一般集団または一般集団の小集団に対して行われうる。一般集団の好ましい小集団としては、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者の小集団が挙げられる。
【０１０５】
治療的および予防的治療は、本明細書に記載の抗原結合性タンパク質またはその医薬組成物を患者に投与する工程を含む、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して患者を防御または治療する方法を含む。所望により、本発明で提供する抗原結合性タンパク質組成物は抗原結合性タンパク質の混合物の一部として提供されうる（例えば、前記第ＩＩ．Ｅ節を参照されたい）。また、該抗原結合性タンパク質組成物は、追加的医薬物質も与えられる組合せ療法（併用療法）計画の一部として投与されうる。したがって、該抗原結合性タンパク質の投与は、単独で又は追加的物質と組合されて、医薬的に活性な担体を含む組成物の形態をとりうる。
【０１０６】
組合せ療法は、医学的効果を有する１以上の追加的成分（限定的なものではないがワクチン抗原または抗生物質を含む）と共に、本明細書に記載されている抗原結合性タンパク質（例えば、前記第ＩＩ節を参照されたい）を使用して行われうる。治療の時機は、予防的および／または治療的治療が達成されるよう設計されうる。例えば、該追加的成分は、該抗原結合性タンパク質での治療と同時に、または該抗原結合性タンパク質での治療の前または後の短期間のうちに投与されうる。短期間のうちの投与は、患者のための最良の治療計画に応じて、抗原結合性タンパク質の投与から約２週間以内の期間を意味する。
【０１０７】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して有効な抗生物質の投与は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｎｓｔｅａｄら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３９１：２２７−２５８，２００７；Ｍｉｃｅｋ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４５：Ｓ１８４−Ｓ１９０，２００７；Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４６：１０３２−１０３７，２００８）を参照されたい）。組合せ治療のための可能な抗生物質には、例えば、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、リファンピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、キヌプリンチン−ダルフォプリスチン（ｑｕｉｎｕｐｒｉｎｔｉｎ−ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、オリタバンシン（ｏｒｉｔａｖａｎｃｉｎ）、ダルババンシン（ｄａｌｂａｖａｎｃｉｎ）、セフトビプロール（ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ）、テラバンシン（ｔｅｌａｖａｎｃｉｎ）およびイクラプリム（ｉｃｌａｐｒｉｍ）が含まれる。
【０１０８】
組合せ治療のための可能な抗原には、例えば、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／００９３７９）；ｓａｉ−１関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／７９３１５）；ＯＲＦ０５９４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／０８６６６３）；ＯＲＦ０８２６関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０５／１１５１１３）；ＰＢＰ４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，国際公開番号ＷＯ ０６／０３３９１８）；ＡｈｐＣ関連ポリペプチドおよびＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物（Ｋｅｌｌｙら，国際公開番号ＷＯ ０６／０７８６８０）；スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型および８型莢膜多糖（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４９１−４９６，２００２）；コラーゲンアドヘシン、フィブリノーゲン結合性タンパク質およびクランピング因子（Ｍａｍｏら，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０：４７−５４，１９９４，Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６４０−２６４９，１９９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４：１５７２−１５８０，２００１）；ならびに多糖細胞間アドヘシンおよびその断片（Ｊｏｙｃｅら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：９０３−９２２，２００３）が含まれる。
【０１０９】
「患者」は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる哺乳動物を意味する。好ましくは、患者はヒトである。しかし、他のタイプの哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ラットおよびマウスもスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる。非ヒト患者の治療は、ペットおよび家畜を防御するのに、ならびに特定の治療の効力を評価するのに有用である。
【０１１０】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者には、医療従事者、入院患者、低下した免疫系を有する患者、手術を受けている患者、カテーテルまたは血管装置のような異物インプラントを受け入れている患者、免疫低下を招く療法を受けている患者、および火傷または創傷のリスクの高い職業の者が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。
【０１１１】
１つの実施形態においては、手術または異物インプラントと共に、１以上の抗原結合性タンパク質を患者に投与する。「手術または異物インプラント」なる語は、異物インプラントの付与を伴う又は伴わない手術、および手術を伴う又は伴わない異物インプラントの付与を含む。投与の時機は、予防的治療および／または治療的治療が達成されうよう計画されうる。投与は、好ましくは、手術または移植とほぼ同時に開始されうる。
【０１１２】
医薬投与全般に関する指針は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【０１１３】
医薬上許容される担体は抗原結合性タンパク質の保存および投与を促進する。タンパク質溶液製剤を安定化するために使用される物質には、炭水化物、アミノ酸および緩衝化塩が含まれる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３７：３３−５８，１９９９）。
【０１１４】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の抗原結合性タンパク質を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。有効用量範囲は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇとなると予想される。投与頻度は該化合物の有効性および安定性によって異なりうる。投与頻度の具体例には、隔週、毎週、毎月および隔月が含まれる。
【０１１５】
ＶＩ．ＣＳ−Ｄ７標的断片
ＯＲＦ０６５７ｎ領域（配列番号４７）内に存在しｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７が結合するＣＳ−Ｄ７標的断片は、例えば、前記ＩＩ．Ｂに記載されているとおり、追加的な抗体を生成させるために使用されうる。ＣＳ−Ｄ７標的断片は、免疫応答を惹起するためにも使用されうる。好ましくは、ＣＳ−Ｄ７標的断片はＣＳ−Ｄ７標的領域を含有する。したがって、ＣＳ−Ｄ７標的領域はＯＲＦ０６５７ｎにより提供される。ＣＳ−Ｄ７標的断片はＯＲＦ０６５７ｎ領域のアミノ酸約４２−３４２内に含有されているようであり（実施例６を参照されたい）、この領域に由来する、より小さな断片中に存在しうる。
【０１１６】
潜在的ＣＳ−Ｄ７標的断片は、以下に記載する種々の実施形態により提供される。第１の実施形態においては、ＣＳ−Ｄ７標的断片は、配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、配列番号４７のアミノ酸４２−２８５および配列番号４７のアミノ酸１０３−２８５よりなる群から選ばれるＯＲＦ０６５７ｎ（配列番号４７）の部分に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチドは３５０アミノ酸長以下である。該ポリペプチドの長さに関する追加的な実施形態においては、該ポリペプチドは２５０アミノ酸以下または２００アミノ酸以下である。追加的アミノ酸は、好ましくは、追加的ＯＲＦ０６５７ｎ領域である。
【０１１７】
第１の実施形態を更に詳しく記載する第２の実施形態においては、配列番号４７関連ポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、アミノ酸４２−２８５またはアミノ酸１０３−２８５に対して少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であり、あるいは配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、アミノ酸４２−２８５またはアミノ酸１０３−２８５と０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の改変だけ異なり、あるいは配列番号４７から実質的になる。各アミノ酸改変は、独立して、アミノ酸の置換、欠失または付加である。該改変は配列番号４７領域内に存在することが可能であり、あるいは配列番号４７領域に付加されうる。
【０１１８】
示されているアミノ酸の「から実質的になる」なる語は、言及されているアミノ酸が存在し、追加的なアミノ酸が存在しうることを示す。追加的なアミノ酸はカルボキシルまたはアミノ末端に存在しうる。種々の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加的なアミノ酸が配列番号４７のアミノ酸４２−３４２、アミノ酸４２−２８５またはアミノ酸１０３−２８５付加される。追加的なアミノ酸の一例はアミノ末端メチオニンである。
【０１１９】
免疫応答の惹起は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療的または予防的に治療するのを助けるのに有用でありうる。当技術分野でよく知られた技術と共に本明細書に記載の指針を用いて、免疫原が製剤化され、患者に投与されうる。医薬投与全般に関する指針は、例えばＶａｃｃｉｎｅｓ，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【０１２０】
医薬上許容される担体は免疫原の保存および患者への免疫原の投与を促進する。医薬上許容される担体は、種々の成分、例えばバッファー、無菌注射用水、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートを含有しうる。
【０１２１】
免疫原は種々の経路（例えば、皮下、筋肉内または粘膜）で投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針またはジェット・インジェクターを使用して行われうる。
【０１２２】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の化合物を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。該免疫原は多用量ワクチン形態で使用されうる。用量は全ポリペプチド１．０μｇ〜１．０ｍｇの範囲よりなると予想される。種々の実施形態において、該範囲は５．０μｇ〜５００μｇ、０．０１ｍｇ〜１．０ｍｇ、または０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。
【０１２３】
投与の時機は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初回投与後、１以上の追加用量を投与して抗体価を維持または増強することが可能である。投与計画の一例としては、第１日、第１ヶ月、第３投与としての第４、６または１２ヶ月の投与、および必要に応じて行う、間隔をあけて投与する追加的な追加投与が挙げられるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１はＩｇＧ分子の構造を例示する。「Ｖｌ」は可変領域の軽鎖を意味する。「Ｖｈ」は重鎖可変領域を意味する。「Ｃｌ」は軽鎖定常領域を意味する。「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は重鎖定常領域である。点線はジスルフィド結合を示す。
【図２】図２は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７軽鎖可変領域（配列番号１のアミノ酸１−１０８）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｅ１１軽鎖可変領域（配列番号３）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０軽鎖可変領域（配列番号５）、ｍＡｂ ＣＳ−Ａ１０軽鎖可変領域（配列番号７）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１軽鎖可変領域（配列番号９）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｅ６軽鎖可変領域（配列番号１１）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４軽鎖可変領域（配列番号１３）およびｍＡｂ ＢＭＶ−Ｃ２軽鎖可変領域（配列番号１５）の配列比較を示す。相補性決定領域１、２および３が、異なるＣＤＲ配列を特定する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）と共に、太字で示されている。
【図３】図３は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７重鎖可変領域（配列番号２のアミノ酸１−１２６）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｅ１１重鎖可変領域（配列番号４）、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０重鎖可変領域（配列番号６）、ｍＡｂ ＣＳ−Ａ１０重鎖可変領域（配列番号８）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１重鎖可変領域（配列番号１０）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｅ６重鎖可変領域（配列番号１２）、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４重鎖可変領域（配列番号１４）およびｍＡｂ ＢＭＶ−Ｃ２重鎖可変領域（配列番号１６）の配列比較を示す。相補性決定領域１、２および３が、異なるＣＤＲ配列を特定する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）と共に、太字で示されている。
【図４】図４は、オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御をもたらしうることを例示する。
【図５】図５は、オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御をもたらしうることを例示する。
【図６】図６は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）菌血症を軽減しうることを例示する。
【０１２５】
ＶＩＩ．実施例
本発明の種々の特徴を更に詳しく例示する実施例を以下に記載する。該実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２６】
ｓｃＦｖライブラリーからの抗０６５７ｎ ｍＡｂの単離
ファージ提示ライブラリーを使用して、ＯＲＦ０６５７ｎに特異的なｓｃＦｖを特定した。該ライブラリーをＯＲＦ０６５７ｎＨでパンニングした。ついでｓｃＦＶを対抗スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎ）して、それらがＯＲＦ０６５７ｔに結合するかどうかを判定した。配列番号４７はＯＲＦ０６５７ｎスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）配列を示す。ＯＲＦ０６５７ｔはＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸４２−４８６に対応する。ＯＲＨ０６５７ｎＨはＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸４２−６０９に対応する。ＯＲＦ０６５７ｎＨおよびＯＲＦ０６５７ｔを酵母内で発現させた。
【０１２７】
固相パンニングを用いて、３つのケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）抗体ライブラリー（ＢＭＶ：末梢血リンパ球；ＣＳ：脾臓リンパ球；およびＤＰ４７：ＣＳライブラリーのＶｈ ＣＤＲ３およびＶｌを伴う生殖系列ＤＰ４７フレームワーク）をＯＲＦ０６５７ｎＨ（１０μｇ／ｍｌ）に対するｓｃＦＶに関してスクリーニングした。特定された２６４個中１９０個がＯＲＦ０６５７ｔに特異的であった。２６４個中１７２個は、可変領域ＤＮＡ配列決定から重複物を除去した後に特定された。ＤＮＡ配列分析は、重複配列および終止コドン含有配列の除去の後、ＤＰ４７スクリーニングからは４１個、ＢＭＶスクリーニングからは５７個、およびＣＳライブラリースクリーニングからは７４個の重複無し（ユニーク）の配列を特定した。
【０１２８】
ファージＥＬＩＳＡスクリーニング − 選択されたｓｃＦｖ−ファージクローンの抗原特異性を実証するために、ラウンド２における各ライブラリーからの１７２個のファージクローンおよびそれぞれの第３ラウンドのライブラリーからの８８個のクローンをＥＬＩＳＡにおいて試験した。ＥＬＩＳＡ陽性体の組をフローサイトメトリーにより及び競合ルミネックス（ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイにおいて更に試験した。フローサイトメトリーにより測定された、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細胞表面上のＯＲＦ０６５７ｎに結合したｓｃＦｖを、後記のとおりに完全ＩｇＧに変換した。
【０１２９】
フローサイトメトリースクリーニング − 種々のｓｃＦｖのＯＲＦ０６７５ｎ結合部位を決定するために、フローサイトメトリー分析を行った。この分析に使用したスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を鉄欠損規定培地（ＲＰＭＩ１６４０）内で増殖させた。固相ファージ提示パンニングのラウンド２から単離された１００個を超えるｓｃＦｖを、２×ＲＰＭＩ内で増殖させたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｂｅｃｋｅｒ細胞に対してフローサイトメトリーにより検査した。試験したｓｃＦｖのほとんどは種々の度合の結合を示した。これらの実験から得られたデータは、パンニングから単離されたｓｃＦｖがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合することを証明した。
【０１３０】
ＩｇＧ変換 − ＩｇＧ変換のために１２個のｓｃＦｖクローンを特定した。可変領域の配列をＰＣＲ増幅し、重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させ、一方、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、対応定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合させた。得られた抗体発現ベクターのクローニング法を以下に説明する。
【０１３１】
軽鎖および重鎖の両方の発現をヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより駆動した。前方部のリーダー配列は培地内への抗体の分泌を引き起こした。重鎖リーダー配列はＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号４９）であった。軽鎖リーダー配列はＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号５０）であった。発現ベクターは、２９３ＥＢＮＡ細胞内での持続的発現のためのＥＢＶウイルスゲノム由来のｏｒｉＰ、およびカナマイシン選択マーカー用の細菌配列、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の複製起点を含有する。
【０１３２】
該可変領域をＰＣＲ増幅した。高忠実度ＰＣＲマスター混合物、１μｌの鋳型容量ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ１μｌ）を含有する２５μｌの容量中でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間の１サイクル；以下の２５サイクル：９４℃で１．５分間；６０℃で１．５分間；７２℃で１．５分間および７２℃で７分間；取り出し、ならびに５末端におけるリーダー配列および３’末端における定常領域へのインフレームでのクローニング（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を利用）まで４℃。例えば、以下のプライマー（軽鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴ（配列番号５１）；軽鎖リバース，５’−ＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＣＧＴＧＴＣＣＣ（配列番号５２）；重鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧ（配列番号５３）および重鎖リバース，５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴ（配列番号５４））を使用して、クローンＣＳ−Ｄ７抗体をクローニングした。
【０１３３】
該クローンの残りを同様にして変換した。それらの全てのクローンのＤＮＡ配列を配列決定により確認した。以下に更に詳しく説明するとおり、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｃ２、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０およびＣＳ−Ｅ１１は、Ｌｕｍｉｎｅｘ結合アッセイを用いた場合、同一エピトープへの結合に関して競合する。
【０１３４】
ＤＮＡ配列から推定された抗体ＣＳ−Ｄ７の完全長アミノ酸配列を以下の表３に示す。可変領域が太字で示されており、ＣＤＲが下線で示されている。
【０１３５】
ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＣＳ−Ｅ１１、ＢＭＶ−Ｅ６およびＢＭＶ−Ｃ２軽鎖および重鎖可変領域の配列比較を図２および３に示す。重鎖定常領域の配列は全て同一であり、軽鎖定常領域の配列はカッパまたはラムダのいずれかである。ＭＡｂ ＣＳ−Ｄ７はカッパ配列を含有し、これは、配列番号１のアミノ酸１０９−２１０に対応する。ＭＡｂ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０、ＣＳ−Ｅ１１、ＢＭＶ−Ｅ６およびＢＭＶ−Ｃ２は、配列番号４８により示されるラムダ配列を含有する。
【０１３６】
該抗体を２９３ＥＢＮＡ単層細胞内で発現させた。ＰＥＩに基づくトランスフェクション試薬を使用して、該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地内でインキュベートし、プロテインＡ／Ｇアフィニティクロマトグラフィーを用いて、分泌された抗体を培地から精製した。精製された抗体の濃度をＯＤ２８０ｎｍにより決定し、純度をＬａｂＣｈｉｐキャピラリー電気泳動により決定した。
【０１３７】
【表３】
【実施例２】
【０１３８】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（ルミネックス）結合研究
ＣＡＴ ｓｃＦｖの選択物（実施例１を参照されたい）を、マウスｍＡｂ（２Ｈ２、１３Ｃ７、１Ｇ３および１３Ｇ１１）およびＣＡＴ ｍＡｂ（ＣＳ−Ｄ３、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ｅ１１、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２）のパネルに対するスクリーニングにより特徴づけして、それらがＯＲＦ０６５７ｎ上の同一エピトープに関して競合するかどうか、または異なるエピトープに結合するかどうかを判定した。これらのアッセイにおいては、単一のＣＡＴ ｓｃＦｖ（またはＣＡＴ ｍＡｂ）を単一のｍＡｂ（マウスまたはＣＡＴ）に対して競合させた。
【０１３９】
マウス２Ｈ２、１Ｇ３、１３Ｃ７または１３Ｇ１１は２００７年１月２３日付け出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／０１６８７（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ０７／０１６８７（国際公開番号ＷＯ ２００７／０８９４７０）は、ブダペスト条約に従い２００５年９月３０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託されている、ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４、ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１、ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１およびｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生するハイブリドーマ細胞系に関するものである。該細胞系はＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２４（ｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１を産生する），ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２５（ｍＡｂ １３Ｃ７．ＢＣ１を産生する）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２６（ｍＡｂ １Ｇ３．ＢＤ４を産生する）およびＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−７１２７（ｍＡｂ １３Ｇ１１．ＢＦ３を産生する）と命名された。
【０１４０】
ＯＲＦ０６５７ｎ−ビーズの構築 − ９．４×１０６個のＲａｄｉｘマレイミドミクロスフェア（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＴＸ）を７５０μｇのＯＲＦ０６５７ｎ−Ｓｅ（カルボキシル末端システイン基を含有するＯＲＦ０６５７ｎ）に室温で２時間にわたって結合（カップリング）させた。ビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、ついで１Ｍ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ）で室温で２時間クエンチした。ミクロスフェアをＰＢＳ中で３回洗浄した。ビーズを計数し、５００ミクロスフェア／μｌの最終濃度で再懸濁させた。
【０１４１】
ＣＡＴ ｓｃＦｖとマウスＡｂとの競合の検出 − ＣＡＴ ｓｃＦｖをＰＢＳ−ＴＢＮ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウム）中、１：４、１：８、１：１６および１：３２で希釈し、５０００個のＯＲＦ０６５７ｎ結合ミクロスフェアと共にマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で室温で１時間１５分にわたってインキュベートした。ついで該ビーズを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。結合したＣＡＴ ｓｃＦｖを伴うＯＲＦ０６５７ｎ−ビーズをマウスモノクローナル抗体（２Ｈ２、１Ｇ３、１３Ｃ７または１３Ｇ１１）と共にインキュベートした。該マウスｍＡｂはＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート（Ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．）で商業的に標識されていた。該標識ｍＡｂをＰＢＳ−ＴＢＮ中で２μｇ／ｍｌの最終濃度に別々に希釈した。該希釈ｍＡｂ（５０μＬ／ウェル）をプレートに加え、これを室温で更に１時間１５分インキュベートした。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘルミノメーター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して中央値蛍光シグナルを読取った。
【０１４２】
ｓｃＦｖと該マウスＡｂとの結合競合に基づき、被験抗体の結合部位を以下の群に分類した：群１，ｓｃＦｖ ＢＭＶ−Ｃ２、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｈ１１、ＣＳ−Ｅ１１、ＣＳ−Ａ１０、ＣＳ−Ｄ１０およびＣＳ−Ｄ７は該マウスｍＡｂのいずれとも競合しなかった；群２，２つのｓｃＦｖがマウスｍＡｂ ２Ｈ２と競合した；群３，２つのｓｃＦｖがｍＡｂ １Ｇ３と競合した；群４，該ｓｃＦｖのいずれもｍＡｂ １３Ｃ７と競合しなかった；ならびに群５，該ｓｃＦｖのいずれもｍＡｂ １３Ｇ１１と競合しなかった。ｓｃＦｖ ＣＳ−Ｄ１０およびＣＳ−Ｄ７に関しては、Ｂｉａｃｏｒｅを用いた結果は、Ｌｕｍｉｎｅｘを用いた本研究における分析と異なっていた（後記実施例５を参照されたい）。
【０１４３】
ＣＡＴ ｍＡｂとマウスｍＡｂとの間の競合の検出 − マウスｍＡｂ ２Ｈ２と競合するｓｃＦｖであるｓｃＦｖ ＢＭＶ−Ｄ４、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０およびＢＭＶ−Ｃ２ならびに１Ｇ３と競合する２つのｓｃＦｖを、実施例１に記載されているとおりにＩｇＧ抗体に変換した。ＣＡＴ ｍＡｂをＰＢＳ−ＴＢＮ中、２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０００個のＯＲＦ０６５７ｎ結合ミクロスフェアと共にマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で室温で１時間１５分にわたってインキュベートした。ついで該ビーズを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。結合したＣＡＴ ｍＡｂを伴うＯＲＦ０６５７ｎ−ビーズをマウスモノクローナル抗体（２Ｈ２、１Ｇ３、１３Ｃ７または１３Ｇ１１）と共にインキュベートした。該マウスｍＡｂはＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート（Ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．）で商業的に標識されていた。該標識ｍＡｂをＰＢＳ−ＴＢＮ中で２μｇ／ｍｌの最終濃度に別々に希釈した。該希釈ｍＡｂ（５０μＬ／ウェル）をプレートに加え、これらを室温で更に１時間１５分インキュベートした。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘルミノメーター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して中央値蛍光シグナルを読取った。
【０１４４】
マウスｍＡｂに対する競合に関してＣＡＴ ｍＡｂを試験した。前記のｓｃＦｖおよびマウスｍＡｂ競合の場合と同様にして、同じ５つの群を観察した。
【０１４５】
ＣＡＴ ｓｃＦｖとＣＡＴ ｍＡｂとの間の競合の検出 − Ｌｕｍｉｎｅｘ ｃＬＩＡアッセイにおいて、ＣＡＴ ｓｃＦｖをＣＡＴ抗体に対して個々に競合させた。ｓｃＦｖをＰＢＳ−ＴＢＮ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウム）中、１：４、１：８、１：１６および１：３２で希釈し、５０００個のＯＲＦ０６５７ｎ結合ミクロスフェアと共にマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で室温で１時間１５分にわたってインキュベートした。ついで該ビーズを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。それらの個々の抗体をＰＢＳ−ＴＢＮ中で２μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、別々のプレートに加えた。５０μＬ／ウェルの該希釈抗体を該プレートに加え、これらを室温で更に１時間１５分インキュベートした。該プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。Ｂｉｏｔｒｅｎｄの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体ＨＰ６０４３（Ｒ−フィコエリトリンで標識されたもの）を１：５０に希釈した。５０μＬ／ウェルの希釈抗体を該プレートに加えた。該プレートを室温で１時間１５分インキュベートした。該ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ミクロスフェアをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘルミノメーター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して中央値蛍光シグナルを読取った。少なくとも２つの希釈度で非競合的ｓｃＦｖに関して検出されたシグナルに対して該中央値蛍光シグナルが少なくとも３０％減少した場合、ｓｃＦｖは競合的であるとみなされた。
【０１４６】
個々のｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｅ６、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０およびＣＳ−Ｅ１１に対する個々のｓｃＦｖｓ ＢＭＶ−Ｈ１１、ＢＭＶ−Ｄ４、ＢＭＶ−Ｅ６、ＢＭＶ−Ｃ２、ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＣＳ−Ａ１０およびＣＳ−Ｅ１１に関する競合の結果を表４に示す。第１列における各ｓｃＦｖは、第２列に示されているｍＡｂの全てに対して個々に競合することが判明した。
【０１４７】
【表４】
【実施例３】
【０１４８】
ＯＲＦ０６５７ｎへの結合のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）測定
ＯＲＦ０６５７ｎへの抗体結合をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標登録）は、カルボキシルメチルデキストランでコーティングされた（ＣＭ５）センサーチップの表面に直接照射される偏光の屈折率の変化をモニターすることにより質量変化を検出するために、ミクロフルイディクス技術および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を組合せたものである。応答単位（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）として測定される応答の変化は結合アナライト（例えば、抗原または抗体）の量に相関されうる。
【０１４９】
ＯＲＦ０６５７ｎへのアフィニティ結合を、抗スタヒロコッカス（ａｎｔｉ−Ｓｔａｐｈ）抗体ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した。該抗体を該ＣＭ５センサーチップの表面上に共有結合させた。該結合Ａｂを、まず、ＯＲＦ０６５７ｎにさらし、ついで、低濃度（５μｇ／ｍＬ）で試験される抗体にさらした。ＯＲＦ０６５７ｎ＋抗体の各サイクルの後、２０ｍＭ ＨＣｌを使用して、該センサーチップの表面を該固定化１３Ｃ７．Ｄ１２へと再生させた。
【０１５０】
各実施において最初に結合した（捕捉された）抗原の量を正規化するために、各試験抗体／抗原複合体に関する以下の比を計算する。
【０１５１】
【数１】
【０１５２】
結果を表５に示す。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ４およびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ６に関する有意な結合は示されなかった。ＩｇＧ結合の欠如の理由には、ＩｇＧタンパク質の非存在または不正確な値、抗体凝集、非常に低い結合活性、あるいは捕捉抗体との完全な重複（該抗原が単量体形態でのみ存在する場合）が含まれる。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ４およびｍＡｂ ＣＳ−Ｅ６の結合は、抗体濃度を有意に増加させるペア形態（ｐａｉｒｗｉｓｅ）結合研究において観察された（後記実施例４）。
【０１５３】
【表５】
【実施例４】
【０１５４】
ペア形態の競合結合
ＯＲＦ０６５７ｎへの抗体の相対結合を測定するために、ペア形態の結合実験を行った。抗スタヒロコッカス抗体ｍＡｂ １３Ｃ７．Ｄ１２を該ＣＭ５センサーチップの表面上に共有結合（固定化）させた。該固定化Ａｂを、まず、該ＯＲＦ０６５７ｎにさらし、ついでマトリックス（行列）形態で抗体のペアにさらした。ＯＲＦ０６５７ｎタンパク質＋抗体ペアの各サイクルの後、２０ｍＭ ＨＣｌを使用して、センサーチップの表面を固定化１３Ｃ７．Ｄ１２へと再生させた。各抗体ペアの全ての組合せが分析されうるよう、マトリックス形態でＯＲＦ０６５７ｎタンパク質に対して抗体を試験した。
【０１５５】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７、ＣＤ−Ｄ１０、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｅ６に関するマトリックス設計を表６に要約する。
【０１５６】
【表６】
【０１５７】
各実施において最初に結合した（捕捉された）抗原の量を正規化するために、各試験抗体／抗原複合体に関する以下の比を計算する。
【０１５８】
【数２】
【０１５９】
各抗体に残存している利用可能なエピトープの割合（％）は、以下のとおりに、マッピングペアに関して計算されうる。
【０１６０】
【数３】
【０１６１】
モノクローナル抗体ＣＳ−Ｄ７、ＣＳ−Ｄ１０、ＢＭＶ−Ｄ４およびＢＭＶ−Ｅ６は、同じ又は有意に重複する領域に対するものであった。表７は該ペア形態結合研究の結果の要約を示す。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
該ｍＡｂの相対フットプリントサイズは以下のとおりである：ＣＳ−Ｄ７ ＞ ＣＳ−Ｄ１０ ＞ ＢＭＶ−Ｄ４ ＞ ＢＭＶ−Ｅ６。モノクローナル抗体ＣＳ−Ｄ７は最大の「フットプリント」（それが結合一次抗体である場合、最高比率のｍＲＵＡｂ／ＲＵＡｂ）を有していた。実施例３に記載されている結合研究とは対照的に、ｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ４およびｍＡｂ ＢＭＶ−Ｄ６を使用した場合には、抗体濃度を有意に増加させ、結合を観察した。
【実施例５】
【０１６４】
追加的なエピトープ・フットプリント法
ＣＡＴ ｓｃＦｖおよびｍＡｂのサブセットに関して、ＢＩＡＣｏｒｅを用いて、追加的なエピトープ・フットプリント研究を行った。これらの研究においては、群１および群２結合競合は実施例２におけるものと同じであった。しかし、ＣＳ−Ｄ７およびＣＳ−Ｅ７はｍＡｂ １Ｇ３と競合することが判明した（群３）。
【０１６５】
特に示さない限り、ＢＩＡＣｏｒｅ ２０００でエピトープ重複に関して抗体をアッセイし、すべての試薬はＢＩＡＣｏｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から供給された。各実験において、フローセルをＥＤＣ／ＮＨＳ（ＮＨＳ，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＥＤＣ，（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド））混合物で活性化し、これらの活性化表面上に酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の種々のモノクローナル抗体を注入し、ついで該表面を１．０Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロッキングした。各実験サイクルにおいて、１５０μＬのＯＲＦ０６５７ｔを、共有的に固定化されたモノクローナル抗体上に１０μＬ／分で注入した。ついで、１２０μＬの別のモノクローナル抗体を該コンジュゲート上に１０μＬ／分で注入した。該実験の全体にわたって、表面プラズモン共鳴データを得、保存した。３０秒の接触時間で６０μＬ／分で流動する２０ｍＭ ＨＣｌの単一注入で再生を行った。すべての実験工程は２５℃の制御温度下で行った。後続の分析は、Ｍａｌｔｌａｂプラットフォーム（７．２．０．２３２ Ｒ２００６ａ，Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）上で実行する内部で開発されたソフトウェアを使用して行った。
【０１６６】
実施例２で示したとおり、競合的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにおいては、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７はｍＡｂ １Ｇ３と競合しない。該競合的Ｌｕｍｉｎｅｘおよび連続的ＢＩＡＣｏｒｅアッセイは、この不一致を可能にする相違を有する。第１に、ビーズに基づく該競合的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイは１つの抗体を別の抗体で置換させ、一方、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいては、１つの抗体が共有的（不可逆的）に結合している。第２に、該競合アッセイは、該抗体の１つに特異的な標識を使用し、一方、ＳＰＲアッセイは標識を使用せず、該表面上の物質の量のみに感受性である。該競合アッセイにおいては、予め結合している低アフィニティ抗体が、標識された高アフィニティ抗体により置換されて、無エピトープ重複の偽結果が生じうるであろう。いずれのアッセイにおいても、両方の抗体が干渉無しに結合する場合には、重複は存在しない。しかし、逆の場合、エピトープが異なりうる場合には、立体障害が見掛け上のエピトープ重複を引き起こしうるであろう。結合工程が連続的であり同時でない場合、どちらのアッセイにおいてもこの効果が増強されうる。
【０１６７】
実施例３および４における実験と実施例５における実験との相違は、実験３および４においては、ＯＲＦ０６５７ｎがまず、１３Ｃ７ ｍＡｂで捕捉され、ついで、もう１つのペアの抗体が、それらがＯＲＦ０６５７ｎに結合しうるかどうかを調べるために連続的に流される点にある。これらの抗体のいずれかがｍＡｂ １３Ｃ７とエピトープを共有する場合には、それはＯＲＦ０６５７ｎに結合できない。したがって、それは、有効に、ｍＡｂ １３Ｃ７、「一次抗体」および「二次抗体」の間の三者比較となる。これに対して、実施例５は二者比較である。
【実施例６】
【０１６８】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７エピトープマッピング
ＯＲＦ０６５７ｔの直鎖状配列の化学的切断、およびどの断片がｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に結合するのかの決定により、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７標的領域のエピトープマッピングを行った。ＯＲＦ０６５７ｔをＣＮＢｒで２時間にわたって化学的に切断した。得られた切断産物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、約４７、４４、３７、３５、３２、２６、１６、１３および１０ｋＤａの分子量を有する１０個のバンドを示した。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７でのウエスタンブロット分析は、４７、４４、３７、３５および３２ｋＤａのバンドのみがｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により認識されることを明らかに示した。ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により認識される短い配列の非存在は、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７がＯＲＦ０６５７ｎの直鎖状配列を認識しないことを示している。
【０１６９】
該ウエスタンブロットバンドを該ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから切り出し、ゲル内消化を行った。タンデム質量分析により特定された得られたペプチドは、ＯＲＦ０６５７ｎ内の対応配列に一致した。結果を表８に示す。
【０１７０】
【表８】
【０１７１】
表８に示されているＯＲＦ０６５７ｎは以下に基づくものである：ゲル内消化において特定されたペプチド、タンデム質量スペクトルにより特定されたＣ末端メチオニン残基、ＣＮＢｒ消化の全断片はメチオニン切断部位で始まり終わるという仮定、およびＳＤＳ ＰＡＧＥゲル内のバンドの見掛け分子量。ウエスタンブロット分析においてｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７により特定可能であったＯＲＦ０６５７ｔの最小内部断片はアミノ酸４２−３４２であった。
【実施例７】
【０１７２】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７エピトープ切断
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７への結合のための、ＯＲＦ０６５７ｔの、より高い分子量の断片の要件を、エピトープ切断により確認した。詳細に説明すると、該エピトープ切断実験のそれぞれに関して、臭化シアン活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ ｎｏ １７ ０４３０ ０１）への化学的架橋により、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７を固定化した。ついで元のＯＲＦ０６５７ｔを該固定化抗体に結合させ、リン酸緩衝食塩水での十分な洗浄により未結合ＯＲＦ０６５７ｔを洗い落とした。該結合ＯＲＦ０６５７ｔにトリプシンを加えた。インキュベーション中に該プロテアーゼにより切り出されたペプチドを十分に洗い落とし、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に特異的に結合したＯＲＦ０６５７ｔ断片をＳＤＳローディングバッファーで遊離させた。
【０１７３】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に特異的に結合した断片をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。該エピトープ切断実験は、該ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析において約４８、２３および１９．５ｋＤａの分子量を有する３つのバンドを示した。該ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから全バンドを切り出し、ゲル内消化を行い、該バンドに対応するＯＲＦ０６５７ｎのペプチドをタンデム質量分析により特定した（表９）。タンデム質量分析により特定された各ＯＲＦ０６５７ｎペプチドの計算分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより特定された対応バンドの分子量より小さい（表９）（該実験計画の結果である）。したがって、この実験におけるｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に結合した断片は、実際には、質量分析により特定されたものより大きなＯＲＦ０６５７ｎポリペプチド領域にわたっている可能性がある。例えば、バンド３は、ＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸１１７−２２４に対応するものとして質量分析により特定され、１２．５ｋＤａの計算分子量を有する。それは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特定では、１９．５ｋＤａの分子量を有する。約７ｋＤａ（計算分子量とＳＤＳ ＰＡＧＥ特定分子量との差）に対応するアミノ酸領域が該質量分析特定ペプチドのＮおよびＣ末端部分の両方に付加されるとすると、ＯＲＦ０６５７ｎのアミノ酸約４２−２８５に対応する断片が生じるであろう。この場合、該特定断片のＮおよびＣ末端部分の両方に７ｋＤａの領域が付加されるため、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７結合を達成するのに必要なＯＲＦ０６５７ｎの最小部分はアミノ酸４２−２８５内の領域に対応する可能性がある。アミノ酸４２−２５４に対応する断片はｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７に結合しないことを実施例６の化学的切断実験が示しているため、アミノ酸２５４−２８５に対応する領域またはその一部が、適切な抗体結合に重要である可能性がある。
【０１７４】
【表９】
【実施例８】
【０１７５】
アフィニティ測定
ｓｃＦｖ ＣＳ−Ｄ７および完全長ＩｇＧ ＣＳ−Ｄ７の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）評価を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて行った。該結合ドメインと該抗原との間の１：１相互作用を測定するために、抗体フラグメントを分析するのか又は完全長ＩｇＧを分析するのかに応じて、Ｂｉａｃｏｒｅの実験設定を変更した。ＩｇＧの測定の場合には、該ＩｇＧをリガンドとして該表面に捕捉させ、ＯＲＦ０６５７ｔをアナライトとして使用した。抗体フラグメントの分析の場合には、０６５７ｔをリガンドとして該表面に結合させ、該抗体フラグメントをアナライトとして使用した。それらの２つの方法の比較は同様の結果を示した（表１０）。それぞれに関して、２つの独立した実験から標準偏差を導き出した。
【０１７６】
【表１０】
【実施例９】
【０１７７】
留置カテーテルモデル
ラットにおける留置カテーテルモデル実施における効力に関して、モノクローナル抗体を試験した。頚静脈内に外科的に移植され縫合により適所に保持され該マウスの背側中央線上の出口から出る留置カテーテル（ＰＥ５０シリコーンゴム）を有するＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。実験開始前の＞７日間、該ラットを収容した。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による定着からの留置カテーテルの抗体防御を試験するために、チャレンジの１時間前に０〜４ｍｇのｍＡｂをラットに注射（ｉｐ）した。動物を尾静脈から４×１０９ ＣＦＵでチャレンジした。２４時間後、動物を犠死させ、無菌技術を用いてカテーテルを取り出した。定着の評価のために、カテーテル（外部口を伴うカテーテル全体を取り出した）をマンニトール塩寒天またはＴＳＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ）上に配置した。プレートを３７℃で２４〜４８時間培養した。コロニー成長のいずれかの徴候を培養陽性として評価した。５つの別々の実験の結果を表１１および１２に示す。表１１における、４ｍｇ用量のｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７を４ｍｇ用量のｍＡｂ ２０Ｃ２ＨＡ（イソタイプ対照）と比較するｐ値は、＜０．０００１である。表１１における、４ｍｇ用量のｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７をＰＢＳ対照と比較するｐ値は、＜０．０００１である。
【０１７８】
【表１１】
【０１７９】
【表１２】
【０１８０】
実験５（表１２）において調べたカニューレ挿入ラットに、チャレンジの１時間前に、４ｍｇのモノクローナル抗体（ＣＳ−Ｄ７またはイソタイプ対照）またはＰＢＳのみを注射（ｉｐ）した。ついでそれらを１〜２×１０９ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｂｅｃｋｅｒでチャレンジした。示されている時点で全てのラットから採血した。最終時点（３２時間）において、採血し、動物を犠死させ、該カテーテルを取り出した。ＴＳＡプレート上に５０μＬを広げ、一晩培養することにより、血液を細菌に関して評価した。マンニトール塩プレート上で一晩プレーティングすることにより、該カテーテルをスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関して評価した。図６に示すとおり、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の注射により血液ＣＦＵの減少が示された。
【実施例１０】
【０１８１】
エクスビボモデル
受動防御の方法を用いて、モノクローナル抗体を評価した。腹腔内（ｉｐ）経路による致死的注射の前に、細菌をエクスビボでｍＡｂで前オプソニン化した（エクスビボ法）。６匹のＢａｌｂ／ｃマウスに十分な細菌の量（６×ＬＤ１００）を、穏やかに振とうしながら、８００μｇのＩｇＧと共に４℃で１時間インキュベートした。ついで細菌をペレット化し、未結合ｍＡｂを除去した。抗体オプソニン化細菌を２．４ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、０．４ｍＬ（１×ＬＤ１００）を５匹のマウスのそれぞれに注射した。同等のＣＦＵが全群のマウスに与えられたこと、および該ｍＡｂが該細菌を凝集していなかったことを保証するために、チャレンジ後、ＴＳＡ上にプレーティングすることにより、各接種物を定量した。チャレンジ後の３日間、生存をモニターした。この方法が有効となるためには該標的抗原が該細菌の表面上に存在しなければならないため、オプソニン化の前に該細菌上でＯＲＦ０６５７ｎが発現されることが保証されるよう留意した。該チャレンジ株はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＲＮ４２２０であり、これを低鉄培地ＲＰＭＩ内で２継代した。各マウスに注射されたオプソニン化細菌の用量は１〜２×１０９ ＣＦＵ／マウスであった。結果を表１３に示す。
【０１８２】
【表１３】
【実施例１１】
【０１８３】
オプソニン貪食アッセイ
抗体のオプソニン貪食能を評価するために、オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを開発した。該アッセイは、顆粒球エフェクター細胞によるこれらの細菌の貪食のレベルの増加をもたらす、細菌表面への補体（Ｃ’）の結合および固定をもたらす抗体の能力を測定する。
【０１８４】
ＯＲＦ０６５７ｎは、ヘム／Ｆｅの獲得に関与していると思われるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面上の鉄調節タンパク質である。このアッセイにおいて使用するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、プロテインＡを産生しない株である。そのような株の一例はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＨ１０００である。このアッセイでは、ＯＲＦ０６５７ｎの発現を増強するために、該株を鉄枯渇させる。また、この株はプロテインＡの産生能を欠く。プロテインＡは任意のＩｇＧのＦｃ部分に結合することが可能であり、この非特異的結合性抗体の存在はＯＰＡ反応を妨げうるであろう。
【０１８５】
ＨＬ６０細胞を、より顆粒球性の表現型への該細胞の分化を誘導するために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に５〜６日間さらした。つぎに２％ Ｃ’−充足ノトバイオートブタ血清を該抗体結合細胞に加えた。最後に、該抗体およびＣ’曝露細胞を次いで、蛍光性化合物５’，６’−ＦＡＭ−ＳＥで標識した。
【０１８６】
オプソニン化蛍光標識細菌および未標識ＨＬ６０ ＤＭＦ細胞のインキュベーションの後、フローサイトメトリーにより、標識細菌を含有するＨＬ６０ ＤＭＦ細胞の比率を測定することにより、貪食のレベルを決定した。飲み込まれた細菌を含有するＨＬ６０細胞の比率は、該抗体により誘導されたオプソニン化の量に比例する。ＯＲＦ０６５７ｎに対するマウスおよびヒトの両方のｍＡｂをこのアッセイにおいて試験した。結果を図４および５に示す。
【０１８７】
ＯＲＦ０６５７ｎ特異的ｍＡｂは、このアッセイにおいて、力価測定可能な活性を示すことが可能であった。マウスｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１はマウスイソタイプ対照ｍＡｂ，６Ｇ６．Ａ８より大きな活性を有していた。ヒトｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７およびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ１０も、それらのＩｇＧ１イソタイプ対照より高いオプソニン活性を有していた。最高レベルの貪食をもたらすのに必要なｍＡｂの量はマウスｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１に関する０．５μｇからヒトｍＡｂに関する０．０６〜０．２５μｇまでの範囲であった。ヒトＡｂ ＣＳ−Ｄ７は、最高レベルの貪食をもたらすのに０．０６μｇを要したに過ぎず、これに対して、マウスｍＡｂ ２Ｈ２．ＢＥ１１は０．５μｇを要した。
【実施例１２】
【０１８８】
追加的配列
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＯＲＦ０６５７ｎ配列を示す配列番号４７は以下のとおりである。
【０１８９】
【化１】
【０１９０】
ヒトラムダ配列を示す配列番号４８は以下のとおりである。
【０１９１】
【化２】
【実施例１３】
【０１９２】
ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の治療投与
カニューレ挿入ラットを尾静脈から１〜２×１０９ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジした。１時間後、４ｍｇのモノクローナル抗体（ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７またはイソタイプ対照）またはＰＢＳのみをラットに注射（ｉｐ）した。チャレンジの２４時間後、該ラットを犠死させ、該カテーテルを取り出した。マンニトール塩プレート上で一晩プレーティングすることにより、該カテーテルをスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関して評価した。４つの異なる実験の結果を表１４に示す。
【０１９３】
【表１４】
【実施例１４】
【０１９４】
組合せ療法−バンコマイシンおよびｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７
２〜４×１０９ ＣＦＵのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｂｅｃｋｅｒでのｉｖチャレンジの１時間（１Ｈ）前に、カニューレ挿入ラットにバンコマイシン（２０ｍｐｋ）を投与（ｓｕｂ．ｃｕ．）した。チャレンジの１時間後、６ｍｇ／ラットのｍＡｂ ＣＳ−Ｄ６、イソタイプ対照ｍＡｂ ２０Ｃ２ＨＡまたはＰＢＳのいずれかを該ラットに注射した。チャレンジの２４時間後、該動物を犠死させ、頚静脈カテーテルを回収し、カテーテル上の細菌負荷に関して評価した。選択的ブロス培地内への配置およびピッコロ（Ｐｉｃｃｏｌｏ）インキュベーション系上での増殖により、カテーテルの評価を行った。該実験カテーテル上のＣＦＵの数を計算するために、同一条件下のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）増殖の標準曲線に対して増殖を比較した。第１の実験においては（表１５）、該系を試験するために少数の動物を使用した。第２の実験においては（表１６）、多数のラットを使用した。どちらの場合も、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７の存在下においては、イソタイプ対照ｍＡｂの存在下と比べて、バンコマイシンの活性の有意な増強が示された。これは、ｍＡｂ ＣＳ−Ｄ７が、バンコマイシンのみの場合と比べて細菌消失を増強しうることを示している。患者が手術または他の侵襲的方法を受け経験的または予防的抗生物質投与を受ける臨床状況を模擬するように、このモデルを設計した。該モデルにおいては、手術中の感染に対する補助的ｍＡｂ治療を模擬するよう、細菌曝露後に該ｍＡｂを注射した。これらの非常に厳密な条件下、該ｍＡｂは有益な効果を示した。
【０１９５】
【表１５】
【０１９６】
他の実施形態も以下の特許請求の範囲の範囲内である。いくつかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１可変領域および第２可変領域（該第１および第２可変領域はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する）を含んでなる単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
該第１可変領域が、
配列番号４６または配列番号４６と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３もしくは配列番号４４または配列番号３６、３８、３９、４１、４３もしくは４４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号３７、配列番号４２もしくは配列番号４５または配列番号３７、４２もしくは４５と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ
よりなる群から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（Ｖｈ）領域である、請求項１記載の結合性タンパク質。
【請求項３】
該Ｖｈ領域が該第１ Ｖｈ ＣＤＲ、該第２ Ｖｈ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む、請求項２記載の結合性タンパク質。
【請求項４】
該第１、第２および第３ Ｖｈ ＣＤＲが、それぞれ、
ａ）配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７；
ｂ）配列番号３５、配列番号３８および配列番号３７；
ｃ）配列番号３５、配列番号３９および配列番号３７；
ｄ）配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２；
ｅ）配列番号４０、配列番号４３および配列番号４５；ならびに
ｆ）配列番号４０、配列番号４４および配列番号４２
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項３記載の結合性タンパク質。
【請求項５】
該第２可変領域が、
配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９もしくは配列番号３２または配列番号１７、２０、２３、２６、２９もしくは３２と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ、
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０もしくは配列番号３３または配列番号１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および
配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１もしくは配列番号３４または配列番号１９、２２、２５、２８、３１もしくは３４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ
よりなる群から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変（Ｖｌ）領域である、請求項１〜４のいずれか１項記載の結合性タンパク質。
【請求項６】
該Ｖｌ領域が該第１ Ｖｌ ＣＤＲ、該第２ Ｖｌ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む、請求項５記載の結合性タンパク質。
【請求項７】
該第１、第２および第３ Ｖｌ ＣＤＲが、それぞれ、
ａ）配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９；
ｂ）配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２；
ｃ）配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５；
ｄ）配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８；
ｅ）配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；ならびに
ｆ）配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の結合性タンパク質。
【請求項８】
該結合性タンパク質が抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の結合性タンパク質。
【請求項９】
該第１ Ｖｈ ＣＤＲ、該第２ Ｖｈ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｈ ＣＤＲが、それぞれ、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７を含み、該第１ Ｖｌ ＣＤＲ、該第２ Ｖｌ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｌ ＣＤＲが、それぞれ、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９を含む、請求項８記載の結合性タンパク質。
【請求項１０】
該Ｖｈ領域が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸１−１２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項８記載の結合性タンパク質。
【請求項１１】
該Ｖｌ領域が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のアミノ酸１−１０８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の結合性タンパク質。
【請求項１２】
該抗体が、
ａ）配列番号１のアミノ酸１−１０８を含むＶｌ領域、および配列番号２のアミノ酸１−１２６を含むＶｈ領域；
ｂ）配列番号３を含むＶｌ領域、および配列番号４を含むＶｈ領域；
ｃ）配列番号５を含むＶｌ領域、および配列番号６を含むＶｈ領域；
ｄ）配列番号７を含むＶｌ領域、および配列番号８を含むＶｈ領域；
ｅ）配列番号９を含むＶｌ領域、および配列番号１０を含むＶｈ領域；
ｆ）配列番号１１を含むＶｌ領域、および配列番号１２を含むＶｈ領域；
ｇ）配列番号１３を含むＶｌ領域、および配列番号１４を含むＶｈ領域；あるいは
ｈ）配列番号１５を含むＶｌ領域、および配列番号１６を含むＶｈ領域
のいずれかを含む、請求項８記載の結合性タンパク質。
【請求項１３】
該Ｖｈ領域が配列番号２のアミノ酸１−１２６を含み、該Ｖｌ領域が配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む、請求項１２記載の結合性タンパク質。
【請求項１４】
該抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖、ならびに該Ｖｌ領域、およびヒトカッパＣｌまたはヒトラムダＣｌのいずれかを含む軽鎖を含む、請求項８〜１３のいずれか１項記載の結合性タンパク質。
【請求項１５】
該結合性タンパク質が、配列番号１を含む軽鎖と、配列番号２を含む重鎖とを含む抗体である、請求項１記載の結合性タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質重鎖可変（Ｖｈ）領域または抗原結合性タンパク質軽鎖可変（Ｖｌ）領域をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含んでなる核酸。
【請求項１７】
該核酸が２つの組換え遺伝子を含み、第１の組換え遺伝子が抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域をコードし、第２の組換え遺伝子が抗原結合性タンパク質Ｖｌ領域をコードする、請求項１６記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７記載の組換え核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項１９】
抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法であって、
ａ）該タンパク質が発現される条件下、請求項１８記載の組換え細胞を増殖させ、
ｂ）該タンパク質を精製する工程を含んでなる製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の結合性タンパク質の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御または治療方法。
【請求項２２】
該患者がヒトであり、手術または異物インプラントと共に該抗原結合性タンパク質を投与する、請求項２３記載の方法。
【請求項２３】
該患者が、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染したヒトである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１５のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質の使用。
【請求項２５】
配列番号４７のアミノ酸４２−３４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、３５０アミノ酸長以下であるポリペプチド。
【請求項１】
第１可変領域および第２可変領域（該第１および第２可変領域はＣＳ−Ｄ７標的領域に結合する）を含んでなる単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
該第１可変領域が、
配列番号４６または配列番号４６と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３もしくは配列番号４４または配列番号３６、３８、３９、４１、４３もしくは４４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｈ ＣＤＲ、
配列番号３７、配列番号４２もしくは配列番号４５または配列番号３７、４２もしくは４５と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｈ ＣＤＲ
よりなる群から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（Ｖｈ）領域である、請求項１記載の結合性タンパク質。
【請求項３】
該Ｖｈ領域が該第１ Ｖｈ ＣＤＲ、該第２ Ｖｈ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｈ ＣＤＲを含む、請求項２記載の結合性タンパク質。
【請求項４】
該第１、第２および第３ Ｖｈ ＣＤＲが、それぞれ、
ａ）配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７；
ｂ）配列番号３５、配列番号３８および配列番号３７；
ｃ）配列番号３５、配列番号３９および配列番号３７；
ｄ）配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２；
ｅ）配列番号４０、配列番号４３および配列番号４５；ならびに
ｆ）配列番号４０、配列番号４４および配列番号４２
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項３記載の結合性タンパク質。
【請求項５】
該第２可変領域が、
配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９もしくは配列番号３２または配列番号１７、２０、２３、２６、２９もしくは３２と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第１ Ｖｌ ＣＤＲ、
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０もしくは配列番号３３または配列番号１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第２ Ｖｌ ＣＤＲ、および
配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１もしくは配列番号３４または配列番号１９、２２、２５、２８、３１もしくは３４と１アミノ酸だけ異なる配列を含む第３ Ｖｌ ＣＤＲ
よりなる群から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変（Ｖｌ）領域である、請求項１〜４のいずれか１項記載の結合性タンパク質。
【請求項６】
該Ｖｌ領域が該第１ Ｖｌ ＣＤＲ、該第２ Ｖｌ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｌ ＣＤＲを含む、請求項５記載の結合性タンパク質。
【請求項７】
該第１、第２および第３ Ｖｌ ＣＤＲが、それぞれ、
ａ）配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９；
ｂ）配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２；
ｃ）配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５；
ｄ）配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８；
ｅ）配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１；ならびに
ｆ）配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の結合性タンパク質。
【請求項８】
該結合性タンパク質が抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の結合性タンパク質。
【請求項９】
該第１ Ｖｈ ＣＤＲ、該第２ Ｖｈ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｈ ＣＤＲが、それぞれ、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７を含み、該第１ Ｖｌ ＣＤＲ、該第２ Ｖｌ ＣＤＲおよび該第３ Ｖｌ ＣＤＲが、それぞれ、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９を含む、請求項８記載の結合性タンパク質。
【請求項１０】
該Ｖｈ領域が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸１−１２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項８記載の結合性タンパク質。
【請求項１１】
該Ｖｌ領域が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のアミノ酸１−１０８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の結合性タンパク質。
【請求項１２】
該抗体が、
ａ）配列番号１のアミノ酸１−１０８を含むＶｌ領域、および配列番号２のアミノ酸１−１２６を含むＶｈ領域；
ｂ）配列番号３を含むＶｌ領域、および配列番号４を含むＶｈ領域；
ｃ）配列番号５を含むＶｌ領域、および配列番号６を含むＶｈ領域；
ｄ）配列番号７を含むＶｌ領域、および配列番号８を含むＶｈ領域；
ｅ）配列番号９を含むＶｌ領域、および配列番号１０を含むＶｈ領域；
ｆ）配列番号１１を含むＶｌ領域、および配列番号１２を含むＶｈ領域；
ｇ）配列番号１３を含むＶｌ領域、および配列番号１４を含むＶｈ領域；あるいは
ｈ）配列番号１５を含むＶｌ領域、および配列番号１６を含むＶｈ領域
のいずれかを含む、請求項８記載の結合性タンパク質。
【請求項１３】
該Ｖｈ領域が配列番号２のアミノ酸１−１２６を含み、該Ｖｌ領域が配列番号１のアミノ酸１−１０８を含む、請求項１２記載の結合性タンパク質。
【請求項１４】
該抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプからのヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖、ならびに該Ｖｌ領域、およびヒトカッパＣｌまたはヒトラムダＣｌのいずれかを含む軽鎖を含む、請求項８〜１３のいずれか１項記載の結合性タンパク質。
【請求項１５】
該結合性タンパク質が、配列番号１を含む軽鎖と、配列番号２を含む重鎖とを含む抗体である、請求項１記載の結合性タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質重鎖可変（Ｖｈ）領域または抗原結合性タンパク質軽鎖可変（Ｖｌ）領域をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含んでなる核酸。
【請求項１７】
該核酸が２つの組換え遺伝子を含み、第１の組換え遺伝子が抗原結合性タンパク質Ｖｈ領域をコードし、第２の組換え遺伝子が抗原結合性タンパク質Ｖｌ領域をコードする、請求項１６記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７記載の組換え核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項１９】
抗体可変領域を含むタンパク質の製造方法であって、
ａ）該タンパク質が発現される条件下、請求項１８記載の組換え細胞を増殖させ、
ｂ）該タンパク質を精製する工程を含んでなる製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の結合性タンパク質および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の結合性タンパク質の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、患者におけるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御または治療方法。
【請求項２２】
該患者がヒトであり、手術または異物インプラントと共に該抗原結合性タンパク質を投与する、請求項２３記載の方法。
【請求項２３】
該患者が、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染したヒトである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１５のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質の使用。
【請求項２５】
配列番号４７のアミノ酸４２−３４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、３５０アミノ酸長以下であるポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２８６０７（Ｐ２０１０−５２８６０７Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０３３３（Ｐ２０１０−５１０３３３）
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７９１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９１３２
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７９１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９１３２
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】
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