スペーサー領域を使用するプロテウス種の検出、同定、および区別
本発明は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリスおよび／またはプロテウス・ペンネリの生体試料における特異的検出および／または同定のために使用される、１６Ｓと２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子間のＩＴＳ領域由来の新しい核酸配列に関する。本発明は、ＩＴＳ（内部転写スペーサー）領域由来の前記新しい核酸配列を使用する、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリスおよび／またはプロテウス・ペンネリの特異的検出および／または同定のための方法にも関する。本発明は試料におけるプロテウス種の前記スペーサー領域の増幅のために使用される核酸プライマーにも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテウス種（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、具体的にはプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）および／またはプロテウス・ペンネリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ）の特異的検出および／または同定のために使用される、１６Ｓと２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子間のＩＴＳ（内部転写スペーサー）領域由来の新しい核酸配列に関する。
【０００２】
本発明は、ＩＴＳ領域由来の新しい核酸配列を使用する、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリスおよび／またはプロテウス・ペンネリの特異的検出および／または同定のための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
プロテウス属は８種、すなわちＰ．ミラビリス、Ｐ．ペンネリ、Ｐ．ブルガリス、Ｐ．ミクソファシエンス（Ｐ．ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、およびＰ．ハウセリ（Ｐ．ｈａｕｓｅｒｉ）、ならびに未だ命名されていない３つのゲノム種からなる。
【０００４】
プロテウス属のメンバーは、一般に環境中に存在するが、それらはしばしば胃腸管の一部をも構成する。臨床的には、Ｐ．ミラビリスが最も頻繁に単離される生物として最も重要ではあるが、その他の種もまた臨床設定において遭遇されうる。
【０００５】
Ｐ．ミラビリスは、院内感染からの単離株の３％を占めるが、一般的な尿路感染の単離株のうち大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に次ぐ第二位であり、単純性膀胱炎、腎盂腎炎、および前立腺炎の原因物質として第三位である。Ｐ．ミラビリスは、菌血症、新生児髄膜脳炎、髄膜炎、膿胸、および骨髄炎など生命にかかわる感染の原因菌としても報告されている。また、胃腸および創傷感染など他の感染もＰ．ミラビリスおよびＰ．ペンネリなど関連種によって引き起こされうる。
【０００６】
Ｐ．ペンネリおよびＰ．ミラビリスは、腎結石形成に関係していることがわかったが、Ｐ．ミラビリスは関節リウマチにおける病原菌として報告されている。
【０００７】
現在、プロテウス種は、培養に基づく方法および表現型生化学試験によって同定され、かつ区別されている。
【０００８】
プロテウスの典型的な特性は、ヒツジ血液寒天上での細菌の群れを成して移動する特性である。オキシダーゼおよびインドール試験と組合せて異なるプロテウス種が正確に区別されうるが、すべての場合が従来の系によって明確なやり方で解決されるわけではない。現在、市販の系ではプロテウス種間の同定および区別における均一かつ唯一の解答は得られない。
【０００９】
ニトロフラントインおよびテトラサイクリンに対するそれら特有の耐性に加えて、プロテウス属のその大部分は、野生型菌株として、アミノ／ウレイドペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、およびカルバペネムに影響されやすい。しかし、最近の報告では、一部の抗菌剤に対する、とりわけ上記のものに対する耐性の発生が、特に一部の病院において示されている。それらの生物の迅速かつ特異的な同定アッセイが、これら典型的な日和見細菌性生物によって引き起こされる感染のより適切な抗菌管理の基礎を形成しうる。
【００１０】
増大する院内感染の数および抗菌剤の既存のパネルに対する増大する耐性を考慮するとともに、培養に基づき試験は依然として時間がかかり、かつ熟練者の高い作業負荷を必要とするため、迅速かつより特異的な同定のための新しい方法が必要である。具体的には、院内敗血症のような重篤な感染の場合に、それが生きるか死ぬかの問題であるため迅速、特異的、かつ高感度なアッセイが必須である。
【００１１】
特許文献１は、ＩＴＳ領域からの偶発性プローブＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣによって記載する、この特定種を同定するためのＰ．ブルガリスの不当に特徴付けられた２３ＳおよびＩＴＳ ｒＲＮＡからの一部のプローブを記載している。試料に存在する２３Ｓ ｒＤＮＡの一部を増幅することによって、唯一存在するプロテウス群からＰ．ミラビリス種を有する試料における細菌を同定するための方法が特許文献２に開示されている。
【００１２】
しかし、プロテウス種が試料に存在するかどうかだけではなく、どのタイプのプロテウス種が存在しているかを確認する方法が必要とされている。
【特許文献１】国際特許出願国際公開第０３／０９５６７７号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願国際公開第００／５２２０３号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のために使用されうる、プロテウス種のＩＴＳ由来の新しい核酸配列を提供することである。
【００１４】
したがって、本発明は、配列番号１〜６７、その相補的形態、ＴがＵによって置換されているそのＲＮＡ形態、および相同体からなる群から選択される単離核酸分子を提供する。
【００１５】
プロテウス種の検出および／または同定のための前記核酸分子の使用も本発明の目的である。
【００１６】
本発明の１の態様は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のための、プローブおよび／またはプライマーとして使用するための新しいポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
したがって、本発明は、プロテウス種の検出および／または同定のための、配列番号１８〜６７、その相補的形態、ＴがＵによって置換されているそのＲＮＡ形態、その相同配列、およびその断片からなる群から選択される核酸分子を含んでなる、またはそれからなる標的配列に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子を提供する。
【００１８】
本発明の他の態様は、試料におけるプロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のためのプローブのセットに関する。
【００１９】
本発明の他の態様は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域の特異的増幅を可能にするプライマーに関する。
【００２０】
本発明の他の目的は、本発明の新しい配列のいずれか、もしくは本発明のプローブおよび／またはプライマーの新しいセットのいずれか、またはその組合せを含んでなる組成物である。
【００２１】
本発明の他の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のために、前記プローブおよび／またはプライマーが使用されるキットである。
【００２２】
本発明の他の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のための迅速かつ確実なハイブリダイゼーション方法である。
【００２３】
本発明の他の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のためのリアルタイムＰＣＲに基づくハイブリダイゼーション方法である。
【００２４】
表の説明
表１：実施例で使用された増幅および融解曲線プログラム。
表２：試験されたＨｙｂプローブの異なる組合せ。
表３：配列番号２４および３９によって表されるＨｙｂプローブの組合せの特異性について試験された微生物のリスト。
表４：配列番号１〜６９のリスト。
【００２５】
この表の配列番号は以下の生物に由来する：
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下の定義は、以下に記載された本発明の異なる実施形態において使用された語および表現を説明するために役立つ。
【００２９】
「スペーサー」および「ＩＴＳ」（内部転写スペーサー）という語は両方とも１６Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間、または１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間の領域を指す略語である。
【００３０】
「プローブ」という語は、標的配列にハイブリダイズする十分に相補的である配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【００３１】
本発明の枠組みにおける標的配列は、配列番号１〜１７のいずれかによって表される核酸分子、その相補的形態、そのＲＮＡ形態、その相同体または断片を含んでなる、検出すべき配列である。
【００３２】
標的配列は、ゲノムＤＮＡまたは前駆体ＲＮＡ、またはその増幅バージョンのいずれかでありうる。
【００３３】
好ましくは、本発明のプローブは、約８０％、約８５％、約９０％、もしくは約９５％以上、標的配列の正確な相補体と相同である。
【００３４】
本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入を含んでなる組換えプラスミドのクローン化（および増殖）によって、任意に、後者を適切なヌクレアーゼを使用してクローン化プラスミドから開裂し、それらを、例えば、分子量に従う分画によって回収することによって形成されうる。
【００３５】
本発明によるプローブは、例えば、従来のリン酸トリエステル法によって化学的に合成もされうる。
【００３６】
本明細書で使用される「相補的」核酸という語は、核酸配列が互いと完全な塩基対二本鎖を形成しうることを意味する。
【００３７】
「ポリ核酸」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」は、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる二本鎖もしくは一本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡに対応する。長さが１００個より小さいヌクレオチドであるポリ核酸は「オリゴヌクレオチド」とも呼ばれる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、実質的にそのハイブリダイゼーション特性を変えることがない修飾基を含んでなるイノシンまたはヌクレオチドなど修飾ヌクレオチドをも含有しうる。
【００３９】
本発明のポリ核酸分子は、つねに５’末端〜３’末端で表される。それらは、いかなる形態でも、すなわちその二本鎖または一本鎖形態（２つの鎖のいずれか）、そのＤＮＡまたはＲＮＡ形態（ここでＴはＵによって置換される）、修飾または非修飾で使用されうる。
【００４０】
「最近隣接」という語は、ＤＮＡ相同性の点で最も密接に関係していることが周知または予想され、かつ目的とする生物から区別される必要がある分類群を意味する。
【００４１】
「分類群特異的ハイブリダイゼーション」または「分類群特異的プローブ」という表現は、プローブが、そのために設計された分類群からのＤＮＡまたはＲＮＡにのみハイブリダイズし、他の分類群からのＤＮＡまたはＲＮＡにはハイブリダイズしないことを意味する。
【００４２】
分類群という語は、完全な属または属内の亜群、種またはさらに種内の亜型（亜種、血液型亜型、シクエバー（Ｓｅｑｕｅｖａｒ）、次亜種等）を指しうる。
【００４３】
「特異的増幅」または「特異的プライマー」という語は、前記プライマーが、そのために設計された生物からの関連領域のみを増幅し、他の生物からものを増幅しないことを指す。
【００４４】
「スペーサー特異的増幅」または「スペーサー特異的プライマー」は、前記プライマーが、そのために設計された生物からのスペーサー領域のみを増幅し、他の生物からのものは増幅しないことを指す。
【００４５】
「特異的プローブ」という語は、そのために設計された生物からの関連領域とのみハイブリダイズし、他の生物からの対応する領域とも、他の領域ともハイブリダイズしないプローブを指す。
【００４６】
「スペーサー特異的プローブ」は、そのために設計された生物からの関連スペーサーとのみハイブリダイズし、他の生物からのスペーサーとはハイブリダイズしないプローブを指す。
【００４７】
「感度」という語は偽陰性の数を指し、すなわち、検出すべき１００個の菌株のうち１個が見逃された場合は、その試験は（１００−１／１００）％＝９９％の感度を示す。
【００４８】
「特異性」という語は偽陽性の数を指し、すなわち、検出される１００個の菌株で、２個がそのために試験が設計されていない生物に属すると思われる場合は、試験の特異性は（１００−２／１００）％＝９８％である。
【００４９】
「優先的」であるとして選択されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、８０％超、好ましくは９０％超、かつ最も好ましくは９５％超の感度および特異性を示す。
【００５０】
「固体支持体」は、プローブがそのハイブリダイゼーションン特性を保持するという条件で、かつハイブリダイゼーションの背景レベルが低く保持するという条件で、ポリヌクレオチドプローブが結合されうる基質を指しうる。通常、固体基質はマイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）、またはマイクロスフェア（ビーズ）となるが、これらの例に限定されることはない。膜または固定への適用前に、固定を促進し、またはハイブリダイゼーション効率を改善するために核酸プローブを修飾することが便利でありうる。かかる修飾はホモポリマーテーリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボン酸基など異なる反応基との結合、またはビオチン、ハプテン、またはタンパク質との結合を包含しうる。
【００５１】
「標識」という語は、標識核酸の使用を指す。標識化は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１頁）またはベイ（Ｂｅｊ）ら（（１９９０年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ プロベス ４：３５３−３６５頁）によって説明されたものなど増幅の重合ステップ中に組込まれた標識ヌクレオチドの使用によって、もしくは標識プライマーの使用によって、または当業者に周知の他の方法によって実行される。標識の性質は同位体（３２Ｐ、３５Ｓ、等）または非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素、等）でありうる。
【００５２】
「シグナル」という語は、一連の電磁波（例えば、蛍光）、または情報を伝える電流の変化を指す。シグナルは直接可視であり、または異なる手段もしくはデバイスによって可視および／または説明可能とされうる。
【００５３】
試料はいずれかの生体材料を含んで成りうる。生体材料は、感染した人間、または動物から直接、または培養もしくは富化後、または食物から、環境等から取られうる。
【００５４】
生体材料は、例えば、あらゆる種類の吐出物、気管支洗浄、血液、皮膚組織、生検、リンパ球血液培養材料、コロニー等でありうる。前記試料は、当技術分野で周知の方法のいずれかに従って調製または抽出されうる。
【００５５】
本発明に照らして臨床的に重要であるプロテウス種は、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、およびプロテウス・ぺンネリである。
【００５６】
異なるプロテウス種は、スペーサー領域に挿入されたｔＲＮＡ遺伝子、ｔＲＮＡｇｌｕまたはｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａのタイプに基づき２つの異なるタイプのスペーサーを示す。さらに、各々のタイプのスペーサーおよび各々のプロテウス種について、異なるクラスターまたはグループが区別されうる。
【００５７】
例えば、Ｐ．ミラビリスの９個の菌株のうち、第１のタイプのスペーサー、すなわち、ｔＲＮＡｇｌｕの挿入を考慮すると、４種類のグループが定義され、それぞれ配列番号１〜４によって示されうる。
【００５８】
第２のタイプ、すなわち、ｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａの挿入を考慮すると、６種類のグループが定義され、それぞれ配列番号５〜１０によって示されうる。
【００５９】
すべてのプロテウス種、もしくは各々のプロテウス種、または少なくとも２つのプロテウス種のいずれかの組合せを検出および／または同定するために、本発明は新しい核酸分子を提供する。
【００６０】
本発明のＩＴＳ配列は、配列番号１〜１７、その相補的形態、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、およびそのいずれかの相同配列を含んでなる、またはこれらからなる。
【００６１】
以下で「相同体」とも呼ばれるプロテウス種のＩＴＳに存在する相同配列は、本発明の目的でもある。相同性の程度は８０％もしくは８５％よりも高く、好ましくは９０％より高く、より好ましくは９５％よりも高い。
【００６２】
本発明の枠組みにおいて、「相同体」は次いで、配列番号１〜１７のいずれか、またはいずれかのプロテウス種のＩＴＳ領域に位置した、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個のヌクレオチドのそのいずれかの断片と相同配列である。
【００６３】
配列番号１〜１０はＰ．ミラビリス由来であり、配列番号１１〜１３はＰ．ブルガリス由来であり、配列番号１４〜１７はＰ．ペンネリ由来である。
【００６４】
本発明は、いずれかのプロテウス種の検出のためのＩＴＳ由来の新しい核酸分子をも提供し、各々タイプが異なるグループを含んでなる、挿入されるｔＲＮＡを考慮すると、異なるタイプのＩＴＳが存在することによるきわめて高いばらつきによって生じる問題を解決する。
【００６５】
実際に、配列番号４４、５３、５８、５９、および６１からなる新しい核酸分子が、試験されたすべてのプロテウス種、特に臨床的に重要であるプロテウス種の２つのタイプのスペーサーに存在することが見出されている。
【００６６】
言及された特異的ポリヌクレオチド、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０個、および好ましくは約２０個のヌクレオチド（１８、１９、２０、２１、または２２個）のその断片、そのＲＮＡ形態、およびその相補的形態は、属特異的ポリヌクレオチドとも呼ばれ、プロテウス種、具体的には、臨床的に重要である３つのプロテウス種のいずれか、もしくはすべての検出のためのプライマーおよび／またはプローブを設計するために使用されうるＩＴＳの特異的領域である。
【００６７】
１つ、２つ、もしくはそれ以上のプロテウス種の検出および／または同定のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用するための新しいポリヌクレオチドも提供される。
【００６８】
言い換えれば、本発明の目的は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のプロテウス種の検出および／または同定のための本発明の標的配列とハイブリダイズするプローブおよび／またはプライマーとして使用するための新しいポリヌクレオチドに関する。
【００６９】
具体的には、本発明の目的は、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、その相同体、その少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、または３００個の隣接ヌクレオチドの断片からなる群から選択される核酸を含んでなる、またはこれらからなる標的配列に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子である。
【００７０】
好ましいポリヌクレオチドプローブは、長さが約５〜約５０の塩基、より好ましくは約１０〜約２５個のヌクレオチドであり、標的配列と十分に相同である。
【００７１】
配列番号１８〜６７のポリヌクレオチドもしくはその相同体のいずれか、その相補的形態もしくはそのＲＮＡ形態がプローブとして使用されうる。
【００７２】
本発明の好ましいプライマーは、本発明の標的配列の合成のための開始点として作用することが可能な一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明のプライマーの長さおよび配列は、エクステンション産物の合成をプライムすることを可能にするほどでなければならない。
【００７３】
好ましくは、本発明のプライマーは、約５〜約５０個のヌクレオチドの長さであり、好ましくは約１０〜約３５個、より好ましくは約１５〜約２５個である。その特異的長さおよび配列は、温度およびイオン強度など使用される条件によって選択されるべきである。
【００７４】
本発明のプライマーは標的配列を増幅する。言い換えれば、本発明のプライマーは、配列番号１〜１７、その相補鎖および／または相同体のいずれかを含んでなる核酸分子を増幅する。
【００７５】
ｒＲＮＡスペーサーの保存フランキング領域、すなわち、１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子に位置した普遍的なプライマーが使用されうる。プロテウス種が試料に存在する場合は、増幅産物、標的配列は、次いで、配列番号１〜１７、および／または相同体のいずれかからなる核酸分子を含んでなる。
【００７６】
好ましくは、標的配列は、配列番号１〜１７、および／または、それぞれ１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの約４０〜約５０個以下のヌクレオチドによってフランキングされた相同体からなる群から選択される核酸分子からなる。
【００７７】
一部の用途では、試料に存在する異なる細菌ではなく、より具体的にプロテウス種を増幅することが適切でありうる。
【００７８】
この場合、プライマーペアが、本発明のＩＴＳ配列、例えば、配列番号４４および５３によって表されるポリヌクレオチド由来である。
【００７９】
増幅プライマーが対応するテンプレート配列と正確にマッチし、適切な増幅を保証する必要がないということは、文献（クオーク（Ｋｗｏｋ）ら（１９９０年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：９９９頁）において十分に実証されている。
【００８０】
使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１頁）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、（（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０頁）、ウー（Ｗｕ）とウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、（（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９頁）、バラニー（Ｂａｒａｎｙ）、（（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３頁）核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ、グアテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、（（１９９０年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８頁）、コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、（（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９２頁）転写ベース増幅系（ＴＡＳ、クオー（Ｋｗｏｈ）ら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７頁）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、ダック（Ｄｕｃｋ）、（（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：１４２−１４７頁）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、（（１９９２年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６頁）、またはＱβレプリカーゼの手段による増幅（リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、（（１９８８年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２頁）、ロメリ（Ｌｏｍｅｌｉ）ら、（（１９８９年）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３５：１８２６−１８３１頁）、または当技術分野で周知の核酸分子を増幅する他の適切な方法でありうる。
【００８１】
プライマーまたはプローブとして使用するための、または本発明の方法において使用される別のプライマーおよびプローブを設計するための本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１８〜６７によって表されている。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、次いで得られる等価物がさらに標的配列と依然としてハイブリダイズするという条件で、１つもしくはいくつかのヌクレオチドのそのそれぞれの極度への添加もしくはそれからの除去によって、または前記配列内の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドを変更することによって、または両方の組合せによって、配列番号１８〜６７によって表されるポリヌクレオチドのいずれかと配列が異なりうる。前記等価のポリヌクレオチドは、対応する非修飾ポリヌクレオチドとの少なくとも８０％の相同性、好ましくは８５％超、最も好ましくは９０％超の相同性を共有する。
【００８３】
ポリヌクレオチドの等価物を使用する場合、ハイブリダイゼーション条件を修正し、対応する非修飾ポリヌクレオチドと同じ特異性を得る必要がありうる。
【００８４】
結果として、ポリヌクレオチドが同じハイブリダイゼーション条件下のセットで使用される場合、他のポリヌクレオチドの配列をそれに応じて修飾することも必要となる。これらの修飾は、ヘイムス（Ｈａｍｅｓ）Ｂとヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｓ（編）：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、英国（ＵＫ）、１９８５年に記載されたものなどの原理に従って行われうる。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、ホスホロチオエート（マツクラ（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ）ら、（（１９８７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（２１）：７７０６−７７１０頁）、アルキルホスホロチオエート（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、（（１９７９年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８（２３）：５１３４−５１４３頁）またはペプチド核酸（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７−１５００頁）、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（（１９９３年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ．２１（２）：１９７−２００頁）などのヌクレオチド類似体をも含んで成り、または挿入剤（アセリン（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）ら、（１９８４年）、）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１１）：３２９７−３３０１頁）等を含有しうる。
【００８６】
修飾プライマーまたはプローブは、必要な特異性および感度を得るためにそれらが使用される条件に関して適応を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションの結果は実質的に非修飾ポリヌクレオチドで得られたものと同じとすべきである。
【００８７】
これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション動態、ハイブリッド形成の可逆性、ポリヌクレオチド分子の生体安定性等など一部の特性に影響を及ぼすために有利でありうる。
【００８８】
本発明のプローブおよびプライマーは、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のための本発明の方法、また目的において使用される。
【００８９】
標的配列の検出および／または同定は、電気泳動法、ハイブリダイゼーション法、またはシークエンシング法を使用することによって実行されうる。
【００９０】
試料における１つもしくはそれ以上のプロテウス種の検出ための本発明の方法は、以下のステップを含んでなる。
− 第１に、かつ必要ならば、試料に存在する核酸を増幅および／またはハイブリダイゼーションのために利用可能にする。
− 第２に、かつ必要ならば、存在する場合には、核酸を１つもしくは別の標的増幅系で増幅する。通常、増幅はその後のハイブリダイゼーションシグナルを強化するために必要である。しかし、一部の試料について、または一部の高度に感受性のシグナル増幅系については、増幅は必要ではない場合がある。
− 第３に、試料に存在する核酸または結果として生じる増幅産物をプローブと接触させ、かつハイブリダイゼーションを続行させる。
−最後に、従来の適合性の検出系を使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、１つ、２つ、もしくはそれ以上のプロテウス種の存在または非存在が推定されうる。
【００９１】
増幅ステップのために、普遍的プライマーとも呼ばれる、ｒＲＮＡスペーサーの保存フランキング領域（１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子）に位置したプライマーが使用されうる。配列番号６８および６９によって表されるプライマーペアは普遍的プライマーペアの例である。
【００９２】
一部の用途のために、試料に存在するすべての細菌ではなく、１つもしくはいくつかの属、または１つもしくはいくつかのプロテウス種を増幅することが適切でありうる。
【００９３】
後者の場合、これはプロテウス種のＩＴＳ領域由来の属特異的プライマーまたは種特異的プライマーを使用することによって達成されうる。
【００９４】
具体的には、試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための発明の方法が、
（ｉ）所望により、前記試料におけるポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）所望により、前記１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または少なくとも１つの適切なプライマーペアを有する、その標的配列または断片の少なくとも１つを増幅するステップと、
（ｉｉｉ）前記ポリ核酸を、配列番号１〜１７、その相同体、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、およびその断片からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）得られたシグナルを解釈し、プロテウス種の存在を推定し、かつ／または前記試料におけるプロテウス種を同定するステップと
を含んでなる。
【００９５】
例えば、本発明のいずれかの方法の増幅またはハイブリダイゼーションステップにおいて言及される断片が、本発明の核酸分子の約１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００個の隣接ヌクレオチドを含んで成り、またはこれらからなりうる。
【００９６】
好ましくは、本発明のプローブは、高い厳密性の条件下にハイブリダイズする。
【００９７】
高い厳密性条件下、相補的核酸ハイブリッドのみが形成される。したがって、アッセイ条件の厳密性は、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間で必要とされる相補性の量を決定する。厳密性は、標的および非標的核酸で形成されるハイブリッド間の安定性における差を最大にするように選択される。
【００９８】
どんな場合でも、適切なハイブリダイゼーション条件は、本発明のポリヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズする場合に得られるハイブリダイゼーションのシグナルが、前記ポリヌクレオチドが非特異的なやり方で標的配列にハイブリダイズする場合に得られるシグナルと異なるようにして選択される。
【００９９】
実際には、異なるシグナルは、例えば、その強度が、標的配列への非特異的ハイブリダイズと比べ、標的への特異的ハイブリダイゼーションにより２倍、５倍、１０倍もしくはそれ以上である場合に視覚化されうる。ＬｉＰＡ系はこの点で優れた例である。
【０１００】
異なるシグナルは、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を使用する場合に、融解曲線分析で異なるピークが引き出される場合にも視覚化されうる。
【０１０１】
１つの実施形態において、おそらく試料に存在する標的配列の検出のためのきわめて便利かつ有利な方法が、リアルタイムＰＣＲ法である。
【０１０２】
本発明の枠組みで使用されうる増幅ＤＮＡの検出のための異なるフォーマット、特にＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブ、「スコーピオンズ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）」、またはＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブがある。
【０１０３】
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブに関して、一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが２つの成分で標識される。第１の成分、いわゆる蛍光剤が適切な波長の光で励起されると、吸収エネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第２の成分、いわゆる消光剤に移される。ＰＣＲ反応のアニーリングステップ中、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、ポリメラーゼ、例えば、伸長段階中のＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によって分解される。結果として、励起蛍光成分および消光剤は空間的に互いから分離され、したがって第１の成分の蛍光放射が測定されうる（欧州特許第５４３９４２号明細書および米国特許第５，２１０，０１５号明細書）。
【０１０４】
モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブに関して、このプローブも第１の成分および消光剤で標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的プローブの異なる末端に位置している。プローブの二次構造の結果として、両方の成分は空間的に近くで溶解する。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、両方の成分は互いから分離し、適切な波長の光による励起後、第１の成分の蛍光放射が測定されうるようになる（米国特許第５，１１８，８０１号明細書）。
【０１０５】
「スコーピオンズ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）」に関して、プローブおよびプライマーが１つの分子に含まれている。モレキュラー・ビーコンズ系と同様、各プローブは第１の成分および消光剤で標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的プローブの異なる末端に位置している。プライマーが、特異的標的配列の非存在下に開放されることから二次構造を防ぐＰＣＲストッパによって各プローブへ連結される。（ホイットコンブ（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ），Ｄ．ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７、８０４−８０７頁、テルウェル（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ），Ｎ．ら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２８巻、第１９号、３７５２−３７６１頁、スワンビック（Ｓｖａｎｖｉｋ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７、１７９−１８２頁（２０００年））。
【０１０６】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ハイブリダイゼーションプローブ試験フォーマットは、あらゆる種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である（マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ），Ｊ．Ａ．およびクリッカ（Ｋｒｉｃｋａ），Ｌ．Ｊ．、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６９（１９８８年）１−２５頁）。これは、同時に使用され、かつ（増幅）標的核酸の同じ鎖の隣接部位と相補的である、２つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブによって特徴付けられる。両方のプローブは異なる蛍光成分で標識される。適切な波長の光で励起されると、第１の成分は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って吸収エネルギーを第２の成分に吸収エネルギーを移し、第２の成分の蛍光放射は両方のハイブリダイゼーションプローブが検出される標的分子の隣接位置に結合する場合にのみ測定されうるようになっている。
【０１０７】
標的配列にアニールされる場合、ハイブリダイゼーションプローブは、頭部−尾部配置で互いにきわめて近くに位置付ける必要がある。通常、第１のプローブの標識３’末端と第２のプローブの標識５’末端との間のギャップは可能な限り小さく、特に約０〜２５個の塩基、かつ好ましくは約１〜約５個の塩基からなる。これはＦＲＥＴドナー化合物およびＦＲＥＴアクセプター化合物の接近を可能にし、これは一般的に１０−１００オングストロームである。
【０１０８】
ＦＲＥＴアクセプター成分の蛍光の増大をモニタリングする代わりに、ハイブリダイゼーションイベントの定量尺度としてＦＲＥＴドナー成分の蛍光減少をモニタリングすることも可能である。
【０１０９】
リアルタイムＰＣＲの当技術分野で周知のすべてのフォーマットのうち、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブフォーマットはきわめて感度が高く、正確、かつ確実であることが証明されている（国際公開公報国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、同第９７／４６７１２号パンフレット、同第９７／４６７１４号パンフレット）。しかし、適切なＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、検出される標的核酸配列の特性によって限定されることもある。
【０１１０】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの用法の代わりとして、蛍光標識プライマーおよび唯一の標識ポリヌクレオチドプローブを使用することも可能である（ベルナルド（Ｂｅｒｎａｒｄ），Ｐ．Ｓ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５（１９９８年）１０１−７頁）。この点で、プライマーがＦＲＥＴドナーまたはＦＲＥＴアクセプター化合物で標識されるかどうか任意に選択されうる。
【０１１１】
蛍光は伸長ステップ中に測定され、使用されるプライマーおよび／またはプローブによって、そのＴｍによって、かつハイブリダイゼーション条件によって増幅曲線を生成し、それにより検出されるプロテウス種の存在を推測し、またはどのプロテウス種が存在するか推測することが可能である。
【０１１２】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（ＨｙｂプローブまたはＦＲＥＴ−プローブとも呼ばれる）も融解曲線分析に使用されうる（国際公開公報国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、同第９７／４６７１２号パンフレット、同第９７／４６７１４号パンフレット）。かかるアッセイにおいては、標的核酸は最初に適切な増幅プライマーとの典型的なＰＣＲ反応で増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、すでに増幅反応中に存在し、またはその後に添加されうる。ＰＣＲ反応の終了後、試料の温度は連続的に上昇する。蛍光はハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合されている限り検出される。融解温度では、ハイブリダイゼーションプローブはその標的から放出され、かつ蛍光シグナルは直ちに背景レベルに低下する。この低下は適切な蛍光対温度−時間プロットでモニタリングされ、第１の微分係数の負数が計算されうる。次いで、かかる係数の得られた最高値に対応する温度の値は、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの前記ペアの確固たる融解温度として取られる。
【０１１３】
標的核酸内の点変異または多型は結果として標的核酸とＦＲＥＴプローブとの間の１００％未満の相補性をもたらし、したがって結果として融解温度の減少が生じる。これによりＦＲＥＴ−Ｈｙｂプローブハイブリダイゼーションによる配列変形のプールの一般的な検出が可能であるが、その後に、前記プールの異なるメンバーが融解曲線分析を実行する手段によって判別されることになりうる。
【０１１４】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの代わりに、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）が代替として融解曲線分析に使用されうる。
【０１１５】
リアルタイムＰＣＲおよび相同リアルタイムＰＣＲ融解曲線分析の有用性に対して、特定のタイプの種または菌株の判別が、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（商標）Ｉなど二本鎖ＤＮＡ結合色素、または、代替として、異なるが類似の標的配列にハイブリダイズする特別に設計されたハイブリダイゼーションプローブのいずれかを使用して可能となる。
【０１１６】
第１の場合、生成された二本鎖ＰＣＲ産物の融解温度が測定される必要がある。しかし、この方法は、小さな配列変形のみが結果としてわずかな融解温度差をもたらすという点で、ほとんど差が有効にモニタリングできないため限定された用途のみ有する。
【０１１７】
あるいは、ハイブリダイゼーションプローブは、プローブ／標的核酸ハイブリッドの融解温度が測定されるやり方で使用されうる。
【０１１８】
ＡＢＩ／Ｐｒｉｓｍ（商標）機器、かつ具体的にはライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（商標）装置など、使用されうる異なるリアルタイムＰＣＲプラットフォームがあり、すべては光放射の測定、融解サイクル中の放射ピークの連続的モニタリング、標識プローブが増幅産物から取外される時点での温度（融解ピーク）の測定、および視覚化からなる同じ原理に基づく。融解ピークデータは、プローブと標的との間のミスマッチが融解の動態に影響を及ぼし、目的とする各々の種の異なる融解ピークをもたらすため、特定の［プローブ：標的］配列の特性である。
【０１１９】
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（商標）プラットフォームは、多くの利点を提供し、具体的には時間の利得、およびハイブリダイゼーションプローブ（Ｈｙｂプローブ）、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）、スコルピン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プローブ、およびバイプローブ（ＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉ）など、いくつかの異なる配列特異的蛍光プローブ検出系の可能な使用である。
【０１２０】
本発明の好ましい方法においては、数個のヌクレオチド、一般に０〜２５個、好ましくは約１〜約５個のヌクレオチドによって間隔をあけられた、頭部−尾部方向で、本発明の標的配列由来の２つの隣接したポリヌクレオチドプローブからなるＨｙｂプローブ系が使用される。プローブの１つはその３’末端においてドナー色素によって標識され、その他はその５’末端においてアクセプター分子で標識され、３’末端において（プライマーとしてのその作用を阻止するため）リン酸ブロックされる。ドナー色素は一般にフルオレセインであり、アクセプター分子は一般にＬＣレッド６１０、６４０、６７０、または７０５である。
【０１２１】
本発明の標的配列の検出は、内部標識ＰＣＲ鎖および反対鎖上に位置した検出プローブによっても達成されうる。シグナルは色素の空間的接近に依存し、かつ標的の量に依存している。
【０１２２】
両方のプローブがその標的配列にハイブリダイズされると、ドナーの放射光は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってアクセプター蛍光プローブヘ移され、放射蛍光（６１０、６４０、６７０、または７０５ｎｍ）が検出されうる。放射蛍光の強度は、増幅の産物である標的ＤＮＡと平行して増大する。
【０１２３】
ライトサイクラープローブは、加水分解を必要とせず、したがって、ＰＣＲ時間の追加の延長がないＴａｑＭａｎ（商標）プローブに対する利点を提供する（アニーリング延長≦１２秒）。したがって、ライトサイクラーの高速熱サイクルを活用し、ＰＣＲプログラムを４５分のみで終了することが可能である。
【０１２４】
また最近の世代のリアルタイムＰＣＲプラットフォームは、単一の反応でいくつかのプローブをモニタリングすることができ、種レベルでの異なるプロテウスの検出および／または同定、および／または異なるタイプのプロテウススペーサーの区別を可能にする。
【０１２５】
さらに、ＴａｑＭａｎ技術のために設計された方法を容易にＨｙｂプローブ技術に変換することができ、同等の結果が得られることがわかっている（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ 第８５巻（１２）ｐｐ．１２４８−１２５４、２０００年１２月）。
【０１２６】
したがって、本発明の他の目的は、Ｈｙｂプローブとも呼ばれる少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブのセットに関するが、両方のＨｙｂプローブは同じ標的配列にハイブリダイズし、互いに隣接し、前記２つのＨｙｂプローブ間に２５個以下のヌクレオチド、好ましくは１５個以下のヌクレオチド、より好ましくは１０個以下のヌクレオチド、具体的には５個以下のヌクレオチドを有する。
【０１２７】
２つのＨｙｂプローブがある場合、１つはアクセプター蛍光プローブで標識され、もう１つはドナーで標識され、標識配列によるＨｙｂプローブのハイブリダイズ時に、ドナーおよびアクセプター蛍光プローブは、好ましくは互いの０〜２５個以内のヌクレオチドであり、より好ましくは互いの０〜１０個以内のヌクレオチドであり、最も好ましくは互いの０〜５個以内のヌクレオチドであるようになっている。
【０１２８】
２つより多くのＨｙｂプローブがある場合、少なくとも１つはアクセプター蛍光プローブで標識され、その他はドナーで標識され（逆もまた同様）、標識配列によるＨｙｂプローブのハイブリダイズ時に、ドナーおよびアクセプター蛍光プローブは、好ましくは互いの０〜２５個以内のヌクレオチドであり、より好ましくは互いの０〜１０個以内のヌクレオチドであり、最も好ましくは互いの０〜５個以内のヌクレオチドであるようになっている。
【０１２９】
プロテウス種、具体的には臨床的に重要であるプロテウス種を検出し、かつ／または同定するために、少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブのセットが使用されうるが、前記プローブは、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つとハイブリダイズし、ここで好ましくは２５以下のヌクレオチド、より好ましくは１０個以下のヌクレオチド、かつ最も好ましくは５個以下のヌクレオチドが前記プローブ間に存在する。
【０１３０】
本発明のプローブのセットは、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれ以上のプローブからも成りうるが、好ましくは、２〜５個のプローブからなる。
【０１３１】
表２にリストアップされたプローブのセットおよびその相同体は、本発明の好ましいセットである。
【０１３２】
プライマーとして使用される２個、プローブとして使用されるその他の３個のポリヌクレオチドのセットも使用されうる。次いで、前記プライマーの１つおよび前記プローブは、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つにハイブリダイズし、好ましくは２５個以下のヌクレオチド、より好ましくは１０個以下のヌクレオチド、かつ最も好ましくは５個以下のヌクレオチドが前記プライマーと前記プローブとの間に存在する。
【０１３３】
本発明の少なくとも２個のポリヌクレオチドのセットは、プロテウス種、具体的には、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、および／またはＰ．ペンネリの検出および／または同定のための方法において使用される。
【０１３４】
試料におけるプロテウス種、具体的には、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、および／またはＰ．ペンネリの検出および／または同定のための本発明の方法が、
（ｉ）所望により、前記試料に存在するポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または少なくとも１つの標的配列、またはその断片を、少なくとも１つの適切なプライマーペアで増幅するステップと、
（ｉｉｉ）配列番号１〜１７からなる群から選択される少なくとも１つの標的配列、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、いずれかの相同体、およびその少なくとも１０個かつ好ましくは少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片にハイブリダイズする少なくとも２つのＨｙｂプローブの少なくとも１つのセットと前記ポリ核酸を接触させるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られた異なったハイブリダイゼーションシグナルからの試料におけるプロテウス種の存在を推定し、またはプロテウス種を同定するステップと
を含んでなる。
【０１３５】
例えば、増幅ステップで使用されるプライマーペアが、配列番号５３もしくは６１によって表されるポリヌクレオチド、またはその相同体のいずれか由来の順方向プライマー、および配列番号４４、５８、もしくは５９によって表されるポリヌクレオチド、またはその相同体のいずれか由来の逆方向プライマーの組合せである。
【０１３６】
例えば、ハイブリダイゼーションステップにおいて使用される２つのＨｙｂプローブのセットは、配列番号２２によって表されるＨｙｂプローブと配列番号３７、３８、および３９によって表されるＨｙｂプローブ、またはその相同体のいずれかとの組合せでありうる。
【０１３７】
配列番号２２によって表されるＨｙｂプローブは、フルオレセイン標識であり、その他はＬＣＲ６１０、ＬＣＲ６４０、ＬＣＲ６７０、またはＬＣＲ７０５標識のいずれかでありうる。
【０１３８】
Ｈｙｂプローブ系の利点の１つは、これにより、以下の分子コンセプトに基づき、変異、多型、および他の変形核酸種を含む、配列バリエーションの検出が可能であることにあり、すなわち、Ｈｙｂプローブの１つは厳重に結合する「アンカープローブ」であるが、隣接した「センサプローブ」は、配列バリエーションの領域を補う。最終ＰＣＲ産物の融解中、配列の変化はセンサプローブの融解温度（Ｔｍ）の変化として検出される。
【０１３９】
例えば、試料が配列番号１のみを含有する場合は、前記配列番号１に特異的にハイブリダイズするＨｙｂプローブを使用することにより単一の融解ピークが生じる。試料に相同体もある場合には、同じ２つのＨｙｂプローブを使用することにより、一般に容易に観察可能な温度変化を誘発する少なくとも１個のミスマッチ塩基がある限り２つのピークが生じることになる。
【０１４０】
増幅の産物の検出のために使用されるプローブのフォーマット、選択（または設計）されるポリヌクレオチド、そのＴｍ、およびハイブリダイゼーション条件によって、蛍光は増幅ステップ中に測定され、次いで増幅曲線を生成し、または増幅ステップ後に、融解曲線分析のために融解曲線を生成しうる。
【０１４１】
したがって、得られたシグナルは、増幅曲線の形または融解曲線の形で視覚化され、そこからプロテウス種の存在を推定し、かつ／または（１つもしくは複数の）どのプロテウス種が存在するかを推定することが可能である。
【０１４２】
具体的には、試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための方法は、
（ｉ）必要ならば、試料におけるポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、いずれかの相同体、およびその少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つを、その１つが標識されているプライマーのペアで増幅させるステップと、
（ｉｉｉ）ポリ核酸を、その間に２５個未満のヌクレオチドを有する前記標識プライマーに隣接し、前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのＨｙｂプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）プロテウス種の存在を推定し、かつ／またはステップ（ｉｖ）において得られたシグナルからの試料におけるプロテウス種を同定するステップと
をも含んでなる。
【０１４３】
Ｈｙｂプローブ系を使用する本発明の方法を１つもしくはいくつかのプロテウス種の検出および同定のために適合させ、それ／それらの他のプロテウス種との区別を可能にしうる。
【０１４４】
具体的には、Ｈｙｂプローブ系を使用する本発明の方法をプロテウス・ミラビリスの検出および同定のために適合させ、その他のプロテウス種との区別を可能にしうる。
【０１４５】
次いで、増幅ステップにおいて、適切なプライマーは、配列番号１〜１０、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列を特異的に増幅するプライマーペアである。
【０１４６】
ハイブリダイズステップにおいて、Ｈｙｂプローブは、例えば、配列番号２１〜２４、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５１、５４、５５、および６５〜６７のいずれか、またはＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、またはその相補的形態に特異的ハイブリダイズするべきである。
【０１４７】
したがって、プロテウス・ミラビリス菌株は、融解曲線分析によって検査された他のすべての生物と明白に区別されうる。
【０１４８】
非プロテウス種またはヒトゲノムＤＮＡと関連性のシグナルは得られなかった。
【０１４９】
２つのＨｙｂプローブの好ましいセットは、配列番号２４または相同体および配列番号３９または相同体からなる。
【０１５０】
配列番号２４および３９からなるＨｙｂプローブのこのセットは、高感度のプロテウス・ミラビリスでありうる。
【０１５１】
Ｈｙｂプローブ系を使用する本発明の方法をプロテウス・ブルガリスまたはプロテウス・ペンネリの検出および同定のために適合させ、その他のプロテウス種と前者および後者との区別を可能にしうる。
【０１５２】
次いで、プロテウス・ブルガリスの検出および／または同定のために、増幅ステップにおいて、適切なプライマーは、配列番号１１〜１３、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列を特異的に増幅するプライマーペアである。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションにおいて、Ｈｙｂプローブは、例えば、配列番号１８〜２０、５６および５７、またはＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、またはその相補的形態のいずれかに特異的にハイブリダイズするべきである。
【０１５４】
配列番号１８〜配列番号６７に対応する表４にリストアップされた各ポリヌクレオチド、およびその相同体のいずれかを、プライマーおよび／またはプローブとして、単独または組合せて、本発明の方法において使用することができる。
【０１５５】
やはりハイブリダイゼーション法に基づく第２の実施形態が、ラインプローブアッセイ（Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ）法である。このラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）は、いくつかのポリヌクレオチドプローブ（陰性または陽性対照ポリヌクレオチドを含む）が平行ラインとして便利に適用されうる膜ストリップを使用する逆ハイブリダイゼーションフォーマットである（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３４頁）。スタイヤー（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら（（１９９３年）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：１０９３−１１０２頁）によって、かつ欧州特許第６３７３４２号明細書に記載されたＬｉＰＡ法は、迅速かつユーザに優しいハイブリダイゼーション試験を提供する。結果は増幅の開始後４時間以内に読取ることができる。通常、その間に非同位標識が増幅産物に組込まれる増幅、およびアルカリ変性後、増幅産物はプローブと膜上で接触され、ハイブリダイゼーション約１〜１．５時間実行される。その結果として、形成されたハイブリッドは酵素法によって検出され、可視の紫茶色の沈殿物が生じる。ＬｉＰＡフォーマットは市販のスキャニングデバイスと完全に互換性であり、したがって結果の自動解釈を可能にする。その利点のすべてにより、ＬｉＰＡフォーマットはルーチン設定での使用に責任をもつ。
【０１５６】
ＬｉＰＡフォーマットは、種レベルだけではなくより高いまたは低い分類群レベルで病原菌の検出および／または同定の有利な手段である。例えば、ＬｉＰＡストリップ上でのプローブ構成は、それらによりプロテウスの完全な属が検出され、または属内の種（例えば、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、および／またはＰ．ペンネリ等）が同定され、または場合により種内の亜型も検出されうるように選択されうる。
【０１５７】
多数のプローブによるハイブリダイゼーション結果を同時に生成する能力は、ＬｉＰＡ技術の他の利点である。多くの場合、プローブの特定の組合せによって得られる情報の量は、単一のプローブアッセイを使用して得られるデータを数で大幅に凌駕する。したがって、膜ストリップ上のプローブの選択は、最適化されたプローブのセットにより可能な限り最大の情報が生じるため最重要である。
【０１５８】
これらのプローブは、異なる位置で膜ストリップに適用されうるとともに、その結果は、これらのプローブの少なくとも１つが陽性である場合は陽性として解釈される。あるいは、これらのプローブは同じ位置で混合物として適用され、それによってストリップ上のラインの数を削減することができる。この削減は、ストリップをより簡潔にし、またはストリップ上のプローブの総数を広げうるために便利でありうる。
【０１５９】
他の方法が、ＬｉＡストリップの製造手順を相当に単純化しうる縮重プローブの使用である。
【０１６０】
さらに他の方法が、本発明の２つのオリゴヌクレオチドを含んでなるキメラプローブである。例えば、配列番号３７および５５の配列は両方とも２つのタイプのＩＴＳ形態Ｐ．ミラビリスを検出するために必要とされる。この代替法において、第１の配列番号のヌクレオチド配列の後、第２のヌクレオチド配列を有するプローブを合成することができる。このプローブは配列番号３７および５５の２つのプローブ配列の複合特性を有することになる。
【０１６１】
これら２つの方法も本発明のいずれかの実施形態または方法において使用されうる。
【０１６２】
上記の特性により、ＬｉＰＡ系は、いくつかの生物が試料で同時に検出される必要があるハイブリダイゼーション法の有効なフォーマットとしてみなされうる。
【０１６３】
しかし、異なるプローブが同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に使用される他のハイブリダイゼーションアッセイが上記の検出および／または選択法のために使用されうることを明らかにすべきである。例えば、標的核酸を固体支持体に固定化し、すべてが異なって標識された異なるプローブの混合物を使用することが可能であり、結果として標的にハイブリダイズされたプローブの各々の異なる検出シグナルが生じうる。また今日、多くの異なる支持体が利用可能である。
【０１６４】
一例として、ＬｉＰＡフォーマットを使用する試料における１つもしくはそれ以上のプロテウス種の検出のために従うべき手順の概略を以下に示す。
− 第１に、かつ必要ならば、試料に存在する核酸を増幅および／またはハイブリダイゼーションのために利用可能にする。
− 所望により、核酸を１つもしくは別の標的増幅系で増幅する。通常、増幅はその後のハイブリダイゼーションシグナルを強化するために必要とされる。
− 第三に、場合により変性ステップ後、試料に存在する核酸または結果として生じる増幅産物を、目的とする生物の検出を可能にする、１つもしくはそれ以上のプローブが固定化されるＬｉＰＡストリップと接触させ、ハイブリダイゼーションを続行させる。
− 最後に、最終的に洗浄ステップを行った後、便利かつ互換性の検出系を使用してハイブリッドを検出する。得られたハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、特定の生体試料においてスクリーニングされる１つもしくはそれ以上の生物の存在または非存在が推定されうることが観察される。
【０１６５】
ｒＲＮＡスペーサーの保存フランキング領域において、すなわち１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子において位置した普遍的プライマーを使用することができる。
【０１６６】
一部の用途のために、試料に存在する異ならない細菌であるが、より特異的にプロテウス種を増幅することが適切でありうる。
【０１６７】
試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための本発明の方法が、
（ｉ）必要ならば、試料に存在するポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）必要ならば、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、またはその一部を、少なくとも１つの適切なプライマーペアで増幅するステップと、
（ｉｉｉ）ポリ核酸を、配列番号１〜１７、またはＴがＵによって置換される前記配列番号１または１７のＲＮＡ形態、またはその相補的形態、またはいずれかの相同体、またはその少なくとも１０個および好ましくは少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドからなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも１個のプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られた異なったハイブリダイゼーションシグナルからの試料に存在する微生物を検出し、かつ／または同定するステップと
を含んでなる。
【０１６８】
増幅のステップにおいて言及されたＩＴＳの一部は、標的配列、または標的配列そのもの、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、またはその相補的形態、またはいずれかの相同体、またはその少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片からなる標的配列を含んでなる。
【０１６９】
優先的に、本発明は、少なくとも２つの微生物が同時に検出される上記の方法を提供する。
【０１７０】
ステップ（ｉｉｉ）に記載されたプローブのセットは、本発明の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、もしくはそれ以上のプローブを含んでなる。
【０１７１】
本発明の好ましい方法において、ステップ（ｉｉｉ）に記載されたプローブのセットは、少なくとも２つのプローブを含んでなる。
【０１７２】
好ましいプローブは、配列番号１８〜６７のポリヌクレオチド、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、いずれかの相同体、および、核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣが排除されるという条件で、その約１０個の隣接ヌクレオチドの断片、より好ましくはその約２０個の隣接ヌクレオチドの断片である。
【０１７３】
本発明は、ステップ（ｉｉｉ）で規定されたプローブが、優先的に１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域からの少なくとも１つの他のプローブと組合されており、同じ試料に存在しやすい異なる病原菌の同時の検出を可能にする上記の方法も提供する。
【０１７４】
好ましいプローブは、同じハイブリダイゼーション条件下に最適な実行を達成するために設計されており、それらは同時のハイブリダイゼーションのセットにおいて使用することができ、これはこれらのプローブの有用性をきわめて増大させ、結果として時間および労力における大幅な利得をもたらす。
【０１７５】
本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含んでなるキットも本発明の目的である。
【０１７６】
本発明のキットは以下の成分を含んでなる。すなわち
− 配列番号１〜１７のいずれかからなる標的配列、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、またはその相同体にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド、
− ハイブリダイゼーションバッファー、または前記バッファーを製造するために必要な成分。
【０１７７】
好ましいキットが、
− 互いに隣接し、２５個未満のヌクレオチド、好ましくは５個未満のヌクレオチドを有する、配列番号１〜１７のいずれかからなる標的配列、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、またはその相同体にハイブリダイズするＨｙｂプローブの少なくとも１つのセット、
− ハイブリダイゼーションバッファー、または前記バッファーを製造するために必要な成分を含んでなる。
【０１７８】
結論として、標的としてプロテウスＩＴＳを使用することにより、異なる検出および／または同定法において使用されるプローブを設計することが可能である。
【０１７９】
リアルタイムＰＣＲ法により、一方では、ライトサイクラー系における単一の融解ピークを生成する単一のＨｙｂプローブセットを使用し、プロテウス属―具体的にはＰ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、およびＰ．ペンネリ―を検出し、同定することが可能である（実施例４）。
【０１８０】
他方では、種特異的シグナルを特定の種（実施例３におけるＰ．ミラビリス）の特異的融解ピークの存在によって、または特定の種（実施例５および６におけるＰ．ブルカリス、およびＰ．ペンネリを参照）に特異的であるＴｍでのピークの存在によって得ることができる。
【０１８１】
完全なＩＴＳ領域をシークエンシングし、かつそれをここに記載された基準配列と比較することも、プロテウス種を検出し、同定する方法として使用できる（実施例７）。
【０１８２】
前述の説明および以下の実施例は、本明細書に具体的に開示された実施形態に本発明を限定するものとして解されるべきではない。
【実施例】
【０１８３】
下記の実施例のために、１６Ｓ−２３Ｓ内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を、それぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの保存領域において設計されたプライマーを使用して増幅させた。
【０１８４】
実施例１：ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）プロトコール
ＤＮＡを標準方法に従って調製し、約１０４個のゲノム等価物を増幅の標的として使用した。
【０１８５】
その試料の定量曲線および融解ピークが存在した場合は、試料を陽性標識した。
【０１８６】
プローブをライトサイクラーｖ１．２（ソフトウェアｖ４）におけるＨｙｂプローブとして作用するように設計し、リアルタイム蛍光ＰＣＲ検出を可能にした。
【０１８７】
１つのＨｙｂプローブはその３’末端においてフルオレセイン色素で標識されたが、隣接するＨｙｂプローブはその５’末端においてＬＣ−レッド６４０またはＬＣ−レッド７０５色素で標識された。
【０１８８】
キットＬＣ−ファストスタート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）ＤＮＡマスター・ハイブリダイゼーション・プローブ（Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ）（カタログ番号３００３２４８または２２３９２７２）のメーカーの使用説明書に従う。
− 純度、濃度、および阻害剤の非存在に関してＰＣＲに適した試料材料が使用可能であり、
− プライマーは、各々０．３〜１μＭの最終濃度とする、
− 各々、または二重で０．２μＭの最終濃度でのＨｙｂプローブ、
− ＭｇＣｌ２の濃度を最適化し、１〜５ｍＭで変動してよく、
− 陰性対照を実行すること。
【０１８９】
増幅および融解条件は以下に記載されている。ＬＣソフトウェアのバージョン４を使用した。定量化設定はＦ２／バックＦ１（サンプル）であった。ベースライン調節のために算術モードを使用した。横断点（Ｃｔ）計算は最大二次微分に基づいた。融解ピークの計算方法は多項式であった。ピーク面積を使用してＴｍを計算した。
【０１９０】
【表３】
【０１９１】
実施例２：Ｈｙｂプローブの異なるセット
本実施例においては、１つのＨｙｂプローブをその３’末端においてフルオレセイン色素で標識し、隣接するＨｙｂプローブをその５’末端においてＬＣ−レッド６４０またはＬＣ−レッド７０５色素で標識した。
【０１９２】
実施例１に記載されたのと同じライトサイクラープロトコールを適用した。
【０１９３】
【表４】
【０１９４】
実施例３：Ｐ．ミラビリス特異的Ｈｙｂプローブ
配列番号２４および配列番号３９によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。第１（配列番号２４）はフルオレセイン標識され、第２（配列番号３９）はＬＣ−レッド６４０標識された。
【０１９５】
実施例１に記載されたのと同じライトサイクラープロトコールを適用し、使用された試料はＰ．ミラビリス菌株の１つを含んだ。５３℃での１つの特異的融解ピークが観察された。
【０１９６】
本Ｈｙｂプローブセットの感度は４２個のＰ．ミラビリス菌株（西欧由来１０個、英国由来１０個、南欧由来１０個、米国由来１０個、および日本由来２個）を使用して評価された。すべてのＰ．ミラビリス菌株は可視定量曲線を有し、Ｃｔ値は１９．９５〜２２．８１のばらつきがあった。
【０１９７】
５３℃（ＳＴＤＥＶＡ ０．６０℃）の融解ピークが試験したすべてのＰ．ミラビリス菌株で観察され、本ＨｙｂプローブセットによるＰ．ミラビリスに対する１００％の感度を示した。
【０１９８】
特異性を試験するために、３個のＰ．ブルガリス菌株および３個のＰ．ペンネリ菌株を試験した。定量曲線および融解曲線は得られず、臨床的に重要なその他のプロテウス種に関して有する１００％の特異性を示した。
【０１９９】
これらのプロテウス種に加えて、大きな一団の他の生物を試験し（表３を参照）、かつ別の実験をヒトＤＮＡで行った。試験したヒトＤＮＡによっても微生物によっても定量曲線または融解曲線は得られず、１００％のＨｙｂプローブ特異性が確認された。
【０２００】
【表５】
【０２０１】
本Ｈｙｂプローブセットは、特異的なやり方でＰ．ミラビリスを検出し、同定することができる。
【０２０２】
実施例４：プロテウス種のＨｙｂプローブ
それぞれＰ．ミラビリスの２個の菌株（１つの試料に各菌株）、Ｐ．ペンネリの１個、およびＰ．ブルガリスの１個を含んでなる４つの試料を試験した。
【０２０３】
配列番号３０および配列番号４４によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。
【０２０４】
各菌株は、定量曲線を生成し、５５℃での１つの融解ピークが観察された。
【０２０５】
したがって、本Ｈｙｂプロテウスセットは、異なるプロテウス種、具体的には、臨床的に重要であるプロテウス種を検出し、かつ同定することができる。
【０２０６】
実施例５：Ｐ．ペンネリを他のプロテウス種と区別するためのＨｙｂプローブ。
それぞれＰ．ミラビリスの２個の菌株（１つの試料に各菌株）、Ｐ．ペンネリの１個、およびＰ．ブルガリスの１個を含んでなる４つの試料をＨｙｂプローブの他のセットで試験した。
【０２０７】
配列番号２７および配列番号４２によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。
【０２０８】
各菌株は定量曲線を生成した。融解曲線分析後、Ｐ．ペンネリは５２．５℃で融解ピークを示した。その他の３つは５６℃で融解ピークを示した。
【０２０９】
したがって、本Ｈｙｂプローブセットは、Ｐ．ペンネリをその他のプロテウス種と区別し、同定することを可能にする。
【０２１０】
実施例６：Ｐ．ブルガリスを他のプロテウス種と区別するためのＨｙｂプローブ。
【０２１１】
それぞれＰ．ミラビリスの２個の菌株（１つの試料に各菌株）、Ｐ．ペンネリの１個、およびＰ．ブルガリスの１個を含んでなる４つの試料をＨｙｂプローブの他のセットで試験した。
【０２１２】
配列番号３２および配列番号４５によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。
【０２１３】
各菌株は定量曲線を生成した。融解曲線分析後、Ｐ．ブルガリスは５４．５℃で融解ピークを示した。その他の２つは５２．５℃で融解ピークを示した。
【０２１４】
したがって、本Ｈｙｂプローブは、Ｐ．ブルガリスをその他のプロテウス種と区別し、同定することを可能にする。
【０２１５】
各々の種のＩＴＳ配列を考慮することにより、５４．５℃での唯一の融解ピークが予想された。
【０２１６】
得られた結果は、試験されたＰ．ブルガリスの菌株が、そのＩＴＳ配列において、Ｔｍで観察されるシフトに関与する多型を含むことを意味する。
【０２１７】
実施例７：ＩＴＳヌクレオチド配列決定によるプロテウス属の検出および同定。
含むことが推定されたプロテウス種の明らかな表示なしに試料を受取った。
【０２１８】
決定すべき種のＩＴＳ領域を１６Ｓおよび２３Ｓに位置した普遍的プライマーを使用して増幅した。
【０２１９】
単位複製配列をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へクローン化し、ＩＴＳヌクレオチド配列をプラスミドベクターにおいて位置したプライマーを使用するジデオキシ鎖末端化学に従って誘導した。
【０２２０】
ｔＲＮＡｇｌｕとｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａを含んでなる両方のスペーサーが確認された。
【０２２１】
これらのＩＴＳ配列を配列分析にかけ、すでに配列決定されたその他のスペーサーと比較した。
【０２２２】
同定すべき試料からのｔＲＮＡｇｌｕスペーサーのヌクレオチド配列は、配列番号４によって表されるＰ．ミラビリスのｔＲＮＡｇｌｕコンセンサススペーサーヌクレオチド配列と完全に一致した。
【０２２３】
この試料からのｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａスペーサーのヌクレオチド配列は、配列番号６によって表されるＰ．ミラビリスのｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａスペーサーのコンセンサスヌクレオチド配列と比較すると７０２のうち３つの塩基ペアが異なっていた（９９．４％相同性）。
【０２２４】
高度の相同性を考慮して、試料がＰ．ミラビリスを含んだことが推定されうる。
【０２２５】
実施例８：臨床的に重要な３つのプロテウス種を区別するためのＨｙｂプローブ。
配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２によって表される３つのＨｙｂプローブのセットを、それぞれ、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ペンネリ、およびＰ．ブルガリスを含んでなる試料について、実施例１に記載されたライトサイクラープロトコール用に設計した。
【０２２６】
フルオレセイン標識された第１のＨｙｂプローブ（配列番号５０）、およびＬＣ−レッド標識されたその他の２つ（配列番号５１および配列番号５２）は、融解曲線の手段、６３℃での融解ピーク、および６７℃での他の２つの融解ピークを有するＰ．ミラビリスを表す融解曲線によって、Ｐ．ブルガリスおよびＰ．ペンネリとＰ．ミラビリスとの区別を可能にする。
【０２２７】
【表６】
【０２２８】
【表７】
【０２２９】
【表８】
【０２３０】
【表９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテウス種（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、具体的にはプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）および／またはプロテウス・ペンネリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ）の特異的検出および／または同定のために使用される、１６Ｓと２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子間のＩＴＳ（内部転写スペーサー）領域由来の新しい核酸配列に関する。
【０００２】
本発明は、ＩＴＳ領域由来の新しい核酸配列を使用する、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリスおよび／またはプロテウス・ペンネリの特異的検出および／または同定のための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
プロテウス属は８種、すなわちＰ．ミラビリス、Ｐ．ペンネリ、Ｐ．ブルガリス、Ｐ．ミクソファシエンス（Ｐ．ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、およびＰ．ハウセリ（Ｐ．ｈａｕｓｅｒｉ）、ならびに未だ命名されていない３つのゲノム種からなる。
【０００４】
プロテウス属のメンバーは、一般に環境中に存在するが、それらはしばしば胃腸管の一部をも構成する。臨床的には、Ｐ．ミラビリスが最も頻繁に単離される生物として最も重要ではあるが、その他の種もまた臨床設定において遭遇されうる。
【０００５】
Ｐ．ミラビリスは、院内感染からの単離株の３％を占めるが、一般的な尿路感染の単離株のうち大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に次ぐ第二位であり、単純性膀胱炎、腎盂腎炎、および前立腺炎の原因物質として第三位である。Ｐ．ミラビリスは、菌血症、新生児髄膜脳炎、髄膜炎、膿胸、および骨髄炎など生命にかかわる感染の原因菌としても報告されている。また、胃腸および創傷感染など他の感染もＰ．ミラビリスおよびＰ．ペンネリなど関連種によって引き起こされうる。
【０００６】
Ｐ．ペンネリおよびＰ．ミラビリスは、腎結石形成に関係していることがわかったが、Ｐ．ミラビリスは関節リウマチにおける病原菌として報告されている。
【０００７】
現在、プロテウス種は、培養に基づく方法および表現型生化学試験によって同定され、かつ区別されている。
【０００８】
プロテウスの典型的な特性は、ヒツジ血液寒天上での細菌の群れを成して移動する特性である。オキシダーゼおよびインドール試験と組合せて異なるプロテウス種が正確に区別されうるが、すべての場合が従来の系によって明確なやり方で解決されるわけではない。現在、市販の系ではプロテウス種間の同定および区別における均一かつ唯一の解答は得られない。
【０００９】
ニトロフラントインおよびテトラサイクリンに対するそれら特有の耐性に加えて、プロテウス属のその大部分は、野生型菌株として、アミノ／ウレイドペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、およびカルバペネムに影響されやすい。しかし、最近の報告では、一部の抗菌剤に対する、とりわけ上記のものに対する耐性の発生が、特に一部の病院において示されている。それらの生物の迅速かつ特異的な同定アッセイが、これら典型的な日和見細菌性生物によって引き起こされる感染のより適切な抗菌管理の基礎を形成しうる。
【００１０】
増大する院内感染の数および抗菌剤の既存のパネルに対する増大する耐性を考慮するとともに、培養に基づき試験は依然として時間がかかり、かつ熟練者の高い作業負荷を必要とするため、迅速かつより特異的な同定のための新しい方法が必要である。具体的には、院内敗血症のような重篤な感染の場合に、それが生きるか死ぬかの問題であるため迅速、特異的、かつ高感度なアッセイが必須である。
【００１１】
特許文献１は、ＩＴＳ領域からの偶発性プローブＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣによって記載する、この特定種を同定するためのＰ．ブルガリスの不当に特徴付けられた２３ＳおよびＩＴＳ ｒＲＮＡからの一部のプローブを記載している。試料に存在する２３Ｓ ｒＤＮＡの一部を増幅することによって、唯一存在するプロテウス群からＰ．ミラビリス種を有する試料における細菌を同定するための方法が特許文献２に開示されている。
【００１２】
しかし、プロテウス種が試料に存在するかどうかだけではなく、どのタイプのプロテウス種が存在しているかを確認する方法が必要とされている。
【特許文献１】国際特許出願国際公開第０３／０９５６７７号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願国際公開第００／５２２０３号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のために使用されうる、プロテウス種のＩＴＳ由来の新しい核酸配列を提供することである。
【００１４】
したがって、本発明は、配列番号１〜６７、その相補的形態、ＴがＵによって置換されているそのＲＮＡ形態、および相同体からなる群から選択される単離核酸分子を提供する。
【００１５】
プロテウス種の検出および／または同定のための前記核酸分子の使用も本発明の目的である。
【００１６】
本発明の１の態様は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のための、プローブおよび／またはプライマーとして使用するための新しいポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
したがって、本発明は、プロテウス種の検出および／または同定のための、配列番号１８〜６７、その相補的形態、ＴがＵによって置換されているそのＲＮＡ形態、その相同配列、およびその断片からなる群から選択される核酸分子を含んでなる、またはそれからなる標的配列に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子を提供する。
【００１８】
本発明の他の態様は、試料におけるプロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のためのプローブのセットに関する。
【００１９】
本発明の他の態様は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域の特異的増幅を可能にするプライマーに関する。
【００２０】
本発明の他の目的は、本発明の新しい配列のいずれか、もしくは本発明のプローブおよび／またはプライマーの新しいセットのいずれか、またはその組合せを含んでなる組成物である。
【００２１】
本発明の他の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のために、前記プローブおよび／またはプライマーが使用されるキットである。
【００２２】
本発明の他の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のための迅速かつ確実なハイブリダイゼーション方法である。
【００２３】
本発明の他の目的は、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のためのリアルタイムＰＣＲに基づくハイブリダイゼーション方法である。
【００２４】
表の説明
表１：実施例で使用された増幅および融解曲線プログラム。
表２：試験されたＨｙｂプローブの異なる組合せ。
表３：配列番号２４および３９によって表されるＨｙｂプローブの組合せの特異性について試験された微生物のリスト。
表４：配列番号１〜６９のリスト。
【００２５】
この表の配列番号は以下の生物に由来する：
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下の定義は、以下に記載された本発明の異なる実施形態において使用された語および表現を説明するために役立つ。
【００２９】
「スペーサー」および「ＩＴＳ」（内部転写スペーサー）という語は両方とも１６Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間、または１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間の領域を指す略語である。
【００３０】
「プローブ」という語は、標的配列にハイブリダイズする十分に相補的である配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【００３１】
本発明の枠組みにおける標的配列は、配列番号１〜１７のいずれかによって表される核酸分子、その相補的形態、そのＲＮＡ形態、その相同体または断片を含んでなる、検出すべき配列である。
【００３２】
標的配列は、ゲノムＤＮＡまたは前駆体ＲＮＡ、またはその増幅バージョンのいずれかでありうる。
【００３３】
好ましくは、本発明のプローブは、約８０％、約８５％、約９０％、もしくは約９５％以上、標的配列の正確な相補体と相同である。
【００３４】
本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入を含んでなる組換えプラスミドのクローン化（および増殖）によって、任意に、後者を適切なヌクレアーゼを使用してクローン化プラスミドから開裂し、それらを、例えば、分子量に従う分画によって回収することによって形成されうる。
【００３５】
本発明によるプローブは、例えば、従来のリン酸トリエステル法によって化学的に合成もされうる。
【００３６】
本明細書で使用される「相補的」核酸という語は、核酸配列が互いと完全な塩基対二本鎖を形成しうることを意味する。
【００３７】
「ポリ核酸」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」は、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる二本鎖もしくは一本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡに対応する。長さが１００個より小さいヌクレオチドであるポリ核酸は「オリゴヌクレオチド」とも呼ばれる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、実質的にそのハイブリダイゼーション特性を変えることがない修飾基を含んでなるイノシンまたはヌクレオチドなど修飾ヌクレオチドをも含有しうる。
【００３９】
本発明のポリ核酸分子は、つねに５’末端〜３’末端で表される。それらは、いかなる形態でも、すなわちその二本鎖または一本鎖形態（２つの鎖のいずれか）、そのＤＮＡまたはＲＮＡ形態（ここでＴはＵによって置換される）、修飾または非修飾で使用されうる。
【００４０】
「最近隣接」という語は、ＤＮＡ相同性の点で最も密接に関係していることが周知または予想され、かつ目的とする生物から区別される必要がある分類群を意味する。
【００４１】
「分類群特異的ハイブリダイゼーション」または「分類群特異的プローブ」という表現は、プローブが、そのために設計された分類群からのＤＮＡまたはＲＮＡにのみハイブリダイズし、他の分類群からのＤＮＡまたはＲＮＡにはハイブリダイズしないことを意味する。
【００４２】
分類群という語は、完全な属または属内の亜群、種またはさらに種内の亜型（亜種、血液型亜型、シクエバー（Ｓｅｑｕｅｖａｒ）、次亜種等）を指しうる。
【００４３】
「特異的増幅」または「特異的プライマー」という語は、前記プライマーが、そのために設計された生物からの関連領域のみを増幅し、他の生物からものを増幅しないことを指す。
【００４４】
「スペーサー特異的増幅」または「スペーサー特異的プライマー」は、前記プライマーが、そのために設計された生物からのスペーサー領域のみを増幅し、他の生物からのものは増幅しないことを指す。
【００４５】
「特異的プローブ」という語は、そのために設計された生物からの関連領域とのみハイブリダイズし、他の生物からの対応する領域とも、他の領域ともハイブリダイズしないプローブを指す。
【００４６】
「スペーサー特異的プローブ」は、そのために設計された生物からの関連スペーサーとのみハイブリダイズし、他の生物からのスペーサーとはハイブリダイズしないプローブを指す。
【００４７】
「感度」という語は偽陰性の数を指し、すなわち、検出すべき１００個の菌株のうち１個が見逃された場合は、その試験は（１００−１／１００）％＝９９％の感度を示す。
【００４８】
「特異性」という語は偽陽性の数を指し、すなわち、検出される１００個の菌株で、２個がそのために試験が設計されていない生物に属すると思われる場合は、試験の特異性は（１００−２／１００）％＝９８％である。
【００４９】
「優先的」であるとして選択されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、８０％超、好ましくは９０％超、かつ最も好ましくは９５％超の感度および特異性を示す。
【００５０】
「固体支持体」は、プローブがそのハイブリダイゼーションン特性を保持するという条件で、かつハイブリダイゼーションの背景レベルが低く保持するという条件で、ポリヌクレオチドプローブが結合されうる基質を指しうる。通常、固体基質はマイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）、またはマイクロスフェア（ビーズ）となるが、これらの例に限定されることはない。膜または固定への適用前に、固定を促進し、またはハイブリダイゼーション効率を改善するために核酸プローブを修飾することが便利でありうる。かかる修飾はホモポリマーテーリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボン酸基など異なる反応基との結合、またはビオチン、ハプテン、またはタンパク質との結合を包含しうる。
【００５１】
「標識」という語は、標識核酸の使用を指す。標識化は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１頁）またはベイ（Ｂｅｊ）ら（（１９９０年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ プロベス ４：３５３−３６５頁）によって説明されたものなど増幅の重合ステップ中に組込まれた標識ヌクレオチドの使用によって、もしくは標識プライマーの使用によって、または当業者に周知の他の方法によって実行される。標識の性質は同位体（３２Ｐ、３５Ｓ、等）または非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素、等）でありうる。
【００５２】
「シグナル」という語は、一連の電磁波（例えば、蛍光）、または情報を伝える電流の変化を指す。シグナルは直接可視であり、または異なる手段もしくはデバイスによって可視および／または説明可能とされうる。
【００５３】
試料はいずれかの生体材料を含んで成りうる。生体材料は、感染した人間、または動物から直接、または培養もしくは富化後、または食物から、環境等から取られうる。
【００５４】
生体材料は、例えば、あらゆる種類の吐出物、気管支洗浄、血液、皮膚組織、生検、リンパ球血液培養材料、コロニー等でありうる。前記試料は、当技術分野で周知の方法のいずれかに従って調製または抽出されうる。
【００５５】
本発明に照らして臨床的に重要であるプロテウス種は、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、およびプロテウス・ぺンネリである。
【００５６】
異なるプロテウス種は、スペーサー領域に挿入されたｔＲＮＡ遺伝子、ｔＲＮＡｇｌｕまたはｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａのタイプに基づき２つの異なるタイプのスペーサーを示す。さらに、各々のタイプのスペーサーおよび各々のプロテウス種について、異なるクラスターまたはグループが区別されうる。
【００５７】
例えば、Ｐ．ミラビリスの９個の菌株のうち、第１のタイプのスペーサー、すなわち、ｔＲＮＡｇｌｕの挿入を考慮すると、４種類のグループが定義され、それぞれ配列番号１〜４によって示されうる。
【００５８】
第２のタイプ、すなわち、ｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａの挿入を考慮すると、６種類のグループが定義され、それぞれ配列番号５〜１０によって示されうる。
【００５９】
すべてのプロテウス種、もしくは各々のプロテウス種、または少なくとも２つのプロテウス種のいずれかの組合せを検出および／または同定するために、本発明は新しい核酸分子を提供する。
【００６０】
本発明のＩＴＳ配列は、配列番号１〜１７、その相補的形態、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、およびそのいずれかの相同配列を含んでなる、またはこれらからなる。
【００６１】
以下で「相同体」とも呼ばれるプロテウス種のＩＴＳに存在する相同配列は、本発明の目的でもある。相同性の程度は８０％もしくは８５％よりも高く、好ましくは９０％より高く、より好ましくは９５％よりも高い。
【００６２】
本発明の枠組みにおいて、「相同体」は次いで、配列番号１〜１７のいずれか、またはいずれかのプロテウス種のＩＴＳ領域に位置した、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個のヌクレオチドのそのいずれかの断片と相同配列である。
【００６３】
配列番号１〜１０はＰ．ミラビリス由来であり、配列番号１１〜１３はＰ．ブルガリス由来であり、配列番号１４〜１７はＰ．ペンネリ由来である。
【００６４】
本発明は、いずれかのプロテウス種の検出のためのＩＴＳ由来の新しい核酸分子をも提供し、各々タイプが異なるグループを含んでなる、挿入されるｔＲＮＡを考慮すると、異なるタイプのＩＴＳが存在することによるきわめて高いばらつきによって生じる問題を解決する。
【００６５】
実際に、配列番号４４、５３、５８、５９、および６１からなる新しい核酸分子が、試験されたすべてのプロテウス種、特に臨床的に重要であるプロテウス種の２つのタイプのスペーサーに存在することが見出されている。
【００６６】
言及された特異的ポリヌクレオチド、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０個、および好ましくは約２０個のヌクレオチド（１８、１９、２０、２１、または２２個）のその断片、そのＲＮＡ形態、およびその相補的形態は、属特異的ポリヌクレオチドとも呼ばれ、プロテウス種、具体的には、臨床的に重要である３つのプロテウス種のいずれか、もしくはすべての検出のためのプライマーおよび／またはプローブを設計するために使用されうるＩＴＳの特異的領域である。
【００６７】
１つ、２つ、もしくはそれ以上のプロテウス種の検出および／または同定のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用するための新しいポリヌクレオチドも提供される。
【００６８】
言い換えれば、本発明の目的は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のプロテウス種の検出および／または同定のための本発明の標的配列とハイブリダイズするプローブおよび／またはプライマーとして使用するための新しいポリヌクレオチドに関する。
【００６９】
具体的には、本発明の目的は、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、その相同体、その少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、または３００個の隣接ヌクレオチドの断片からなる群から選択される核酸を含んでなる、またはこれらからなる標的配列に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子である。
【００７０】
好ましいポリヌクレオチドプローブは、長さが約５〜約５０の塩基、より好ましくは約１０〜約２５個のヌクレオチドであり、標的配列と十分に相同である。
【００７１】
配列番号１８〜６７のポリヌクレオチドもしくはその相同体のいずれか、その相補的形態もしくはそのＲＮＡ形態がプローブとして使用されうる。
【００７２】
本発明の好ましいプライマーは、本発明の標的配列の合成のための開始点として作用することが可能な一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明のプライマーの長さおよび配列は、エクステンション産物の合成をプライムすることを可能にするほどでなければならない。
【００７３】
好ましくは、本発明のプライマーは、約５〜約５０個のヌクレオチドの長さであり、好ましくは約１０〜約３５個、より好ましくは約１５〜約２５個である。その特異的長さおよび配列は、温度およびイオン強度など使用される条件によって選択されるべきである。
【００７４】
本発明のプライマーは標的配列を増幅する。言い換えれば、本発明のプライマーは、配列番号１〜１７、その相補鎖および／または相同体のいずれかを含んでなる核酸分子を増幅する。
【００７５】
ｒＲＮＡスペーサーの保存フランキング領域、すなわち、１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子に位置した普遍的なプライマーが使用されうる。プロテウス種が試料に存在する場合は、増幅産物、標的配列は、次いで、配列番号１〜１７、および／または相同体のいずれかからなる核酸分子を含んでなる。
【００７６】
好ましくは、標的配列は、配列番号１〜１７、および／または、それぞれ１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの約４０〜約５０個以下のヌクレオチドによってフランキングされた相同体からなる群から選択される核酸分子からなる。
【００７７】
一部の用途では、試料に存在する異なる細菌ではなく、より具体的にプロテウス種を増幅することが適切でありうる。
【００７８】
この場合、プライマーペアが、本発明のＩＴＳ配列、例えば、配列番号４４および５３によって表されるポリヌクレオチド由来である。
【００７９】
増幅プライマーが対応するテンプレート配列と正確にマッチし、適切な増幅を保証する必要がないということは、文献（クオーク（Ｋｗｏｋ）ら（１９９０年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：９９９頁）において十分に実証されている。
【００８０】
使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１頁）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、（（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０頁）、ウー（Ｗｕ）とウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、（（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９頁）、バラニー（Ｂａｒａｎｙ）、（（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３頁）核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ、グアテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、（（１９９０年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８頁）、コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、（（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９２頁）転写ベース増幅系（ＴＡＳ、クオー（Ｋｗｏｈ）ら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７頁）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、ダック（Ｄｕｃｋ）、（（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：１４２−１４７頁）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、（（１９９２年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６頁）、またはＱβレプリカーゼの手段による増幅（リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、（（１９８８年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２頁）、ロメリ（Ｌｏｍｅｌｉ）ら、（（１９８９年）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３５：１８２６−１８３１頁）、または当技術分野で周知の核酸分子を増幅する他の適切な方法でありうる。
【００８１】
プライマーまたはプローブとして使用するための、または本発明の方法において使用される別のプライマーおよびプローブを設計するための本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１８〜６７によって表されている。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、次いで得られる等価物がさらに標的配列と依然としてハイブリダイズするという条件で、１つもしくはいくつかのヌクレオチドのそのそれぞれの極度への添加もしくはそれからの除去によって、または前記配列内の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドを変更することによって、または両方の組合せによって、配列番号１８〜６７によって表されるポリヌクレオチドのいずれかと配列が異なりうる。前記等価のポリヌクレオチドは、対応する非修飾ポリヌクレオチドとの少なくとも８０％の相同性、好ましくは８５％超、最も好ましくは９０％超の相同性を共有する。
【００８３】
ポリヌクレオチドの等価物を使用する場合、ハイブリダイゼーション条件を修正し、対応する非修飾ポリヌクレオチドと同じ特異性を得る必要がありうる。
【００８４】
結果として、ポリヌクレオチドが同じハイブリダイゼーション条件下のセットで使用される場合、他のポリヌクレオチドの配列をそれに応じて修飾することも必要となる。これらの修飾は、ヘイムス（Ｈａｍｅｓ）Ｂとヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｓ（編）：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、英国（ＵＫ）、１９８５年に記載されたものなどの原理に従って行われうる。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、ホスホロチオエート（マツクラ（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ）ら、（（１９８７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（２１）：７７０６−７７１０頁）、アルキルホスホロチオエート（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、（（１９７９年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８（２３）：５１３４−５１４３頁）またはペプチド核酸（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７−１５００頁）、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（（１９９３年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ．２１（２）：１９７−２００頁）などのヌクレオチド類似体をも含んで成り、または挿入剤（アセリン（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）ら、（１９８４年）、）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１１）：３２９７−３３０１頁）等を含有しうる。
【００８６】
修飾プライマーまたはプローブは、必要な特異性および感度を得るためにそれらが使用される条件に関して適応を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションの結果は実質的に非修飾ポリヌクレオチドで得られたものと同じとすべきである。
【００８７】
これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション動態、ハイブリッド形成の可逆性、ポリヌクレオチド分子の生体安定性等など一部の特性に影響を及ぼすために有利でありうる。
【００８８】
本発明のプローブおよびプライマーは、プロテウス種、具体的にはプロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、および／またはプロテウス・ペンネリの検出および／または同定のための本発明の方法、また目的において使用される。
【００８９】
標的配列の検出および／または同定は、電気泳動法、ハイブリダイゼーション法、またはシークエンシング法を使用することによって実行されうる。
【００９０】
試料における１つもしくはそれ以上のプロテウス種の検出ための本発明の方法は、以下のステップを含んでなる。
− 第１に、かつ必要ならば、試料に存在する核酸を増幅および／またはハイブリダイゼーションのために利用可能にする。
− 第２に、かつ必要ならば、存在する場合には、核酸を１つもしくは別の標的増幅系で増幅する。通常、増幅はその後のハイブリダイゼーションシグナルを強化するために必要である。しかし、一部の試料について、または一部の高度に感受性のシグナル増幅系については、増幅は必要ではない場合がある。
− 第３に、試料に存在する核酸または結果として生じる増幅産物をプローブと接触させ、かつハイブリダイゼーションを続行させる。
−最後に、従来の適合性の検出系を使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、１つ、２つ、もしくはそれ以上のプロテウス種の存在または非存在が推定されうる。
【００９１】
増幅ステップのために、普遍的プライマーとも呼ばれる、ｒＲＮＡスペーサーの保存フランキング領域（１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子）に位置したプライマーが使用されうる。配列番号６８および６９によって表されるプライマーペアは普遍的プライマーペアの例である。
【００９２】
一部の用途のために、試料に存在するすべての細菌ではなく、１つもしくはいくつかの属、または１つもしくはいくつかのプロテウス種を増幅することが適切でありうる。
【００９３】
後者の場合、これはプロテウス種のＩＴＳ領域由来の属特異的プライマーまたは種特異的プライマーを使用することによって達成されうる。
【００９４】
具体的には、試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための発明の方法が、
（ｉ）所望により、前記試料におけるポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）所望により、前記１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または少なくとも１つの適切なプライマーペアを有する、その標的配列または断片の少なくとも１つを増幅するステップと、
（ｉｉｉ）前記ポリ核酸を、配列番号１〜１７、その相同体、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、およびその断片からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）得られたシグナルを解釈し、プロテウス種の存在を推定し、かつ／または前記試料におけるプロテウス種を同定するステップと
を含んでなる。
【００９５】
例えば、本発明のいずれかの方法の増幅またはハイブリダイゼーションステップにおいて言及される断片が、本発明の核酸分子の約１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００個の隣接ヌクレオチドを含んで成り、またはこれらからなりうる。
【００９６】
好ましくは、本発明のプローブは、高い厳密性の条件下にハイブリダイズする。
【００９７】
高い厳密性条件下、相補的核酸ハイブリッドのみが形成される。したがって、アッセイ条件の厳密性は、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間で必要とされる相補性の量を決定する。厳密性は、標的および非標的核酸で形成されるハイブリッド間の安定性における差を最大にするように選択される。
【００９８】
どんな場合でも、適切なハイブリダイゼーション条件は、本発明のポリヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズする場合に得られるハイブリダイゼーションのシグナルが、前記ポリヌクレオチドが非特異的なやり方で標的配列にハイブリダイズする場合に得られるシグナルと異なるようにして選択される。
【００９９】
実際には、異なるシグナルは、例えば、その強度が、標的配列への非特異的ハイブリダイズと比べ、標的への特異的ハイブリダイゼーションにより２倍、５倍、１０倍もしくはそれ以上である場合に視覚化されうる。ＬｉＰＡ系はこの点で優れた例である。
【０１００】
異なるシグナルは、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を使用する場合に、融解曲線分析で異なるピークが引き出される場合にも視覚化されうる。
【０１０１】
１つの実施形態において、おそらく試料に存在する標的配列の検出のためのきわめて便利かつ有利な方法が、リアルタイムＰＣＲ法である。
【０１０２】
本発明の枠組みで使用されうる増幅ＤＮＡの検出のための異なるフォーマット、特にＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブ、「スコーピオンズ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）」、またはＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブがある。
【０１０３】
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブに関して、一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが２つの成分で標識される。第１の成分、いわゆる蛍光剤が適切な波長の光で励起されると、吸収エネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第２の成分、いわゆる消光剤に移される。ＰＣＲ反応のアニーリングステップ中、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、ポリメラーゼ、例えば、伸長段階中のＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によって分解される。結果として、励起蛍光成分および消光剤は空間的に互いから分離され、したがって第１の成分の蛍光放射が測定されうる（欧州特許第５４３９４２号明細書および米国特許第５，２１０，０１５号明細書）。
【０１０４】
モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）プローブに関して、このプローブも第１の成分および消光剤で標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的プローブの異なる末端に位置している。プローブの二次構造の結果として、両方の成分は空間的に近くで溶解する。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、両方の成分は互いから分離し、適切な波長の光による励起後、第１の成分の蛍光放射が測定されうるようになる（米国特許第５，１１８，８０１号明細書）。
【０１０５】
「スコーピオンズ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）」に関して、プローブおよびプライマーが１つの分子に含まれている。モレキュラー・ビーコンズ系と同様、各プローブは第１の成分および消光剤で標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的プローブの異なる末端に位置している。プライマーが、特異的標的配列の非存在下に開放されることから二次構造を防ぐＰＣＲストッパによって各プローブへ連結される。（ホイットコンブ（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ），Ｄ．ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７、８０４−８０７頁、テルウェル（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ），Ｎ．ら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２８巻、第１９号、３７５２−３７６１頁、スワンビック（Ｓｖａｎｖｉｋ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７、１７９−１８２頁（２０００年））。
【０１０６】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ハイブリダイゼーションプローブ試験フォーマットは、あらゆる種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である（マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ），Ｊ．Ａ．およびクリッカ（Ｋｒｉｃｋａ），Ｌ．Ｊ．、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６９（１９８８年）１−２５頁）。これは、同時に使用され、かつ（増幅）標的核酸の同じ鎖の隣接部位と相補的である、２つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブによって特徴付けられる。両方のプローブは異なる蛍光成分で標識される。適切な波長の光で励起されると、第１の成分は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って吸収エネルギーを第２の成分に吸収エネルギーを移し、第２の成分の蛍光放射は両方のハイブリダイゼーションプローブが検出される標的分子の隣接位置に結合する場合にのみ測定されうるようになっている。
【０１０７】
標的配列にアニールされる場合、ハイブリダイゼーションプローブは、頭部−尾部配置で互いにきわめて近くに位置付ける必要がある。通常、第１のプローブの標識３’末端と第２のプローブの標識５’末端との間のギャップは可能な限り小さく、特に約０〜２５個の塩基、かつ好ましくは約１〜約５個の塩基からなる。これはＦＲＥＴドナー化合物およびＦＲＥＴアクセプター化合物の接近を可能にし、これは一般的に１０−１００オングストロームである。
【０１０８】
ＦＲＥＴアクセプター成分の蛍光の増大をモニタリングする代わりに、ハイブリダイゼーションイベントの定量尺度としてＦＲＥＴドナー成分の蛍光減少をモニタリングすることも可能である。
【０１０９】
リアルタイムＰＣＲの当技術分野で周知のすべてのフォーマットのうち、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブフォーマットはきわめて感度が高く、正確、かつ確実であることが証明されている（国際公開公報国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、同第９７／４６７１２号パンフレット、同第９７／４６７１４号パンフレット）。しかし、適切なＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、検出される標的核酸配列の特性によって限定されることもある。
【０１１０】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの用法の代わりとして、蛍光標識プライマーおよび唯一の標識ポリヌクレオチドプローブを使用することも可能である（ベルナルド（Ｂｅｒｎａｒｄ），Ｐ．Ｓ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５（１９９８年）１０１−７頁）。この点で、プライマーがＦＲＥＴドナーまたはＦＲＥＴアクセプター化合物で標識されるかどうか任意に選択されうる。
【０１１１】
蛍光は伸長ステップ中に測定され、使用されるプライマーおよび／またはプローブによって、そのＴｍによって、かつハイブリダイゼーション条件によって増幅曲線を生成し、それにより検出されるプロテウス種の存在を推測し、またはどのプロテウス種が存在するか推測することが可能である。
【０１１２】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（ＨｙｂプローブまたはＦＲＥＴ−プローブとも呼ばれる）も融解曲線分析に使用されうる（国際公開公報国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、同第９７／４６７１２号パンフレット、同第９７／４６７１４号パンフレット）。かかるアッセイにおいては、標的核酸は最初に適切な増幅プライマーとの典型的なＰＣＲ反応で増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、すでに増幅反応中に存在し、またはその後に添加されうる。ＰＣＲ反応の終了後、試料の温度は連続的に上昇する。蛍光はハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合されている限り検出される。融解温度では、ハイブリダイゼーションプローブはその標的から放出され、かつ蛍光シグナルは直ちに背景レベルに低下する。この低下は適切な蛍光対温度−時間プロットでモニタリングされ、第１の微分係数の負数が計算されうる。次いで、かかる係数の得られた最高値に対応する温度の値は、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの前記ペアの確固たる融解温度として取られる。
【０１１３】
標的核酸内の点変異または多型は結果として標的核酸とＦＲＥＴプローブとの間の１００％未満の相補性をもたらし、したがって結果として融解温度の減少が生じる。これによりＦＲＥＴ−Ｈｙｂプローブハイブリダイゼーションによる配列変形のプールの一般的な検出が可能であるが、その後に、前記プールの異なるメンバーが融解曲線分析を実行する手段によって判別されることになりうる。
【０１１４】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの代わりに、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）が代替として融解曲線分析に使用されうる。
【０１１５】
リアルタイムＰＣＲおよび相同リアルタイムＰＣＲ融解曲線分析の有用性に対して、特定のタイプの種または菌株の判別が、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（商標）Ｉなど二本鎖ＤＮＡ結合色素、または、代替として、異なるが類似の標的配列にハイブリダイズする特別に設計されたハイブリダイゼーションプローブのいずれかを使用して可能となる。
【０１１６】
第１の場合、生成された二本鎖ＰＣＲ産物の融解温度が測定される必要がある。しかし、この方法は、小さな配列変形のみが結果としてわずかな融解温度差をもたらすという点で、ほとんど差が有効にモニタリングできないため限定された用途のみ有する。
【０１１７】
あるいは、ハイブリダイゼーションプローブは、プローブ／標的核酸ハイブリッドの融解温度が測定されるやり方で使用されうる。
【０１１８】
ＡＢＩ／Ｐｒｉｓｍ（商標）機器、かつ具体的にはライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（商標）装置など、使用されうる異なるリアルタイムＰＣＲプラットフォームがあり、すべては光放射の測定、融解サイクル中の放射ピークの連続的モニタリング、標識プローブが増幅産物から取外される時点での温度（融解ピーク）の測定、および視覚化からなる同じ原理に基づく。融解ピークデータは、プローブと標的との間のミスマッチが融解の動態に影響を及ぼし、目的とする各々の種の異なる融解ピークをもたらすため、特定の［プローブ：標的］配列の特性である。
【０１１９】
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（商標）プラットフォームは、多くの利点を提供し、具体的には時間の利得、およびハイブリダイゼーションプローブ（Ｈｙｂプローブ）、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、モレキュラー・ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）、スコルピン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プローブ、およびバイプローブ（ＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉ）など、いくつかの異なる配列特異的蛍光プローブ検出系の可能な使用である。
【０１２０】
本発明の好ましい方法においては、数個のヌクレオチド、一般に０〜２５個、好ましくは約１〜約５個のヌクレオチドによって間隔をあけられた、頭部−尾部方向で、本発明の標的配列由来の２つの隣接したポリヌクレオチドプローブからなるＨｙｂプローブ系が使用される。プローブの１つはその３’末端においてドナー色素によって標識され、その他はその５’末端においてアクセプター分子で標識され、３’末端において（プライマーとしてのその作用を阻止するため）リン酸ブロックされる。ドナー色素は一般にフルオレセインであり、アクセプター分子は一般にＬＣレッド６１０、６４０、６７０、または７０５である。
【０１２１】
本発明の標的配列の検出は、内部標識ＰＣＲ鎖および反対鎖上に位置した検出プローブによっても達成されうる。シグナルは色素の空間的接近に依存し、かつ標的の量に依存している。
【０１２２】
両方のプローブがその標的配列にハイブリダイズされると、ドナーの放射光は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってアクセプター蛍光プローブヘ移され、放射蛍光（６１０、６４０、６７０、または７０５ｎｍ）が検出されうる。放射蛍光の強度は、増幅の産物である標的ＤＮＡと平行して増大する。
【０１２３】
ライトサイクラープローブは、加水分解を必要とせず、したがって、ＰＣＲ時間の追加の延長がないＴａｑＭａｎ（商標）プローブに対する利点を提供する（アニーリング延長≦１２秒）。したがって、ライトサイクラーの高速熱サイクルを活用し、ＰＣＲプログラムを４５分のみで終了することが可能である。
【０１２４】
また最近の世代のリアルタイムＰＣＲプラットフォームは、単一の反応でいくつかのプローブをモニタリングすることができ、種レベルでの異なるプロテウスの検出および／または同定、および／または異なるタイプのプロテウススペーサーの区別を可能にする。
【０１２５】
さらに、ＴａｑＭａｎ技術のために設計された方法を容易にＨｙｂプローブ技術に変換することができ、同等の結果が得られることがわかっている（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ 第８５巻（１２）ｐｐ．１２４８−１２５４、２０００年１２月）。
【０１２６】
したがって、本発明の他の目的は、Ｈｙｂプローブとも呼ばれる少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブのセットに関するが、両方のＨｙｂプローブは同じ標的配列にハイブリダイズし、互いに隣接し、前記２つのＨｙｂプローブ間に２５個以下のヌクレオチド、好ましくは１５個以下のヌクレオチド、より好ましくは１０個以下のヌクレオチド、具体的には５個以下のヌクレオチドを有する。
【０１２７】
２つのＨｙｂプローブがある場合、１つはアクセプター蛍光プローブで標識され、もう１つはドナーで標識され、標識配列によるＨｙｂプローブのハイブリダイズ時に、ドナーおよびアクセプター蛍光プローブは、好ましくは互いの０〜２５個以内のヌクレオチドであり、より好ましくは互いの０〜１０個以内のヌクレオチドであり、最も好ましくは互いの０〜５個以内のヌクレオチドであるようになっている。
【０１２８】
２つより多くのＨｙｂプローブがある場合、少なくとも１つはアクセプター蛍光プローブで標識され、その他はドナーで標識され（逆もまた同様）、標識配列によるＨｙｂプローブのハイブリダイズ時に、ドナーおよびアクセプター蛍光プローブは、好ましくは互いの０〜２５個以内のヌクレオチドであり、より好ましくは互いの０〜１０個以内のヌクレオチドであり、最も好ましくは互いの０〜５個以内のヌクレオチドであるようになっている。
【０１２９】
プロテウス種、具体的には臨床的に重要であるプロテウス種を検出し、かつ／または同定するために、少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブのセットが使用されうるが、前記プローブは、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つとハイブリダイズし、ここで好ましくは２５以下のヌクレオチド、より好ましくは１０個以下のヌクレオチド、かつ最も好ましくは５個以下のヌクレオチドが前記プローブ間に存在する。
【０１３０】
本発明のプローブのセットは、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれ以上のプローブからも成りうるが、好ましくは、２〜５個のプローブからなる。
【０１３１】
表２にリストアップされたプローブのセットおよびその相同体は、本発明の好ましいセットである。
【０１３２】
プライマーとして使用される２個、プローブとして使用されるその他の３個のポリヌクレオチドのセットも使用されうる。次いで、前記プライマーの１つおよび前記プローブは、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つにハイブリダイズし、好ましくは２５個以下のヌクレオチド、より好ましくは１０個以下のヌクレオチド、かつ最も好ましくは５個以下のヌクレオチドが前記プライマーと前記プローブとの間に存在する。
【０１３３】
本発明の少なくとも２個のポリヌクレオチドのセットは、プロテウス種、具体的には、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、および／またはＰ．ペンネリの検出および／または同定のための方法において使用される。
【０１３４】
試料におけるプロテウス種、具体的には、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、および／またはＰ．ペンネリの検出および／または同定のための本発明の方法が、
（ｉ）所望により、前記試料に存在するポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または少なくとも１つの標的配列、またはその断片を、少なくとも１つの適切なプライマーペアで増幅するステップと、
（ｉｉｉ）配列番号１〜１７からなる群から選択される少なくとも１つの標的配列、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、いずれかの相同体、およびその少なくとも１０個かつ好ましくは少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片にハイブリダイズする少なくとも２つのＨｙｂプローブの少なくとも１つのセットと前記ポリ核酸を接触させるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られた異なったハイブリダイゼーションシグナルからの試料におけるプロテウス種の存在を推定し、またはプロテウス種を同定するステップと
を含んでなる。
【０１３５】
例えば、増幅ステップで使用されるプライマーペアが、配列番号５３もしくは６１によって表されるポリヌクレオチド、またはその相同体のいずれか由来の順方向プライマー、および配列番号４４、５８、もしくは５９によって表されるポリヌクレオチド、またはその相同体のいずれか由来の逆方向プライマーの組合せである。
【０１３６】
例えば、ハイブリダイゼーションステップにおいて使用される２つのＨｙｂプローブのセットは、配列番号２２によって表されるＨｙｂプローブと配列番号３７、３８、および３９によって表されるＨｙｂプローブ、またはその相同体のいずれかとの組合せでありうる。
【０１３７】
配列番号２２によって表されるＨｙｂプローブは、フルオレセイン標識であり、その他はＬＣＲ６１０、ＬＣＲ６４０、ＬＣＲ６７０、またはＬＣＲ７０５標識のいずれかでありうる。
【０１３８】
Ｈｙｂプローブ系の利点の１つは、これにより、以下の分子コンセプトに基づき、変異、多型、および他の変形核酸種を含む、配列バリエーションの検出が可能であることにあり、すなわち、Ｈｙｂプローブの１つは厳重に結合する「アンカープローブ」であるが、隣接した「センサプローブ」は、配列バリエーションの領域を補う。最終ＰＣＲ産物の融解中、配列の変化はセンサプローブの融解温度（Ｔｍ）の変化として検出される。
【０１３９】
例えば、試料が配列番号１のみを含有する場合は、前記配列番号１に特異的にハイブリダイズするＨｙｂプローブを使用することにより単一の融解ピークが生じる。試料に相同体もある場合には、同じ２つのＨｙｂプローブを使用することにより、一般に容易に観察可能な温度変化を誘発する少なくとも１個のミスマッチ塩基がある限り２つのピークが生じることになる。
【０１４０】
増幅の産物の検出のために使用されるプローブのフォーマット、選択（または設計）されるポリヌクレオチド、そのＴｍ、およびハイブリダイゼーション条件によって、蛍光は増幅ステップ中に測定され、次いで増幅曲線を生成し、または増幅ステップ後に、融解曲線分析のために融解曲線を生成しうる。
【０１４１】
したがって、得られたシグナルは、増幅曲線の形または融解曲線の形で視覚化され、そこからプロテウス種の存在を推定し、かつ／または（１つもしくは複数の）どのプロテウス種が存在するかを推定することが可能である。
【０１４２】
具体的には、試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための方法は、
（ｉ）必要ならば、試料におけるポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、いずれかの相同体、およびその少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つを、その１つが標識されているプライマーのペアで増幅させるステップと、
（ｉｉｉ）ポリ核酸を、その間に２５個未満のヌクレオチドを有する前記標識プライマーに隣接し、前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのＨｙｂプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）プロテウス種の存在を推定し、かつ／またはステップ（ｉｖ）において得られたシグナルからの試料におけるプロテウス種を同定するステップと
をも含んでなる。
【０１４３】
Ｈｙｂプローブ系を使用する本発明の方法を１つもしくはいくつかのプロテウス種の検出および同定のために適合させ、それ／それらの他のプロテウス種との区別を可能にしうる。
【０１４４】
具体的には、Ｈｙｂプローブ系を使用する本発明の方法をプロテウス・ミラビリスの検出および同定のために適合させ、その他のプロテウス種との区別を可能にしうる。
【０１４５】
次いで、増幅ステップにおいて、適切なプライマーは、配列番号１〜１０、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列を特異的に増幅するプライマーペアである。
【０１４６】
ハイブリダイズステップにおいて、Ｈｙｂプローブは、例えば、配列番号２１〜２４、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５１、５４、５５、および６５〜６７のいずれか、またはＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、またはその相補的形態に特異的ハイブリダイズするべきである。
【０１４７】
したがって、プロテウス・ミラビリス菌株は、融解曲線分析によって検査された他のすべての生物と明白に区別されうる。
【０１４８】
非プロテウス種またはヒトゲノムＤＮＡと関連性のシグナルは得られなかった。
【０１４９】
２つのＨｙｂプローブの好ましいセットは、配列番号２４または相同体および配列番号３９または相同体からなる。
【０１５０】
配列番号２４および３９からなるＨｙｂプローブのこのセットは、高感度のプロテウス・ミラビリスでありうる。
【０１５１】
Ｈｙｂプローブ系を使用する本発明の方法をプロテウス・ブルガリスまたはプロテウス・ペンネリの検出および同定のために適合させ、その他のプロテウス種と前者および後者との区別を可能にしうる。
【０１５２】
次いで、プロテウス・ブルガリスの検出および／または同定のために、増幅ステップにおいて、適切なプライマーは、配列番号１１〜１３、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される標的配列を特異的に増幅するプライマーペアである。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションにおいて、Ｈｙｂプローブは、例えば、配列番号１８〜２０、５６および５７、またはＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、またはその相補的形態のいずれかに特異的にハイブリダイズするべきである。
【０１５４】
配列番号１８〜配列番号６７に対応する表４にリストアップされた各ポリヌクレオチド、およびその相同体のいずれかを、プライマーおよび／またはプローブとして、単独または組合せて、本発明の方法において使用することができる。
【０１５５】
やはりハイブリダイゼーション法に基づく第２の実施形態が、ラインプローブアッセイ（Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ）法である。このラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）は、いくつかのポリヌクレオチドプローブ（陰性または陽性対照ポリヌクレオチドを含む）が平行ラインとして便利に適用されうる膜ストリップを使用する逆ハイブリダイゼーションフォーマットである（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３４頁）。スタイヤー（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら（（１９９３年）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：１０９３−１１０２頁）によって、かつ欧州特許第６３７３４２号明細書に記載されたＬｉＰＡ法は、迅速かつユーザに優しいハイブリダイゼーション試験を提供する。結果は増幅の開始後４時間以内に読取ることができる。通常、その間に非同位標識が増幅産物に組込まれる増幅、およびアルカリ変性後、増幅産物はプローブと膜上で接触され、ハイブリダイゼーション約１〜１．５時間実行される。その結果として、形成されたハイブリッドは酵素法によって検出され、可視の紫茶色の沈殿物が生じる。ＬｉＰＡフォーマットは市販のスキャニングデバイスと完全に互換性であり、したがって結果の自動解釈を可能にする。その利点のすべてにより、ＬｉＰＡフォーマットはルーチン設定での使用に責任をもつ。
【０１５６】
ＬｉＰＡフォーマットは、種レベルだけではなくより高いまたは低い分類群レベルで病原菌の検出および／または同定の有利な手段である。例えば、ＬｉＰＡストリップ上でのプローブ構成は、それらによりプロテウスの完全な属が検出され、または属内の種（例えば、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、および／またはＰ．ペンネリ等）が同定され、または場合により種内の亜型も検出されうるように選択されうる。
【０１５７】
多数のプローブによるハイブリダイゼーション結果を同時に生成する能力は、ＬｉＰＡ技術の他の利点である。多くの場合、プローブの特定の組合せによって得られる情報の量は、単一のプローブアッセイを使用して得られるデータを数で大幅に凌駕する。したがって、膜ストリップ上のプローブの選択は、最適化されたプローブのセットにより可能な限り最大の情報が生じるため最重要である。
【０１５８】
これらのプローブは、異なる位置で膜ストリップに適用されうるとともに、その結果は、これらのプローブの少なくとも１つが陽性である場合は陽性として解釈される。あるいは、これらのプローブは同じ位置で混合物として適用され、それによってストリップ上のラインの数を削減することができる。この削減は、ストリップをより簡潔にし、またはストリップ上のプローブの総数を広げうるために便利でありうる。
【０１５９】
他の方法が、ＬｉＡストリップの製造手順を相当に単純化しうる縮重プローブの使用である。
【０１６０】
さらに他の方法が、本発明の２つのオリゴヌクレオチドを含んでなるキメラプローブである。例えば、配列番号３７および５５の配列は両方とも２つのタイプのＩＴＳ形態Ｐ．ミラビリスを検出するために必要とされる。この代替法において、第１の配列番号のヌクレオチド配列の後、第２のヌクレオチド配列を有するプローブを合成することができる。このプローブは配列番号３７および５５の２つのプローブ配列の複合特性を有することになる。
【０１６１】
これら２つの方法も本発明のいずれかの実施形態または方法において使用されうる。
【０１６２】
上記の特性により、ＬｉＰＡ系は、いくつかの生物が試料で同時に検出される必要があるハイブリダイゼーション法の有効なフォーマットとしてみなされうる。
【０１６３】
しかし、異なるプローブが同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に使用される他のハイブリダイゼーションアッセイが上記の検出および／または選択法のために使用されうることを明らかにすべきである。例えば、標的核酸を固体支持体に固定化し、すべてが異なって標識された異なるプローブの混合物を使用することが可能であり、結果として標的にハイブリダイズされたプローブの各々の異なる検出シグナルが生じうる。また今日、多くの異なる支持体が利用可能である。
【０１６４】
一例として、ＬｉＰＡフォーマットを使用する試料における１つもしくはそれ以上のプロテウス種の検出のために従うべき手順の概略を以下に示す。
− 第１に、かつ必要ならば、試料に存在する核酸を増幅および／またはハイブリダイゼーションのために利用可能にする。
− 所望により、核酸を１つもしくは別の標的増幅系で増幅する。通常、増幅はその後のハイブリダイゼーションシグナルを強化するために必要とされる。
− 第三に、場合により変性ステップ後、試料に存在する核酸または結果として生じる増幅産物を、目的とする生物の検出を可能にする、１つもしくはそれ以上のプローブが固定化されるＬｉＰＡストリップと接触させ、ハイブリダイゼーションを続行させる。
− 最後に、最終的に洗浄ステップを行った後、便利かつ互換性の検出系を使用してハイブリッドを検出する。得られたハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、特定の生体試料においてスクリーニングされる１つもしくはそれ以上の生物の存在または非存在が推定されうることが観察される。
【０１６５】
ｒＲＮＡスペーサーの保存フランキング領域において、すなわち１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子において位置した普遍的プライマーを使用することができる。
【０１６６】
一部の用途のために、試料に存在する異ならない細菌であるが、より特異的にプロテウス種を増幅することが適切でありうる。
【０１６７】
試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための本発明の方法が、
（ｉ）必要ならば、試料に存在するポリ核酸を放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）必要ならば、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、またはその一部を、少なくとも１つの適切なプライマーペアで増幅するステップと、
（ｉｉｉ）ポリ核酸を、配列番号１〜１７、またはＴがＵによって置換される前記配列番号１または１７のＲＮＡ形態、またはその相補的形態、またはいずれかの相同体、またはその少なくとも１０個および好ましくは少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドからなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも１個のプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られた異なったハイブリダイゼーションシグナルからの試料に存在する微生物を検出し、かつ／または同定するステップと
を含んでなる。
【０１６８】
増幅のステップにおいて言及されたＩＴＳの一部は、標的配列、または標的配列そのもの、配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、またはその相補的形態、またはいずれかの相同体、またはその少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片からなる標的配列を含んでなる。
【０１６９】
優先的に、本発明は、少なくとも２つの微生物が同時に検出される上記の方法を提供する。
【０１７０】
ステップ（ｉｉｉ）に記載されたプローブのセットは、本発明の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、もしくはそれ以上のプローブを含んでなる。
【０１７１】
本発明の好ましい方法において、ステップ（ｉｉｉ）に記載されたプローブのセットは、少なくとも２つのプローブを含んでなる。
【０１７２】
好ましいプローブは、配列番号１８〜６７のポリヌクレオチド、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、いずれかの相同体、および、核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣが排除されるという条件で、その約１０個の隣接ヌクレオチドの断片、より好ましくはその約２０個の隣接ヌクレオチドの断片である。
【０１７３】
本発明は、ステップ（ｉｉｉ）で規定されたプローブが、優先的に１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域からの少なくとも１つの他のプローブと組合されており、同じ試料に存在しやすい異なる病原菌の同時の検出を可能にする上記の方法も提供する。
【０１７４】
好ましいプローブは、同じハイブリダイゼーション条件下に最適な実行を達成するために設計されており、それらは同時のハイブリダイゼーションのセットにおいて使用することができ、これはこれらのプローブの有用性をきわめて増大させ、結果として時間および労力における大幅な利得をもたらす。
【０１７５】
本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含んでなるキットも本発明の目的である。
【０１７６】
本発明のキットは以下の成分を含んでなる。すなわち
− 配列番号１〜１７のいずれかからなる標的配列、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、またはその相同体にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド、
− ハイブリダイゼーションバッファー、または前記バッファーを製造するために必要な成分。
【０１７７】
好ましいキットが、
− 互いに隣接し、２５個未満のヌクレオチド、好ましくは５個未満のヌクレオチドを有する、配列番号１〜１７のいずれかからなる標的配列、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、またはその相同体にハイブリダイズするＨｙｂプローブの少なくとも１つのセット、
− ハイブリダイゼーションバッファー、または前記バッファーを製造するために必要な成分を含んでなる。
【０１７８】
結論として、標的としてプロテウスＩＴＳを使用することにより、異なる検出および／または同定法において使用されるプローブを設計することが可能である。
【０１７９】
リアルタイムＰＣＲ法により、一方では、ライトサイクラー系における単一の融解ピークを生成する単一のＨｙｂプローブセットを使用し、プロテウス属―具体的にはＰ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリス、およびＰ．ペンネリ―を検出し、同定することが可能である（実施例４）。
【０１８０】
他方では、種特異的シグナルを特定の種（実施例３におけるＰ．ミラビリス）の特異的融解ピークの存在によって、または特定の種（実施例５および６におけるＰ．ブルカリス、およびＰ．ペンネリを参照）に特異的であるＴｍでのピークの存在によって得ることができる。
【０１８１】
完全なＩＴＳ領域をシークエンシングし、かつそれをここに記載された基準配列と比較することも、プロテウス種を検出し、同定する方法として使用できる（実施例７）。
【０１８２】
前述の説明および以下の実施例は、本明細書に具体的に開示された実施形態に本発明を限定するものとして解されるべきではない。
【実施例】
【０１８３】
下記の実施例のために、１６Ｓ−２３Ｓ内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を、それぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの保存領域において設計されたプライマーを使用して増幅させた。
【０１８４】
実施例１：ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）プロトコール
ＤＮＡを標準方法に従って調製し、約１０４個のゲノム等価物を増幅の標的として使用した。
【０１８５】
その試料の定量曲線および融解ピークが存在した場合は、試料を陽性標識した。
【０１８６】
プローブをライトサイクラーｖ１．２（ソフトウェアｖ４）におけるＨｙｂプローブとして作用するように設計し、リアルタイム蛍光ＰＣＲ検出を可能にした。
【０１８７】
１つのＨｙｂプローブはその３’末端においてフルオレセイン色素で標識されたが、隣接するＨｙｂプローブはその５’末端においてＬＣ−レッド６４０またはＬＣ−レッド７０５色素で標識された。
【０１８８】
キットＬＣ−ファストスタート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）ＤＮＡマスター・ハイブリダイゼーション・プローブ（Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ）（カタログ番号３００３２４８または２２３９２７２）のメーカーの使用説明書に従う。
− 純度、濃度、および阻害剤の非存在に関してＰＣＲに適した試料材料が使用可能であり、
− プライマーは、各々０．３〜１μＭの最終濃度とする、
− 各々、または二重で０．２μＭの最終濃度でのＨｙｂプローブ、
− ＭｇＣｌ２の濃度を最適化し、１〜５ｍＭで変動してよく、
− 陰性対照を実行すること。
【０１８９】
増幅および融解条件は以下に記載されている。ＬＣソフトウェアのバージョン４を使用した。定量化設定はＦ２／バックＦ１（サンプル）であった。ベースライン調節のために算術モードを使用した。横断点（Ｃｔ）計算は最大二次微分に基づいた。融解ピークの計算方法は多項式であった。ピーク面積を使用してＴｍを計算した。
【０１９０】
【表３】
【０１９１】
実施例２：Ｈｙｂプローブの異なるセット
本実施例においては、１つのＨｙｂプローブをその３’末端においてフルオレセイン色素で標識し、隣接するＨｙｂプローブをその５’末端においてＬＣ−レッド６４０またはＬＣ−レッド７０５色素で標識した。
【０１９２】
実施例１に記載されたのと同じライトサイクラープロトコールを適用した。
【０１９３】
【表４】
【０１９４】
実施例３：Ｐ．ミラビリス特異的Ｈｙｂプローブ
配列番号２４および配列番号３９によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。第１（配列番号２４）はフルオレセイン標識され、第２（配列番号３９）はＬＣ−レッド６４０標識された。
【０１９５】
実施例１に記載されたのと同じライトサイクラープロトコールを適用し、使用された試料はＰ．ミラビリス菌株の１つを含んだ。５３℃での１つの特異的融解ピークが観察された。
【０１９６】
本Ｈｙｂプローブセットの感度は４２個のＰ．ミラビリス菌株（西欧由来１０個、英国由来１０個、南欧由来１０個、米国由来１０個、および日本由来２個）を使用して評価された。すべてのＰ．ミラビリス菌株は可視定量曲線を有し、Ｃｔ値は１９．９５〜２２．８１のばらつきがあった。
【０１９７】
５３℃（ＳＴＤＥＶＡ ０．６０℃）の融解ピークが試験したすべてのＰ．ミラビリス菌株で観察され、本ＨｙｂプローブセットによるＰ．ミラビリスに対する１００％の感度を示した。
【０１９８】
特異性を試験するために、３個のＰ．ブルガリス菌株および３個のＰ．ペンネリ菌株を試験した。定量曲線および融解曲線は得られず、臨床的に重要なその他のプロテウス種に関して有する１００％の特異性を示した。
【０１９９】
これらのプロテウス種に加えて、大きな一団の他の生物を試験し（表３を参照）、かつ別の実験をヒトＤＮＡで行った。試験したヒトＤＮＡによっても微生物によっても定量曲線または融解曲線は得られず、１００％のＨｙｂプローブ特異性が確認された。
【０２００】
【表５】
【０２０１】
本Ｈｙｂプローブセットは、特異的なやり方でＰ．ミラビリスを検出し、同定することができる。
【０２０２】
実施例４：プロテウス種のＨｙｂプローブ
それぞれＰ．ミラビリスの２個の菌株（１つの試料に各菌株）、Ｐ．ペンネリの１個、およびＰ．ブルガリスの１個を含んでなる４つの試料を試験した。
【０２０３】
配列番号３０および配列番号４４によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。
【０２０４】
各菌株は、定量曲線を生成し、５５℃での１つの融解ピークが観察された。
【０２０５】
したがって、本Ｈｙｂプロテウスセットは、異なるプロテウス種、具体的には、臨床的に重要であるプロテウス種を検出し、かつ同定することができる。
【０２０６】
実施例５：Ｐ．ペンネリを他のプロテウス種と区別するためのＨｙｂプローブ。
それぞれＰ．ミラビリスの２個の菌株（１つの試料に各菌株）、Ｐ．ペンネリの１個、およびＰ．ブルガリスの１個を含んでなる４つの試料をＨｙｂプローブの他のセットで試験した。
【０２０７】
配列番号２７および配列番号４２によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。
【０２０８】
各菌株は定量曲線を生成した。融解曲線分析後、Ｐ．ペンネリは５２．５℃で融解ピークを示した。その他の３つは５６℃で融解ピークを示した。
【０２０９】
したがって、本Ｈｙｂプローブセットは、Ｐ．ペンネリをその他のプロテウス種と区別し、同定することを可能にする。
【０２１０】
実施例６：Ｐ．ブルガリスを他のプロテウス種と区別するためのＨｙｂプローブ。
【０２１１】
それぞれＰ．ミラビリスの２個の菌株（１つの試料に各菌株）、Ｐ．ペンネリの１個、およびＰ．ブルガリスの１個を含んでなる４つの試料をＨｙｂプローブの他のセットで試験した。
【０２１２】
配列番号３２および配列番号４５によって表されるＨｙｂプローブを実施例１において記載されたライトサイクラープロトコールで使用した。
【０２１３】
各菌株は定量曲線を生成した。融解曲線分析後、Ｐ．ブルガリスは５４．５℃で融解ピークを示した。その他の２つは５２．５℃で融解ピークを示した。
【０２１４】
したがって、本Ｈｙｂプローブは、Ｐ．ブルガリスをその他のプロテウス種と区別し、同定することを可能にする。
【０２１５】
各々の種のＩＴＳ配列を考慮することにより、５４．５℃での唯一の融解ピークが予想された。
【０２１６】
得られた結果は、試験されたＰ．ブルガリスの菌株が、そのＩＴＳ配列において、Ｔｍで観察されるシフトに関与する多型を含むことを意味する。
【０２１７】
実施例７：ＩＴＳヌクレオチド配列決定によるプロテウス属の検出および同定。
含むことが推定されたプロテウス種の明らかな表示なしに試料を受取った。
【０２１８】
決定すべき種のＩＴＳ領域を１６Ｓおよび２３Ｓに位置した普遍的プライマーを使用して増幅した。
【０２１９】
単位複製配列をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へクローン化し、ＩＴＳヌクレオチド配列をプラスミドベクターにおいて位置したプライマーを使用するジデオキシ鎖末端化学に従って誘導した。
【０２２０】
ｔＲＮＡｇｌｕとｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａを含んでなる両方のスペーサーが確認された。
【０２２１】
これらのＩＴＳ配列を配列分析にかけ、すでに配列決定されたその他のスペーサーと比較した。
【０２２２】
同定すべき試料からのｔＲＮＡｇｌｕスペーサーのヌクレオチド配列は、配列番号４によって表されるＰ．ミラビリスのｔＲＮＡｇｌｕコンセンサススペーサーヌクレオチド配列と完全に一致した。
【０２２３】
この試料からのｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａスペーサーのヌクレオチド配列は、配列番号６によって表されるＰ．ミラビリスのｔＲＮＡｉｌｅ−ａｌａスペーサーのコンセンサスヌクレオチド配列と比較すると７０２のうち３つの塩基ペアが異なっていた（９９．４％相同性）。
【０２２４】
高度の相同性を考慮して、試料がＰ．ミラビリスを含んだことが推定されうる。
【０２２５】
実施例８：臨床的に重要な３つのプロテウス種を区別するためのＨｙｂプローブ。
配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２によって表される３つのＨｙｂプローブのセットを、それぞれ、Ｐ．ミラビリス、Ｐ．ペンネリ、およびＰ．ブルガリスを含んでなる試料について、実施例１に記載されたライトサイクラープロトコール用に設計した。
【０２２６】
フルオレセイン標識された第１のＨｙｂプローブ（配列番号５０）、およびＬＣ−レッド標識されたその他の２つ（配列番号５１および配列番号５２）は、融解曲線の手段、６３℃での融解ピーク、および６７℃での他の２つの融解ピークを有するＰ．ミラビリスを表す融解曲線によって、Ｐ．ブルガリスおよびＰ．ペンネリとＰ．ミラビリスとの区別を可能にする。
【０２２７】
【表６】
【０２２８】
【表７】
【０２２９】
【表８】
【０２３０】
【表９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される単離核酸分子。
【請求項２】
プロテウス種の検出および／または同定のための、請求項１に記載された核酸分子、またはその少なくとも１０個の隣接ヌクレオチドの断片に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子であって、核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣを除くもの。
【請求項３】
プロテウス種の検出および／または同定のための、請求項１に記載された核酸分子、またはその少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１８〜６７よりなる群から選択される核酸を含んでなる請求項２または３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
２個のポリヌクレオチドプローブのセットであって、前記プローブが、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸、または核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣに特異的にハイブリダイズし、ここで前記プローブ間に２５個以下のヌクレオチドが存在する前記セット。
【請求項６】
３個のポリヌクレオチドプローブのセットであって、前記プローブが、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸、または核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣに特異的にハイブリダイズし、ここで前記プローブの２個間に２５個以下のヌクレオチドが存在するセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子、および／または請求項５または請求項６に記載の少なくとも２個のポリヌクレオチドプローブの少なくとも１つのセットを含んでなる組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子のプローブとしての使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子のプライマーとしての使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子のプロテウス種、具体的にはＰ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリスおよび／またはＰ．ペンネリの検出および／または同定のための使用。
【請求項１１】
増幅方法および／またはハイブリダイゼーション方法における請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１個の核酸分子を使用するプロテウス種を検出または同定するための方法。
【請求項１３】
試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための請求項１２に記載の方法であって、
（ｉ）前記試料におけるポリ核酸を任意に放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または請求項１に記載のいずれかの核酸分子を含んでなる標的配列の少なくとも１つを、プライマーペアに適した少なくとも１つで任意に増幅するステップと、
（ｉｉｉ）前記ポリ核酸を前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１個のポリヌクレオチドプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）得られたシグナルを解釈し、プロテウス種の存在を推定し、かつ／または前記試料におけるプロテウス種を同定するステップと
を含んでなる方法。
【請求項１４】
２個のポリヌクレオチドプローブが使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２個のポリヌクレオチドプローブが、その間に２５個未満のヌクレオチドを有する互いに隣接した標的配列にハイブリダイズする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記２個のポリヌクレオチドプローブが、表２のポリヌクレオチドのいずれかの組合せからなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の成分、すなわち
−請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子、および／または請求項５または６に記載の少なくとも２個のポリヌクレオチドプローブのセットと、
−ハイブリダイゼーションバッファー、または前記バッファーを製造するために必要な成分と
を含んでなるプロテウス種の検出および／または同定のためのキット。
【請求項１】
配列番号１〜１７、ＴがＵによって置換されるそのＲＮＡ形態、その相補的形態、および相同体からなる群から選択される単離核酸分子。
【請求項２】
プロテウス種の検出および／または同定のための、請求項１に記載された核酸分子、またはその少なくとも１０個の隣接ヌクレオチドの断片に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子であって、核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣを除くもの。
【請求項３】
プロテウス種の検出および／または同定のための、請求項１に記載された核酸分子、またはその少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの断片に特異的にハイブリダイズする単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１８〜６７よりなる群から選択される核酸を含んでなる請求項２または３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
２個のポリヌクレオチドプローブのセットであって、前記プローブが、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸、または核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣに特異的にハイブリダイズし、ここで前記プローブ間に２５個以下のヌクレオチドが存在する前記セット。
【請求項６】
３個のポリヌクレオチドプローブのセットであって、前記プローブが、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸、または核酸分子ＡＴＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣに特異的にハイブリダイズし、ここで前記プローブの２個間に２５個以下のヌクレオチドが存在するセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子、および／または請求項５または請求項６に記載の少なくとも２個のポリヌクレオチドプローブの少なくとも１つのセットを含んでなる組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子のプローブとしての使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子のプライマーとしての使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子のプロテウス種、具体的にはＰ．ミラビリス、Ｐ．ブルガリスおよび／またはＰ．ペンネリの検出および／または同定のための使用。
【請求項１１】
増幅方法および／またはハイブリダイゼーション方法における請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１個の核酸分子を使用するプロテウス種を検出または同定するための方法。
【請求項１３】
試料におけるプロテウス種の検出および／または同定のための請求項１２に記載の方法であって、
（ｉ）前記試料におけるポリ核酸を任意に放出、単離、および／または濃縮するステップと、
（ｉｉ）１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または請求項１に記載のいずれかの核酸分子を含んでなる標的配列の少なくとも１つを、プライマーペアに適した少なくとも１つで任意に増幅するステップと、
（ｉｉｉ）前記ポリ核酸を前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１個のポリヌクレオチドプローブと接触させるステップと、
（ｉｖ）形成されたハイブリッドを検出するステップと、
（ｖ）得られたシグナルを解釈し、プロテウス種の存在を推定し、かつ／または前記試料におけるプロテウス種を同定するステップと
を含んでなる方法。
【請求項１４】
２個のポリヌクレオチドプローブが使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２個のポリヌクレオチドプローブが、その間に２５個未満のヌクレオチドを有する互いに隣接した標的配列にハイブリダイズする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記２個のポリヌクレオチドプローブが、表２のポリヌクレオチドのいずれかの組合せからなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の成分、すなわち
−請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子、および／または請求項５または６に記載の少なくとも２個のポリヌクレオチドプローブのセットと、
−ハイブリダイゼーションバッファー、または前記バッファーを製造するために必要な成分と
を含んでなるプロテウス種の検出および／または同定のためのキット。
【公表番号】特表２００７−５２０２２６（Ｐ２００７−５２０２２６Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１８５２（Ｐ２００６−５５１８５２）
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６７３
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（３９９０４４１６０）イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ Ｎ．Ｖ．
【出願人】（５０６２７０１１２）ロシュ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＣＨＥ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６７３
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（３９９０４４１６０）イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ Ｎ．Ｖ．
【出願人】（５０６２７０１１２）ロシュ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＣＨＥ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
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