セマフォリン阻害剤としての新規化合物
【課題】神経傷害疾患や神経変性疾患の治療剤の提供。
【解決手段】
（Ｒ１、Ｒ５およびＲ７は、カルボキシル基等、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８は、水酸基等。）
【解決手段】
（Ｒ１、Ｒ５およびＲ７は、カルボキシル基等、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８は、水酸基等。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セマフォリン阻害活性を有する新規な化合物、該化合物の微生物学的製造方法、および該化合物を有効成分として含有する神経再生促進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は成体において分裂能を持っていない特殊な組織である。そのため一旦障害を受けると長期にわたって障害が続く。特に脳や脊髄といった中枢神経系では全く再生能がない。脊髄損傷に代表される外因性の傷害やアルツハイマー病、パーキンソン病といった神経変性疾患に対する治療方法がないことも、中枢神経における再生能が無いことが一つの原因になっているということができる。他方、末梢神経は再生能を有しており、一旦切断された後も軸索が再生し機能が回復する。しかしこの場合にも再生に要する期間は数ヶ月から1年以上と非常に長時間を要し、患者にとっての苦痛は大きい。更にこのように再生に長期間を要するために、その間に神経細胞が死滅し機能回復に至らない場合も多い。このように再生能を有する末梢神経の場合も、脳や脊髄といった中枢神経系の環境では全く伸長することはできない。そのため、中枢神経系には神経の伸長を阻止する物質が存在しているとされている。この中枢神経系に存在する神経再生阻害物質を抗体などで抑制すると一部ではあるが、中枢での神経再生が起こり、機能の回復も見られる。最近、この中枢神経再生阻害因子としてNogoが発見された（非特許文献１、２）。しかし、Nogoを阻害することによって、再生する神経線維は一部であり、他の再生阻害物質が存在するのではないかと考えられているが、インビボで神経の再生阻害に働いている因子は、これまで明らかにされていない。
【０００３】
ところで、セマフォリンは、もともと発生期におけるバッタの神経系形成に関係する因子としてその遺伝子が単離されたものであるが、その後、線虫、魚、哺乳類さらにはある種のウイルスなどにも分布する大きな遺伝子ファミリーを形成していることが報告され、現在ではセマフォリン遺伝子は構造上８つの遺伝子サブファミリー、クラス、に分類されている（非特許文献３）。セマフォリンは神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質であり、これまでに約２０種の分子種が知られている（非特許文献３）が、多くのセマフォリンファミリーの大部分の機能について詳しいことはわかっていない。最も良く研究されているのがクラス３型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群であり、これらの翻訳産物はすべて分泌型蛋白質である。これらの遺伝子がコードする蛋白質はインビトロで強い神経突起伸長抑制活性、成長円錐退縮活性を有していることが知られているが、ある条件下では神経突起伸長に誘引的に作用するとの報告もある。中でも最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）（非特許文献４、５）であり、この蛋白は１０ｐＭという低濃度で短時間のうちに培養神経細胞の成長円錐退縮を誘発する。セマフォリンのインビボでの機能を解析する研究として、Ｓｅｍａ３Ａの受容体の一つのコンポーネントであるニューロピリン−１のノックアウトマウスの研究がなされている（非特許文献６）。当該ノックアウトマウスは胎生致死であるが、三叉神経など一部の神経系の走行異常、血管形成異常が起こることが知られている。一方、Ｓｅｍａ３Ａのノックアウトマウスでも同様の神経系の走行異常は認められるが、大きな異常も無く成体にまで発育する個体もあるとされており、生体内でのＳｅｍａ３Ａの機能については未だ不明な点も多い。
【０００４】
その他セマフォリンに関しては、セマフォリンＷ、セマフォリンＹ、セマフォリンＺに対する抗体等のアンタゴニストやアンチセンスヌクレオチドを中枢神経の再生促進剤とすること（特許文献１，２，３）や、神経細胞とヒトコラプシンに特異的に結合する抗体とを接触させることにより、神経突起成長を誘導する方法（特許文献４）が知られている。しかし、セマフォリンを特異的に阻害する低分子化合物は、これまで全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO98/15628号公報
【特許文献２】WO98/11216号公報
【特許文献３】WO98/20928号公報
【特許文献４】米国特許第５４１６１９７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature 403, 434, 2000
【非特許文献２】Nature 403, 439, 2000
【非特許文献３】Cell 97, 551, 1999
【非特許文献４】Cell 75, 217, 1993
【非特許文献５】Cell 75, 1389, 1993
【非特許文献６】Neuron 19, 995, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、セマフォリン阻害活性を有する新規な化合物、該化合物の微生物学的製造方法、および該化合物を有効成分として含有する神経再生促進剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
セマフォリンは多くの作用を有していると考えられ、一部ではセマフォリンが神経の発生のみでなく再生にも関与しているとの考えもあったが、実際のところは全くわかっていなかった。本発明者らは、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物中に見い出される化合物、ＳＰＦ−３０５９−１等がセマフォリン阻害活性を有することを見い出すとともに、該化合物が、インビボにおいて、神経再生を促進することを明らかにした。更に、ＳＰＦ−３０５９株の培養物を単離精製し、インビトロでセマフォリンの活性を阻害する物質をスクリーニングすることによって、セマフォリン阻害活性を有する新規な化合物を見い出した。本発明は、上記の知見に基づいて、完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ 一般式（１）で表される化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００１０】
【化１】
［式中、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は以下の［I］〜［IX］のいずれかを表す。
【００１１】
［I］Ｒ３およびＲ４は結合して、式（２）：
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒ５は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ６は水素原子または水酸基を表す。）
で表される2価基を表す。
【００１３】
［II］Ｒ３およびＲ４は結合して、式（３）：
【００１４】
【化３】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００１５】
［III］Ｒ３およびＲ４は結合して、式（４）：
【００１６】
【化４】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００１７】
[IV] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（５）：
【００１８】
【化５】
［式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。］
で表される2価基を表す。
【００１９】
[V] Ｒ３は水素原子を表し、Ｒ４は式（６）：
【００２０】
【化６】
で表される基を表す。
【００２１】
[VI] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（７）：
【００２２】
【化７】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００２３】
[VII] Ｒ３は式（８）：
【００２４】
【化８】
（式中、Ｒ７は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ８は水素原子または水酸基を表す。）
で表される基を表し、Ｒ４は式（９）：
【００２５】
【化９】
（式中、Ｒ５及びＲ６は前記と同義である。）
で表される基を表す。
【００２６】
[VIII] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（１０）：
【００２７】
【化１０】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００２８】
［IX] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（１１）：
【００２９】
【化１１】
で表される2価基を表す。］
【００３０】
［２］ 一般式（１２）：
【００３１】
【化１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、上記［１］と同義である。）
で表される、上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３２】
［３］ 一般式（１２）において、Ｒ１およびＲ５が、カルボキシル基であり、Ｒ２が水酸基又は水素原子であり、Ｒ６が水酸基である、上記［２］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３３】
［４］ 一般式（１３）：
【００３４】
【化１３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。）
で表される、上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３５】
［５］ 一般式（１３）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基であり、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［４］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３６】
［６］ 一般式（１４）：
【００３７】
【化１４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。］
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３８】
［７］ 一般式（１４）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基であり、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［６］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３９】
［８］ 一般式（１５）：
【００４０】
【化１５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４１】
［９］ 一般式（１５）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基であり、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［８］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４２】
［１０］ 一般式（１６）：
【００４３】
【化１６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４４】
［１１］ 一般式（１６）において、Ｒ１が、カルボキシル基を表し、Ｒ２が、水酸基を表す上記［１０］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４５】
［１２］ 一般式（１７）：
【００４６】
【化１７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６は、上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４７】
［１３］ 一般式（１７）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基を表し、Ｒ２およびＲ６が水酸基を表す、上記［１１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４８】
［１４］ 一般式（１８）：
【００４９】
【化１８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５０】
［１５］ 一般式（１８）において、Ｒ１およびＲ５はカルボキシル基であり、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８が水酸基である、上記［１４］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５１】
［１６］ 一般式（１８）において、Ｒ７が水素原子である、上記［１５］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５２】
［１７］ 一般式（１９）：
【００５３】
【化１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５４】
［１８］ 一般式（１９）において、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［１７］記載の化合物、又はその薬学上許容される塩。
【００５５】
［１９］ 一般式（１９）において、Ｒ５がカルボキシル基である、上記［１８］記載の化合物、又はその薬学上許容される塩。
【００５６】
［２０］ 一般式（１９）において、Ｒ１がカルボキシル基である、上記［１９］記載の化合物、又はその薬学上許容される塩。
【００５７】
［２１］ 一般式（２０）：
【００５８】
【化２０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５９】
［２２］ 一般式（２０）において、Ｒ１がカルボキシル基であり、Ｒ２が水酸基である、上記［２１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００６０】
［２３］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：５４５；
（ｂ）分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１２；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：213(41700)、286(29500)、338sh(14900)、429sh(6500)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１： 3358、3073、1700、1674、1631、1464、1276、1248；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、５００ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第１図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、１２５ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第２図に示す；
【００６１】
［２４］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：５６１；
（ｂ）分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１３；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：219(34300)、257(28900)、311(28600)、404(14600)、450(14400)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：3154、1657、1605、1468、1279；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中）：スペクトルのチャートを第３図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中）：スペクトルのチャートを第４図に示す；
【００６２】
［２５］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：６６９；
（ｂ）分子式：Ｃ３４Ｈ２０Ｏ１５；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：213(54600)、235sh(39400)、312(31300)、350(24200)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：3348、1766、1707、1644、1588、1464、1301；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、５００ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第５図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、１２５ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第６図に示す；
【００６３】
［２６］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：５４９；
（ｂ）分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１２；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：227(30200)、282sh(13500)、315(13900)、356(11000)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：3396、1688、1662、1622、1470、1294；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、５００ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第７図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、１２５ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第８図に示す；
【００６４】
［２７］ 上記［１］〜［２６］のいずれか記載の化合物、またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
【００６５】
［２８］ セマフォリンが、クラス３型セマフォリンであることを特徴とする、上記［２７］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６６】
［２９］ クラス３型セマフォリンが、セマフォリン３Ａであることを特徴とする、上記［２８］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６７】
［３０］ セマフォリンが、クラス６型セマフォリンであることを特徴とする、［２７］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６８】
［３１］ クラス６型セマフォリンが、セマフォリン６Ｃであることを特徴とする、上記［３０］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６９】
［３２］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経伸長反発因子阻害剤。
【００７０】
［３３］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する薬剤。
【００７１】
［３４］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経再生促進剤。
【００７２】
［３５］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
【００７３】
［３６］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患の予防若しくは治療剤。
【００７４】
［３７］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、嗅覚異常症、外傷性神経傷害、脳梗塞性神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経変性疾患、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、又は外傷性神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
【００７５】
［３８］ ペニシリウム属に属する微生物を培養して、その培養物から化合物を採取することを特徴とする、上記［１］〜［２６］のいずれか記載の化合物、その薬学上またはその薬学上許容される塩の製造方法。
【００７６】
［３９］ ペニシリウム属に属する微生物が、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株であることを特徴とする上記［３８］記載の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＳＰＦ−３０５９−１０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図２】ＳＰＦ−３０５９−１０の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図３】ＳＰＦ−３０５９−１８の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図４】ＳＰＦ−３０５９−１８の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図５】ＳＰＦ−３０５９−３１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図６】ＳＰＦ−３０５９−３１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図７】ＳＰＦ−３０５９−４１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図８】ＳＰＦ−３０５９−４１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明において、セマフォリンとは、およそ５００アミノ酸残基からなる類似構造のセマフォリンドメインを有する蛋白質の総称であり（Neuron 14, 941-948, 1995）、現在までに約２０種以上が報告されているが、これら公知のセマフォリンに限定されるものではない。かかるセマフォリンとしては、ヒト等の哺乳類のセマフォリン、好ましくは文献（Cell 97, 551, 1999）において定義されたクラス３型，４型，５型又は６型のセマフォリン、更に好ましくはクラス３型又はクラス6型セマフォリンを例示することができ、最も好ましくはクラス３型セマフォリンにおいてはセマフォリン３Ａ（Cell 75, 217, 1993、Cell 75, 1389, 1993）を、またクラス６型セマフォリンにおいてはセマフォリン６Ｃ（国際公開第98/11216号パンフレット、Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）を例示することができる。これらセマフォリンをコードする遺伝子の配列情報は、GenBankデータベースや前記文献等において公開されている。また、本発明におけるセマフォリンには、天然型・組換え型のタンパク質に限ることなく、膜結合型セマフォリンの細胞外ドメインのみを発現可溶化させたもの、抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質との融合タンパク質、あるいはヒスタグやフラグなどのタグを付けたもの、さらには一部のアミノ酸を欠失、置換、付加させた変異体なども含まれる。
【００７９】
例えば、セマフォリン６Ｃ（Ｓｅｍａ６Ｃ）は膜結合型タンパク質であり、Ｓｅｍａ６Ｃの有する活性の促進・抑制作用を利用して阻害剤の活性を測定する場合等においては、通常Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインが使用される。Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインには２つのアイソフォームが知られているが（国際公開第98/11216号パンフレット及びMoll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）、そのいずれも成長円錐退縮活性を有している。かかるＳｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質も、Ｓｅｍａ６Ｃ活性を損なわない限り、被験物質の活性を測定する場合等において有利に用いることができ、マーカータンパク質としては、例えばアルカリホスファターゼ（Cell 63,185-194 (1990)）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、ＨＲＰなどの従来よく知られたマーカータンパク質を、またペプチドタグとしては、例えばミックタグ、ヒスタグ、フラグタグなどの従来よく知られたペプチドタグを挙げることができる。
【００８０】
また本発明においてセマフォリン阻害剤とは、上記セマフォリンのいずれかが有する活性、例えば、細胞の遊走活性、細胞死誘導活性、細胞の球状化や成長円錐の退縮といった細胞の形態変化、神経突起伸長抑制あるいは促進活性、神経細胞の樹状突起の伸長促進あるいは抑制活性、神経軸索ガイダンス活性などを阻害する物質をいい、かかるセマフォリン阻害剤としては、前記セマフォリン活性を阻害する物質であれば特に制限されるものではないが、好ましくは中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用を有する化合物、より好ましくはセマフォリンの有する成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物、さらに好ましくはセマフォリンの有する成長円錐退縮活性とコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の両方に対して抑制作用を有する化合物を挙げることができる。
【００８１】
中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用とは、脳及び脊髄などからなる中枢（組織）、及び／又は該中枢（組織）以外の周辺・末梢部である体表や体内の諸器官である末梢（組織）における神経の再生を促進する作用を言う。ここで中枢における神経再生促進作用には、網膜神経や大脳皮質神経のような、中枢領域にある神経細胞体から軸索を出し同じく中枢にある他の神経細胞に投射する神経の再生促進作用のみならず、嗅神経、後根神経節感覚神経の中枢性線維等の、末梢に存在する神経細胞体から出る神経であっても、神経軸索が再生される環境が中枢（組織）であるときの神経再生促進作用も含まれる。また、末梢における神経再生促進作用としては、末梢にある神経細胞体から出て末梢組織の中を伸びる神経の再生促進作用のみならず、中枢（脳及び脊髄など）にある神経細胞体から出る神経であっても、再生される環境が末梢（組織）であるときの神経再生促進作用も含まれる。後者としては具体的に、脊髄運動神経、交感神経・副交感神経といった自律神経系の節前神経等の神経再生促進作用を例示することができる。また坐骨神経のように、前記の両方の神経を含む神経の再生促進作用も含まれる。そして、本発明のセマフォリン阻害剤としては、中枢及び末梢における神経再生促進作用を有する化合物が特に好ましい。なお、前記において中枢（組織）とは、脳、延髄、脊髄、眼などからなる組織で詳しくは血液脳関門・血液網膜関門といった構造によって高分子量物質の輸送が制限されている領域であり、末梢組織とは身体のそれ以外の領域を指す。一般に、神経線維は末梢組織の中では再生が可能であるが、中枢組織の中では再生することができない。
【００８２】
上記セマフォリンの有する成長円錐退縮（コラプス）活性とは、神経細胞（通常は神経節の組織片）をインビトロで所定時間培養し、伸長した神経突起とその神経突起先端の成長円錐を観察しうる状態にした後、所定の濃度（例えば、約３ユニット／ｍｌ；なお、１ユニット／ｍｌは５０％の成長円錐を退縮させるセマフォリンの濃度をいう）のセマフォリンを加えさらに所定時間（例えば１時間）培養を続けた後に観察される成長円錐を消失させる活性をいう。伸長した神経突起とその神経突起先端の成長円錐を観察しうる状態とするために、神経細胞のインビトロでの培養は通常１０時間から２０時間行われるが、神経の種類、培養条件によって適宜変更することができる。そして、例えばこの実験系において、セマフォリンを添加する約１時間前にあらかじめ適当濃度の化合物を加えておいた場合に、セマフォリンによる成長円錐の退縮が抑制されたとき、かかる化合物をセマフォリン阻害剤、特にセマフォリンの成長円錐退縮活性の抑制作用を有する化合物ということができる。また、かかる成長円錐退縮活性の抑制作用を有する化合物としては特に制限されるものではないが、１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すものを例示することができる。さらに、セマフォリン阻害剤としては、神経細胞やセマフォリン発現細胞等の細胞の増殖に実質的に影響を与えることがない化合物が、本発明のセマフォリン阻害剤の効果を確認する上で、また、医薬品として用いた場合の安全性の点で好ましい。
【００８３】
また上記セマフォリンの有するコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性とは、例えばセマフォリン産生細胞と神経細胞（通常は神経節）とを共に含むコラーゲンゲル中で観察される神経伸長阻害活性をいう。そして当該神経伸長阻害活性の抑制作用とは、コラーゲンゲル中でのセマフォリン活性を持続的に阻害する活性であり、例えばコラーゲンゲル中で神経細胞と近接してセマフォリン産生細胞を培養し、通常一晩以上経過した後に神経突起伸長を観察したときに、セマフォリン産生細胞と逆側へ伸長している神経突起に比べてセマフォリン産生細胞の方へは１／３以下しか伸長しない実験条件において、その物質存在下で培養すると１／２以上の長さにまで伸長することのできる活性をいう。また、かかるコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物としては特に制限されるものではないが、１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すものを例示することができる。
【００８４】
上記セマフォリンの２種類の活性測定において用いられるセマフォリンとしては、天然型のセマフォリンに限定されることなく、前記の膜結合型のセマフォリンの細胞外ドメインのみを発現可溶化させたもの、抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質との融合タンパク質、あるいはヒスタグや、フラグなどのタグを付けたもの、一部のアミノ酸を変化させたものなども使用することができる。また、培養に用いる神経細胞としては、ニワトリ７日齢、８日齢の胎仔から取り出した後根神経節が便利であるが、ニワトリ以外の動物の後根神経節、また、後根神経節以外の交感神経節、網膜神経節、上頚神経節など、インビトロ培養下において神経突起を伸長する神経細胞であればどのような神経細胞でも用いることができる。培養条件としては、神経突起の伸長を観察でき、セマフォリンの活性が測定できる条件であれば、特に制限されるものではない。
【００８５】
本発明におけるセマフォリン阻害剤の作用機序は、以下のように考えられる。すなわち、セマフォリンの神経突起伸長抑制活性あるいは成長円錐退縮活性の発現は、まずセマフォリンが神経細胞表面（成長円錐）上のレセプターに結合することに始まる。セマフォリンの結合したレセプターから細胞内にシグナルが伝達され最終的にアクチン繊維の脱重合が惹起され、その結果として神経突起伸長抑制、成長円錐退縮が生じる。セマフォリン活性阻害はこれら一連の反応のいずれかの部分を阻害・遮断することで達成される。上記セマフォリンのレセプターとしては、前述のセマフォリンのいずれかのレセプターであればよく、セマフォリンが結合することができれば、その改変体や、その一部のコンポーネントであってもよい。具体的には、ニューロピリン−１、プレキシン（国際公開WO01/405457）等が例示される。そして、本発明のセマフォリン阻害剤は、作用機序により限定されるものではなく、また上記の作用機序において、いずれの段階を阻害するものであっても本発明の範疇に含まれる。すなわち、上記セマフォリンのレセプター結合からアクチン繊維脱重合までに至る細胞内情報伝達に関わる反応を阻害することによりセマフォリン活性を阻害する化合物もまた、本発明の範疇に含まれる。なお、セマフォリンのレセプター結合阻害活性を測定する方法としては、当業者により適宜選択される方法であればどのような方法であってもよく、例えば、前述の抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質を融合したセマフォリン、あるいはヒスタグや、フラグなどのタグを付けたセマフォリンを、被験物質存在下において当該セマフォリンレセプターあるいはレセプターコンポーネントを発現する細胞に対して結合させることで、セマフォリンのレセプター結合阻害活性を測定する方法を例示することができる。
【００８６】
前記一般式（１）及び（１２）〜（２０）において、Ｒ１は水素原子もしくはカルボキシル基を表し、好ましくはカルボキシル基を表す。また、Ｒ２は水素原子もしくは水酸基を表し、好ましくは水酸基を表す。
【００８７】
前記一般式（１）、（１２）〜（１５）、及び（１７）〜（１９）において、Ｒ５は水素原子もしくはカルボキシル基を表し、好ましくはカルボキシル基を表す。また、Ｒ６は水素原子もしくは水酸基を表し、好ましくは水酸基を表す。
【００８８】
前記一般式（１８）において、Ｒ８は水素原子もしくは水酸基を表し、好ましくは水酸基を表す。
【００８９】
本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物として、具体的には、後述する本件明細書実施例に記載された化合物を例示することができる。
【００９０】
前記一般式（１）、及び（１２）〜（２０）のいずれかで表される化合物、またはその薬学上許容される塩は、本発明者らが大阪府内土壌より分離したペニシリウム属に属するカビ、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物より、ＳＰＦ−３０５９株の培養物からセマフォリン阻害活性を指標とする等して、得ることができる。
該ＳＰＦ−３０５９株は次のような菌学的性質を有する。
【００９１】
（a）培養的・形態的性質
麦芽エキス寒天培地上で、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径２．８〜２．９ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色又は黄色、コロニー裏面は濃い黄色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。ポテト・グルコース寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径３．２〜３．３ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面の色は白色又はクリーム色、コロニー裏面は濃い黄色又は黄褐色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。ツアペック寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径３．１〜３．２ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色又は灰色、コロニー裏面はクリーム色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。オートミール寒天培地（日本製薬製放線菌培地No.3「ダイゴ」）上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径２．０〜２．１ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色、灰緑色又は黄色、コロニー裏面はクリーム色又は灰色であり、可溶性色素の産生は認められないが、分生胞子を形成する。分生子柄は平滑、長さ５〜２０μｍであり、分生子柄の先端に３〜６個のフィアライドを単輪生する。フィアライドは長さ３〜４μｍであり、その先端から分生子が２〜１０個の連鎖を形成する。分生子は球形で、直径２．２〜２．４μｍ、表面には縦に通常１０本のしわがある。テレオモルフは認められない。
【００９２】
（b）生理学的性質
１．生育ｐＨ範囲
サブローブロス中、２７℃、３日間の振盪培養における生育は次の通り。
ｐＨ 生育
３．１ −
４．５ ＋
５．５ ＋＋
７．１ ＋＋＋
８．０ ＋＋
９．０ ±
１０．０ −
２．生育温度範囲
オートミール寒天培地上、３８℃、５日間の培養で生育が認められる。
【００９３】
以上の菌学的性質より、本菌株をペニシリウム属に属する菌株であると同定し、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９と命名した。本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３として寄託されている。
【００９４】
上記ＳＰＦ−３０５９株の培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養又は通気撹拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が用いられ、また窒素源としては、例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティープリカー、ヒスチジン等のアミノ酸類等の有機窒素源や、アンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が用いられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を添加しても良い。なお、培養期間中に、シリコン油、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を添加することも可能である。そして、培養温度としては、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度を挙げることができ、培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲を挙げることができ、培養期間としては例えば、５〜１０日間の範囲を例示することができる。
【００９５】
本発明の一般式（１）及び（１２）〜（２０）のいずれかで表される化合物を培養液から単離・精製するには、微生物の生産する二次代謝物の培養物から、通常使用される単離・精製手段を用いることができる。培養液上清から目的物を単離・精製する場合は、培養濾液からの通常の単離・精製法、例えば溶媒抽出、イオン交換樹脂、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー等を用いることができ、これらの単離・精製法は単独又は組み合わせて行うことができる。また、培養菌体から目的物を単離・精製する場合は、濾過又は遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトン、メタノール等の水溶性有機溶媒を用いて直接抽出することができ、抽出物は培養液上清からの単離・精製と同様の方法で、目的化合物を得ることができる。該目的化合物は、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル等の適当な溶媒を用いて、約１当量の塩基を作用させることによって、塩とすることもできる。
【００９６】
また、本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物においては、それらの塩、好ましくは医薬的又は獣医薬的に許容される塩も本発明の範疇に含まれる。ここで、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩や、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩や、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸塩などを挙げることができる。
【００９７】
本発明の脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤は、神経伸長反発因子阻害剤、特に上記セマフォリン阻害剤を有効成分とする前記の神経再生促進剤を含有するものであれば特に制限されるものではないが、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００９８】
投与量及び投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、病床部位に局所的に投与する方法が好ましい。神経の再生には通常数日から数ヶ月以上の期間を要するので、その間セマフォリンの活性を抑制するために１回又は２回以上投与することが好ましい。２回以上投与するときは連日あるいは適当な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。投与量は一回当たりセマフォリン阻害剤として数百μｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ以下を用いることができ、投与回数を減らすために徐放性製剤を用いたり、オスモティックポンプなどで長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。そして、これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてセマフォリンの活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。
【００９９】
上記脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患としては、末梢神経や中枢神経の傷害、変性疾患、すなわち老化等に起因する嗅覚異常症、脊髄損傷などの外傷による嗅覚以外の神経傷害、脳梗塞などに起因する神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病やパーキンソン病、ＡＬＳといった神経変性疾患、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、外傷性神経変性疾患などを具体的に挙げることができる。さらに、受容体がニューロピリンである点が共通であるＶＥＧＦ１６５が関与する血管新生を伴う疾患も、対象となる。
【０１００】
また、本発明の神経再生促進剤の用途は、神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤等の医薬品に限定されることなく、動物薬、さらにはセマフォリンシグナル阻害剤として産業上重要な実験試薬としても利用が可能である。本発明の神経再生促進剤はセマフォリン阻害剤を有効成分として含むことから、末梢神経である嗅神経の再生や、脳や脊髄の中の嗅球、大脳皮質、海馬、線条体、視床、間脳、中脳、小脳、橋、延髄、精髄、網膜などにあって脳脊髄関門で区切られた領域である中枢内での神経の再生を促進する。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】
（本発明の化合物の製造）
グルコース２％、ショ糖５％、綿実粉２％、硝酸ナトリウム０．１％、Ｌ−ヒスチジン０．１％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カリウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１４％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地１０ｍｌを５０ｍｌ容の三角フラスコに分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３）を１白金耳接種し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前々培養とした。５００ｍｌ容三角フラスコ５本に上記と同じ組成の培地を１２５ｍｌずつ分注しオートクレーブで滅菌した後、上記の前々培養液を４ｍｌずつ添加し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前培養とした。５０リットル容ジャーファーメンターに、グルコース１．４３％、ショ糖３．５７％、綿実粉１．４３％、硝酸ナトリウム０．０７％、Ｌ−ヒスチジン０．０７％、リン酸２カリウム０．０３６％、塩化カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１％、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製消泡剤）０．０１％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地を３０リットル分注し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）した後、上記の前培養液を５００ｍｌ添加し、２７℃、４００ｒｐｍ、通気量１５リットル／分にて９日間通気攪拌培養した。
【０１０３】
培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清液と菌体に分離した。菌体画分を３０リットルのアセトンで抽出し、濾過、濃縮後、水溶液となったところで１０リットルの酢酸エチル−蟻酸（９９：１）で２回抽出した。抽出液を減圧濃縮して粗抽出物１３０ｇを得た。これを２００ｍｌのメタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、油状物９１．４ｇを得た。これを２００ｍｌのメタノールに溶解し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、粗精製物４１．９ｇを得た。これを５００ｍｇずつ２．５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、分取逆相ＨＰＬＣに付した。分取逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ−II５Ｃ１８ＨＧｐｒｅｐ（φ５×１０ｃｍとφ５×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合４５％から７５％へ２時間の直線的グラジエント、流速：２５ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とし、溶出液を１分ずつ分取した。
【０１０４】
上記分取した画分を分析用ＨＰＬＣで分析した。分析用ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｗａｋｏｓｉｌ−II５Ｃ１８ＲＳ（φ４．６×１５０ｍｍ、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合２０％から６７％へ７１．１分間の直線的グラジエント、流速：１．３ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とした。この分析用ＨＰＬＣにおける保持時間を指標に分取用ＨＰＬＣの溶出画分を集め、減圧下に溶媒を留去した後、再度分取用ＨＰＬＣに付して上記と同様に精製し、さらにＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付して上記と同様に精製し、溶媒を減圧留去、乾燥することにより、以下に示す精製品を得た。
【０１０５】
表１
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
化合物 取得量(ｍｇ) 分析用HPLCでの保持時間(分)
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＰＦ−３０５９−８ １１．１ ５１．２
ＳＰＦ−３０５９−１０ ３．３ ５４．８
ＳＰＦ−３０５９−１６ ６．７ ４１．５
ＳＰＦ−３０５９−１７ ７．９ ５７．０
ＳＰＦ−３０５９−１８ １．６ ５１．５
ＳＰＦ−３０５９−１９ ７．８ ３９．６
ＳＰＦ−３０５９−２０ １．３ ４５．５
ＳＰＦ−３０５９−２２ １．０ ４８．４
ＳＰＦ−３０５９−２３ １６．７ ３３．２
ＳＰＦ−３０５９−３１ ６．５ ４９．６
ＳＰＦ−３０５９−３８ ４．０ ６３．１
ＳＰＦ−３０５９−４０ ２．３ ５３．７
ＳＰＦ−３０５９−４１ １．０ ５４．０
ＳＰＦ−３０５９−４２ ２．４ ４８．２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【０１０６】
得られた化合物の物理化学的性状は次の通り。
【０１０７】
（ＳＰＦ−３０５９−８）
外観：クリーム色粉末
分子量：５７８
分子式：Ｃ２８Ｈ１８Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５７９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５７６（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５７９．０７７９
計算値：５７９．０７７５（Ｃ２８Ｈ１９Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
220(45700)、305(18200)、358(16800)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3414、1652、1568、1464、1614、1289
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.75(3H,s)、2.21(3H,s)、3.06(1H,d,18.8)、3.41(1H,d,18.8)、4.72(1H,d,13.6)、5.02(1H,d,13.6)、6.16(1H,s)、6.17(1H,s)、6.84(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
18.7、26.9、38.2、62.0、62.1、101.1、102.1、104.8、112.3、112.6、113.3、113.5、116.6、119.1、119.4、141.4、143.7(2Ｃ)、145.0、149.9、152.0、154.7、159.4、164.6、167.3、167.7、170.9、174.8
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−８の構造式を、次式と決定した。
【０１０８】
【化２１】
【０１０９】
（ＳＰＦ−３０５９−１０）
外観：黄色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：５４４
分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４５（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４３（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５４５．０７３２
計算値：５４５．０７４０（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(41700)、286(29500)、338sh(14900)、429sh(6500)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3358、3073、1700、1674、1631、1464、1276、1248
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図１に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図２に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１１０】
（ＳＰＦ−３０５９−１６）
外観：クリーム色粉末
分子量：５８０
分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５８１（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５７９（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：５７９．０８１２
計算値：５７９．０７７６（Ｃ２８Ｈ１９Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
210(44500)、323(15000)、353sh(12000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3420、1694、1668、1634、1568、1464、1278
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.88(3H,s)、2.08(3H,s)、2.28(1H,d,16.6)、2.34(1H,d,16.6)、4.07(1H,d,10.1)、4.17(1H,s)、4.42(1H,d,10.1)、6.29(1H,s)、6.93(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
21.1、24.2、30.4、50.1、50.4、64.9、69.3、102.3、104.1、110.6、111.6、112、119.0、121.6、138.7、139.4、141.6、147.1、148.0、150.4、152.1、160.4、162.6、167.7、171.3、174.3、198.6、201.3
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１６の構造式を、次式と決定した（立体は相対立体配置）。
【０１１１】
【化２２】
【０１１２】
（ＳＰＦ−３０５９−１７）
外観：黄色粉末
分子量：５７８
分子式：Ｃ２８Ｈ１８Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５７９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５７７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：５７７．０６７５
計算値：５７７．０６１９（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
214(49400)、301(8900)、390(22100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3109、1656、1564、1459、1272
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.89(3H,s)、2.46(3H,s)、4.85(1H,d,13.3)、4.92(1H,d,13.3)、5.52(1H,s)、6.42(1H,s)、6.65(1H,s)、6.88(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
17.1、20.2、61.9、71.9、91.8、102.8、103.0(2Ｃ)、103.5、111.0、112.6、117.6、119.2、122.9、139.4、143.3、149.2、150.4、151.2、151.7、154.4、159.1、163.4、165.6、167.8、168.6、170.9、172.9
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１７の構造式を、次式と決定した。
【０１１３】
【化２３】
【０１１４】
（ＳＰＦ−３０５９−１８）
外観：オレンジ色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：５６０
分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５５９（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５６１．０７１０
計算値：５６１．０６７０（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
219(34300)、257(28900)、311(28600)、404(14600)、450(14400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3154、1657、1605、1468、1279
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図３に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図４に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１１５】
（ＳＰＦ−３０５９−１９）
外観：黄色粉末
分子量：５９６
分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１５
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５９７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５９５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５９７．０８９０
計算値：５９７．０８８１（Ｃ２８Ｈ２１Ｏ１５）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
204(34600)、225(30900)、267sh(8300)、319(17100)、349(13800)、404(10100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3418、1634、1605、1462、1270
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.43(3H,s)、1.55(3H,s)、2.94(1H,d,5.5)、3.17(1H,d,18.6)、3.24(1H,d,18.6)、4.38(1H,d,11.9)、4.54(1H,d,11.9)、5.27(1H,d,5.5)、5.84(1H,s)、6.59(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
24.5、28.7、36.6、49.4、62.1、64.2、96.8、99.6、102.0、102.6、103.0、104.0、111.1、120.2(2C)、113.1、137.3、146.5、150.8、151.8、152.0、153.0、159.2、161.3、167.7、169.8、172.6、185.4
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１９の構造式を、次式と決定した。
【０１１６】
【化２４】
【０１１７】
（ＳＰＦ−３０５９−２０）
外観：黄色粉末
分子量：５６２
分子式：Ｃ２８Ｈ１８Ｏ１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６３（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５６３．０８８２
計算値：５６３．０８２６（Ｃ２８Ｈ１９Ｏ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
216(49100)、301(21700)、369(14200)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3444、3069、1690、1649、1619、1536、1435、1283
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.76(3H,s), 2.21(3H,s), 3.09(1H,d,18.8), 3.43(1H,d,18.8), 4.75(1H,d,13.4), 5.03(1H,d,13.4), 6.17(1H,s),6.18(1H,s), 6.75(1H,d,2.1), 6.83(1H,d,2.1)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
18.7, 27.0, 38.3, 61.8, 62.2, 101.0, 102.9, 104.8, 112.3, 112.7, 113.1, 113.3, 113.4, 117.4, 119.2, 136.3, 141.1, 143.7, 145.1, 154.7, 156.9, 160.2, 161.9, 164.7, 167.3, 169.3, 170.8, 174.9
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２０の構造式を、次式と決定した。
【０１１８】
【化２５】
【０１１９】
（ＳＰＦ−３０５９−２２）
外観：クリーム色粉末
分子量：５４８
分子式：Ｃ２７Ｈ１６Ｏ１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：５４７．０５６８
計算値：５４７．０５１３（Ｃ２７Ｈ１５Ｏ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
208(51900)、240sh(43900)、270sh(38000)、310(30700)、387(18000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3410、3068、1655、1619、1599、1561、1460、1310、1251
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.34(3H,s)、2.73(3H,s)、6.31(1H,s)、6.98(1H,s)、8.08(1H,s)、8.69(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
17.1、32.3、98.1、101.8、102.6、113.3、117.1、119.8、123.2、125.4、126、131.9、136.2、140.4、142.1、144.7、150.4、152.7、152.9、154.8、156.2、160.4、167.1、172.1、178.9、192.7、202.4
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２２の構造式を、次式と決定した。
【０１２０】
【化２６】
【０１２１】
（ＳＰＦ−３０５９−２３）
外観：黄色粉末
分子量：６８６
分子式：Ｃ３４Ｈ２２Ｏ１６
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６８７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６８５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：６８５．０８８７
計算値：６８５．０８３０（Ｃ３４Ｈ２１Ｏ１６）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(53800)、282sh(24100)、324(21700)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3354、1688、1588、1468、1288
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.14(3H,s), 2.21(3H,s), 2.61(3H,brs), 6.50(1H,s), 6.85(1H,s), 7.28(1H,brs), 7.68(1H,brs), 8.29(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
30.2, 31.3, 32.3, 102.4, 107.3, 110.0, 114.7, 114.9, 119.7, 120.5, 123.8, 125.9, 126.4, 126.5, 132.6, 135.6, 136.1, 136.7, 139.5, 141.0, 143.4, 145.6, 147.8, 150.4, 151.8, 154.1, 160.5, 167.5, 170.5, 172.7, 197.9, 200.4, 201.2, 202.0
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２３の構造式を、次式と決定した。
【０１２２】
【化２７】
【０１２３】
（ＳＰＦ−３０５９−３１）
外観：黄色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：６６８
分子式：Ｃ３４Ｈ２０Ｏ１５
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６６９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６６７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：６６９．０８８７
計算値：６６９．０８８１（Ｃ３４Ｈ２１Ｏ１５）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(54600)、235sh(39400)、312(31300)、350(24200)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3348、1766、1707、1644、1588、1464、1301
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図５に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図６に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１２４】
（ＳＰＦ−３０５９−３８）
外観：黄色粉末
分子量：６５４
分子式：Ｃ３４Ｈ２２Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６５５（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６５３（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：６５５．１１００
計算値：６５５．１０８８（Ｃ３４Ｈ２３Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
212(41100)、239sh(34000)、287(22200)、300sh(21900)、328(24400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3418、1696、1660、1607、1471、1283
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.30(1H,m)、2.36(1H,m)、2.65(3H,s)、2.81(1H,m)、2.96(1H,m)、3.00(3H,s)、4.56(1H,d,11.8)、4.75(1H,d,11.8)、6.43(1H,s)、7.07(1H,s)、8.15(1H,d,9.2)、8.73(1H,d,9.2)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
21.7、23.3、26.6、32.9、56.9、71.3、102.3、102.5、107.9、110.2、117.4、119.4、121.2、122.22、122.24、124.0、127.1、134.3、136.1、138.1、141.7、141.8、142.1、150.1、154.0、154.1、154.6、155.6、167.7、167.9、173.1、189.5、197.5、207.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３８の構造式を、次式と決定した。
【０１２５】
【化２８】
【０１２６】
（ＳＰＦ−３０５９−４０）
外観：オレンジ色粉末
分子量：５３６
分子式：Ｃ２７Ｈ２０Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３７．１０１８
計算値：５３７．１０３４（Ｃ２７Ｈ２１Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
209(34100)、223(34200)、277(19900)、340(11600)、460(25000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3361、1698、1620、1465、1293
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.95(3H,s), 2.34(1H,d,16.8), 2.63(3H,s), 3.22(1H,d,16.8), 4.04(1H,d,10.8), 4.51(1H,d,10.8), 5.78(1H,s), 6.27(1H,s), 6.76(1H,s), 6.78(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
23.7, 24.4, 32.0, 50.6, 71.9, 98.4, 102.5, 104.5, 109.0, 109.3, 111.9, 112.7, 118.8, 125.0, 135.4, 141.2, 143.0, 149.7, 151.1, 152.0, 152.6, 155.8, 168.3, 172.5, 189.0, 197.0, 204.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−４０の構造式を、次式と決定した。
【０１２７】
【化２９】
【０１２８】
（ＳＰＦ−３０５９−４１）
外観：黄色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：５４８
分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５４９．１００２
計算値：５４９．１０３４（Ｃ２８Ｈ２１Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
227(30200)、282sh(13500)、315(13900)、356(11000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3396、1688、1662、1622、1470、1294
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図７に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図８に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１２９】
（ＳＰＦ−３０５９−４２）
外観：黄色粉末
分子量：８０６
分子式：Ｃ４１Ｈ２６Ｏ１８
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：８０７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：８０５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＨＲＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：８０７．１２６１
計算値：８０７．１１９８（Ｃ４１Ｈ２７Ｏ１８）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
221(58300)、316(28000)、353(23100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3400、1704、1651、1620、1444、1294
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.08(3H,s)、2.10(3H,s)、2.51(3H,s)、3.47(1H,d,15.9)、3.54(1H,d,15.9)、4.48(1H,d,13.1)、4.65(1H,d,13.1)、6.28(1H,s)、6.84(1H,s)、6.89(1H,s)、7.40(1H,s)、8.12(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
16.5、17.1、19.1、31.9、61.8、102.1、102.9(2Ｃ)、103.4、108.7、109.2、111.5、113.5、118.5、119.1(2Ｃ)、119.7、122.0、127.8、128.9、131.2、139.1(2Ｃ)、141.7、144.2、150.0、154.0(2Ｃ)、150.5、150.6、150.7、152.0、152.3、158.9、160.9、167.8、167.9、173.1、173.3、175.0、202.5
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
これらからＳＰＦ−３０５９−４２の構造式を、次式と決定した。
【０１３０】
【化３０】
【実施例２】
【０１３１】
（Ｓｅｍａ３Ａのコラプス活性に対する本発明の化合物の抑制作用）
ポリリジンを塗布した９６ウェルプレート（住友ベークライト）にさらにラミニン塗布（２０μｇ／ｍｌのラミニン、室温１時間）を行った。各ウェルに１００μｌの培地（１０％の牛胎仔血清、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＦ１２培地）を入れ、ここに７日齢ニワトリ胚から摘出した後根神経節を接種し、１６〜２０時間５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。その後、対象化合物を種々の濃度で培地に添加し１時間培養後、３ユニット／ｍｌのマウスセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）を添加し、更に１時間培養した。１時間経過後、速やかに最終濃度１％になるようにグルタルアルデヒドを添加し、室温に１５分間放置して組織片を固定した後、顕微鏡下で退縮した成長円錐の割合を測定した。陰性対照群（化合物、Ｓｅｍａ３Ａ共に不添加）の成長円錐退縮割合を(Ａ)％、陽性対照群（化合物不添加、Ｓｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮割合を(Ｂ)％、試験群（各化合物及びＳｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮割合を(Ｃ)％として、Ｃ＝(Ａ＋Ｂ)／２となる各化合物の濃度をＩＣ５０値とした。結果を以下に示す。この結果から、本発明の化合物は強くセマフォリンを阻害することがわかる。
【０１３２】
表２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
化合物 ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＰＦ−３０５９−８ ２
ＳＰＦ−３０５９−１０ ２
ＳＰＦ−３０５９−１６ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−１７ ０．１３
ＳＰＦ−３０５９−１８ ０．０６３
ＳＰＦ−３０５９−１９ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−２０ ４
ＳＰＦ−３０５９−２２ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−２３ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−３１ ０．２５
ＳＰＦ−３０５９−３８ ０．０１３
ＳＰＦ−３０５９−４０ ０．１２５
ＳＰＦ−３０５９−４１ ０．２５
ＳＰＦ−３０５９−４２ ０．０６３
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【実施例３】
【０１３３】
（本発明の化合物の塩の製造）
本発明の化合物をメタノールに溶解して１ｍＭ溶液を調製する。この溶液１ｍｌに、１ｍＭ水酸化ナトリウムのメタノール溶液を、本発明の化合物が２個のカルボキシル基を持つ場合は２ｍｌ、本発明の化合物が１個のカルボキシル基を持つ場合は１ｍｌ加え、十分に混合する。この溶液を減圧下に溶媒を留去、乾燥し、本発明の化合物のナトリウム塩１μｍｏｌを得る。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の化合物は、セマフォリン阻害活性を有し、各種神経障害性疾患・神経変性疾患に対する予防剤や治療剤として有利に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セマフォリン阻害活性を有する新規な化合物、該化合物の微生物学的製造方法、および該化合物を有効成分として含有する神経再生促進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は成体において分裂能を持っていない特殊な組織である。そのため一旦障害を受けると長期にわたって障害が続く。特に脳や脊髄といった中枢神経系では全く再生能がない。脊髄損傷に代表される外因性の傷害やアルツハイマー病、パーキンソン病といった神経変性疾患に対する治療方法がないことも、中枢神経における再生能が無いことが一つの原因になっているということができる。他方、末梢神経は再生能を有しており、一旦切断された後も軸索が再生し機能が回復する。しかしこの場合にも再生に要する期間は数ヶ月から1年以上と非常に長時間を要し、患者にとっての苦痛は大きい。更にこのように再生に長期間を要するために、その間に神経細胞が死滅し機能回復に至らない場合も多い。このように再生能を有する末梢神経の場合も、脳や脊髄といった中枢神経系の環境では全く伸長することはできない。そのため、中枢神経系には神経の伸長を阻止する物質が存在しているとされている。この中枢神経系に存在する神経再生阻害物質を抗体などで抑制すると一部ではあるが、中枢での神経再生が起こり、機能の回復も見られる。最近、この中枢神経再生阻害因子としてNogoが発見された（非特許文献１、２）。しかし、Nogoを阻害することによって、再生する神経線維は一部であり、他の再生阻害物質が存在するのではないかと考えられているが、インビボで神経の再生阻害に働いている因子は、これまで明らかにされていない。
【０００３】
ところで、セマフォリンは、もともと発生期におけるバッタの神経系形成に関係する因子としてその遺伝子が単離されたものであるが、その後、線虫、魚、哺乳類さらにはある種のウイルスなどにも分布する大きな遺伝子ファミリーを形成していることが報告され、現在ではセマフォリン遺伝子は構造上８つの遺伝子サブファミリー、クラス、に分類されている（非特許文献３）。セマフォリンは神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質であり、これまでに約２０種の分子種が知られている（非特許文献３）が、多くのセマフォリンファミリーの大部分の機能について詳しいことはわかっていない。最も良く研究されているのがクラス３型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群であり、これらの翻訳産物はすべて分泌型蛋白質である。これらの遺伝子がコードする蛋白質はインビトロで強い神経突起伸長抑制活性、成長円錐退縮活性を有していることが知られているが、ある条件下では神経突起伸長に誘引的に作用するとの報告もある。中でも最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）（非特許文献４、５）であり、この蛋白は１０ｐＭという低濃度で短時間のうちに培養神経細胞の成長円錐退縮を誘発する。セマフォリンのインビボでの機能を解析する研究として、Ｓｅｍａ３Ａの受容体の一つのコンポーネントであるニューロピリン−１のノックアウトマウスの研究がなされている（非特許文献６）。当該ノックアウトマウスは胎生致死であるが、三叉神経など一部の神経系の走行異常、血管形成異常が起こることが知られている。一方、Ｓｅｍａ３Ａのノックアウトマウスでも同様の神経系の走行異常は認められるが、大きな異常も無く成体にまで発育する個体もあるとされており、生体内でのＳｅｍａ３Ａの機能については未だ不明な点も多い。
【０００４】
その他セマフォリンに関しては、セマフォリンＷ、セマフォリンＹ、セマフォリンＺに対する抗体等のアンタゴニストやアンチセンスヌクレオチドを中枢神経の再生促進剤とすること（特許文献１，２，３）や、神経細胞とヒトコラプシンに特異的に結合する抗体とを接触させることにより、神経突起成長を誘導する方法（特許文献４）が知られている。しかし、セマフォリンを特異的に阻害する低分子化合物は、これまで全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO98/15628号公報
【特許文献２】WO98/11216号公報
【特許文献３】WO98/20928号公報
【特許文献４】米国特許第５４１６１９７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature 403, 434, 2000
【非特許文献２】Nature 403, 439, 2000
【非特許文献３】Cell 97, 551, 1999
【非特許文献４】Cell 75, 217, 1993
【非特許文献５】Cell 75, 1389, 1993
【非特許文献６】Neuron 19, 995, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、セマフォリン阻害活性を有する新規な化合物、該化合物の微生物学的製造方法、および該化合物を有効成分として含有する神経再生促進剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
セマフォリンは多くの作用を有していると考えられ、一部ではセマフォリンが神経の発生のみでなく再生にも関与しているとの考えもあったが、実際のところは全くわかっていなかった。本発明者らは、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物中に見い出される化合物、ＳＰＦ−３０５９−１等がセマフォリン阻害活性を有することを見い出すとともに、該化合物が、インビボにおいて、神経再生を促進することを明らかにした。更に、ＳＰＦ−３０５９株の培養物を単離精製し、インビトロでセマフォリンの活性を阻害する物質をスクリーニングすることによって、セマフォリン阻害活性を有する新規な化合物を見い出した。本発明は、上記の知見に基づいて、完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ 一般式（１）で表される化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００１０】
【化１】
［式中、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は以下の［I］〜［IX］のいずれかを表す。
【００１１】
［I］Ｒ３およびＲ４は結合して、式（２）：
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒ５は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ６は水素原子または水酸基を表す。）
で表される2価基を表す。
【００１３】
［II］Ｒ３およびＲ４は結合して、式（３）：
【００１４】
【化３】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００１５】
［III］Ｒ３およびＲ４は結合して、式（４）：
【００１６】
【化４】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００１７】
[IV] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（５）：
【００１８】
【化５】
［式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。］
で表される2価基を表す。
【００１９】
[V] Ｒ３は水素原子を表し、Ｒ４は式（６）：
【００２０】
【化６】
で表される基を表す。
【００２１】
[VI] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（７）：
【００２２】
【化７】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００２３】
[VII] Ｒ３は式（８）：
【００２４】
【化８】
（式中、Ｒ７は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ８は水素原子または水酸基を表す。）
で表される基を表し、Ｒ４は式（９）：
【００２５】
【化９】
（式中、Ｒ５及びＲ６は前記と同義である。）
で表される基を表す。
【００２６】
[VIII] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（１０）：
【００２７】
【化１０】
（式中、Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
で表される2価基を表す。
【００２８】
［IX] Ｒ３およびＲ４は結合して、式（１１）：
【００２９】
【化１１】
で表される2価基を表す。］
【００３０】
［２］ 一般式（１２）：
【００３１】
【化１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、上記［１］と同義である。）
で表される、上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３２】
［３］ 一般式（１２）において、Ｒ１およびＲ５が、カルボキシル基であり、Ｒ２が水酸基又は水素原子であり、Ｒ６が水酸基である、上記［２］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３３】
［４］ 一般式（１３）：
【００３４】
【化１３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。）
で表される、上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３５】
［５］ 一般式（１３）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基であり、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［４］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３６】
［６］ 一般式（１４）：
【００３７】
【化１４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。］
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３８】
［７］ 一般式（１４）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基であり、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［６］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００３９】
［８］ 一般式（１５）：
【００４０】
【化１５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４１】
［９］ 一般式（１５）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基であり、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［８］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４２】
［１０］ 一般式（１６）：
【００４３】
【化１６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４４】
［１１］ 一般式（１６）において、Ｒ１が、カルボキシル基を表し、Ｒ２が、水酸基を表す上記［１０］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４５】
［１２］ 一般式（１７）：
【００４６】
【化１７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６は、上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４７】
［１３］ 一般式（１７）において、Ｒ１およびＲ５がカルボキシル基を表し、Ｒ２およびＲ６が水酸基を表す、上記［１１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００４８】
［１４］ 一般式（１８）：
【００４９】
【化１８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５０】
［１５］ 一般式（１８）において、Ｒ１およびＲ５はカルボキシル基であり、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８が水酸基である、上記［１４］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５１】
［１６］ 一般式（１８）において、Ｒ７が水素原子である、上記［１５］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５２】
［１７］ 一般式（１９）：
【００５３】
【化１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５４】
［１８］ 一般式（１９）において、Ｒ２およびＲ６が水酸基である、上記［１７］記載の化合物、又はその薬学上許容される塩。
【００５５】
［１９］ 一般式（１９）において、Ｒ５がカルボキシル基である、上記［１８］記載の化合物、又はその薬学上許容される塩。
【００５６】
［２０］ 一般式（１９）において、Ｒ１がカルボキシル基である、上記［１９］記載の化合物、又はその薬学上許容される塩。
【００５７】
［２１］ 一般式（２０）：
【００５８】
【化２０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、上記［１］と同義である。）
で表される上記［１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００５９】
［２２］ 一般式（２０）において、Ｒ１がカルボキシル基であり、Ｒ２が水酸基である、上記［２１］記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【００６０】
［２３］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：５４５；
（ｂ）分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１２；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：213(41700)、286(29500)、338sh(14900)、429sh(6500)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１： 3358、3073、1700、1674、1631、1464、1276、1248；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、５００ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第１図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、１２５ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第２図に示す；
【００６１】
［２４］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：５６１；
（ｂ）分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１３；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：219(34300)、257(28900)、311(28600)、404(14600)、450(14400)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：3154、1657、1605、1468、1279；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中）：スペクトルのチャートを第３図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中）：スペクトルのチャートを第４図に示す；
【００６２】
［２５］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：６６９；
（ｂ）分子式：Ｃ３４Ｈ２０Ｏ１５；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：213(54600)、235sh(39400)、312(31300)、350(24200)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：3348、1766、1707、1644、1588、1464、1301；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、５００ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第５図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、１２５ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第６図に示す；
【００６３】
［２６］ ペニシリウム属に属するSPF-3059株より得ることができ、下記の物理的性質および化学的性質を有し、かつセマフォリン阻害活性を有する化合物。
（ａ）高速電子衝撃質量スペクトルｍ／ｚ値（Ｍ＋Ｈ）+：５４９；
（ｂ）分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１２；
（ｃ）紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：227(30200)、282sh(13500)、315(13900)、356(11000)；
（ｄ）赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：3396、1688、1662、1622、1470、1294；
（ｅ）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、５００ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第７図に示す；
（ｆ）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル(DMSO-d6中、１２５ＭＨｚ）：スペクトルのチャートを第８図に示す；
【００６４】
［２７］ 上記［１］〜［２６］のいずれか記載の化合物、またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
【００６５】
［２８］ セマフォリンが、クラス３型セマフォリンであることを特徴とする、上記［２７］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６６】
［２９］ クラス３型セマフォリンが、セマフォリン３Ａであることを特徴とする、上記［２８］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６７】
［３０］ セマフォリンが、クラス６型セマフォリンであることを特徴とする、［２７］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６８】
［３１］ クラス６型セマフォリンが、セマフォリン６Ｃであることを特徴とする、上記［３０］記載のセマフォリン阻害剤。
【００６９】
［３２］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経伸長反発因子阻害剤。
【００７０】
［３３］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する薬剤。
【００７１】
［３４］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経再生促進剤。
【００７２】
［３５］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
【００７３】
［３６］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患の予防若しくは治療剤。
【００７４】
［３７］ 上記［２７］〜［３１］のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、嗅覚異常症、外傷性神経傷害、脳梗塞性神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経変性疾患、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、又は外傷性神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
【００７５】
［３８］ ペニシリウム属に属する微生物を培養して、その培養物から化合物を採取することを特徴とする、上記［１］〜［２６］のいずれか記載の化合物、その薬学上またはその薬学上許容される塩の製造方法。
【００７６】
［３９］ ペニシリウム属に属する微生物が、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株であることを特徴とする上記［３８］記載の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＳＰＦ−３０５９−１０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図２】ＳＰＦ−３０５９−１０の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図３】ＳＰＦ−３０５９−１８の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図４】ＳＰＦ−３０５９−１８の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図５】ＳＰＦ−３０５９−３１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図６】ＳＰＦ−３０５９−３１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図７】ＳＰＦ−３０５９−４１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図８】ＳＰＦ−３０５９−４１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明において、セマフォリンとは、およそ５００アミノ酸残基からなる類似構造のセマフォリンドメインを有する蛋白質の総称であり（Neuron 14, 941-948, 1995）、現在までに約２０種以上が報告されているが、これら公知のセマフォリンに限定されるものではない。かかるセマフォリンとしては、ヒト等の哺乳類のセマフォリン、好ましくは文献（Cell 97, 551, 1999）において定義されたクラス３型，４型，５型又は６型のセマフォリン、更に好ましくはクラス３型又はクラス6型セマフォリンを例示することができ、最も好ましくはクラス３型セマフォリンにおいてはセマフォリン３Ａ（Cell 75, 217, 1993、Cell 75, 1389, 1993）を、またクラス６型セマフォリンにおいてはセマフォリン６Ｃ（国際公開第98/11216号パンフレット、Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）を例示することができる。これらセマフォリンをコードする遺伝子の配列情報は、GenBankデータベースや前記文献等において公開されている。また、本発明におけるセマフォリンには、天然型・組換え型のタンパク質に限ることなく、膜結合型セマフォリンの細胞外ドメインのみを発現可溶化させたもの、抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質との融合タンパク質、あるいはヒスタグやフラグなどのタグを付けたもの、さらには一部のアミノ酸を欠失、置換、付加させた変異体なども含まれる。
【００７９】
例えば、セマフォリン６Ｃ（Ｓｅｍａ６Ｃ）は膜結合型タンパク質であり、Ｓｅｍａ６Ｃの有する活性の促進・抑制作用を利用して阻害剤の活性を測定する場合等においては、通常Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインが使用される。Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインには２つのアイソフォームが知られているが（国際公開第98/11216号パンフレット及びMoll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）、そのいずれも成長円錐退縮活性を有している。かかるＳｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質も、Ｓｅｍａ６Ｃ活性を損なわない限り、被験物質の活性を測定する場合等において有利に用いることができ、マーカータンパク質としては、例えばアルカリホスファターゼ（Cell 63,185-194 (1990)）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、ＨＲＰなどの従来よく知られたマーカータンパク質を、またペプチドタグとしては、例えばミックタグ、ヒスタグ、フラグタグなどの従来よく知られたペプチドタグを挙げることができる。
【００８０】
また本発明においてセマフォリン阻害剤とは、上記セマフォリンのいずれかが有する活性、例えば、細胞の遊走活性、細胞死誘導活性、細胞の球状化や成長円錐の退縮といった細胞の形態変化、神経突起伸長抑制あるいは促進活性、神経細胞の樹状突起の伸長促進あるいは抑制活性、神経軸索ガイダンス活性などを阻害する物質をいい、かかるセマフォリン阻害剤としては、前記セマフォリン活性を阻害する物質であれば特に制限されるものではないが、好ましくは中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用を有する化合物、より好ましくはセマフォリンの有する成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物、さらに好ましくはセマフォリンの有する成長円錐退縮活性とコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の両方に対して抑制作用を有する化合物を挙げることができる。
【００８１】
中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用とは、脳及び脊髄などからなる中枢（組織）、及び／又は該中枢（組織）以外の周辺・末梢部である体表や体内の諸器官である末梢（組織）における神経の再生を促進する作用を言う。ここで中枢における神経再生促進作用には、網膜神経や大脳皮質神経のような、中枢領域にある神経細胞体から軸索を出し同じく中枢にある他の神経細胞に投射する神経の再生促進作用のみならず、嗅神経、後根神経節感覚神経の中枢性線維等の、末梢に存在する神経細胞体から出る神経であっても、神経軸索が再生される環境が中枢（組織）であるときの神経再生促進作用も含まれる。また、末梢における神経再生促進作用としては、末梢にある神経細胞体から出て末梢組織の中を伸びる神経の再生促進作用のみならず、中枢（脳及び脊髄など）にある神経細胞体から出る神経であっても、再生される環境が末梢（組織）であるときの神経再生促進作用も含まれる。後者としては具体的に、脊髄運動神経、交感神経・副交感神経といった自律神経系の節前神経等の神経再生促進作用を例示することができる。また坐骨神経のように、前記の両方の神経を含む神経の再生促進作用も含まれる。そして、本発明のセマフォリン阻害剤としては、中枢及び末梢における神経再生促進作用を有する化合物が特に好ましい。なお、前記において中枢（組織）とは、脳、延髄、脊髄、眼などからなる組織で詳しくは血液脳関門・血液網膜関門といった構造によって高分子量物質の輸送が制限されている領域であり、末梢組織とは身体のそれ以外の領域を指す。一般に、神経線維は末梢組織の中では再生が可能であるが、中枢組織の中では再生することができない。
【００８２】
上記セマフォリンの有する成長円錐退縮（コラプス）活性とは、神経細胞（通常は神経節の組織片）をインビトロで所定時間培養し、伸長した神経突起とその神経突起先端の成長円錐を観察しうる状態にした後、所定の濃度（例えば、約３ユニット／ｍｌ；なお、１ユニット／ｍｌは５０％の成長円錐を退縮させるセマフォリンの濃度をいう）のセマフォリンを加えさらに所定時間（例えば１時間）培養を続けた後に観察される成長円錐を消失させる活性をいう。伸長した神経突起とその神経突起先端の成長円錐を観察しうる状態とするために、神経細胞のインビトロでの培養は通常１０時間から２０時間行われるが、神経の種類、培養条件によって適宜変更することができる。そして、例えばこの実験系において、セマフォリンを添加する約１時間前にあらかじめ適当濃度の化合物を加えておいた場合に、セマフォリンによる成長円錐の退縮が抑制されたとき、かかる化合物をセマフォリン阻害剤、特にセマフォリンの成長円錐退縮活性の抑制作用を有する化合物ということができる。また、かかる成長円錐退縮活性の抑制作用を有する化合物としては特に制限されるものではないが、１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すものを例示することができる。さらに、セマフォリン阻害剤としては、神経細胞やセマフォリン発現細胞等の細胞の増殖に実質的に影響を与えることがない化合物が、本発明のセマフォリン阻害剤の効果を確認する上で、また、医薬品として用いた場合の安全性の点で好ましい。
【００８３】
また上記セマフォリンの有するコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性とは、例えばセマフォリン産生細胞と神経細胞（通常は神経節）とを共に含むコラーゲンゲル中で観察される神経伸長阻害活性をいう。そして当該神経伸長阻害活性の抑制作用とは、コラーゲンゲル中でのセマフォリン活性を持続的に阻害する活性であり、例えばコラーゲンゲル中で神経細胞と近接してセマフォリン産生細胞を培養し、通常一晩以上経過した後に神経突起伸長を観察したときに、セマフォリン産生細胞と逆側へ伸長している神経突起に比べてセマフォリン産生細胞の方へは１／３以下しか伸長しない実験条件において、その物質存在下で培養すると１／２以上の長さにまで伸長することのできる活性をいう。また、かかるコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物としては特に制限されるものではないが、１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すものを例示することができる。
【００８４】
上記セマフォリンの２種類の活性測定において用いられるセマフォリンとしては、天然型のセマフォリンに限定されることなく、前記の膜結合型のセマフォリンの細胞外ドメインのみを発現可溶化させたもの、抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質との融合タンパク質、あるいはヒスタグや、フラグなどのタグを付けたもの、一部のアミノ酸を変化させたものなども使用することができる。また、培養に用いる神経細胞としては、ニワトリ７日齢、８日齢の胎仔から取り出した後根神経節が便利であるが、ニワトリ以外の動物の後根神経節、また、後根神経節以外の交感神経節、網膜神経節、上頚神経節など、インビトロ培養下において神経突起を伸長する神経細胞であればどのような神経細胞でも用いることができる。培養条件としては、神経突起の伸長を観察でき、セマフォリンの活性が測定できる条件であれば、特に制限されるものではない。
【００８５】
本発明におけるセマフォリン阻害剤の作用機序は、以下のように考えられる。すなわち、セマフォリンの神経突起伸長抑制活性あるいは成長円錐退縮活性の発現は、まずセマフォリンが神経細胞表面（成長円錐）上のレセプターに結合することに始まる。セマフォリンの結合したレセプターから細胞内にシグナルが伝達され最終的にアクチン繊維の脱重合が惹起され、その結果として神経突起伸長抑制、成長円錐退縮が生じる。セマフォリン活性阻害はこれら一連の反応のいずれかの部分を阻害・遮断することで達成される。上記セマフォリンのレセプターとしては、前述のセマフォリンのいずれかのレセプターであればよく、セマフォリンが結合することができれば、その改変体や、その一部のコンポーネントであってもよい。具体的には、ニューロピリン−１、プレキシン（国際公開WO01/405457）等が例示される。そして、本発明のセマフォリン阻害剤は、作用機序により限定されるものではなく、また上記の作用機序において、いずれの段階を阻害するものであっても本発明の範疇に含まれる。すなわち、上記セマフォリンのレセプター結合からアクチン繊維脱重合までに至る細胞内情報伝達に関わる反応を阻害することによりセマフォリン活性を阻害する化合物もまた、本発明の範疇に含まれる。なお、セマフォリンのレセプター結合阻害活性を測定する方法としては、当業者により適宜選択される方法であればどのような方法であってもよく、例えば、前述の抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質を融合したセマフォリン、あるいはヒスタグや、フラグなどのタグを付けたセマフォリンを、被験物質存在下において当該セマフォリンレセプターあるいはレセプターコンポーネントを発現する細胞に対して結合させることで、セマフォリンのレセプター結合阻害活性を測定する方法を例示することができる。
【００８６】
前記一般式（１）及び（１２）〜（２０）において、Ｒ１は水素原子もしくはカルボキシル基を表し、好ましくはカルボキシル基を表す。また、Ｒ２は水素原子もしくは水酸基を表し、好ましくは水酸基を表す。
【００８７】
前記一般式（１）、（１２）〜（１５）、及び（１７）〜（１９）において、Ｒ５は水素原子もしくはカルボキシル基を表し、好ましくはカルボキシル基を表す。また、Ｒ６は水素原子もしくは水酸基を表し、好ましくは水酸基を表す。
【００８８】
前記一般式（１８）において、Ｒ８は水素原子もしくは水酸基を表し、好ましくは水酸基を表す。
【００８９】
本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物として、具体的には、後述する本件明細書実施例に記載された化合物を例示することができる。
【００９０】
前記一般式（１）、及び（１２）〜（２０）のいずれかで表される化合物、またはその薬学上許容される塩は、本発明者らが大阪府内土壌より分離したペニシリウム属に属するカビ、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物より、ＳＰＦ−３０５９株の培養物からセマフォリン阻害活性を指標とする等して、得ることができる。
該ＳＰＦ−３０５９株は次のような菌学的性質を有する。
【００９１】
（a）培養的・形態的性質
麦芽エキス寒天培地上で、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径２．８〜２．９ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色又は黄色、コロニー裏面は濃い黄色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。ポテト・グルコース寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径３．２〜３．３ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面の色は白色又はクリーム色、コロニー裏面は濃い黄色又は黄褐色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。ツアペック寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径３．１〜３．２ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色又は灰色、コロニー裏面はクリーム色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。オートミール寒天培地（日本製薬製放線菌培地No.3「ダイゴ」）上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径２．０〜２．１ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色、灰緑色又は黄色、コロニー裏面はクリーム色又は灰色であり、可溶性色素の産生は認められないが、分生胞子を形成する。分生子柄は平滑、長さ５〜２０μｍであり、分生子柄の先端に３〜６個のフィアライドを単輪生する。フィアライドは長さ３〜４μｍであり、その先端から分生子が２〜１０個の連鎖を形成する。分生子は球形で、直径２．２〜２．４μｍ、表面には縦に通常１０本のしわがある。テレオモルフは認められない。
【００９２】
（b）生理学的性質
１．生育ｐＨ範囲
サブローブロス中、２７℃、３日間の振盪培養における生育は次の通り。
ｐＨ 生育
３．１ −
４．５ ＋
５．５ ＋＋
７．１ ＋＋＋
８．０ ＋＋
９．０ ±
１０．０ −
２．生育温度範囲
オートミール寒天培地上、３８℃、５日間の培養で生育が認められる。
【００９３】
以上の菌学的性質より、本菌株をペニシリウム属に属する菌株であると同定し、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９と命名した。本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３として寄託されている。
【００９４】
上記ＳＰＦ−３０５９株の培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養又は通気撹拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が用いられ、また窒素源としては、例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティープリカー、ヒスチジン等のアミノ酸類等の有機窒素源や、アンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が用いられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を添加しても良い。なお、培養期間中に、シリコン油、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を添加することも可能である。そして、培養温度としては、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度を挙げることができ、培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲を挙げることができ、培養期間としては例えば、５〜１０日間の範囲を例示することができる。
【００９５】
本発明の一般式（１）及び（１２）〜（２０）のいずれかで表される化合物を培養液から単離・精製するには、微生物の生産する二次代謝物の培養物から、通常使用される単離・精製手段を用いることができる。培養液上清から目的物を単離・精製する場合は、培養濾液からの通常の単離・精製法、例えば溶媒抽出、イオン交換樹脂、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー等を用いることができ、これらの単離・精製法は単独又は組み合わせて行うことができる。また、培養菌体から目的物を単離・精製する場合は、濾過又は遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトン、メタノール等の水溶性有機溶媒を用いて直接抽出することができ、抽出物は培養液上清からの単離・精製と同様の方法で、目的化合物を得ることができる。該目的化合物は、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル等の適当な溶媒を用いて、約１当量の塩基を作用させることによって、塩とすることもできる。
【００９６】
また、本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物においては、それらの塩、好ましくは医薬的又は獣医薬的に許容される塩も本発明の範疇に含まれる。ここで、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩や、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩や、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸塩などを挙げることができる。
【００９７】
本発明の脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤は、神経伸長反発因子阻害剤、特に上記セマフォリン阻害剤を有効成分とする前記の神経再生促進剤を含有するものであれば特に制限されるものではないが、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００９８】
投与量及び投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、病床部位に局所的に投与する方法が好ましい。神経の再生には通常数日から数ヶ月以上の期間を要するので、その間セマフォリンの活性を抑制するために１回又は２回以上投与することが好ましい。２回以上投与するときは連日あるいは適当な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。投与量は一回当たりセマフォリン阻害剤として数百μｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ以下を用いることができ、投与回数を減らすために徐放性製剤を用いたり、オスモティックポンプなどで長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。そして、これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてセマフォリンの活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。
【００９９】
上記脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患としては、末梢神経や中枢神経の傷害、変性疾患、すなわち老化等に起因する嗅覚異常症、脊髄損傷などの外傷による嗅覚以外の神経傷害、脳梗塞などに起因する神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病やパーキンソン病、ＡＬＳといった神経変性疾患、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、外傷性神経変性疾患などを具体的に挙げることができる。さらに、受容体がニューロピリンである点が共通であるＶＥＧＦ１６５が関与する血管新生を伴う疾患も、対象となる。
【０１００】
また、本発明の神経再生促進剤の用途は、神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤等の医薬品に限定されることなく、動物薬、さらにはセマフォリンシグナル阻害剤として産業上重要な実験試薬としても利用が可能である。本発明の神経再生促進剤はセマフォリン阻害剤を有効成分として含むことから、末梢神経である嗅神経の再生や、脳や脊髄の中の嗅球、大脳皮質、海馬、線条体、視床、間脳、中脳、小脳、橋、延髄、精髄、網膜などにあって脳脊髄関門で区切られた領域である中枢内での神経の再生を促進する。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】
（本発明の化合物の製造）
グルコース２％、ショ糖５％、綿実粉２％、硝酸ナトリウム０．１％、Ｌ−ヒスチジン０．１％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カリウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１４％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地１０ｍｌを５０ｍｌ容の三角フラスコに分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３）を１白金耳接種し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前々培養とした。５００ｍｌ容三角フラスコ５本に上記と同じ組成の培地を１２５ｍｌずつ分注しオートクレーブで滅菌した後、上記の前々培養液を４ｍｌずつ添加し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前培養とした。５０リットル容ジャーファーメンターに、グルコース１．４３％、ショ糖３．５７％、綿実粉１．４３％、硝酸ナトリウム０．０７％、Ｌ−ヒスチジン０．０７％、リン酸２カリウム０．０３６％、塩化カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１％、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製消泡剤）０．０１％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地を３０リットル分注し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）した後、上記の前培養液を５００ｍｌ添加し、２７℃、４００ｒｐｍ、通気量１５リットル／分にて９日間通気攪拌培養した。
【０１０３】
培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清液と菌体に分離した。菌体画分を３０リットルのアセトンで抽出し、濾過、濃縮後、水溶液となったところで１０リットルの酢酸エチル−蟻酸（９９：１）で２回抽出した。抽出液を減圧濃縮して粗抽出物１３０ｇを得た。これを２００ｍｌのメタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、油状物９１．４ｇを得た。これを２００ｍｌのメタノールに溶解し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、粗精製物４１．９ｇを得た。これを５００ｍｇずつ２．５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、分取逆相ＨＰＬＣに付した。分取逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ−II５Ｃ１８ＨＧｐｒｅｐ（φ５×１０ｃｍとφ５×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合４５％から７５％へ２時間の直線的グラジエント、流速：２５ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とし、溶出液を１分ずつ分取した。
【０１０４】
上記分取した画分を分析用ＨＰＬＣで分析した。分析用ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｗａｋｏｓｉｌ−II５Ｃ１８ＲＳ（φ４．６×１５０ｍｍ、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合２０％から６７％へ７１．１分間の直線的グラジエント、流速：１．３ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とした。この分析用ＨＰＬＣにおける保持時間を指標に分取用ＨＰＬＣの溶出画分を集め、減圧下に溶媒を留去した後、再度分取用ＨＰＬＣに付して上記と同様に精製し、さらにＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付して上記と同様に精製し、溶媒を減圧留去、乾燥することにより、以下に示す精製品を得た。
【０１０５】
表１
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
化合物 取得量(ｍｇ) 分析用HPLCでの保持時間(分)
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＰＦ−３０５９−８ １１．１ ５１．２
ＳＰＦ−３０５９−１０ ３．３ ５４．８
ＳＰＦ−３０５９−１６ ６．７ ４１．５
ＳＰＦ−３０５９−１７ ７．９ ５７．０
ＳＰＦ−３０５９−１８ １．６ ５１．５
ＳＰＦ−３０５９−１９ ７．８ ３９．６
ＳＰＦ−３０５９−２０ １．３ ４５．５
ＳＰＦ−３０５９−２２ １．０ ４８．４
ＳＰＦ−３０５９−２３ １６．７ ３３．２
ＳＰＦ−３０５９−３１ ６．５ ４９．６
ＳＰＦ−３０５９−３８ ４．０ ６３．１
ＳＰＦ−３０５９−４０ ２．３ ５３．７
ＳＰＦ−３０５９−４１ １．０ ５４．０
ＳＰＦ−３０５９−４２ ２．４ ４８．２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【０１０６】
得られた化合物の物理化学的性状は次の通り。
【０１０７】
（ＳＰＦ−３０５９−８）
外観：クリーム色粉末
分子量：５７８
分子式：Ｃ２８Ｈ１８Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５７９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５７６（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５７９．０７７９
計算値：５７９．０７７５（Ｃ２８Ｈ１９Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
220(45700)、305(18200)、358(16800)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3414、1652、1568、1464、1614、1289
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.75(3H,s)、2.21(3H,s)、3.06(1H,d,18.8)、3.41(1H,d,18.8)、4.72(1H,d,13.6)、5.02(1H,d,13.6)、6.16(1H,s)、6.17(1H,s)、6.84(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
18.7、26.9、38.2、62.0、62.1、101.1、102.1、104.8、112.3、112.6、113.3、113.5、116.6、119.1、119.4、141.4、143.7(2Ｃ)、145.0、149.9、152.0、154.7、159.4、164.6、167.3、167.7、170.9、174.8
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−８の構造式を、次式と決定した。
【０１０８】
【化２１】
【０１０９】
（ＳＰＦ−３０５９−１０）
外観：黄色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：５４４
分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４５（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４３（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５４５．０７３２
計算値：５４５．０７４０（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(41700)、286(29500)、338sh(14900)、429sh(6500)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3358、3073、1700、1674、1631、1464、1276、1248
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図１に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図２に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１１０】
（ＳＰＦ−３０５９−１６）
外観：クリーム色粉末
分子量：５８０
分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５８１（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５７９（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：５７９．０８１２
計算値：５７９．０７７６（Ｃ２８Ｈ１９Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
210(44500)、323(15000)、353sh(12000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3420、1694、1668、1634、1568、1464、1278
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.88(3H,s)、2.08(3H,s)、2.28(1H,d,16.6)、2.34(1H,d,16.6)、4.07(1H,d,10.1)、4.17(1H,s)、4.42(1H,d,10.1)、6.29(1H,s)、6.93(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
21.1、24.2、30.4、50.1、50.4、64.9、69.3、102.3、104.1、110.6、111.6、112、119.0、121.6、138.7、139.4、141.6、147.1、148.0、150.4、152.1、160.4、162.6、167.7、171.3、174.3、198.6、201.3
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１６の構造式を、次式と決定した（立体は相対立体配置）。
【０１１１】
【化２２】
【０１１２】
（ＳＰＦ−３０５９−１７）
外観：黄色粉末
分子量：５７８
分子式：Ｃ２８Ｈ１８Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５７９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５７７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：５７７．０６７５
計算値：５７７．０６１９（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
214(49400)、301(8900)、390(22100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3109、1656、1564、1459、1272
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.89(3H,s)、2.46(3H,s)、4.85(1H,d,13.3)、4.92(1H,d,13.3)、5.52(1H,s)、6.42(1H,s)、6.65(1H,s)、6.88(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
17.1、20.2、61.9、71.9、91.8、102.8、103.0(2Ｃ)、103.5、111.0、112.6、117.6、119.2、122.9、139.4、143.3、149.2、150.4、151.2、151.7、154.4、159.1、163.4、165.6、167.8、168.6、170.9、172.9
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１７の構造式を、次式と決定した。
【０１１３】
【化２３】
【０１１４】
（ＳＰＦ−３０５９−１８）
外観：オレンジ色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：５６０
分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５５９（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５６１．０７１０
計算値：５６１．０６７０（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
219(34300)、257(28900)、311(28600)、404(14600)、450(14400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3154、1657、1605、1468、1279
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図３に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図４に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１１５】
（ＳＰＦ−３０５９−１９）
外観：黄色粉末
分子量：５９６
分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１５
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５９７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５９５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５９７．０８９０
計算値：５９７．０８８１（Ｃ２８Ｈ２１Ｏ１５）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
204(34600)、225(30900)、267sh(8300)、319(17100)、349(13800)、404(10100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3418、1634、1605、1462、1270
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.43(3H,s)、1.55(3H,s)、2.94(1H,d,5.5)、3.17(1H,d,18.6)、3.24(1H,d,18.6)、4.38(1H,d,11.9)、4.54(1H,d,11.9)、5.27(1H,d,5.5)、5.84(1H,s)、6.59(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
24.5、28.7、36.6、49.4、62.1、64.2、96.8、99.6、102.0、102.6、103.0、104.0、111.1、120.2(2C)、113.1、137.3、146.5、150.8、151.8、152.0、153.0、159.2、161.3、167.7、169.8、172.6、185.4
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１９の構造式を、次式と決定した。
【０１１６】
【化２４】
【０１１７】
（ＳＰＦ−３０５９−２０）
外観：黄色粉末
分子量：５６２
分子式：Ｃ２８Ｈ１８Ｏ１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６３（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５６３．０８８２
計算値：５６３．０８２６（Ｃ２８Ｈ１９Ｏ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
216(49100)、301(21700)、369(14200)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3444、3069、1690、1649、1619、1536、1435、1283
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.76(3H,s), 2.21(3H,s), 3.09(1H,d,18.8), 3.43(1H,d,18.8), 4.75(1H,d,13.4), 5.03(1H,d,13.4), 6.17(1H,s),6.18(1H,s), 6.75(1H,d,2.1), 6.83(1H,d,2.1)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
18.7, 27.0, 38.3, 61.8, 62.2, 101.0, 102.9, 104.8, 112.3, 112.7, 113.1, 113.3, 113.4, 117.4, 119.2, 136.3, 141.1, 143.7, 145.1, 154.7, 156.9, 160.2, 161.9, 164.7, 167.3, 169.3, 170.8, 174.9
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２０の構造式を、次式と決定した。
【０１１８】
【化２５】
【０１１９】
（ＳＰＦ−３０５９−２２）
外観：クリーム色粉末
分子量：５４８
分子式：Ｃ２７Ｈ１６Ｏ１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：５４７．０５６８
計算値：５４７．０５１３（Ｃ２７Ｈ１５Ｏ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
208(51900)、240sh(43900)、270sh(38000)、310(30700)、387(18000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3410、3068、1655、1619、1599、1561、1460、1310、1251
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.34(3H,s)、2.73(3H,s)、6.31(1H,s)、6.98(1H,s)、8.08(1H,s)、8.69(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
17.1、32.3、98.1、101.8、102.6、113.3、117.1、119.8、123.2、125.4、126、131.9、136.2、140.4、142.1、144.7、150.4、152.7、152.9、154.8、156.2、160.4、167.1、172.1、178.9、192.7、202.4
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２２の構造式を、次式と決定した。
【０１２０】
【化２６】
【０１２１】
（ＳＰＦ−３０５９−２３）
外観：黄色粉末
分子量：６８６
分子式：Ｃ３４Ｈ２２Ｏ１６
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６８７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６８５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−：
実測値：６８５．０８８７
計算値：６８５．０８３０（Ｃ３４Ｈ２１Ｏ１６）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(53800)、282sh(24100)、324(21700)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3354、1688、1588、1468、1288
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.14(3H,s), 2.21(3H,s), 2.61(3H,brs), 6.50(1H,s), 6.85(1H,s), 7.28(1H,brs), 7.68(1H,brs), 8.29(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
30.2, 31.3, 32.3, 102.4, 107.3, 110.0, 114.7, 114.9, 119.7, 120.5, 123.8, 125.9, 126.4, 126.5, 132.6, 135.6, 136.1, 136.7, 139.5, 141.0, 143.4, 145.6, 147.8, 150.4, 151.8, 154.1, 160.5, 167.5, 170.5, 172.7, 197.9, 200.4, 201.2, 202.0
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２３の構造式を、次式と決定した。
【０１２２】
【化２７】
【０１２３】
（ＳＰＦ−３０５９−３１）
外観：黄色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：６６８
分子式：Ｃ３４Ｈ２０Ｏ１５
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６６９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６６７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：６６９．０８８７
計算値：６６９．０８８１（Ｃ３４Ｈ２１Ｏ１５）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(54600)、235sh(39400)、312(31300)、350(24200)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3348、1766、1707、1644、1588、1464、1301
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図５に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図６に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１２４】
（ＳＰＦ−３０５９−３８）
外観：黄色粉末
分子量：６５４
分子式：Ｃ３４Ｈ２２Ｏ１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６５５（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６５３（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：６５５．１１００
計算値：６５５．１０８８（Ｃ３４Ｈ２３Ｏ１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
212(41100)、239sh(34000)、287(22200)、300sh(21900)、328(24400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3418、1696、1660、1607、1471、1283
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.30(1H,m)、2.36(1H,m)、2.65(3H,s)、2.81(1H,m)、2.96(1H,m)、3.00(3H,s)、4.56(1H,d,11.8)、4.75(1H,d,11.8)、6.43(1H,s)、7.07(1H,s)、8.15(1H,d,9.2)、8.73(1H,d,9.2)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
21.7、23.3、26.6、32.9、56.9、71.3、102.3、102.5、107.9、110.2、117.4、119.4、121.2、122.22、122.24、124.0、127.1、134.3、136.1、138.1、141.7、141.8、142.1、150.1、154.0、154.1、154.6、155.6、167.7、167.9、173.1、189.5、197.5、207.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３８の構造式を、次式と決定した。
【０１２５】
【化２８】
【０１２６】
（ＳＰＦ−３０５９−４０）
外観：オレンジ色粉末
分子量：５３６
分子式：Ｃ２７Ｈ２０Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３７．１０１８
計算値：５３７．１０３４（Ｃ２７Ｈ２１Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
209(34100)、223(34200)、277(19900)、340(11600)、460(25000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3361、1698、1620、1465、1293
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
1.95(3H,s), 2.34(1H,d,16.8), 2.63(3H,s), 3.22(1H,d,16.8), 4.04(1H,d,10.8), 4.51(1H,d,10.8), 5.78(1H,s), 6.27(1H,s), 6.76(1H,s), 6.78(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
23.7, 24.4, 32.0, 50.6, 71.9, 98.4, 102.5, 104.5, 109.0, 109.3, 111.9, 112.7, 118.8, 125.0, 135.4, 141.2, 143.0, 149.7, 151.1, 152.0, 152.6, 155.8, 168.3, 172.5, 189.0, 197.0, 204.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−４０の構造式を、次式と決定した。
【０１２７】
【化２９】
【０１２８】
（ＳＰＦ−３０５９−４１）
外観：黄色粉末
物質の性質：酸性物質
分子量：５４８
分子式：Ｃ２８Ｈ２０Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５４９．１００２
計算値：５４９．１０３４（Ｃ２８Ｈ２１Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
227(30200)、282sh(13500)、315(13900)、356(11000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3396、1688、1662、1622、1470、1294
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図７に示す。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図８に示す。
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【０１２９】
（ＳＰＦ−３０５９−４２）
外観：黄色粉末
分子量：８０６
分子式：Ｃ４１Ｈ２６Ｏ１８
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：８０７（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：８０５（Ｍ−Ｈ）−
高分解能マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＨＲＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：８０７．１２６１
計算値：８０７．１１９８（Ｃ４１Ｈ２７Ｏ１８）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
221(58300)、316(28000)、353(23100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
3400、1704、1651、1620、1444、1294
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
2.08(3H,s)、2.10(3H,s)、2.51(3H,s)、3.47(1H,d,15.9)、3.54(1H,d,15.9)、4.48(1H,d,13.1)、4.65(1H,d,13.1)、6.28(1H,s)、6.84(1H,s)、6.89(1H,s)、7.40(1H,s)、8.12(1H,s)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
16.5、17.1、19.1、31.9、61.8、102.1、102.9(2Ｃ)、103.4、108.7、109.2、111.5、113.5、118.5、119.1(2Ｃ)、119.7、122.0、127.8、128.9、131.2、139.1(2Ｃ)、141.7、144.2、150.0、154.0(2Ｃ)、150.5、150.6、150.7、152.0、152.3、158.9、160.9、167.8、167.9、173.1、173.3、175.0、202.5
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
これらからＳＰＦ−３０５９−４２の構造式を、次式と決定した。
【０１３０】
【化３０】
【実施例２】
【０１３１】
（Ｓｅｍａ３Ａのコラプス活性に対する本発明の化合物の抑制作用）
ポリリジンを塗布した９６ウェルプレート（住友ベークライト）にさらにラミニン塗布（２０μｇ／ｍｌのラミニン、室温１時間）を行った。各ウェルに１００μｌの培地（１０％の牛胎仔血清、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＦ１２培地）を入れ、ここに７日齢ニワトリ胚から摘出した後根神経節を接種し、１６〜２０時間５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。その後、対象化合物を種々の濃度で培地に添加し１時間培養後、３ユニット／ｍｌのマウスセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）を添加し、更に１時間培養した。１時間経過後、速やかに最終濃度１％になるようにグルタルアルデヒドを添加し、室温に１５分間放置して組織片を固定した後、顕微鏡下で退縮した成長円錐の割合を測定した。陰性対照群（化合物、Ｓｅｍａ３Ａ共に不添加）の成長円錐退縮割合を(Ａ)％、陽性対照群（化合物不添加、Ｓｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮割合を(Ｂ)％、試験群（各化合物及びＳｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮割合を(Ｃ)％として、Ｃ＝(Ａ＋Ｂ)／２となる各化合物の濃度をＩＣ５０値とした。結果を以下に示す。この結果から、本発明の化合物は強くセマフォリンを阻害することがわかる。
【０１３２】
表２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
化合物 ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＰＦ−３０５９−８ ２
ＳＰＦ−３０５９−１０ ２
ＳＰＦ−３０５９−１６ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−１７ ０．１３
ＳＰＦ−３０５９−１８ ０．０６３
ＳＰＦ−３０５９−１９ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−２０ ４
ＳＰＦ−３０５９−２２ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−２３ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−３１ ０．２５
ＳＰＦ−３０５９−３８ ０．０１３
ＳＰＦ−３０５９−４０ ０．１２５
ＳＰＦ−３０５９−４１ ０．２５
ＳＰＦ−３０５９−４２ ０．０６３
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【実施例３】
【０１３３】
（本発明の化合物の塩の製造）
本発明の化合物をメタノールに溶解して１ｍＭ溶液を調製する。この溶液１ｍｌに、１ｍＭ水酸化ナトリウムのメタノール溶液を、本発明の化合物が２個のカルボキシル基を持つ場合は２ｍｌ、本発明の化合物が１個のカルボキシル基を持つ場合は１ｍｌ加え、十分に混合する。この溶液を減圧下に溶媒を留去、乾燥し、本発明の化合物のナトリウム塩１μｍｏｌを得る。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の化合物は、セマフォリン阻害活性を有し、各種神経障害性疾患・神経変性疾患に対する予防剤や治療剤として有利に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１８）：
（式中、Ｒ１、Ｒ５およびＲ７は、独立して、水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８は、独立して、水素原子または水酸基を表す。）
で表される化合物、またはその薬学上許容される塩。
【請求項２】
一般式（１８）において、Ｒ１およびＲ５はカルボキシル基であり、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８が水酸基である、請求項１記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【請求項３】
一般式（１８）において、Ｒ７が水素原子である、請求項２記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の化合物、またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
【請求項５】
セマフォリンが、クラス３型セマフォリンであることを特徴とする、請求項４記載のセマフォリン阻害剤。
【請求項６】
クラス３型セマフォリンが、セマフォリン３Ａであることを特徴とする、請求項５記載のセマフォリン阻害剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経伸長反発因子阻害剤。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する薬剤。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経再生促進剤。
【請求項１０】
ペニシリウム属に属する微生物を培養して、その培養物から化合物を採取することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の化合物、またはその薬学上許容される塩の製造方法。
【請求項１１】
ペニシリウム属に属する微生物が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３として寄託されたペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＳＰＦ−３０５９株であることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１】
一般式（１８）：
（式中、Ｒ１、Ｒ５およびＲ７は、独立して、水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８は、独立して、水素原子または水酸基を表す。）
で表される化合物、またはその薬学上許容される塩。
【請求項２】
一般式（１８）において、Ｒ１およびＲ５はカルボキシル基であり、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８が水酸基である、請求項１記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【請求項３】
一般式（１８）において、Ｒ７が水素原子である、請求項２記載の化合物、またはその薬学上許容される塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の化合物、またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
【請求項５】
セマフォリンが、クラス３型セマフォリンであることを特徴とする、請求項４記載のセマフォリン阻害剤。
【請求項６】
クラス３型セマフォリンが、セマフォリン３Ａであることを特徴とする、請求項５記載のセマフォリン阻害剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経伸長反発因子阻害剤。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する薬剤。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、神経再生促進剤。
【請求項１０】
ペニシリウム属に属する微生物を培養して、その培養物から化合物を採取することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の化合物、またはその薬学上許容される塩の製造方法。
【請求項１１】
ペニシリウム属に属する微生物が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３として寄託されたペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＳＰＦ−３０５９株であることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−４６７３４（Ｐ２０１１−４６７３４Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４６９６５（Ｐ２０１０−２４６９６５）
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【分割の表示】特願２００９−２３５５８０（Ｐ２００９−２３５５８０）の分割
【原出願日】平成１５年１月２２日（２００３．１．２２）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【分割の表示】特願２００９−２３５５８０（Ｐ２００９−２３５５８０）の分割
【原出願日】平成１５年１月２２日（２００３．１．２２）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]