本発明は、阻害の程度、標的セリンプロテアーゼによるセリンプロテアーゼインヒビターの切断後の阻害の維持、セリンプロテアーゼへの結合速度、中和及び結合親和性を含む種々の所望の特性のいずれか1つを獲得又は増強するためにセリンプロテアーゼインヒビターを改変する方法に関する。本発明はまた、かかる改変の産物、及びかかる産物の使用、特にそれらの治療における使用に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的セリンプロテアーゼ（SP）の阻害の増大を示す改変型セリンプロテアーゼインヒビター（SPI）の作製方法であって、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるようにSPIを改変するステップを含む方法。
【請求項２】
標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基をSPIへ導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
阻害持続時間の延長を示す改変型SPIを作製する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
1以上の導入されるアミノ酸残基が置換又は挿入により導入される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
標的SPの触媒3残基における1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基を含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
1以上の導入されるアミノ酸がメチオニン-ヒスチジン配列を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
1以上の導入されるアミノ酸がメチオニン-ヒスチジン-リジン配列を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
1以上の導入されるアミノ酸がメチオニン-ヒスチジン-リジン-トレオニン配列を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
標的セリンプロテアーゼの触媒3残基における、変位させられる1以上の残基が触媒セリン残基を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
SPIを中和することが可能なようにSPIを改変するステップであって、SPIへのイオン電荷の領域の導入を含むステップ、をさらに含み、該イオン電荷の領域が中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なものである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
導入されるイオン電荷の領域が、SPIのカルボキシ末端に対して導入される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
導入されるイオン電荷の領域がアニオン電荷の領域である、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
導入されるイオン電荷の領域が1以上の酸性残基を含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
1以上の酸性残基が1以上のグルタミン酸(glutamine)残基を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
中和剤が硫酸プロタミンである、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
SPIがトロンビンインヒビターである、請求項1〜15のいずれか1項に記載のSPIの改変方法。
【請求項１７】
SPIが配列番号14及び17〜153のいずれか1つからなる群より選択される、請求項16に記載のSPIの改変方法。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法により得ることができる又は得られた改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物。
【請求項１９】
SPIがトロンビンインヒビターである、請求項18に記載の改変型SPI。
【請求項２０】
コンセンサス配列：
N末端ペプチド) -X₁-H-X₂-(G)_n- (エキソサイトI 結合ペプチド) (配列番号771)
を含む、請求項19に記載の改変型SPI。
【請求項２１】
配列番号158〜770のいずれか1つから選択される配列を含む若しくはそれからなる請求項19若しくは20に記載の改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物。
【請求項２２】
請求項18〜21のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子、又は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて請求項18〜21のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子。
【請求項２３】
請求項22に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２４】
請求項23に記載のベクター又は請求項22に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２５】
被験者に請求項18〜21のいずれか1項に記載の改変型SPIを投与することを含む、標的SPの阻害方法。
【請求項２６】
血液凝固障害に罹患している被験者を治療する又は血液凝固障害の発症から被験者を予防する方法であって、請求項19に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与することを含む方法。
【請求項２７】
被験者においてトロンビン阻害を中和する方法であって、
（a）請求項19に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与するステップ、
（b）続いて、トロンビン阻害の中和が生じるのに十分な量の硫酸プロタミンを被験者に投与するステップ
を含む方法。
【請求項２８】
標的SPIの阻害の増大を示す改変型SPIであって、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるものである、改変型SPI。
【請求項２９】
標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基を含む、請求項28に記載の改変型SPI。
【請求項３０】
阻害持続時間の延長を示す、請求項29に記載の改変型SPI。
【請求項３１】
標的SPの触媒3残基における1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基を含む、請求項29に記載の改変型SPI。
【請求項３２】
標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がメチオニン-ヒスチジン配列を含む、請求項29に記載の改変型SPI。
【請求項３３】
標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がメチオニン-ヒスチジン-リジン配列を含む、請求項32に記載の改変型SPI。
【請求項３４】
標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がメチオニン-ヒスチジン-リジン-トレオニン配列を含む、請求項33に記載の改変型SPI。
【請求項３５】
標的セリンプロテアーゼの触媒3残基における、変位させられる1以上のアミノ酸残基が触媒セリン残基を含む、請求項28〜34のいずれか1項に記載の改変型SPI。
【請求項３６】
中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なイオン電荷の領域をさらに含む、請求項28〜34のいずれか1項に記載の改変型SPI。
【請求項３７】
イオン電荷の領域が、SPIのカルボキシ末端に対して配置されている、請求項36に記載の改変型SPI。
【請求項３８】
イオン電荷の領域がアニオン電荷の領域である、請求項36に記載の改変型SPI。
【請求項３９】
イオン電荷の領域が1以上の酸性残基を含む、請求項36に記載の改変型SPI。
【請求項４０】
1以上の酸性残基が1以上のグルタミン酸（glutamine）残基を含む、請求項39に記載の改変型SPI。
【請求項４１】
中和剤が硫酸プロタミンである、請求項36〜40のいずれか1項に記載の改変型SPI。
【請求項４２】
SPIがトロンビンインヒビターである、請求項28〜41のいずれか1項に記載の改変型SPI。
【請求項４３】
コンセンサス配列：N末端ペプチド) -X₁-H-X₂-(G)_n- (エキソサイトI 結合ペプチド) (配列番号771)
を含む、請求項42に記載の改変型SPI。
【請求項４４】
配列番号158〜770のいずれか1つから選択される配列を含む若しくはそれからなる改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物。
【請求項４５】
請求項28〜44のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子、又は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて請求項28〜44のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子。
【請求項４６】
請求項45に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項４７】
請求項46に記載のベクター又は請求項45に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項４８】
請求項28〜44のいずれか1項に記載の改変型SPIを投与することを含む、標的SPの阻害方法。
【請求項４９】
血液凝固障害に罹患している被験者を治療する又は血液凝固障害の発症から被験者を予防する方法であって、請求項42に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与することを含む方法。
【請求項５０】
被験者においてトロンビン阻害を中和する方法であって、
（a）請求項42に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与するステップ、
（b）続いて、トロンビン阻害の中和が生じるのに十分な量の硫酸プロタミンを被験者に投与するステップ
を含む方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【公表番号】特表２０１２−５２５８３６（Ｐ２０１２−５２５８３６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０９０８２（Ｐ２０１２−５０９０８２）
【出願日】平成２２年５月５日（２０１０．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００８８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８２８５
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０８１３３２７１）
【Ｆターム（参考）】