セルロースの糖化力が増強された酵母
【課題】酵母によるセルロースの糖化力を増強する手段の提供。
【解決手段】特定の塩基配列で示されるＤＮＡを含む、セロビオヒドロラーゼ１をコードする遺伝子。該遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母。該形質転換酵母とセルロースとを反応させる、セルロースの糖化方法。
【解決手段】特定の塩基配列で示されるＤＮＡを含む、セロビオヒドロラーゼ１をコードする遺伝子。該遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母。該形質転換酵母とセルロースとを反応させる、セルロースの糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースの糖化力が増強された酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースからエタノールを生産するために、セルロース分解酵素を表層提示させた酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いて、セルロースからのグルコースへの糖化およびグルコースを基質とするエタノール発酵の両方を同時に行う、糖化同時発酵の試みがなされている。例えば、セルロースを糖化する酵素群を表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている（特許文献１および２）。エタノール生産の増大のために、酵母によるセルロースの糖化力の増強が求められている。
【０００３】
セルロースを糖化する酵素群として、サッカロマイセス・セレビシエで表層提示するために、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来のエンドグルカナーゼEGIIおよびセロビオヒドロラーゼCBH2が用いられてきた。トリコデルマ・リーセイは、セロビオヒドロラーゼとしてCBH1も有する。
【０００４】
担子菌であるファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）もまた、CBH1を有する。ファネロカエテ・クリソスポリウムは、白い糸状の外観を呈し、リグニン分解能が非常に強く、木を脱色しながら不朽させる白色不朽菌の代表的な菌である。非特許文献１には、酵母によるセルロースの分解を目的として、ファネロカエテ・クリソスポリウム由来CBH1をサッカロマイセス・セレビシエで分泌発現させたことが記載されている。ファネロカエテ・クリソスポリウムのCBH1には、いくつかのアイソザイムが存在することが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０１／７９４８３号
【特許文献２】特開２００８−８６３１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】P. Van Rensburgら, Yeast, 1998年, 14(1)巻, 67-76頁
【非特許文献２】P.F. Simsら, Mol. Microbiol., 1994年, 12(2)巻, 209-216頁
【非特許文献３】N. Satoら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002年, 60巻, 469-474頁
【非特許文献４】T. Matumotoら，Appl. Environ. Microbiol., 2002年, 68巻, 4517-4522頁
【非特許文献５】R. Akadaら, Yeast, 2006年, 23巻, 399-405頁
【非特許文献６】Y. Fujitaら, Appl. Environ. Microbiol., 2002年, 68巻, 5136-5141頁
【非特許文献７】P. N. Lipkeら, Mol. Cell. Biol., 1989年, 9(8)巻, 3155-3165頁
【非特許文献８】Y. Fujitaら, Appl. Environ. Microbiol., 2004年, 70巻, 1207-1212頁
【非特許文献９】Roseら, Methods in Yeast genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY 1990年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、酵母によるセルロースの糖化力を増強する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含む、セロビオヒドロラーゼ１をコードする遺伝子を提供する。
【０００９】
１つの実施態様では、上記セロビオヒドロラーゼ１はセロビオヒドロラーゼ１．１である。
【００１０】
本発明はまた、上記遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母を提供する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。
【００１２】
１つの実施態様では、上記酵母は、上記セロビオヒドロラーゼ１が表層提示されている。
【００１３】
本発明はさらに、セルロースの糖化方法を提供し、この方法は、上記形質転換酵母とセルロースとを反応させる工程を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、セルロースの糖化力が増強された酵母が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cまたはNBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を分解して生じたグルコース量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の遺伝子は、配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含み、セロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）をコードする。本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいてＤＮＡ合成機などにより合成され得る。より具体的には、本発明の遺伝子は、それらの領域が配列番号１の塩基配列の全長をカバーし得るように設計した１００ｂｐ程度のオリゴＤＮＡを合成し、これらのオリゴＤＮＡをＰＣＲなどによって連結することで取得し得る。本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列で示される。
【００１７】
本発明は、上記遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母をさらに提供する（本明細書では、「本発明の形質転換酵母」ともいう）。本発明の形質転換酵母は、以下に説明するようなセルロース加水分解酵素をコードする遺伝子をさらに発現するように形質転換されていてもよい。
【００１８】
セルロース加水分解酵素とは、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素であり得る。β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素としては、代表的には、エンドβ１，４−グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
セルロース加水分解酵素は、任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)）、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。セルロース加水分解酵素生産菌には、担子菌（例えば、ファネロカエテ・クリソスポリウム）もまた含まれる。
【００２０】
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離し得る（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解し得るが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素（以下、「結晶性加水分解酵素」ともいう）の代表例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅くなり得る。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）およびセロビオヒドロラーゼ２（ＣＢＨ２）と称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異によるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来のＣＢＨ１およびＣＢＨ２が知られている。担子菌ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１もまた知られ（非特許文献１）、その遺伝子の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、GenBank L22656.1およびAAA19802.1に記載されている。担子菌ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１のアイソザイムであるＣＢＨ１．１（セロビオヒドロラーゼ１．１）もまた知られ（非特許文献２）、その遺伝子の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、GenBank Z22528およびCAA80253.1に記載されている。ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１．１遺伝子は、配列番号３の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含み、この遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列で示される。配列番号４のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【００２１】
エンドグルカナーゼは、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であり得るが、これに限定されない）を生じ得る。このようなセルロースの単糖または少糖（好ましくは単糖）への分解を、本明細書中では「糖化」ともいう。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルに対する反応性は低い。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）、エンドグルカナーゼIII（ＥＧIII）、エンドグルカナーゼIV（ＥＧIV）、およびエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）と称される。これらの区別はアミノ酸配列の差異によるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。代表的には、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧII）が挙げられる。
【００２２】
β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グルコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）が用いられ得るが、これに限定されない。
【００２３】
セルロース加水分解酵素の遺伝子は、酵素を産生する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。
【００２４】
本発明の遺伝子またはセルロース加水分解酵素をコードする遺伝子を用いて、遺伝子発現カセットを構築し得る。遺伝子発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するプロモーター、ターミネーターなどのいわゆる調節因子を含み得る。プロモーターおよびターミネーターは、発現させる遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものであってもよい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’−リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、発現させる遺伝子に応じて、当業者によって適宜選択され得る。発現カセットは、必要に応じて、さらなる調節因子（例えば、オペレーターおよびエンハンサー）などをさらに含み得る。オペレーター、エンハンサーなどの発現調節因子についても、当業者によって適宜選択され得る。発現カセットは、遺伝子発現の目的に応じて、必要な機能配列をさらに含むこともできる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
【００２５】
遺伝子を含む発現カセットの構築に際して、細胞表層工学の技術が利用され得る。例えば、目的の酵素タンパク質を（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介して細胞表層に提示する方法があるが、これらに限定されない。細胞表層工学の技術は、例えば、特許文献１および２にも記載される。
【００２６】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、Ｆｌｏ１タンパク質（Ｆｌｏ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る：例えば、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、Ｆｌｏ１４６、Ｆｌｏ３１８、Ｆｌｏ４２８など；非特許文献３：なお、Ｆｌｏ１３２６とは、全長Ｆｌｏ１タンパク質を表す）、Ｆｌｏタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず凝集性を利用する、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇ；非特許文献４）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
【００２７】
まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元付近で切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００２８】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００２９】
ここで、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端にある、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列も用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列としては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、発現産物自身の分泌シグナル配列などが好適に用いられる。細胞表層局在タンパク質に融合している目的の酵素タンパク質の活性に影響を及ぼさないのであれば、分泌シグナル配列は、その一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
【００３０】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡが特に有用である。
【００３１】
したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的の酵素タンパク質をコードするＤＮＡに置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素タンパク質を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このため、「α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域」が利用され得る。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示された酵素は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
【００３２】
次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン、ＦＬＯタンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００３３】
この細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）と目的の酵素タンパク質とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；あるいは（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする遺伝子；あるいは（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする第一の遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする第二の遺伝子（但し、第一の遺伝子と第二の遺伝子とは同じでも異なっていてもよい）、を作製することにより、細胞表層に目的の酵素を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡは、一部のみ存在してもよいが、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため（例えば、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇのいずれかを選択できる）、より適切な長さで酵素を細胞表層に提示できる点で、ならびに酵素のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
【００３４】
次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的の酵素タンパク質を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼ（Ｓｕｃ２タンパク質）が挙げられる。目的の酵素タンパク質は、これらのペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
【００３５】
酵母にてタンパク質を細胞外に分泌して発現させる方法は、当業者に周知である。上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、目的の酵素タンパク質の遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し、酵母に導入すればよい。
【００３６】
酵母の細胞内にて遺伝子を発現させる方法もまた、当業者に周知である。この場合、上記細胞表層提示技術や上記分泌シグナルを用いることなく、目的の酵素タンパク質の遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し、酵母に導入すればよい。
【００３７】
各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列と目的の酵素タンパク質の遺伝子との結合は、部位特異的変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断と活性のあるタンパク質の発現とが可能である。
【００３８】
遺伝子または遺伝子発現カセットは、プラスミドの形態のベクターに挿入され得る。ＤＮＡの取得の簡易化の点から、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、上述したような調節配列を含み得る。ベクター作製の出発材料としては、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ori）と大腸菌ColE1の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など））および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。
【００３９】
出発材料のプラスミドの例としては、GAPDHプロモーターおよびGAPDHターミネーターを含むプラスミドpYGA2270またはpYE22m、あるいはUPR-ICL（イソクエン酸リアーゼ上流領域）およびTerm-ICL（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）を含むプラスミドpWI3、PGKプロモーターおよびターミネーターを含むプラスミドpGK406などが挙げられる。プラスミドベクターは、以下の実施例に示すように調製され得る。
【００４０】
本明細書で遺伝子またはＤＮＡの「導入」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入することだけでなく、発現させることも意味する。「形質転換」は、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入して発現させることにより宿主の遺伝的形質を変えること、またはその操作をいう。遺伝子またはＤＮＡの導入、または形質転換のために、酵母細胞に関しては、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態で存在してもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入されて、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００４１】
宿主の酵母としては、特に限定されないが、サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエの実用酵母である。宿主酵母は、発酵基質である単糖（例えば、グルコース）からのアルコールの発酵能を高めるように形質転換されていてもよい。
【００４２】
「実用酵母」とは、従来エタノール発酵に用いられる任意の酵母（例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など）をいう。実用酵母の中でも、高いエタノール発酵能および高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。「実用酵母」は、高いエタノール耐性を有する酵母であり、好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる酵母である。さらに耐酸性、耐熱性などを有することが好ましい。さらに好ましくは、凝集性であり得る。例えば、このような性質を有する実用酵母としては、独立行政法人製品評価技術基板機構により入手可能であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（ＭＡＴα、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性あり）およびＮＢＲＣ１４４５株（ＭＡＴａ、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性なし）が挙げられる。
【００４３】
実用酵母は、エタノールに極めて高い耐性を有するため、単糖を生産した後、そのままエタノール発酵に供することができる。中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しく過酷な培養条件になる場合もある工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で好ましい。また実用酵母は多倍体となるため、相同染色体に複数の遺伝子構築物（発現ベクター）を組み込むことが可能であり、その結果一倍体であることが多い実験室酵母に組み込む場合に比べて、目的タンパク質の発現量が高くなる。
【００４４】
実用酵母は、多くの場合原栄養体であって形質転換体を選抜するための適切な栄養要求性マーカーを有しない。したがって目的の遺伝子導入に適した特定の栄養要求性マーカーを、実用酵母（特に、栄養要求性を有しない酵母であって、エタノール耐性の高い（好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる）酵母）に付与することにより、目的の遺伝子の導入が容易になる。栄養要求性マーカーとしては、その遺伝子操作上の利点から、ウラシル要求性、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性などが挙げられるがこれらに限定されない。ウラシル要求性に関しては、ウラシル要求性変異株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＴ−８株）から獲得したｕｒａ３−断片を実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子と相同組換えすることによって付与することができる。ウラシル要求性以外の栄養要求性（例えば、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性など）に関しては、例えば、非特許文献５に記載の方法に準じて、これらの遺伝子を破壊するようにフラグメントを設計して付与することができる。
【００４５】
上記発現カセットが導入された実用酵母は、上で説明したように、酵母選択マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。さらに、発現された酵素タンパク質の活性を測定することによって確認され得る。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。
【００４６】
本明細書では、用語「セルロース」は、β１，４−グルコシド結合によりグルコピラノースが連なった繊維状高分子をいうが、その誘導体または塩、あるいは分解により重合度が低下したものもまた含む。「セルロース」には、セルロースがカルボキシメチル化されたカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース、および結晶性セルロース（例えば、アビセル）などのセルロース化合物もまた含まれ得る。セルロース化合物の中でも、リン酸膨潤セルロースは、セルロースを加水分解し得る酵素のセルロース加水分解力を測定するために、実際のバイオマスのセルロースの代替基質としてよく用いられるセルロースである。
【００４７】
本発明の形質転換酵母をセルロースと共存させることで、セルロースの糖化反応が生じ得る。糖化反応の温度は、用いる酵母に依存し得るが、通常、約３０℃〜約３８℃であり得、好ましくは、約３５℃である。pHは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。時間は、反応に用いる酵母負荷量またはセルロース量に基づいて決定し得る。
【００４８】
本発明の形質転換酵母は、糖化反応に供する前に好気的条件下で培養することにより、その数を増加させ得る。増殖培地の組成は当業者によって適宜設計され得、選択培地であっても非選択培地であってもよい。培養時の培地のｐＨは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約0.5〜約６ppm、より好ましくは約１〜約４ppm、よりさらに好ましくは約２ppmである。また、培養時の温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約４０℃、より好ましくは約３０〜約３７℃であり得る。培養時間は、反応に用いる酵母負荷量に基づいて決定し得る。例えば、総酵母の菌体濃度が20g（湿潤量）/L以上、より好ましくは50g（湿潤量）/L、さらに好ましくは75g（湿潤量）/L以上になるまで培養する場合は、約20〜約50時間程度であり得る。
【００４９】
本発明の形質転換酵母によるセルロースの糖化反応により生じたグルコースは、エタノール発酵に用いられ得、好ましくは、本発明の形質転換酵母によるセルロースの糖化反応は、エタノール発酵と共に行われ得る。エタノール発酵は、本発明の形質転換酵母を培養（好ましくは、液体培養）することで行われ得る。発酵培地の組成は当業者によって適宜設計され得、発酵培地は、発酵基質として、上記セルロースの糖化反応により生じたグルコースを含有し得る。糖化発酵同時反応の場合は、セルロースを発酵基質として用い得る。発酵基質以外には、酵母エキス、ポリペプトン、クエン酸緩衝液、二亜硫酸カリウムなどを含有し得る。温度は、用いる酵母に依存し得るが、通常、約３０℃〜約３８℃であり得、好ましくは、約３５℃であり得る。pHは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。時間は、用いる酵母負荷量、セルロース量などに基づいて決定し得る。発酵培養は嫌気的に行われ得る（溶存酸素濃度は、例えば、約１ppm以下、より好ましくは約0.1ppm以下、よりさらに好ましくは約0.05ppm以下であり得る）。
【００５０】
エタノール発酵には、セルラーゼ酵素を補助的に用い得る。「セルラーゼ酵素」とは、酵素として単離された任意の形態を含む。例えば、「セルラーゼ酵素」としては、上で説明したようなセルラーゼ（すなわち、エンドグルカナーゼ）を生産する微生物から単離精製された酵素、およびセルラーゼ遺伝子を用いて遺伝子組換えにより生産された酵素が挙げられる。市販のセルラーゼ酵素も使用可能である。市販のセルラーゼ酵素としては、例えば、ナガセケムテックス社のCellulase SS：トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ：力価7.6FPU/mL（「FPU」は「Filter Paper Unit」の略であり、ろ紙から１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量が「1FPU」とされる）が挙げられる。特に、エタノールを工業的に製造する場合、生産効率を促進するために、セルラーゼ酵母とセルロース系物質との反応の際に、セルラーゼ酵素をさらに添加してもよい。
【００５１】
発酵の進行とともに発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵条件の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
【００５２】
発酵工程終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
【００５３】
本発明の形質転換酵母および必要に応じてセルラーゼ酵素は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
【００５４】
固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられ、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
【００５５】
担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、50〜1000μｍが好ましい。
【００５６】
また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が2〜50ｍｍ、立方体状の場合、2〜50ｍｍ角が好ましい。
【００５７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
本実施例で用いた菌株サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株（MATα）およびサッカロマイセス・セレビシエMT8-1株（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した。
【００５９】
本実施例に示す全てのＰＣＲ増幅は、KOD-Plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて実施した。
【００６０】
本実施例に示す全ての酵母の形質転換は、YEAST MAKER酵母形質転換システム（Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA）を用いて酢酸リチウム法によって実施した。
【００６１】
本実施例に示す試薬について、特に記載がなければ、当業者が通常用いる試薬を用いた。
【００６２】
（プラスミドベクターpGK406の調製）
ＰＧＫプロモーターＤＮＡ断片およびＰＧＫターミネーターＤＮＡ断片のそれぞれをＰＣＲによって調製した。本ＰＣＲでは、サッカロマイセス・セレビシエBY4741株（アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より入手）から常法で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＧＫプロモーターＤＮＡ断片についてはフォワードプライマー配列番号５およびリバースプライマー配列番号６のプライマー対、ＰＧＫターミネーターＤＮＡ断片については、フォワードプライマー配列番号７およびリバースプライマー配列番号８のプライマー対を用いた。さらに、フォワードプライマー配列番号９およびリバースプライマー配列番号１０のプライマー対を用いてアニーリングすることにより、マルチクローニングサイトを調製した。ＰＧＫプロモーターをXhoIおよびNheIで、マルチクローニングサイトをNheIおよびBglIIで、ＰＧＫターミネーターをBglIIおよびNotIでそれぞれ消化し、pTA2ベクター（東洋紡社製）のXhoI−NotI部位にクローニングした。得られたベクターをXhoIおよびNotIで消化し、その断片をpRS406（Stratagene社製）に連結し、得られたベクターをpGK406とした。
【００６３】
（プラスミドベクターpGK406PHC-CBH1の調製）
株式会社メディビックが、ＤＮＡ２．０社製のコドン使用頻度最適化ソフトウェアを用いて、サッカロマイセス・セレビシエのコドン使用頻度に最も適合するように、ファネロカエテ・クリソスポリウム由来セロビオヒドロラーゼ１．１（ＣＢＨ１．１）の野生型のコドンから変更した最適化コドンを求め、該最適化コドンに基づいてＤＮＡ断片を合成した。該合成ＤＮＡ断片の上流にＨｉｓ６タグをコードするＤＮＡ断片およびさらに上流にリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片を連結して、これらの３つのＤＮＡ断片を含むプラスミド（「pPHC-CBH1」と命名した）を得た。これらの３つのＤＮＡ断片からなる総領域の上流側にSalIおよび下流側にXbaIの認識配列が存在する。
【００６４】
上記の最適化コドンに基づく合成ＤＮＡ断片は、配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＣＢＨ１．１のコード領域からなる。推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００６５】
鋳型としてpEG23u31H6（非特許文献６）を用い、フォワードプライマー配列番号１１およびリバースプライマー配列番号１２のプライマー対を用いるＰＣＲにより、α-アグルチニン遺伝子の３’側の領域（非特許文献７）の断片を取得した。この断片をEcoRIで消化し、同様にEcoRIで消化したpGK406に連結し、得られたプラスミドをpGK406AGと命名した。
【００６６】
上記プラスミドpPHC-CBH1を制限酵素SalIおよびXbaIで消化して得られたＤＮＡ断片（ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１．１の最適化コドン合成ＤＮＡ断片を含む）を、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、α-アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406AGのSalI部位とXbaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ならびにＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナルコード領域、コドン最適化ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＰＧＫターミネーターを含む発現カセットを含むプラスミドが得られた。このプラスミドをpGK406 PHC-CBH1と命名した。
【００６７】
（プラスミドベクターpRS406 EG CBH2の調製）
リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼの分泌シグナルコード領域とトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子とα−アグルチニン遺伝子の３’側の領域とを含む2719bpのＤＮＡ断片をＰＣＲによって調製した。本ＰＣＲでは、鋳型としてpEG23u31H6を用い、フォワードプライマー配列番号１３およびリバースプライマー配列番号１４のプライマー対を用いた。
【００６８】
上記2719bpのＤＮＡ断片を制限酵素NheIおよびXmaIで消化し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406のNheI部位とXmaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ならびにＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルコード領域、トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＰＧＫターミネーターを含む発現カセットを含むプラスミドが得られた。このプラスミドをpGK406 EGと命名した。
【００６９】
鋳型としてプラスミドpFCBH2w3（非特許文献８）を用い、フォワードプライマー配列番号１５およびリバースプライマー配列番号１６のプライマー対を用いるＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を調製した。この断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK406 EGに連結し、得られたプラスミドをpRS406 EG CBH2と命名した。
【００７０】
プラスミドpRS406 EG CBH2は、ウラシル遺伝子（ＵＲＡ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子およびトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子により発現される酵素が表層提示されるように組み込むためのプラスミドである。
【００７１】
（プラスミドベクターpRS403 EG CBH2の調製）
pGK406 EGを制限酵素ApaIおよびNotIで消化して、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を切り出し、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS403（Stratagene社製）に上記断片を連結し、得られたプラスミドをpGK403 EGと命名した。
【００７２】
上記と同様に調製したＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK403 EGに連結し、得られたプラスミドをpRS403 EG CBH2と命名した。
【００７３】
プラスミドpRS403 EG CBH2は、ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子およびトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子により発現される酵素が表層提示されるように組み込むためのプラスミドである。
【００７４】
（プラスミドベクターpRS405 EG CBH2の調製）
上記と同様にpGK406 EGを制限酵素ApaIおよびNotIで消化して切り出した、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS405（Stratagene社製）に連結し、得られたプラスミドをpGK405 EGと命名した。
【００７５】
上記と同様に調製したＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK405 EGにクローニングした。得られたプラスミドをpRS405 EG CBH2と命名した。
【００７６】
プラスミドpRS405 EG CBH2は、ロイシン遺伝子（ＬＥＵ２）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子およびトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子により発現される酵素が表層提示されるように組み込むためのプラスミドである。
【００７７】
（NBRC1440株へのＵＲＡ３要求性の付与）
鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）のゲノムを用いて、フォワードプライマー配列番号１７およびリバースプライマー配列番号１８のプライマー対を用いるＰＣＲにより、変異ＵＲＡ３断片を取得した。この断片をサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）株に導入し、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地でＵＲＡ３変異株を選択し、ＵＲＡ３要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
【００７８】
なお、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地は以下のように調製した。50mg/Lウラシル酸および２％（w/v）寒天を添加したウラシルドロップアウト合成デキストロース（ＳＤ）培地（非特許文献９）をオートクレーブ処理し、６５℃を維持した。ＦＯＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に100mg/mLの濃度で溶解し、約６５℃の上記オートクレーブした培地に添加し、ＦＯＡの最終濃度を1mg/mLとした。
【００７９】
（NBRC1440株へのＨＩＳ３要求性の付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、フォワードプライマーHIS3-Green U（配列番号１９）およびリバースプライマーHIS3-Green R（配列番号２０）のプライマー対を用い、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを用いるＰＣＲにより、ＨＩＳ３上流部分配列を調製した；
ＰＣＲ２、フォワードプライマーURA3 fragment（配列番号２１）およびリバースプライマーHIS3-40Uc（配列番号２２）のプライマー対を用い、pRS406プラスミド（Stratagene社製）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を増幅した；
ＰＣＲ３、フォワードプライマーHIS3-Green U（配列番号１９）およびリバースプライマーHIS3-40Uc（配列番号２２）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
【００８０】
この得られた融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株について常法で相同組換えを行った。ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。この構築物が上記実用酵母NBRC1440の染色体に組み込まれると同時にＨＩＳ３遺伝子破壊が生じ、ＵＲＡ３マーカーおよびその両側の反復配列とが染色体内に組み込まれる。
【００８１】
引き続き、この相同組換えを生じた株を３０℃にて２４時間、ＹＰＤ培地中で増殖させた。次いで５−ＦＯＡ培地プレート上で1.0×107細胞／200μLまで増殖させた。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した全てのコロニーは、ウラシル要求性（Ｕｒａ−）の表現型であり、これを選択した。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した株では、ＵＲＡ３マーカーの両側にある反復配列により生じたさらなる相同組換えのため、先の相同組換えにより導入されたはずのＵＲＡ３マーカーが染色体上から除去され、ウラシル栄養要求性（Ｕｒａ−）の表現型を示していた。
【００８２】
したがって、ＨＩＳ３遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子が欠失してこれらの栄養要求性を有する株、すなわち、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３要求性が付与されたNBRC1440株が得られた。
【００８３】
（NBRC1440株へのＴＲＰ１要求性の付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、フォワードプライマーTRP1-988（配列番号２３）およびリバースプライマーTRP1-28r（配列番号２４）のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、ＴＲＰ１上流部分配列を調製した；
ＰＣＲ２、フォワードプライマーTRP1-URA3（配列番号２５）およびリバースプライマーTRP1-40r（配列番号２６）のプライマー対を用い、pRS406プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
ＰＣＲ３、フォワードプライマーTRP1-988（配列番号２３）およびリバースプライマーTRP1-40r（配列番号２６）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
【００８４】
この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＨＩＳ３およびＵＲＡ３要求性が付与されたNBRC1440株から上記と同様にして、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
【００８５】
（NBRC1440株へのＬＥＵ２要求性の付与）
さらに、以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、フォワードプライマーLEU2-UP 3rd（配列番号２７）およびリバースプライマーLEU2-down 3rd（配列番号２８）のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、ＬＥＵ２上流部分配列を調製した；
ＰＣＲ２、フォワードプライマーLEU2-URA3 3rd（配列番号２９）およびリバースプライマーLEU2-40r（配列番号３０）のプライマー対を用い、pRS406プラスミド（Stratagene社製）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
ＰＣＲ３、フォワードプライマーLEU2-UP 3rd（配列番号２７）およびリバースプライマーLEU2-40r（配列番号３０）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
【００８６】
この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株から上記と同様にして、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
【００８７】
（形質転換酵母の作製）
上記にしたがって得られたＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株を、本明細書では便宜上「NBRC1440/UHWL」と表し、形質転換に用いた。
【００８８】
プラスミドpRS403 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/UHWLに導入し、ヒスチジンドロップアウト（ヒスチジン不含培地）プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/UHWLの破壊されたＨＩＳ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換酵母株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2」と命名した。
【００８９】
プラスミドpRS405 EG CBH2を制限酵素HpaIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS403 EG CBH2に導入し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS403 EG CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-2c」とも表記する。
【００９０】
プラスミドpRS406 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2に導入し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2の破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換酵母株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2/pRS406 EG CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-3c」とも表記する。
【００９１】
プラスミドpGK406 PHC-CBH1を制限酵素StuIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2に導入し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2の破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換酵母株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2/pGK406 PHC-CBH1」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1」とも表記する。
【００９２】
（形質転換酵母のセルロース糖化力の比較）
形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cおよびNBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1について、セルロースの糖化力として、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；ナカライテスク株式会社製）の分解力を調べた。50mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.05% 二亜硫酸カリウム、酵母量 OD600=1.0、20g/L ＣＭＣの反応組成を用いた。反応は、３７℃にて２４時間で行った。基質ＣＭＣを分解させ生じた還元糖を、ソモギ・ネルソン法により定量した。糖化力を、菌体１ｇ当たり１分間に生成したグルコース量（Ｕ／ｇ Cell）で表した。
【００９３】
図１は、形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cまたはNBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1がＣＭＣを分解して生じたグルコース量を示すグラフである。図１中、縦軸は、ＣＭＣ分解により生じたグルコース量（Ｕ／ｇ Cell）を表す。図１に示されるように、形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1は、形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cと比較して、ＣＭＣから約４倍多い量のグルコースを生成した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、酵母の発酵基質となり得るグルコースのような糖を、セルロースから効率よく得ることができる。したがって、セルロースを原料として用いる酵母によるエタノール生産に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースの糖化力が増強された酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースからエタノールを生産するために、セルロース分解酵素を表層提示させた酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いて、セルロースからのグルコースへの糖化およびグルコースを基質とするエタノール発酵の両方を同時に行う、糖化同時発酵の試みがなされている。例えば、セルロースを糖化する酵素群を表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている（特許文献１および２）。エタノール生産の増大のために、酵母によるセルロースの糖化力の増強が求められている。
【０００３】
セルロースを糖化する酵素群として、サッカロマイセス・セレビシエで表層提示するために、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来のエンドグルカナーゼEGIIおよびセロビオヒドロラーゼCBH2が用いられてきた。トリコデルマ・リーセイは、セロビオヒドロラーゼとしてCBH1も有する。
【０００４】
担子菌であるファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）もまた、CBH1を有する。ファネロカエテ・クリソスポリウムは、白い糸状の外観を呈し、リグニン分解能が非常に強く、木を脱色しながら不朽させる白色不朽菌の代表的な菌である。非特許文献１には、酵母によるセルロースの分解を目的として、ファネロカエテ・クリソスポリウム由来CBH1をサッカロマイセス・セレビシエで分泌発現させたことが記載されている。ファネロカエテ・クリソスポリウムのCBH1には、いくつかのアイソザイムが存在することが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０１／７９４８３号
【特許文献２】特開２００８−８６３１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】P. Van Rensburgら, Yeast, 1998年, 14(1)巻, 67-76頁
【非特許文献２】P.F. Simsら, Mol. Microbiol., 1994年, 12(2)巻, 209-216頁
【非特許文献３】N. Satoら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002年, 60巻, 469-474頁
【非特許文献４】T. Matumotoら，Appl. Environ. Microbiol., 2002年, 68巻, 4517-4522頁
【非特許文献５】R. Akadaら, Yeast, 2006年, 23巻, 399-405頁
【非特許文献６】Y. Fujitaら, Appl. Environ. Microbiol., 2002年, 68巻, 5136-5141頁
【非特許文献７】P. N. Lipkeら, Mol. Cell. Biol., 1989年, 9(8)巻, 3155-3165頁
【非特許文献８】Y. Fujitaら, Appl. Environ. Microbiol., 2004年, 70巻, 1207-1212頁
【非特許文献９】Roseら, Methods in Yeast genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY 1990年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、酵母によるセルロースの糖化力を増強する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含む、セロビオヒドロラーゼ１をコードする遺伝子を提供する。
【０００９】
１つの実施態様では、上記セロビオヒドロラーゼ１はセロビオヒドロラーゼ１．１である。
【００１０】
本発明はまた、上記遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母を提供する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。
【００１２】
１つの実施態様では、上記酵母は、上記セロビオヒドロラーゼ１が表層提示されている。
【００１３】
本発明はさらに、セルロースの糖化方法を提供し、この方法は、上記形質転換酵母とセルロースとを反応させる工程を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、セルロースの糖化力が増強された酵母が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cまたはNBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を分解して生じたグルコース量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の遺伝子は、配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含み、セロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）をコードする。本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいてＤＮＡ合成機などにより合成され得る。より具体的には、本発明の遺伝子は、それらの領域が配列番号１の塩基配列の全長をカバーし得るように設計した１００ｂｐ程度のオリゴＤＮＡを合成し、これらのオリゴＤＮＡをＰＣＲなどによって連結することで取得し得る。本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列で示される。
【００１７】
本発明は、上記遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母をさらに提供する（本明細書では、「本発明の形質転換酵母」ともいう）。本発明の形質転換酵母は、以下に説明するようなセルロース加水分解酵素をコードする遺伝子をさらに発現するように形質転換されていてもよい。
【００１８】
セルロース加水分解酵素とは、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素であり得る。β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素としては、代表的には、エンドβ１，４−グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
セルロース加水分解酵素は、任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)）、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。セルロース加水分解酵素生産菌には、担子菌（例えば、ファネロカエテ・クリソスポリウム）もまた含まれる。
【００２０】
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離し得る（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解し得るが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素（以下、「結晶性加水分解酵素」ともいう）の代表例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅くなり得る。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）およびセロビオヒドロラーゼ２（ＣＢＨ２）と称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異によるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来のＣＢＨ１およびＣＢＨ２が知られている。担子菌ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１もまた知られ（非特許文献１）、その遺伝子の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、GenBank L22656.1およびAAA19802.1に記載されている。担子菌ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１のアイソザイムであるＣＢＨ１．１（セロビオヒドロラーゼ１．１）もまた知られ（非特許文献２）、その遺伝子の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、GenBank Z22528およびCAA80253.1に記載されている。ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１．１遺伝子は、配列番号３の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含み、この遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列で示される。配列番号４のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【００２１】
エンドグルカナーゼは、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であり得るが、これに限定されない）を生じ得る。このようなセルロースの単糖または少糖（好ましくは単糖）への分解を、本明細書中では「糖化」ともいう。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルに対する反応性は低い。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）、エンドグルカナーゼIII（ＥＧIII）、エンドグルカナーゼIV（ＥＧIV）、およびエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）と称される。これらの区別はアミノ酸配列の差異によるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。代表的には、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧII）が挙げられる。
【００２２】
β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グルコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）が用いられ得るが、これに限定されない。
【００２３】
セルロース加水分解酵素の遺伝子は、酵素を産生する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。
【００２４】
本発明の遺伝子またはセルロース加水分解酵素をコードする遺伝子を用いて、遺伝子発現カセットを構築し得る。遺伝子発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するプロモーター、ターミネーターなどのいわゆる調節因子を含み得る。プロモーターおよびターミネーターは、発現させる遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものであってもよい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’−リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、発現させる遺伝子に応じて、当業者によって適宜選択され得る。発現カセットは、必要に応じて、さらなる調節因子（例えば、オペレーターおよびエンハンサー）などをさらに含み得る。オペレーター、エンハンサーなどの発現調節因子についても、当業者によって適宜選択され得る。発現カセットは、遺伝子発現の目的に応じて、必要な機能配列をさらに含むこともできる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
【００２５】
遺伝子を含む発現カセットの構築に際して、細胞表層工学の技術が利用され得る。例えば、目的の酵素タンパク質を（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介して細胞表層に提示する方法があるが、これらに限定されない。細胞表層工学の技術は、例えば、特許文献１および２にも記載される。
【００２６】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、Ｆｌｏ１タンパク質（Ｆｌｏ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る：例えば、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、Ｆｌｏ１４６、Ｆｌｏ３１８、Ｆｌｏ４２８など；非特許文献３：なお、Ｆｌｏ１３２６とは、全長Ｆｌｏ１タンパク質を表す）、Ｆｌｏタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず凝集性を利用する、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇ；非特許文献４）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
【００２７】
まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元付近で切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００２８】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００２９】
ここで、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端にある、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列も用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列としては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、発現産物自身の分泌シグナル配列などが好適に用いられる。細胞表層局在タンパク質に融合している目的の酵素タンパク質の活性に影響を及ぼさないのであれば、分泌シグナル配列は、その一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
【００３０】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡが特に有用である。
【００３１】
したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的の酵素タンパク質をコードするＤＮＡに置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素タンパク質を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このため、「α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域」が利用され得る。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示された酵素は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
【００３２】
次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン、ＦＬＯタンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００３３】
この細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）と目的の酵素タンパク質とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；あるいは（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする遺伝子；あるいは（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする第一の遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする第二の遺伝子（但し、第一の遺伝子と第二の遺伝子とは同じでも異なっていてもよい）、を作製することにより、細胞表層に目的の酵素を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡは、一部のみ存在してもよいが、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため（例えば、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇのいずれかを選択できる）、より適切な長さで酵素を細胞表層に提示できる点で、ならびに酵素のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
【００３４】
次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的の酵素タンパク質を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼ（Ｓｕｃ２タンパク質）が挙げられる。目的の酵素タンパク質は、これらのペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
【００３５】
酵母にてタンパク質を細胞外に分泌して発現させる方法は、当業者に周知である。上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、目的の酵素タンパク質の遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し、酵母に導入すればよい。
【００３６】
酵母の細胞内にて遺伝子を発現させる方法もまた、当業者に周知である。この場合、上記細胞表層提示技術や上記分泌シグナルを用いることなく、目的の酵素タンパク質の遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し、酵母に導入すればよい。
【００３７】
各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列と目的の酵素タンパク質の遺伝子との結合は、部位特異的変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断と活性のあるタンパク質の発現とが可能である。
【００３８】
遺伝子または遺伝子発現カセットは、プラスミドの形態のベクターに挿入され得る。ＤＮＡの取得の簡易化の点から、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、上述したような調節配列を含み得る。ベクター作製の出発材料としては、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ori）と大腸菌ColE1の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など））および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。
【００３９】
出発材料のプラスミドの例としては、GAPDHプロモーターおよびGAPDHターミネーターを含むプラスミドpYGA2270またはpYE22m、あるいはUPR-ICL（イソクエン酸リアーゼ上流領域）およびTerm-ICL（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）を含むプラスミドpWI3、PGKプロモーターおよびターミネーターを含むプラスミドpGK406などが挙げられる。プラスミドベクターは、以下の実施例に示すように調製され得る。
【００４０】
本明細書で遺伝子またはＤＮＡの「導入」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入することだけでなく、発現させることも意味する。「形質転換」は、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入して発現させることにより宿主の遺伝的形質を変えること、またはその操作をいう。遺伝子またはＤＮＡの導入、または形質転換のために、酵母細胞に関しては、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態で存在してもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入されて、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００４１】
宿主の酵母としては、特に限定されないが、サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエの実用酵母である。宿主酵母は、発酵基質である単糖（例えば、グルコース）からのアルコールの発酵能を高めるように形質転換されていてもよい。
【００４２】
「実用酵母」とは、従来エタノール発酵に用いられる任意の酵母（例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など）をいう。実用酵母の中でも、高いエタノール発酵能および高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。「実用酵母」は、高いエタノール耐性を有する酵母であり、好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる酵母である。さらに耐酸性、耐熱性などを有することが好ましい。さらに好ましくは、凝集性であり得る。例えば、このような性質を有する実用酵母としては、独立行政法人製品評価技術基板機構により入手可能であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（ＭＡＴα、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性あり）およびＮＢＲＣ１４４５株（ＭＡＴａ、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性なし）が挙げられる。
【００４３】
実用酵母は、エタノールに極めて高い耐性を有するため、単糖を生産した後、そのままエタノール発酵に供することができる。中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しく過酷な培養条件になる場合もある工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で好ましい。また実用酵母は多倍体となるため、相同染色体に複数の遺伝子構築物（発現ベクター）を組み込むことが可能であり、その結果一倍体であることが多い実験室酵母に組み込む場合に比べて、目的タンパク質の発現量が高くなる。
【００４４】
実用酵母は、多くの場合原栄養体であって形質転換体を選抜するための適切な栄養要求性マーカーを有しない。したがって目的の遺伝子導入に適した特定の栄養要求性マーカーを、実用酵母（特に、栄養要求性を有しない酵母であって、エタノール耐性の高い（好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる）酵母）に付与することにより、目的の遺伝子の導入が容易になる。栄養要求性マーカーとしては、その遺伝子操作上の利点から、ウラシル要求性、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性などが挙げられるがこれらに限定されない。ウラシル要求性に関しては、ウラシル要求性変異株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＴ−８株）から獲得したｕｒａ３−断片を実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子と相同組換えすることによって付与することができる。ウラシル要求性以外の栄養要求性（例えば、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性など）に関しては、例えば、非特許文献５に記載の方法に準じて、これらの遺伝子を破壊するようにフラグメントを設計して付与することができる。
【００４５】
上記発現カセットが導入された実用酵母は、上で説明したように、酵母選択マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。さらに、発現された酵素タンパク質の活性を測定することによって確認され得る。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。
【００４６】
本明細書では、用語「セルロース」は、β１，４−グルコシド結合によりグルコピラノースが連なった繊維状高分子をいうが、その誘導体または塩、あるいは分解により重合度が低下したものもまた含む。「セルロース」には、セルロースがカルボキシメチル化されたカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース、および結晶性セルロース（例えば、アビセル）などのセルロース化合物もまた含まれ得る。セルロース化合物の中でも、リン酸膨潤セルロースは、セルロースを加水分解し得る酵素のセルロース加水分解力を測定するために、実際のバイオマスのセルロースの代替基質としてよく用いられるセルロースである。
【００４７】
本発明の形質転換酵母をセルロースと共存させることで、セルロースの糖化反応が生じ得る。糖化反応の温度は、用いる酵母に依存し得るが、通常、約３０℃〜約３８℃であり得、好ましくは、約３５℃である。pHは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。時間は、反応に用いる酵母負荷量またはセルロース量に基づいて決定し得る。
【００４８】
本発明の形質転換酵母は、糖化反応に供する前に好気的条件下で培養することにより、その数を増加させ得る。増殖培地の組成は当業者によって適宜設計され得、選択培地であっても非選択培地であってもよい。培養時の培地のｐＨは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約0.5〜約６ppm、より好ましくは約１〜約４ppm、よりさらに好ましくは約２ppmである。また、培養時の温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約４０℃、より好ましくは約３０〜約３７℃であり得る。培養時間は、反応に用いる酵母負荷量に基づいて決定し得る。例えば、総酵母の菌体濃度が20g（湿潤量）/L以上、より好ましくは50g（湿潤量）/L、さらに好ましくは75g（湿潤量）/L以上になるまで培養する場合は、約20〜約50時間程度であり得る。
【００４９】
本発明の形質転換酵母によるセルロースの糖化反応により生じたグルコースは、エタノール発酵に用いられ得、好ましくは、本発明の形質転換酵母によるセルロースの糖化反応は、エタノール発酵と共に行われ得る。エタノール発酵は、本発明の形質転換酵母を培養（好ましくは、液体培養）することで行われ得る。発酵培地の組成は当業者によって適宜設計され得、発酵培地は、発酵基質として、上記セルロースの糖化反応により生じたグルコースを含有し得る。糖化発酵同時反応の場合は、セルロースを発酵基質として用い得る。発酵基質以外には、酵母エキス、ポリペプトン、クエン酸緩衝液、二亜硫酸カリウムなどを含有し得る。温度は、用いる酵母に依存し得るが、通常、約３０℃〜約３８℃であり得、好ましくは、約３５℃であり得る。pHは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。時間は、用いる酵母負荷量、セルロース量などに基づいて決定し得る。発酵培養は嫌気的に行われ得る（溶存酸素濃度は、例えば、約１ppm以下、より好ましくは約0.1ppm以下、よりさらに好ましくは約0.05ppm以下であり得る）。
【００５０】
エタノール発酵には、セルラーゼ酵素を補助的に用い得る。「セルラーゼ酵素」とは、酵素として単離された任意の形態を含む。例えば、「セルラーゼ酵素」としては、上で説明したようなセルラーゼ（すなわち、エンドグルカナーゼ）を生産する微生物から単離精製された酵素、およびセルラーゼ遺伝子を用いて遺伝子組換えにより生産された酵素が挙げられる。市販のセルラーゼ酵素も使用可能である。市販のセルラーゼ酵素としては、例えば、ナガセケムテックス社のCellulase SS：トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ：力価7.6FPU/mL（「FPU」は「Filter Paper Unit」の略であり、ろ紙から１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量が「1FPU」とされる）が挙げられる。特に、エタノールを工業的に製造する場合、生産効率を促進するために、セルラーゼ酵母とセルロース系物質との反応の際に、セルラーゼ酵素をさらに添加してもよい。
【００５１】
発酵の進行とともに発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵条件の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
【００５２】
発酵工程終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
【００５３】
本発明の形質転換酵母および必要に応じてセルラーゼ酵素は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
【００５４】
固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられ、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
【００５５】
担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、50〜1000μｍが好ましい。
【００５６】
また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が2〜50ｍｍ、立方体状の場合、2〜50ｍｍ角が好ましい。
【００５７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
本実施例で用いた菌株サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株（MATα）およびサッカロマイセス・セレビシエMT8-1株（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した。
【００５９】
本実施例に示す全てのＰＣＲ増幅は、KOD-Plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて実施した。
【００６０】
本実施例に示す全ての酵母の形質転換は、YEAST MAKER酵母形質転換システム（Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA）を用いて酢酸リチウム法によって実施した。
【００６１】
本実施例に示す試薬について、特に記載がなければ、当業者が通常用いる試薬を用いた。
【００６２】
（プラスミドベクターpGK406の調製）
ＰＧＫプロモーターＤＮＡ断片およびＰＧＫターミネーターＤＮＡ断片のそれぞれをＰＣＲによって調製した。本ＰＣＲでは、サッカロマイセス・セレビシエBY4741株（アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より入手）から常法で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＧＫプロモーターＤＮＡ断片についてはフォワードプライマー配列番号５およびリバースプライマー配列番号６のプライマー対、ＰＧＫターミネーターＤＮＡ断片については、フォワードプライマー配列番号７およびリバースプライマー配列番号８のプライマー対を用いた。さらに、フォワードプライマー配列番号９およびリバースプライマー配列番号１０のプライマー対を用いてアニーリングすることにより、マルチクローニングサイトを調製した。ＰＧＫプロモーターをXhoIおよびNheIで、マルチクローニングサイトをNheIおよびBglIIで、ＰＧＫターミネーターをBglIIおよびNotIでそれぞれ消化し、pTA2ベクター（東洋紡社製）のXhoI−NotI部位にクローニングした。得られたベクターをXhoIおよびNotIで消化し、その断片をpRS406（Stratagene社製）に連結し、得られたベクターをpGK406とした。
【００６３】
（プラスミドベクターpGK406PHC-CBH1の調製）
株式会社メディビックが、ＤＮＡ２．０社製のコドン使用頻度最適化ソフトウェアを用いて、サッカロマイセス・セレビシエのコドン使用頻度に最も適合するように、ファネロカエテ・クリソスポリウム由来セロビオヒドロラーゼ１．１（ＣＢＨ１．１）の野生型のコドンから変更した最適化コドンを求め、該最適化コドンに基づいてＤＮＡ断片を合成した。該合成ＤＮＡ断片の上流にＨｉｓ６タグをコードするＤＮＡ断片およびさらに上流にリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片を連結して、これらの３つのＤＮＡ断片を含むプラスミド（「pPHC-CBH1」と命名した）を得た。これらの３つのＤＮＡ断片からなる総領域の上流側にSalIおよび下流側にXbaIの認識配列が存在する。
【００６４】
上記の最適化コドンに基づく合成ＤＮＡ断片は、配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＣＢＨ１．１のコード領域からなる。推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００６５】
鋳型としてpEG23u31H6（非特許文献６）を用い、フォワードプライマー配列番号１１およびリバースプライマー配列番号１２のプライマー対を用いるＰＣＲにより、α-アグルチニン遺伝子の３’側の領域（非特許文献７）の断片を取得した。この断片をEcoRIで消化し、同様にEcoRIで消化したpGK406に連結し、得られたプラスミドをpGK406AGと命名した。
【００６６】
上記プラスミドpPHC-CBH1を制限酵素SalIおよびXbaIで消化して得られたＤＮＡ断片（ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１．１の最適化コドン合成ＤＮＡ断片を含む）を、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、α-アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406AGのSalI部位とXbaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ならびにＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナルコード領域、コドン最適化ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨ１遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＰＧＫターミネーターを含む発現カセットを含むプラスミドが得られた。このプラスミドをpGK406 PHC-CBH1と命名した。
【００６７】
（プラスミドベクターpRS406 EG CBH2の調製）
リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼの分泌シグナルコード領域とトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子とα−アグルチニン遺伝子の３’側の領域とを含む2719bpのＤＮＡ断片をＰＣＲによって調製した。本ＰＣＲでは、鋳型としてpEG23u31H6を用い、フォワードプライマー配列番号１３およびリバースプライマー配列番号１４のプライマー対を用いた。
【００６８】
上記2719bpのＤＮＡ断片を制限酵素NheIおよびXmaIで消化し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406のNheI部位とXmaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ならびにＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルコード領域、トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＰＧＫターミネーターを含む発現カセットを含むプラスミドが得られた。このプラスミドをpGK406 EGと命名した。
【００６９】
鋳型としてプラスミドpFCBH2w3（非特許文献８）を用い、フォワードプライマー配列番号１５およびリバースプライマー配列番号１６のプライマー対を用いるＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を調製した。この断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK406 EGに連結し、得られたプラスミドをpRS406 EG CBH2と命名した。
【００７０】
プラスミドpRS406 EG CBH2は、ウラシル遺伝子（ＵＲＡ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子およびトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子により発現される酵素が表層提示されるように組み込むためのプラスミドである。
【００７１】
（プラスミドベクターpRS403 EG CBH2の調製）
pGK406 EGを制限酵素ApaIおよびNotIで消化して、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を切り出し、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS403（Stratagene社製）に上記断片を連結し、得られたプラスミドをpGK403 EGと命名した。
【００７２】
上記と同様に調製したＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK403 EGに連結し、得られたプラスミドをpRS403 EG CBH2と命名した。
【００７３】
プラスミドpRS403 EG CBH2は、ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子およびトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子により発現される酵素が表層提示されるように組み込むためのプラスミドである。
【００７４】
（プラスミドベクターpRS405 EG CBH2の調製）
上記と同様にpGK406 EGを制限酵素ApaIおよびNotIで消化して切り出した、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS405（Stratagene社製）に連結し、得られたプラスミドをpGK405 EGと命名した。
【００７５】
上記と同様に調製したＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK405 EGにクローニングした。得られたプラスミドをpRS405 EG CBH2と命名した。
【００７６】
プラスミドpRS405 EG CBH2は、ロイシン遺伝子（ＬＥＵ２）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子およびトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子により発現される酵素が表層提示されるように組み込むためのプラスミドである。
【００７７】
（NBRC1440株へのＵＲＡ３要求性の付与）
鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）のゲノムを用いて、フォワードプライマー配列番号１７およびリバースプライマー配列番号１８のプライマー対を用いるＰＣＲにより、変異ＵＲＡ３断片を取得した。この断片をサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）株に導入し、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地でＵＲＡ３変異株を選択し、ＵＲＡ３要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
【００７８】
なお、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地は以下のように調製した。50mg/Lウラシル酸および２％（w/v）寒天を添加したウラシルドロップアウト合成デキストロース（ＳＤ）培地（非特許文献９）をオートクレーブ処理し、６５℃を維持した。ＦＯＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に100mg/mLの濃度で溶解し、約６５℃の上記オートクレーブした培地に添加し、ＦＯＡの最終濃度を1mg/mLとした。
【００７９】
（NBRC1440株へのＨＩＳ３要求性の付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、フォワードプライマーHIS3-Green U（配列番号１９）およびリバースプライマーHIS3-Green R（配列番号２０）のプライマー対を用い、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを用いるＰＣＲにより、ＨＩＳ３上流部分配列を調製した；
ＰＣＲ２、フォワードプライマーURA3 fragment（配列番号２１）およびリバースプライマーHIS3-40Uc（配列番号２２）のプライマー対を用い、pRS406プラスミド（Stratagene社製）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を増幅した；
ＰＣＲ３、フォワードプライマーHIS3-Green U（配列番号１９）およびリバースプライマーHIS3-40Uc（配列番号２２）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
【００８０】
この得られた融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株について常法で相同組換えを行った。ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。この構築物が上記実用酵母NBRC1440の染色体に組み込まれると同時にＨＩＳ３遺伝子破壊が生じ、ＵＲＡ３マーカーおよびその両側の反復配列とが染色体内に組み込まれる。
【００８１】
引き続き、この相同組換えを生じた株を３０℃にて２４時間、ＹＰＤ培地中で増殖させた。次いで５−ＦＯＡ培地プレート上で1.0×107細胞／200μLまで増殖させた。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した全てのコロニーは、ウラシル要求性（Ｕｒａ−）の表現型であり、これを選択した。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した株では、ＵＲＡ３マーカーの両側にある反復配列により生じたさらなる相同組換えのため、先の相同組換えにより導入されたはずのＵＲＡ３マーカーが染色体上から除去され、ウラシル栄養要求性（Ｕｒａ−）の表現型を示していた。
【００８２】
したがって、ＨＩＳ３遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子が欠失してこれらの栄養要求性を有する株、すなわち、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３要求性が付与されたNBRC1440株が得られた。
【００８３】
（NBRC1440株へのＴＲＰ１要求性の付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、フォワードプライマーTRP1-988（配列番号２３）およびリバースプライマーTRP1-28r（配列番号２４）のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、ＴＲＰ１上流部分配列を調製した；
ＰＣＲ２、フォワードプライマーTRP1-URA3（配列番号２５）およびリバースプライマーTRP1-40r（配列番号２６）のプライマー対を用い、pRS406プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
ＰＣＲ３、フォワードプライマーTRP1-988（配列番号２３）およびリバースプライマーTRP1-40r（配列番号２６）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
【００８４】
この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＨＩＳ３およびＵＲＡ３要求性が付与されたNBRC1440株から上記と同様にして、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
【００８５】
（NBRC1440株へのＬＥＵ２要求性の付与）
さらに、以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、フォワードプライマーLEU2-UP 3rd（配列番号２７）およびリバースプライマーLEU2-down 3rd（配列番号２８）のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、ＬＥＵ２上流部分配列を調製した；
ＰＣＲ２、フォワードプライマーLEU2-URA3 3rd（配列番号２９）およびリバースプライマーLEU2-40r（配列番号３０）のプライマー対を用い、pRS406プラスミド（Stratagene社製）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
ＰＣＲ３、フォワードプライマーLEU2-UP 3rd（配列番号２７）およびリバースプライマーLEU2-40r（配列番号３０）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
【００８６】
この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株から上記と同様にして、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
【００８７】
（形質転換酵母の作製）
上記にしたがって得られたＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株を、本明細書では便宜上「NBRC1440/UHWL」と表し、形質転換に用いた。
【００８８】
プラスミドpRS403 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/UHWLに導入し、ヒスチジンドロップアウト（ヒスチジン不含培地）プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/UHWLの破壊されたＨＩＳ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換酵母株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2」と命名した。
【００８９】
プラスミドpRS405 EG CBH2を制限酵素HpaIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS403 EG CBH2に導入し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS403 EG CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-2c」とも表記する。
【００９０】
プラスミドpRS406 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2に導入し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2の破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換酵母株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2/pRS406 EG CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-3c」とも表記する。
【００９１】
プラスミドpGK406 PHC-CBH1を制限酵素StuIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2に導入し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2の破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。得られた形質転換酵母株を「NBRC1440/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2/pGK406 PHC-CBH1」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1」とも表記する。
【００９２】
（形質転換酵母のセルロース糖化力の比較）
形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cおよびNBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1について、セルロースの糖化力として、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；ナカライテスク株式会社製）の分解力を調べた。50mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.05% 二亜硫酸カリウム、酵母量 OD600=1.0、20g/L ＣＭＣの反応組成を用いた。反応は、３７℃にて２４時間で行った。基質ＣＭＣを分解させ生じた還元糖を、ソモギ・ネルソン法により定量した。糖化力を、菌体１ｇ当たり１分間に生成したグルコース量（Ｕ／ｇ Cell）で表した。
【００９３】
図１は、形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cまたはNBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1がＣＭＣを分解して生じたグルコース量を示すグラフである。図１中、縦軸は、ＣＭＣ分解により生じたグルコース量（Ｕ／ｇ Cell）を表す。図１に示されるように、形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-2c/PHC-CBH1は、形質転換酵母NBRC1440/EG-CBH2-3cと比較して、ＣＭＣから約４倍多い量のグルコースを生成した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、酵母の発酵基質となり得るグルコースのような糖を、セルロースから効率よく得ることができる。したがって、セルロースを原料として用いる酵母によるエタノール生産に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含む、セロビオヒドロラーゼ１をコードする遺伝子。
【請求項２】
前記セロビオヒドロラーゼ１が、セロビオヒドロラーゼ１．１である、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母。
【請求項４】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項３に記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記セロビオヒドロラーゼ１が表層提示されている、請求項３または４に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
セルロースの糖化方法であって、請求項３から５のいずれかに記載の形質転換酵母とセルロースとを反応させる工程を含む、方法。
【請求項１】
配列番号１の１位から１４６７位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含む、セロビオヒドロラーゼ１をコードする遺伝子。
【請求項２】
前記セロビオヒドロラーゼ１が、セロビオヒドロラーゼ１．１である、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子が導入され、該遺伝子を発現する形質転換酵母。
【請求項４】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項３に記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記セロビオヒドロラーゼ１が表層提示されている、請求項３または４に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
セルロースの糖化方法であって、請求項３から５のいずれかに記載の形質転換酵母とセルロースとを反応させる工程を含む、方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２３４６８３（Ｐ２０１１−２３４６８３Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１０１４４（Ｐ２０１０−１１０１４４）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（５０２０５９８２５）Ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｙ株式会社 (16)
【出願人】（３９０００６２６４）関西化学機械製作株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（５０２０５９８２５）Ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｙ株式会社 (16)
【出願人】（３９０００６２６４）関西化学機械製作株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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