セルロースアセテート膜を用いたリポ蛋白質の分離方法
【課題】
電気泳動法を用いたリポ蛋白質の新規な分離方法を提供すること、さらにリポ蛋白質のサブクラスの存在形態を指標として高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法を提供することをその主な課題とする。
【解決手段】
分子量４万〜２００万のデキストランを含有させたセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により検体中のリポ蛋白質を分離する方法、および分離したリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
電気泳動法を用いたリポ蛋白質の新規な分離方法を提供すること、さらにリポ蛋白質のサブクラスの存在形態を指標として高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法を提供することをその主な課題とする。
【解決手段】
分子量４万〜２００万のデキストランを含有させたセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により検体中のリポ蛋白質を分離する方法、および分離したリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動法によるリポ蛋白質の分離方法に関する。また、電気泳動により分離したリポ蛋白質を免疫染色し、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を確認することにより脂質代謝異常に起因する疾患の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の各リポ蛋白質の量的および質的異常を検出することにより、脂質代謝異常を推定することができる。そのため、リポ蛋白質の分離分析法は、高脂血症、冠動脈硬化症、甲状腺機能低下症、閉塞性肝疾患、糖尿病、腎不全などの脂質代謝異常に起因する疾患の診断や治療にとって大切な臨床検査の一つとなっている。
【０００３】
リポ蛋白質は脂質と蛋白質とが結合した粒子であり、血液中では可溶化しており、脂質を運ぶ役割を担っている。リポ蛋白質の種類として、比重の軽い方から示すと、カイロミクロン（ＣＨＹＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポ蛋白質（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）等がある。リポ蛋白質の比重、電気的易動度、粒子サイズの違いは、リポ蛋白質を構成する脂質と蛋白（アポ蛋白）の割合、蛋白（アポ蛋白）の種類の異なることに由来する。リポ蛋白質を構成する脂質は、トリグリセライド、コレステロールエステル、遊離型コレステロール、リン脂質があり、リポ蛋白質を構成するアポ蛋白の主なものとしてアポＡＩ、アポＡＩＩ、アポＢ‐１００、アポＢ‐４８、アポＣＩ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩ、アポＥなどがある。
【０００４】
脂質代謝異常に起因する主たる疾患である高脂血症は、１種類または２種類のリポ蛋白質の増量によって生じるものである。各種高脂血症の分類は、原発性および二次性高脂血症の成因や病態の解析、治療法の判定のために重要である。Ｉ型の高脂血症は、先天性リポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）の欠損や、先天性アポＣＩＩ欠損が原因で発症する。ＩＩａ型の高脂血症は、ＬＤＬ受容体の異常が原因でＬＤＬが増加し、遺伝性の家族性高コレステロール血症を発症する。家族性高コレステロール血症は、ヘテロ型とホモ型があり、ヘテロ型は、５００人に１人程度と、頻度が高く存在し、ホモ型は、１００万人に１人程度と、頻度は稀だが、若いうちから動脈硬化などを発症し易く、治療が必要である。ＬＤＬとＶＬＤＬが増加する高脂血症ＩＩｂ型と、ＶＬＤＬが増加するＩＶ型は二次性高脂血症として糖尿病を続発することが多い。ＩＩＩ型の高脂血症は、ＩＤＬが増加し、Ｖ型の高脂血症は、ＣＨＹＬとＶＬＤＬが増加する。日本で最も多く発症が見られるのはＩＩａ型の高脂血症であることから、リポ蛋白質のＬＤＬの増加を観察することはＩＩａ型の高脂血症の診断および治療のために重要である。
【０００５】
リポ蛋白質の分画法としては、超遠心法や、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）、アガロースゲル、セルロースアセテート膜を支持体として用いた電気泳動法、高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）による方法がある。
【０００６】
超遠心法では、血清中のリポ蛋白質は、該リポ蛋白質の比重に基づいて、上液よりＣＨＹＬ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬに分離される。しかし、超遠心法は、超遠心機用試料の調製や処理に手間がかかりまた時間を要するため、臨床検査の現場において、特定の疾患に特有の分画の検出やその分画の増減など、詳細な解析を伴う分析を行うことは困難である。
【０００７】
一方、電気泳動法は、リポ蛋白質の分離状況を視覚的に捕えることができるため、日常の検査では多くの場合、電気泳動法を用いてリポ蛋白質の分離分析を行っている。
【０００８】
ＰＡＧ電気泳動法は、所定のポアサイズを有し、分子篩効果が高いポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）を用いた電気泳動法であり、リポ蛋白質は、粒子のサイズが最も小さいＨＤＬが先に分離され、次にＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＨＹＬの順で分離される。すなわち、この方法は、リポ蛋白質中の各粒子の等電点の違いではなく、リポ蛋白質中の各粒子の大きさの違いに基づいて分画されている。しかしながらＰＡＧ電気泳動法は、ゲル濃度を低くするため、ゲルが軟弱で、ブロッティングや染色等の２次分析への展開が困難であり、詳細な解析を要する分析を行うことは困難である。
【０００９】
アガロースゲル電気泳動法は、ＰＡＧ電気泳動法によるリポ蛋白質中の各粒子の大きさだけの違いではなく、異なる種類や異なる数のアポ蛋白を持つ粒子の、アポ蛋白の質的異常または量的異常を分析する方法として知られている。例えば、アポ蛋白Ｂ−１００が変性したＬＤＬの分画と、ＬＤＬが変性していない正常なＬＤＬの分画との比較を行い、脂質代謝に直接関与しているアポ蛋白の異常を捕らえる方法（特許文献１）等がある。
【００１０】
リポ蛋白質のセルロースアセテート膜を利用した電気泳動法としては、セルロースアセテートを主成分とする微多孔質膜に、添加剤としてポリオキシエチレンソルビト−ル脂肪酸エステルを一定の重量比で含有させて作成した膜により、α２−グロブリンとβ−グロブリンの分離に影響を与える低比重リポ蛋白質の影響をなくし、血清タンパクの正確な分画百分率の測定を行うセルロースアセテート膜を提供した文献（特許文献２）があるが、各リポ蛋白質を分離する方法を明らかにしたものではない。また、セルロースアセテート膜電気泳動法を利用した疾患の検出法として、糖尿病患者の尿中アルブミン分解物を検出することによって早期の糖尿病性腎症の診断方法が明らかにされている（特許文献３）が、脂質代謝異常を推定する方法を明らかにしたものではない。
【００１１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用したリポ蛋白質の分離法では、分子篩い効果を有するゲルを充填したゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて、ＬＤＬとＨＤＬのサブクラスの分析を行うことにより代謝動態や病態の診断が可能となったことを明らかにしている。（特許文献４）
【００１２】
免疫測定法としては、血液中に存在するＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬなどのリポ蛋白が変性した、変性リポ蛋白の検出方法として、酵素免疫法、ラテックス凝集法、免疫発光分析法、イムノクロマト法などの免疫学的手法を用い、マイクロプレート上で発色法により測定する方法（特許文献５）や、血液中のＬＤＬおよび変性ＬＤＬを、超遠心法または硫酸デキストラン／Ｃａ沈澱法により前処理して調整し、溶液中で標識物質の発色法により測定する方法（特許文献６）等が知られているが、セルロースアセテート膜電気泳動法を利用した、リポ蛋白質の免疫測定法は知られていない。
【特許文献１】特開２０００−３５６６４１広報
【特許文献２】特開平６−６６７６８公報
【特許文献３】特開平６−１６０３８４公報
【特許文献４】特開２００２−１３９５０１公報
【特許文献５】特開２００１−６６３０７公報
【特許文献６】特開２００３−２２７８３７公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患は、各リポ蛋白質の質的あるいは量的な異常によることから、各リポ蛋白質あるいは、特定のリポ蛋白質のサブクラスの増減を簡便な手法で測定することは、脂質代謝異常に起因する疾患を検出するために重要である。本発明は、電気泳動法を用いたリポ蛋白質の新規な分離方法を提供すること、さらにリポ蛋白質のサブクラスの存在形態を指標として高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、電気泳動法に用いるセルロースアセテート膜に水溶性高分子を含有させることにより、良好なリポ蛋白質の分離が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の構成を有する。
【００１５】
（１）電気泳動用のセルロースアセテート膜であって、検体中のリポ蛋白質の分離に用いる水溶性高分子を含有させたセルロースアセテート膜。
【００１６】
（２）上記水溶性高分子の含有量が、セルロースアセテート膜を浸潤する緩衝液の粘度を１０〜５０ｃＰとなる濃度に調整することを特徴とするセルロースアセテート膜。
【００１７】
（３）（１）または（２）に記載の水溶性高分子が、デキストランであることを特徴とするセルロースアセテート膜。
【００１８】
（４）（３）に記載のデキストランの分子量が、４万〜２００万であることを特徴とするセルロースアセテート膜。
【００１９】
（５）検体中に含まれるリポ蛋白質を、（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【００２０】
（６）検体中に含まれるリポ蛋白質を、（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質抗体を反応させた後、酵素を標識した二次抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【００２１】
（７）検体中に含まれるリポ蛋白質を、（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質ヒツジ抗体を反応させた後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【００２２】
（８）検体中に含まれるリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を（５）〜（７）のいずれかに記載の分離方法を用いて確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
【００２３】
（９）脂質代謝異常に起因する疾患が、高脂血症、高コレステロール血症および低コレステロール血症であることを特徴とする（８）に記載の脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
（１０）（５）〜（７）のいずれかに記載の電気泳動法による分離方法を実施するために用いるキット。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のセルロースアセテート膜を用いた電気泳動法では、検体中のリポ蛋白質のサブクラスを容易に分離分析することができるため、日常的な臨床検査の現場において、脂質代謝異常に起因する疾患の各病態の検出が可能となり、各疾患に適切な処置を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の、リポ蛋白質の分離分析法は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動法によるものである。電気泳動によるリポ蛋白質の分離は、一般的には等電点の違いに基づくが、リポ蛋白質中の各粒子の大きさの違いに基づいた分画は、サブクラスを観察する場合においても重要である。
【００２６】
セルロースアセテート膜電気泳動法は、１９５７年にＫｏｈｎ．Ｊが血清蛋白の分析法として発表して以来、研究分野あるいは臨床分野で多く利用されている。さらに、セルロースアセテート膜についても、蛋白質の分離に優れた膜が開発されてきた。本発明に用いるセルロースアセテート膜は、通常の血漿タンパク異常のスクリーニングで使用されるものであれば、各種市販されているものを使用することができる。例えば、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）を素材とする多孔質膜Ｓｅｐａｒａｘ−Ｓ（富士フィルム社製）、Ｓｅｐａｒａｘ−ＥＦ（富士フィルム社製）、Ｓｅｐａｒａｘ−ＳＰ（富士フィルム社製）等のほか、セラフォア（Ｓｈａｄｏｎ社製）、セレカV（東洋濾紙社製）があるが、リポ蛋白質の分離には、Ｓｅｐａｒａｘ−ＳＰを使用することが望ましい。
【００２７】
＜水溶性高分子含有セルロースアセテート膜の作成＞
水溶性高分子をセルロースアセテート膜に含有させる方法として、セルロースアセテート膜上に、電気泳動用緩衝液の浸潤可能な媒体を置き、水溶性高分子を含有する緩衝液を、該媒体を介してセルロースアセテート膜に浸潤させる。電気泳動用緩衝液の浸潤可能な媒体としては、セルロース、ニトロセルロース、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のろ紙があげられるが、一般的には安価で、水溶性高分子の保持能力が優れたセルロースのろ紙が好ましい。
【００２８】
セルロースアセテート膜に含有させる水溶性高分子の量は、水溶性高分子の種類により、あるいは目的とするリポ蛋白の分離法により異なるが、セルロースアセテート膜を浸潤する緩衝液の粘度が１〜１０００ｃＰとなる濃度に調整する。より好ましい濃度は、緩衝液の粘度が１〜１００ｃＰとなる濃度であり、最も好ましい濃度は、緩衝液の粘度が１０〜５０ｃＰとなる濃度である。例えば、水溶性高分子として、デキストランを使用する場合、４％のデキストランＴ２０００を緩衝液に溶解した場合、緩衝液の粘度は約１５ｃＰであり、８％のデキストランＴ２０００を緩衝液に溶解した場合、緩衝液の粘度は約３０ｃＰである。
【００２９】
水溶性高分子をセルロースアセテート膜に浸潤させる場合、全体を浸潤させることもできるが、試料塗布点近辺から電気泳動する方向へ部分的に浸潤させ、セルロースアセテート膜の不連続緩衝液膜を作ることが望ましい。
【００３０】
水溶性高分子としては、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびアガロース等があげられるが、好ましくは、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースであり、最も好ましいのはデキストランである。
【００３１】
デキストランは、同じ濃度の溶液では、分子量が大きくなるに従って粘度が高くなる性質を有する。セルロースアセテート膜に含有させるデキストランは、平均分子量が４万、５万、７万、１０万、２０万、５０万、１００万または２００万のものを使用することができる。好ましいのは平均分子量５０万、１００万または２００万のデキストランであり、最も好ましいのは平均分子量２００万のデキストランである。平均分子量２００万のデキストランとしては、デキストランＴ２０００（アマシャム社製）を使用するのが好ましい。
【００３２】
＜セルロースアセテート膜電気泳動法によるリポ蛋白質の分離＞
セルロースアセテート膜を用いた電気泳動法は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（編集：堀尾武一、南江堂、１９９６年）、または「新生化学実験講座１、タンパク質Ｉ、分離・精製・性質」（東京化学同人、１９９０年）などに述べられた手法に従い行う。
【００３３】
本発明に用いる電気泳動装置としては、２３８型泳動装置（常光社製）、ＥＣ−１００（東洋濾紙社製）、ＡＥ−６１７０ＡＳ型（アトー社製）、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）などが適している。電気泳動用緩衝液としてはベロナール緩衝液、トリス緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液）などを使用する。より明確な分離を行うには、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．６〜ｐＨ８．８）が好ましい。検体塗布量は幅１ｃｍ当り、一般的には０．８〜２．４μＬとされているが、試料の濃度により適宜調整する。通電条件としては、通常行われる条件であれば、特に制限されないが、膜の幅１ｃｍあたり０．６〜０．８ｍＡ程度の電流を流すことが望ましい。この場合、電気泳動中のセルロースアセテート膜の温度は、一般に１０℃〜２５℃の範囲において一定とする。
【００３４】
本発明のセルロースアセテート膜電気泳動法により得られるリポ蛋白質は、電気泳動度の大きい方からＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬである。さらに、水溶性高分子の含量を調整することにより、リポ蛋白の連続的なサブクラスの存在も確認することができる。例えば、ＬＤＬのサブクラスについては、８％のデキストランＴ２０００を浸潤したセルロースアセテート膜を使用して電気泳動を行うことにより、ＬＤＬサブクラス１、ＬＤＬサブクラス２、ＬＤＬサブクラス３を確認することができる。
【００３５】
リポ蛋白質のサブクラスを分離解析する場合には、電気泳動を行う前に超遠心分離を行うことにより、ある種のリポ蛋白を除去し、目的のリポ蛋白質のサブクラスを効果的に分離することもできる。例えば、デキストラン硫酸と塩化マグネシウムの混液を試料に加えて超遠心分離を行う場合は、リポ蛋白質のＶＬＤＬとＬＤＬが沈殿除去されるため、ＨＤＬのサブクラスを解析することができる。
【００３６】
＜リポ蛋白質の免疫染色法＞
本発明の免疫染色法は、セルロースアセテート膜電気泳動法により分離したリポ蛋白質を、転写膜に転写し、該転写膜に抗リポ蛋白抗体を加えて反応させ、洗浄後、酵素標識第２抗体を反応させ、次いで発色試薬によりリポ蛋白を確認する方法である。
【００３７】
分離したリポ蛋白質を転写する膜は、従来公知のものが使用でき、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオライド膜等が好ましい。転写手段も従来公知の方法に基づき行う。Ｔｒｉｓ緩衝液などのブロッティング緩衝液を用い、通電して転写を行うこともできるが、分離にセルロースアセテート膜を使用した場合は、セルロースアセテート膜の下部に水溶液で湿らせたろ紙を敷き、毛細管現象を利用する転写方法が好ましい。転写した膜は、スキムミルク液や、ＢＳＡ溶液、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬（株））、などを用いてブロッキングを行う。
【００３８】
転写した膜上のリポ蛋白質には、一次抗体の抗リポ蛋白抗体を反応させる。反応は常法により行うことができる。例えば、転写膜を、スキムミルク液やＢＳＡ溶液、ＢｌｏｃｋＡｃｅ溶液で希釈した抗リポ蛋白の溶液中で、振盪することにより反応を行う。未反応の一次抗体は、例えばＴＢＳ溶液等により洗浄して除去する。抗ヒトリポ蛋白抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体などの市販の抗体を使用でき、検出するリポ蛋白の種類により、抗ヒトＬＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）、抗ヒトＨＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）などを使用する。
【００３９】
次いで、酵素を標識した二次抗体を反応させる。一次抗体と標識した二次抗体との反応は、例えば、スキムミルク溶液や、ＢＳＡ溶液、ＴＢＳ溶液中で振盪することにより行う。未反応の標識二次抗体は、例えばＴＢＳ溶液等により洗浄して除去する。標識二次抗体としては、酵素の種類によりペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体、β−ガラクトシダーゼ（ＧｌｕＯｘ）標識抗体等を使用することができる。酵素標識抗体は、最終的な検出法が、酵素の発色法によるか、あるいは蛍光法によるかを選択して使用する。例えば、ＰＯＤ標識抗体あるいはＡＬＰ標識抗体を用いた場合は、発色法も蛍光法も可能である。発色法あるいは蛍光法では、試薬と二次抗体に標識された酵素との反応により生成した生成物の発色または蛍光の発現度を測定する。
【００４０】
本発明では、二次抗体に標識された酵素と、発色試薬との反応により、二次抗体に結合したリポ蛋白質の検出を発色法で検出する。発色試薬としては、ｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ジアミノベンジジン（ＤＢＡ）、４−クロロ−１−ナフトール等を使用することができる。例えば、ＰＯＤ標識抗体と４−クロロ−１−ナフトール溶液を反応させた場合は、転写膜上に、リポ蛋白質に由来するブルーのバンドを観察することができる。
【００４１】
＜脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法＞
本発明における「脂質代謝異常」とは、血液中の脂質量が正常である場合と比較して、異常に多いあるいは少ない状態をいう。通常、血液中の脂質量はほぼ一定になるように常に調節されているが、何らかの原因により、血液中の脂質量のバランスが崩れ、血液中の脂質量に異常をきたす場合がある。血液中の脂質量が高過ぎると、通常、高脂血症と判断される。高脂血症は、動脈硬化性疾患の危険因子の一つであり、高脂血症患者では心筋梗塞、脳梗塞、狭心症等の疾患を発症する危険性が高い。一方、血液中の脂質量が極端に少ない場合は、肝臓や脳、血管などで栄養が不足し、脳出血や脳卒中の原因となる。特に若年者における低コレステロール血症は、脳出血の危険因子とされている。血液中では、脂質はリポ蛋白として存在しているため、脂質代謝異常に起因する疾患は、リポ蛋白粒子の分析を行うことにより検出することができる。例えば、コレステロール値および／またはトリグリセリド値が、正常値より高い患者のＶＬＤＬとＬＤＬのサブクラスとの分離は、セルロースアセテート膜に含有させる水溶性高分子の粘度を選択することによって可能である。また、ＨＤＬあるいはＬＤＬのサブクラスの分離形態は、本発明のセルロースアセテート膜を使用した電気泳動法を行った後、リポ蛋白を膜に転写して、免疫染色法により求めることができる。
【００４２】
脂質代謝異常に起因する疾患を検出するための、リポ蛋白質を含有する測定検体は、ヒト又は動物由来の検体であれば特に限定されない。例えば、血液、尿、血漿、血清、髄液、唾液、腹水若しくは羊水、汗、涙液、精液、大便、組織・細胞の抽出液など測定対象物が含まれる可能性のある生体試料であればよい。測定検体として好ましいのは、ヒトから採血して得た血液試料を、遠心分離などの常法に基づき成分分離して得られた血清あるいは血漿である。より高精度の測定とするために、この血清または血漿をさらに超遠心分離により分離したリポ蛋白質画分として用いることもできる。
【００４３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
血清中の各リポ蛋白質のセルロースアセテート膜による電気泳動法
【００４５】
＜電気泳動条件＞
セルロースアセテート膜：Ｓｅｐａｒａｘ ＳＰ（富士フィルム社製）、６０×４４ｍｍ
電気泳動装置：ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、２０℃、２５０Ｖ、２ｍＡ
膜緩衝液：４７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．８、Ｔｒｉｓ ４．５４ｇを１Ｎ塩酸でｐＨ調整後１００ｍｌに調製）、用時８倍希釈する。
電極緩衝液：３６５ｍＭＴｒｉｓホウ酸緩衝液（Ｔｒｉｓ４４．２ｇとホウ酸８．４ｇを１００ｍｌに溶解）
スキャナー：反射光デンシトメトリー（キャノン社製）
解析ソフト：Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトでバックグランド補正後、ｐｌｏｆｉｌｅ ｐｌｏｔ機能を用い、ｗｉｄｔｈ２０で解析する。
【００４６】
＜水溶性高分子含有セルロースアセテート膜の作成＞
セルロースアセテート膜Ｓｅｐａｒａｘ ＳＰの上に、試料塗布点から電気泳動方向へ５ｍｍ上部にろ紙を置き、４％または８％のデキストランＴ２０００（アマシャム社製、平均分子量２００万）を含む膜緩衝液を、ろ紙を介してセルロースアセテート膜に染み込ませ、分離ゾーンを作成した。また、ＤｅｘｔｒａｎＴ２０００を染み込ませていないセルロースアセテート膜の下部には、膜緩衝液を染み込ませ、試料濃縮ゾーンを作成した。作成した電気泳動用ろ紙の両端の上には、電極緩衝液を染み込ませた等電点用電極濾紙（アマシャム社製）を置いた。
【００４７】
＜試料血清＞
健常な成人男子（年齢４９歳、身長１８３ｃｍ、体重８６ｋｇ）の血清１０容に対し、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ Ｂ染色液１容を混合し、１時間放置後遠心分離して、その上清１．６μＬを、０．８ｃｍの長さに電気泳動用膜に塗布した。
【００４８】
＜泳動時間＞
平行レーンのＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）血清のアルブミンが２．５ｃｍ移動するまで通電した。約８分を要し、約３０ＡＶｈであった。
【００４９】
＜血清中のリポ蛋白質の泳動結果＞
図１に示すように、デキストランＴ２０００を４％添加した膜ではＬＤＬに先行してＶＬＤＬがあり、デキストランＴ２０００を８％添加した膜では、ＬＤＬの後、緩衝液の境界線付近にＶＬＤＬが泳動され、ＨＤＬは常に他のリポ蛋白質に先行している。すなわち８％デキストランの存在下では、リポ蛋白質は粒子サイズの順に泳動されることがわかった。
【実施例２】
【００５０】
血清中のリポ蛋白質ＬＤＬサブクラスとＶＬＤＬのセルロースアセテート膜電気泳動法による分離
【００５１】
＜電気泳動条件＞
実施例１と同様のセルロースアセテート膜、装置、緩衝液等を用いた。
＜水溶性高分子含有セルロースアセテート膜の作成＞
デキストランＴ２０００を８％含む膜緩衝液を用いて、実施例１と同様に、セルロースアセテート膜Ｓｅｐａｒａｘ ＳＰを処理して作成した。
【００５２】
＜試料血清＞
高脂血症患者の成人６名および健常人１名から、それぞれ得られた血清を用いた。血清中のコレステロール値およびトリグリセライド値はあらかじめ測定しておいた。血清は、実施例１と同様に処理し、その上清１．６μＬを、０．８ｃｍの長さに電気泳動用膜に塗布した。
【００５３】
＜血清中のリポ蛋白質ＬＤＬサブクラスとＶＬＤＬの泳動結果＞
塗布点から上位に、ＶＬＤＬ、ＬＤＬサブクラスを示すバンドが観察された。この膜を反射光デンシトメトリーにより測定した。結果を図２に示す。また、ＶＬＤＬとＬＤＬサブクラス間の電気泳動距離を表１に表した。この結果から、高脂血症患者では、ＬＤＬサブクラス２およびＬＤＬサブクラス３の増加が何らかの影響を及ぼしているものと推測された。
【００５４】
【表１】
【実施例３】
【００５５】
血清中のリポ蛋白質ＬＤＬとＨＤＬの免疫染色法
高脂血症患者６名および健常人１名から、それぞれ得られた血清を用い、実施例１と同様の手法で電気泳動を行った。リポ蛋白質のＶＬＤＬ、ＬＤＬ，ＨＤＬがセルロースアセテート膜上に分離した。
【００５６】
＜ブロッティング＞
電気泳動後のセルロースアセテート膜をニトロセルロース膜（シュライヒャシュレル社製）に転写した。すなわち、水に湿らせたろ紙の上に泳動後のセルロースアセテート膜を置き、次いでニトロセルロース転写膜を重ね、さらに上部に乾いたろ紙を置き水分が浸み込むまで３分間放置した。毛細管現象により、リポ蛋白質はニトロセルロース膜にブロッティングされた。
【００５７】
＜免疫染色法＞
ニトロセルロース膜に転写後、５％スキムミルク溶解５０ｍＭトリス塩酸緩衝生理食塩水液（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）のブロッキング液で、振とう機にて室温３０分間振とうし、ブロッキングした。次に抗ＬＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）、または抗ＨＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）を上記ブロッキング試薬にて１：１０００に希釈し、室温で１晩振とうして反応させた。反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分間振とう洗浄を３回行い、次いで、上記ブロッキング試薬にて１：１０００に希釈したＰＯＤ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（シグマアルドリッチ社製）を加えて室温で３時間反応させた。反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分間振とう洗浄を３回行い、洗浄後、発色試薬の４−クロロ−１−ナフトールＰＢＳ（２０％メタノール）溶液および過酸化水素水を加え５分間振とうして発色させた。反応停止は蒸留水により行ない、ＬＤＬのサブクラスまたはＨＤＬのサブクラスの有無を健常者のパターンと比較した。
【００５８】
＜血清中のリポ蛋白質ＬＤＬのサブクラスまたはＨＤＬのサブクラスの泳動結果＞
図３に示すように、ＬＤＬおよびＨＤＬのパターンから、高脂血症患者と健常者では、ＬＤＬサブクラスまたはＨＤＬサブクラスの存在形態が異なることがわかった。従って、この方法は高脂血症患者の検出に有効と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のセルロースアセテート膜を用いた電気泳動法は、各リポ蛋白質を明確に分離することができ、また、各リポ蛋白質のサブクラスの解析も可能であるため、高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患を検出できる簡便な検査法として利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】４％または８％のデキストランＴ２０００を含む緩衝液を膜に含有させ、健常な成人男子の血清を用いて、電気泳動を行った図面に代わる写真である。
【図２】８％のデキストランＴ２０００を含む緩衝液を膜に含有させ、高脂血症および正常コレステロール濃度の血清を用いて、電気泳動を行った図面に代わる写真と、写真の電気泳動パターンを反射光デンシトメトリーで測定したチャート図である。
【図３】８％のデキストランＴ２０００を含む緩衝液を膜に含有させ、高脂血症および正常コレステロール濃度の血清を用いて、電気泳動を行った後、ブロッティングしたものを免疫染色した、ＨＤＬおよびＬＤＬのサブクラスを観察できる図面に代わる写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動法によるリポ蛋白質の分離方法に関する。また、電気泳動により分離したリポ蛋白質を免疫染色し、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を確認することにより脂質代謝異常に起因する疾患の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の各リポ蛋白質の量的および質的異常を検出することにより、脂質代謝異常を推定することができる。そのため、リポ蛋白質の分離分析法は、高脂血症、冠動脈硬化症、甲状腺機能低下症、閉塞性肝疾患、糖尿病、腎不全などの脂質代謝異常に起因する疾患の診断や治療にとって大切な臨床検査の一つとなっている。
【０００３】
リポ蛋白質は脂質と蛋白質とが結合した粒子であり、血液中では可溶化しており、脂質を運ぶ役割を担っている。リポ蛋白質の種類として、比重の軽い方から示すと、カイロミクロン（ＣＨＹＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポ蛋白質（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）等がある。リポ蛋白質の比重、電気的易動度、粒子サイズの違いは、リポ蛋白質を構成する脂質と蛋白（アポ蛋白）の割合、蛋白（アポ蛋白）の種類の異なることに由来する。リポ蛋白質を構成する脂質は、トリグリセライド、コレステロールエステル、遊離型コレステロール、リン脂質があり、リポ蛋白質を構成するアポ蛋白の主なものとしてアポＡＩ、アポＡＩＩ、アポＢ‐１００、アポＢ‐４８、アポＣＩ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩ、アポＥなどがある。
【０００４】
脂質代謝異常に起因する主たる疾患である高脂血症は、１種類または２種類のリポ蛋白質の増量によって生じるものである。各種高脂血症の分類は、原発性および二次性高脂血症の成因や病態の解析、治療法の判定のために重要である。Ｉ型の高脂血症は、先天性リポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）の欠損や、先天性アポＣＩＩ欠損が原因で発症する。ＩＩａ型の高脂血症は、ＬＤＬ受容体の異常が原因でＬＤＬが増加し、遺伝性の家族性高コレステロール血症を発症する。家族性高コレステロール血症は、ヘテロ型とホモ型があり、ヘテロ型は、５００人に１人程度と、頻度が高く存在し、ホモ型は、１００万人に１人程度と、頻度は稀だが、若いうちから動脈硬化などを発症し易く、治療が必要である。ＬＤＬとＶＬＤＬが増加する高脂血症ＩＩｂ型と、ＶＬＤＬが増加するＩＶ型は二次性高脂血症として糖尿病を続発することが多い。ＩＩＩ型の高脂血症は、ＩＤＬが増加し、Ｖ型の高脂血症は、ＣＨＹＬとＶＬＤＬが増加する。日本で最も多く発症が見られるのはＩＩａ型の高脂血症であることから、リポ蛋白質のＬＤＬの増加を観察することはＩＩａ型の高脂血症の診断および治療のために重要である。
【０００５】
リポ蛋白質の分画法としては、超遠心法や、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）、アガロースゲル、セルロースアセテート膜を支持体として用いた電気泳動法、高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）による方法がある。
【０００６】
超遠心法では、血清中のリポ蛋白質は、該リポ蛋白質の比重に基づいて、上液よりＣＨＹＬ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬに分離される。しかし、超遠心法は、超遠心機用試料の調製や処理に手間がかかりまた時間を要するため、臨床検査の現場において、特定の疾患に特有の分画の検出やその分画の増減など、詳細な解析を伴う分析を行うことは困難である。
【０００７】
一方、電気泳動法は、リポ蛋白質の分離状況を視覚的に捕えることができるため、日常の検査では多くの場合、電気泳動法を用いてリポ蛋白質の分離分析を行っている。
【０００８】
ＰＡＧ電気泳動法は、所定のポアサイズを有し、分子篩効果が高いポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）を用いた電気泳動法であり、リポ蛋白質は、粒子のサイズが最も小さいＨＤＬが先に分離され、次にＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＨＹＬの順で分離される。すなわち、この方法は、リポ蛋白質中の各粒子の等電点の違いではなく、リポ蛋白質中の各粒子の大きさの違いに基づいて分画されている。しかしながらＰＡＧ電気泳動法は、ゲル濃度を低くするため、ゲルが軟弱で、ブロッティングや染色等の２次分析への展開が困難であり、詳細な解析を要する分析を行うことは困難である。
【０００９】
アガロースゲル電気泳動法は、ＰＡＧ電気泳動法によるリポ蛋白質中の各粒子の大きさだけの違いではなく、異なる種類や異なる数のアポ蛋白を持つ粒子の、アポ蛋白の質的異常または量的異常を分析する方法として知られている。例えば、アポ蛋白Ｂ−１００が変性したＬＤＬの分画と、ＬＤＬが変性していない正常なＬＤＬの分画との比較を行い、脂質代謝に直接関与しているアポ蛋白の異常を捕らえる方法（特許文献１）等がある。
【００１０】
リポ蛋白質のセルロースアセテート膜を利用した電気泳動法としては、セルロースアセテートを主成分とする微多孔質膜に、添加剤としてポリオキシエチレンソルビト−ル脂肪酸エステルを一定の重量比で含有させて作成した膜により、α２−グロブリンとβ−グロブリンの分離に影響を与える低比重リポ蛋白質の影響をなくし、血清タンパクの正確な分画百分率の測定を行うセルロースアセテート膜を提供した文献（特許文献２）があるが、各リポ蛋白質を分離する方法を明らかにしたものではない。また、セルロースアセテート膜電気泳動法を利用した疾患の検出法として、糖尿病患者の尿中アルブミン分解物を検出することによって早期の糖尿病性腎症の診断方法が明らかにされている（特許文献３）が、脂質代謝異常を推定する方法を明らかにしたものではない。
【００１１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用したリポ蛋白質の分離法では、分子篩い効果を有するゲルを充填したゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて、ＬＤＬとＨＤＬのサブクラスの分析を行うことにより代謝動態や病態の診断が可能となったことを明らかにしている。（特許文献４）
【００１２】
免疫測定法としては、血液中に存在するＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬなどのリポ蛋白が変性した、変性リポ蛋白の検出方法として、酵素免疫法、ラテックス凝集法、免疫発光分析法、イムノクロマト法などの免疫学的手法を用い、マイクロプレート上で発色法により測定する方法（特許文献５）や、血液中のＬＤＬおよび変性ＬＤＬを、超遠心法または硫酸デキストラン／Ｃａ沈澱法により前処理して調整し、溶液中で標識物質の発色法により測定する方法（特許文献６）等が知られているが、セルロースアセテート膜電気泳動法を利用した、リポ蛋白質の免疫測定法は知られていない。
【特許文献１】特開２０００−３５６６４１広報
【特許文献２】特開平６−６６７６８公報
【特許文献３】特開平６−１６０３８４公報
【特許文献４】特開２００２−１３９５０１公報
【特許文献５】特開２００１−６６３０７公報
【特許文献６】特開２００３−２２７８３７公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患は、各リポ蛋白質の質的あるいは量的な異常によることから、各リポ蛋白質あるいは、特定のリポ蛋白質のサブクラスの増減を簡便な手法で測定することは、脂質代謝異常に起因する疾患を検出するために重要である。本発明は、電気泳動法を用いたリポ蛋白質の新規な分離方法を提供すること、さらにリポ蛋白質のサブクラスの存在形態を指標として高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、電気泳動法に用いるセルロースアセテート膜に水溶性高分子を含有させることにより、良好なリポ蛋白質の分離が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の構成を有する。
【００１５】
（１）電気泳動用のセルロースアセテート膜であって、検体中のリポ蛋白質の分離に用いる水溶性高分子を含有させたセルロースアセテート膜。
【００１６】
（２）上記水溶性高分子の含有量が、セルロースアセテート膜を浸潤する緩衝液の粘度を１０〜５０ｃＰとなる濃度に調整することを特徴とするセルロースアセテート膜。
【００１７】
（３）（１）または（２）に記載の水溶性高分子が、デキストランであることを特徴とするセルロースアセテート膜。
【００１８】
（４）（３）に記載のデキストランの分子量が、４万〜２００万であることを特徴とするセルロースアセテート膜。
【００１９】
（５）検体中に含まれるリポ蛋白質を、（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【００２０】
（６）検体中に含まれるリポ蛋白質を、（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質抗体を反応させた後、酵素を標識した二次抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【００２１】
（７）検体中に含まれるリポ蛋白質を、（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質ヒツジ抗体を反応させた後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【００２２】
（８）検体中に含まれるリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を（５）〜（７）のいずれかに記載の分離方法を用いて確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
【００２３】
（９）脂質代謝異常に起因する疾患が、高脂血症、高コレステロール血症および低コレステロール血症であることを特徴とする（８）に記載の脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
（１０）（５）〜（７）のいずれかに記載の電気泳動法による分離方法を実施するために用いるキット。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のセルロースアセテート膜を用いた電気泳動法では、検体中のリポ蛋白質のサブクラスを容易に分離分析することができるため、日常的な臨床検査の現場において、脂質代謝異常に起因する疾患の各病態の検出が可能となり、各疾患に適切な処置を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の、リポ蛋白質の分離分析法は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動法によるものである。電気泳動によるリポ蛋白質の分離は、一般的には等電点の違いに基づくが、リポ蛋白質中の各粒子の大きさの違いに基づいた分画は、サブクラスを観察する場合においても重要である。
【００２６】
セルロースアセテート膜電気泳動法は、１９５７年にＫｏｈｎ．Ｊが血清蛋白の分析法として発表して以来、研究分野あるいは臨床分野で多く利用されている。さらに、セルロースアセテート膜についても、蛋白質の分離に優れた膜が開発されてきた。本発明に用いるセルロースアセテート膜は、通常の血漿タンパク異常のスクリーニングで使用されるものであれば、各種市販されているものを使用することができる。例えば、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）を素材とする多孔質膜Ｓｅｐａｒａｘ−Ｓ（富士フィルム社製）、Ｓｅｐａｒａｘ−ＥＦ（富士フィルム社製）、Ｓｅｐａｒａｘ−ＳＰ（富士フィルム社製）等のほか、セラフォア（Ｓｈａｄｏｎ社製）、セレカV（東洋濾紙社製）があるが、リポ蛋白質の分離には、Ｓｅｐａｒａｘ−ＳＰを使用することが望ましい。
【００２７】
＜水溶性高分子含有セルロースアセテート膜の作成＞
水溶性高分子をセルロースアセテート膜に含有させる方法として、セルロースアセテート膜上に、電気泳動用緩衝液の浸潤可能な媒体を置き、水溶性高分子を含有する緩衝液を、該媒体を介してセルロースアセテート膜に浸潤させる。電気泳動用緩衝液の浸潤可能な媒体としては、セルロース、ニトロセルロース、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のろ紙があげられるが、一般的には安価で、水溶性高分子の保持能力が優れたセルロースのろ紙が好ましい。
【００２８】
セルロースアセテート膜に含有させる水溶性高分子の量は、水溶性高分子の種類により、あるいは目的とするリポ蛋白の分離法により異なるが、セルロースアセテート膜を浸潤する緩衝液の粘度が１〜１０００ｃＰとなる濃度に調整する。より好ましい濃度は、緩衝液の粘度が１〜１００ｃＰとなる濃度であり、最も好ましい濃度は、緩衝液の粘度が１０〜５０ｃＰとなる濃度である。例えば、水溶性高分子として、デキストランを使用する場合、４％のデキストランＴ２０００を緩衝液に溶解した場合、緩衝液の粘度は約１５ｃＰであり、８％のデキストランＴ２０００を緩衝液に溶解した場合、緩衝液の粘度は約３０ｃＰである。
【００２９】
水溶性高分子をセルロースアセテート膜に浸潤させる場合、全体を浸潤させることもできるが、試料塗布点近辺から電気泳動する方向へ部分的に浸潤させ、セルロースアセテート膜の不連続緩衝液膜を作ることが望ましい。
【００３０】
水溶性高分子としては、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびアガロース等があげられるが、好ましくは、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースであり、最も好ましいのはデキストランである。
【００３１】
デキストランは、同じ濃度の溶液では、分子量が大きくなるに従って粘度が高くなる性質を有する。セルロースアセテート膜に含有させるデキストランは、平均分子量が４万、５万、７万、１０万、２０万、５０万、１００万または２００万のものを使用することができる。好ましいのは平均分子量５０万、１００万または２００万のデキストランであり、最も好ましいのは平均分子量２００万のデキストランである。平均分子量２００万のデキストランとしては、デキストランＴ２０００（アマシャム社製）を使用するのが好ましい。
【００３２】
＜セルロースアセテート膜電気泳動法によるリポ蛋白質の分離＞
セルロースアセテート膜を用いた電気泳動法は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（編集：堀尾武一、南江堂、１９９６年）、または「新生化学実験講座１、タンパク質Ｉ、分離・精製・性質」（東京化学同人、１９９０年）などに述べられた手法に従い行う。
【００３３】
本発明に用いる電気泳動装置としては、２３８型泳動装置（常光社製）、ＥＣ−１００（東洋濾紙社製）、ＡＥ−６１７０ＡＳ型（アトー社製）、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）などが適している。電気泳動用緩衝液としてはベロナール緩衝液、トリス緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液）などを使用する。より明確な分離を行うには、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．６〜ｐＨ８．８）が好ましい。検体塗布量は幅１ｃｍ当り、一般的には０．８〜２．４μＬとされているが、試料の濃度により適宜調整する。通電条件としては、通常行われる条件であれば、特に制限されないが、膜の幅１ｃｍあたり０．６〜０．８ｍＡ程度の電流を流すことが望ましい。この場合、電気泳動中のセルロースアセテート膜の温度は、一般に１０℃〜２５℃の範囲において一定とする。
【００３４】
本発明のセルロースアセテート膜電気泳動法により得られるリポ蛋白質は、電気泳動度の大きい方からＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬである。さらに、水溶性高分子の含量を調整することにより、リポ蛋白の連続的なサブクラスの存在も確認することができる。例えば、ＬＤＬのサブクラスについては、８％のデキストランＴ２０００を浸潤したセルロースアセテート膜を使用して電気泳動を行うことにより、ＬＤＬサブクラス１、ＬＤＬサブクラス２、ＬＤＬサブクラス３を確認することができる。
【００３５】
リポ蛋白質のサブクラスを分離解析する場合には、電気泳動を行う前に超遠心分離を行うことにより、ある種のリポ蛋白を除去し、目的のリポ蛋白質のサブクラスを効果的に分離することもできる。例えば、デキストラン硫酸と塩化マグネシウムの混液を試料に加えて超遠心分離を行う場合は、リポ蛋白質のＶＬＤＬとＬＤＬが沈殿除去されるため、ＨＤＬのサブクラスを解析することができる。
【００３６】
＜リポ蛋白質の免疫染色法＞
本発明の免疫染色法は、セルロースアセテート膜電気泳動法により分離したリポ蛋白質を、転写膜に転写し、該転写膜に抗リポ蛋白抗体を加えて反応させ、洗浄後、酵素標識第２抗体を反応させ、次いで発色試薬によりリポ蛋白を確認する方法である。
【００３７】
分離したリポ蛋白質を転写する膜は、従来公知のものが使用でき、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオライド膜等が好ましい。転写手段も従来公知の方法に基づき行う。Ｔｒｉｓ緩衝液などのブロッティング緩衝液を用い、通電して転写を行うこともできるが、分離にセルロースアセテート膜を使用した場合は、セルロースアセテート膜の下部に水溶液で湿らせたろ紙を敷き、毛細管現象を利用する転写方法が好ましい。転写した膜は、スキムミルク液や、ＢＳＡ溶液、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬（株））、などを用いてブロッキングを行う。
【００３８】
転写した膜上のリポ蛋白質には、一次抗体の抗リポ蛋白抗体を反応させる。反応は常法により行うことができる。例えば、転写膜を、スキムミルク液やＢＳＡ溶液、ＢｌｏｃｋＡｃｅ溶液で希釈した抗リポ蛋白の溶液中で、振盪することにより反応を行う。未反応の一次抗体は、例えばＴＢＳ溶液等により洗浄して除去する。抗ヒトリポ蛋白抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体などの市販の抗体を使用でき、検出するリポ蛋白の種類により、抗ヒトＬＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）、抗ヒトＨＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）などを使用する。
【００３９】
次いで、酵素を標識した二次抗体を反応させる。一次抗体と標識した二次抗体との反応は、例えば、スキムミルク溶液や、ＢＳＡ溶液、ＴＢＳ溶液中で振盪することにより行う。未反応の標識二次抗体は、例えばＴＢＳ溶液等により洗浄して除去する。標識二次抗体としては、酵素の種類によりペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体、β−ガラクトシダーゼ（ＧｌｕＯｘ）標識抗体等を使用することができる。酵素標識抗体は、最終的な検出法が、酵素の発色法によるか、あるいは蛍光法によるかを選択して使用する。例えば、ＰＯＤ標識抗体あるいはＡＬＰ標識抗体を用いた場合は、発色法も蛍光法も可能である。発色法あるいは蛍光法では、試薬と二次抗体に標識された酵素との反応により生成した生成物の発色または蛍光の発現度を測定する。
【００４０】
本発明では、二次抗体に標識された酵素と、発色試薬との反応により、二次抗体に結合したリポ蛋白質の検出を発色法で検出する。発色試薬としては、ｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ジアミノベンジジン（ＤＢＡ）、４−クロロ−１−ナフトール等を使用することができる。例えば、ＰＯＤ標識抗体と４−クロロ−１−ナフトール溶液を反応させた場合は、転写膜上に、リポ蛋白質に由来するブルーのバンドを観察することができる。
【００４１】
＜脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法＞
本発明における「脂質代謝異常」とは、血液中の脂質量が正常である場合と比較して、異常に多いあるいは少ない状態をいう。通常、血液中の脂質量はほぼ一定になるように常に調節されているが、何らかの原因により、血液中の脂質量のバランスが崩れ、血液中の脂質量に異常をきたす場合がある。血液中の脂質量が高過ぎると、通常、高脂血症と判断される。高脂血症は、動脈硬化性疾患の危険因子の一つであり、高脂血症患者では心筋梗塞、脳梗塞、狭心症等の疾患を発症する危険性が高い。一方、血液中の脂質量が極端に少ない場合は、肝臓や脳、血管などで栄養が不足し、脳出血や脳卒中の原因となる。特に若年者における低コレステロール血症は、脳出血の危険因子とされている。血液中では、脂質はリポ蛋白として存在しているため、脂質代謝異常に起因する疾患は、リポ蛋白粒子の分析を行うことにより検出することができる。例えば、コレステロール値および／またはトリグリセリド値が、正常値より高い患者のＶＬＤＬとＬＤＬのサブクラスとの分離は、セルロースアセテート膜に含有させる水溶性高分子の粘度を選択することによって可能である。また、ＨＤＬあるいはＬＤＬのサブクラスの分離形態は、本発明のセルロースアセテート膜を使用した電気泳動法を行った後、リポ蛋白を膜に転写して、免疫染色法により求めることができる。
【００４２】
脂質代謝異常に起因する疾患を検出するための、リポ蛋白質を含有する測定検体は、ヒト又は動物由来の検体であれば特に限定されない。例えば、血液、尿、血漿、血清、髄液、唾液、腹水若しくは羊水、汗、涙液、精液、大便、組織・細胞の抽出液など測定対象物が含まれる可能性のある生体試料であればよい。測定検体として好ましいのは、ヒトから採血して得た血液試料を、遠心分離などの常法に基づき成分分離して得られた血清あるいは血漿である。より高精度の測定とするために、この血清または血漿をさらに超遠心分離により分離したリポ蛋白質画分として用いることもできる。
【００４３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
血清中の各リポ蛋白質のセルロースアセテート膜による電気泳動法
【００４５】
＜電気泳動条件＞
セルロースアセテート膜：Ｓｅｐａｒａｘ ＳＰ（富士フィルム社製）、６０×４４ｍｍ
電気泳動装置：ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、２０℃、２５０Ｖ、２ｍＡ
膜緩衝液：４７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．８、Ｔｒｉｓ ４．５４ｇを１Ｎ塩酸でｐＨ調整後１００ｍｌに調製）、用時８倍希釈する。
電極緩衝液：３６５ｍＭＴｒｉｓホウ酸緩衝液（Ｔｒｉｓ４４．２ｇとホウ酸８．４ｇを１００ｍｌに溶解）
スキャナー：反射光デンシトメトリー（キャノン社製）
解析ソフト：Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトでバックグランド補正後、ｐｌｏｆｉｌｅ ｐｌｏｔ機能を用い、ｗｉｄｔｈ２０で解析する。
【００４６】
＜水溶性高分子含有セルロースアセテート膜の作成＞
セルロースアセテート膜Ｓｅｐａｒａｘ ＳＰの上に、試料塗布点から電気泳動方向へ５ｍｍ上部にろ紙を置き、４％または８％のデキストランＴ２０００（アマシャム社製、平均分子量２００万）を含む膜緩衝液を、ろ紙を介してセルロースアセテート膜に染み込ませ、分離ゾーンを作成した。また、ＤｅｘｔｒａｎＴ２０００を染み込ませていないセルロースアセテート膜の下部には、膜緩衝液を染み込ませ、試料濃縮ゾーンを作成した。作成した電気泳動用ろ紙の両端の上には、電極緩衝液を染み込ませた等電点用電極濾紙（アマシャム社製）を置いた。
【００４７】
＜試料血清＞
健常な成人男子（年齢４９歳、身長１８３ｃｍ、体重８６ｋｇ）の血清１０容に対し、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ Ｂ染色液１容を混合し、１時間放置後遠心分離して、その上清１．６μＬを、０．８ｃｍの長さに電気泳動用膜に塗布した。
【００４８】
＜泳動時間＞
平行レーンのＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）血清のアルブミンが２．５ｃｍ移動するまで通電した。約８分を要し、約３０ＡＶｈであった。
【００４９】
＜血清中のリポ蛋白質の泳動結果＞
図１に示すように、デキストランＴ２０００を４％添加した膜ではＬＤＬに先行してＶＬＤＬがあり、デキストランＴ２０００を８％添加した膜では、ＬＤＬの後、緩衝液の境界線付近にＶＬＤＬが泳動され、ＨＤＬは常に他のリポ蛋白質に先行している。すなわち８％デキストランの存在下では、リポ蛋白質は粒子サイズの順に泳動されることがわかった。
【実施例２】
【００５０】
血清中のリポ蛋白質ＬＤＬサブクラスとＶＬＤＬのセルロースアセテート膜電気泳動法による分離
【００５１】
＜電気泳動条件＞
実施例１と同様のセルロースアセテート膜、装置、緩衝液等を用いた。
＜水溶性高分子含有セルロースアセテート膜の作成＞
デキストランＴ２０００を８％含む膜緩衝液を用いて、実施例１と同様に、セルロースアセテート膜Ｓｅｐａｒａｘ ＳＰを処理して作成した。
【００５２】
＜試料血清＞
高脂血症患者の成人６名および健常人１名から、それぞれ得られた血清を用いた。血清中のコレステロール値およびトリグリセライド値はあらかじめ測定しておいた。血清は、実施例１と同様に処理し、その上清１．６μＬを、０．８ｃｍの長さに電気泳動用膜に塗布した。
【００５３】
＜血清中のリポ蛋白質ＬＤＬサブクラスとＶＬＤＬの泳動結果＞
塗布点から上位に、ＶＬＤＬ、ＬＤＬサブクラスを示すバンドが観察された。この膜を反射光デンシトメトリーにより測定した。結果を図２に示す。また、ＶＬＤＬとＬＤＬサブクラス間の電気泳動距離を表１に表した。この結果から、高脂血症患者では、ＬＤＬサブクラス２およびＬＤＬサブクラス３の増加が何らかの影響を及ぼしているものと推測された。
【００５４】
【表１】
【実施例３】
【００５５】
血清中のリポ蛋白質ＬＤＬとＨＤＬの免疫染色法
高脂血症患者６名および健常人１名から、それぞれ得られた血清を用い、実施例１と同様の手法で電気泳動を行った。リポ蛋白質のＶＬＤＬ、ＬＤＬ，ＨＤＬがセルロースアセテート膜上に分離した。
【００５６】
＜ブロッティング＞
電気泳動後のセルロースアセテート膜をニトロセルロース膜（シュライヒャシュレル社製）に転写した。すなわち、水に湿らせたろ紙の上に泳動後のセルロースアセテート膜を置き、次いでニトロセルロース転写膜を重ね、さらに上部に乾いたろ紙を置き水分が浸み込むまで３分間放置した。毛細管現象により、リポ蛋白質はニトロセルロース膜にブロッティングされた。
【００５７】
＜免疫染色法＞
ニトロセルロース膜に転写後、５％スキムミルク溶解５０ｍＭトリス塩酸緩衝生理食塩水液（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）のブロッキング液で、振とう機にて室温３０分間振とうし、ブロッキングした。次に抗ＬＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）、または抗ＨＤＬヒツジ抗体（シグマアルドリッチ社製）を上記ブロッキング試薬にて１：１０００に希釈し、室温で１晩振とうして反応させた。反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分間振とう洗浄を３回行い、次いで、上記ブロッキング試薬にて１：１０００に希釈したＰＯＤ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（シグマアルドリッチ社製）を加えて室温で３時間反応させた。反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分間振とう洗浄を３回行い、洗浄後、発色試薬の４−クロロ−１−ナフトールＰＢＳ（２０％メタノール）溶液および過酸化水素水を加え５分間振とうして発色させた。反応停止は蒸留水により行ない、ＬＤＬのサブクラスまたはＨＤＬのサブクラスの有無を健常者のパターンと比較した。
【００５８】
＜血清中のリポ蛋白質ＬＤＬのサブクラスまたはＨＤＬのサブクラスの泳動結果＞
図３に示すように、ＬＤＬおよびＨＤＬのパターンから、高脂血症患者と健常者では、ＬＤＬサブクラスまたはＨＤＬサブクラスの存在形態が異なることがわかった。従って、この方法は高脂血症患者の検出に有効と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のセルロースアセテート膜を用いた電気泳動法は、各リポ蛋白質を明確に分離することができ、また、各リポ蛋白質のサブクラスの解析も可能であるため、高脂血症に代表される脂質代謝異常に起因する疾患を検出できる簡便な検査法として利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】４％または８％のデキストランＴ２０００を含む緩衝液を膜に含有させ、健常な成人男子の血清を用いて、電気泳動を行った図面に代わる写真である。
【図２】８％のデキストランＴ２０００を含む緩衝液を膜に含有させ、高脂血症および正常コレステロール濃度の血清を用いて、電気泳動を行った図面に代わる写真と、写真の電気泳動パターンを反射光デンシトメトリーで測定したチャート図である。
【図３】８％のデキストランＴ２０００を含む緩衝液を膜に含有させ、高脂血症および正常コレステロール濃度の血清を用いて、電気泳動を行った後、ブロッティングしたものを免疫染色した、ＨＤＬおよびＬＤＬのサブクラスを観察できる図面に代わる写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動用のセルロースアセテート膜であって、検体中のリポ蛋白質の分離に用いる水溶性高分子を含有させたセルロースアセテート膜。
【請求項２】
水溶性高分子の含有量が、セルロースアセテート膜を浸潤する緩衝液の粘度を１０〜５０ｃＰとなる濃度に調整することを特徴とする請求項１に記載のセルロースアセテート膜。
【請求項３】
水溶性高分子が、デキストランであることを特徴とする請求項１または２に記載のセルロースアセテート膜。
【請求項４】
デキストランの分子量が、４万〜２００万であることを特徴とする請求項３に記載のセルロースアセテート膜。
【請求項５】
検体中に含まれるリポ蛋白質を、請求項１〜４のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項６】
検体中に含まれるリポ蛋白質を、請求項１〜４のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質抗体を反応させた後、酵素を標識した二次抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項７】
検体中に含まれるリポ蛋白質を、請求項１〜４のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質ヒツジ抗体を反応させた後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項８】
検体中に含まれるリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を、請求項請求項５〜７のいずれかに記載の分離方法を用いて確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
【請求項９】
脂質代謝異常に起因する疾患が、高脂血症、高コレステロール血症および低コレス
テロール血症であることを特徴とする請求項８に記載の脂質代謝異常に起因する疾
患を検出する方法。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれかに記載の電気泳動法による分離方法を実施するために用
いるキット。
【請求項１】
電気泳動用のセルロースアセテート膜であって、検体中のリポ蛋白質の分離に用いる水溶性高分子を含有させたセルロースアセテート膜。
【請求項２】
水溶性高分子の含有量が、セルロースアセテート膜を浸潤する緩衝液の粘度を１０〜５０ｃＰとなる濃度に調整することを特徴とする請求項１に記載のセルロースアセテート膜。
【請求項３】
水溶性高分子が、デキストランであることを特徴とする請求項１または２に記載のセルロースアセテート膜。
【請求項４】
デキストランの分子量が、４万〜２００万であることを特徴とする請求項３に記載のセルロースアセテート膜。
【請求項５】
検体中に含まれるリポ蛋白質を、請求項１〜４のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項６】
検体中に含まれるリポ蛋白質を、請求項１〜４のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質抗体を反応させた後、酵素を標識した二次抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項７】
検体中に含まれるリポ蛋白質を、請求項１〜４のいずれかに記載のセルロースアセテート膜を用いて、電気泳動法により分離し、次いで、分離された膜上のリポ蛋白質を転写用膜に転写し、該転写膜に一次抗体として抗リポ蛋白質ヒツジ抗体を反応させた後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項８】
検体中に含まれるリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を、請求項請求項５〜７のいずれかに記載の分離方法を用いて確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法。
【請求項９】
脂質代謝異常に起因する疾患が、高脂血症、高コレステロール血症および低コレス
テロール血症であることを特徴とする請求項８に記載の脂質代謝異常に起因する疾
患を検出する方法。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれかに記載の電気泳動法による分離方法を実施するために用
いるキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２４８１３１（Ｐ２００７−２４８１３１Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６９３１８（Ｐ２００６−６９３１８）
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年１０月１５日 日本電気泳動学会発行の「生物物理化学第４９巻補冊」に発表
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年１０月１５日 日本電気泳動学会発行の「生物物理化学第４９巻補冊」に発表
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]