セルロース分解を促進するタンパク質及びその利用とその生産方法
【課題】
セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質及びそれをコードする遺伝子の提供、該タンパク質を利用してセルロース分解を促進し、効率良くかつコスト削減を可能とする方法の提供。
【解決手段】
以下の（ａ）または（ｂ）である、イネいもち病菌由来あるいは枯草菌由来のタンパク質を用いてセルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
枯草菌を宿主細胞とすることで大量生産が可能である。
セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質及びそれをコードする遺伝子の提供、該タンパク質を利用してセルロース分解を促進し、効率良くかつコスト削減を可能とする方法の提供。
【解決手段】
以下の（ａ）または（ｂ）である、イネいもち病菌由来あるいは枯草菌由来のタンパク質を用いてセルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
枯草菌を宿主細胞とすることで大量生産が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質及びその利用及びその生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年化石資源の枯渇化や二酸化炭素濃度の上昇による地球規模の温暖化が懸念されており、今後化石資源に依存しない資源循環型のエネルギーの創出が求められている。特に自動車を中心とする大型機械の稼働力となるガソリンの代替エネルギーとして植物から製造されるバイオエタノールが脚光を浴びている。主として、サトウキビやトウモロコシなどをバイオエタノールの原料として利用しているため、食料との競合により価格が高騰している。
【０００３】
食料との競合や価格の高騰をさけるため、次世代のバイオエタノール原料として、非食部である植物の茎や葉に含まれるセルロース（細胞壁の主要な糖鎖）の利用が求められている。例えば、イナワラやコーンストーバー（トウモロコシの茎葉）、バガス等である。セルロースはグルコースが1,4−β−グリコシド結合したバイオポリマーであり、加水分解によりグルコースが得られる。得られたグルコースは酵母による発酵によりエタノールが製造される。
【０００４】
このように植物細胞壁に由来するセルロースからエタノールを製造することが可能ではあるが、その効率は悪く、価格も高い。特に、セルロースをグルコースに変換（加水分解）することは困難であるとともにコストが高くなる。
硫酸を用いたセルロース糖化は可能ではあるが廃液による環境負荷が大きいため、生物的手法（酵素糖化）を用いた低コストかつ環境負荷の少ないセルロース糖化法が必要である。そこでセルロースを効率的に加水分解する酵素の開発が進められているが、期待に答える成果は得られていない。
【０００５】
公知文献から従来技術をみるに、非特許文献１には、グラム陽性桿菌はペリプラズム間隙を有しないため、細胞外分泌シグナルを有するタンパク質を細胞外（液体培地中）に分泌する技術が開示されている。
【０００６】
ベクター（ｐＮＣＭＯ2）を枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) に形質転換した宿主細胞を用いたタンパク質の大量生産方法は知られている（特許文献１）。
【０００７】
ＤＮＡシークエンサーを用いることにより、遺伝子配列を解読することは可能である。決定された遺伝子をタンパク質に変換し、Blast search（ホモロジー検索）より遺伝子の機能を推測することは可能である。
【０００８】
セルラーゼ等の加水分解酵素の触媒作用により、糖鎖を加水分解することは可能である。エンド−1,4−β−グルカナーゼとセロビオハイドロラーゼとエキソ−1,4−β−グルカナーゼ（1,4−β−グルコシダーゼ）の混合によりセルラーゼ等の糖鎖は加水分解され、主としてグルコースが生産される（非特許文献２）。
【０００９】
セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解反応を促進する技術としては、ボールミル等の物理的破壊方法を用いた植物試料の粉砕によるものが知られており（非特許文献３）、また、アンモニア水処理によるセルロース構造の変化により、セルラーゼ等による加水分解反応は促進される（非特許文献４）。
【００１０】
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をベクター (pNCMO2) を用いて、枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を宿主として、タンパク質を生産することができる。この手法は特許文献１で示されているが、いかなる遺伝子が該ベクター（pNCMO2）を用いて、枯草菌を宿主としてタンパク質を生産することができるかは不明である。
【００１１】
これまで１４種類の遺伝子を上記のベクターを用い、枯草菌を宿主としてタンパク質の生産を試みたところ、８個のタンパク質は生産されたが、それらが本来有する酵素活性を示すタンパク質は殆んど得られていない。特許文献１の方法は有効な方法とはいえない。
【００１２】
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子を上記のベクターを用い、枯草菌を宿主としてタンパク質生産が可能である。また、常法により遺伝子をベクター（例えば pET vector, タカラバイオ（株））を用いた、大腸菌を宿主とするタンパク質の生産は可能であるが、細胞外分泌性タンパク質、例えばエンド−1,4−β−グルカナーゼ（非特許文献５）やエクスパンシン（非特許文献６）などの活性を有するタンパク質生産の成功例はない。
また、生産されたタンパク質が封入体を形成するため、実質得られるタンパク質の量は少ない(後述の表４参照)。
【００１３】
以上のように、生物的手法（酵素糖化）を用いた低コストかつ環境負荷の少ないセルロースの糖化法において、効率よい方法は見出されておらず、生産コストの削減は実現されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３７５３９４５号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Colin R. Harwood and Rocky CranenburghBacillusproteinsecretion: an unfolding story. Trends in Microbiology, 16(2), 73-79 (2008).
【非特許文献２】Riedel, K., Ritter, J. and Bronnenmeire, K. (1997)、Synergistic interaction of the Clostridium stercorarium cellulases Avicelase I (CelZ) and Avicelase II (CelY) in the degradation of microcrystalline cellulose. FEMS Microbiol. Lett. 147, 239-243.
【非特許文献３】遠藤貴士，粉砕技術による木質バイオマスの液体燃料および形成材料転換，粉体と工業，38, 33-39 (2006)
【非特許文献４】Igarashi Kiyohiko, Masahisa Wada and Masahiro Samejima, Activation of crystalline cellulose to cellulose III results in efficient hydrolysis by cellobiohydrolase. FEBS 274 (7), 1785-1792 (2007).
【非特許文献５】Takumi Takeda, FukumiSakaiandTakahisa Hayashi, A homologue ofEGL1 encoding endo-1,4-β-glucanaseinelongating pea stems. Biosci. Biotech. Biochem., 64(3), 6363-640 (2000).
【非特許文献６】Daniel J. Cosgrove, Loosening of plant cell walls by expansions.Nature, 407(6802), 321-326 (2000).
【非特許文献７】Hideo Matsumura, Akiko Ito, HiromasaSaitoh, Peter Winter, GunterKahl, Monika Reuter, DetlevH. Kruger and Ryohei Terauchi, SuperSAGECellMicrobiol. 7(1), 11-18 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記の問題点を解決し、生物的手法（酵素糖化）を用いた低コストかつ環境負荷の少ないセルロースの糖化法において、効率良い方法を可能とし、生産コスト削減を可能とすることを目的とする。具体的には、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質を提供すること、及び該タンパク質を利用したセルロース分解を促進する方法を提供することを目的とする。
また、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質をコードする遺伝子を提供すること、及び該タンパク質を効率良く生産する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、意外にも、イネいもち病菌 (Magnaporthe oryzae) 由来のタンパク質がセルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進することを見出し、その知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は、具体的には、以下の各技術を基礎とする。
【００１８】
〔１〕以下の（ａ）または（ｂ）である、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１９】
〔２〕上記〔１〕に記載のタンパク質を用いて、加水分解酵素によるセルロース分解を促進する方法。
【００２０】
〔３〕以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列上の少なくとも１位〜７７０位を含む塩基配列からなる遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【００２１】
〔４〕枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主細胞として前記遺伝子を発現させてタンパク質を生産することを含む、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質の製造方法。
【００２２】
〔５〕上記〔３〕に記載の遺伝子をベクター(pNCMO2)で形質転換された宿主細胞。
【発明の効果】
【００２３】
グルコースは医療品や酵母によるエタノール発酵の原料として利用される。植物細胞壁に由来するセルロースを中心とする糖鎖からグルコースを得る手段として、セルラーゼ等による加水分解反応を行う。セルロースを中心とした植物細胞壁糖鎖は複雑な高次構造や水素結合を形成しているため、セルラーゼ等による加水分解は容易ではない。そのため効率的にグルコースを得るためには、大量のセルラーゼ等を必要とするため、グルコースの生産コストが高くなる。それに対して、本発明のセルロース分解促進タンパク質を用いて、セルラーゼ等によるセルロース分解を行うと、セルロースの分解効率が上昇し、グルコースの生産コストを低減することができる。
【００２４】
植物細胞壁に由来するセルロースを中心とした糖鎖は硫酸を使用することでグルコースを得ることができる。希硫酸を使用した植物細胞壁のヘミセルロースを中心とした糖鎖の加水分解によりグルコースやキシロースを得ることができるが、その後の残さに含まれるセルロースを中心とした糖鎖を高温条件下で硫酸を用いてグルコースに加水分解することは非効率的である。
【００２５】
特に、この条件下ではフルフラールが生産されるためグルコースの生産効率が減少するだけでなく、硫酸の廃液処理コストが高くなる。そのため、希硫酸でヘミセルロースをグルコースやキシロースに加水分解した後、その残さに主として含まれるセルロース等の糖鎖をセルラーゼ等の加水分解酵素により加水分解することでグルコースを得ることができる。
【００２６】
本発明のセルロース分解促進タンパク質は、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進する。本発明のセルロース分解促進タンパク質を利用すれば、セルロース分解に要するセルラーゼ等の加水分解酵素の使用量減少や加水分解処理時間の短縮により、セルロース分解に要するコストを削減することができる。
【００２７】
また、枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主とした生産方法を採用することにより、セルロース分解促進タンパク質を大量に生産することができ、生産コストを削減することができるので、結果として、セルロース分解に要するコストをさらに削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Brevibacillus choshinensis によるセルロース分解促進タンパク質の生産を示す。
【図２】図２は、セルロース分解促進タンパク質を生産している枯草菌の液体培養日数と生産されるセルロース分解促進タンパク質をウエスタンブロットにより調べた結果である。
【図３】図３は、セルロース分解を促進するセルロース分解促進タンパク質の効果を示す結果である。
【図４】図４は、セルロース分解促進タンパク質によるセルロース分解の促進効果を示す結果である。
【図５】図５は、精製したセルロース分解促進タンパク質によるセルロース分解の促進効果を示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１．本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子とその取得＞
本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子はイネいもち病菌がイネに感染する際に発現する遺伝子であり、イネいもち病菌がイネに侵入する際にイネ細胞壁のセルロース分解を促進するセルロース分解促進タンパク質をコードする遺伝子である（表１）。
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１は、イネいもち病菌がイネに感染する際に発現している細胞壁分解に関与するタンパク質をコードしている遺伝子のリストである。 MGG00245.6がセルロース分解促進タンパク質をコードしている遺伝子である。
【００３２】
したがって、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは数個（１〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、セルロース分解を促進するタンパク質をコードするＤＮＡであってよい。
【００３３】
そのようなＤＮＡとしては、限定するものではないが、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端にヒスチジンタグ（６〜１０残基程度のヒスチジンからなる短いペプチド）が付加されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。
【００３４】
本発明の遺伝子は、本発明のセルロース分解促進タンパク質またはその遺伝子の配列（配列番号１のアミノ酸配列若しくは配列番号1の塩基配列）に基づいて、常法により単離することができる。例えば、いもち病菌から常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明のセルロース分解促進タンパク質またはその遺伝子の配列に基づいて設計されるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をDNA増幅断片として取得することができる。
【００３５】
得られたＤＮＡ増幅断片は、常法により抽出・精製することが望ましい。あるいは、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子またはその一部を用いてプローブを作製し、それを他の生物から常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等の核酸に対してハイブリダイズさせることにより、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をクローンとして取得することもできる。本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子はまた、化学合成法を利用して合成してもよい。
【００３６】
＜２．セルロース分解促進タンパク質の生産方法＞
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をベクター (ｐＮＣＭＯ２) を用いて、枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を宿主として、タンパク質を大量に生産することができる。
表２は、各種調整法による生産量を比較したものである。枯草菌を宿主とした場合の生産量が顕著であることが明らかである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
本発明においては、セルロース分解促進タンパク質の遺伝子を持つ枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を１リットルの培養液で３日間培養することにより、少なくとも３００ｍｇのセルロース分解促進タンパク質を生産する。
【００３９】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１位〜１７位は細胞外分泌シグナルであるため、セルロース分解促進タンパク質としてセルロース分解促進に関与していない。つまり、枯草菌を宿主とするセルロース分解促進タンパク質の生産には配列番号２の１位〜１７位のアミノ酸配列がなくても生産することはできる。
【００４０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端にヒスチジンタグ（６〜１０残基程度のヒスチジンからなる短いペプチド）が付加されたアミノ酸配列はセルロース分解促進タンパク質としてセルロース分解を促進することができる。
【００４１】
また、枯草菌を宿主として生産されたヒスチジンタグを付加したセルロース分解促進タンパク質はヒスチジンタグ吸着カラムにより、一般的な生化学的方法（例えば硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせた精製方法）に比べ、はるかに容易かつ短時間で精製タンパク質を得ることができる。ヒスチジンタグを付加したセルロース分解促進タンパク質はヒスチジンタグに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより検出することができ、生産されたセルロース分解促進タンパク質の生産量を決定することができる。
【００４２】
＜３．セルロース分解促進タンパク質を利用したセルロース分解促進方法＞
植物の細胞壁の主成分であるセルロースはβ−1,4−グリコシド結合により形成されたバイオポリマーである。その利用は木材としての建築材料や紙の原料としてのパルプ等である。また、セルラーゼ等の加水分解酵素処理により、セルロースのオリゴ糖や単糖（グルコース）に変換することができる。本発明のセルロース分解促進タンパク質は、セルラーゼ等によるセルロースの加水分解反応を促進することができ、反応産物としてセルロースの分解産物（グルコースやオリゴ糖など）の生産量を増加することができる。
【００４３】
イネいもち病菌に由来するセルロース分解促進タンパク質の遺伝子（配列番号２）をＭＰＧ１プロモーターを含むベクター (ｐＢＡＦＰ, 非特許文献７) を用いて、イネいもち病菌を宿主としてセルロース分解促進タンパク質を生産することができる。イネいもち病菌を宿主として生産されたセルロース分解促進タンパク質をセルラーゼ等によるセルロース分解反応系に加えることにより、セルラーゼ等によるセルロースの分解を増加させることができる。
【００４４】
同様にイネいもち病菌に由来するセルロース分解促進タンパク質の遺伝子（配列番号２）をベクター (ｐＮＣＭＯ２) を用いて、枯草菌を宿主として生産されたセルロース分解促進タンパク質をセルラーゼ等によるセルロース分解反応系に加えることにより、セルラーゼ等によるセルロースの分解を増加させることができる。
【００４５】
セルラーゼ等によるセルロース分解反応系に加えるセルロース分解促進タンパク質は、イネいもち病菌および枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主として生産されたセルロース分解促進タンパク質を含む培養培地の濃縮液およびヒスチジンタグを認識する吸着カラムで精製したセルロース分解促進タンパク質を利用することができる。また、本発明のセルロース分解促進タンパク質は熱処理やウレア熱処理によりセルロース分解の促進作用を欠失することはなく、高温条件下においてセルロース分解促進タンパク質を使用することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
［実施例１]
＜セルロース分解促進タンパク質の遺伝子の単離およびタンパク質の調製＞
（１）イネいもち病菌由来セルロース分解促進タンパク質の遺伝子の単離
イネの幼鞘にイネいもち病菌を接種し、感染２４時間後のイネの細胞をマイクロダイセクション法に従い採取し、全ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、SuperＳＡＧＥ法（非特許文献７）によりイネいもち病菌のイネ感染時の遺伝子発現を解析し、イネ細胞壁分解に関与する遺伝子群を決定し、セルロース分解促進タンパク質をコードする遺伝子が含まれていた（表３）。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３は、セルロース分解促進タンパク質 (ＭＧＧ０２４５．６) をもとにBlast search（ホモロジー検索）を行った結果である。
【００５０】
また、本発明のセルロース分解促進タンパク質およびその遺伝子をBlast search（ホモロジー検索）を行い、相同性の高いタンパク質を抽出した（表４）。
【００５１】
【表４】
【００５２】
[実施例２]
（２）枯草菌によるセルロース分解促進タンパク質の生産およびその作用
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子（５２位〜５４９位）にＢａｍＨＩサイト (５’末端)、ヒスチジンタグ（７個のヒスチジン）とＨｉｎｄＩＩＩサイト (３’末端)を付加した遺伝子断片を合成プライマー (プライマー1；５’−cgcggatcccacggcaacatcaccgtgcccc−３’, プライマー２；５’−cccaagctt ttagtgatggtgatggtggtgatgtccctggacaaagtcaacacag−３’) を用いたＰＣＲにより得た。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ処理した後、ベクター (ｐＮＣＭＯ２) に挿入し、エレクトロポレーション法により枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) にセルロース分解促進タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター (ｐＮＣＭＯ２) を導入した。
【００５３】
セルロース分解促進タンパク質を含むベクター (ｐＮＣＭＯ２) を持つ枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) の選抜はネオマイシン (１０μg／ｍｌ) を含むＭＴ寒天プレート(１０ｇグルコース、１０ｇポリペプトン、５ｇ肉エキス、２ｇ酵母エキス、１０ｍｇＦｅＳＯ4、１０ｍｇＭｎＳＯ4、１０ｍｇＺｎＳＯ4、４．１ｇ ＭｇＣｌ2、１５ｇＡｇａｒ／Ｌ、ｐＨ７.０)で行った（ｐＮＣＭＯ２ベクターへの遺伝子挿入および枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) への遺伝子導入はBrevibacillus Expression System User Manual (TaKaRa) にしたがって行った。）。
【００５４】
ネオマイシンを含むＭＴ寒天プレートから得たれた枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) のコロニーをTM液体培地（１０ｇグルコース、１０ｇポリペプトン、５ｇ肉エキス、２ｇ酵母エキス、１０ｍｇＦｅＳＯ4、１０ｍｇＭｎＳＯ４、１ｍｇＺｎＳＯ４ ／Ｌ、ｐＨ７.０）（３ｍｌ）で３０℃、１８時間振とう培養したのち、新たにTM液体培地（２５ｍｌ）に枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を移し、３０℃、９６時間培養した後、６０％飽和硫酸アンモニウム沈澱によりタンパク質を沈殿として得た。60%飽和硫酸アンモニウム沈澱は酢酸緩衝液 (１００ｍＭ,ｐＨ４.５) で溶解した後、粗タンパク質標品として使用した。
【００５５】
また、６０％飽和硫酸アンモニウム沈澱はヒスチジン吸着カラム緩衝液（５０ｍＭ sodium phosphate, ０.３Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ７.０）で溶解した後、ヒスチジン吸着カラムで精製した（ヒスチジン吸着カラムによるセルロース分解促進タンパク質の精製はMetal Affinity Resins User Manual (TALON) にしたがって行った）。精製したセルロース分解促進タンパク質は限外濾過カラム（Amicon Ultra-4、日本ミリポア）を用いて酢酸緩衝液（１００ｍＭ,ｐＨ４.５）に交換した後、精製セルロース分解促進タンパク質として使用した。
【００５６】
上記の手法により調製されるセルロース分解促進タンパク質量は、枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を1リットルのTM液体培地で３０℃、３日間振とう培養することで300 mg 以上を得ることができた。イネいもち病菌を宿主として生産したセルロース分解促進タンパク質は１ｍｇ程度であり、枯草菌を宿主として生産することではるかに大量のセルロース分解促進タンパク質を調製することができた。
【００５７】
また、常法で大腸菌を宿主としてタンパク質を生産すると大部分が封入体として形成され、実質利用可能なタンパク質は枯草菌を宿主として生産されるタンパク質より少ない。
【００５８】
枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主としたタンパク質の生産はかなり高い確率で成功するが、これらが酵素活性や機能を有することはまれであり、特許文献１が開示する技術は応用できない。これまで１４個の遺伝子をベクター (ｐＮＣＭＯ２) に挿入し、枯草菌（Brevibacillus choshinensis) に導入したところ、８個のタンパク質生産は成功したが、機能を有するタンパク質が生産されたのは本発明のセルロース分解促進タンパク質のみである（表４）。
【００５９】
図１は、セルロース分解促進タンパク質を生産している枯草菌の液体培養日数と生産されるセルロース分解促進タンパク質をウエスタンブロットにより調べた結果である。
セルロース分解促進タンパク質を生産する枯草菌を25 ml のTM液体培地で30℃、１〜７日間振とう培養した後、遠心分離により得られた上清を12.5% SDS-アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離し、銀染色法によりタンパク質の染色を行った（Ａ）。 また、セルロース分解促進タンパク質のカルボキシ末端に付加したヒスチジンタグ（連続する７個のヒスチジンタグ）に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ｂ）。
【００６０】
セルロース分解促進タンパク質とアビセルＰＨ−１０１（１０ｍｇ、Fluka）およびキチンを酢酸緩衝液（１００ｍＭ, ｐＨ４.５) 中で混合（３０℃、1時間振とう) した後、遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分は１％ＳＤＳ溶液で８０℃、２分間処理した後、遠心分離により得られた上清を結合画分として得た。可溶性画分と結合画分を１２.５％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した後、セルロース分解促進タンパク質のカルボキシ末端に付加したヒスチジンタグ（７ＸＨｉｓ）に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ａ）。
【００６１】
対象実験として、エンドウ由来のＥＧＬ２（エンド−1,4−β−グルカナーゼ）を高発現しているベンサミアーナ (Nicotiana benthamiana) からリン酸バッファー可溶性画分、１Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸バッファー可溶性画分、１％ ＳＤＳ可溶性画分を得て、これらを１２.５％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した後、ＥＧＬ２のカルボキシ末端に付加したＨＡタグに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
【００６２】
図２は、枯草菌を宿主として生産したセルロース分解促進タンパク質のセルロースとキチンへの結合を調べた結果である。
枯草菌を宿主として生産したセルロース分解促進タンパク質をヒスチジン吸着カラムを用いて精製し、アビセルＰＨ−１０１ (セルロース、１０ｍｇ)またはチキン（１０ｍｇ)と酢酸緩衝液（１００ｍＭ,ｐＨ４.５) 中で混合（３０℃、1時間振とう) した後、遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分は１％ＳＤＳ溶液で８０℃、２分間処理した後、遠心分離により得られた上清を結合画分として得た。可溶性画分と結合画分を１２.５％ＳＤＳ−アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した後、セルロース分解促進タンパク質のカルボキシ末端に付加したヒスチジンタグ （７ＸＨｉｓ） に対する抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った（Ａ）。また、エンドウ由来のＥＧＬ２（エンド−1,4−β−グルカナーゼ）のベンサミアーナ (Nicotiana benthamiana) における局在をＥＧＬ２ のカルボキシ末端に付加したＨＡタグの抗体を用いて、ＥＧＬ２の局在を調べた（Ｂ）。
【００６３】
表１におけるBlast search（ホモロジー検索）の結果において、本発明のセルロース分解促進タンパク質がセルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質に類似した機能を有する可能性が示されているが、図５の結果から本発明のセルロース分解促進タンパク質はセルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質に類似した機能を保持していない。
【００６４】
対象実験として行ったＥＧＬ２は非結晶性のセルロースを加水分解する酵素であり、セルロース結合部位を持っていないにも関わらず、大部分のＥＧＬ２を抽出するために１％ＳＤＳ処理を必要とする（Ｂ）。つまり、セルロース結合部位を持っていなくてもセルロースを主とする糖鎖に強固に結合することができる。それに対して、本発明のセルロース分解促進タンパク質の大部分がセルロースやキチンと結合しないため、セルロース分解促進タンパク質はセルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質に類似した機能を持っていない。
【００６５】
（４）セルロース分解促進タンパク質の利用方法
セルラーゼ等の加水分解酵素（エンド−1,4−β−グルカナーゼやセロビオハイドロラーゼ、エキソ−1,4−β−グルカナーゼ（1,4−β−グルコシダーゼ）等を含む）はセルロースを加水分解し、反応産物としてセルロースのオリゴ糖や単糖（グルコース）を生成する。このセルラーゼ等によるセルロースを加水分解する反応系に本発明のセルロース分解促進タンパク質を加えることで、セルロース分解を促進することができる。ここではコットンおよびアビセルPH-101の結晶性のセルロース（１０ｍｇ）を含む溶液（２００μｌ）にセルラーゼ (Trichoderma reesei 由来セルラーゼ、Sigma) を加えた標準反応液にセルロース分解促進タンパク質（０.１〜１−１０μｇ）を加えることによるセルロース分解の増加を測定した。この際、反応液は３５℃で１８時間振とうした。
【００６６】
上記の反応後、遠心分離機により可溶性画分（加水分解により生じたセルロースのオリゴ糖やグルコースを含む画分）と不溶性画分（高分子のセルロースを含む画分）に分離し、可溶性画分に含まれる糖量をアンスロン／硫酸法（０.５％（ｗ／ｖ）アンスロンを含む硫酸）を用いて決定した。使用したセルロース分解促進タンパク質は、セルロース分解促進タンパク質の遺伝子を有する枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) をTM液体培地で３０℃、３日間振とう培養した後、液体培地を60%硫酸アンモニウム沈澱として回収し、酢酸緩衝液（１００ｍＭ,ｐＨ４.５) で懸だくした粗酵素標品を使用した。反応系にセルラーゼを加えない場合、生成される可溶性糖はほとんど生じないことより、セルロース分解促進タンパク質自体が加水分解を触媒しない。
【００６７】
一方、セルラーゼ0.1μg を含む反応系ではセルロース分解促進タンパク質量（０−５μg）の増加に従い、生成される可溶性糖量が増加した（図３）。
【００６８】
図３は、セルラーゼ等によるセルロース分解を促進するセルロース分解促進タンパク質の効果を示す結果である。
コットンセルロースおよびアビセルＰＨ−１０１（セルロース）の結晶性のセルロース（１０ｍｇ）を含む溶液（２００μｌ）にセルラーゼ (Trichoderma reesei由来セルラーゼ１.０ｍｇ、Sigma) を加えた標準反応液にセルロース分解促進タンパク質を加え、３５℃で１８時間振とうした後、遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。可溶性画分に含まれる可溶性糖量（セルロース由来のオリゴ糖およびグルコースを含む）をアンスロン/硫酸法を用いて測定し、セルロース分解量を評価した。
【００６９】
セルロース分解促進タンパク質の効果を調べる反応系において加えられるセルラーゼ量（０.１〜１００μｇ）を変化させると、セルラーゼ量の増加に伴い生成される糖量は増加するが、セルロース分解促進タンパク質によるセルロース分解促進効果は減少した（図４）。
【００７０】
枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主として生産されたヒスチジンタグを有するセルロース分解促進タンパク質はヒスチジン吸着カラムにより精製することができる。精製したセルロース分解促進タンパク質を用いてセルラーゼによるセルロース分解の促進効果を調べ結果、精製したセルロース分解促進タンパク質は粗酵素標品中のセルロース分解促進タンパク質と同様のセルロース分解促進効果を示した（図５）。つまり、ヒスチジン吸着カラムによる精製過程においてセルロース分解促進タンパク質の不活化は生じない。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
化石燃料に代わるクリーンなエネルギー源として注目されているバイオエタノールを植物糖鎖（細胞壁に由来する）から製造する過程において、効率的な糖化方法として利用することができる。特に現在ではサトウキビやトウモロコシなど食料となる資源からバイオエタノールが製造されているが、植物糖鎖からバイオエタノールを低コストで製造できるので、食料資源の安定供給や再生産可能な植物資源を効率的に利用出来ることになり、大気中の二酸化炭素濃度の上昇を制御することも可能となる。
【００７２】
日本には化石資源がなく、エネルギー自給率は数％と非常に低いが植物バイオマスからエネルギーを製造する効率的な技術の確立により、自国のエネルギー自給率の上昇も可能である。これに伴う産業の発展により地域社会の活性化も期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質及びその利用及びその生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年化石資源の枯渇化や二酸化炭素濃度の上昇による地球規模の温暖化が懸念されており、今後化石資源に依存しない資源循環型のエネルギーの創出が求められている。特に自動車を中心とする大型機械の稼働力となるガソリンの代替エネルギーとして植物から製造されるバイオエタノールが脚光を浴びている。主として、サトウキビやトウモロコシなどをバイオエタノールの原料として利用しているため、食料との競合により価格が高騰している。
【０００３】
食料との競合や価格の高騰をさけるため、次世代のバイオエタノール原料として、非食部である植物の茎や葉に含まれるセルロース（細胞壁の主要な糖鎖）の利用が求められている。例えば、イナワラやコーンストーバー（トウモロコシの茎葉）、バガス等である。セルロースはグルコースが1,4−β−グリコシド結合したバイオポリマーであり、加水分解によりグルコースが得られる。得られたグルコースは酵母による発酵によりエタノールが製造される。
【０００４】
このように植物細胞壁に由来するセルロースからエタノールを製造することが可能ではあるが、その効率は悪く、価格も高い。特に、セルロースをグルコースに変換（加水分解）することは困難であるとともにコストが高くなる。
硫酸を用いたセルロース糖化は可能ではあるが廃液による環境負荷が大きいため、生物的手法（酵素糖化）を用いた低コストかつ環境負荷の少ないセルロース糖化法が必要である。そこでセルロースを効率的に加水分解する酵素の開発が進められているが、期待に答える成果は得られていない。
【０００５】
公知文献から従来技術をみるに、非特許文献１には、グラム陽性桿菌はペリプラズム間隙を有しないため、細胞外分泌シグナルを有するタンパク質を細胞外（液体培地中）に分泌する技術が開示されている。
【０００６】
ベクター（ｐＮＣＭＯ2）を枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) に形質転換した宿主細胞を用いたタンパク質の大量生産方法は知られている（特許文献１）。
【０００７】
ＤＮＡシークエンサーを用いることにより、遺伝子配列を解読することは可能である。決定された遺伝子をタンパク質に変換し、Blast search（ホモロジー検索）より遺伝子の機能を推測することは可能である。
【０００８】
セルラーゼ等の加水分解酵素の触媒作用により、糖鎖を加水分解することは可能である。エンド−1,4−β−グルカナーゼとセロビオハイドロラーゼとエキソ−1,4−β−グルカナーゼ（1,4−β−グルコシダーゼ）の混合によりセルラーゼ等の糖鎖は加水分解され、主としてグルコースが生産される（非特許文献２）。
【０００９】
セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解反応を促進する技術としては、ボールミル等の物理的破壊方法を用いた植物試料の粉砕によるものが知られており（非特許文献３）、また、アンモニア水処理によるセルロース構造の変化により、セルラーゼ等による加水分解反応は促進される（非特許文献４）。
【００１０】
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をベクター (pNCMO2) を用いて、枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を宿主として、タンパク質を生産することができる。この手法は特許文献１で示されているが、いかなる遺伝子が該ベクター（pNCMO2）を用いて、枯草菌を宿主としてタンパク質を生産することができるかは不明である。
【００１１】
これまで１４種類の遺伝子を上記のベクターを用い、枯草菌を宿主としてタンパク質の生産を試みたところ、８個のタンパク質は生産されたが、それらが本来有する酵素活性を示すタンパク質は殆んど得られていない。特許文献１の方法は有効な方法とはいえない。
【００１２】
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子を上記のベクターを用い、枯草菌を宿主としてタンパク質生産が可能である。また、常法により遺伝子をベクター（例えば pET vector, タカラバイオ（株））を用いた、大腸菌を宿主とするタンパク質の生産は可能であるが、細胞外分泌性タンパク質、例えばエンド−1,4−β−グルカナーゼ（非特許文献５）やエクスパンシン（非特許文献６）などの活性を有するタンパク質生産の成功例はない。
また、生産されたタンパク質が封入体を形成するため、実質得られるタンパク質の量は少ない(後述の表４参照)。
【００１３】
以上のように、生物的手法（酵素糖化）を用いた低コストかつ環境負荷の少ないセルロースの糖化法において、効率よい方法は見出されておらず、生産コストの削減は実現されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３７５３９４５号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Colin R. Harwood and Rocky CranenburghBacillusproteinsecretion: an unfolding story. Trends in Microbiology, 16(2), 73-79 (2008).
【非特許文献２】Riedel, K., Ritter, J. and Bronnenmeire, K. (1997)、Synergistic interaction of the Clostridium stercorarium cellulases Avicelase I (CelZ) and Avicelase II (CelY) in the degradation of microcrystalline cellulose. FEMS Microbiol. Lett. 147, 239-243.
【非特許文献３】遠藤貴士，粉砕技術による木質バイオマスの液体燃料および形成材料転換，粉体と工業，38, 33-39 (2006)
【非特許文献４】Igarashi Kiyohiko, Masahisa Wada and Masahiro Samejima, Activation of crystalline cellulose to cellulose III results in efficient hydrolysis by cellobiohydrolase. FEBS 274 (7), 1785-1792 (2007).
【非特許文献５】Takumi Takeda, FukumiSakaiandTakahisa Hayashi, A homologue ofEGL1 encoding endo-1,4-β-glucanaseinelongating pea stems. Biosci. Biotech. Biochem., 64(3), 6363-640 (2000).
【非特許文献６】Daniel J. Cosgrove, Loosening of plant cell walls by expansions.Nature, 407(6802), 321-326 (2000).
【非特許文献７】Hideo Matsumura, Akiko Ito, HiromasaSaitoh, Peter Winter, GunterKahl, Monika Reuter, DetlevH. Kruger and Ryohei Terauchi, SuperSAGECellMicrobiol. 7(1), 11-18 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記の問題点を解決し、生物的手法（酵素糖化）を用いた低コストかつ環境負荷の少ないセルロースの糖化法において、効率良い方法を可能とし、生産コスト削減を可能とすることを目的とする。具体的には、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質を提供すること、及び該タンパク質を利用したセルロース分解を促進する方法を提供することを目的とする。
また、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質をコードする遺伝子を提供すること、及び該タンパク質を効率良く生産する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、意外にも、イネいもち病菌 (Magnaporthe oryzae) 由来のタンパク質がセルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進することを見出し、その知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は、具体的には、以下の各技術を基礎とする。
【００１８】
〔１〕以下の（ａ）または（ｂ）である、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１９】
〔２〕上記〔１〕に記載のタンパク質を用いて、加水分解酵素によるセルロース分解を促進する方法。
【００２０】
〔３〕以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列上の少なくとも１位〜７７０位を含む塩基配列からなる遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【００２１】
〔４〕枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主細胞として前記遺伝子を発現させてタンパク質を生産することを含む、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質の製造方法。
【００２２】
〔５〕上記〔３〕に記載の遺伝子をベクター(pNCMO2)で形質転換された宿主細胞。
【発明の効果】
【００２３】
グルコースは医療品や酵母によるエタノール発酵の原料として利用される。植物細胞壁に由来するセルロースを中心とする糖鎖からグルコースを得る手段として、セルラーゼ等による加水分解反応を行う。セルロースを中心とした植物細胞壁糖鎖は複雑な高次構造や水素結合を形成しているため、セルラーゼ等による加水分解は容易ではない。そのため効率的にグルコースを得るためには、大量のセルラーゼ等を必要とするため、グルコースの生産コストが高くなる。それに対して、本発明のセルロース分解促進タンパク質を用いて、セルラーゼ等によるセルロース分解を行うと、セルロースの分解効率が上昇し、グルコースの生産コストを低減することができる。
【００２４】
植物細胞壁に由来するセルロースを中心とした糖鎖は硫酸を使用することでグルコースを得ることができる。希硫酸を使用した植物細胞壁のヘミセルロースを中心とした糖鎖の加水分解によりグルコースやキシロースを得ることができるが、その後の残さに含まれるセルロースを中心とした糖鎖を高温条件下で硫酸を用いてグルコースに加水分解することは非効率的である。
【００２５】
特に、この条件下ではフルフラールが生産されるためグルコースの生産効率が減少するだけでなく、硫酸の廃液処理コストが高くなる。そのため、希硫酸でヘミセルロースをグルコースやキシロースに加水分解した後、その残さに主として含まれるセルロース等の糖鎖をセルラーゼ等の加水分解酵素により加水分解することでグルコースを得ることができる。
【００２６】
本発明のセルロース分解促進タンパク質は、セルラーゼ等の加水分解酵素によるセルロース分解を促進する。本発明のセルロース分解促進タンパク質を利用すれば、セルロース分解に要するセルラーゼ等の加水分解酵素の使用量減少や加水分解処理時間の短縮により、セルロース分解に要するコストを削減することができる。
【００２７】
また、枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主とした生産方法を採用することにより、セルロース分解促進タンパク質を大量に生産することができ、生産コストを削減することができるので、結果として、セルロース分解に要するコストをさらに削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Brevibacillus choshinensis によるセルロース分解促進タンパク質の生産を示す。
【図２】図２は、セルロース分解促進タンパク質を生産している枯草菌の液体培養日数と生産されるセルロース分解促進タンパク質をウエスタンブロットにより調べた結果である。
【図３】図３は、セルロース分解を促進するセルロース分解促進タンパク質の効果を示す結果である。
【図４】図４は、セルロース分解促進タンパク質によるセルロース分解の促進効果を示す結果である。
【図５】図５は、精製したセルロース分解促進タンパク質によるセルロース分解の促進効果を示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１．本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子とその取得＞
本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子はイネいもち病菌がイネに感染する際に発現する遺伝子であり、イネいもち病菌がイネに侵入する際にイネ細胞壁のセルロース分解を促進するセルロース分解促進タンパク質をコードする遺伝子である（表１）。
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１は、イネいもち病菌がイネに感染する際に発現している細胞壁分解に関与するタンパク質をコードしている遺伝子のリストである。 MGG00245.6がセルロース分解促進タンパク質をコードしている遺伝子である。
【００３２】
したがって、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは数個（１〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、セルロース分解を促進するタンパク質をコードするＤＮＡであってよい。
【００３３】
そのようなＤＮＡとしては、限定するものではないが、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端にヒスチジンタグ（６〜１０残基程度のヒスチジンからなる短いペプチド）が付加されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。
【００３４】
本発明の遺伝子は、本発明のセルロース分解促進タンパク質またはその遺伝子の配列（配列番号１のアミノ酸配列若しくは配列番号1の塩基配列）に基づいて、常法により単離することができる。例えば、いもち病菌から常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明のセルロース分解促進タンパク質またはその遺伝子の配列に基づいて設計されるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をDNA増幅断片として取得することができる。
【００３５】
得られたＤＮＡ増幅断片は、常法により抽出・精製することが望ましい。あるいは、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子またはその一部を用いてプローブを作製し、それを他の生物から常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等の核酸に対してハイブリダイズさせることにより、本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をクローンとして取得することもできる。本発明のセルロース分解促進タンパク質の遺伝子はまた、化学合成法を利用して合成してもよい。
【００３６】
＜２．セルロース分解促進タンパク質の生産方法＞
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子をベクター (ｐＮＣＭＯ２) を用いて、枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を宿主として、タンパク質を大量に生産することができる。
表２は、各種調整法による生産量を比較したものである。枯草菌を宿主とした場合の生産量が顕著であることが明らかである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
本発明においては、セルロース分解促進タンパク質の遺伝子を持つ枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を１リットルの培養液で３日間培養することにより、少なくとも３００ｍｇのセルロース分解促進タンパク質を生産する。
【００３９】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１位〜１７位は細胞外分泌シグナルであるため、セルロース分解促進タンパク質としてセルロース分解促進に関与していない。つまり、枯草菌を宿主とするセルロース分解促進タンパク質の生産には配列番号２の１位〜１７位のアミノ酸配列がなくても生産することはできる。
【００４０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端にヒスチジンタグ（６〜１０残基程度のヒスチジンからなる短いペプチド）が付加されたアミノ酸配列はセルロース分解促進タンパク質としてセルロース分解を促進することができる。
【００４１】
また、枯草菌を宿主として生産されたヒスチジンタグを付加したセルロース分解促進タンパク質はヒスチジンタグ吸着カラムにより、一般的な生化学的方法（例えば硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせた精製方法）に比べ、はるかに容易かつ短時間で精製タンパク質を得ることができる。ヒスチジンタグを付加したセルロース分解促進タンパク質はヒスチジンタグに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより検出することができ、生産されたセルロース分解促進タンパク質の生産量を決定することができる。
【００４２】
＜３．セルロース分解促進タンパク質を利用したセルロース分解促進方法＞
植物の細胞壁の主成分であるセルロースはβ−1,4−グリコシド結合により形成されたバイオポリマーである。その利用は木材としての建築材料や紙の原料としてのパルプ等である。また、セルラーゼ等の加水分解酵素処理により、セルロースのオリゴ糖や単糖（グルコース）に変換することができる。本発明のセルロース分解促進タンパク質は、セルラーゼ等によるセルロースの加水分解反応を促進することができ、反応産物としてセルロースの分解産物（グルコースやオリゴ糖など）の生産量を増加することができる。
【００４３】
イネいもち病菌に由来するセルロース分解促進タンパク質の遺伝子（配列番号２）をＭＰＧ１プロモーターを含むベクター (ｐＢＡＦＰ, 非特許文献７) を用いて、イネいもち病菌を宿主としてセルロース分解促進タンパク質を生産することができる。イネいもち病菌を宿主として生産されたセルロース分解促進タンパク質をセルラーゼ等によるセルロース分解反応系に加えることにより、セルラーゼ等によるセルロースの分解を増加させることができる。
【００４４】
同様にイネいもち病菌に由来するセルロース分解促進タンパク質の遺伝子（配列番号２）をベクター (ｐＮＣＭＯ２) を用いて、枯草菌を宿主として生産されたセルロース分解促進タンパク質をセルラーゼ等によるセルロース分解反応系に加えることにより、セルラーゼ等によるセルロースの分解を増加させることができる。
【００４５】
セルラーゼ等によるセルロース分解反応系に加えるセルロース分解促進タンパク質は、イネいもち病菌および枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主として生産されたセルロース分解促進タンパク質を含む培養培地の濃縮液およびヒスチジンタグを認識する吸着カラムで精製したセルロース分解促進タンパク質を利用することができる。また、本発明のセルロース分解促進タンパク質は熱処理やウレア熱処理によりセルロース分解の促進作用を欠失することはなく、高温条件下においてセルロース分解促進タンパク質を使用することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
［実施例１]
＜セルロース分解促進タンパク質の遺伝子の単離およびタンパク質の調製＞
（１）イネいもち病菌由来セルロース分解促進タンパク質の遺伝子の単離
イネの幼鞘にイネいもち病菌を接種し、感染２４時間後のイネの細胞をマイクロダイセクション法に従い採取し、全ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、SuperＳＡＧＥ法（非特許文献７）によりイネいもち病菌のイネ感染時の遺伝子発現を解析し、イネ細胞壁分解に関与する遺伝子群を決定し、セルロース分解促進タンパク質をコードする遺伝子が含まれていた（表３）。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３は、セルロース分解促進タンパク質 (ＭＧＧ０２４５．６) をもとにBlast search（ホモロジー検索）を行った結果である。
【００５０】
また、本発明のセルロース分解促進タンパク質およびその遺伝子をBlast search（ホモロジー検索）を行い、相同性の高いタンパク質を抽出した（表４）。
【００５１】
【表４】
【００５２】
[実施例２]
（２）枯草菌によるセルロース分解促進タンパク質の生産およびその作用
配列番号２に示すセルロース分解促進タンパク質の遺伝子（５２位〜５４９位）にＢａｍＨＩサイト (５’末端)、ヒスチジンタグ（７個のヒスチジン）とＨｉｎｄＩＩＩサイト (３’末端)を付加した遺伝子断片を合成プライマー (プライマー1；５’−cgcggatcccacggcaacatcaccgtgcccc−３’, プライマー２；５’−cccaagctt ttagtgatggtgatggtggtgatgtccctggacaaagtcaacacag−３’) を用いたＰＣＲにより得た。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ処理した後、ベクター (ｐＮＣＭＯ２) に挿入し、エレクトロポレーション法により枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) にセルロース分解促進タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター (ｐＮＣＭＯ２) を導入した。
【００５３】
セルロース分解促進タンパク質を含むベクター (ｐＮＣＭＯ２) を持つ枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) の選抜はネオマイシン (１０μg／ｍｌ) を含むＭＴ寒天プレート(１０ｇグルコース、１０ｇポリペプトン、５ｇ肉エキス、２ｇ酵母エキス、１０ｍｇＦｅＳＯ4、１０ｍｇＭｎＳＯ4、１０ｍｇＺｎＳＯ4、４．１ｇ ＭｇＣｌ2、１５ｇＡｇａｒ／Ｌ、ｐＨ７.０)で行った（ｐＮＣＭＯ２ベクターへの遺伝子挿入および枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) への遺伝子導入はBrevibacillus Expression System User Manual (TaKaRa) にしたがって行った。）。
【００５４】
ネオマイシンを含むＭＴ寒天プレートから得たれた枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) のコロニーをTM液体培地（１０ｇグルコース、１０ｇポリペプトン、５ｇ肉エキス、２ｇ酵母エキス、１０ｍｇＦｅＳＯ4、１０ｍｇＭｎＳＯ４、１ｍｇＺｎＳＯ４ ／Ｌ、ｐＨ７.０）（３ｍｌ）で３０℃、１８時間振とう培養したのち、新たにTM液体培地（２５ｍｌ）に枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を移し、３０℃、９６時間培養した後、６０％飽和硫酸アンモニウム沈澱によりタンパク質を沈殿として得た。60%飽和硫酸アンモニウム沈澱は酢酸緩衝液 (１００ｍＭ,ｐＨ４.５) で溶解した後、粗タンパク質標品として使用した。
【００５５】
また、６０％飽和硫酸アンモニウム沈澱はヒスチジン吸着カラム緩衝液（５０ｍＭ sodium phosphate, ０.３Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ７.０）で溶解した後、ヒスチジン吸着カラムで精製した（ヒスチジン吸着カラムによるセルロース分解促進タンパク質の精製はMetal Affinity Resins User Manual (TALON) にしたがって行った）。精製したセルロース分解促進タンパク質は限外濾過カラム（Amicon Ultra-4、日本ミリポア）を用いて酢酸緩衝液（１００ｍＭ,ｐＨ４.５）に交換した後、精製セルロース分解促進タンパク質として使用した。
【００５６】
上記の手法により調製されるセルロース分解促進タンパク質量は、枯草菌 (Brevibacilluschoshinensis) を1リットルのTM液体培地で３０℃、３日間振とう培養することで300 mg 以上を得ることができた。イネいもち病菌を宿主として生産したセルロース分解促進タンパク質は１ｍｇ程度であり、枯草菌を宿主として生産することではるかに大量のセルロース分解促進タンパク質を調製することができた。
【００５７】
また、常法で大腸菌を宿主としてタンパク質を生産すると大部分が封入体として形成され、実質利用可能なタンパク質は枯草菌を宿主として生産されるタンパク質より少ない。
【００５８】
枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主としたタンパク質の生産はかなり高い確率で成功するが、これらが酵素活性や機能を有することはまれであり、特許文献１が開示する技術は応用できない。これまで１４個の遺伝子をベクター (ｐＮＣＭＯ２) に挿入し、枯草菌（Brevibacillus choshinensis) に導入したところ、８個のタンパク質生産は成功したが、機能を有するタンパク質が生産されたのは本発明のセルロース分解促進タンパク質のみである（表４）。
【００５９】
図１は、セルロース分解促進タンパク質を生産している枯草菌の液体培養日数と生産されるセルロース分解促進タンパク質をウエスタンブロットにより調べた結果である。
セルロース分解促進タンパク質を生産する枯草菌を25 ml のTM液体培地で30℃、１〜７日間振とう培養した後、遠心分離により得られた上清を12.5% SDS-アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離し、銀染色法によりタンパク質の染色を行った（Ａ）。 また、セルロース分解促進タンパク質のカルボキシ末端に付加したヒスチジンタグ（連続する７個のヒスチジンタグ）に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ｂ）。
【００６０】
セルロース分解促進タンパク質とアビセルＰＨ−１０１（１０ｍｇ、Fluka）およびキチンを酢酸緩衝液（１００ｍＭ, ｐＨ４.５) 中で混合（３０℃、1時間振とう) した後、遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分は１％ＳＤＳ溶液で８０℃、２分間処理した後、遠心分離により得られた上清を結合画分として得た。可溶性画分と結合画分を１２.５％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した後、セルロース分解促進タンパク質のカルボキシ末端に付加したヒスチジンタグ（７ＸＨｉｓ）に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ａ）。
【００６１】
対象実験として、エンドウ由来のＥＧＬ２（エンド−1,4−β−グルカナーゼ）を高発現しているベンサミアーナ (Nicotiana benthamiana) からリン酸バッファー可溶性画分、１Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸バッファー可溶性画分、１％ ＳＤＳ可溶性画分を得て、これらを１２.５％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した後、ＥＧＬ２のカルボキシ末端に付加したＨＡタグに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
【００６２】
図２は、枯草菌を宿主として生産したセルロース分解促進タンパク質のセルロースとキチンへの結合を調べた結果である。
枯草菌を宿主として生産したセルロース分解促進タンパク質をヒスチジン吸着カラムを用いて精製し、アビセルＰＨ−１０１ (セルロース、１０ｍｇ)またはチキン（１０ｍｇ)と酢酸緩衝液（１００ｍＭ,ｐＨ４.５) 中で混合（３０℃、1時間振とう) した後、遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分は１％ＳＤＳ溶液で８０℃、２分間処理した後、遠心分離により得られた上清を結合画分として得た。可溶性画分と結合画分を１２.５％ＳＤＳ−アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離した後、セルロース分解促進タンパク質のカルボキシ末端に付加したヒスチジンタグ （７ＸＨｉｓ） に対する抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った（Ａ）。また、エンドウ由来のＥＧＬ２（エンド−1,4−β−グルカナーゼ）のベンサミアーナ (Nicotiana benthamiana) における局在をＥＧＬ２ のカルボキシ末端に付加したＨＡタグの抗体を用いて、ＥＧＬ２の局在を調べた（Ｂ）。
【００６３】
表１におけるBlast search（ホモロジー検索）の結果において、本発明のセルロース分解促進タンパク質がセルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質に類似した機能を有する可能性が示されているが、図５の結果から本発明のセルロース分解促進タンパク質はセルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質に類似した機能を保持していない。
【００６４】
対象実験として行ったＥＧＬ２は非結晶性のセルロースを加水分解する酵素であり、セルロース結合部位を持っていないにも関わらず、大部分のＥＧＬ２を抽出するために１％ＳＤＳ処理を必要とする（Ｂ）。つまり、セルロース結合部位を持っていなくてもセルロースを主とする糖鎖に強固に結合することができる。それに対して、本発明のセルロース分解促進タンパク質の大部分がセルロースやキチンと結合しないため、セルロース分解促進タンパク質はセルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質に類似した機能を持っていない。
【００６５】
（４）セルロース分解促進タンパク質の利用方法
セルラーゼ等の加水分解酵素（エンド−1,4−β−グルカナーゼやセロビオハイドロラーゼ、エキソ−1,4−β−グルカナーゼ（1,4−β−グルコシダーゼ）等を含む）はセルロースを加水分解し、反応産物としてセルロースのオリゴ糖や単糖（グルコース）を生成する。このセルラーゼ等によるセルロースを加水分解する反応系に本発明のセルロース分解促進タンパク質を加えることで、セルロース分解を促進することができる。ここではコットンおよびアビセルPH-101の結晶性のセルロース（１０ｍｇ）を含む溶液（２００μｌ）にセルラーゼ (Trichoderma reesei 由来セルラーゼ、Sigma) を加えた標準反応液にセルロース分解促進タンパク質（０.１〜１−１０μｇ）を加えることによるセルロース分解の増加を測定した。この際、反応液は３５℃で１８時間振とうした。
【００６６】
上記の反応後、遠心分離機により可溶性画分（加水分解により生じたセルロースのオリゴ糖やグルコースを含む画分）と不溶性画分（高分子のセルロースを含む画分）に分離し、可溶性画分に含まれる糖量をアンスロン／硫酸法（０.５％（ｗ／ｖ）アンスロンを含む硫酸）を用いて決定した。使用したセルロース分解促進タンパク質は、セルロース分解促進タンパク質の遺伝子を有する枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) をTM液体培地で３０℃、３日間振とう培養した後、液体培地を60%硫酸アンモニウム沈澱として回収し、酢酸緩衝液（１００ｍＭ,ｐＨ４.５) で懸だくした粗酵素標品を使用した。反応系にセルラーゼを加えない場合、生成される可溶性糖はほとんど生じないことより、セルロース分解促進タンパク質自体が加水分解を触媒しない。
【００６７】
一方、セルラーゼ0.1μg を含む反応系ではセルロース分解促進タンパク質量（０−５μg）の増加に従い、生成される可溶性糖量が増加した（図３）。
【００６８】
図３は、セルラーゼ等によるセルロース分解を促進するセルロース分解促進タンパク質の効果を示す結果である。
コットンセルロースおよびアビセルＰＨ−１０１（セルロース）の結晶性のセルロース（１０ｍｇ）を含む溶液（２００μｌ）にセルラーゼ (Trichoderma reesei由来セルラーゼ１.０ｍｇ、Sigma) を加えた標準反応液にセルロース分解促進タンパク質を加え、３５℃で１８時間振とうした後、遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。可溶性画分に含まれる可溶性糖量（セルロース由来のオリゴ糖およびグルコースを含む）をアンスロン/硫酸法を用いて測定し、セルロース分解量を評価した。
【００６９】
セルロース分解促進タンパク質の効果を調べる反応系において加えられるセルラーゼ量（０.１〜１００μｇ）を変化させると、セルラーゼ量の増加に伴い生成される糖量は増加するが、セルロース分解促進タンパク質によるセルロース分解促進効果は減少した（図４）。
【００７０】
枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主として生産されたヒスチジンタグを有するセルロース分解促進タンパク質はヒスチジン吸着カラムにより精製することができる。精製したセルロース分解促進タンパク質を用いてセルラーゼによるセルロース分解の促進効果を調べ結果、精製したセルロース分解促進タンパク質は粗酵素標品中のセルロース分解促進タンパク質と同様のセルロース分解促進効果を示した（図５）。つまり、ヒスチジン吸着カラムによる精製過程においてセルロース分解促進タンパク質の不活化は生じない。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
化石燃料に代わるクリーンなエネルギー源として注目されているバイオエタノールを植物糖鎖（細胞壁に由来する）から製造する過程において、効率的な糖化方法として利用することができる。特に現在ではサトウキビやトウモロコシなど食料となる資源からバイオエタノールが製造されているが、植物糖鎖からバイオエタノールを低コストで製造できるので、食料資源の安定供給や再生産可能な植物資源を効率的に利用出来ることになり、大気中の二酸化炭素濃度の上昇を制御することも可能となる。
【００７２】
日本には化石資源がなく、エネルギー自給率は数％と非常に低いが植物バイオマスからエネルギーを製造する効率的な技術の確立により、自国のエネルギー自給率の上昇も可能である。これに伴う産業の発展により地域社会の活性化も期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）である、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質を用いて、加水分解酵素によるセルロース分解を促進する方法。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列上の少なくとも１位〜７７０位を含む塩基配列からなる遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主細胞として前記遺伝子を発現させてタンパク質を生産することを含む、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子をベクター (ｐＮＣＭＯ２)で形質転換された宿主細胞。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）である、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質を用いて、加水分解酵素によるセルロース分解を促進する方法。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列上の少なくとも１位〜７７０位を含む塩基配列からなる遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
枯草菌 (Brevibacillus choshinensis) を宿主細胞として前記遺伝子を発現させてタンパク質を生産することを含む、加水分解酵素によるセルロース分解を促進するタンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子をベクター (ｐＮＣＭＯ２)で形質転換された宿主細胞。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１７２２０６（Ｐ２０１０−１７２２０６Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５３４２（Ｐ２００９−１５３４２）
【出願日】平成２１年１月２７日（２００９．１．２７）
【出願人】（３９００２５７９３）岩手県 (38)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２７日（２００９．１．２７）
【出願人】（３９００２５７９３）岩手県 (38)
【Ｆターム（参考）】
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