タンパク質の精製方法およびタンパク質精製用アフィニティカラム
ペプチドタグとプロテアーゼ阻害剤との特異的親和性を利用した、標的タンパク質をサンプルから精製する方法を開示する。また、支持体上に固定されたプロテアーゼ阻害剤を有する支持体上のタンパク質の精製のためのアフィニティクロマトグラフィ媒質、および前記アフィニティクロマトグラフィ媒質を含むアフィニティクロマトグラフィカラムを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、タンパク質を精製する方法およびタンパク質を精製するために使用されるアフィニティカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、タンパク質を疾病の治療や診断に使用しようとする試みが多くなされている。特に、治療用抗体の市場が飛躍的に成長してきており、多くのバイオテクノロジー企業がこのようなタンパク質治療の発展に尽力している。キメラ抗体またはヒト化抗体に関連した初期の組換え抗体工学分野は、現在では、脱免疫化抗体、または形質転換マウスおよびファージディスプレイ技術を利用した完全ヒト抗体の開発段階まで進歩してきている。
【０００３】
多くの場合、疾病の治療や診断用タンパク質は、これを発現するベクターで形質転換させた細胞の培養中に、タンパク質を発現することによって生成される。または、このようなタンパク質は、組換え植物または組換え動物中で過剰発現することがある。例えば、このようなタンパク質は、前記タンパク質が形質転換動物の乳から得られるような、組換え乳泌動物中で発現されうる。この場合、前記タンパク質は、一般的に、細胞培養物または乳から単離精製する必要がある。植物や微生物中でタンパク質を発現させる場合には、単離精製には、貯蔵器官または細胞からタンパク質を抽出する過程が含まれる。これらのいずれかのソースから発現されたタンパク質の単離精製は、決して容易な作業でない。これには、宿主細胞のタンパク質またはＤＮＡを除去または分離、ヒトに感染するウイルスの除去、並びに植物由来のレクチンまたはグラム陰性菌由来のエンドトキシンの除去が必要である。
【０００４】
血清または腹水のような哺乳動物細胞培養物上澄液（例えば、ＣＨＯまたはＮＳＯ細胞培養物）または粗タンパク質混合物由来の抗体の精製に広く用いられる方法は、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィである。タンパク質Ａは、多くの哺乳動物種に由来するタンパク質に結合する。特に、重鎖との相互作用によって免疫グロブリンのＦｃ部位に結合する。タンパク質Ａは、免疫グロブリンＩｇＧに対し高い親和性で結合する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書中に開示された内容は、サンプルから標的タンパク質を精製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、前記方法は、プロテアーゼ阻害剤と、前記プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有するペプチドタグとのカップリングを含む。他の実施形態において、前記方法は、プロテアーゼ阻害剤と、前記プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有するペプチドタグとのカップリングを含み、前記プロテアーゼ阻害剤は支持体に固定され、前記ペプチドタグは精製される標的タンパク質に結合されている。一実施形態において、前記方法は、タグ付けされた標的タンパク質を含むサンプルを、プロテアーゼ阻害剤が固定された支持体に接触させ、この際、前記タグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグと共有結合した標的タンパク質であり、前記ペプチドタグは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有しており、前記接触は、プロテアーゼ阻害剤がペプチドタグに結合するような条件で行われ、結合されていない前記サンプル成分を除去し、次いで、支持体から標的タンパク質を除去することを含む。
【０００７】
また、本明細書中には、支持体および前記支持体に結合したプロテアーゼ阻害剤を含むアフィニティクロマトグラフィ媒質が開示される。アフィニティクロマトグラフィ媒質を充填したアフィニティクロマトグラフィカラムもまた開示される。
【０００８】
本明細書中には、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有するペプチドタグおよび標的タンパク質を含む融合タンパク質が開示される。融合タンパク質を発現する組換え細胞もまた開示される。
【発明の効果】
【０００９】
本明細書に開示された方法およびカラムによって抗体のようなタンパク質を効率よく精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、本明細書に開示されたタンパク質の精製過程の一実施形態を示す概略図である。
【図２】図２は、精製されたエコチンを電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図３】図３は、エコチンアフィニティカラムを利用して精製されたヒトカチオン性トリプシノーゲン（ＰＲＳＳ１）を電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図４】図４は、タンパク質Ａアフィニティカラムクロマトグラフィまたはエコチンアフィニティカラムクロマトグラフィのいずれかをそれぞれ利用した抗エコチン抗体の親和性精製過程を示す概略図である。
【図５】図５は、タンパク質Ａアフィニティカラムまたはエコチンアフィニティカラムによって精製された抗エコチン抗体を電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図６】図６は、ポリペプチド配列（配列番号１３）およびその構造の特徴を示すヒトカチオン性トリプシノーゲンに対するスウィツ−プロット・エントリー Ｐ０７４７７（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｐ０７４７７）の一部を複製したものである。
【図７】図７は、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼを切断部位に挿入して突然変異した、突然変異トリプシンタグでタグ付けされた重鎖を含む組換え抗ＥＧＦＲ抗体のＨＥＫ２９３細胞中での発現を確認するための電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図８】図８は、ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＤＨＦＲ−）細胞中での発現後にエコチンアフィニティクロマトグラフィによって精製された、突然変異トリプシンタグでタグ付けされた抗ＥＧＦＲ抗体を電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細中に、タンパク質の精製のための方法およびタンパク質の精製のためのアフィニティクロマトグラフィ媒質を開示する。前記方法は、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤との高い結合特異性を利用して、標的タンパク質、例えば抗体を迅速に精製できるようにする。
【００１２】
本明細書中で用いられる「プロテアーゼ」とは、タンパク質分解を行う酵素、すなわち、ポリペプチド鎖でアミノ酸を連結しているペプチド結合を加水分解することで、タンパク質を分解する酵素のことを意味する。周知のプロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼが挙げられる。
【００１３】
本明細書中で用いられる「ペプチドタグ」とは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するペプチドであれば、その由来や長さにかかわらず、いずれのペプチドも含まれる。例えば、前記「ペプチドタグ」という語は、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するその断片、またはプロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するその突然変異体を含む。プロテアーゼ断片のペプチドタグの例として、プロテアーゼ阻害剤に対して特異的結合親和性を有するが、全長プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠くペプチドがある。プロテアーゼ断片の一例は、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保持し、タンパク質分解活性を欠如するプロテアーゼからの最短ペプチドでありうる。さらに、プロテアーゼ突然変異体のペプチドタグの例として、プロテアーゼ阻害剤に対する結合親和性は保有しているが、野生型プロテアーゼの正常タンパク質分解活性が、例えばタンパク質分解活性部位の突然変異によって欠けたものである、プロテアーゼの突然変異体がある。ペプチドタグの長さは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保持し、タンパク質分解活性を欠くプロテアーゼ由来の少なくとも６以上の隣接したアミノ酸でありうる。
【００１４】
本明細書中で用いられる「プロテアーゼ阻害剤」とは、プロテアーゼを阻害するすべての物質を意味する。プロテアーゼ阻害剤は、低分子量化合物、例えば不可逆的阻害剤であるフッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸塩酸塩もしくはフッ化フェニルメチルスルホン酸、または高分子量化合物、例えばタンパク質である。
【００１５】
本明細書中で用いられる「タグ付けされたタンパク質を含むサンプル」とは、天然由来または人工的に調製されたものであるかにかかわらず、標的タンパク質を含むすべてのサンプルを意味する。前記サンプルは、異なる液体の混合物、液体と固体との混合物、または異なる固体の混合物を含む。標的タンパク質を含むサンプルの例として、血液、血清、腹水、乳、組職サンプル、細胞培養物、細胞溶解物または細胞培養の上澄液が挙げられる。
【００１６】
本明細書中で用いられる「支持体」とは、形態またはその原料にかかわらず、プロテアーゼ阻害剤を固定してアフィニティクロマトグラフィ媒質を得ることができるものであればいずれの物質であってもよい。例えば、アフィニティクロマトグラフィにおいて通常使用されるアガロース；セルロース；およびポリアクリルアミドなどが挙げられる。
【００１７】
本明細書中で用いられる「クロマトグラフィ媒質」とは、形態（カラムもしくは平板）、状態（液体もしくは固体）、またはその原料にかかわらず、クロマトグラフィ精製のために使用される固定相を意味する。一般的なタンパク質の精製のために使用されるクロマトグラフィ媒質の例として、イオン交換樹脂、親和性固定相、およびゲル浸透固定相が挙げられる。
【００１８】
本明細書中で用いられる「カップリングされた（連結された）」とは、２以上の遺伝子またはタンパク質の直接接触したもの、およびリンカー遺伝子またはタンパク質の配列を意味する。また、共有結合または非共有結合によるカップリングも含む。
【００１９】
本明細書中で用いられる「標的タンパク質」とは、精製されるすべてのタンパク質を意味する。標的タンパク質の例として、抗体が挙げられる。
【００２０】
本明細書中で用いられる「タグ付けされたタンパク質」とは、ペプチドタグに共有結合された標的タンパク質を意味する。
【００２１】
本明細書中で用いられる「融合タンパク質」とは、２以上の別個のポリペプチドの任意の組み合わせを意味する。融合タンパク質の例として、本来別個のポリペプチドをコード化した核酸を２以上結合して生成されたタンパク質が挙げられる。タグ付けされた標的タンパク質は、融合タンパク質をコード化する核酸を得るために、ペプチドタグをコード化する核酸が、標的タンパク質をコード化する核酸と結合した融合タンパク質でありうる。前記融合タンパク質は、２以上の別個のポリペプチドの組み合わせを含み、前記２以上のポリペプチドは共有結合で結合されたものであってもよい。前記融合タンパク質は、２以上の別個のポリペプチドの組み合わせを含み、前記２以上の別個のポリペプチドは、非共有結合で結合されたものであってもよい。前記２以上の別個のポリペプチドは、いずれのメディエータを介することなく互いに直接的に接触されたものであってもよい。前記２以上の別個のポリペプチドは、リンカーペプチドのようなメディエータによって媒介されていてもよい。
【００２２】
本明細書中に開示された方法は、プロテアーゼと特異的プロテアーゼ阻害剤との高い結合特異性を利用して、標的タンパク質を精製するものである。
【００２３】
一実施形態において、前記方法は、タグ付けされた標的タンパク質を含むサンプルを、プロテアーゼ阻害剤が固定された支持体へ接触させ、この際、前記タグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグと共有結合した標的タンパク質であり、前記ペプチドタグは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有しており、前記接触は、プロテアーゼ阻害剤がペプチドタグに結合するような条件で行われ、結合されていない前記サンプルの成分を除去し、次いで、支持体から標的タンパク質を除去することを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは細胞溶解物、細胞培養物、細胞培養の上澄液または標的タンパク質を含む生物液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）である。いくつかの実施形態において、支持体上に固定されたプロテアーゼ阻害剤を有する支持体は、アフィニティクロマトグラフィカラムとして構成される。
【００２４】
本明細書中に開示されたタンパク質の精製に用いられる方法およびタンパク質を精製するために使用されるカラムには、使い捨てカラムが使用されうる。前記使い捨てカラムは、約０．１〜約１．０ｍｍ、約０．３〜約０．７ｍｍ、または約０．５ｍｍの径を有しうる。前記カラムは、約１６×１２５ｍｍのガラス試験管に設置されうる。一実施形態において、約０．５ｍｍの径を有する使い捨てカラムが、１６×１２５ｍｍのガラス試験管に取り付けられる。クロマトグラフィ媒質、例えばアガロースゲルは、当該技術分野で知られている任意の方法によってカラム内に充填されうる。使い捨てカラムを使用する一実施形態において、十分な体積の脱気したバッファー／水をカラムに添加して貯水部分（広い開口）まで満たし、次いで、カラム内のすべての気泡を除去する。次に、ゲルを室温で脱気された５０％ゲルスラリーおよび脱気されたバッファー溶液（または水）と一緒にカラムに充填する。十分な体積の脱気されたゲルスラリーを添加して所望の安定したゲル体積が得られる。前記ゲルは、カラム内が落ち着くように、少なくとも３０分間静置しうる。前記パックされたカラムは、４℃で保管および使用されうる。
【００２５】
標的タンパク質の支持体からの除去は、支持体からタグ付けされた標的タンパク質を溶出させ；次いで、タグ付けされた標的タンパク質からペプチドタグを分離して、標的タンパク質を得ることを含みうる。タグ付けされた標的タンパク質の溶出は、タグ付けされた標的タンパク質が支持体から除去されるように、ペプチドタグとプロテアーゼ阻害剤との結合親和性を低下させるｐＨで行われうる。タグ付けされた標的タンパク質からのペプチドタグの分離は、溶出されたタグ付け標的タンパク質をプロテアーゼ、例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、パパイン、またはペプシンで処理することによって行われる。
【００２６】
また、カラム上の標的タンパク質から結合したペプチドタグを酵素を用いて切断し、カラム上にペプチドタグを結合したままにすることで、前記標的タンパク質をカラムから溶出させるように遊離させることによって、標的タンパク質を除去することができる。プロテアーゼの例としては、ＴＥＶプロテアーゼ、パパイン、またはペプシンが挙げられる。
【００２７】
図１には、本明細書中に開示されたタンパク質を精製する方法の一実施形態の概略図が示されている。示されている前記実施形態において、標的タンパク質は免疫グロブリン重鎖のＣ末端に共有結合したペプチドタグを含む抗体である。示されている前記実施形態において、ペプチドタグと特異的に結合するプロテアーゼ阻害剤を支持体上に固定させて、アフィニティクロマトグラフィ媒質を与える。標的タンパク質を含むサンプルがアフィニティクロマトグラフィ媒質を含むアフィニティクロマトグラフィカラムを流れる場合、前記標的タンパク質は、ペプチドタグおよびプロテアーゼ阻害剤の間の特異的な結合によってカラム上に保持され、サンプルの他の成分はカラム上に保持されない。その後、結合した標的タンパク質はカラムから除去されうる。
【００２８】
図１に示すように、結合したタグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグがプロテアーゼ阻害剤ともはや結合しない条件、例えば、より低いｐＨのバッファーで溶出することにより、カラムから除去されうる。その後、前記溶出された標的タンパク質は、ペプチドタグから分離されうる。例えば、図１に示すように、タグ付けされた標的抗体を、酵素、例えばペプシンまたはパパインで処理することによって、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂ断片が得られうる。また、抗体の正常のパパイン切断部位を破壊するように、およびペプチドタグと標的抗体との間に新規パパイン切断部位を挿入するように、標的抗体の重鎖が突然変異される場合には、カラムから放出された融合タンパク質をパパインで処理することにより、タグ付けされた標的抗体からペプチドタグが除去されうる。本明細書中に開示される方法において使用されうるペプチドタグは、下記いずれかのプロテアーゼ群の突然変異プロテアーゼに由来するペプチドタグを含む：セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼ。具体的には、ペプチドタグは、パパイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、レンニン、カテプシンＤ、サーモリシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、またはコラゲナーゼの突然変異から由来したペプチドタグを含む。
【００２９】
ペプチドタグは、当該技術分野で知られている任意の方法によって調製されうる。加水分解活性を阻害するのに必要な最小レベルのみで突然変異が起こりうる。例えば、単一ヌクレオチドまたは単一アミノ酸の置換によって、ペプチドタグとして使用されるプロテアーゼ突然変異体が調製されうる。これに関連して、当該技術分野で通常知られた周知の方法として、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が用いられうる。いくつかの実施形態において、タンパク質分解活性部位全体がペプチドタグから除去される。前記除去は、当該技術分野で知られた任意の方法を用いて行われうる。
【００３０】
本明細書中に開示される方法またはアフィニティクロマトグラフィ媒質で使用することができるプロテアーゼ阻害剤としては、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター（ｐａｐａｙａ Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ペプスタチンＡ（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン（ｂｄｅｌｌｉｎ）、ペプシノストレプチン（ｐｅｐｓｉｎｏｓｔｒｅｐｔｉｎ）、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、および２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムが挙げられる。具体的に、プロテアーゼ阻害剤は下記表１または表２に記載のいずれかでありうる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
また、本明細書中に開示された、使用されうるプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の組み合わせの例は、下記表２のとおりである。
【００３３】
【表２】
【００３４】
本明細書中に開示された方法またはカラムの一実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来の、トリプシンおよび他の膵プロテアーゼを阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤のエコチンである。エコチンは、１００℃、ｐＨ１．０の条件下でも少なくとも３０分間は安定した状態を保持する。エコチンの分子量は１８ｋＤで、等電点（Ｐｉ）は６.１である。エコチンは、トリプシン、キモトリプシン、膵エラスターゼ、ラットマスト細胞、キマーゼ、またはヒトの漿膜ウロキナーゼ（ｓｅｒｏｓａｌ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）によって分解されない。さらに、エコチンは、ヒトの肺トリプターゼ、カリクレイン、パパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ、スブチリシン、およびサーモリシンを阻害しない。また、大腸菌から最近単離された８種の可溶性エンドプロテアーゼ（すなわち、Ｄｏ、Ｒｅ、Ｍｉ、Ｆａ、Ｓｏ、Ｌａ、ＣｉおよびＰｉ）、キモトリプシン様エステラーゼ（プロテアーゼＩ）またはトリプシン様エステラーゼ（プロテアーゼＩＩ）を阻害しない。プロテアーゼ阻害剤がエコチンである方法の一実施形態において、プロテアーゼはトリプシンである。トリプシンは、消化器に見られる、タンパク質を分解するセリンプロテアーゼである。例えば、トリプシンは、牛乳中のカゼインを分解する。トリプシンは、プロリンが連続する場合を除き、主にアミノ酸であるリジンおよびアルギニンのカルボキシル側のペプチド鎖を切断する。トリプシンは、膵臓に多量に存在し、容易に精製される。
【００３５】
本明細書中に開示された方法またはカラムの他の一実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、カリーカ・パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）に由来したパパイアプロティナーゼ阻害剤（ＰＰＩ）の１つである、パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤である。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は、ウシのトリプシンを１：１モル比で阻害する。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は、極めて広いｐＨ範囲（１．５〜１１．０）および８０℃までの温度でも阻害剤として活性がある。また、強い化学的変性剤（例えば、５．５Ｍグアニジン塩酸塩）が高濃度に存在する場合にも安定である。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は、ペプシンに対して顕著に優れたタンパク質分解抵抗性を示す。プロテアーゼ阻害剤がパパイアクニッツ型トリプシン阻害剤であるいくつかの実施形態において、プロテアーゼはトリプシンである。
【００３６】
標的タンパク質をコード化する核酸は、ペプチドタグを含むように、すなわち、遺伝子が標的タンパク質およびペプチドタグを含む融合タンパク質をコード化するように設計されうる。その後、前記融合タンパク質をコード化する前記遺伝子がベクターに導入され、次いで、前記ベクターは適した宿主細胞を形質転換させるために使用される。前述したように、標的タンパク質がペプチドタグ由来のプロテアーゼに鋭敏な配列を含む場合、ペプチドタグのプロテアーゼによって標的タンパク質のタンパク質分解を防ぐことが重要である。これは、例えばタンパク質分解活性部位の領域におけるプロテアーゼの遺伝子突然変異生成によって防ぐことができる。突然変異、融合タンパク質（タグ付けされた標的タンパク質）をコード化する組換え核酸の形成、組換え発現ベクターの形成、および宿主細胞の形質転換は、関連技術分野において知られたいずれの方法によっても行われうる。
【００３７】
「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができ、およびこれに作動可能に連結する標的タンパク質をコード化する核酸の発現を指令することができる核酸分子を意味する。さらに、ベクターは形質転換された宿主細胞をスクリーニングできる適切なマーカーを有しうる。使用可能なベクターとしては、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス、および挿入可能なＤＮＡ断片（相同組換えによって宿主細胞ゲノムに挿入可能な断片）が含まれうる。
【００３８】
「作動可能に連結する」という語とは、１つの機能が他方によって調節されるような単一核酸断片上の核酸配列連関性を意味する。例えば、プロモータがコード配列の発現を制御することができる場合（すなわち、前記コード配列がプローモータの転写調節下にある場合）、プローモータはコード配列に作動可能に連結される、または、リボソーム結合部位が翻訳を促進できるように位置している場合、リボソーム結合部位はコード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向にて調節配列に連結されて作動されうる。
【００３９】
ベクターは宿主細胞に導入され、前述した核酸によってコード化された融合タンパク質またはペプチドが生産されうる。いくつかの場合において、ベクターは、宿主細胞によって認識されるプローモータを含みうる。「プローモータ」は、転写を指令するのに十分な最小配列を意味する。また、細胞型特異的または外部の信号もしくは化学物質によって誘導される調節可能なプローモータ依存性遺伝子発現に十分なプローモータ成分が含まれ、このような成分は、遺伝子の５’もしくは３’部位に位置しうる。構成的プロモータおよび誘導的プローモータの両方が含まれる。プローモータ配列は、原核生物、真核生物、またはウイルスに由来しうる。宿主細胞の核酸発現に望ましいレベルの適したプローモータ活性を有する宿主細胞適合プローモータの選択は当業者の能力範囲内にある。
【００４０】
ベクターは、さらなる発現調節配列を有しうる。「調節配列」とは、特定の宿主個体内で作動可能に連結するコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。前記調節配列は、シャイン−ダルガーノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でありうる。例えば、前記シャイン−ダルガーノ配列は、ＭＳ−２上ファージのレプリガーゼ遺伝子（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ｇｅｎｅ）またはバクテリオファージ１のｃＩＩ遺伝子由来でありうる。宿主の形質転換は、当該技術分野に周知の技術のいずれかによって行われうる。
【００４１】
本明細書中に開示された一実施形態によるプロテアーゼ阻害剤アフィニティクロマトグラフィ媒質およびカラムは、アルデヒドによって活性化されたアガロースビーズおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）の還元的アミノ化によって、プロテアーゼ阻害剤を固定化することで調製されうる。
【００４２】
本明細書中に開示された他の一実施形態によるプロテアーゼ阻害剤アフィニティカラムは、下記過程を通じて調製されうる：
１．支持体の調製：
プロテアーゼ阻害剤がカップリングされうる支持体を調製する。支持体としては、アガロースゲルが使用されうる。例えば、溶媒中に懸濁した凍結乾燥されたアガロースビーズが使用されうる。凍結乾燥されたアガロースビーズは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）であり、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂを添加剤の存在下で凍結乾燥させることで得られうる。セファロース４Ｂにプロテアーゼ阻害剤をカップリングする前に、反応基の活性を維持するため、低いｐＨでＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂを洗浄することによって添加剤が除去される。この点において、ｐＨは３以下であり、これより高いｐＨでは加水分解を誘発しうる。凍結乾燥されたアガロースビーズは、溶媒、例えば１ｍＭ ＨＣｌ中に懸濁させる。通常、溶媒中に懸濁した凍結乾燥された臭化シアン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂビーズの１ｇは、膨潤後、支持体最終体積約３．５ｍｌを与える。上記懸濁の直後、前記支持体は、膨潤した場合にさらに洗浄する必要があり、例えば、孔隙率がＧ３の焼結ガラスフィルター上において１ｍＭ ＨＣｌで１５分間洗浄する。
【００４３】
２．プロテアーゼ阻害剤のカップリング
本工程は、プロテアーゼ阻害剤を上記項目１の支持体とカップリングすることを含む。はじめに、プロテアーゼ阻害剤をカップリング溶液に溶解させる。カップリング溶液は、凍結乾燥されたセファロースパウダー当初の１ｇ当たり約３〜７ｍｌが使用されうる。また、プロテアーゼ阻害剤は膨潤した支持体１ｍｌ当たり約５〜１０ｍｇが使用されうる。プロテアーゼ阻害剤の分子量が小さい場合（５ｋＤ以下）には、支持体１ｍｌ当たり１〜１０μｍｏｌの濃度で添加されうる。カップリング溶液の例として、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌが挙げられる。項目１に従い調製された支持体懸濁物はプロテアーゼ阻害剤含有カップリング溶液に添加され、撹拌させる。温和な撹拌方法であれば特に制限はなく、例えば、エンド−オーバーエンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒｅｎｄ）回転させる。
【００４４】
標的タンパク質の精製方法の一実施形態において、結合された標的タンパク質の溶出は、プロテアーゼ阻害剤アフィニティクロマトグラフィ媒質から標的タンパク質を溶出させるあらゆる好適な溶媒の中で起こりうる。いくつかの実施形態において、溶出は、ｐＨ溶出によって行われうる。例えば、ｐＨを２〜５の範囲内に調整することによって、ペプチドタグとカップリングした標的タンパク質を溶出させうる。例えば、プロテアーゼ阻害剤としてエコチンを使用する場合、エコチンは強酸中でも高い安定性および相補的なペプチドタグとの高い親和性を示すことから、溶出はｐＨ２〜３で行われる。溶出ｐＨが低いほど、溶出が容易および効率的となるため、タンパク質の収率および純度が高くなる。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤を使用する場合、パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は酸中では非常に安定であるが、相補的ペプチドタグとの親和性がエコチンに比べて約１／１００と低く、溶出はｐＨ３〜４で可能になる。上述の例に示すように、ペプチドタグおよびプロテアーゼ阻害剤の間の親和性は変化し、プロテアーゼ阻害剤親和性媒質および相補的ペプチドタグの組み合わせの違いによって、異なる溶出ｐＨが使用されうる。ペプチドタグと結合した標的タンパク質をカラムから分離する他の方法は、活性プロテアーゼの使用を含む。このような方法において使用に選択される前記活性プロテアーゼは、カラム上でのプロテアーゼ阻害剤の分解、または標的タンパク質の不活性化を生じないものである。例えば、前述したように、このような方法を標的抗体に使用する場合、完全抗体分子または抗体断片（Ｆａｂ、F（ａｂ）２）が溶出されうる。
【００４５】
標的タンパク質からのペプチドタグの分離は、特に制限されないが、酵素処理によって行われうる。例えば、標的タンパク質が抗体である場合、タグ付けされた抗体をパパインやペプシンのような酵素で処理すると、前述したようにＦ（ａｂ）２またはＦａｂが得られる。パパインでタンパク質分解した完全免疫グロブリンを提供できるタグ付けされた標的抗体は、免疫グロブリン重鎖遺伝子のパパイン切断部位の突然変異、ペプチドタグをコード化する核酸と免疫グロブリン重鎖遺伝子との間へのパパイン切断部位の挿入、およびそのようにして得られたタグ付きの抗体へのパパインの処理によって得られうる。これは、図１の右下部に示されている。また、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位は、ペプチドタグと前記タンパク質との間に挿入されうる。前記ペプチドタグは、融合タンパク質をＴＥＶプロテアーゼで分解することによって、前記タンパク質から分離されうる。
【００４６】
以下、本明細書に開示された方法およびクロマトグラフィが、下記実施例を参照により具体的に記載されるが、これらの実施例は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：エコチンの精製
１．エコチンの調製
過剰発現ベクターにクローニングした配列番号１のエコチンを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．）で過剰発現させた。発現した細胞は、５，０００×ｇで１５分間遠心分離して収集した。前記細胞を超音波によって粉砕し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して粗抽出物を得た。前記粗抽出物に１Ｍ ＨＣｌを添加して処理し、ｐＨを３に調整した。１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して上澄液からエコチンを得た。エコチンを４℃で２０分間インキュベーションさせた後、１Ｍトリス塩基を添加してｐＨを７.８に再調整し、１００℃で２０分間加熱した。各ステップにおいて、不溶性物質を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して除去して上澄液を得て、前記上澄液に８０％（ｗ／ｖ）に飽和するように、固体硫酸アンモニウムを添加して、１０％間隔で分画されたタンパク質を得た。
【００４８】
沈澱したタンパク質を、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に対して透析させ、同じバッファーで平衡化された陰イオン交換カラム上にロードした。カラムに結合していないタンパク質を収集し、トリプシンアフィニティカラムを使用して精製し、その後４℃で保存した。
【００４９】
２．ゲル電気泳動
上記項目１に記載の方法によって得られたエコチンの純度は、Ｌａｅｍｍｌｉらによってに記載されているように（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５）、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有した１０〜２０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド勾配スラブゲルを用いて電気泳動を行うことにより決定した。電気泳動の結果を図２に示した。前記得られたエコチンの純度は９５％以上であった。
【００５０】
３．エコチン活性の測定
上記記載によって得られたエコチンがプロテアーゼ活性を有するか否かを調べるため、Ｗｏｏらによって記載されているように（Ｗｏｏ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｊ．，Ｈａ，Ｄ．Ｂ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，２０８８−２０９１）、蛍光性ペプチドの切断が分析された。トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼの基質として、それぞれＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−４−メトキシ−β−ナフチルアミド、Ｎ−スクシニル（Ｓｕｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）およびＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＭＣが用いられた。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）中に、適量のエコチン、およびトリプシン１０ｎｇ、キモトリプシン２ｎｇ、もしくはエラスターゼ３０ｎｇを含む反応混合物０．１ｍｌを、ペプチド基質（０．１ｍＭ）を添加する前に、室温で３０分間インキュベーションさせた。トリプシンおよびキモトリプシンを分析する際には、２０ｍＭ ＣａＣｌ２も添加させた。インキュベーション後、０.１×ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．１）０．９ｍｌを前記反応混合物に添加させ、熱湯槽内で６分間加熱した。４−メトキシ−ｐ−ナフチルアミドに対しては、３１０ｎｍ（励起）および４１０ｎｍ（発光）、ＡＭＣに対しては、３８０ｎｍ（励起）および４４０ｎｍ（発光）で蛍光を測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄらによって記載されているように（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４）、基準としてウシ血清アルブミンの使用、または吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）が知られたタンパク質の２８０ｎｍの吸光度によって、タンパク質を分析した。上記項目１で得られたエコチンはトリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼの活性の１００％の阻害を示した。
【００５１】
実施例２：エコチンアフィニティカラムの調製
精製したエコチンを、臭化シアン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を用いた還元的アミノ化反応によって固定化させ、本実施例におけるエコチンアフィニティカラムを調製した。
【００５２】
１．クロマトグラフィ媒質の調製
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を１ｍＭ ＨＣｌ中に懸濁させ、またはゲルが膨潤するまで３０分以上放置した。凍結乾燥したセファロースパウダー１ｇは、約３．５ｍｌの最終体積の媒質を与えた。懸濁直後に支持体を設置する場合、上澄液を捨て、この過程を繰り返して、壊れた媒質断片等を分離した。その後、前記支持体を冷たい１ｍＭ ＨＣｌの支持体（ゲル）体積の１５倍量で洗浄した。そして、支持体のバッファーをカップリングバッファーで置換するために支持体を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌのカップリングバッファーで洗浄した。
【００５３】
２．エコチンのカップリング
実施例１の工程で得られたエコチンを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌのカップリングバッファーに溶解させた。上記凍結乾燥されたセファロースパウダー１ｇ当たり、カップリングバッファー約７ｍｌが使用された。支持体１ｍｌ当たりエコチン約１０ｍｇが使用される。エコチン含有カップリング溶液に上記項目１で用意されたセファロース懸濁物を添加し、室温で３〜４時間または４℃で一晩中撹拌させた。前記反応は、カップリングされたアガロースにストップバッファー（０．１Ｍエタノールアミン）を添加させることによって停止させた。その後、過剰のエコチンは、媒質（ゲル）体積の少なくとも５倍量のカップリングバッファーで洗浄して除去した。前記クロマトグラフィ媒質を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）に移し、ｐＨ８で２〜４時間放置した。次に、前記クロマトグラフィ媒質を、交互に異なるｐＨで８サイクル洗浄した。各洗浄用バッファーは媒質体積の５倍量を使用した。各サイクルは、５０ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ３．５）による洗浄、続く５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１Ｍ ＮａＣｌによる洗浄で構成される。その後、前記クロマトグラフィ媒質を再度、媒質体積の１０倍量でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。
【００５４】
３．使い捨てカラム（径０．５ｍＭ）を抗体の精製に使用した。前記カラムは、１６×１２５ｍｍのガラス試験管（試験管ラック中）に設置された。十分な体積の脱気されたバッファー／水をカラムに添加して貯水部分（広い開口）まで満たし、カラム内の全ての気泡を除去した。ゲルを室温で脱気された５０％ゲルスラリーおよび脱気されたバッファー溶液（または水）と一緒にカラムに充填した。十分な体積の脱気されたゲルスラリーを添加して所望の安定したゲル体積を得た。前記ゲルは、カラム内で少なくとも３０分静置させた。前記充填されたカラムは、４℃で保管および使用される。
【００５５】
実施例３：エコチンアフィニティクロマトグラフィを利用したトリプシンの精製
ヒトカチオン性トリプシノーゲン（ＰＲＳＳ１）遺伝子（配列番号２）をクローニングした。タンパク質分解活性が欠如し、抗ＥＧＦＲ抗体を加水分解できない突然変異体ＰＲＳＳ１（配列番号２）を得るために、野生型ヒトＰＲＳＳ１（ＨＧＮＣ：９４７５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７４７７）（図６、配列番号１３）の遺伝子を、タンパク質分解活性部位で部位特異的突然変異誘発させた。特に、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，＃２００５２４−５，Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）が、２００番目セリンアミノ酸のコドンをアラニンのコドンに突然変異させるために使用された。得られた突然変異ＰＲＳＳ１遺伝子（配列番号２）をｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターにクローニングさせ、ＹＴ培地で培養されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。Ｏ．Ｄ．６００が０．６に達する場合、１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が培地に添加され、前記培地を３７℃で４時間さらに培養した。前記培養細胞は、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ ＮａＣｌ、および６Ｍグアニジン−ＨＣｌ）中において超音波で粉砕し、１０，０００ｇで遠心分離することによって、上澄液を得た。前記上澄液は、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ ＮａＣｌ、および０．９Ｍグアニジン−ＨＣｌ）を透析させて、変性タンパク質をリフォールディングした。上述のようにして得られたサンプルを実施例２で調製された１−ｍＬエコチンカラムに適用させた。前記カラムを上記と同じバッファーで洗浄し、５０ｍＭ ＨＣｌで溶出させて、精製トリプシノーゲンを回収した。上述のように得られた前記トリプシノーゲンは、実施例１と同様に電気泳動した。その結果を図３に示す。レーン１（最左のレーン）はサイズマーカーを示し、レーン２（左側から２番目）は粗タンパク質抽出物（未精製）を示し、レーン３（左側から３番目）はフロースルー（エコチン未結合）を示し、レーン４（最右のレーン）は精製トリプシン突然変異体のみを示す。
【００５６】
実施例４：エコチンアフィニティクロマトグラフィを利用した抗エコチン抗体の精製
実施例１で得られたエコチン２００μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に溶解し、ニュージーランドホワイトラピッド（生後２ヶ月、雄）に皮下注射して、抗エコチン抗体を生成させた。抗体の生成後、ウサギの血漿を収集した。血漿サンプルを、ローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、および０．２Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、または実施例２において調製されたエコチンカラムにそれぞれ直接適用した。その後、各カラムをバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、および０．５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄し、グリシンバッファー（５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）で溶出した。図４は、タンパク質Ａアフィニティカラムまたはエコチンアフィニティカラムをそれぞれ利用した抗エコチン抗体の精製過程を示す概略図である。タンパク質Ａアフィニティカラムクロマトグラフィまたはエコチンアフィニティカラムクロマトグラフィによって精製された抗エコチン抗体は、実施例１に記載されているように、タンパク質ゲル電気泳動によって分析した。図５は、電気泳動の結果の写真である。
【００５７】
図５において、レーン１およびレーン７はサイズマーカーであり、レーン２からレーン６はタンパク質Ａカラムクロマトグラフィの結果であり、レーン８からレーン１２はエコチンカラムクロマトグラフィの結果である。特に、レーン２および８は粗抽出物（カラムに適用していない血漿）、レーン３および９はフロースルー抽出物（カラムに適用したが、カラムと結合していない）、レーン４および１０は０．５Ｍ ＮａＣｌ含有バッファーの洗浄で得られた抽出物、レーン５および１１は溶出液にジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した結果、レーン６および１２は溶出液にＤＴＴを添加しない結果である。
【００５８】
実施例５：ＨＥＫ２９３細胞中における抗ＥＧＦＲ−トリプシンモノクローナル抗体の発現
本実施例において、抗ＥＧＦＲ−トリプシンモノクローナル抗体、すなわちトリプシンタグでタグ付けされたモノクローナルＥＧＦＲ抗体は、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ．ＣＲＬ−１５７３）中で一時的に過剰発現させ、並びに特性化させる。下記表３は、本実施例に使用された抗ＥＧＦＲ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を表す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
前記モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体は、標的抗原としてＥＧＦＲタンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｅ３６４１）を用いてパンニングしたファージライブラリディスプレイを使用して入手される。抗ＥＧＦＲ抗体について重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を用意した後、組換えｐｃＤＮＡ３．３重鎖ベクター上の重鎖配列の可変領域は、ヒト完全ＩｇＧ１重鎖抗体骨格で置換させた。組換えｐｃＤＮＡ３．３軽鎖ベクター上の軽鎖配列の可変領域は、ヒト完全ＩｇＧ１軽鎖抗体骨格で置換させた。さらに、前記モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の結晶化可能フラグメント領域（Ｆｃ）は、配列番号５の配列を有する。配列番号５は、重鎖におけるヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３のみの配列である。
【００６１】
前記トリプシンタグは、突然変異ヒトＰＲＳＳ１（ＨＧＮＣ：９４７５）（配列番号２）から入手される。野生型ヒトＰＲＳＳ１（ＨＧＮＣ：９４７５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７４７７）（図６、配列番号１３）の遺伝子は、タンパク質分解活性が欠如し、抗ＥＧＦＲ抗体を加水分解できない突然変異ＰＲＳＳ１を入手するため、タンパク質分解活性部位に部位特異的突然変異誘発させた。特に、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、＃２００５２４−５、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）が、２００番目セリンアミノ酸のコドンをアラニンに突然変異させるために使用された。
【００６２】
突然変異ＰＲＳＳ１遺伝子は、次のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲによって増幅させた：ＸｈｏＩ−ＴＥＶ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号：３，５’−ＧＡＧ−ＣＴＣＧＡＧ−ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ−ＡＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧ）およびＸｈｏＩ−ＴＡＡ−Ｒ（配列番号：４，５’−ＧＡＧ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＣＴＴ Ａ）。このようなプライマーを使用して、シグナルペプチド（１−１５ａａ）およびプロペプチド（１６−２３ａａ）を欠如したトリプシンドメイン（２４−２４４ａａ、配列番号２）をコード化する核酸が、突然変異ＰＲＳＳ１遺伝子から増幅され、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖をコード化する核酸に連結するためのトリプシンタグをコード化する核酸として使用された。上述のように得られた前記トリプシンタグ核酸は、制限酵素であるＸｈｏＩによって切断され、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖（Ｆｃ部位の配列参照、配列番号５）をコード化する核酸のカルボキシ末端のＸｈｏＩ−サイト内に、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を用いて連結させた。抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖中のＦｃをコード化するｃＤＮＡ（配列番号：５）の６９７〜６９９部位において、重鎖の終止コドン（ＴＧＡ）は、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、＃２００５２４−５）を利用して除去される。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（塩基配列：５’−ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ−３’、配列番号：６）が、終止コドンが欠如した抗体ｃＤＮＡと上記で調製されたトリプシンタグ核酸との間に挿入される。
【００６３】
前述したタグ付けされた抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖構成は、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して、ベクターに挿入される。また、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖をコード化する遺伝子も、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して、ベクターに挿入される。上記のように得られた重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをそれぞれ１２μｇ用意した。２つのベクターの合計２４μｇが、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商品名；インビトロジェン社製）を利用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、抗生物質ペニシリン（最終濃度が１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（最終濃度が１００μｇ／ｍｌ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ ｎｏ １１９９５）を使用して、３７℃および５％のＣＯ２で３日間培養させた。発現された重鎖および軽鎖は、培地中に別々に分泌され、重鎖および軽鎖が互いに結合して抗体複合体を形成する。その後、細胞培養液の上澄液を収集し、実施例２で調製されたエコチンカラムに適用した。精製過程は、次の通りである：
上記で用意されたエコチンアフィニティカラムを任意の周知方法でセットアップした。細胞培養物上澄液のｐＨは、１／１０体積量の１.０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整される。その後、細胞培養物上澄液をエコチンアフィニティカラムに通過させた。カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０.５Ｍ ＮａＣｌで前記カラムを洗浄した。そして、カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）／０.５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。その後、グリシンバッファー（５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）を用いて、トリプシンがタグ付けされたモノクローナル抗体をカラムから溶出させた。溶出液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加することで中和させた。
【００６４】
精製過程からの各種のサンプルを、実施例１で説明したように、タンパク質ゲル電気泳動により分析した。その結果を、電気泳動ゲルの写真である図７に示した。図７の結果により、組換え抗体のＨＥＫ２９３細胞中に発現が確認される。
【００６５】
図７において、レーン１はサイズマーカーである。レーン２からレーン１０は、突然変異トリプシンでタグ付けされた重鎖を有する抗ＥＧＦＲ抗体のエコチン親和性精製から得た溶液の電気泳動の結果であり、レーン１１およびレーン１２は、トリプシンタグのない抗ＥＧＦＲ抗体を含み、ＤＴＴの存在下または不在下でそれぞれ電気泳動した結果である。レーン２はコントロールレーンであり、カラム適用前の粗細胞培養液である。レーン３は、フロースルーカラム（Ｆ）、すなわち、カラムの適用後にエコチンが結合されていないタンパク質である。レーン４は溶出液（Ｅ（＋））であり、電気泳動においてＤＴＴが添加されたカラムから得られた溶出溶液である。レーン５は、電気泳動においてＤＴＴが添加されていない（−）溶出液（Ｅ）である。レーン６はＴＥＶプロテアーゼ単独であり、ＴＥＶプロテアーゼバンドはゲル写真においてＣと標識されている。レーン７からレーン１０は、ＤＴＴの存在下（＋）または不在下（−）、およびＴＥＶプロテアーゼ（Ｔ）の存在下または不在下で、３７℃でインキュベーションさせた溶出液（Ｅ）の結果を示す。レーン７はＥ（＋）（レーン４と同一）、レーン８はＥ（−）（レーン５と同一）、レーン９はＥ＋Ｔ（＋）、およびレーン１０はＥ＋Ｔ（−）である。
【００６６】
図７のゲル写真内の注釈において、Ａは抗ＥＧＦＲ重鎖−トリプシン融合タンパク質バンドであり、ＢはＴＥＶプロテアーゼ−分解抗ＥＧＦＲ重鎖バンドであり、ＣはＴＥＶプロテアーゼバンドであり、Ｄは切断トリプシンタグバンド（５個のＳ−Ｓ結合を有する単体）であり、並びにＧは抗ＥＧＦＲ軽鎖バンドである。
【００６７】
実施例６：エコチンアフィニティクロマトグラフィを利用したモノクローナル抗体の精製
本実施例において、実施例５に記載の抗ＥＧＦＲ−トリプシンモノクローナル抗体が、ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＤＨＦＲ−）細胞（インビトロジェン社製；Ｃａｔ．ｎｏ．１２６１３−０１４）で過剰発現される。
【００６８】
実施例５に記載したように、突然変異トリプシンでタグ付けされた抗ＥＧＦＲ重鎖遺伝子は、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用してベクターに挿入させた。また、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用してベクターに挿入させた。本実験において、上述のように得られた重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをそれぞれ１８.７５μｇ用意した。
【００６９】
これらベクターをトランスフェクトする前に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、６×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌにて８ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１８％のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８を添加したＣＤ ＤＧ４４培地（Ｇｉｂｃｏ．Ｃａｔ ｎｏ．１２６１０）中で、４８時間前、２４時間前にそれぞれ１回ずつ２回にかけて、１３０ｒｐｍの条件下、３７℃、８％のＣＯ２で、６×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように継代培養させた。生存率が９５％以上になる細胞を３×１０７ｃｅｌｌｓに調節し、１２５ｍｌフラスコに入れ、最終体積が３０ｍｌになるようにＣＤ ＤＧ４４倍地を入れた。重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをそれぞれ１８．７５μｇ、並びにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製、１６４４７１００）３７．５μｌを、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（インビトロジェン社製、無血清培地）を用いて最終体積１.２ｍｌに調節するように、ゆっくり混合した。その後、前記混合物を室温で１０分間インキュベートさせた。このようにして得られたプラスミド−脂質複合体をＣＨＯ−ＤＧ４４（ＤＨＦＲ−）細胞を含むフラスコにゆっくり入れ、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ５００μｇ／ｍｌを添加したＣＤ ＤＧ４４倍地で５日間培養した。その後、培養培地を収集し、下記のように、実施例２で用意したエコチンアフィニティクロマトグラフィ媒質に適用した。
【００７０】
上記のように用意されたエコチンアフィニティカラムを任意の周知方法によってセットアップした。上記で得た細胞培養物上澄液には抗体約４μｇ／ｍｌを含む。上記細胞培養物上澄液のｐＨは、１／１０体積量の１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。その後、前記細胞培養物上澄液をエコチンアフィニティカラムに通過させた。カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した。そして、カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）／０．５Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した。その後、グリシンバッファー（５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）で、トリプシンがタグ付けされたモノクローナル抗体をエコチンアフィニティクロマトグラフィ媒質から溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加して中和させた。
【００７１】
抗体精製過程から各種溶液をタンパク質ゲル電気泳動で分析した。その結果を図８に示す。図８において、レーン５はサイズマーカーを含む。レーン１はコントロールであり、カラム適用前の粗細胞培養上澄液である。レーン２はフロースルー、すなわち、カラム適用後のエコチンに結合していないタンパク質を示す。レーン３はタンパク質Ａアフィニティカラムで精製されたトリプシンタグがないコントロールの抗ＥＧＦＲ抗体であり、軽鎖バンド（Ｃ）および重鎖バンド（Ｂ）の位置を示す。レーン４および６は、それぞれ電気泳動においてＤＴＴ処理を含むまたは含まない、エコチンアフィニティクロマトグラフィ媒質カラムで精製されたトリプシンタグを有する抗ＥＧＦＲ抗体を示す。レーン４において、トリプシンでタグ付けされた重鎖バンドは、Ａでラベリングされ、Ｃは軽鎖である。レーン６において、ＤＴＴのない状態で、鎖は結合し、より大きな分子量でランニングした単一バンド（Ａ／Ｃでラベリング）としてランニングする。
【００７２】
本明細書中で使用された専門用語は、具体的に実施形態を記載することのみを目的としており、本発明を限定するものではない。単数形「ａ」および「ａｎ」との語は、量を限定するものではなく、参照事項の少なくとも１つの存在を意味するものである。用語「または」は、「および／または」を意味する。用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」）はオープンエンド用語として解釈されるものである（すなわち、「を含むが、これに限定されない」）。
【００７３】
値の範囲の記述は、本明細書中に特に示されていない限り、単にその範囲に含まれるそれぞれ別個の値を個々に参照する簡略化した方法に役立つものとなることを意図しており、それぞれの別個の値は、本明細書中に個別に列挙されているように本明細書中に組み込まれている。すべての範囲のエンドポイントは、前記範囲内に含まれており、独立して結合できる。
【００７４】
本明細書中に示されていない限り、または、明らかに内容と矛盾しなければ、本明細書中に記載されたすべての方法は、好適な順序で行われうる。任意のおよびすべての実施例の利用、または例示的な用語（すなわち、「のような」）は、特に主張されていない限り、単に本発明の開示をより良くすることを目的としており、本発明の技術的範囲を制限するものではない。特に定義されていない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語は、当業者が通常理解されるものと同様の意味である。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中に記載されており、発明者が知っている本発明を行うための最良の形態が含まれる。当業者であれば上述の発明の詳細な説明によって、容易にこれら好ましい実施形態を変更しうることが明らかになるであろう。本発明者は、当業者がこのような好適な変更を適宜利用することを予期しており、本発明が、本明細書中に具体的に開示される形態と別の形態で実施されることも意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるものとして、添付の特許請求の範囲に記載の事項とすべての修飾および等価物を含む。さらに、すべての可能な変更において、上述した要素のどのような組み合わせも、
本明細書中に示されていない限り、または、明らかに内容と矛盾しなければ、本発明に包含される。本発明は、典型的な実施形態を参照して具体的に示して記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の思想および技術的範囲に逸脱することなく、形式および詳細の変更が可能であることが理解されよう。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、タンパク質を精製する方法およびタンパク質を精製するために使用されるアフィニティカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、タンパク質を疾病の治療や診断に使用しようとする試みが多くなされている。特に、治療用抗体の市場が飛躍的に成長してきており、多くのバイオテクノロジー企業がこのようなタンパク質治療の発展に尽力している。キメラ抗体またはヒト化抗体に関連した初期の組換え抗体工学分野は、現在では、脱免疫化抗体、または形質転換マウスおよびファージディスプレイ技術を利用した完全ヒト抗体の開発段階まで進歩してきている。
【０００３】
多くの場合、疾病の治療や診断用タンパク質は、これを発現するベクターで形質転換させた細胞の培養中に、タンパク質を発現することによって生成される。または、このようなタンパク質は、組換え植物または組換え動物中で過剰発現することがある。例えば、このようなタンパク質は、前記タンパク質が形質転換動物の乳から得られるような、組換え乳泌動物中で発現されうる。この場合、前記タンパク質は、一般的に、細胞培養物または乳から単離精製する必要がある。植物や微生物中でタンパク質を発現させる場合には、単離精製には、貯蔵器官または細胞からタンパク質を抽出する過程が含まれる。これらのいずれかのソースから発現されたタンパク質の単離精製は、決して容易な作業でない。これには、宿主細胞のタンパク質またはＤＮＡを除去または分離、ヒトに感染するウイルスの除去、並びに植物由来のレクチンまたはグラム陰性菌由来のエンドトキシンの除去が必要である。
【０００４】
血清または腹水のような哺乳動物細胞培養物上澄液（例えば、ＣＨＯまたはＮＳＯ細胞培養物）または粗タンパク質混合物由来の抗体の精製に広く用いられる方法は、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィである。タンパク質Ａは、多くの哺乳動物種に由来するタンパク質に結合する。特に、重鎖との相互作用によって免疫グロブリンのＦｃ部位に結合する。タンパク質Ａは、免疫グロブリンＩｇＧに対し高い親和性で結合する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書中に開示された内容は、サンプルから標的タンパク質を精製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、前記方法は、プロテアーゼ阻害剤と、前記プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有するペプチドタグとのカップリングを含む。他の実施形態において、前記方法は、プロテアーゼ阻害剤と、前記プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有するペプチドタグとのカップリングを含み、前記プロテアーゼ阻害剤は支持体に固定され、前記ペプチドタグは精製される標的タンパク質に結合されている。一実施形態において、前記方法は、タグ付けされた標的タンパク質を含むサンプルを、プロテアーゼ阻害剤が固定された支持体に接触させ、この際、前記タグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグと共有結合した標的タンパク質であり、前記ペプチドタグは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有しており、前記接触は、プロテアーゼ阻害剤がペプチドタグに結合するような条件で行われ、結合されていない前記サンプル成分を除去し、次いで、支持体から標的タンパク質を除去することを含む。
【０００７】
また、本明細書中には、支持体および前記支持体に結合したプロテアーゼ阻害剤を含むアフィニティクロマトグラフィ媒質が開示される。アフィニティクロマトグラフィ媒質を充填したアフィニティクロマトグラフィカラムもまた開示される。
【０００８】
本明細書中には、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合活性を有するペプチドタグおよび標的タンパク質を含む融合タンパク質が開示される。融合タンパク質を発現する組換え細胞もまた開示される。
【発明の効果】
【０００９】
本明細書に開示された方法およびカラムによって抗体のようなタンパク質を効率よく精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、本明細書に開示されたタンパク質の精製過程の一実施形態を示す概略図である。
【図２】図２は、精製されたエコチンを電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図３】図３は、エコチンアフィニティカラムを利用して精製されたヒトカチオン性トリプシノーゲン（ＰＲＳＳ１）を電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図４】図４は、タンパク質Ａアフィニティカラムクロマトグラフィまたはエコチンアフィニティカラムクロマトグラフィのいずれかをそれぞれ利用した抗エコチン抗体の親和性精製過程を示す概略図である。
【図５】図５は、タンパク質Ａアフィニティカラムまたはエコチンアフィニティカラムによって精製された抗エコチン抗体を電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図６】図６は、ポリペプチド配列（配列番号１３）およびその構造の特徴を示すヒトカチオン性トリプシノーゲンに対するスウィツ−プロット・エントリー Ｐ０７４７７（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｐ０７４７７）の一部を複製したものである。
【図７】図７は、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼを切断部位に挿入して突然変異した、突然変異トリプシンタグでタグ付けされた重鎖を含む組換え抗ＥＧＦＲ抗体のＨＥＫ２９３細胞中での発現を確認するための電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【図８】図８は、ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＤＨＦＲ−）細胞中での発現後にエコチンアフィニティクロマトグラフィによって精製された、突然変異トリプシンタグでタグ付けされた抗ＥＧＦＲ抗体を電気泳動した後のタンパク質ゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細中に、タンパク質の精製のための方法およびタンパク質の精製のためのアフィニティクロマトグラフィ媒質を開示する。前記方法は、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤との高い結合特異性を利用して、標的タンパク質、例えば抗体を迅速に精製できるようにする。
【００１２】
本明細書中で用いられる「プロテアーゼ」とは、タンパク質分解を行う酵素、すなわち、ポリペプチド鎖でアミノ酸を連結しているペプチド結合を加水分解することで、タンパク質を分解する酵素のことを意味する。周知のプロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼが挙げられる。
【００１３】
本明細書中で用いられる「ペプチドタグ」とは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するペプチドであれば、その由来や長さにかかわらず、いずれのペプチドも含まれる。例えば、前記「ペプチドタグ」という語は、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するその断片、またはプロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するその突然変異体を含む。プロテアーゼ断片のペプチドタグの例として、プロテアーゼ阻害剤に対して特異的結合親和性を有するが、全長プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠くペプチドがある。プロテアーゼ断片の一例は、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保持し、タンパク質分解活性を欠如するプロテアーゼからの最短ペプチドでありうる。さらに、プロテアーゼ突然変異体のペプチドタグの例として、プロテアーゼ阻害剤に対する結合親和性は保有しているが、野生型プロテアーゼの正常タンパク質分解活性が、例えばタンパク質分解活性部位の突然変異によって欠けたものである、プロテアーゼの突然変異体がある。ペプチドタグの長さは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保持し、タンパク質分解活性を欠くプロテアーゼ由来の少なくとも６以上の隣接したアミノ酸でありうる。
【００１４】
本明細書中で用いられる「プロテアーゼ阻害剤」とは、プロテアーゼを阻害するすべての物質を意味する。プロテアーゼ阻害剤は、低分子量化合物、例えば不可逆的阻害剤であるフッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸塩酸塩もしくはフッ化フェニルメチルスルホン酸、または高分子量化合物、例えばタンパク質である。
【００１５】
本明細書中で用いられる「タグ付けされたタンパク質を含むサンプル」とは、天然由来または人工的に調製されたものであるかにかかわらず、標的タンパク質を含むすべてのサンプルを意味する。前記サンプルは、異なる液体の混合物、液体と固体との混合物、または異なる固体の混合物を含む。標的タンパク質を含むサンプルの例として、血液、血清、腹水、乳、組職サンプル、細胞培養物、細胞溶解物または細胞培養の上澄液が挙げられる。
【００１６】
本明細書中で用いられる「支持体」とは、形態またはその原料にかかわらず、プロテアーゼ阻害剤を固定してアフィニティクロマトグラフィ媒質を得ることができるものであればいずれの物質であってもよい。例えば、アフィニティクロマトグラフィにおいて通常使用されるアガロース；セルロース；およびポリアクリルアミドなどが挙げられる。
【００１７】
本明細書中で用いられる「クロマトグラフィ媒質」とは、形態（カラムもしくは平板）、状態（液体もしくは固体）、またはその原料にかかわらず、クロマトグラフィ精製のために使用される固定相を意味する。一般的なタンパク質の精製のために使用されるクロマトグラフィ媒質の例として、イオン交換樹脂、親和性固定相、およびゲル浸透固定相が挙げられる。
【００１８】
本明細書中で用いられる「カップリングされた（連結された）」とは、２以上の遺伝子またはタンパク質の直接接触したもの、およびリンカー遺伝子またはタンパク質の配列を意味する。また、共有結合または非共有結合によるカップリングも含む。
【００１９】
本明細書中で用いられる「標的タンパク質」とは、精製されるすべてのタンパク質を意味する。標的タンパク質の例として、抗体が挙げられる。
【００２０】
本明細書中で用いられる「タグ付けされたタンパク質」とは、ペプチドタグに共有結合された標的タンパク質を意味する。
【００２１】
本明細書中で用いられる「融合タンパク質」とは、２以上の別個のポリペプチドの任意の組み合わせを意味する。融合タンパク質の例として、本来別個のポリペプチドをコード化した核酸を２以上結合して生成されたタンパク質が挙げられる。タグ付けされた標的タンパク質は、融合タンパク質をコード化する核酸を得るために、ペプチドタグをコード化する核酸が、標的タンパク質をコード化する核酸と結合した融合タンパク質でありうる。前記融合タンパク質は、２以上の別個のポリペプチドの組み合わせを含み、前記２以上のポリペプチドは共有結合で結合されたものであってもよい。前記融合タンパク質は、２以上の別個のポリペプチドの組み合わせを含み、前記２以上の別個のポリペプチドは、非共有結合で結合されたものであってもよい。前記２以上の別個のポリペプチドは、いずれのメディエータを介することなく互いに直接的に接触されたものであってもよい。前記２以上の別個のポリペプチドは、リンカーペプチドのようなメディエータによって媒介されていてもよい。
【００２２】
本明細書中に開示された方法は、プロテアーゼと特異的プロテアーゼ阻害剤との高い結合特異性を利用して、標的タンパク質を精製するものである。
【００２３】
一実施形態において、前記方法は、タグ付けされた標的タンパク質を含むサンプルを、プロテアーゼ阻害剤が固定された支持体へ接触させ、この際、前記タグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグと共有結合した標的タンパク質であり、前記ペプチドタグは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有しており、前記接触は、プロテアーゼ阻害剤がペプチドタグに結合するような条件で行われ、結合されていない前記サンプルの成分を除去し、次いで、支持体から標的タンパク質を除去することを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは細胞溶解物、細胞培養物、細胞培養の上澄液または標的タンパク質を含む生物液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）である。いくつかの実施形態において、支持体上に固定されたプロテアーゼ阻害剤を有する支持体は、アフィニティクロマトグラフィカラムとして構成される。
【００２４】
本明細書中に開示されたタンパク質の精製に用いられる方法およびタンパク質を精製するために使用されるカラムには、使い捨てカラムが使用されうる。前記使い捨てカラムは、約０．１〜約１．０ｍｍ、約０．３〜約０．７ｍｍ、または約０．５ｍｍの径を有しうる。前記カラムは、約１６×１２５ｍｍのガラス試験管に設置されうる。一実施形態において、約０．５ｍｍの径を有する使い捨てカラムが、１６×１２５ｍｍのガラス試験管に取り付けられる。クロマトグラフィ媒質、例えばアガロースゲルは、当該技術分野で知られている任意の方法によってカラム内に充填されうる。使い捨てカラムを使用する一実施形態において、十分な体積の脱気したバッファー／水をカラムに添加して貯水部分（広い開口）まで満たし、次いで、カラム内のすべての気泡を除去する。次に、ゲルを室温で脱気された５０％ゲルスラリーおよび脱気されたバッファー溶液（または水）と一緒にカラムに充填する。十分な体積の脱気されたゲルスラリーを添加して所望の安定したゲル体積が得られる。前記ゲルは、カラム内が落ち着くように、少なくとも３０分間静置しうる。前記パックされたカラムは、４℃で保管および使用されうる。
【００２５】
標的タンパク質の支持体からの除去は、支持体からタグ付けされた標的タンパク質を溶出させ；次いで、タグ付けされた標的タンパク質からペプチドタグを分離して、標的タンパク質を得ることを含みうる。タグ付けされた標的タンパク質の溶出は、タグ付けされた標的タンパク質が支持体から除去されるように、ペプチドタグとプロテアーゼ阻害剤との結合親和性を低下させるｐＨで行われうる。タグ付けされた標的タンパク質からのペプチドタグの分離は、溶出されたタグ付け標的タンパク質をプロテアーゼ、例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、パパイン、またはペプシンで処理することによって行われる。
【００２６】
また、カラム上の標的タンパク質から結合したペプチドタグを酵素を用いて切断し、カラム上にペプチドタグを結合したままにすることで、前記標的タンパク質をカラムから溶出させるように遊離させることによって、標的タンパク質を除去することができる。プロテアーゼの例としては、ＴＥＶプロテアーゼ、パパイン、またはペプシンが挙げられる。
【００２７】
図１には、本明細書中に開示されたタンパク質を精製する方法の一実施形態の概略図が示されている。示されている前記実施形態において、標的タンパク質は免疫グロブリン重鎖のＣ末端に共有結合したペプチドタグを含む抗体である。示されている前記実施形態において、ペプチドタグと特異的に結合するプロテアーゼ阻害剤を支持体上に固定させて、アフィニティクロマトグラフィ媒質を与える。標的タンパク質を含むサンプルがアフィニティクロマトグラフィ媒質を含むアフィニティクロマトグラフィカラムを流れる場合、前記標的タンパク質は、ペプチドタグおよびプロテアーゼ阻害剤の間の特異的な結合によってカラム上に保持され、サンプルの他の成分はカラム上に保持されない。その後、結合した標的タンパク質はカラムから除去されうる。
【００２８】
図１に示すように、結合したタグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグがプロテアーゼ阻害剤ともはや結合しない条件、例えば、より低いｐＨのバッファーで溶出することにより、カラムから除去されうる。その後、前記溶出された標的タンパク質は、ペプチドタグから分離されうる。例えば、図１に示すように、タグ付けされた標的抗体を、酵素、例えばペプシンまたはパパインで処理することによって、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂ断片が得られうる。また、抗体の正常のパパイン切断部位を破壊するように、およびペプチドタグと標的抗体との間に新規パパイン切断部位を挿入するように、標的抗体の重鎖が突然変異される場合には、カラムから放出された融合タンパク質をパパインで処理することにより、タグ付けされた標的抗体からペプチドタグが除去されうる。本明細書中に開示される方法において使用されうるペプチドタグは、下記いずれかのプロテアーゼ群の突然変異プロテアーゼに由来するペプチドタグを含む：セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼ。具体的には、ペプチドタグは、パパイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、レンニン、カテプシンＤ、サーモリシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、またはコラゲナーゼの突然変異から由来したペプチドタグを含む。
【００２９】
ペプチドタグは、当該技術分野で知られている任意の方法によって調製されうる。加水分解活性を阻害するのに必要な最小レベルのみで突然変異が起こりうる。例えば、単一ヌクレオチドまたは単一アミノ酸の置換によって、ペプチドタグとして使用されるプロテアーゼ突然変異体が調製されうる。これに関連して、当該技術分野で通常知られた周知の方法として、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が用いられうる。いくつかの実施形態において、タンパク質分解活性部位全体がペプチドタグから除去される。前記除去は、当該技術分野で知られた任意の方法を用いて行われうる。
【００３０】
本明細書中に開示される方法またはアフィニティクロマトグラフィ媒質で使用することができるプロテアーゼ阻害剤としては、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター（ｐａｐａｙａ Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ペプスタチンＡ（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン（ｂｄｅｌｌｉｎ）、ペプシノストレプチン（ｐｅｐｓｉｎｏｓｔｒｅｐｔｉｎ）、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、および２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムが挙げられる。具体的に、プロテアーゼ阻害剤は下記表１または表２に記載のいずれかでありうる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
また、本明細書中に開示された、使用されうるプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の組み合わせの例は、下記表２のとおりである。
【００３３】
【表２】
【００３４】
本明細書中に開示された方法またはカラムの一実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来の、トリプシンおよび他の膵プロテアーゼを阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤のエコチンである。エコチンは、１００℃、ｐＨ１．０の条件下でも少なくとも３０分間は安定した状態を保持する。エコチンの分子量は１８ｋＤで、等電点（Ｐｉ）は６.１である。エコチンは、トリプシン、キモトリプシン、膵エラスターゼ、ラットマスト細胞、キマーゼ、またはヒトの漿膜ウロキナーゼ（ｓｅｒｏｓａｌ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）によって分解されない。さらに、エコチンは、ヒトの肺トリプターゼ、カリクレイン、パパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ、スブチリシン、およびサーモリシンを阻害しない。また、大腸菌から最近単離された８種の可溶性エンドプロテアーゼ（すなわち、Ｄｏ、Ｒｅ、Ｍｉ、Ｆａ、Ｓｏ、Ｌａ、ＣｉおよびＰｉ）、キモトリプシン様エステラーゼ（プロテアーゼＩ）またはトリプシン様エステラーゼ（プロテアーゼＩＩ）を阻害しない。プロテアーゼ阻害剤がエコチンである方法の一実施形態において、プロテアーゼはトリプシンである。トリプシンは、消化器に見られる、タンパク質を分解するセリンプロテアーゼである。例えば、トリプシンは、牛乳中のカゼインを分解する。トリプシンは、プロリンが連続する場合を除き、主にアミノ酸であるリジンおよびアルギニンのカルボキシル側のペプチド鎖を切断する。トリプシンは、膵臓に多量に存在し、容易に精製される。
【００３５】
本明細書中に開示された方法またはカラムの他の一実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、カリーカ・パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）に由来したパパイアプロティナーゼ阻害剤（ＰＰＩ）の１つである、パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤である。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は、ウシのトリプシンを１：１モル比で阻害する。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は、極めて広いｐＨ範囲（１．５〜１１．０）および８０℃までの温度でも阻害剤として活性がある。また、強い化学的変性剤（例えば、５．５Ｍグアニジン塩酸塩）が高濃度に存在する場合にも安定である。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は、ペプシンに対して顕著に優れたタンパク質分解抵抗性を示す。プロテアーゼ阻害剤がパパイアクニッツ型トリプシン阻害剤であるいくつかの実施形態において、プロテアーゼはトリプシンである。
【００３６】
標的タンパク質をコード化する核酸は、ペプチドタグを含むように、すなわち、遺伝子が標的タンパク質およびペプチドタグを含む融合タンパク質をコード化するように設計されうる。その後、前記融合タンパク質をコード化する前記遺伝子がベクターに導入され、次いで、前記ベクターは適した宿主細胞を形質転換させるために使用される。前述したように、標的タンパク質がペプチドタグ由来のプロテアーゼに鋭敏な配列を含む場合、ペプチドタグのプロテアーゼによって標的タンパク質のタンパク質分解を防ぐことが重要である。これは、例えばタンパク質分解活性部位の領域におけるプロテアーゼの遺伝子突然変異生成によって防ぐことができる。突然変異、融合タンパク質（タグ付けされた標的タンパク質）をコード化する組換え核酸の形成、組換え発現ベクターの形成、および宿主細胞の形質転換は、関連技術分野において知られたいずれの方法によっても行われうる。
【００３７】
「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができ、およびこれに作動可能に連結する標的タンパク質をコード化する核酸の発現を指令することができる核酸分子を意味する。さらに、ベクターは形質転換された宿主細胞をスクリーニングできる適切なマーカーを有しうる。使用可能なベクターとしては、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス、および挿入可能なＤＮＡ断片（相同組換えによって宿主細胞ゲノムに挿入可能な断片）が含まれうる。
【００３８】
「作動可能に連結する」という語とは、１つの機能が他方によって調節されるような単一核酸断片上の核酸配列連関性を意味する。例えば、プロモータがコード配列の発現を制御することができる場合（すなわち、前記コード配列がプローモータの転写調節下にある場合）、プローモータはコード配列に作動可能に連結される、または、リボソーム結合部位が翻訳を促進できるように位置している場合、リボソーム結合部位はコード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向にて調節配列に連結されて作動されうる。
【００３９】
ベクターは宿主細胞に導入され、前述した核酸によってコード化された融合タンパク質またはペプチドが生産されうる。いくつかの場合において、ベクターは、宿主細胞によって認識されるプローモータを含みうる。「プローモータ」は、転写を指令するのに十分な最小配列を意味する。また、細胞型特異的または外部の信号もしくは化学物質によって誘導される調節可能なプローモータ依存性遺伝子発現に十分なプローモータ成分が含まれ、このような成分は、遺伝子の５’もしくは３’部位に位置しうる。構成的プロモータおよび誘導的プローモータの両方が含まれる。プローモータ配列は、原核生物、真核生物、またはウイルスに由来しうる。宿主細胞の核酸発現に望ましいレベルの適したプローモータ活性を有する宿主細胞適合プローモータの選択は当業者の能力範囲内にある。
【００４０】
ベクターは、さらなる発現調節配列を有しうる。「調節配列」とは、特定の宿主個体内で作動可能に連結するコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。前記調節配列は、シャイン−ダルガーノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でありうる。例えば、前記シャイン−ダルガーノ配列は、ＭＳ−２上ファージのレプリガーゼ遺伝子（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ｇｅｎｅ）またはバクテリオファージ１のｃＩＩ遺伝子由来でありうる。宿主の形質転換は、当該技術分野に周知の技術のいずれかによって行われうる。
【００４１】
本明細書中に開示された一実施形態によるプロテアーゼ阻害剤アフィニティクロマトグラフィ媒質およびカラムは、アルデヒドによって活性化されたアガロースビーズおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）の還元的アミノ化によって、プロテアーゼ阻害剤を固定化することで調製されうる。
【００４２】
本明細書中に開示された他の一実施形態によるプロテアーゼ阻害剤アフィニティカラムは、下記過程を通じて調製されうる：
１．支持体の調製：
プロテアーゼ阻害剤がカップリングされうる支持体を調製する。支持体としては、アガロースゲルが使用されうる。例えば、溶媒中に懸濁した凍結乾燥されたアガロースビーズが使用されうる。凍結乾燥されたアガロースビーズは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）であり、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂを添加剤の存在下で凍結乾燥させることで得られうる。セファロース４Ｂにプロテアーゼ阻害剤をカップリングする前に、反応基の活性を維持するため、低いｐＨでＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂを洗浄することによって添加剤が除去される。この点において、ｐＨは３以下であり、これより高いｐＨでは加水分解を誘発しうる。凍結乾燥されたアガロースビーズは、溶媒、例えば１ｍＭ ＨＣｌ中に懸濁させる。通常、溶媒中に懸濁した凍結乾燥された臭化シアン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂビーズの１ｇは、膨潤後、支持体最終体積約３．５ｍｌを与える。上記懸濁の直後、前記支持体は、膨潤した場合にさらに洗浄する必要があり、例えば、孔隙率がＧ３の焼結ガラスフィルター上において１ｍＭ ＨＣｌで１５分間洗浄する。
【００４３】
２．プロテアーゼ阻害剤のカップリング
本工程は、プロテアーゼ阻害剤を上記項目１の支持体とカップリングすることを含む。はじめに、プロテアーゼ阻害剤をカップリング溶液に溶解させる。カップリング溶液は、凍結乾燥されたセファロースパウダー当初の１ｇ当たり約３〜７ｍｌが使用されうる。また、プロテアーゼ阻害剤は膨潤した支持体１ｍｌ当たり約５〜１０ｍｇが使用されうる。プロテアーゼ阻害剤の分子量が小さい場合（５ｋＤ以下）には、支持体１ｍｌ当たり１〜１０μｍｏｌの濃度で添加されうる。カップリング溶液の例として、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌが挙げられる。項目１に従い調製された支持体懸濁物はプロテアーゼ阻害剤含有カップリング溶液に添加され、撹拌させる。温和な撹拌方法であれば特に制限はなく、例えば、エンド−オーバーエンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒｅｎｄ）回転させる。
【００４４】
標的タンパク質の精製方法の一実施形態において、結合された標的タンパク質の溶出は、プロテアーゼ阻害剤アフィニティクロマトグラフィ媒質から標的タンパク質を溶出させるあらゆる好適な溶媒の中で起こりうる。いくつかの実施形態において、溶出は、ｐＨ溶出によって行われうる。例えば、ｐＨを２〜５の範囲内に調整することによって、ペプチドタグとカップリングした標的タンパク質を溶出させうる。例えば、プロテアーゼ阻害剤としてエコチンを使用する場合、エコチンは強酸中でも高い安定性および相補的なペプチドタグとの高い親和性を示すことから、溶出はｐＨ２〜３で行われる。溶出ｐＨが低いほど、溶出が容易および効率的となるため、タンパク質の収率および純度が高くなる。パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤を使用する場合、パパイアクニッツ型トリプシン阻害剤は酸中では非常に安定であるが、相補的ペプチドタグとの親和性がエコチンに比べて約１／１００と低く、溶出はｐＨ３〜４で可能になる。上述の例に示すように、ペプチドタグおよびプロテアーゼ阻害剤の間の親和性は変化し、プロテアーゼ阻害剤親和性媒質および相補的ペプチドタグの組み合わせの違いによって、異なる溶出ｐＨが使用されうる。ペプチドタグと結合した標的タンパク質をカラムから分離する他の方法は、活性プロテアーゼの使用を含む。このような方法において使用に選択される前記活性プロテアーゼは、カラム上でのプロテアーゼ阻害剤の分解、または標的タンパク質の不活性化を生じないものである。例えば、前述したように、このような方法を標的抗体に使用する場合、完全抗体分子または抗体断片（Ｆａｂ、F（ａｂ）２）が溶出されうる。
【００４５】
標的タンパク質からのペプチドタグの分離は、特に制限されないが、酵素処理によって行われうる。例えば、標的タンパク質が抗体である場合、タグ付けされた抗体をパパインやペプシンのような酵素で処理すると、前述したようにＦ（ａｂ）２またはＦａｂが得られる。パパインでタンパク質分解した完全免疫グロブリンを提供できるタグ付けされた標的抗体は、免疫グロブリン重鎖遺伝子のパパイン切断部位の突然変異、ペプチドタグをコード化する核酸と免疫グロブリン重鎖遺伝子との間へのパパイン切断部位の挿入、およびそのようにして得られたタグ付きの抗体へのパパインの処理によって得られうる。これは、図１の右下部に示されている。また、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位は、ペプチドタグと前記タンパク質との間に挿入されうる。前記ペプチドタグは、融合タンパク質をＴＥＶプロテアーゼで分解することによって、前記タンパク質から分離されうる。
【００４６】
以下、本明細書に開示された方法およびクロマトグラフィが、下記実施例を参照により具体的に記載されるが、これらの実施例は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：エコチンの精製
１．エコチンの調製
過剰発現ベクターにクローニングした配列番号１のエコチンを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．）で過剰発現させた。発現した細胞は、５，０００×ｇで１５分間遠心分離して収集した。前記細胞を超音波によって粉砕し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して粗抽出物を得た。前記粗抽出物に１Ｍ ＨＣｌを添加して処理し、ｐＨを３に調整した。１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して上澄液からエコチンを得た。エコチンを４℃で２０分間インキュベーションさせた後、１Ｍトリス塩基を添加してｐＨを７.８に再調整し、１００℃で２０分間加熱した。各ステップにおいて、不溶性物質を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して除去して上澄液を得て、前記上澄液に８０％（ｗ／ｖ）に飽和するように、固体硫酸アンモニウムを添加して、１０％間隔で分画されたタンパク質を得た。
【００４８】
沈澱したタンパク質を、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に対して透析させ、同じバッファーで平衡化された陰イオン交換カラム上にロードした。カラムに結合していないタンパク質を収集し、トリプシンアフィニティカラムを使用して精製し、その後４℃で保存した。
【００４９】
２．ゲル電気泳動
上記項目１に記載の方法によって得られたエコチンの純度は、Ｌａｅｍｍｌｉらによってに記載されているように（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５）、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有した１０〜２０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド勾配スラブゲルを用いて電気泳動を行うことにより決定した。電気泳動の結果を図２に示した。前記得られたエコチンの純度は９５％以上であった。
【００５０】
３．エコチン活性の測定
上記記載によって得られたエコチンがプロテアーゼ活性を有するか否かを調べるため、Ｗｏｏらによって記載されているように（Ｗｏｏ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｊ．，Ｈａ，Ｄ．Ｂ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，２０８８−２０９１）、蛍光性ペプチドの切断が分析された。トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼの基質として、それぞれＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−４−メトキシ−β−ナフチルアミド、Ｎ−スクシニル（Ｓｕｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）およびＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＭＣが用いられた。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）中に、適量のエコチン、およびトリプシン１０ｎｇ、キモトリプシン２ｎｇ、もしくはエラスターゼ３０ｎｇを含む反応混合物０．１ｍｌを、ペプチド基質（０．１ｍＭ）を添加する前に、室温で３０分間インキュベーションさせた。トリプシンおよびキモトリプシンを分析する際には、２０ｍＭ ＣａＣｌ２も添加させた。インキュベーション後、０.１×ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．１）０．９ｍｌを前記反応混合物に添加させ、熱湯槽内で６分間加熱した。４−メトキシ−ｐ−ナフチルアミドに対しては、３１０ｎｍ（励起）および４１０ｎｍ（発光）、ＡＭＣに対しては、３８０ｎｍ（励起）および４４０ｎｍ（発光）で蛍光を測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄらによって記載されているように（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４）、基準としてウシ血清アルブミンの使用、または吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）が知られたタンパク質の２８０ｎｍの吸光度によって、タンパク質を分析した。上記項目１で得られたエコチンはトリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼの活性の１００％の阻害を示した。
【００５１】
実施例２：エコチンアフィニティカラムの調製
精製したエコチンを、臭化シアン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を用いた還元的アミノ化反応によって固定化させ、本実施例におけるエコチンアフィニティカラムを調製した。
【００５２】
１．クロマトグラフィ媒質の調製
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を１ｍＭ ＨＣｌ中に懸濁させ、またはゲルが膨潤するまで３０分以上放置した。凍結乾燥したセファロースパウダー１ｇは、約３．５ｍｌの最終体積の媒質を与えた。懸濁直後に支持体を設置する場合、上澄液を捨て、この過程を繰り返して、壊れた媒質断片等を分離した。その後、前記支持体を冷たい１ｍＭ ＨＣｌの支持体（ゲル）体積の１５倍量で洗浄した。そして、支持体のバッファーをカップリングバッファーで置換するために支持体を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌのカップリングバッファーで洗浄した。
【００５３】
２．エコチンのカップリング
実施例１の工程で得られたエコチンを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌのカップリングバッファーに溶解させた。上記凍結乾燥されたセファロースパウダー１ｇ当たり、カップリングバッファー約７ｍｌが使用された。支持体１ｍｌ当たりエコチン約１０ｍｇが使用される。エコチン含有カップリング溶液に上記項目１で用意されたセファロース懸濁物を添加し、室温で３〜４時間または４℃で一晩中撹拌させた。前記反応は、カップリングされたアガロースにストップバッファー（０．１Ｍエタノールアミン）を添加させることによって停止させた。その後、過剰のエコチンは、媒質（ゲル）体積の少なくとも５倍量のカップリングバッファーで洗浄して除去した。前記クロマトグラフィ媒質を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）に移し、ｐＨ８で２〜４時間放置した。次に、前記クロマトグラフィ媒質を、交互に異なるｐＨで８サイクル洗浄した。各洗浄用バッファーは媒質体積の５倍量を使用した。各サイクルは、５０ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ３．５）による洗浄、続く５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１Ｍ ＮａＣｌによる洗浄で構成される。その後、前記クロマトグラフィ媒質を再度、媒質体積の１０倍量でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。
【００５４】
３．使い捨てカラム（径０．５ｍＭ）を抗体の精製に使用した。前記カラムは、１６×１２５ｍｍのガラス試験管（試験管ラック中）に設置された。十分な体積の脱気されたバッファー／水をカラムに添加して貯水部分（広い開口）まで満たし、カラム内の全ての気泡を除去した。ゲルを室温で脱気された５０％ゲルスラリーおよび脱気されたバッファー溶液（または水）と一緒にカラムに充填した。十分な体積の脱気されたゲルスラリーを添加して所望の安定したゲル体積を得た。前記ゲルは、カラム内で少なくとも３０分静置させた。前記充填されたカラムは、４℃で保管および使用される。
【００５５】
実施例３：エコチンアフィニティクロマトグラフィを利用したトリプシンの精製
ヒトカチオン性トリプシノーゲン（ＰＲＳＳ１）遺伝子（配列番号２）をクローニングした。タンパク質分解活性が欠如し、抗ＥＧＦＲ抗体を加水分解できない突然変異体ＰＲＳＳ１（配列番号２）を得るために、野生型ヒトＰＲＳＳ１（ＨＧＮＣ：９４７５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７４７７）（図６、配列番号１３）の遺伝子を、タンパク質分解活性部位で部位特異的突然変異誘発させた。特に、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，＃２００５２４−５，Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）が、２００番目セリンアミノ酸のコドンをアラニンのコドンに突然変異させるために使用された。得られた突然変異ＰＲＳＳ１遺伝子（配列番号２）をｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターにクローニングさせ、ＹＴ培地で培養されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。Ｏ．Ｄ．６００が０．６に達する場合、１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が培地に添加され、前記培地を３７℃で４時間さらに培養した。前記培養細胞は、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ ＮａＣｌ、および６Ｍグアニジン−ＨＣｌ）中において超音波で粉砕し、１０，０００ｇで遠心分離することによって、上澄液を得た。前記上澄液は、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ ＮａＣｌ、および０．９Ｍグアニジン−ＨＣｌ）を透析させて、変性タンパク質をリフォールディングした。上述のようにして得られたサンプルを実施例２で調製された１−ｍＬエコチンカラムに適用させた。前記カラムを上記と同じバッファーで洗浄し、５０ｍＭ ＨＣｌで溶出させて、精製トリプシノーゲンを回収した。上述のように得られた前記トリプシノーゲンは、実施例１と同様に電気泳動した。その結果を図３に示す。レーン１（最左のレーン）はサイズマーカーを示し、レーン２（左側から２番目）は粗タンパク質抽出物（未精製）を示し、レーン３（左側から３番目）はフロースルー（エコチン未結合）を示し、レーン４（最右のレーン）は精製トリプシン突然変異体のみを示す。
【００５６】
実施例４：エコチンアフィニティクロマトグラフィを利用した抗エコチン抗体の精製
実施例１で得られたエコチン２００μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に溶解し、ニュージーランドホワイトラピッド（生後２ヶ月、雄）に皮下注射して、抗エコチン抗体を生成させた。抗体の生成後、ウサギの血漿を収集した。血漿サンプルを、ローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、および０．２Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、または実施例２において調製されたエコチンカラムにそれぞれ直接適用した。その後、各カラムをバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、および０．５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄し、グリシンバッファー（５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）で溶出した。図４は、タンパク質Ａアフィニティカラムまたはエコチンアフィニティカラムをそれぞれ利用した抗エコチン抗体の精製過程を示す概略図である。タンパク質Ａアフィニティカラムクロマトグラフィまたはエコチンアフィニティカラムクロマトグラフィによって精製された抗エコチン抗体は、実施例１に記載されているように、タンパク質ゲル電気泳動によって分析した。図５は、電気泳動の結果の写真である。
【００５７】
図５において、レーン１およびレーン７はサイズマーカーであり、レーン２からレーン６はタンパク質Ａカラムクロマトグラフィの結果であり、レーン８からレーン１２はエコチンカラムクロマトグラフィの結果である。特に、レーン２および８は粗抽出物（カラムに適用していない血漿）、レーン３および９はフロースルー抽出物（カラムに適用したが、カラムと結合していない）、レーン４および１０は０．５Ｍ ＮａＣｌ含有バッファーの洗浄で得られた抽出物、レーン５および１１は溶出液にジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した結果、レーン６および１２は溶出液にＤＴＴを添加しない結果である。
【００５８】
実施例５：ＨＥＫ２９３細胞中における抗ＥＧＦＲ−トリプシンモノクローナル抗体の発現
本実施例において、抗ＥＧＦＲ−トリプシンモノクローナル抗体、すなわちトリプシンタグでタグ付けされたモノクローナルＥＧＦＲ抗体は、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ．ＣＲＬ−１５７３）中で一時的に過剰発現させ、並びに特性化させる。下記表３は、本実施例に使用された抗ＥＧＦＲ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を表す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
前記モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体は、標的抗原としてＥＧＦＲタンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｅ３６４１）を用いてパンニングしたファージライブラリディスプレイを使用して入手される。抗ＥＧＦＲ抗体について重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を用意した後、組換えｐｃＤＮＡ３．３重鎖ベクター上の重鎖配列の可変領域は、ヒト完全ＩｇＧ１重鎖抗体骨格で置換させた。組換えｐｃＤＮＡ３．３軽鎖ベクター上の軽鎖配列の可変領域は、ヒト完全ＩｇＧ１軽鎖抗体骨格で置換させた。さらに、前記モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の結晶化可能フラグメント領域（Ｆｃ）は、配列番号５の配列を有する。配列番号５は、重鎖におけるヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３のみの配列である。
【００６１】
前記トリプシンタグは、突然変異ヒトＰＲＳＳ１（ＨＧＮＣ：９４７５）（配列番号２）から入手される。野生型ヒトＰＲＳＳ１（ＨＧＮＣ：９４７５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７４７７）（図６、配列番号１３）の遺伝子は、タンパク質分解活性が欠如し、抗ＥＧＦＲ抗体を加水分解できない突然変異ＰＲＳＳ１を入手するため、タンパク質分解活性部位に部位特異的突然変異誘発させた。特に、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、＃２００５２４−５、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）が、２００番目セリンアミノ酸のコドンをアラニンに突然変異させるために使用された。
【００６２】
突然変異ＰＲＳＳ１遺伝子は、次のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲによって増幅させた：ＸｈｏＩ−ＴＥＶ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号：３，５’−ＧＡＧ−ＣＴＣＧＡＧ−ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ−ＡＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧ）およびＸｈｏＩ−ＴＡＡ−Ｒ（配列番号：４，５’−ＧＡＧ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＣＴＴ Ａ）。このようなプライマーを使用して、シグナルペプチド（１−１５ａａ）およびプロペプチド（１６−２３ａａ）を欠如したトリプシンドメイン（２４−２４４ａａ、配列番号２）をコード化する核酸が、突然変異ＰＲＳＳ１遺伝子から増幅され、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖をコード化する核酸に連結するためのトリプシンタグをコード化する核酸として使用された。上述のように得られた前記トリプシンタグ核酸は、制限酵素であるＸｈｏＩによって切断され、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖（Ｆｃ部位の配列参照、配列番号５）をコード化する核酸のカルボキシ末端のＸｈｏＩ−サイト内に、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を用いて連結させた。抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖中のＦｃをコード化するｃＤＮＡ（配列番号：５）の６９７〜６９９部位において、重鎖の終止コドン（ＴＧＡ）は、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、＃２００５２４−５）を利用して除去される。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（塩基配列：５’−ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ−３’、配列番号：６）が、終止コドンが欠如した抗体ｃＤＮＡと上記で調製されたトリプシンタグ核酸との間に挿入される。
【００６３】
前述したタグ付けされた抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖構成は、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して、ベクターに挿入される。また、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖をコード化する遺伝子も、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して、ベクターに挿入される。上記のように得られた重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをそれぞれ１２μｇ用意した。２つのベクターの合計２４μｇが、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商品名；インビトロジェン社製）を利用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、抗生物質ペニシリン（最終濃度が１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（最終濃度が１００μｇ／ｍｌ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ ｎｏ １１９９５）を使用して、３７℃および５％のＣＯ２で３日間培養させた。発現された重鎖および軽鎖は、培地中に別々に分泌され、重鎖および軽鎖が互いに結合して抗体複合体を形成する。その後、細胞培養液の上澄液を収集し、実施例２で調製されたエコチンカラムに適用した。精製過程は、次の通りである：
上記で用意されたエコチンアフィニティカラムを任意の周知方法でセットアップした。細胞培養物上澄液のｐＨは、１／１０体積量の１.０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整される。その後、細胞培養物上澄液をエコチンアフィニティカラムに通過させた。カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０.５Ｍ ＮａＣｌで前記カラムを洗浄した。そして、カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）／０.５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。その後、グリシンバッファー（５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）を用いて、トリプシンがタグ付けされたモノクローナル抗体をカラムから溶出させた。溶出液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加することで中和させた。
【００６４】
精製過程からの各種のサンプルを、実施例１で説明したように、タンパク質ゲル電気泳動により分析した。その結果を、電気泳動ゲルの写真である図７に示した。図７の結果により、組換え抗体のＨＥＫ２９３細胞中に発現が確認される。
【００６５】
図７において、レーン１はサイズマーカーである。レーン２からレーン１０は、突然変異トリプシンでタグ付けされた重鎖を有する抗ＥＧＦＲ抗体のエコチン親和性精製から得た溶液の電気泳動の結果であり、レーン１１およびレーン１２は、トリプシンタグのない抗ＥＧＦＲ抗体を含み、ＤＴＴの存在下または不在下でそれぞれ電気泳動した結果である。レーン２はコントロールレーンであり、カラム適用前の粗細胞培養液である。レーン３は、フロースルーカラム（Ｆ）、すなわち、カラムの適用後にエコチンが結合されていないタンパク質である。レーン４は溶出液（Ｅ（＋））であり、電気泳動においてＤＴＴが添加されたカラムから得られた溶出溶液である。レーン５は、電気泳動においてＤＴＴが添加されていない（−）溶出液（Ｅ）である。レーン６はＴＥＶプロテアーゼ単独であり、ＴＥＶプロテアーゼバンドはゲル写真においてＣと標識されている。レーン７からレーン１０は、ＤＴＴの存在下（＋）または不在下（−）、およびＴＥＶプロテアーゼ（Ｔ）の存在下または不在下で、３７℃でインキュベーションさせた溶出液（Ｅ）の結果を示す。レーン７はＥ（＋）（レーン４と同一）、レーン８はＥ（−）（レーン５と同一）、レーン９はＥ＋Ｔ（＋）、およびレーン１０はＥ＋Ｔ（−）である。
【００６６】
図７のゲル写真内の注釈において、Ａは抗ＥＧＦＲ重鎖−トリプシン融合タンパク質バンドであり、ＢはＴＥＶプロテアーゼ−分解抗ＥＧＦＲ重鎖バンドであり、ＣはＴＥＶプロテアーゼバンドであり、Ｄは切断トリプシンタグバンド（５個のＳ−Ｓ結合を有する単体）であり、並びにＧは抗ＥＧＦＲ軽鎖バンドである。
【００６７】
実施例６：エコチンアフィニティクロマトグラフィを利用したモノクローナル抗体の精製
本実施例において、実施例５に記載の抗ＥＧＦＲ−トリプシンモノクローナル抗体が、ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＤＨＦＲ−）細胞（インビトロジェン社製；Ｃａｔ．ｎｏ．１２６１３−０１４）で過剰発現される。
【００６８】
実施例５に記載したように、突然変異トリプシンでタグ付けされた抗ＥＧＦＲ重鎖遺伝子は、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用してベクターに挿入させた。また、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｐｃＤＮＡ（商標）３．３−ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用してベクターに挿入させた。本実験において、上述のように得られた重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをそれぞれ１８.７５μｇ用意した。
【００６９】
これらベクターをトランスフェクトする前に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、６×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌにて８ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１８％のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８を添加したＣＤ ＤＧ４４培地（Ｇｉｂｃｏ．Ｃａｔ ｎｏ．１２６１０）中で、４８時間前、２４時間前にそれぞれ１回ずつ２回にかけて、１３０ｒｐｍの条件下、３７℃、８％のＣＯ２で、６×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように継代培養させた。生存率が９５％以上になる細胞を３×１０７ｃｅｌｌｓに調節し、１２５ｍｌフラスコに入れ、最終体積が３０ｍｌになるようにＣＤ ＤＧ４４倍地を入れた。重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをそれぞれ１８．７５μｇ、並びにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製、１６４４７１００）３７．５μｌを、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（インビトロジェン社製、無血清培地）を用いて最終体積１.２ｍｌに調節するように、ゆっくり混合した。その後、前記混合物を室温で１０分間インキュベートさせた。このようにして得られたプラスミド−脂質複合体をＣＨＯ−ＤＧ４４（ＤＨＦＲ−）細胞を含むフラスコにゆっくり入れ、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ５００μｇ／ｍｌを添加したＣＤ ＤＧ４４倍地で５日間培養した。その後、培養培地を収集し、下記のように、実施例２で用意したエコチンアフィニティクロマトグラフィ媒質に適用した。
【００７０】
上記のように用意されたエコチンアフィニティカラムを任意の周知方法によってセットアップした。上記で得た細胞培養物上澄液には抗体約４μｇ／ｍｌを含む。上記細胞培養物上澄液のｐＨは、１／１０体積量の１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。その後、前記細胞培養物上澄液をエコチンアフィニティカラムに通過させた。カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した。そして、カラム体積の１０倍量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）／０．５Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した。その後、グリシンバッファー（５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）で、トリプシンがタグ付けされたモノクローナル抗体をエコチンアフィニティクロマトグラフィ媒質から溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加して中和させた。
【００７１】
抗体精製過程から各種溶液をタンパク質ゲル電気泳動で分析した。その結果を図８に示す。図８において、レーン５はサイズマーカーを含む。レーン１はコントロールであり、カラム適用前の粗細胞培養上澄液である。レーン２はフロースルー、すなわち、カラム適用後のエコチンに結合していないタンパク質を示す。レーン３はタンパク質Ａアフィニティカラムで精製されたトリプシンタグがないコントロールの抗ＥＧＦＲ抗体であり、軽鎖バンド（Ｃ）および重鎖バンド（Ｂ）の位置を示す。レーン４および６は、それぞれ電気泳動においてＤＴＴ処理を含むまたは含まない、エコチンアフィニティクロマトグラフィ媒質カラムで精製されたトリプシンタグを有する抗ＥＧＦＲ抗体を示す。レーン４において、トリプシンでタグ付けされた重鎖バンドは、Ａでラベリングされ、Ｃは軽鎖である。レーン６において、ＤＴＴのない状態で、鎖は結合し、より大きな分子量でランニングした単一バンド（Ａ／Ｃでラベリング）としてランニングする。
【００７２】
本明細書中で使用された専門用語は、具体的に実施形態を記載することのみを目的としており、本発明を限定するものではない。単数形「ａ」および「ａｎ」との語は、量を限定するものではなく、参照事項の少なくとも１つの存在を意味するものである。用語「または」は、「および／または」を意味する。用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」）はオープンエンド用語として解釈されるものである（すなわち、「を含むが、これに限定されない」）。
【００７３】
値の範囲の記述は、本明細書中に特に示されていない限り、単にその範囲に含まれるそれぞれ別個の値を個々に参照する簡略化した方法に役立つものとなることを意図しており、それぞれの別個の値は、本明細書中に個別に列挙されているように本明細書中に組み込まれている。すべての範囲のエンドポイントは、前記範囲内に含まれており、独立して結合できる。
【００７４】
本明細書中に示されていない限り、または、明らかに内容と矛盾しなければ、本明細書中に記載されたすべての方法は、好適な順序で行われうる。任意のおよびすべての実施例の利用、または例示的な用語（すなわち、「のような」）は、特に主張されていない限り、単に本発明の開示をより良くすることを目的としており、本発明の技術的範囲を制限するものではない。特に定義されていない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語は、当業者が通常理解されるものと同様の意味である。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中に記載されており、発明者が知っている本発明を行うための最良の形態が含まれる。当業者であれば上述の発明の詳細な説明によって、容易にこれら好ましい実施形態を変更しうることが明らかになるであろう。本発明者は、当業者がこのような好適な変更を適宜利用することを予期しており、本発明が、本明細書中に具体的に開示される形態と別の形態で実施されることも意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるものとして、添付の特許請求の範囲に記載の事項とすべての修飾および等価物を含む。さらに、すべての可能な変更において、上述した要素のどのような組み合わせも、
本明細書中に示されていない限り、または、明らかに内容と矛盾しなければ、本発明に包含される。本発明は、典型的な実施形態を参照して具体的に示して記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の思想および技術的範囲に逸脱することなく、形式および詳細の変更が可能であることが理解されよう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質を含むサンプルから標的タンパク質を精製する方法であって、
プロテアーゼ阻害剤を、前記プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するペプチドタグと、カップリングさせることを含む、標的タンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼ阻害剤が支持体に固定されており、前記ペプチドタグが精製される標的タンパク質とカップリングしている、請求項１に記載の標的タンパク質の精製方法。
【請求項３】
タグ付けされた標的タンパク質を含むサンプルを、プロテアーゼ阻害剤が固定された支持体へ接触させ、
この際、前記タグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグと共有結合した標的タンパク質であり、前記ペプチドタグは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有し、
前記接触は、プロテアーゼ阻害剤がペプチドタグに結合するような条件で行われ；
結合されていない前記サンプル成分を除去し；
次いで、支持体から標的タンパク質を除去することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体からの標的タンパク質の除去が、
タグ付けされた標的タンパク質を支持体から溶出させ；次いで
タグ付けされた標的タンパク質からペプチドタグを分離させて標的タンパク質を得ることをを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タグ付けされた標的タンパク質の支持体からの溶出が、タグ付けされた標的タンパク質が支持体から除去されるように、ペプチドタグとプロテアーゼ阻害剤との結合親和性を低下させるｐＨにおける溶出によって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タグ付けされた標的タンパク質からのペプチドタグの分離が、溶出されたタグ付けされた標的タンパク質のプロテアーゼによる処理を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、ＴＥＶプロテアーゼ、パパイン、またはペプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記支持体からの標的タンパク質の除去が、タグ付けされた標的タンパク質から結合したペプチドタグを分離して、標的タンパク質を得ることを含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項９】
タグ付けされた標的タンパク質からの前記結合したペプチドタグの分離が、結合した標的タンパク質のプロテアーゼによる処理によって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドタグがプロテアーゼに由来する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドタグが、プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠くプロテアーゼの断片、野生型プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠く突然変異プロテアーゼ、または突然変異体の断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテアーゼが、パパイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、レンニン、カテプシンＤ、サーモリシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、またはコラゲナーゼであり、
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的タンパク質が抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグ付けされた標的タンパク質が融合タンパク質を含む、請求項３〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、ペプチドタグをコード化する核酸を、標的タンパク質をコード化する核酸へ結合させて融合タンパク質をコード化する核酸を得て、融合タンパク質をコード化する核酸を発現ベクターへ挿入し、宿主細胞における融合タンパク質を発現させることによって得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
支持体上にプロテアーゼ阻害剤を固定することを含む、アフィニティクロマトグラフィ媒質の製造方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記支持体が、アガロース、セルロース、またはアクリルアミドである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
支持体およびプロテアーゼ阻害剤を含む、アフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２１】
前記支持体が、アガロース、セルロース、またはアクリルアミドである、請求項２０に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項２０または２１に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２３】
前記プロテアーゼ阻害剤がエコチンである、請求項２２に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質を充填したカラムを含む、アフィニティクロマトグラフィカラム。
【請求項２５】
前記プロテアーゼ阻害剤は、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項２４に記載のアフィニティクロマトグラフィカラム。
【請求項２６】
ペプチドタグをコード化する核酸を、標的タンパク質をコード化する核酸へ結合させて、タグ付けされた標的タンパク質をコード化する核酸を得て；
前記タグ付けされた標的タンパク質をコード化する核酸配列を、発現ベクターへ結合させて、組換えベクターを得て；
前記組換えベクターを用いた宿主細胞を形質転換させることを含む、タグ付けされた標的タンパク質を発現させるための組換え細胞を調製する方法。
【請求項２７】
前記ペプチドタグが、プロテアーゼ活性を欠く突然変異トリプシンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異トリプシン配列が、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保有する配列番号２の断片を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記突然変異トリプシン配列が、配列番号２の２４〜２４４番目アミノ酸を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記突然変異トリプシン配列が、配列番号２の１６〜２４４番目アミノ酸から構成される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的タンパク質が免疫グロブリン重鎖である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫グロブリンが抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
プロテアーゼ阻害剤に対する特異性結合親和性を有するペプチドタグ、およびタンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項３４】
前記ペプチドタグが、パパイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、レンニン、カテプシンＤ、サーモリシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、およびコラゲナーゼから選択されるプロテアーゼに由来する、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記ペプチドタグが、プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠くプロテアーゼの断片、野生型プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠く突然変異プロテアーゼ、または突然変異体の断片である、請求項３３または３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
前記ペプチドタグが突然変異トリプシンである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
前記突然変異トリプシンの配列が、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保有する配列番号２の断片を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記突然変異トリプシンの配列が、配列番号２の２４〜２４４番目アミノ酸を含む、請求項３６または３７に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記突然変異トリプシンの配列が、配列番号２の１６〜２４４番目アミノ酸を含む、請求項３６または３７に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記標的タンパク質が免疫グロブリン重鎖である、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコード化する、単離されたポリヌクレオチドを含む、組換え細胞。
【請求項１】
標的タンパク質を含むサンプルから標的タンパク質を精製する方法であって、
プロテアーゼ阻害剤を、前記プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有するペプチドタグと、カップリングさせることを含む、標的タンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼ阻害剤が支持体に固定されており、前記ペプチドタグが精製される標的タンパク質とカップリングしている、請求項１に記載の標的タンパク質の精製方法。
【請求項３】
タグ付けされた標的タンパク質を含むサンプルを、プロテアーゼ阻害剤が固定された支持体へ接触させ、
この際、前記タグ付けされた標的タンパク質は、ペプチドタグと共有結合した標的タンパク質であり、前記ペプチドタグは、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を有し、
前記接触は、プロテアーゼ阻害剤がペプチドタグに結合するような条件で行われ；
結合されていない前記サンプル成分を除去し；
次いで、支持体から標的タンパク質を除去することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体からの標的タンパク質の除去が、
タグ付けされた標的タンパク質を支持体から溶出させ；次いで
タグ付けされた標的タンパク質からペプチドタグを分離させて標的タンパク質を得ることをを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タグ付けされた標的タンパク質の支持体からの溶出が、タグ付けされた標的タンパク質が支持体から除去されるように、ペプチドタグとプロテアーゼ阻害剤との結合親和性を低下させるｐＨにおける溶出によって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タグ付けされた標的タンパク質からのペプチドタグの分離が、溶出されたタグ付けされた標的タンパク質のプロテアーゼによる処理を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、ＴＥＶプロテアーゼ、パパイン、またはペプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記支持体からの標的タンパク質の除去が、タグ付けされた標的タンパク質から結合したペプチドタグを分離して、標的タンパク質を得ることを含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項９】
タグ付けされた標的タンパク質からの前記結合したペプチドタグの分離が、結合した標的タンパク質のプロテアーゼによる処理によって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドタグがプロテアーゼに由来する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドタグが、プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠くプロテアーゼの断片、野生型プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠く突然変異プロテアーゼ、または突然変異体の断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテアーゼが、パパイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、レンニン、カテプシンＤ、サーモリシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、またはコラゲナーゼであり、
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的タンパク質が抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグ付けされた標的タンパク質が融合タンパク質を含む、請求項３〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、ペプチドタグをコード化する核酸を、標的タンパク質をコード化する核酸へ結合させて融合タンパク質をコード化する核酸を得て、融合タンパク質をコード化する核酸を発現ベクターへ挿入し、宿主細胞における融合タンパク質を発現させることによって得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
支持体上にプロテアーゼ阻害剤を固定することを含む、アフィニティクロマトグラフィ媒質の製造方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記支持体が、アガロース、セルロース、またはアクリルアミドである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
支持体およびプロテアーゼ阻害剤を含む、アフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２１】
前記支持体が、アガロース、セルロース、またはアクリルアミドである、請求項２０に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項２０または２１に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２３】
前記プロテアーゼ阻害剤がエコチンである、請求項２２に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ媒質を充填したカラムを含む、アフィニティクロマトグラフィカラム。
【請求項２５】
前記プロテアーゼ阻害剤は、エコチン、パパイアクニッツ型トリプシンインヒビター、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、ａ２−マクログロブリン、ａ２−アンチプラスミン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ａ１−アンチトリプシン、ブデリン、ペプシノストレプチン、キモスタチン、ホスホラミドン、イソアミルホスホニル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、または２（Ｒ）−２−メルカプトメチル−４−メチルペンタノイル−ベータ−（２−ナフチル）−Ａｌａ−Ａｌａアミド二カリウムである、請求項２４に記載のアフィニティクロマトグラフィカラム。
【請求項２６】
ペプチドタグをコード化する核酸を、標的タンパク質をコード化する核酸へ結合させて、タグ付けされた標的タンパク質をコード化する核酸を得て；
前記タグ付けされた標的タンパク質をコード化する核酸配列を、発現ベクターへ結合させて、組換えベクターを得て；
前記組換えベクターを用いた宿主細胞を形質転換させることを含む、タグ付けされた標的タンパク質を発現させるための組換え細胞を調製する方法。
【請求項２７】
前記ペプチドタグが、プロテアーゼ活性を欠く突然変異トリプシンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異トリプシン配列が、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保有する配列番号２の断片を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記突然変異トリプシン配列が、配列番号２の２４〜２４４番目アミノ酸を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記突然変異トリプシン配列が、配列番号２の１６〜２４４番目アミノ酸から構成される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的タンパク質が免疫グロブリン重鎖である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫グロブリンが抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
プロテアーゼ阻害剤に対する特異性結合親和性を有するペプチドタグ、およびタンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項３４】
前記ペプチドタグが、パパイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、レンニン、カテプシンＤ、サーモリシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、およびコラゲナーゼから選択されるプロテアーゼに由来する、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記ペプチドタグが、プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠くプロテアーゼの断片、野生型プロテアーゼのタンパク質分解活性を欠く突然変異プロテアーゼ、または突然変異体の断片である、請求項３３または３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
前記ペプチドタグが突然変異トリプシンである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
前記突然変異トリプシンの配列が、プロテアーゼ阻害剤に対する特異的結合親和性を保有する配列番号２の断片を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記突然変異トリプシンの配列が、配列番号２の２４〜２４４番目アミノ酸を含む、請求項３６または３７に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記突然変異トリプシンの配列が、配列番号２の１６〜２４４番目アミノ酸を含む、請求項３６または３７に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記標的タンパク質が免疫グロブリン重鎖である、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコード化する、単離されたポリヌクレオチドを含む、組換え細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５２０４４３（Ｐ２０１１−５２０４４３Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９４２０（Ｐ２０１１−５０９４２０）
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００２５９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３９６０１
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０３４４７０３６）サムスン エレクトロニクス カンパニー リミテッド (2,221)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００２５９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３９６０１
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０３４４７０３６）サムスン エレクトロニクス カンパニー リミテッド (2,221)
【Ｆターム（参考）】
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