タンパク質の誘導体化及び結合のための活性化シアル酸誘導体
【課題】天然のＰＳＡを利用して薬物動態特性が改善したタンパク質治療剤の提供。
【解決手段】還元性末端及び／又は非還元性末端のシアル酸ユニットをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基に変換させて、ＰＳＡの誘導体を合成する。この誘導体を、治療に有用な薬物、ペプチド若しくはタンパク質、又はドラッグデリバリーシステムアミン基又はヒドラジン基を含有する基質、と反応させて形成した、非架橋／架橋ポリシアル酸化化合物。
【解決手段】還元性末端及び／又は非還元性末端のシアル酸ユニットをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基に変換させて、ＰＳＡの誘導体を合成する。この誘導体を、治療に有用な薬物、ペプチド若しくはタンパク質、又はドラッグデリバリーシステムアミン基又はヒドラジン基を含有する基質、と反応させて形成した、非架橋／架橋ポリシアル酸化化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元性末端又は非還元性末端において基質と反応するためのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有する末端シアル酸ユニットを有し、且つ好ましくは主にシアル酸ユニットのみから成るポリシアル酸等の化合物誘導体、及びこれらを製造する方法に関する。これらの誘導体は、ペプチド、タンパク質、薬物、ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム）、ウイルス、細胞（例えば、動物細胞）、微生物、合成ポリマー又はコポリマー等のような、アミン基を含有する基質との結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、或る特定の菌株により、及び、哺乳動物において所定の細胞で製造される、天然に存在するシアル酸の非分枝ポリマーである（Ｒｏｔｈ他、１９９３）。それらは、ノイラミニダーゼによる消化である制限された酸加水分解、又は、天然の細菌又は細胞由来のポリマー形態の分別のいずれかにより、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基から、下はｎ＝２までの様々な重合度で製造することができる。ホモポリマー形態、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１株及びＢ群髄膜炎菌のカプセル状ポリサッカライドを含む、アルファ−２，８結合したＰＳＡ（神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）の胚形態においても見出される）が存在するように、種々のＰＳＡの組成も変化する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２株及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣ群ポリサッカライドの、アルファ−２，８、アルファ−２，９が交互に結合したＰＳＡのようなヘテロポリマー形態も存在する。さらに、シアル酸は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＷ１３５群又はＹ群のようなシアル酸以外のモノマーとの交互コポリマーにおいても見出され得る。哺乳動物において、ＰＳＡについてのレセプターは知られていないが、ＰＳＡは、病原菌による免疫系及び補体系の回避、及び胎児成長期における幼若な神経のグリアの接着（ｇｌｉａｌ ａｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ）の調節（ここで、このポリマーは抗接着機能を有する）を含む、重要な生物学的機能を有する（Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ他、１９９８；Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、１９８９；Ｔｒｏｙ、１９９０及び１９９２；Ｃｈｏ及びＴｒｏｙ、１９９４）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１株のアルファ−２，８結合したＰＳＡは、「コロミン酸」としても知られており、本発明を例示するために（様々な長さで）用いられる。
【０００３】
細菌性ポリサッカライド中のＰＳＡのアルファ−２，８結合形態は、免疫原性キャリアタンパク質に結合した場合でさえも（哺乳類の被験体において、Ｔ−細胞又は抗体の反応のいずれも誘発しない）固有に非免疫原性であり、これは哺乳類（同様に細菌の）ポリマーとしてのその存在を反映するものであり得る。ポリマーのより短い形態（最大ｎ＝４）は、体内に広く分布しており、ＰＳＡに対する免疫寛容を効果的に課し、且つ維持すると考えられている、細胞表面ガングリオシドにおいて見出される。近年、ＰＳＡ、特にアルファ−２，８結合したホモポリマーＰＳＡの生物学的特性は、タンパク質及び低分子量の薬物分子の薬物動態特性を改良するために活用されてきた（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００１；Ｊａｉｎ他、２００３；米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）。カタラーゼ及びアスパラギナーゼを含む多くの治療タンパク質のＰＳＡ誘導体化（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６及び１９９７）は、循環半減期及びそれらの安定性において劇的な向上をもたらし、また、そのようなタンパク質は、治療タンパク質への事前曝露の望ましくない（及び、時には避けられない）結果として生じる既存の抗体に直面して、用いルことを可能にする（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００１）。多くの点で、ポリシアル酸化されたタンパク質の改良された特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導体化されたタンパク質に匹敵する。例えば、それぞれの場合において、半減期は増大し、タンパク質及びペプチドは、タンパク質消化に対してより安定であるが、生物学的活性の維持は、ＰＥＧを用いた場合よりも、ＰＳＡを用いた場合のほうが大きいと思われる（Ｈｒｅｃｚｕｋ−Ｈｉｒｓｔ他、２００２）。また、ＰＥＧは、非常にゆっくりとしか生分解せず（Ｂｅｒａｎｏｖａ他、２０００）、高分子量及び低分子量の両方の形態が組織中に蓄積する傾向にある（Ｂｅｎｄｅｌｅ他、１９９８；Ｃｏｎｖｅｒｓ他、１９９７）ため、慢性的に投与しなければならない治療剤とのＰＥＧの使用については疑問がある。ＰＥＧ化されたタンパク質は、血液循環中における複合体の滞留時間にも影響を与える可能性のある抗ＰＥＧ抗体を生じることが見出された（Ｃｈｅｎｇ他、１９９０）。治療剤と結合する非経口投与ポリマーとしてのＰＥＧの確立した歴史にもかかわらず、その免疫毒性学、薬理学及び代謝についてのより良い理解が求められる（Ｈｕｎｔｅｒ及びＭｏｇｈｉｍｉ、２００２；Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ、２００３）。同様に、ＰＥＧの蓄積は毒性につながる可能性があるため、高投与量を必要とする治療剤（したがって最終的には高投与量のＰＥＧ）におけるＰＥＧの有用性についての懸念が存在する。したがって、アルファ−２，８結合したＰＳＡは、本来人体の一部である、免疫学的に「見えない」（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ’ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ’）生分解性ポリマーであり、組織のノイラミニダーゼにより、非毒性サッカライドであるシアル酸に分解することができる、ＰＥＧの有力な代替物を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等のグループは、以前の学術論文及び登録特許において、タンパク質治療剤の薬物動態特性の改善における、天然のＰＳＡの有用性について記載している（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６、１９９７、２００１；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ他、１９９３、１９９８、２０００；Ｈｒｅｃｚｕｋ−Ｈｉｒｓｔ他、２００２；Ｍｉｔａｌ、２００４；Ｊａｉｎ他、２００３、２００４；米国特許第０５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）。今回、本発明者等は、ＰＳＡ誘導体化タンパク質（及び治療剤の他の形態）を製造する新規の組成物、及び新規の方法をもたらす、新規なＰＳＡの誘導体を記載する。これらの新規の物質及び方法は、医療倫理及び監督機関（例えば、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ）の安全要求事項のため、薬物（ｄｒｕｇ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の化学的及び分子的定義が非常に重要であるので、ヒト及び動物における使用が意図されるＰＳＡ誘導体化治療剤の製造に対して特に有用である。
【０００５】
タンパク質のような治療剤へのポリサッカライドの結合のための方法は、以前に記載されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ及びＬｕｇｏｗｓｋｉ、１９８１；米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）。これらの方法のうちのいくつかは、ポリマーの「非還元性」末端の化学的誘導体化に依存し、これによってタンパク質反応性アルデヒド部分を生じる（図１）。ＰＳＡ（及び他のポリサッカライド）の還元性末端は、タンパク質の構造及び結合の間のＰＳＡの化学的結合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を保存するために必要な穏和な条件下で、タンパク質に対して弱反応性しか示さない。ビシナルジオールを含むシアル酸末端ユニットの非還元性末端は、過ヨウ素酸塩を用いて容易に（且つ選択的に）酸化され、これによりモノアルデヒド誘導体を生じ得る。この誘導体はタンパク質に対してより反応性があり、還元アミノ化及び他の化学反応によるタンパク質の結合に好適な反応性エレメントを含む。本発明者等は、このことについて、米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号に記載している。この反応は、図１中に例示され、ここで、
ａ）は、末端のシアル酸の非還元性末端においてタンパク質反応性アルデヒドを形成するための、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたＣＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルファ−２，８結合したＰＳＡ）の酸化後の、アルデヒドとタンパク質の第１級アミン基との反応を示し、
ｂ）は、タンパク質のアミノ基との安定で不可逆性の共有結合を形成するための、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）を用いた、シッフ塩基の選択的還元を示す。
【０００６】
国際公開特許第２００５／０１６９７３号において、本発明者等は、末端シアル酸ユニットを介して導入されるスルフヒドリル反応性基を有するポリサッカライド誘導体を記載している。このユニットは通常、ポリサッカライドの非還元性末端におけるシアル酸ユニットの誘導体化によって導入される。スルフヒドリル反応性基は好ましくはマレイミド基である。この基を導入する反応は、一方の末端にスルフヒドリル反応性基、及び他方の末端にヒドラジド又はエステル等の特性基を有するヘテロ二官能性試薬と、ポリサッカライドのシアル酸誘導体化末端ユニット上のアルデヒド基又はアミン基とを反応させることを伴い得る。この生成物は、例えばＣｙｓユニット又は導入されるスルフヒドリル基において、タンパク質の部位特異的誘導体化に有用である。
【０００７】
ＰＳＡを治療剤と結合させることを記載している種々の方法（米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）は理論的に有用であるが、タンパク質とＰＳＡの非還元末端（アルデヒド形態）との反応を介した複合体の許容可能な収量の達成には、高温でのタンパク質安定性につながらない反応時間を必要とする（例えば、インターフェロンアルファ−２ｂ）。次に、達成することができないか又は非経済的となるおそれのある反応物濃度（すなわち、過剰量のポリマー）を必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明者等は、還元性末端及び／又は非還元性末端にＮＨＳ−シアル酸基を有するポリシアル酸と、タンパク質とを結合させる新規の方法の開発により、この問題を解決した。還元性末端の弱い反応性を（非還元性末端を破壊し、この還元性末端をキャッピングし、且つ二官能性架橋剤により誘導体化することによって）有益な効果のために活用することにより、過ヨウ素酸塩で酸化されたＣＡによるタンパク質の還元アミノ化の確立された方法（図１）を用いた、図２及び図３に記載される生成物の複雑さを回避することができる。
【０００９】
米国特許第４，３５６，１７０号においてＪｅｎｎｉｎｇｓ及びＬｕｇｏｗｓｋｉは、予備還元工程後に酸化工程を伴う、活性化された還元性末端ユニットを介したタンパク質による細菌性ポリサッカライドの誘導体化を記載している。Ｊｅｎｎｉｎｇｓ他によりこのアプローチが用いられた例としては、還元性末端ユニットが、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、グルコサミン、ラムノース及びリボースであるポリサッカライドが挙げられる。
【００１０】
欧州公開特許第０４５４８９８号において、タンパク質のアミノ基は、グリコサミノグリカンの還元性末端の糖部分の還元及び部分的酸化により合成されたアルデヒド基と結合する。この方法で扱われるグリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸が挙げられる。これらの化合物のいずれも、還元性末端にシアル酸ユニットを有さない。
【００１１】
本発明において、シアル酸ユニット由来の少なくとも１つの末端ユニットを有するポリシアル酸基質を含む新規の化合物が提供される。当該化合物は、必要に応じてリンカーを介して２位又は７位炭素のいずれかで末端ユニットと結合するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含む。Ｎ−スクシンイミジルオキシ基は以後、ＮＨＳ基と表される。本発明において、スクシンイミジル部分は、非置換であっても、スルホニル基又は有用な溶解特性を与える他の基のような基で置換されていてもよい。誘導体化された末端ユニットは、非還元性末端シアル酸基又は還元性末端シアル酸基に由来し得る。ＰＳＡ分子１つ当たり、２つのこのようなＮＨＳ基、例えば、非還元性末端シアル酸基由来の末端ユニットに１つのＮＨＳ基、及び還元性末端シアル酸基由来の末端ユニットに残りのＮＨＳ基が存在し得る。
【００１２】
本発明の化合物はまた、一般式の観点から定義されてもよい。新規の化合物は好ましくは一般式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ
【００１３】
【化１】
【００１４】
（式中、Ｒ１はＨ又はスルホニルであり、
Ｒ２は連結基であり、
Ａは、ＮＲ５、ＮＲ５ＮＲ６、Ｏ又はＳＲであり（式中、Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びアリールから選択される）、
ＳｙｌＯはシアリル基であり、
ｎは１〜１００であり、ｍは０〜１００であり、
Ｒ３は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、細胞膜若しくは細胞壁成分、又はドラッグデリバリーシステムであり、
Ｒ４は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、アルキル基、アシル基、薬物、又はドラッグデリバリーシステムである）
を有する。
【００１５】
化合物Ｉ〜ＩＩＩ中に存在するＮＨＳ基及びエステル結合と共に連結基、すなわちＲ２は、一般的に、化合物を合成するのに用いられる二官能性ＮＨＳ試薬に由来する構造を形成する。好適な二官能性試薬を本願の後半で挙げる。合成中、ＰＳＡ出発物質に由来するＡで表示される基は、（反応しないＮＨＳ基と反対の末端における）ＮＨＳ試薬からの対応する脱離基の欠失、又は代替的に試薬の構造的再配置を伴って、それ自体を二官能性試薬の適切な末端に結合させる。通常、連結基Ｒ２は、式Ｉ〜式ＩＩＩの化合物中でＡと結合するカルボニルと共に、アルカン−ジイル基を含む。好ましくは、Ｒ２はＣｐＨ２ｐＣＯ（式中、ｐは２〜１２である）である。代替的に、連結基は、アルカン炭素原子の１つがＡ基と結合しているアルカンジイル基を含み得る。Ｒ２としては、例えば、ＰＳＡ試薬又はＮＨＳ試薬の予備誘導体化反応に由来する、中鎖エステル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合及び／又は１−チオ−Ｎ−スクシンイミジルアミン結合が挙げられ得る。Ｒ２は、アルキレンオキシアルキレン基又はアルキレンオリゴオキシアルキレン基であってもよい。
【００１６】
Ａは好ましくは、第１級アミンＰＳＡ出発試薬に由来するＮＲ５（式中、Ｒ５は水素である）である。このようなアミンＰＳＡ誘導体、及びそれらを製造する方法の例を以下に示す。
【００１７】
１つの実施の形態において、末端シアル酸ユニットは、マレイミド基を含有する試薬と結合し得る有用な官能基を生成する予備化学反応に供される。
【００１８】
１つの実施の形態において、ＮＨＳ基を連結し得る官能基を生成する予備工程として、アルデヒド基を生成する、本文献で前に開示した化学反応を使用することが便利であることを見出した。
【００１９】
本発明は、新規の化合物を製造するプロセスを含む。必要に応じて末端シアル酸ユニット（複数可）の予備誘導体化工程（複数可）の後で、官能基の一方がＮＨＳエステルであり、且つ官能基の他方がシアル酸ユニット（複数可）又はその誘導体（複数可）と反応性である二官能性試薬と、場合によっては、試薬と末端シアル酸基（複数可）又はその誘導体の２位又は７位炭素とを共有結合させると共に、ＮＨＳ基が変化しないような条件下で、ＰＳＡ基質を反応させる、上記新規の化合物を合成する新規のプロセスも提供する。
【００２０】
好ましい実施の形態において、基質中のシアル酸ユニットは、アミン基を生成する予備工程に供される。
【００２１】
誘導化されるシアル酸ユニットが、還元性末端ユニットである場合、予備工程は、アノマー炭素におけるアミン化、又は好ましくは一連の
ａ）ビシナルジオール基を形成するために、前記還元性末端シアル酸ユニットを開環する還元工程と、
ｂ）アルデヒド基を形成するための、工程ａ）で形成された前記ビシナルジオール基の選択的酸化工程と、
ｃ）例えばシアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏ ｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）を用いたアンモニウム化合物との還元アミノ化による工程ｂ）のアルデヒドのアミノ基への変換工程と、
ｄ）工程ｃ）による前記アミノ基を、過剰量のホモ二官能性ＮＨＳ試薬と反応させる工程と
を含み得る。
【００２２】
このプロセスに用いられる還元性末端シアル酸基を有する出発基質物質は好ましくは、８位炭素原子を介して隣接ユニットと結合するシアル酸ユニットを還元性末端に有する。工程ｂ）において、末端シアル酸の還元的開環の後、還元性末端の６，７−ジオール基を酸化して、７位炭素原子にアルデヒド基を形成し、続いてアミノ基の導入（工程ｃ）及びＮＨＳ基の導入（工程ｄ）を行う。
【００２３】
代替的な実施の形態において、還元性末端におけるシアル酸ユニットは、９位炭素原子を介して隣接するユニットと結合し、工程ｂ）において、工程ａ）中に形成された還元性末端のＣ−７及びＣ−８のジオール基を酸化して、８位炭素原子にアルデヒド基を形成した後、アミノ基を形成し（工程ｃ）、その後ＮＨＳ基を形成する（工程ｄ）。
【００２４】
１つの好ましい実施の形態によれば、出発物質は、還元性末端にシアル酸、また非還元性末端にビシナルジオール基を有する末端シアル酸ユニットを有するＰＳＡである。このプロセスの第１の工程（工程ａ）において、還元反応をポリサッカライドの還元性末端において行い、ビシナルジオールを提供するように開環する。還元工程中、非還元性末端におけるビシナルジオール官能基は修飾されることなく、原型を保っている。第２の工程は酸化（工程ｂ）であり、このプロセス中、非還元性末端及び還元性末端におけるビシナルジオールは酸化されて、アルデヒド基を形成する。工程ｃにおいて、アルデヒドがアミン化され、工程ｄにおいて、ＮＨＳ基が結合する。結果として、生成物は、２つのＮＨＳ基を有する二官能性となり、また、還元性末端及び非還元性末端において両方のＮＨＳ基を含む適切に官能化された基質による反応により基質を架橋することができる能力に由来する、有用な治療活性を有し得る。
【００２５】
還元性末端シアル酸がアミン化するプロセスの別の好ましい実施の形態によれば、非還元性末端に末端シアル酸も有するシアル酸出発基質物質は、以下の：
ｅ）非還元性末端シアル酸ユニットをＣ−７及びＣ−８のビシナルジオール基において酸化し、Ｃ−７にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と、
ｆ）Ｃ−７のアルデヒド基を対応するアルコールへと還元するための還元工程と
に供される。この工程はまた同時に、還元性末端のシアル酸環を還元的に開環する、すなわち、工程ａ）と同時に行われる。本発明のこの態様は、「不動態化された」シアル酸非還元性末端を有するシアル酸誘導体を提供し、過ヨウ素酸塩による酸化（工程ｂ）及び還元アミノ化（工程ｃ）を介して還元性末端を活性化させる。
【００２６】
本発明のさらなる実施の形態によれば、非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発物質が、以下の：工程ｅ）非還元性末端シアル酸ユニットをＣ−７及びＣ−８のビシナルジオール基において酸化し、７位炭素原子上にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と；工程ｃ）アンモニウム化合物との還元アミノ化による、工程ｅ）のアルデヒド基のアミノ基への変換工程と、そして；工程ｄ）得られるアミノ基の修飾工程とに供される、新規のプロセスを提供する。
【００２７】
本発明のこの実施の形態において用いられる出発物質は好ましくは、隣接するユニットの８位炭素原子を介して隣接するユニットと結合する非還元性末端にシアル酸ユニットを有するべきである。工程ｅ）において、Ｃ−７及びＣ−８のジオール基は酸化されて、後にアミノ基（工程ｃ）及びＮＨＳ基（工程ｄ）に変換されるアルデヒド基を７位炭素原子に形成する。
【００２８】
代替的な実施の形態において、非還元性末端のシアル酸ユニットが、隣接するユニットの９位炭素原子を介して隣接するユニットと結合する場合、工程ｂ）において、この隣接する基のＣ−７及びＣ−８のジオールは酸化され、アミノ基（工程ｃ）及びＮＨＳ基（工程ｄ）で置換されるアルデヒド基を８位炭素原子上に形成する。
【００２９】
上記酸化工程（ｂ及びｅ）は好ましくは、実質的な長鎖高分子骨格の出発物質の中鎖開裂も、その後の実質的な分子量減少も生じない条件下で行われるべきである。この酸化工程を実施し得る酵素を用いてもよい。より便宜的には、酸化は化学酸化である。反応は、高分子系過ルテニウム酸塩等の固定化試薬を用いて、又は試薬溶液を用いたより直接的な方法によって行うことができる。酸化剤は好適には、過ルテニウム酸塩、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩を用いて、５〜１０のｐＨ範囲、０〜６０℃の温度範囲、１分〜４８時間の範囲の時間で行い得る。
【００３０】
工程ａ）及び工程ｆ）の好適な還元条件は、触媒と共に水素、すなわち好ましくは水素化ホウ素等の水素化物を利用し得る。これらは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅにより支持される水素化ホウ素のように固定化されていてもよい。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物は、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲、６．５〜１０のｐＨ範囲、０〜６０℃の温度範囲、１分〜４８時間の期間で還元剤として用いられる。反応条件は、ＰＳＡ出発物質のペンダント型カルボキシル基が還元されないように選択される。予備酸化工程を（すなわち、非還元性末端において）行う場合、生成されるアルデヒド基が、ビシナルジオール基の一部ではないアルコール基に還元される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でシアノ水素化ホウ素、例えば、高分子により支持されるシアノ水素化ホウ素、又はアルカリ金属シアノ水素化ホウ素、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ（商標）、トリアセトキシ水素化ホウ素等である。
【００３１】
反応の様々な工程（例えば、還元及び酸化）中、各中間体は、次の工程にかけられる前に、酸化剤及び還元剤、架橋剤、並びにＮａＣＮＢＨ３、シスタミン等の他の試薬から単離する必要がある。工程が溶液相中で行われる場合、単離は、エチレングリコールを用いた酸化剤の過剰量の消費、エタノール沈殿、ポリサッカライドの透析、サイズ排除クロマトグラフィ、及び水溶液を濃縮するための限外ろ過等の、従来の技術によるものであり得る。還元工程による混合生成物を再度、透析及び限外ろ過によって分離してもよい。生成物の単離を容易にする固定化された酸化試薬及び還元試薬により実行される反応を考案することができる。
【００３２】
中間体アミン化合物を生成し、その後二官能性ＮＨＳ試薬と反応させる本発明のプロセスにおいて、ＮＨＳ基はアミン基と反応性であるため、ホモ二官能性ＮＨＳ試薬を用いることが便利である。このような試薬の２つのＮＨＳ基が等しく反応性である場合、架橋度を最小にするためにかなり過剰な量の試薬を用いる必要があり、この架橋は、アミン中間体の２つの分子とジ−ＮＨＳ試薬の１つの分子との反応を含む。反応はまた、第２のＮＨＳ基が変わらず残るような条件下で行う必要がある。反応生成物は、過剰量の未反応のＮＨＳ試薬から分離可能でなければならない。
【００３３】
ＮＨＳ基は水中でかなり不安定である。そのため、反応条件は、ＮＨＳ試薬と、水又は他のプロトン性溶媒との接触を最小限にしなければならない。好ましくは、反応は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行われる。基質を溶解するために、少量の水、又は他のプロトン性溶媒及び極性溶媒を含む必要がある場合がある。この量は、最小、例えば、全溶媒の１０％未満に維持されるべきである。試薬の可溶化を最適なものとし、且つ反応を促進させるため、温度を上げることが望ましい場合があるが、但し、これによって、望ましくない基質の酸化又は開裂等の化学修飾が為されることはない。
【００３４】
さらなる実施の形態において、工程ａ）及び工程ｂ）、並びに／又は工程ｃ）によって生成されるアルデヒド末端化中間体はヒドラジンと反応し、ヒドラゾン中間体を形成する。ヒドラゾン基は、ＮＨＳ基と反応性である。二官能性ＮＨＳ試薬が反応する本発明のプロセスの必須工程において、このＮＨＳ試薬は便利にはジ−ＮＨＳ化合物である。上記のアミン中間体における反応と同じ注意を守らなければならない。反応スキームはスキーム８ａ）として示される。
【００３５】
好適なジ−ＮＨＳ試薬は、
ビス［２−スクシンイミジルオキシカルボニル−オキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）及びそのスルホ類似体、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）（ＢＳ３）、
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、
ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、
ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）又はそのスルホ類似体、
３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、並びに
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）及びそのスルホ類似体である。
【００３６】
該プロセスの代替的な実施の形態によれば、基質におけるアミン基の形成を含む予備工程の代わりに、チオール基が好ましくは１つの末端シアル酸ユニットに、代替的には、末端シアル酸ユニット及び反対末端の末端ユニットに提供され、シアル酸又は別の糖残基になり得る予備工程が提供される。
【００３７】
チオール基は、例えば、シスタミンとアルデヒド基とを反応させた後、還元することによって形成される。アルデヒド基は、それぞれの末端基を有する出発物質において工程ａ）及び工程ｂ）、並びに／又は工程ｅ）を行うことによって、１つ又は両方の末端ユニットに導入することができる。出発物質は付加的に、シスタミンとの反応のためにアルデヒドに変換され得るビシナルジオール基を有する非還元性末端の糖を有し得る。代替的には、このような末端基は後の酸化工程、それから還元工程によって不活性化され、二官能性チオール中間体の形成を阻害し得る。チオール化は、Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ他によって記載されている一般的な手法を用いて行われる。
【００３８】
チオール基は、代替的に、工程ａ〜工程ｃにおいて上記で生成されるアミン中間体上で行われる一連の工程において導入され得る。チオール基は、アミン基と、チオール化シアル酸ユニットを含む２−イミノチオラン（２−ＩＴ）（Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ａ．他（前掲））との反応によって導入される。
【００３９】
チオール基を含有する中間体は新規の化合物であり、本発明のさらなる態様を示す。当該化合物は、以下の一般式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩ
【００４０】
【化２】
【００４１】
（式中、
Ｒ７は連結基であり、
Ａ１はＮＲ１２（式中、Ｒ１２はＨ、Ｃ１〜４アルキル又はアリールである）であり、
ＧｌｙＯはグリコシル基であり、ｋは０〜１００であり、
Ｇｌｙ１Ｏは、ペンダント型カルボン酸基上で必要に応じて誘導体化されるグリコシル基であり、Ｒ８は、モノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリサッカライド基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、ドラッグデリバリーシステム、又は細胞膜若しくは細胞壁の成分であり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ、水素、又はモノ−、ジ−、オリゴサッカライド基、アルキル基、アシル基、薬物、脂質又はドラッグデリバリーシステムであり、
Ｒ１０は、モノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリサッカライド基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、ドラッグデリバリーシステム、又は細胞膜若しくは細胞壁の成分、
又は基
【００４２】
【化３】
であり、
【００４３】
【化４】
【００４４】
（式中、Ｒ１３及びＲ１４の一方は水素であり、他方はモノ−、ジ−若しくはオリゴサッカライド基、アルキル基、アシル基、薬物、脂質又はドラッグデリバリーシステムである）である）
で表され得る。
【００４５】
連結基Ｒ７は、上記に列挙されるＲ２と同じ基から選択される。
【００４６】
Ｒ８及びＲ９の定義は好ましくは、それぞれＲ３基及びＲ４基の好ましい定義として上記されたのと同じである。ＧｌｙＯは好ましくはＳｙｌＯである。
【００４７】
ＧｌｙＯがＳｙｌＯであるチオール中間体は、本発明の第１の態様のプロセスの必須工程において、チオール反応性官能基並びにＮＨＳ基を有するヘテロ二官能性リンカーと反応する。このようなチオール反応性基は、例えば、Ｎ−マレイミド基、又はチオピリジルジチオ基、ビニルスルホン基若しくはＮ−ヨードアセトアミン基である。好適な二官能性試薬の例は、
Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、
Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、
Ｎ−（ξ−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、又はそのスルホ類似体、
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＨＣＣ）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−６−（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、
Ｎ−（ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、
スクシンイミジル−６−［３−２（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）又はそのスルホ類似体、
４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）又はそのスルホ−ＬＣ類似体、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル［４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、
スクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、及び
Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）及び
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）又はそのスルホ類似体である。
【００４８】
一般的に用いられる反応の反応条件はまた、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９５）を参照して、本明細書で用いられるものであり得る。
【００４９】
上記ＮＨＳヘテロ二官能性試薬は、その水溶性、及び、複合体が開裂性か又は非開裂性かに応じて選択され得る。好ましくは、短く且つ非免疫原性であるリンカーを有する試薬である。
【００５０】
ＮＨＳ試薬との反応は通常、０〜１００％ＤＭＳＯ溶液中（好ましくは最少量の水、例えば１０％を用いて）０〜１５０℃、好ましくは２０℃の温度で行われる。中間体上のシアル酸基質は、加熱、例えば、音波処理又はマイクロウェーブによって、好ましくは不活性環境下で溶解され得る。生成物の続く使用における有機溶媒の存在に耐性がない場合には、水溶性ＮＨＳ試薬を用いることができる。また、生成物から除去されていない未反応の試薬がいずれも細胞膜を透過しない可能性があるため、生成物の使用が細胞表面結合に関する場合には、水溶性ＮＨＳ試薬が好ましいであろう。
【００５１】
本発明において、出発物質はポリシアル酸（ＰＳＡ）である。このような化合物は、分子中にシアル酸以外のユニットを含んでいてもよい。例えば、シアル酸ユニットが他のサッカライドユニットと交互に配列されていてもよい。しかしながら、好ましくは、ポリサッカライドは実質的に、アルファ−２，８及び／又はアルファ−２，９結合しているシアル酸のユニットのみから成ることが好ましい（ポリシアル酸（以後、ＰＳＡ））。
【００５２】
出発物質は、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０のシアル酸ユニットを有する。ＰＳＡは、いずれの供給源、好ましくは、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１又はＫ９２、Ｂ群髄膜炎菌）、又は牛乳若しくはＮ−ＣＡＭ等の自然源に由来するものであってもよい。シアル酸ポリマーは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１３５群又はＶ群等のヘテロ多量体ポリマーであってもよく、又は化学合成されていてもよい。ＰＳＡは、塩又は遊離酸の形態であってもよい。それは、分子量が減少された後、細菌源により回収されるような加水分解形態であってもよい。ＰＳＡは、１．０１、実際は２以上と同程度もの多分散性を有するような狭いか又は広範な分子量を有する物質であってもよい。好ましくは、使用されるＰＳＡの分子量の多分散性は、１．２未満である。
【００５３】
天然型の、上記の種類の中間体としての、又は広い分子量分布を有する最終生成物であるいずれかのＰＳＡ群は、より低い多分散性を有する画分、すなわち、様々な平均分子量を有する画分に分画され得る。分画は好ましくは、溶出のために好適な塩基バッファーを用いたアニオン交換クロマトグラフィによって行われる。好適なアニオン交換媒体、すなわち、第４級アンモニウムイオンペンダント基（すなわち、強塩基）を有する、活性化されたアガロースに基づく強イオン交換物質等の分離用媒体を見出した。溶出バッファーは非反応性であり、所望の生成物を各画分の塩基から蒸発によって回収し得るように、好ましくは揮発性である。好適な例は、トリエタノールアミン等のアミンである。回収は、例えば、凍結乾燥によるものであってもよい。分画方法は、他のＰＳＡ誘導体に対するのと同様に、ＰＳＡ出発物質についても好適である。このため、この技術は、本発明の必須のプロセス工程の前後いずれでも適用することができる。
【００５４】
好ましくは、分画のプロセスは、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を用いて、また溶出バッファーとして好ましくは揮発性である塩基又は酸を用いて、好ましくは５ｋＤａより大きい分子量（Ｍｗ）を有するイオン性の群に関して実施される。好ましくは、ＰＳＡはカルボン酸基を有し、イオン交換はアニオン交換である。好ましくは、溶出バッファーはトリエタノールアミン等のアミンを含み、ＰＳＡの回収は好ましくは溶出画分を凍結乾燥することによるものである。
【００５５】
本発明のＰＳＡ−ＮＨＳ化合物は、例えば、生物学的に有用な化合物であるアミンを誘導体化するための続くプロセスにおいて使用することができる。このような反応は、好ましくはリン酸、炭酸水素／炭酸、ＨＥＰＥＳ又はホウ酸バッファー中で、好ましくは５〜２００ｍＭの濃度で行われ得る。第１級アミンを含有していなければ、他のバッファーを使用してもよい。例えば、第３級アミンのみを含有しているため、ＨＥＰＥＳを使用することができる。中性ｐＨから塩基性ｐＨまでの大過剰量のトリス／グリシンを、クエンチする反応の終わりに添加してもよい。反応は好ましくは、ｐＨ７〜９、４℃〜２０℃で３０分〜２時間行われ得る。ＰＳＡ−ＮＨＳ化合物は、アミンの濃度に応じて、タンパク質（又は他の誘導性化合物）に対して２〜５０倍過剰モルで用いられ得る。通常、ＰＳＡ−ＮＨＳ化合物の濃度は好ましくは、０．１〜１０ｍＭで変動し得る。より希薄なタンパク質溶液が、ＰＳＡ−ＮＨＳ化合物のＮＨＳ基を過剰に加水分解することから、アミン、例えば、タンパク質の濃度が好ましくは、約１０〜１００μＭに維持され得る。
【００５６】
生成物であるＮＨＳ化合物は、アミン基が好適にリジンのイプシロンアミン基又はＮ末端アミノ基である、アミン基を含有するタンパク質を誘導体化するため特に価値がある。この生成物は、タンパク質又はペプチドの治療活性剤、例えばサイトカイン、成長ホルモン、酵素、ホルモン及び抗体又はそれらのフラグメント等を誘導体化するために特に価値がある。代替的に、このプロセスは、例えば、ＮＨＳ基をリポソーム形成成分のアミン基と反応させることによって、リポソーム等のドラッグデリバリーシステムを誘導体化するのに用いることができる。他のドラッグデリバリーシステムは、米国特許第５８４６９５１号（Ａ）に記載されている。誘導体化され得る他の物質としては、ウイルス、微生物、細胞（例えば、動物細胞）、合成ポリマー又はコポリマーが挙げられる。
【００５７】
本発明はまた、新規の化合物が、ＮＨＳ基とアミン基との反応に好適な条件下で、誘導性アミン基を有する生物学的関連化合物と反応して、共有結合体を形成する方法を提供する。生物学的関連分子は好ましくはペプチド又はタンパク質であり、アミン基はＬｙｓユニットの側鎖上にあるか、又はペプチド若しくはタンパク質のＮ末端に存在する。誘導体化度は１．０未満であってもよいが、好ましくは少なくとも１．０、例えば少なくとも１．５であり、このことはすなわち、生物学的に活性な化合物の各分子が少なくとも１つのＰＳＡ基質部分と結合することを示す。
【００５８】
新規のＰＳＡ化合物との反応によるタンパク質及びドラッグデリバリーシステムの誘導体化は、半減期を増大させ、安定性を高め、免疫原性若しくは抗原性を低減し、且つ／又は溶解性及びそれゆえ生物学的利用能及び薬物動態特性を制御し得るか、又は活性剤の溶解性、若しくは誘導体化された活性剤を含有する溶液の粘度を改良し得る。
【００５９】
新規の好ましい単官能性ＰＳＡ−ＮＨＳは反応性が高く、修飾されていない還元性末端を有するＰＳＡ形態の使用により生成され得るかなりの複雑さ（図２）を回避することから、薬学的に許容可能な生成物の合成及び製造をより促進させる。ポリマーの新規な形態の生成（図５）は、好ましくは過ヨウ素酸塩による選択的酸化（工程ｅ）を伴い（前述のセクションを参照のこと）、アルデヒド官能基を非還元性末端に導入した後、還元アミノ化し（工程ｃ）、縮合してＮＨＳ官能性を形成する（工程ｄ）。しかしながら、図１に例示された従来技術とは異なり、このアルデヒド部分は、例えば水素化ホウ素による還元によって破壊される場合がある（工程ａ）。ポリマーの他の末端において、水素化ホウ素による還元工程はまた、ヘミケタールを還元することによって同時に還元性末端の環構造の開環を固定する。ケトンのこのヒドロキシル部分への同時還元は、第２の酸化工程における選択的酸化に適する新たなジオール官能性を還元性末端に導入する。天然ポリマーを（首尾良く）過ヨウ素酸塩で酸化し、水素化ホウ素で還元し、過ヨウ素酸塩で２回目の酸化を行い、ＮＨＳ化合物を形成するようにアミノ化及び結合させる場合、厳密に単官能性であり、先に還元される末端にのみ１つの反応性基（すなわち、ＮＨＳ基）を有する新規なポリマー形態が生成される（図５）。
【００６０】
様々な誘導体の縮合によるタンパク質反応性のスキームを図９及び図１０に記載する。単官能性ＰＳＡは、最も外側の非還元性末端を用いて、タンパク質と、単一方向にしか結合を引き起こすことなく、また意図せずにタンパク質を架橋することはない。この新規の反応（図５）方法のスキームは、（図２に記載されるように）意図される生成物を様々な意図されるものではない生成物から精製する必要性を回避する。この意図されるものではない生成物はこの新規の反応スキームにおいて完全に回避される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ａ】非還元性シアル酸末端ユニットの従来技術による活性化を示す反応スキームである。
【図１ｂ】タンパク質−アミン部分を用いた、反応スキーム１ａの生成物のアルデヒド部分の従来技術による還元アミノ化を示す反応スキームである。
【図２】副次反応による、可能性のある副生成物を概略的に示す。
【図３】ケタールとＰＳＡの還元性末端シアル酸ユニットの閉環形態との間の互変異性を示す反応スキームである。
【図４】（非還元性末端がビシナルジオールを有さない場合に）還元性末端誘導体化ＮＨＳコロミン酸の調製を示す。
【図５】還元性末端誘導体化ＮＨ２−ＣＡコロミン酸（ビシナルジオールは非還元性末端において除去される）の調製を示す。
【図６】ＣＡ−ＮＨＳ−タンパク質複合体の調製の一般的なスキームを示す。
【図７ａ】誘導体化チオールコロミン酸（非還元性末端にＣＡ−ＳＨ）の調製を示す。
【図７ｂ】ＮＨＳ−マレイミドを用いたＣＡ−ＳＨを介するＣＡ−タンパク質結合の概略図を示す。
【図７ｃ】ＮＨＳ−マレイミド（ＡＭＡＳ）を用いたＣＡ−ＳＨを介するＣＡ−タンパク質複合体の調製を示す。
【図８ａ】還元性末端上のＮＨＳを介するＣＡ−タンパク質複合体の調製を示す。
【図８ｂ】ポリシアル酸の還元性末端のキャッピングを示す。
【図８ｃ】非還元性末端誘導体化ＣＡの調製を示す。
【図９】非還元性末端上のビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）を用いたＣＡ−タンパク質複合体の調製を示す。
【図１０】架橋剤であるＤＳＧを用いたＣＡ−タンパク質複合体の概略図を示す。
【図１１】実施例５にあるように分離されたＣＡについてのゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）のクロマトグラムを示す。
【図１２】ＣＡ−ＮＨＳ−成長ホルモン（ＧＨ）タンパク質結合反応（ＣＡ ３５ｋＤａ）に関するサイズ排除ＨＰＬＣを示す。
【図１３】ＣＡ−ＮＨＳ−ＧＨ複合体（ＣＡ ３５ｋＤａ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す。
【図１４】未反応のＣＡ及び反応したＣＡのネイティブＰＡＧＥを示す。
【図１５】実施例１０にあるようなＣＡＨ−ＮＨＳ反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１６】図１５の画分６のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６２】
実施例
材料
メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び分子量マーカーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（英国）から入手した。使用されるＣＡ、鎖状アルファ−（２，８）結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１ ＰＳＡ（平均２２．７ｋＤａ、多分散性（ｐ．ｄ．）１．３４；３９ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．４；１１ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．２７）はＣａｍｉｄａ（アイルランド）から入手した。他の物質は、２，４ジニトロフェニルヒドラジン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、英国）；透析チューブ（３．５ｋＤａ及び１０ｋＤａのカットオフ限界（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国））；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨｉＴｒａｐ、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国）；ＸＫ５０カラム及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）；トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（４〜２０％及び１６％）、トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー（Ｎｏｖｅｘ、英国）を含む。脱イオン水は、Ｅｌｇａｓｔａｔ Ｏｐｔｉｏｎ ４水精製ユニット（Ｅｌｇａ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）から得た。使用される全ての試薬は、分析用グレードである。プレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を、タンパク質又はＣＡアッセイにおける分光学的測定のために用いた。
方法
タンパク質及びＣＡ測定
シアル酸であるＣＡの定量評価は、別記されるように（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ他、１９９３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６及び１９９７）、レゾルシノール法（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９５７）によって行った。ＧＨはビシンコニン酸（ＢＣＡ）比色法によって測定した。
【００６３】
実施例１−ＩＥＣによるＣＡの分画（ＣＡ、２２．７ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．３４）（参照例）
ＸＫ５０カラムに９００ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ ＦＦを充填し、３カラム体積の洗浄バッファー（２０ｍＭトリエタノールアミン；ｐＨ７．４）を用いて、５０ｍｌ／分の流量で平衡とした。ＣＡ（２００ｍｌの洗浄バッファー中に２５グラム）をシリンジポートを介して５０ｍｌ／分でカラムに供給した。その後、１．５カラム体積（１３５０ｍｌ）の洗浄バッファーでカラムを洗浄した。
【００６４】
結合したＣＡを、１．５カラム体積の種々の溶出バッファー（０ｍＭ〜４７５ｍＭ ＮａＣｌを２５ｍＭのＮａＣｌ刻みで含むトリエタノールアミンバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４））、及び最終的に１０００ｍＭのＮａＣｌを含む同様のバッファーを用いて溶出し、全ての残余ＣＡ及び他の残余物（もしあれば）を除去した。
【００６５】
試料を、５ｋＤａの膜（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、英国）による高圧限外濾過によって２０ｍｌまで濃縮した。これらの試料を、４℃での限外濾過を繰り返すことにより、バッファーを脱イオン水に交換した。試料を、（実施例５で報告されるように）ＧＰＣ及び（アルシアンブルーで染色される（実施例８））ネイティブＰＡＧＥによって、平均分子量及び他のパラメーターについて分析した。上記の手順を用いて生成したＣＡの狭い画分を、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、ＧＰＣ及びネイティブＰＡＧＥにより、ポリマーへの総変化について分析した。
【００６６】
実施例２：ＣＡの活性化（参照例）
新たに調製した０．０２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４；ＣＡに対して６倍過剰モル）溶液を２０℃でＣＡと混合し、この反応混合物を暗所で１５分間、磁気攪拌させた。酸化させたＣＡを、７０％（最終濃度）エタノールを用いて、混合物を３０００ｇで２０分間遠心分離することによって沈殿させた。上清を除去し、ペレットを最小量の脱イオン水に溶解した。ＣＡを再度７０％エタノールで沈殿させた後、１２，０００ｇで遠心分離した。ペレットを最小量（ｑｕａｎｔｉｔｉｙ）の水に溶解し、凍結乾燥して、次に使用するまで−２０℃で保存した。
【００６７】
実施例３：ＣＡ及び誘導体の酸化状態の測定（参照例）
ＣＡの酸化度の定量評価は、カルボニル化合物との相互作用において、難溶性の２，４ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる２，４ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて行った。非酸化ＣＡ及び酸化ＣＡ（ＣＡＯ）（各５ｍｇ）を、２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に添加し、この溶液を振盪し、その後、結晶性沈殿が観察されるまで３７℃で放置した（Ｓｈｒｉｎｅｒ他、１９８０）。ＣＡの酸化度（定量的）は、アルカリ性溶液中のフェリシアニドイオンのフェロシアン化第二鉄（ペルシアンブルー）への還元に基づく方法（Ｐａｒｋ及びＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９）を用いて測定した（後で６３０ｎｍで測定する）。この例では、グルコースを標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）として用いた。
【００６８】
実施例４ａ：アミノコロミン酸（ＣＡ−ＮＨ２）の調製（参照例）
１０〜１００ｍｇ／ｍｌのＣＡＯを、５０ｍｌのチューブ内で３００倍過剰モルのＮＨ４Ｃｌを含む２ｍｌの脱イオン水に溶解した後、ＮａＣＮＢＨ４（１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中に５Ｍのストック）を最終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。この混合物を室温で５日間インキュベートした。ＣＡＯの代わりにコロミン酸を用いて対照反応物も準備した。生成物であるコロミン酸アミン誘導体を、５ｍｌの氷冷エタノールを添加することにより沈殿させた。沈殿物を４０００ｒｐｍで３０分間、室温で、卓上遠心機で遠心分離することにより回収した。ペレットはそのままにしておき、２ｍｌの脱イオン水で再懸濁した後、１０ｍｌの超遠心チューブ内で５ｍｌの氷冷エタノールを用いて再度沈殿させた。沈殿物を３０，０００ｒｐｍで３０分間、室温で遠心分離することにより回収した。ペレットを２ｍｌの脱イオン水で再懸濁し、凍結乾燥させた。
【００６９】
実施例４ｂ：アミン含有量の分析
ＴＮＢＳ（ピクリルスルホン酸、すなわち２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）分析を用いて、生成物中に存在するアミノ基の量を測定した（Ｓａｔａｋｅ他、１９６０）。
【００７０】
マイクロタイタープレートのウェル内で、ＴＮＢＳ（０．５μｌの１５ｍＭ ＴＮＢＳ）を９０μｌの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．５）に添加した。これに、１０μｌの５０ｍｇ／ｍｌのＣＡ−アミン溶液を添加した。このプレートを２０分間室温で放置した後、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。０．１〜１ｍＭの濃度範囲のグリシンを標準として用いた。ＴＮＢＳは第１級アミン基をトリニトロフェニル化する。アミンのＴＮＰ付加物が検出される。
【００７１】
冷エタノール二重沈殿（ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｌｄ−ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により精製された生成物をＴＮＢＳ分析を用いて試験すると、８５％に近い変換が示された。
【００７２】
実施例４ｃ：コロミン酸−ＳＨの調製
ＮＨ４Ｃｌの代わりに１００倍過剰モルのシスタミンを用いること以外は、実施例４ａに記載したのと同様に、酸化させたＣＡを還元アミノ化によってシスタミンで誘導体化した。この生成物を精製する前に、これを３７℃で１時間、５０ｍＭ ＤＴＴで処理した。還元された生成物を、エタノール二重沈殿及びｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｇ２５によるサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
【００７３】
別の実施例において、実施例４ａのように調製されたＣＡＮＨ２を、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を有する１０ｍＭ ＰＢＳに溶解する。５０倍過剰モルの２−イミノチオランを添加し、反応を２５℃で１時間続ける。未反応の２−イミノチオラートを、反応バッファーを用いて平衡にしたｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムによるゲルろ過によって除去する。
【００７４】
チオール含有量をエルマン分析を用いて評価する。１５μｌの試料を１５０μｌの０．１Ｍホスフェート、０．０８ｍｇ／ｍｌの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）と混合し、３０分間室温で反応させ、４０５ｎｍで読み取る。この生成物は図７ｂ及び図７ｃのスキームによる反応に好適である。
【００７５】
さらに、ポリマーのチオール含有量が６０％であることが分かった。
【００７６】
実施例４ｄ：ＣＡ−ＮＨＳの調製
上記の参照例４ａで合成したＣＡ−ＮＨ２（３５ｋＤａ）（１５〜２０ｍｇ）を０．１５Ｍ ＰＢＳ（３５０μＬ、ｐＨ７．２）に溶解し、次に、ＰＢＳ（１５０μＬ、ＰＨ７．２）に溶解した５０又は７５モル当量のＢＳ３を添加した。この混合物を５秒間ボルテックスにかけた後、３０分間２０℃で反応させた。ＣＡ−ＮＨＳ生成物を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いてＰＤ−１０カラムにより精製し、直ちにタンパク質及びペプチドのＮＨ２基との部位特異的結合に用いた。ＰＤ１０画分からのＣＡ濃度の測定を、レゾルシノール分析を用いてシアル酸含有量を分析することによって行った。ＣＡとＮＨＳとの反応溶液を２６０ｎｍで分析することによる紫外分光法によって、また２５４ｎｍでの可視化を伴う薄層クロマトグラフィによって、ＣＡポリマーにおけるＮＨＳ含有量を測定した。
【００７７】
上記の実施例４ａで合成したＣＡ−ＮＨ２（３５ｋＤａ）（１５〜２０ｍｇ）を、加熱（１００〜１２５℃）しながら、ＤＭＳＯ（３００〜２８５μＬ）を添加した最小量の水（５０〜６５μＬ）に溶解するか、又は９５％を超えるＤＭＳＯ（３５０μＬ）に溶解した。ＤＭＳＯ（１５０Ｌ）に溶解した７５モル当量のＤＳＧをＣＡ−ＮＨ２溶液に添加し、５秒間ボルテックスにかけた後、３０分間２０℃で反応させた。ＣＡ−ＮＨＳ生成物を、ジオキサンによる沈殿（×２）によって、又は溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いたＰＤ−１０カラムによって精製し、直ちにタンパク質及びペプチドのＮＨ２基との部位特異的結合に用いた。前述のように、ＰＤ１０画分からのＣＡ濃度の測定を、レゾルシノール分析を用いて行った。紫外分光法（２６０ｎｍ）によって、また薄層クロマトグラフィ（２５４ｎｍ）によって、ＣＡポリマーにおけるＮＨＳ含有量を測定した。
【００７８】
実施例５：ＣＡ試料のゲル浸透クロマトグラフィ（参照例）
ＣＡ（３５ｋＤａ）試料をＮａＮＯ３（０．２Ｍ）及びＣＨ３ＣＮ（１０％；５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２×ＧＭＰＷＸＬカラム上で、屈折率を検出しながらクロマトグラフィを行った（ＧＰＣシステム：ＶＥ１１２１ ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０ ＲＩ検出器及びＴｒｉｓｅｃ３ソフトウェア（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ）による照合）。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を、０．４５μｍナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ ＮａＮＯ３及びＣＨ３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／分で流した（図１１）。
【００７９】
実施例６：（ＢＳ３及びＤＳＧを用いた）ＣＡ−ＮＨＳ−タンパク質複合体の調製
炭酸水素ナトリウムに溶解したＧＨ（２３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、過剰量のＢＳ３を用いて実施例４ｂからのＣＡ−ＮＨＳ（３５ｋＤａ）と共有結合させた。２５：１又は５０：１のＣＡ−ＮＨＳ：ＧＨのモル比を用いて０．１５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２、１．５ｍｌ）中で３０分間、２０℃で反応を行った。ポリシアリル化させたＧＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィにより測定された結合収量を用いて特徴付けた。対照は、天然のタンパク質を、ＣＡ−ＮＨＳの非存在下でＢＳ３を用いた結合手順にかけることを含むものであった。ＣＡ−ＮＨ２をまた、天然のＧＨの非存在下でＢＳ３を用いた結合手順にかけた。
【００８０】
炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．４）に溶解したＧＨをＣＡ−ＮＨＳ（３５ｋＤａ）に共有結合させ、これを、実施例４ｂに記載したように過剰量のＤＳＧを用いて調製した。５０：１のＣＡ−ＮＨＳ：ＧＨのモル比を用いて０．１５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２、１．５ｍｌ）中で３０分間、２０℃で反応を行った。ポリシアリル化させたＧＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィにより測定された結合収量を用いて特徴付けた。対照は、天然のタンパク質を、ＣＡ−ＮＨＳの非存在下でＤＳＧを用いた結合手順にかけることを含むものであった。
【００８１】
実施例７．ＣＡ−ＮＨＳ−ＧＨ複合体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ
ＣＡ−ＧＨ複合体を炭酸水素アンモニウムバッファー（０．２Ｍ、ｐＨ７）に溶解し、ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上で、紫外線指数により検出しながら（Ａｇｉｌｅｎｔ、１０／５０システム（英国））クロマトグラフィを行った。試料（１ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍナイロン膜で濾過し、１７５μｌを注入し、移動相として炭酸水素アンモニウムバッファーを用いて０．２５ｃｍ／分で流した（図１２）。
【００８２】
実施例８．ＣＡ及びＣＡ−ＧＨ複合体のＳＤＳ及びネイティブＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＭｉｎｉＧｅｌ、Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｇｅｌ Ｕｎｉｔ、型式 ＶＧＴ １、電源型式 Ｃｏｎｓｏｒｔ Ｅ１３２（ＶＷＲ、英国））を、ポリシアリル化におけるＧＨの分子サイズの変化を検出するために使用した。反応混合物からの０分（対照）及び３０分の試料におけるＧＨ及びその（ＣＡ−ＮＨＳとの）複合体、並びにプロセスの対照（非酸化ＣＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。この試料を幅広い分子量マーカーに対して較正した（図１３及び図１４）。
結果
ＣＡ（２２．７ｋＤａ）及びその誘導体を、１．１未満の多分散性、４６ｋＤａまでの平均分子量、及び種々の％割合を有する様々な狭い種（ｎａｒｒｏｗ ｓｐｅｃｉｅｓ）に、首尾よく分画した。表２は２２．７ｋＤａの物質を分離した結果を示す。
【００８３】
【表１】
【００８４】
このプロセスは、各スケールでほとんど同一の分画プロフィールを有する、１ｍｌから９００ｍｌまでのマトリックスに拡大縮小可能である（全ての結果は示していない）。
【００８５】
より大きなポリマー（ＣＡ、３９ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．４）の分画は、９０ｋＤａまでの種を生じる。このプロセスは、大きなバッチのポリマーの分画にさえ、首尾よく用いることができる。この結果は、イオン交換画分が狭く分散することを示す。これは、ＧＰＣのデータと一致する。
【００８６】
全ての狭い画分は、２０ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて首尾よく酸化され、製造プロセスの種々の段階から採取され且つＧＰＣ及びネイティブＰＡＧＥにより分析された試料は、分子量及び多分散性における変化を示さなかった。
【００８７】
ＣＡ、すなわちＰＳＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の鎖状アルファ−２，８結合したホモポリマーである（図１ａ）。
【００８８】
ＣＡの酸化状態の定量測定は、グルコースを標準として用い、アルカリ性溶液中でフェリシアニドイオンをフェロシアン化物（プルシアンブルー）に還元する（Ｐａｒｋ及びＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９）ことにより行われた。酸化されたＣＡは、天然のポリマーと比較して１００ｍｏｌ％近い見かけのアルデヒド含有量を有することが見出された。フェリシアニドを用いた酸化プロセスにおけるＣＡ中間生成物の定量分析の結果は、天然のＣＡと共に淡黄色の沈殿物を生じ、ポリマーのアルデヒド含有形態と共に濃橙色を生じ、且つ室温での１０分間の反応後に濃橙色沈殿を生じる、２，４−ＤＮＰＨを用いて行われる定性試験の結果と一致する。
【００８９】
過ヨウ素酸塩及びボロヒドリド処理後の内部のアルファ−２，８結合したＮｅｕ５Ａｃ残基の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をＧＰＣによって分析し、酸化した（ＣＡＯ）、アミノＣＡ（ＣＡ−ＮＨ２）、ＣＡ−ＮＨＳ物質について得られたクロマトグラフを、天然のＣＡのものと比較した。ＣＡは全て、ほとんど同一の溶出プロフィールを示すことが見出され（図１２）、種々の工程が、ポリマー鎖の顕著なフラグメント化又は（ＣＡ−ＮＨＳの場合には）架橋を引き起こす証拠は何もない。小さなピークは緩衝塩を示す。
【００９０】
ＣＡ−ＧＨ複合体の形成をＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＤＳＧとのこの結合反応に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、遊離ＧＨが残存しないこと、及びこの結合反応が完了したことが示された。これはＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認されたため、遊離ＧＨの予測溶出時間前にＣＡ−ＧＨ複合体を溶出した（遊離ＧＨのピークは観測されなかった）。一方、ＢＳ３を用いたＧＨへのＣＡ−ＮＨ２の結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は遊離ＧＨの存在を示し、これは、７０分付近で遊離タンパク質の溶出ピークを示したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって確認された。
【００９１】
結果（図１３）により、複合体レーンでは、ＧＨに比べてポリシアリル化されたＧＨを示す質量の増大を典型的に示すバンドシフトが存在することが示される。さらに、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってＧＨ複合体を様々な種に分離した。
【００９２】
実施例９：コロミン酸ヒドラジド（ＣＡＨ）の調製（参照例）
４００μｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中で２時間、２５℃で、５０ｍｇの酸化されたコロミン酸（１９ｋＤａ）を２．６ｍｇのヒドラジン（液体）と反応させた。次に、このコロミン酸を７０％エタノールで沈殿させた。この沈殿物を３５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に再溶解し、ＮａＣＮＢＨ３を５ｍｇ／ｍｌまで添加した。この混合物を４時間、２５℃で反応させた後、一晩凍結させた。移動相として０．１５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を充填したＰＤ１０カラム上のゲル浸透クロマトグラフィによって、ＮａＣＮＢＨ３及び反応副生成物を除去した。画分（各０．５ｍｌ）を（アミノ基に対して特異的であり、既述の）ＴＮＢＳ分析によって分析した。画分６、７、８及び９（ボイドボリューム画分）は、バックグラウンドよりもかなり強いシグナル（ｓｉｎｇａｌ）を有し、バックグラウンドはＮＨ４＋イオンの存在により高い値を示した。また、画分６、７、８及び９はコロミン酸を含有していた。これらの４つの画分を凍結乾燥し、ＣＡ−ヒドラジド（ＣＡＨ）を回収した。
【００９３】
実施例１０：コロミン酸ＮＨＳ（ＣＡ−ＮＨＳ）及びコロミン酸−タンパク質複合体の調製
１０ｍｇの１９ｋＤａであるＣＡ−ヒドラジドを９ｍｇのＢＳ３と、４００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３０分間、室温で反応させた。この反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を充填したＰＤ１０カラムに入れて、０．５ｍｌ画分を回収した。０．１ｍｇのＢＳＡを５〜９の各画分に加えた。室温で２時間後、画分をＢＳＡと反応させた。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ ＨＰＬＣで分析した。
【００９４】
これらの画分は、コロミン酸をわずかしか有していなかった。コロミン酸を多く含む画分（６及び７）は、他の試料及びＢＳＡにおいて存在するバンドに加えてタンパク質によるストリーク（ｓｔｒｅａｋ）を有し、これは結合の明らかな証拠である（図１５）。
【００９５】
画分６のＨＰＬＣクロマトグラムは、遊離タンパク質と比較して複合体の保持時間に大きなシフトが存在することを示し、これにより結合が裏付けられる（図１６ａ及び図１６ｂ）。
【００９６】
用いられるＢＳＡは不純物を含有する。ＢＳＡのピークは、５６分である（図１６ａ）。
【００９７】
５６分のピークに加えて、複合体であるより大きい種が存在する。８０分に大きいピークが存在し、このピークは、タンパク質と反応したためにＣＡ−ＮＨＳから放出されたＮＨＳである。遊離ＢＳ３を除去するゲル浸透クロマトグラフィカラムにＣＡＨを通したことから、このピークが遊離ＢＳ３である可能性はない。これは、ＣＡ分子上にＮＨＳエステル基が生成されたことを強く示唆している（図１６ｂ）。
参考文献
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元性末端又は非還元性末端において基質と反応するためのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有する末端シアル酸ユニットを有し、且つ好ましくは主にシアル酸ユニットのみから成るポリシアル酸等の化合物誘導体、及びこれらを製造する方法に関する。これらの誘導体は、ペプチド、タンパク質、薬物、ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム）、ウイルス、細胞（例えば、動物細胞）、微生物、合成ポリマー又はコポリマー等のような、アミン基を含有する基質との結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、或る特定の菌株により、及び、哺乳動物において所定の細胞で製造される、天然に存在するシアル酸の非分枝ポリマーである（Ｒｏｔｈ他、１９９３）。それらは、ノイラミニダーゼによる消化である制限された酸加水分解、又は、天然の細菌又は細胞由来のポリマー形態の分別のいずれかにより、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基から、下はｎ＝２までの様々な重合度で製造することができる。ホモポリマー形態、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１株及びＢ群髄膜炎菌のカプセル状ポリサッカライドを含む、アルファ−２，８結合したＰＳＡ（神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）の胚形態においても見出される）が存在するように、種々のＰＳＡの組成も変化する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２株及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣ群ポリサッカライドの、アルファ−２，８、アルファ−２，９が交互に結合したＰＳＡのようなヘテロポリマー形態も存在する。さらに、シアル酸は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＷ１３５群又はＹ群のようなシアル酸以外のモノマーとの交互コポリマーにおいても見出され得る。哺乳動物において、ＰＳＡについてのレセプターは知られていないが、ＰＳＡは、病原菌による免疫系及び補体系の回避、及び胎児成長期における幼若な神経のグリアの接着（ｇｌｉａｌ ａｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ）の調節（ここで、このポリマーは抗接着機能を有する）を含む、重要な生物学的機能を有する（Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ他、１９９８；Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、１９８９；Ｔｒｏｙ、１９９０及び１９９２；Ｃｈｏ及びＴｒｏｙ、１９９４）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１株のアルファ−２，８結合したＰＳＡは、「コロミン酸」としても知られており、本発明を例示するために（様々な長さで）用いられる。
【０００３】
細菌性ポリサッカライド中のＰＳＡのアルファ−２，８結合形態は、免疫原性キャリアタンパク質に結合した場合でさえも（哺乳類の被験体において、Ｔ−細胞又は抗体の反応のいずれも誘発しない）固有に非免疫原性であり、これは哺乳類（同様に細菌の）ポリマーとしてのその存在を反映するものであり得る。ポリマーのより短い形態（最大ｎ＝４）は、体内に広く分布しており、ＰＳＡに対する免疫寛容を効果的に課し、且つ維持すると考えられている、細胞表面ガングリオシドにおいて見出される。近年、ＰＳＡ、特にアルファ−２，８結合したホモポリマーＰＳＡの生物学的特性は、タンパク質及び低分子量の薬物分子の薬物動態特性を改良するために活用されてきた（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００１；Ｊａｉｎ他、２００３；米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）。カタラーゼ及びアスパラギナーゼを含む多くの治療タンパク質のＰＳＡ誘導体化（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６及び１９９７）は、循環半減期及びそれらの安定性において劇的な向上をもたらし、また、そのようなタンパク質は、治療タンパク質への事前曝露の望ましくない（及び、時には避けられない）結果として生じる既存の抗体に直面して、用いルことを可能にする（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００１）。多くの点で、ポリシアル酸化されたタンパク質の改良された特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導体化されたタンパク質に匹敵する。例えば、それぞれの場合において、半減期は増大し、タンパク質及びペプチドは、タンパク質消化に対してより安定であるが、生物学的活性の維持は、ＰＥＧを用いた場合よりも、ＰＳＡを用いた場合のほうが大きいと思われる（Ｈｒｅｃｚｕｋ−Ｈｉｒｓｔ他、２００２）。また、ＰＥＧは、非常にゆっくりとしか生分解せず（Ｂｅｒａｎｏｖａ他、２０００）、高分子量及び低分子量の両方の形態が組織中に蓄積する傾向にある（Ｂｅｎｄｅｌｅ他、１９９８；Ｃｏｎｖｅｒｓ他、１９９７）ため、慢性的に投与しなければならない治療剤とのＰＥＧの使用については疑問がある。ＰＥＧ化されたタンパク質は、血液循環中における複合体の滞留時間にも影響を与える可能性のある抗ＰＥＧ抗体を生じることが見出された（Ｃｈｅｎｇ他、１９９０）。治療剤と結合する非経口投与ポリマーとしてのＰＥＧの確立した歴史にもかかわらず、その免疫毒性学、薬理学及び代謝についてのより良い理解が求められる（Ｈｕｎｔｅｒ及びＭｏｇｈｉｍｉ、２００２；Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ、２００３）。同様に、ＰＥＧの蓄積は毒性につながる可能性があるため、高投与量を必要とする治療剤（したがって最終的には高投与量のＰＥＧ）におけるＰＥＧの有用性についての懸念が存在する。したがって、アルファ−２，８結合したＰＳＡは、本来人体の一部である、免疫学的に「見えない」（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ’ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ’）生分解性ポリマーであり、組織のノイラミニダーゼにより、非毒性サッカライドであるシアル酸に分解することができる、ＰＥＧの有力な代替物を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等のグループは、以前の学術論文及び登録特許において、タンパク質治療剤の薬物動態特性の改善における、天然のＰＳＡの有用性について記載している（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６、１９９７、２００１；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ他、１９９３、１９９８、２０００；Ｈｒｅｃｚｕｋ−Ｈｉｒｓｔ他、２００２；Ｍｉｔａｌ、２００４；Ｊａｉｎ他、２００３、２００４；米国特許第０５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）。今回、本発明者等は、ＰＳＡ誘導体化タンパク質（及び治療剤の他の形態）を製造する新規の組成物、及び新規の方法をもたらす、新規なＰＳＡの誘導体を記載する。これらの新規の物質及び方法は、医療倫理及び監督機関（例えば、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ）の安全要求事項のため、薬物（ｄｒｕｇ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の化学的及び分子的定義が非常に重要であるので、ヒト及び動物における使用が意図されるＰＳＡ誘導体化治療剤の製造に対して特に有用である。
【０００５】
タンパク質のような治療剤へのポリサッカライドの結合のための方法は、以前に記載されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ及びＬｕｇｏｗｓｋｉ、１９８１；米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）。これらの方法のうちのいくつかは、ポリマーの「非還元性」末端の化学的誘導体化に依存し、これによってタンパク質反応性アルデヒド部分を生じる（図１）。ＰＳＡ（及び他のポリサッカライド）の還元性末端は、タンパク質の構造及び結合の間のＰＳＡの化学的結合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を保存するために必要な穏和な条件下で、タンパク質に対して弱反応性しか示さない。ビシナルジオールを含むシアル酸末端ユニットの非還元性末端は、過ヨウ素酸塩を用いて容易に（且つ選択的に）酸化され、これによりモノアルデヒド誘導体を生じ得る。この誘導体はタンパク質に対してより反応性があり、還元アミノ化及び他の化学反応によるタンパク質の結合に好適な反応性エレメントを含む。本発明者等は、このことについて、米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号に記載している。この反応は、図１中に例示され、ここで、
ａ）は、末端のシアル酸の非還元性末端においてタンパク質反応性アルデヒドを形成するための、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたＣＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルファ−２，８結合したＰＳＡ）の酸化後の、アルデヒドとタンパク質の第１級アミン基との反応を示し、
ｂ）は、タンパク質のアミノ基との安定で不可逆性の共有結合を形成するための、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）を用いた、シッフ塩基の選択的還元を示す。
【０００６】
国際公開特許第２００５／０１６９７３号において、本発明者等は、末端シアル酸ユニットを介して導入されるスルフヒドリル反応性基を有するポリサッカライド誘導体を記載している。このユニットは通常、ポリサッカライドの非還元性末端におけるシアル酸ユニットの誘導体化によって導入される。スルフヒドリル反応性基は好ましくはマレイミド基である。この基を導入する反応は、一方の末端にスルフヒドリル反応性基、及び他方の末端にヒドラジド又はエステル等の特性基を有するヘテロ二官能性試薬と、ポリサッカライドのシアル酸誘導体化末端ユニット上のアルデヒド基又はアミン基とを反応させることを伴い得る。この生成物は、例えばＣｙｓユニット又は導入されるスルフヒドリル基において、タンパク質の部位特異的誘導体化に有用である。
【０００７】
ＰＳＡを治療剤と結合させることを記載している種々の方法（米国特許第５８４６，９５１号（Ａ）；国際公開特許第０１８７９２２号）は理論的に有用であるが、タンパク質とＰＳＡの非還元末端（アルデヒド形態）との反応を介した複合体の許容可能な収量の達成には、高温でのタンパク質安定性につながらない反応時間を必要とする（例えば、インターフェロンアルファ−２ｂ）。次に、達成することができないか又は非経済的となるおそれのある反応物濃度（すなわち、過剰量のポリマー）を必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明者等は、還元性末端及び／又は非還元性末端にＮＨＳ−シアル酸基を有するポリシアル酸と、タンパク質とを結合させる新規の方法の開発により、この問題を解決した。還元性末端の弱い反応性を（非還元性末端を破壊し、この還元性末端をキャッピングし、且つ二官能性架橋剤により誘導体化することによって）有益な効果のために活用することにより、過ヨウ素酸塩で酸化されたＣＡによるタンパク質の還元アミノ化の確立された方法（図１）を用いた、図２及び図３に記載される生成物の複雑さを回避することができる。
【０００９】
米国特許第４，３５６，１７０号においてＪｅｎｎｉｎｇｓ及びＬｕｇｏｗｓｋｉは、予備還元工程後に酸化工程を伴う、活性化された還元性末端ユニットを介したタンパク質による細菌性ポリサッカライドの誘導体化を記載している。Ｊｅｎｎｉｎｇｓ他によりこのアプローチが用いられた例としては、還元性末端ユニットが、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、グルコサミン、ラムノース及びリボースであるポリサッカライドが挙げられる。
【００１０】
欧州公開特許第０４５４８９８号において、タンパク質のアミノ基は、グリコサミノグリカンの還元性末端の糖部分の還元及び部分的酸化により合成されたアルデヒド基と結合する。この方法で扱われるグリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸が挙げられる。これらの化合物のいずれも、還元性末端にシアル酸ユニットを有さない。
【００１１】
本発明において、シアル酸ユニット由来の少なくとも１つの末端ユニットを有するポリシアル酸基質を含む新規の化合物が提供される。当該化合物は、必要に応じてリンカーを介して２位又は７位炭素のいずれかで末端ユニットと結合するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含む。Ｎ−スクシンイミジルオキシ基は以後、ＮＨＳ基と表される。本発明において、スクシンイミジル部分は、非置換であっても、スルホニル基又は有用な溶解特性を与える他の基のような基で置換されていてもよい。誘導体化された末端ユニットは、非還元性末端シアル酸基又は還元性末端シアル酸基に由来し得る。ＰＳＡ分子１つ当たり、２つのこのようなＮＨＳ基、例えば、非還元性末端シアル酸基由来の末端ユニットに１つのＮＨＳ基、及び還元性末端シアル酸基由来の末端ユニットに残りのＮＨＳ基が存在し得る。
【００１２】
本発明の化合物はまた、一般式の観点から定義されてもよい。新規の化合物は好ましくは一般式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ
【００１３】
【化１】
【００１４】
（式中、Ｒ１はＨ又はスルホニルであり、
Ｒ２は連結基であり、
Ａは、ＮＲ５、ＮＲ５ＮＲ６、Ｏ又はＳＲであり（式中、Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びアリールから選択される）、
ＳｙｌＯはシアリル基であり、
ｎは１〜１００であり、ｍは０〜１００であり、
Ｒ３は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、細胞膜若しくは細胞壁成分、又はドラッグデリバリーシステムであり、
Ｒ４は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、アルキル基、アシル基、薬物、又はドラッグデリバリーシステムである）
を有する。
【００１５】
化合物Ｉ〜ＩＩＩ中に存在するＮＨＳ基及びエステル結合と共に連結基、すなわちＲ２は、一般的に、化合物を合成するのに用いられる二官能性ＮＨＳ試薬に由来する構造を形成する。好適な二官能性試薬を本願の後半で挙げる。合成中、ＰＳＡ出発物質に由来するＡで表示される基は、（反応しないＮＨＳ基と反対の末端における）ＮＨＳ試薬からの対応する脱離基の欠失、又は代替的に試薬の構造的再配置を伴って、それ自体を二官能性試薬の適切な末端に結合させる。通常、連結基Ｒ２は、式Ｉ〜式ＩＩＩの化合物中でＡと結合するカルボニルと共に、アルカン−ジイル基を含む。好ましくは、Ｒ２はＣｐＨ２ｐＣＯ（式中、ｐは２〜１２である）である。代替的に、連結基は、アルカン炭素原子の１つがＡ基と結合しているアルカンジイル基を含み得る。Ｒ２としては、例えば、ＰＳＡ試薬又はＮＨＳ試薬の予備誘導体化反応に由来する、中鎖エステル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合及び／又は１−チオ−Ｎ−スクシンイミジルアミン結合が挙げられ得る。Ｒ２は、アルキレンオキシアルキレン基又はアルキレンオリゴオキシアルキレン基であってもよい。
【００１６】
Ａは好ましくは、第１級アミンＰＳＡ出発試薬に由来するＮＲ５（式中、Ｒ５は水素である）である。このようなアミンＰＳＡ誘導体、及びそれらを製造する方法の例を以下に示す。
【００１７】
１つの実施の形態において、末端シアル酸ユニットは、マレイミド基を含有する試薬と結合し得る有用な官能基を生成する予備化学反応に供される。
【００１８】
１つの実施の形態において、ＮＨＳ基を連結し得る官能基を生成する予備工程として、アルデヒド基を生成する、本文献で前に開示した化学反応を使用することが便利であることを見出した。
【００１９】
本発明は、新規の化合物を製造するプロセスを含む。必要に応じて末端シアル酸ユニット（複数可）の予備誘導体化工程（複数可）の後で、官能基の一方がＮＨＳエステルであり、且つ官能基の他方がシアル酸ユニット（複数可）又はその誘導体（複数可）と反応性である二官能性試薬と、場合によっては、試薬と末端シアル酸基（複数可）又はその誘導体の２位又は７位炭素とを共有結合させると共に、ＮＨＳ基が変化しないような条件下で、ＰＳＡ基質を反応させる、上記新規の化合物を合成する新規のプロセスも提供する。
【００２０】
好ましい実施の形態において、基質中のシアル酸ユニットは、アミン基を生成する予備工程に供される。
【００２１】
誘導化されるシアル酸ユニットが、還元性末端ユニットである場合、予備工程は、アノマー炭素におけるアミン化、又は好ましくは一連の
ａ）ビシナルジオール基を形成するために、前記還元性末端シアル酸ユニットを開環する還元工程と、
ｂ）アルデヒド基を形成するための、工程ａ）で形成された前記ビシナルジオール基の選択的酸化工程と、
ｃ）例えばシアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏ ｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）を用いたアンモニウム化合物との還元アミノ化による工程ｂ）のアルデヒドのアミノ基への変換工程と、
ｄ）工程ｃ）による前記アミノ基を、過剰量のホモ二官能性ＮＨＳ試薬と反応させる工程と
を含み得る。
【００２２】
このプロセスに用いられる還元性末端シアル酸基を有する出発基質物質は好ましくは、８位炭素原子を介して隣接ユニットと結合するシアル酸ユニットを還元性末端に有する。工程ｂ）において、末端シアル酸の還元的開環の後、還元性末端の６，７−ジオール基を酸化して、７位炭素原子にアルデヒド基を形成し、続いてアミノ基の導入（工程ｃ）及びＮＨＳ基の導入（工程ｄ）を行う。
【００２３】
代替的な実施の形態において、還元性末端におけるシアル酸ユニットは、９位炭素原子を介して隣接するユニットと結合し、工程ｂ）において、工程ａ）中に形成された還元性末端のＣ−７及びＣ−８のジオール基を酸化して、８位炭素原子にアルデヒド基を形成した後、アミノ基を形成し（工程ｃ）、その後ＮＨＳ基を形成する（工程ｄ）。
【００２４】
１つの好ましい実施の形態によれば、出発物質は、還元性末端にシアル酸、また非還元性末端にビシナルジオール基を有する末端シアル酸ユニットを有するＰＳＡである。このプロセスの第１の工程（工程ａ）において、還元反応をポリサッカライドの還元性末端において行い、ビシナルジオールを提供するように開環する。還元工程中、非還元性末端におけるビシナルジオール官能基は修飾されることなく、原型を保っている。第２の工程は酸化（工程ｂ）であり、このプロセス中、非還元性末端及び還元性末端におけるビシナルジオールは酸化されて、アルデヒド基を形成する。工程ｃにおいて、アルデヒドがアミン化され、工程ｄにおいて、ＮＨＳ基が結合する。結果として、生成物は、２つのＮＨＳ基を有する二官能性となり、また、還元性末端及び非還元性末端において両方のＮＨＳ基を含む適切に官能化された基質による反応により基質を架橋することができる能力に由来する、有用な治療活性を有し得る。
【００２５】
還元性末端シアル酸がアミン化するプロセスの別の好ましい実施の形態によれば、非還元性末端に末端シアル酸も有するシアル酸出発基質物質は、以下の：
ｅ）非還元性末端シアル酸ユニットをＣ−７及びＣ−８のビシナルジオール基において酸化し、Ｃ−７にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と、
ｆ）Ｃ−７のアルデヒド基を対応するアルコールへと還元するための還元工程と
に供される。この工程はまた同時に、還元性末端のシアル酸環を還元的に開環する、すなわち、工程ａ）と同時に行われる。本発明のこの態様は、「不動態化された」シアル酸非還元性末端を有するシアル酸誘導体を提供し、過ヨウ素酸塩による酸化（工程ｂ）及び還元アミノ化（工程ｃ）を介して還元性末端を活性化させる。
【００２６】
本発明のさらなる実施の形態によれば、非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発物質が、以下の：工程ｅ）非還元性末端シアル酸ユニットをＣ−７及びＣ−８のビシナルジオール基において酸化し、７位炭素原子上にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と；工程ｃ）アンモニウム化合物との還元アミノ化による、工程ｅ）のアルデヒド基のアミノ基への変換工程と、そして；工程ｄ）得られるアミノ基の修飾工程とに供される、新規のプロセスを提供する。
【００２７】
本発明のこの実施の形態において用いられる出発物質は好ましくは、隣接するユニットの８位炭素原子を介して隣接するユニットと結合する非還元性末端にシアル酸ユニットを有するべきである。工程ｅ）において、Ｃ−７及びＣ−８のジオール基は酸化されて、後にアミノ基（工程ｃ）及びＮＨＳ基（工程ｄ）に変換されるアルデヒド基を７位炭素原子に形成する。
【００２８】
代替的な実施の形態において、非還元性末端のシアル酸ユニットが、隣接するユニットの９位炭素原子を介して隣接するユニットと結合する場合、工程ｂ）において、この隣接する基のＣ−７及びＣ−８のジオールは酸化され、アミノ基（工程ｃ）及びＮＨＳ基（工程ｄ）で置換されるアルデヒド基を８位炭素原子上に形成する。
【００２９】
上記酸化工程（ｂ及びｅ）は好ましくは、実質的な長鎖高分子骨格の出発物質の中鎖開裂も、その後の実質的な分子量減少も生じない条件下で行われるべきである。この酸化工程を実施し得る酵素を用いてもよい。より便宜的には、酸化は化学酸化である。反応は、高分子系過ルテニウム酸塩等の固定化試薬を用いて、又は試薬溶液を用いたより直接的な方法によって行うことができる。酸化剤は好適には、過ルテニウム酸塩、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩を用いて、５〜１０のｐＨ範囲、０〜６０℃の温度範囲、１分〜４８時間の範囲の時間で行い得る。
【００３０】
工程ａ）及び工程ｆ）の好適な還元条件は、触媒と共に水素、すなわち好ましくは水素化ホウ素等の水素化物を利用し得る。これらは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅにより支持される水素化ホウ素のように固定化されていてもよい。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物は、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲、６．５〜１０のｐＨ範囲、０〜６０℃の温度範囲、１分〜４８時間の期間で還元剤として用いられる。反応条件は、ＰＳＡ出発物質のペンダント型カルボキシル基が還元されないように選択される。予備酸化工程を（すなわち、非還元性末端において）行う場合、生成されるアルデヒド基が、ビシナルジオール基の一部ではないアルコール基に還元される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でシアノ水素化ホウ素、例えば、高分子により支持されるシアノ水素化ホウ素、又はアルカリ金属シアノ水素化ホウ素、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ（商標）、トリアセトキシ水素化ホウ素等である。
【００３１】
反応の様々な工程（例えば、還元及び酸化）中、各中間体は、次の工程にかけられる前に、酸化剤及び還元剤、架橋剤、並びにＮａＣＮＢＨ３、シスタミン等の他の試薬から単離する必要がある。工程が溶液相中で行われる場合、単離は、エチレングリコールを用いた酸化剤の過剰量の消費、エタノール沈殿、ポリサッカライドの透析、サイズ排除クロマトグラフィ、及び水溶液を濃縮するための限外ろ過等の、従来の技術によるものであり得る。還元工程による混合生成物を再度、透析及び限外ろ過によって分離してもよい。生成物の単離を容易にする固定化された酸化試薬及び還元試薬により実行される反応を考案することができる。
【００３２】
中間体アミン化合物を生成し、その後二官能性ＮＨＳ試薬と反応させる本発明のプロセスにおいて、ＮＨＳ基はアミン基と反応性であるため、ホモ二官能性ＮＨＳ試薬を用いることが便利である。このような試薬の２つのＮＨＳ基が等しく反応性である場合、架橋度を最小にするためにかなり過剰な量の試薬を用いる必要があり、この架橋は、アミン中間体の２つの分子とジ−ＮＨＳ試薬の１つの分子との反応を含む。反応はまた、第２のＮＨＳ基が変わらず残るような条件下で行う必要がある。反応生成物は、過剰量の未反応のＮＨＳ試薬から分離可能でなければならない。
【００３３】
ＮＨＳ基は水中でかなり不安定である。そのため、反応条件は、ＮＨＳ試薬と、水又は他のプロトン性溶媒との接触を最小限にしなければならない。好ましくは、反応は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行われる。基質を溶解するために、少量の水、又は他のプロトン性溶媒及び極性溶媒を含む必要がある場合がある。この量は、最小、例えば、全溶媒の１０％未満に維持されるべきである。試薬の可溶化を最適なものとし、且つ反応を促進させるため、温度を上げることが望ましい場合があるが、但し、これによって、望ましくない基質の酸化又は開裂等の化学修飾が為されることはない。
【００３４】
さらなる実施の形態において、工程ａ）及び工程ｂ）、並びに／又は工程ｃ）によって生成されるアルデヒド末端化中間体はヒドラジンと反応し、ヒドラゾン中間体を形成する。ヒドラゾン基は、ＮＨＳ基と反応性である。二官能性ＮＨＳ試薬が反応する本発明のプロセスの必須工程において、このＮＨＳ試薬は便利にはジ−ＮＨＳ化合物である。上記のアミン中間体における反応と同じ注意を守らなければならない。反応スキームはスキーム８ａ）として示される。
【００３５】
好適なジ−ＮＨＳ試薬は、
ビス［２−スクシンイミジルオキシカルボニル−オキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）及びそのスルホ類似体、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）（ＢＳ３）、
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、
ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、
ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）又はそのスルホ類似体、
３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、並びに
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）及びそのスルホ類似体である。
【００３６】
該プロセスの代替的な実施の形態によれば、基質におけるアミン基の形成を含む予備工程の代わりに、チオール基が好ましくは１つの末端シアル酸ユニットに、代替的には、末端シアル酸ユニット及び反対末端の末端ユニットに提供され、シアル酸又は別の糖残基になり得る予備工程が提供される。
【００３７】
チオール基は、例えば、シスタミンとアルデヒド基とを反応させた後、還元することによって形成される。アルデヒド基は、それぞれの末端基を有する出発物質において工程ａ）及び工程ｂ）、並びに／又は工程ｅ）を行うことによって、１つ又は両方の末端ユニットに導入することができる。出発物質は付加的に、シスタミンとの反応のためにアルデヒドに変換され得るビシナルジオール基を有する非還元性末端の糖を有し得る。代替的には、このような末端基は後の酸化工程、それから還元工程によって不活性化され、二官能性チオール中間体の形成を阻害し得る。チオール化は、Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ他によって記載されている一般的な手法を用いて行われる。
【００３８】
チオール基は、代替的に、工程ａ〜工程ｃにおいて上記で生成されるアミン中間体上で行われる一連の工程において導入され得る。チオール基は、アミン基と、チオール化シアル酸ユニットを含む２−イミノチオラン（２−ＩＴ）（Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ａ．他（前掲））との反応によって導入される。
【００３９】
チオール基を含有する中間体は新規の化合物であり、本発明のさらなる態様を示す。当該化合物は、以下の一般式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩ
【００４０】
【化２】
【００４１】
（式中、
Ｒ７は連結基であり、
Ａ１はＮＲ１２（式中、Ｒ１２はＨ、Ｃ１〜４アルキル又はアリールである）であり、
ＧｌｙＯはグリコシル基であり、ｋは０〜１００であり、
Ｇｌｙ１Ｏは、ペンダント型カルボン酸基上で必要に応じて誘導体化されるグリコシル基であり、Ｒ８は、モノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリサッカライド基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、ドラッグデリバリーシステム、又は細胞膜若しくは細胞壁の成分であり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ、水素、又はモノ−、ジ−、オリゴサッカライド基、アルキル基、アシル基、薬物、脂質又はドラッグデリバリーシステムであり、
Ｒ１０は、モノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリサッカライド基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、ドラッグデリバリーシステム、又は細胞膜若しくは細胞壁の成分、
又は基
【００４２】
【化３】
であり、
【００４３】
【化４】
【００４４】
（式中、Ｒ１３及びＲ１４の一方は水素であり、他方はモノ−、ジ−若しくはオリゴサッカライド基、アルキル基、アシル基、薬物、脂質又はドラッグデリバリーシステムである）である）
で表され得る。
【００４５】
連結基Ｒ７は、上記に列挙されるＲ２と同じ基から選択される。
【００４６】
Ｒ８及びＲ９の定義は好ましくは、それぞれＲ３基及びＲ４基の好ましい定義として上記されたのと同じである。ＧｌｙＯは好ましくはＳｙｌＯである。
【００４７】
ＧｌｙＯがＳｙｌＯであるチオール中間体は、本発明の第１の態様のプロセスの必須工程において、チオール反応性官能基並びにＮＨＳ基を有するヘテロ二官能性リンカーと反応する。このようなチオール反応性基は、例えば、Ｎ−マレイミド基、又はチオピリジルジチオ基、ビニルスルホン基若しくはＮ−ヨードアセトアミン基である。好適な二官能性試薬の例は、
Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、
Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、
Ｎ−（ξ−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、又はそのスルホ類似体、
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＨＣＣ）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−６−（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、
Ｎ−（ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、
スクシンイミジル−６−［３−２（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）又はそのスルホ類似体、
４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）又はそのスルホ−ＬＣ類似体、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル［４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、
スクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、及び
Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）及び
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）又はそのスルホ類似体である。
【００４８】
一般的に用いられる反応の反応条件はまた、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９５）を参照して、本明細書で用いられるものであり得る。
【００４９】
上記ＮＨＳヘテロ二官能性試薬は、その水溶性、及び、複合体が開裂性か又は非開裂性かに応じて選択され得る。好ましくは、短く且つ非免疫原性であるリンカーを有する試薬である。
【００５０】
ＮＨＳ試薬との反応は通常、０〜１００％ＤＭＳＯ溶液中（好ましくは最少量の水、例えば１０％を用いて）０〜１５０℃、好ましくは２０℃の温度で行われる。中間体上のシアル酸基質は、加熱、例えば、音波処理又はマイクロウェーブによって、好ましくは不活性環境下で溶解され得る。生成物の続く使用における有機溶媒の存在に耐性がない場合には、水溶性ＮＨＳ試薬を用いることができる。また、生成物から除去されていない未反応の試薬がいずれも細胞膜を透過しない可能性があるため、生成物の使用が細胞表面結合に関する場合には、水溶性ＮＨＳ試薬が好ましいであろう。
【００５１】
本発明において、出発物質はポリシアル酸（ＰＳＡ）である。このような化合物は、分子中にシアル酸以外のユニットを含んでいてもよい。例えば、シアル酸ユニットが他のサッカライドユニットと交互に配列されていてもよい。しかしながら、好ましくは、ポリサッカライドは実質的に、アルファ−２，８及び／又はアルファ−２，９結合しているシアル酸のユニットのみから成ることが好ましい（ポリシアル酸（以後、ＰＳＡ））。
【００５２】
出発物質は、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０のシアル酸ユニットを有する。ＰＳＡは、いずれの供給源、好ましくは、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１又はＫ９２、Ｂ群髄膜炎菌）、又は牛乳若しくはＮ−ＣＡＭ等の自然源に由来するものであってもよい。シアル酸ポリマーは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１３５群又はＶ群等のヘテロ多量体ポリマーであってもよく、又は化学合成されていてもよい。ＰＳＡは、塩又は遊離酸の形態であってもよい。それは、分子量が減少された後、細菌源により回収されるような加水分解形態であってもよい。ＰＳＡは、１．０１、実際は２以上と同程度もの多分散性を有するような狭いか又は広範な分子量を有する物質であってもよい。好ましくは、使用されるＰＳＡの分子量の多分散性は、１．２未満である。
【００５３】
天然型の、上記の種類の中間体としての、又は広い分子量分布を有する最終生成物であるいずれかのＰＳＡ群は、より低い多分散性を有する画分、すなわち、様々な平均分子量を有する画分に分画され得る。分画は好ましくは、溶出のために好適な塩基バッファーを用いたアニオン交換クロマトグラフィによって行われる。好適なアニオン交換媒体、すなわち、第４級アンモニウムイオンペンダント基（すなわち、強塩基）を有する、活性化されたアガロースに基づく強イオン交換物質等の分離用媒体を見出した。溶出バッファーは非反応性であり、所望の生成物を各画分の塩基から蒸発によって回収し得るように、好ましくは揮発性である。好適な例は、トリエタノールアミン等のアミンである。回収は、例えば、凍結乾燥によるものであってもよい。分画方法は、他のＰＳＡ誘導体に対するのと同様に、ＰＳＡ出発物質についても好適である。このため、この技術は、本発明の必須のプロセス工程の前後いずれでも適用することができる。
【００５４】
好ましくは、分画のプロセスは、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を用いて、また溶出バッファーとして好ましくは揮発性である塩基又は酸を用いて、好ましくは５ｋＤａより大きい分子量（Ｍｗ）を有するイオン性の群に関して実施される。好ましくは、ＰＳＡはカルボン酸基を有し、イオン交換はアニオン交換である。好ましくは、溶出バッファーはトリエタノールアミン等のアミンを含み、ＰＳＡの回収は好ましくは溶出画分を凍結乾燥することによるものである。
【００５５】
本発明のＰＳＡ−ＮＨＳ化合物は、例えば、生物学的に有用な化合物であるアミンを誘導体化するための続くプロセスにおいて使用することができる。このような反応は、好ましくはリン酸、炭酸水素／炭酸、ＨＥＰＥＳ又はホウ酸バッファー中で、好ましくは５〜２００ｍＭの濃度で行われ得る。第１級アミンを含有していなければ、他のバッファーを使用してもよい。例えば、第３級アミンのみを含有しているため、ＨＥＰＥＳを使用することができる。中性ｐＨから塩基性ｐＨまでの大過剰量のトリス／グリシンを、クエンチする反応の終わりに添加してもよい。反応は好ましくは、ｐＨ７〜９、４℃〜２０℃で３０分〜２時間行われ得る。ＰＳＡ−ＮＨＳ化合物は、アミンの濃度に応じて、タンパク質（又は他の誘導性化合物）に対して２〜５０倍過剰モルで用いられ得る。通常、ＰＳＡ−ＮＨＳ化合物の濃度は好ましくは、０．１〜１０ｍＭで変動し得る。より希薄なタンパク質溶液が、ＰＳＡ−ＮＨＳ化合物のＮＨＳ基を過剰に加水分解することから、アミン、例えば、タンパク質の濃度が好ましくは、約１０〜１００μＭに維持され得る。
【００５６】
生成物であるＮＨＳ化合物は、アミン基が好適にリジンのイプシロンアミン基又はＮ末端アミノ基である、アミン基を含有するタンパク質を誘導体化するため特に価値がある。この生成物は、タンパク質又はペプチドの治療活性剤、例えばサイトカイン、成長ホルモン、酵素、ホルモン及び抗体又はそれらのフラグメント等を誘導体化するために特に価値がある。代替的に、このプロセスは、例えば、ＮＨＳ基をリポソーム形成成分のアミン基と反応させることによって、リポソーム等のドラッグデリバリーシステムを誘導体化するのに用いることができる。他のドラッグデリバリーシステムは、米国特許第５８４６９５１号（Ａ）に記載されている。誘導体化され得る他の物質としては、ウイルス、微生物、細胞（例えば、動物細胞）、合成ポリマー又はコポリマーが挙げられる。
【００５７】
本発明はまた、新規の化合物が、ＮＨＳ基とアミン基との反応に好適な条件下で、誘導性アミン基を有する生物学的関連化合物と反応して、共有結合体を形成する方法を提供する。生物学的関連分子は好ましくはペプチド又はタンパク質であり、アミン基はＬｙｓユニットの側鎖上にあるか、又はペプチド若しくはタンパク質のＮ末端に存在する。誘導体化度は１．０未満であってもよいが、好ましくは少なくとも１．０、例えば少なくとも１．５であり、このことはすなわち、生物学的に活性な化合物の各分子が少なくとも１つのＰＳＡ基質部分と結合することを示す。
【００５８】
新規のＰＳＡ化合物との反応によるタンパク質及びドラッグデリバリーシステムの誘導体化は、半減期を増大させ、安定性を高め、免疫原性若しくは抗原性を低減し、且つ／又は溶解性及びそれゆえ生物学的利用能及び薬物動態特性を制御し得るか、又は活性剤の溶解性、若しくは誘導体化された活性剤を含有する溶液の粘度を改良し得る。
【００５９】
新規の好ましい単官能性ＰＳＡ−ＮＨＳは反応性が高く、修飾されていない還元性末端を有するＰＳＡ形態の使用により生成され得るかなりの複雑さ（図２）を回避することから、薬学的に許容可能な生成物の合成及び製造をより促進させる。ポリマーの新規な形態の生成（図５）は、好ましくは過ヨウ素酸塩による選択的酸化（工程ｅ）を伴い（前述のセクションを参照のこと）、アルデヒド官能基を非還元性末端に導入した後、還元アミノ化し（工程ｃ）、縮合してＮＨＳ官能性を形成する（工程ｄ）。しかしながら、図１に例示された従来技術とは異なり、このアルデヒド部分は、例えば水素化ホウ素による還元によって破壊される場合がある（工程ａ）。ポリマーの他の末端において、水素化ホウ素による還元工程はまた、ヘミケタールを還元することによって同時に還元性末端の環構造の開環を固定する。ケトンのこのヒドロキシル部分への同時還元は、第２の酸化工程における選択的酸化に適する新たなジオール官能性を還元性末端に導入する。天然ポリマーを（首尾良く）過ヨウ素酸塩で酸化し、水素化ホウ素で還元し、過ヨウ素酸塩で２回目の酸化を行い、ＮＨＳ化合物を形成するようにアミノ化及び結合させる場合、厳密に単官能性であり、先に還元される末端にのみ１つの反応性基（すなわち、ＮＨＳ基）を有する新規なポリマー形態が生成される（図５）。
【００６０】
様々な誘導体の縮合によるタンパク質反応性のスキームを図９及び図１０に記載する。単官能性ＰＳＡは、最も外側の非還元性末端を用いて、タンパク質と、単一方向にしか結合を引き起こすことなく、また意図せずにタンパク質を架橋することはない。この新規の反応（図５）方法のスキームは、（図２に記載されるように）意図される生成物を様々な意図されるものではない生成物から精製する必要性を回避する。この意図されるものではない生成物はこの新規の反応スキームにおいて完全に回避される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ａ】非還元性シアル酸末端ユニットの従来技術による活性化を示す反応スキームである。
【図１ｂ】タンパク質−アミン部分を用いた、反応スキーム１ａの生成物のアルデヒド部分の従来技術による還元アミノ化を示す反応スキームである。
【図２】副次反応による、可能性のある副生成物を概略的に示す。
【図３】ケタールとＰＳＡの還元性末端シアル酸ユニットの閉環形態との間の互変異性を示す反応スキームである。
【図４】（非還元性末端がビシナルジオールを有さない場合に）還元性末端誘導体化ＮＨＳコロミン酸の調製を示す。
【図５】還元性末端誘導体化ＮＨ２−ＣＡコロミン酸（ビシナルジオールは非還元性末端において除去される）の調製を示す。
【図６】ＣＡ−ＮＨＳ−タンパク質複合体の調製の一般的なスキームを示す。
【図７ａ】誘導体化チオールコロミン酸（非還元性末端にＣＡ−ＳＨ）の調製を示す。
【図７ｂ】ＮＨＳ−マレイミドを用いたＣＡ−ＳＨを介するＣＡ−タンパク質結合の概略図を示す。
【図７ｃ】ＮＨＳ−マレイミド（ＡＭＡＳ）を用いたＣＡ−ＳＨを介するＣＡ−タンパク質複合体の調製を示す。
【図８ａ】還元性末端上のＮＨＳを介するＣＡ−タンパク質複合体の調製を示す。
【図８ｂ】ポリシアル酸の還元性末端のキャッピングを示す。
【図８ｃ】非還元性末端誘導体化ＣＡの調製を示す。
【図９】非還元性末端上のビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）を用いたＣＡ−タンパク質複合体の調製を示す。
【図１０】架橋剤であるＤＳＧを用いたＣＡ−タンパク質複合体の概略図を示す。
【図１１】実施例５にあるように分離されたＣＡについてのゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）のクロマトグラムを示す。
【図１２】ＣＡ−ＮＨＳ−成長ホルモン（ＧＨ）タンパク質結合反応（ＣＡ ３５ｋＤａ）に関するサイズ排除ＨＰＬＣを示す。
【図１３】ＣＡ−ＮＨＳ−ＧＨ複合体（ＣＡ ３５ｋＤａ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す。
【図１４】未反応のＣＡ及び反応したＣＡのネイティブＰＡＧＥを示す。
【図１５】実施例１０にあるようなＣＡＨ−ＮＨＳ反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１６】図１５の画分６のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６２】
実施例
材料
メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び分子量マーカーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（英国）から入手した。使用されるＣＡ、鎖状アルファ−（２，８）結合したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１ ＰＳＡ（平均２２．７ｋＤａ、多分散性（ｐ．ｄ．）１．３４；３９ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．４；１１ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．２７）はＣａｍｉｄａ（アイルランド）から入手した。他の物質は、２，４ジニトロフェニルヒドラジン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、英国）；透析チューブ（３．５ｋＤａ及び１０ｋＤａのカットオフ限界（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国））；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨｉＴｒａｐ、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国）；ＸＫ５０カラム及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）；トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（４〜２０％及び１６％）、トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー（Ｎｏｖｅｘ、英国）を含む。脱イオン水は、Ｅｌｇａｓｔａｔ Ｏｐｔｉｏｎ ４水精製ユニット（Ｅｌｇａ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）から得た。使用される全ての試薬は、分析用グレードである。プレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を、タンパク質又はＣＡアッセイにおける分光学的測定のために用いた。
方法
タンパク質及びＣＡ測定
シアル酸であるＣＡの定量評価は、別記されるように（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ他、１９９３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６及び１９９７）、レゾルシノール法（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９５７）によって行った。ＧＨはビシンコニン酸（ＢＣＡ）比色法によって測定した。
【００６３】
実施例１−ＩＥＣによるＣＡの分画（ＣＡ、２２．７ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．３４）（参照例）
ＸＫ５０カラムに９００ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ ＦＦを充填し、３カラム体積の洗浄バッファー（２０ｍＭトリエタノールアミン；ｐＨ７．４）を用いて、５０ｍｌ／分の流量で平衡とした。ＣＡ（２００ｍｌの洗浄バッファー中に２５グラム）をシリンジポートを介して５０ｍｌ／分でカラムに供給した。その後、１．５カラム体積（１３５０ｍｌ）の洗浄バッファーでカラムを洗浄した。
【００６４】
結合したＣＡを、１．５カラム体積の種々の溶出バッファー（０ｍＭ〜４７５ｍＭ ＮａＣｌを２５ｍＭのＮａＣｌ刻みで含むトリエタノールアミンバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４））、及び最終的に１０００ｍＭのＮａＣｌを含む同様のバッファーを用いて溶出し、全ての残余ＣＡ及び他の残余物（もしあれば）を除去した。
【００６５】
試料を、５ｋＤａの膜（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、英国）による高圧限外濾過によって２０ｍｌまで濃縮した。これらの試料を、４℃での限外濾過を繰り返すことにより、バッファーを脱イオン水に交換した。試料を、（実施例５で報告されるように）ＧＰＣ及び（アルシアンブルーで染色される（実施例８））ネイティブＰＡＧＥによって、平均分子量及び他のパラメーターについて分析した。上記の手順を用いて生成したＣＡの狭い画分を、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、ＧＰＣ及びネイティブＰＡＧＥにより、ポリマーへの総変化について分析した。
【００６６】
実施例２：ＣＡの活性化（参照例）
新たに調製した０．０２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４；ＣＡに対して６倍過剰モル）溶液を２０℃でＣＡと混合し、この反応混合物を暗所で１５分間、磁気攪拌させた。酸化させたＣＡを、７０％（最終濃度）エタノールを用いて、混合物を３０００ｇで２０分間遠心分離することによって沈殿させた。上清を除去し、ペレットを最小量の脱イオン水に溶解した。ＣＡを再度７０％エタノールで沈殿させた後、１２，０００ｇで遠心分離した。ペレットを最小量（ｑｕａｎｔｉｔｉｙ）の水に溶解し、凍結乾燥して、次に使用するまで−２０℃で保存した。
【００６７】
実施例３：ＣＡ及び誘導体の酸化状態の測定（参照例）
ＣＡの酸化度の定量評価は、カルボニル化合物との相互作用において、難溶性の２，４ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる２，４ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて行った。非酸化ＣＡ及び酸化ＣＡ（ＣＡＯ）（各５ｍｇ）を、２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に添加し、この溶液を振盪し、その後、結晶性沈殿が観察されるまで３７℃で放置した（Ｓｈｒｉｎｅｒ他、１９８０）。ＣＡの酸化度（定量的）は、アルカリ性溶液中のフェリシアニドイオンのフェロシアン化第二鉄（ペルシアンブルー）への還元に基づく方法（Ｐａｒｋ及びＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９）を用いて測定した（後で６３０ｎｍで測定する）。この例では、グルコースを標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）として用いた。
【００６８】
実施例４ａ：アミノコロミン酸（ＣＡ−ＮＨ２）の調製（参照例）
１０〜１００ｍｇ／ｍｌのＣＡＯを、５０ｍｌのチューブ内で３００倍過剰モルのＮＨ４Ｃｌを含む２ｍｌの脱イオン水に溶解した後、ＮａＣＮＢＨ４（１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中に５Ｍのストック）を最終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。この混合物を室温で５日間インキュベートした。ＣＡＯの代わりにコロミン酸を用いて対照反応物も準備した。生成物であるコロミン酸アミン誘導体を、５ｍｌの氷冷エタノールを添加することにより沈殿させた。沈殿物を４０００ｒｐｍで３０分間、室温で、卓上遠心機で遠心分離することにより回収した。ペレットはそのままにしておき、２ｍｌの脱イオン水で再懸濁した後、１０ｍｌの超遠心チューブ内で５ｍｌの氷冷エタノールを用いて再度沈殿させた。沈殿物を３０，０００ｒｐｍで３０分間、室温で遠心分離することにより回収した。ペレットを２ｍｌの脱イオン水で再懸濁し、凍結乾燥させた。
【００６９】
実施例４ｂ：アミン含有量の分析
ＴＮＢＳ（ピクリルスルホン酸、すなわち２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）分析を用いて、生成物中に存在するアミノ基の量を測定した（Ｓａｔａｋｅ他、１９６０）。
【００７０】
マイクロタイタープレートのウェル内で、ＴＮＢＳ（０．５μｌの１５ｍＭ ＴＮＢＳ）を９０μｌの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．５）に添加した。これに、１０μｌの５０ｍｇ／ｍｌのＣＡ−アミン溶液を添加した。このプレートを２０分間室温で放置した後、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。０．１〜１ｍＭの濃度範囲のグリシンを標準として用いた。ＴＮＢＳは第１級アミン基をトリニトロフェニル化する。アミンのＴＮＰ付加物が検出される。
【００７１】
冷エタノール二重沈殿（ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｌｄ−ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により精製された生成物をＴＮＢＳ分析を用いて試験すると、８５％に近い変換が示された。
【００７２】
実施例４ｃ：コロミン酸−ＳＨの調製
ＮＨ４Ｃｌの代わりに１００倍過剰モルのシスタミンを用いること以外は、実施例４ａに記載したのと同様に、酸化させたＣＡを還元アミノ化によってシスタミンで誘導体化した。この生成物を精製する前に、これを３７℃で１時間、５０ｍＭ ＤＴＴで処理した。還元された生成物を、エタノール二重沈殿及びｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｇ２５によるサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
【００７３】
別の実施例において、実施例４ａのように調製されたＣＡＮＨ２を、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を有する１０ｍＭ ＰＢＳに溶解する。５０倍過剰モルの２−イミノチオランを添加し、反応を２５℃で１時間続ける。未反応の２−イミノチオラートを、反応バッファーを用いて平衡にしたｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムによるゲルろ過によって除去する。
【００７４】
チオール含有量をエルマン分析を用いて評価する。１５μｌの試料を１５０μｌの０．１Ｍホスフェート、０．０８ｍｇ／ｍｌの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）と混合し、３０分間室温で反応させ、４０５ｎｍで読み取る。この生成物は図７ｂ及び図７ｃのスキームによる反応に好適である。
【００７５】
さらに、ポリマーのチオール含有量が６０％であることが分かった。
【００７６】
実施例４ｄ：ＣＡ−ＮＨＳの調製
上記の参照例４ａで合成したＣＡ−ＮＨ２（３５ｋＤａ）（１５〜２０ｍｇ）を０．１５Ｍ ＰＢＳ（３５０μＬ、ｐＨ７．２）に溶解し、次に、ＰＢＳ（１５０μＬ、ＰＨ７．２）に溶解した５０又は７５モル当量のＢＳ３を添加した。この混合物を５秒間ボルテックスにかけた後、３０分間２０℃で反応させた。ＣＡ−ＮＨＳ生成物を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いてＰＤ−１０カラムにより精製し、直ちにタンパク質及びペプチドのＮＨ２基との部位特異的結合に用いた。ＰＤ１０画分からのＣＡ濃度の測定を、レゾルシノール分析を用いてシアル酸含有量を分析することによって行った。ＣＡとＮＨＳとの反応溶液を２６０ｎｍで分析することによる紫外分光法によって、また２５４ｎｍでの可視化を伴う薄層クロマトグラフィによって、ＣＡポリマーにおけるＮＨＳ含有量を測定した。
【００７７】
上記の実施例４ａで合成したＣＡ−ＮＨ２（３５ｋＤａ）（１５〜２０ｍｇ）を、加熱（１００〜１２５℃）しながら、ＤＭＳＯ（３００〜２８５μＬ）を添加した最小量の水（５０〜６５μＬ）に溶解するか、又は９５％を超えるＤＭＳＯ（３５０μＬ）に溶解した。ＤＭＳＯ（１５０Ｌ）に溶解した７５モル当量のＤＳＧをＣＡ−ＮＨ２溶液に添加し、５秒間ボルテックスにかけた後、３０分間２０℃で反応させた。ＣＡ−ＮＨＳ生成物を、ジオキサンによる沈殿（×２）によって、又は溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いたＰＤ−１０カラムによって精製し、直ちにタンパク質及びペプチドのＮＨ２基との部位特異的結合に用いた。前述のように、ＰＤ１０画分からのＣＡ濃度の測定を、レゾルシノール分析を用いて行った。紫外分光法（２６０ｎｍ）によって、また薄層クロマトグラフィ（２５４ｎｍ）によって、ＣＡポリマーにおけるＮＨＳ含有量を測定した。
【００７８】
実施例５：ＣＡ試料のゲル浸透クロマトグラフィ（参照例）
ＣＡ（３５ｋＤａ）試料をＮａＮＯ３（０．２Ｍ）及びＣＨ３ＣＮ（１０％；５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２×ＧＭＰＷＸＬカラム上で、屈折率を検出しながらクロマトグラフィを行った（ＧＰＣシステム：ＶＥ１１２１ ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０ ＲＩ検出器及びＴｒｉｓｅｃ３ソフトウェア（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ）による照合）。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を、０．４５μｍナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ ＮａＮＯ３及びＣＨ３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／分で流した（図１１）。
【００７９】
実施例６：（ＢＳ３及びＤＳＧを用いた）ＣＡ−ＮＨＳ−タンパク質複合体の調製
炭酸水素ナトリウムに溶解したＧＨ（２３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、過剰量のＢＳ３を用いて実施例４ｂからのＣＡ−ＮＨＳ（３５ｋＤａ）と共有結合させた。２５：１又は５０：１のＣＡ−ＮＨＳ：ＧＨのモル比を用いて０．１５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２、１．５ｍｌ）中で３０分間、２０℃で反応を行った。ポリシアリル化させたＧＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィにより測定された結合収量を用いて特徴付けた。対照は、天然のタンパク質を、ＣＡ−ＮＨＳの非存在下でＢＳ３を用いた結合手順にかけることを含むものであった。ＣＡ−ＮＨ２をまた、天然のＧＨの非存在下でＢＳ３を用いた結合手順にかけた。
【００８０】
炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．４）に溶解したＧＨをＣＡ−ＮＨＳ（３５ｋＤａ）に共有結合させ、これを、実施例４ｂに記載したように過剰量のＤＳＧを用いて調製した。５０：１のＣＡ−ＮＨＳ：ＧＨのモル比を用いて０．１５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２、１．５ｍｌ）中で３０分間、２０℃で反応を行った。ポリシアリル化させたＧＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィにより測定された結合収量を用いて特徴付けた。対照は、天然のタンパク質を、ＣＡ−ＮＨＳの非存在下でＤＳＧを用いた結合手順にかけることを含むものであった。
【００８１】
実施例７．ＣＡ−ＮＨＳ−ＧＨ複合体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ
ＣＡ−ＧＨ複合体を炭酸水素アンモニウムバッファー（０．２Ｍ、ｐＨ７）に溶解し、ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上で、紫外線指数により検出しながら（Ａｇｉｌｅｎｔ、１０／５０システム（英国））クロマトグラフィを行った。試料（１ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍナイロン膜で濾過し、１７５μｌを注入し、移動相として炭酸水素アンモニウムバッファーを用いて０．２５ｃｍ／分で流した（図１２）。
【００８２】
実施例８．ＣＡ及びＣＡ−ＧＨ複合体のＳＤＳ及びネイティブＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＭｉｎｉＧｅｌ、Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｇｅｌ Ｕｎｉｔ、型式 ＶＧＴ １、電源型式 Ｃｏｎｓｏｒｔ Ｅ１３２（ＶＷＲ、英国））を、ポリシアリル化におけるＧＨの分子サイズの変化を検出するために使用した。反応混合物からの０分（対照）及び３０分の試料におけるＧＨ及びその（ＣＡ−ＮＨＳとの）複合体、並びにプロセスの対照（非酸化ＣＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。この試料を幅広い分子量マーカーに対して較正した（図１３及び図１４）。
結果
ＣＡ（２２．７ｋＤａ）及びその誘導体を、１．１未満の多分散性、４６ｋＤａまでの平均分子量、及び種々の％割合を有する様々な狭い種（ｎａｒｒｏｗ ｓｐｅｃｉｅｓ）に、首尾よく分画した。表２は２２．７ｋＤａの物質を分離した結果を示す。
【００８３】
【表１】
【００８４】
このプロセスは、各スケールでほとんど同一の分画プロフィールを有する、１ｍｌから９００ｍｌまでのマトリックスに拡大縮小可能である（全ての結果は示していない）。
【００８５】
より大きなポリマー（ＣＡ、３９ｋＤａ、ｐ．ｄ． １．４）の分画は、９０ｋＤａまでの種を生じる。このプロセスは、大きなバッチのポリマーの分画にさえ、首尾よく用いることができる。この結果は、イオン交換画分が狭く分散することを示す。これは、ＧＰＣのデータと一致する。
【００８６】
全ての狭い画分は、２０ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて首尾よく酸化され、製造プロセスの種々の段階から採取され且つＧＰＣ及びネイティブＰＡＧＥにより分析された試料は、分子量及び多分散性における変化を示さなかった。
【００８７】
ＣＡ、すなわちＰＳＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の鎖状アルファ−２，８結合したホモポリマーである（図１ａ）。
【００８８】
ＣＡの酸化状態の定量測定は、グルコースを標準として用い、アルカリ性溶液中でフェリシアニドイオンをフェロシアン化物（プルシアンブルー）に還元する（Ｐａｒｋ及びＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９）ことにより行われた。酸化されたＣＡは、天然のポリマーと比較して１００ｍｏｌ％近い見かけのアルデヒド含有量を有することが見出された。フェリシアニドを用いた酸化プロセスにおけるＣＡ中間生成物の定量分析の結果は、天然のＣＡと共に淡黄色の沈殿物を生じ、ポリマーのアルデヒド含有形態と共に濃橙色を生じ、且つ室温での１０分間の反応後に濃橙色沈殿を生じる、２，４−ＤＮＰＨを用いて行われる定性試験の結果と一致する。
【００８９】
過ヨウ素酸塩及びボロヒドリド処理後の内部のアルファ−２，８結合したＮｅｕ５Ａｃ残基の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をＧＰＣによって分析し、酸化した（ＣＡＯ）、アミノＣＡ（ＣＡ−ＮＨ２）、ＣＡ−ＮＨＳ物質について得られたクロマトグラフを、天然のＣＡのものと比較した。ＣＡは全て、ほとんど同一の溶出プロフィールを示すことが見出され（図１２）、種々の工程が、ポリマー鎖の顕著なフラグメント化又は（ＣＡ−ＮＨＳの場合には）架橋を引き起こす証拠は何もない。小さなピークは緩衝塩を示す。
【００９０】
ＣＡ−ＧＨ複合体の形成をＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＤＳＧとのこの結合反応に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、遊離ＧＨが残存しないこと、及びこの結合反応が完了したことが示された。これはＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認されたため、遊離ＧＨの予測溶出時間前にＣＡ−ＧＨ複合体を溶出した（遊離ＧＨのピークは観測されなかった）。一方、ＢＳ３を用いたＧＨへのＣＡ−ＮＨ２の結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は遊離ＧＨの存在を示し、これは、７０分付近で遊離タンパク質の溶出ピークを示したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって確認された。
【００９１】
結果（図１３）により、複合体レーンでは、ＧＨに比べてポリシアリル化されたＧＨを示す質量の増大を典型的に示すバンドシフトが存在することが示される。さらに、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってＧＨ複合体を様々な種に分離した。
【００９２】
実施例９：コロミン酸ヒドラジド（ＣＡＨ）の調製（参照例）
４００μｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中で２時間、２５℃で、５０ｍｇの酸化されたコロミン酸（１９ｋＤａ）を２．６ｍｇのヒドラジン（液体）と反応させた。次に、このコロミン酸を７０％エタノールで沈殿させた。この沈殿物を３５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に再溶解し、ＮａＣＮＢＨ３を５ｍｇ／ｍｌまで添加した。この混合物を４時間、２５℃で反応させた後、一晩凍結させた。移動相として０．１５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を充填したＰＤ１０カラム上のゲル浸透クロマトグラフィによって、ＮａＣＮＢＨ３及び反応副生成物を除去した。画分（各０．５ｍｌ）を（アミノ基に対して特異的であり、既述の）ＴＮＢＳ分析によって分析した。画分６、７、８及び９（ボイドボリューム画分）は、バックグラウンドよりもかなり強いシグナル（ｓｉｎｇａｌ）を有し、バックグラウンドはＮＨ４＋イオンの存在により高い値を示した。また、画分６、７、８及び９はコロミン酸を含有していた。これらの４つの画分を凍結乾燥し、ＣＡ−ヒドラジド（ＣＡＨ）を回収した。
【００９３】
実施例１０：コロミン酸ＮＨＳ（ＣＡ−ＮＨＳ）及びコロミン酸−タンパク質複合体の調製
１０ｍｇの１９ｋＤａであるＣＡ−ヒドラジドを９ｍｇのＢＳ３と、４００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３０分間、室温で反応させた。この反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を充填したＰＤ１０カラムに入れて、０．５ｍｌ画分を回収した。０．１ｍｇのＢＳＡを５〜９の各画分に加えた。室温で２時間後、画分をＢＳＡと反応させた。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ ＨＰＬＣで分析した。
【００９４】
これらの画分は、コロミン酸をわずかしか有していなかった。コロミン酸を多く含む画分（６及び７）は、他の試料及びＢＳＡにおいて存在するバンドに加えてタンパク質によるストリーク（ｓｔｒｅａｋ）を有し、これは結合の明らかな証拠である（図１５）。
【００９５】
画分６のＨＰＬＣクロマトグラムは、遊離タンパク質と比較して複合体の保持時間に大きなシフトが存在することを示し、これにより結合が裏付けられる（図１６ａ及び図１６ｂ）。
【００９６】
用いられるＢＳＡは不純物を含有する。ＢＳＡのピークは、５６分である（図１６ａ）。
【００９７】
５６分のピークに加えて、複合体であるより大きい種が存在する。８０分に大きいピークが存在し、このピークは、タンパク質と反応したためにＣＡ−ＮＨＳから放出されたＮＨＳである。遊離ＢＳ３を除去するゲル浸透クロマトグラフィカラムにＣＡＨを通したことから、このピークが遊離ＢＳ３である可能性はない。これは、ＣＡ分子上にＮＨＳエステル基が生成されたことを強く示唆している（図１６ｂ）。
参考文献
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアル酸ユニット由来の少なくとも１つの末端ユニットを有するポリシアル酸（ＰＳＡ）基質分子を含む化合物であって、必要に応じてリンカーを介して、シアル酸ユニットの２位又は７位炭素のいずれかで該ユニットと結合するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含む、化合物。
【請求項２】
各末端ユニットが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含むシアル酸ユニットに由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ
【化１】
（式中、Ｒ１はＨ又はスルホニルであり、
Ｒ２は連結基であり、
Ａは、ＮＲ５、ＮＲ５ＮＲ６、Ｏ又はＳであり（式中、Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びアリールから選択される）、
ＳｙｌＯはシアリル基であり、
ｎは１〜１００であり、ｍは０〜１００であり、
Ｒ３は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、細胞膜若しくは細胞壁成分、又はドラッグデリバリーシステムであり、
および
Ｒ４は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、アルキル基、アシル基、薬物、又はドラッグデリバリーシステムである）
を有する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、チオエステル結合、エステル結合、アミン結合又はアミド結合とみなされ得る任意のアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン、アルキルヘテロアリーレンから選択され、Ａが、ＮＲ５、すなわちＮＲ５基を介して前記分子の残りの部分と結合する連結基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
必要に応じて予備末端シアル酸誘導体化工程（複数可）の後で、官能基の一方がＮＨＳエステルであり、且つ官能基の他方が末端シアル酸ユニット（複数可）又はその誘導体（複数可）の２位又は７位炭素原子において反応性である、二官能性試薬と、場合によっては、該試薬と該シアル酸基（複数可）とを共有結合させると共に、該ＮＨＳ基が変化しないような条件下で、ＰＳＡ基質を反応させる方法。
【請求項６】
前記基質中の前記シアル酸ユニットが、アミン基を生成する予備工程に供される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シアル酸ユニットが還元性末端ユニットであり、前記予備工程が、一連の：
ａ）ビシナルジオール基を形成するために、前記還元性末端シアル酸ユニットを開環する還元工程と、
ｂ）アルデヒド基を形成するための、工程ａ）で形成された前記ビシナルジオール基の選択的酸化工程と、
ｃ）例えばシアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏ ｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）を用いたアンモニウム化合物との還元アミノ化による工程ｂ）のアルデヒドのアミノ基への変換工程と、
ｄ）工程ｃ）による前記アミノ基を、過剰量のホモ二官能性ＮＨＳ試薬と反応させる工程と
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発物質が、工程ｅ）該非還元性末端のシアル酸ユニットをＣ−７及びＣ−８のビシナルジオール基において酸化し、７位炭素原子上にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と、工程ｃ）アンモニウム化合物との還元アミノ化による、工程ｅ）のアルデヒド基のアミノ基への変換工程と、工程ｄ）得られるアミノ基の修飾工程とに供される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＨＳ試薬が、ビス［２−スクシンイミジルオキシカルボニル−オキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）（ＢＳ３）、
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、
ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、
ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）又はそのスルホ類似体、
３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、並びに
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）及びそのスルホ類似体から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＨＳ試薬との前記反応が、非プロトン性溶媒中で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質中の前記シアル酸ユニットが、チオール基を生成する予備工程に供される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＨＳ試薬が、
Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、
Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、
Ｎ−（ξ−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、又はそのスルホ類似体、
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）ｍ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＢＰ）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−６−（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、
Ｎ−（ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、
スクシンイミジル６−［３−２（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）又はそのスルホ類似体、
４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル［４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、
スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、及び
Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）及び
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）又はそのスルホ類似体から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１級アミン基を有する生物学的に有用な化合物を、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物と、又は請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法の生成物と、前記Ｎ−スクシンイミジルオキシ基が置換された後に残るアシル基で前記アミンの活性水素を置換する条件下で反応させる、誘導体化方法。
【請求項１４】
前記生物学的に有用な分子が、第１級アミン基がＮ末端であるか又はリジンユニットのγ−アミノ基である、タンパク質又はペプチドである、請求項１３に記載の誘導体化方法。
【請求項１】
シアル酸ユニット由来の少なくとも１つの末端ユニットを有するポリシアル酸（ＰＳＡ）基質分子を含む化合物であって、必要に応じてリンカーを介して、シアル酸ユニットの２位又は７位炭素のいずれかで該ユニットと結合するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含む、化合物。
【請求項２】
各末端ユニットが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含むシアル酸ユニットに由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ
【化１】
（式中、Ｒ１はＨ又はスルホニルであり、
Ｒ２は連結基であり、
Ａは、ＮＲ５、ＮＲ５ＮＲ６、Ｏ又はＳであり（式中、Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びアリールから選択される）、
ＳｙｌＯはシアリル基であり、
ｎは１〜１００であり、ｍは０〜１００であり、
Ｒ３は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、細胞膜若しくは細胞壁成分、又はドラッグデリバリーシステムであり、
および
Ｒ４は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、アルキル基、アシル基、薬物、又はドラッグデリバリーシステムである）
を有する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、チオエステル結合、エステル結合、アミン結合又はアミド結合とみなされ得る任意のアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン、アルキルヘテロアリーレンから選択され、Ａが、ＮＲ５、すなわちＮＲ５基を介して前記分子の残りの部分と結合する連結基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
必要に応じて予備末端シアル酸誘導体化工程（複数可）の後で、官能基の一方がＮＨＳエステルであり、且つ官能基の他方が末端シアル酸ユニット（複数可）又はその誘導体（複数可）の２位又は７位炭素原子において反応性である、二官能性試薬と、場合によっては、該試薬と該シアル酸基（複数可）とを共有結合させると共に、該ＮＨＳ基が変化しないような条件下で、ＰＳＡ基質を反応させる方法。
【請求項６】
前記基質中の前記シアル酸ユニットが、アミン基を生成する予備工程に供される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シアル酸ユニットが還元性末端ユニットであり、前記予備工程が、一連の：
ａ）ビシナルジオール基を形成するために、前記還元性末端シアル酸ユニットを開環する還元工程と、
ｂ）アルデヒド基を形成するための、工程ａ）で形成された前記ビシナルジオール基の選択的酸化工程と、
ｃ）例えばシアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏ ｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）を用いたアンモニウム化合物との還元アミノ化による工程ｂ）のアルデヒドのアミノ基への変換工程と、
ｄ）工程ｃ）による前記アミノ基を、過剰量のホモ二官能性ＮＨＳ試薬と反応させる工程と
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発物質が、工程ｅ）該非還元性末端のシアル酸ユニットをＣ−７及びＣ−８のビシナルジオール基において酸化し、７位炭素原子上にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と、工程ｃ）アンモニウム化合物との還元アミノ化による、工程ｅ）のアルデヒド基のアミノ基への変換工程と、工程ｄ）得られるアミノ基の修飾工程とに供される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＨＳ試薬が、ビス［２−スクシンイミジルオキシカルボニル−オキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）（ＢＳ３）、
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、
ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、
ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）又はそのスルホ類似体、
３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、並びに
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）及びそのスルホ類似体から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＨＳ試薬との前記反応が、非プロトン性溶媒中で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質中の前記シアル酸ユニットが、チオール基を生成する予備工程に供される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＨＳ試薬が、
Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、
Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、
Ｎ−（ξ−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、又はそのスルホ類似体、
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）ｍ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＢＰ）又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−６−（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、
Ｎ−（ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、
スクシンイミジル６−［３−２（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）又はそのスルホ類似体、
４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル［４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、
スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、及び
Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）及び
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）又はそのスルホ類似体から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１級アミン基を有する生物学的に有用な化合物を、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物と、又は請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法の生成物と、前記Ｎ−スクシンイミジルオキシ基が置換された後に残るアシル基で前記アミンの活性水素を置換する条件下で反応させる、誘導体化方法。
【請求項１４】
前記生物学的に有用な分子が、第１級アミン基がＮ末端であるか又はリジンユニットのγ−アミノ基である、タンパク質又はペプチドである、請求項１３に記載の誘導体化方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１３−４９８６０（Ｐ２０１３−４９８６０Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２３０３２０（Ｐ２０１２−２３０３２０）
【出願日】平成２４年９月２８日（２０１２．９．２８）
【分割の表示】特願２００７−５５５６９６（Ｐ２００７−５５５６９６）の分割
【原出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０７０４２５４５）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月２８日（２０１２．９．２８）
【分割の表示】特願２００７−５５５６９６（Ｐ２００７−５５５６９６）の分割
【原出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０７０４２５４５）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
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