タンパク質光電変換素子、光電変換システム、タンパク質光電変換素子の製造方法、光電変換システムの製造方法およびタンパク質固定化電極
【課題】大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子およびその製造方法を提供する。
【解決手段】金電極１１上に金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質１２を固定化してタンパク質固定化電極を形成する。このタンパク質固定化電極を用いてタンパク質光電変換素子を製造する。このタンパク質光電変換素子をカラー撮像素子などの光電変換システムに用いる。
【解決手段】金電極１１上に金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質１２を固定化してタンパク質固定化電極を形成する。このタンパク質固定化電極を用いてタンパク質光電変換素子を製造する。このタンパク質光電変換素子をカラー撮像素子などの光電変換システムに用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、タンパク質光電変換素子、光電変換システム、タンパク質光電変換素子の製造方法、光電変換システムの製造方法およびタンパク質固定化電極に関する。この発明は、より詳細には、シトクロムｂ562 をベースとするタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子、光電変換システム、タンパク質光電変換素子の製造方法、光電変換システムの製造方法およびタンパク質固定化電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は半導体素子に代わる次世代の機能素子として期待されている。半導体素子の微細化は数十ｎｍのサイズが限界とされるなか、タンパク質は２〜１０ｎｍというはるかに小さいサイズで高度で複雑な機能を発揮する。
【０００３】
従来、タンパク質を用いた光電変換素子として、ウマ心筋シトクロムｃのヘムの中心金属の鉄を亜鉛に置換した亜鉛置換シトクロムｃを金電極に固定化したタンパク質固定化電極を用いたものが提案されており、このタンパク質固定化電極から光電流が得られることが示されている（特許文献１参照）。タンパク質を用いた光電変換素子としては、亜鉛置換シトクロムｃ５５２を金電極に固定化したタンパク質固定化電極を用いたものも提案されている（特許文献２参照）。
【０００４】
なお、シトクロムｂ562 については、大腸菌による発現・精製方法（非特許文献１参照）、立体構造（２５６Ｂ．ｐｄｂ、非特許文献２参照）、ヘムの抜き方（非特許文献３参照）、亜鉛ポルフィリンの入れ方（非特許文献４参照）、分子内へのキノンの入れ方（非特許文献５参照）、銀電極への固定化方法（非特許文献６参照）が報告されている。また、亜鉛置換シトクロムｃ５５２を用いた青色光の光電変換素子、修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２を用いた赤色光または緑色光の光電変換素子が提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２２０４４５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１９０６４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nikkila,H.,Gennis,R.B.,and Sliger,S.G.Eur.J.Biochem.202,309(1991)
【非特許文献２】Mathews,F.S.,Bethge,P.H.,and Czerwinski,E.W.J.Biol.Chem.254,1699(1979)
【非特許文献３】Itagaki,E.,Palmer,G.and Hager,L.P.J.Biol.Chem.242,2272(1967)
【非特許文献４】Hamachi,I.,Takashima,H.,Tsukiji,S.Shinkai,S.,Nagamune,T.andOishi,S.Chem.Lett.1999,551(1999)
【非特許文献５】Hay,S.,Wallace,B.B.,Smith,T.A.,Ghiggino,K.P.and Wydrzynski,T.Proc.Natl.Sci USA,101,17675(2004)
【非特許文献６】Zuo,P.,Albrecht,T.Baker,P.D.,Murgida,D.H.,and Hildebrandt,P.Phys.Chem.Chem.Phys.11,7430(2009)
【非特許文献７】Mennenga,A.,Gartner,W.,Lubitz,W.and Gorner,H.Phys.Chem.Chem.Phys.8,5444(2006)
【非特許文献８】Shih,C.,Museth,A.K.,Abrahamsson,M.,Blanco-Rodriguez,A.M.,Bilio,A.J.D.and 8 others,Science,320,1760(2008)
【非特許文献９】Yasutomi,S.,Morita,T.,Imanishi,Y.and Kimura,S.Science,304,1944(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１で提案された光電変換素子で用いられている亜鉛置換シトクロムｃの調製に用いられるウマ心筋シトクロムｃにおいては、補欠分子族であるポルフィリンはシステイン残基と共有結合をしている。このため、ウマ心筋シトクロムｃからポルフィリンを外すことは容易ではなく、中心の鉄を亜鉛やスズに置換するといった操作しかできなかった。この結果、使用可能なタンパク質の種類が極少数に限定されていた。
【０００８】
そこで、この発明が解決しようとする課題は、大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子およびその製造方法を提供することである。
【０００９】
この発明が解決しようとする他の課題は、大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子を用いた光電変換システムおよびその製造方法を提供することである。
【００１０】
この発明が解決しようとするさらに他の課題は、大腸菌由来のシトクロムｂ562 あるいこはこのシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質が固定化されたタンパク質固定化電極およびその製造方法を提供することである。
上記課題および他の課題は、添付図面を参照した本明細書の記述から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、従来技術が有する上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、タンパク質光電変換素子のタンパク質として、大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとしたものを用いることが有効であることを見出した。このシトクロムｂ562 はヘムあるいはポルフィリンの出し入れを簡単に行うことができ、中心金属の置換を行ったり、ポルフィリンの改変を行ったりすることにより、多色化を簡単に行うことができる。また、シトクロムｂ562 あるいはシトクロムｂ562 をベースとするタンパク質は金電極に容易に固定化することができることを見出した。また、π電子を有するレドックスアクティブな基をシトクロムｂ562 をベースとしたタンパク質の分子内に導入することにより、光電流を増幅することができることを見出した。
【００１２】
この発明は、本発明者らが独自に得た上記の知見に基づいて鋭意検討を行った結果、案出されたものである。
【００１３】
すなわち、上記課題を解決するために、この発明は、
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子である。
【００１４】
また、この発明は、
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子を有する光電変換システムである。
【００１５】
また、この発明は、
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有するタンパク質光電変換素子の製造方法である。
【００１６】
また、この発明は、
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有する光電変換システムの製造方法である。
【００１７】
また、この発明は、
金電極と、
上記金電極に固定化されたシトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質固定化電極である。
【００１８】
好適には、上記の金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体、あるいは、シトクロムｂ562 またはその誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を金電極側に向けて固定化される。必要に応じて、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入される。このレドックスアクティブな基としては、従来公知のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、好適にはトリプトファンまたはキノンが用いられる。金属置換シトクロムｂ562 の金属は、目的とする光電変換波長が得られるように適宜選ばれるが、例えば、亜鉛（Ｚｎ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、バリウム（Ｂａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、カドミウム（Ｃｄ）、アンチモン（Ｓｂ）、トリウム（Ｔｈ）、鉛（Ｐｂ）などである。シトクロムｂ562 、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の誘導体は、それらの骨格のアミノ酸残基もしくはポルフィリンが化学修飾されたものである。また、シトクロムｂ562 、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の変異体は、それらの骨格のアミノ酸残基の一部が他のアミノ酸残基に置換されたものである。
【００１９】
光電変換システムは、典型的には、互いに異なる波長の光に対して応答する二種類以上の光電変換素子を含み、少なくともこれらの光電変換素子のうちの一種類が、金電極と、この金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子である。光電変換システムを構成する光電変換素子の数は、光電変換システムの用途などに応じて適宜選ばれる。光電変換システムは、例えば、カラー撮像素子、光センサーなどである。
【００２０】
上記のタンパク質光電変換素子は、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化したタンパク質固定化電極に加えて対極を有する。この対極は、このタンパク質固定化電極に対して間隔を空けて対向するように設けられる。
【００２１】
上述のように構成されたこの発明においては、大腸菌由来のシトクロムｂ562 は、シトクロムｃに比べてヘムあるいはポルフィリンの出し入れを容易に行うことができる。このため、シトクロムｂ562 をベースとして、金属置換シトクロムｂ562 や亜鉛クロリンシトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を容易に調製することができる。また、これらの金属置換シトクロムｂ562 や亜鉛クロリンシトクロムｂ562 やそれらの誘導体あるいは変異体をタンパク質光電変換素子に用いることにより、様々な波長の可視光を吸収する光電変換素子を得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
この発明によれば、シトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子やこのタンパク質光電変換素子を用いた各種の光電変換システムなどを実現することができる。素子を実現することができる。そして、このように優れたカラー撮像素子、光センサーまたは光電変換素子を用いることにより優れた電子機器を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す略線図である。
【図２】精製されたシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを示す略線図である。
【図３】シトクロムｂ562 の構造を示す略線図である。
【図４】シトクロムｂ562 が自己組織化単分子膜を介して金電極に吸着した様子を模式的に示す略線図である。
【図５】シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られたサイクリックボルタモグラムを示す略線図である。
【図６】亜鉛置換シトクロムｂ562 の吸収スペクトルを示す略線図である。
【図７】亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流リアルタイムウェーブフォームを示す略線図である。
【図８】亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図９】亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図１０】亜鉛クロリンの構造を示す略線図である。
【図１１】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 のカラム溶出パターンを示す略線図である。
【図１２】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを示す略線図である。
【図１３】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図１４】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極およびクロリン固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図１５】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図１６】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎの吸収スペクトルを示す略線図である。
【図１７】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎが自己組織化単分子膜を介して金電極に吸着した様子を模式的に示す略線図である。
【図１８】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図１９】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極および野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図２０】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極および野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流リアルタイムウェーブフォームを示す略線図である。
【図２１】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極および野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図２２】メチルビオロゲンの添加量を変化させた野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図２３】メチルビオロゲンの添加量を変化させた亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図２４】シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶の光学顕微鏡像を示す図面代用写真である。
【図２５】シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶の単位胞を示す略線図である。
【図２６】シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎのトリプトファン１７付近の構造を示す略線図である。
【図２７】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＡ鎖を比較して示す略線図である。
【図２８】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＣ鎖を比較して示す略線図である。
【図２９】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＡ鎖のトリプトファン１７近傍の構造を示す略線図である。
【図３０】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＣ鎖のトリプトファン１７近傍の構造を示す略線図である。
【図３１】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子を示す略線図である。
【図３２】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子の使用形態の第１の例を示す略線図である。
【図３３】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子の使用形態の第２の例を示す略線図である。
【図３４】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子の使用形態の第３の例を示す略線図である。
【図３５】この発明の第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子を示す断面図である。
【図３６】図３５に示す非接液全固体型タンパク質光電変換素子の要部を拡大して示す断面図である。
【図３７】この発明の第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作を説明するための略線図である。
【図３８】この発明の第４の実施の形態によるカラー撮像素子の第１の例を示す略線図である。
【図３９】この発明の第４の実施の形態によるカラー撮像素子の第２の例を示す略線図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、発明を実施するための形態（以下「実施の形態」とする）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態（タンパク質固定化電極およびその製造方法）
２．第２の実施の形態（タンパク質光電変換素子）
３．第３の実施の形態（非接液全固体型タンパク質光電変換素子）
４．第４の実施の形態（カラー撮像素子）
【００２５】
〈１．第１の実施の形態〉
［タンパク質固定化電極］
図１は第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す。
【００２６】
図１に示すように、このタンパク質固定化電極においては、金電極１１上に大腸菌由来のシトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質１２が固定化されている。
【００２７】
図１においては一分子のタンパク質１２が示されているが、金電極１１上に固定化するタンパク質１２の数は必要に応じて決められ、一般的には複数のタンパク質１２が単分子膜または多分子膜として固定化される。また、図１においては、金電極１１は平坦な表面形状を有するように描かれているが、金電極１１の表面形状は任意であり、例えば凹面、凸面、凹凸面などのいずれであってもよく、いずれの形状の面にも容易にタンパク質１２を固定化することができる。また、金電極１１の全体形状も任意であり、例えば板状、ドロップ状などのいずれであってもよい。
【００２８】
タンパク質１２は、好適には、このタンパク質１２のヘムまたはポルフィリンのプロピオン酸が金電極１１側を向くように固定化される。この場合、このタンパク質１２のヘムまたはポルフィリンのプロピオン酸サイトは大きな負電荷を有するため、金電極１１の表面に正電荷を持たせると、タンパク質１２を静電引力により金電極１１に吸着させることができる。金電極１１の表面に正電荷を持たせる方法としては、従来公知の各種の方法を用いることができ、必要に応じて選ばれるが、例えば、金電極１１上に、最表面に正電荷が現れるように自己組織化単分子膜（self-assembled monolayer, ＳＡＭ）を形成する方法を用いることができる。
【００２９】
［タンパク質固定化電極の製造方法］
このタンパク質固定化電極は、例えば、金電極１１の表面に正電荷を持たせた後、タンパク質１２を溶解した緩衝液に金電極１１を浸漬して金電極１１の表面にタンパク質１２を吸着させることにより製造することができる。
【００３０】
［実施例１］
ａ．大腸菌由来シトクロムｂ562 の発現・精製方法
大腸菌由来シトクロムｂ562 の構造遺伝子を組み込んだプラスミド（Ｃｙｔ−ｂ５６２／ｐＫＫ２２３−３）を作製し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。発現・精製方法は非特許文献１に準じた。
【００３１】
ＬＢ−Ａｍｐ培地１００ｍＬで３７℃、オーバーナイト培養した前培養液を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ ４Ｌ（２Ｌ×２）に移し、３７℃で５〜６時間培養した。０．２ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに２５℃で１８時間培養することで、赤色の菌体７０ｇを得ることができた。凍結した菌体を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＤＴＴ（適当）、ＤＮａｓｅ（適当）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００ｍＬに懸濁し、超音波で細胞粉砕した。
【００３２】
遠心上澄みに２Ｍリン酸を加えてｐＨ４．５５に調整し、不要タンパク質を遠心沈殿させた。このサンプルを、ＣＭ５２陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（カラム体積８０ｍＬ、５０〜１５０ｍＭ ＫＣｌ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ／５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ４．５５））、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ Ｆｉｎｅゲルろ過クロマトグラフィー（カラム体積４８０ｍＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）により精製し、約８０ｍｇのシトクロムｂ562 を得ることができた。
【００３３】
精製されたシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを図２に示す。測定は、精製されたシトクロムｂ562 を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図２に示すように、精製された状態では、シトクロムｂ562 は、４１８ｎｍ、５３２ｎｍに吸収ピークのある酸化型であった。緩衝液に少量のジチオナイトを加えて還元型としたところ、４２６ｎｍ、５３１ｎｍ、５６２ｎｍの吸収ピークが確認された。
【００３４】
得られたシトクロムｂ562 のアミノ酸配列は下記のとおりである。このアミノ酸配列では、後述のように、下線を付したヘムの配位子メチオニン７およびヒスチジン１０２と、イソロイシン１７とが重要な役割を果たす。
【００３５】
ＡＤＬＥＤＮＭＥＴＬ ＮＤＮＬＫＶＩＥＫＡ ＤＮＡＡＱＶＫＤＡＬ ＴＫＭＲＡＡＡＬＤＡ ＱＫＡＴＰＰＫＬＥＤ ＫＳＰＤＳＰＥＭＫＤ ＦＲＨＧＦＤＩＬＶＧ ＱＩＤＤＡＬＫＬＡＮ ＥＧＫＶＫＥＡＱＡＡ ＡＥＱＬＫＴＴＲＮＡ ＹＨＱＫＹＲ
【００３６】
ｂ．シトクロムｂ562 の金ドロップ電極への固定化
１９７９年にＸ線結晶構造解析により決定されたシトクロムｂ562 の結晶構造（非特許文献２参照）を図３Ａ、ＢおよびＣに示す。ここで、図３Ａはリボンモデルを示し、ヘムとその配位子アミノ酸を棒モデルで示す。図３Ｂはシトクロムｂ562 が図３Ａと同じ向きの時の電荷分布を示し、楕円状の破線で囲まれた部分が一番強く負に帯電しているヘム−プロピオン酸露出面である（図３Ｃでも同様）。図３Ｃはシトクロムｂ562 を図３Ｂの状態から縦軸の周りに１８０度回転させた状態（図３Ｂに示す状態のシトクロムｂ562 の裏側）の電荷分布を示す。図３Ａ、ＢおよびＣに示すように、シトクロムｂ562 は４ヘリックスバンドル構造を有し、補欠分子族ヘムを１分子有する。そのヘムのプロピオン酸は分子から足を出すように露出している。図３Ｂに示す電荷分布を見ると、ちょうどそのヘムのプロピオン酸サイトに強い負電荷を持つことが分かる。したがって、金電極１１の表面に正電荷を持たせると、シトクロムｂ562 をヘムのプロピオン酸サイトで金電極１１に吸着させることができる。その模式図を図４に示す（ヘムのみ棒モデルで示す）。この例では、金電極１１上に、最表面に正電荷を有する自己組織化単分子膜１３を形成し、この自己組織化単分子膜１３の最表面の正電荷とシトクロムｂ562 のヘムのプロピオン酸サイトの負電荷との間に働く静電引力によりシトクロムｂ562 が自己組織化単分子膜１３に吸着している。
【００３７】
金電極１１として直径２ｍｍの金ドロップ電極を形成した。
この金ドロップ電極を熱濃硫酸（１２０℃）で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス（粗さ）を増した。この金ドロップ電極を０．１ｍＭ １１−アミノウンデカンチオール（Ｈ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ）／エタノール溶液に室温で１６時間以上浸し、金ドロップ電極の表面に自己組織化単分子膜１３としてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した。こうしてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した金ドロップ電極に圧縮エアを当てて乾燥後、５０μＭシトクロムｂ562 ／４．４ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）溶液６０μＬにソーキングし、４℃で一昼夜インキュベートした。
【００３８】
インキュベートした金ドロップ電極を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に浸漬して測定したサイクリックボルタモグラムを図５に示す。電位掃引速度は１Ｖ／ｓである。図５に示すように、吸着型のサイクリックボルタモグラムが得られた。金ドロップ電極の表面のシトクロムｂ562 の有効表面積は１．７±０．６ｐｍｏｌ／ｃｍ2 、酸化還元電位は−４±１１ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ、シトクロムｂ562 −金ドロップ電極間の電子伝達速度定数は９０±１２ｓ-1であった。同様の吸着効果は、金ドロップ電極の表面に形成する１１−アミノウンデカンチオールに０〜１０％のヒドロキシウンデカンチオールを混在させても得られる。図５に、１１−アミノウンデカンチオールに１０％のヒドロキシウンデカンチオールを混在させた場合のサイクリックボルタモグラムを示す。
【００３９】
［実施例２］
ａ．亜鉛置換シトクロムｂ562 の調製
亜鉛置換シトクロムｂ562 の調製法はすでにＨａｍａｃｈｉらによる報告（非特許文献４）があるため、それに準じて亜鉛置換シトクロムｂ562 の調製を行った。
【００４０】
まず、シトクロムｂ562 水溶液（３３μＭ）３ｍＬに、１Ｍ塩酸を加え、ｐＨを２〜３に調整した。このシトクロムｂ562 水溶液に、あらかじめ水冷しておいた２−ブタノンを３ｍＬ加え、穏やかに攪拌してシトクロムｂ562 からヘムを抽出し、ブタノン層をピペッティングで取り除いた。ブタノン層が色を呈さなくなるまで、この抽出操作を繰り返した。こうしてヘムの抽出操作を繰り返した水溶液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を極少量加え、ｐＨを７〜８に調整後、超純水に対して透析（２Ｌ×５回）を行い、アポシトクロムｂ562 を得た。
【００４１】
亜鉛プロトポルフィリンＩＸ（ＺｎＰＰ）をジメチルスルホキシドに溶かし、上記のアポシトクロムｂ562 溶液に２等量加えていった。これを、あらかじめ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化しておいたＢｉｏ−ｇｅｌ Ｐ１０脱塩カラムを用いて、タンパク質画分を回収し、精製亜鉛置換シトクロムｂ562 （Ｚｎ−Ｃｙｔ ｂ562 ）を得た。
【００４２】
得られた亜鉛置換シトクロムｂ562 の吸収スペクトルを図６に示す。測定は、亜鉛置換シトクロムｂ562 を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図６に示すように、２８０ｎｍ、３５７ｎｍ、４２９ｎｍ、５５４ｎｍ、５９３ｎｍに吸収ピークがあり、その位置は非特許文献４と一致していた。また、波長５５４ｎｍでの吸光度に対する波長４２９ｎｍでの吸光度の比（Ａ４２９／Ａ５５４）は１１．０５であった。
【００４３】
ｂ．亜鉛置換シトクロムｂ562 の金ドロップ電極への固定化と光電流測定
金電極１１として直径２ｍｍの金ドロップ電極を形成した。
【００４４】
この金ドロップ電極を熱濃硫酸（１２０℃）で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス（粗さ）を増した。この金ドロップ電極を０．１ｍＭ １１−アミノウンデカンチオール（Ｈ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ）／エタノール溶液に室温で１６時間以上浸し、金ドロップ電極の表面に自己組織化単分子膜１３としてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した。こうしてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した金ドロップ電極に圧縮エアを当てて乾燥後、５０μＭ亜鉛置換シトクロムｂ562 ／４．４ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）溶液６０μＬにソーキングし、４℃で一昼夜インキュベートした。
【００４５】
光電流測定は、窒素パージしておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用い、対極としてＰｔメッシュ電極を用いて行った。
【００４６】
バイアス電圧３００ｍＶ、０ｍＶ、−３００ｍＶにおける光電流の測定結果（光電流リアルタイムウェーブフォーム）を図７に示す。図７は、波長４２０ｎｍの光を３０秒照射し、１０秒オフしたときの電流値を時間に対してプロットしたものである。図７に示すように、このバイアス電圧の範囲では、全てカソーディックな光電流が観測された。光電流アクションスペクトルを図８に示す。図８に示すように、ピーク電流を示す波長は４１８〜４２０ｎｍ、５５０ｎｍ、５８６ｎｍであり、図６に示す亜鉛置換シトクロムｂ562 の溶液紫外可視吸収スペクトルにおける吸収極大波長４２９ｎｍ、５５４ｎｍ、５９３ｎｍと大きく異なっている。また、波長５５０ｎｍにおける光電流に対する波長４１８〜４２０ｎｍにおける光電流の比は３．７であり、図６に示す吸収スペクトルにおけるその光電流の比１１．０５に対して大きく下回っている。波長４２０ｎｍにおける光電流値を電位Ｅに対してプロットしたグラフを図９に示す。図９において、電流−電圧曲線に付けた数字はデータ取得順を示す。特許文献１によれば、亜鉛置換シトクロムｃを金電極に固定化した場合には−１００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）付近にスレッショルドを持ち、この電位を境に光電流の反転が見られるのに対し、図９に示すように、亜鉛置換シトクロムｂ562 ではそれが見られない。また、フェロシアン化カリウムを加えてもこの光電流はエンハンスされない。これは特許文献１とは異なる。
【００４７】
［実施例３］
ａ．亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の調製
実施例２と同様にしてアポシトクロムｂ562 を得た。
【００４８】
亜鉛クロリン（ＺｎＣｅ６、図１０）の合成は非特許文献７に従った。化合物を溶かす緩衝液は全て２５ｍＭグリシンと５０ｍＭ ＮａＣｌとの混合液（ｐＨ１０）（以下「緩衝液Ａ」という。）を用いた。１０ｍＭクロリンｅ６を５０μＬ、緩衝液Ａを４５μＬ、１００ｍＭ無水酢酸亜鉛を５μＬ混ぜ、氷中で３０分以上インキュベートした（ＺｎＣｅ６として５００ｎｍｏｌ）。溶液が深緑から鮮やかな緑になった。
【００４９】
この溶液に５５．６μＭのアポシトクロムｂ562 を等量加え（アポシトクロムｂ562 ：５．１ｎｍｏｌ）、さらに氷中で３０分以上、インキュベートした。混合液をＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ脱塩カラム（バイオラッド）にロードし、５０ｍＭ ＫＰｉ、１００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．２で溶出した。緩衝液としては、５０ｍＭ ＫＰｉ、１００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．２を用いた。フラクションを１ｍＬずつ集め、波長２８０ｎｍ、４１２ｎｍ、６３４ｎｍでの吸光度を測定した。溶出パターンを図１１に示す。図１１に示すように、一番下の曲線のバンドが二つに分かれて出てきた。初めて出てきたタンパク質フラクション（溶出体積４〜８ｍＬ）にも色素による吸収があった。溶出体積１０ｍＬ以上は色素である。
【００５０】
また、このとき、亜鉛を入れないとタンパク質フラクションに色素による吸収は見られなくなる。すなわち、亜鉛とシトクロムｂ562 との配位結合が色素の取り込みに重要である。この傾向は、亜鉛ビリベルジンｂ562 調製の際と同じである。
【００５１】
精製した亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを図１２に示す。測定は、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 を１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図１２に示すように、波長４２５ｎｍおよび波長６４１ｎｍに吸収ピークがある。
【００５２】
ｂ．亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の金ドロップ電極への固定化と光電流測定
金電極１１として直径２ｍｍの金ドロップ電極を形成した。
【００５３】
この金ドロップ電極を熱濃硫酸（１２０℃）で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス（粗さ）を増した。この金ドロップ電極を０．１ｍＭ １１−アミノウンデカンチオール塩酸塩／エタノール溶液に漬け込み、室温で１６時間以上インキュベートした。この金ドロップ電極をエタノールでリンス後、５０μＭ亜鉛クロリンシトクロムｂ562 ／４．４ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．２）溶液６０μＬに浸し、４℃で一昼夜インキュベートした。この亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極とは別に、亜鉛クロリン（ＺｎＣｅ６）のみ、クロリン（Ｃｅ６）のみに浸した金ドロップ電極も調製した。
【００５４】
光電流測定は、窒素パージしておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用い、対極としてＰｔメッシュ電極を用いて行った。
【００５５】
バイアス電圧２００ｍＶ〜−２００ｍＶにおける光電流アクションスペクトルを図１３に示す。測定は、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図１３に示すように、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極では、カソーディックな光電流が観測される。また、青色帯の４２０ｎｍに加えて赤色帯の６３６ｎｍにも電流応答が観測される。これは、亜鉛ポルフィリン系タンパク質光電変換素子で初めて赤色光応答の光電流が観測された世界初の事例である。
【００５６】
図１４は、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合と、亜鉛クロリン（ＺｎＣｅ６）のみ、クロリン（Ｃｅ６）のみ固定化した金ドロップ電極を用いた場合との光電流アクションスペクトルを比較して示したものである。バイアス電圧は−２００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌである。図１４に示すように、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合には、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合に比べて、２ｎｍほどレッドシフト（赤方偏移）している。また、波長４６０ｎｍ付近のふくらみが、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合には見えていない。したがって、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 と亜鉛クロリンとでは色素周りの環境が異なっていると考えられる。光電流量は亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合の方が、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合より大きい。これは、金ドロップ電極への吸着量が、亜鉛クロリンの方が亜鉛クロリンシトクロムｂ562 より多いためであると考えられる。
【００５７】
図１５は、波長４２０ｎｍおよび波長６３６ｎｍにおける光電流値を電位Ｅに対してプロットしたグラフを示す。図１５に示すように、正電圧を印加してもアノーディック電流は観察されなかった。この図１５に示す電流−電圧曲線はダイオード様の挙動を示している。この傾向は、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極、クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合でも同じであった。また、実施例２の亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合にも同様の傾向が見られている（図９参照）。
【００５８】
［実施例４］
ａ．シトクロムｂ562 のトリプトファンおよびシステイン変異体の調製
実施例１の発現プラスミドと下記のプライマー（下線は変異箇所）を用いて、Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎ（イソロイシン１７をトリプトファンに、ヒスチジン６３をアスパラギンに変更）変異体、および、Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎ（イソロイシン１７をシステインに、ヒスチジン６３をアスパラギンに変更）変異体プラスミドをStratagene社製、QuickChange Lightning Site directed mutagenesis kit を用いて調製した。なお、Ｈ６３Ｎの変異は、亜鉛ポルフィリンの再構成時に、このヒスチジンに亜鉛ポルフィリンが配位結合するのを避けるためである（非特許文献７参照）。また、イソロイシン１７と異なるアミノ酸残基をトリプトファンに変更してもよい。
【００５９】
Ｉ１７Ｗ ｓｅｎ：５’−ＣＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ−３’
Ｉ１７Ｗ ａｎｓ：５’−ＣＣＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧ−３’
Ｉ１７Ｃ ｓｅｎ：５’−ＣＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ−３’
Ｉ１７Ｃ ａｎｓ：５’−ＣＣＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧ−３’
Ｈ６３Ｎ ｓｅｎ：５’−ＧＡＴＴＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−３’
Ｈ６３Ｎ ａｎｓ：５’−ＧＴＣＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＣ−３’
【００６０】
このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、実施例１と同様の培養・発現・精製過程を経て、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎおよびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎを調製した。
【００６１】
ｂ．キノン導入アポシトクロムｂ562 変異体の調製
上記の精製シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎから実施例２と同様にして酸−ブタノン法により脱ヘムし、超純水（２Ｌ×３回）、１ｍＭ ＤＴＴ（２Ｌ×１回）、１ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ ｐＨ５．０、１００ｍＭ ＫＣｌ（２Ｌ×１回）に対して透析し、アポタンパク質を調製した。
【００６２】
得られたアポタンパク質に対して５倍モル量のパラベンゾキノン（ＢＱ）または２，３−ジトメキシ−５−メチルパラベンゾキノン（ＣｏＱ）を加え、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中、室温で３０分インキュベートした。反応溶液を１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）（１Ｌ×２回）、超純水（１Ｌ×１回）に対して透析し、キノン修飾体を調製した。ＢＱ体は薄いマゼンタ色、ＣｏＱ体は薄い黄色を呈した。
【００６３】
なお、この方法により遊離のシステイン残基に後述の図１７の右に示すようにキノンが結合することが報告されている。このタンパク質に唯一存在するシステイン１７にキノンが結合していると考えられる。
【００６４】
ｃ．亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎの調製
上記のキノン導入アポタンパク質に対し、２．２〜２．５倍量の亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）を加え、Ｂｉｏ−ｒａｄ ＥｃｏｎｏＰａｃ１０ ＤＧ脱塩カラム（緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）でタンパク質画分を回収した。こうして得られた亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎの吸収スペクトルを図１６に示す。図１６の右上の挿入図は野生型（ＷＴ）の吸収スペクトルを示す。
【００６５】
ｄ．亜鉛置換シトクロムｂ562 変異体の金ドロップ電極への固定と光電流測定
上記のようにして得られた亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎを実施例１と同様に、１１−アミノウンデカンチオールを用いて金ドロップ電極に固定化した。亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎを金ドロップ電極からなる金電極１１上の自己組織化単分子膜１３に吸着させた時の模式図を図１７に示す。図１７において、１７番目のアミノ酸（Ｗ、ＢＱ、ＣｏＱ）と６３番目のアスパラギン（Ｈ６３Ｎ）を棒モデルで示す。この亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極に光を照射すると、電子（ｅ- ）が破線で示すように電極から分子表面方向へと抜け出す。図１７には、トリプトファン（Ｔｒｐ）、システイン（Ｃｙｓ）に結合したパラベンゾキノン（ＢＱ）およびシステインに結合した２，３−ジメトキシ−５−メチルパラベンゾキノン（ＣｏＱ）の構造を示した。
【００６６】
光電流測定は、窒素パージしておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用い、対極としてＰｔメッシュ電極を用いて行った。
【００６７】
亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ（ただし、Ｘ＝ＣｏＱ、Ｗ、ＢＱ）または野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 を固定化した金ドロップ電極を用いた場合の光電流アクションスペクトルを図１８に示す。バイアス電圧は−３００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌである。図１８に示すように、カソーディック電流発生においては、Ｉ１７Ｗ、Ｉ１７ＣｏＱ、Ｉ１７ＢＱ変異体の光電流は野生型の２〜３倍であった。これらの変異残基が、光電流を増加させていると考えられる。波長４２０ｎｍにおける光電流値を電位Ｅに対してプロットしたグラフを図１９に示す。図１９において、電流−電圧曲線に付けた数字はデータ取得順を示す。
【００６８】
非特許文献８では、レニウム錯体で修飾した銅タンパク質・アズリンにトリプトファンを導入し（２１７０．ｐｄｂ）、レニウム−銅間の電子伝達速度を２桁向上させたことが報告されているが、これはタンパク質分子の表面に配置されたトリプトファンである。これに対し、実施例４は、タンパク質分子の内部に導入したトリプトファンが光電流を増加させたという世界初の事例である。
【００６９】
一方、金ドロップ電極を使った実験で得られた光電流値５０〜８０ｎＡは、特許文献１の実験で得られた光電流値の約５０〜８０倍に相当する。
【００７０】
亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いた場合、野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 またはＺｎＰＰのみを固定化した金ドロップ電極を用いた場合のバイアス電圧３００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）における光電流の測定結果（光電流リアルタイムウェーブフォーム）を図２０に示す。緩衝液としては、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いた。図２０は、波長４２０ｎｍの光を３０秒照射し、１０秒オフしたときの電流値を時間に対してプロットしたものである。図２０に示すように、亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極では、微弱ながらもカソーディックな光電流を発生しているのに対し、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極ではそれがない。
【００７１】
亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いた場合、野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 またはＺｎＰＰ単体を固定化した金ドロップ電極を用いた場合のバイアス電圧０ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）における光電流アクションスペクトルを図２１に示す。緩衝液としては、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いた。図２１に示すように、光電流アクションスペクトルも、ＺｎＰＰ単体と亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎに包括された状態とでは異なる。したがって、図１８で見られた光電流はタンパク質由来のものである。
【００７２】
［亜鉛置換シトクロムｂ562 の光電流の発生におけるメチルビオロゲンの効果］
特許文献１によると、亜鉛置換シトクロムｃ固定化電極にメディエーターとしてフェロ／フェリシアナイド（Ｅ0 ＝３６０ｍＶ ｖｓ ＮＨＥ）を入れると、光電流がエンハンスされる。光照射によりポルフィリンの電子が励起され、光励起に関わる分子軌道（Ｇｏｕｔｅｒｍａｎの４軌道）のうち、被占軌道の二つ（ポルフィリンπ軌道に亜鉛−硫黄のπ結合性軌道が混成したもの）に正孔（ホール）が発生する。その正孔がタンパク質の外殻アミノ酸に局在化した分子軌道と強くカップルし、色素上で発生した正孔はタンパク質の外殻（溶液側）に移動する。フェロ／フェリシアナイドはその正孔を埋めるというモデルが提唱されている。
【００７３】
しかしながら、亜鉛置換シトクロムｂ562 の一連の実験では、フェロ／フェリシアナイドを加えても光電流に影響はなかった。そして、亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化電極からはカソーディックな光電流しか見られない。また、ダイオード様の発生挙動を示すことから、励起電子が分子表面方向へ抜けていくと考えられる。そこで、非特許文献９にならい、励起電子をエンハンスさせる効果があるメチルビオロゲン（Ｅ0 ＝−４４０ｍＶ ｖｓ ＮＨＥ）を加えて光電流測定を行った。
【００７４】
図２２は、野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 を固定化した金ドロップ電極の光電流発生におけるメチルビオロゲン（ＭＶ）の効果を示す。また、図２３は、亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎを固定化した金ドロップ電極の光電流発生におけるメチルビオロゲンの効果を示す。図２２および図２３においては、カソーディックな光電流の発生量の増加を分かりやすくするために、横軸（バイアス電圧）および縦軸（波長４２０ｎｍにおける光電流値）ともに反転させてある。図２２および図２３に示すように、野生型、トリプトファン変異型の両方で、メチルビオロゲンの添加により光電流量が増加するのが見られる。したがって、この亜鉛置換シトクロムｂ562 の光電流は正孔移動に由来するものではなく、励起電子の移動に由来するものである可能性が高い。亜鉛置換シトクロムｂ562 の全電子計算もこの現象を説明することができる。
【００７５】
［トリプトファン変異シトクロムｂ562 のＸ線結晶構造解析］
３０ｍｇ／ｍＬのシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎ溶液（１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ ｐＨ５．０）を等量の０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、４５％Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｐ４００（Ｉｎｄｅｘ−５８）と混ぜ、シッティングドロップ蒸気拡散法、ハンギングドロップ蒸気拡散法で２０℃、２日間インキュベートすることで、図２４に示すようなシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶が得られた。図２４中の両矢印は０．１ｍｍを示す。得られた結晶は空間群Ｐ１のツイン結晶で、２．５３Å分解能の回折データを得ることができた。その統計値を表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
野生型シトクロムｂ562 の構造（２５６Ｂ．ｐｄｂ）中、ｃｈａｉｎＡのみ（ヘム以外のヘテロ分子、ダイマー中のｃｈａｉｎＢを削除した座標データ）をテンプレートとして用い、プログラムＭｏｌｒｅｐ／ＣＣＰ４で分子置換を行った。図２５に示すように、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶では、単位胞中に６分子が含まれる。図２６は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎのトリプトファン１７付近の構造を示すステレオ図であり、単位胞中の６分子全てを重ね合わせてある。トリプトファン１７（Ｔｒｐ１７）の側鎖の向きはいずれの分子も同じである。
【００７８】
プログラムＲｅｆｍａｃ５／ＣＣＰ４でＲｉｇｉｄｂｏｄｙ→Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ→ＴＬＳ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（全てＡｍｐｌｉｔｕｄｅ ｂａｓｅｄ ｔｗｉｎ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔを使用）、Ｃｏｏｔでマニュアルモデル構築を行った。Ｉ１７Ｗ、Ｈ６３Ｎの変異を入れた。精密化の統計値を表１に示す。
【００７９】
図２７は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＡ鎖（単位胞中に６分子あるうちの一つ）を比較したものである。図２８は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＣ鎖（単位胞中に６分子あるうちの一つ）を比較したものである。図２７および図２８において、ヘムおよびトリプトファン１７は棒モデルで示してある。図２７および図２８に示すように、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの全体構造は野生型シトクロムｂ562 と同様の４ヘリックスバンドル構造を保っていた。図２７および図２８において、トリプトファン１７の向かい側にあるＨｅｌｉｘ ＩＶが分子の外側に押し退けられている（破線の矢印部分）。野生型シトクロムｂ562 とシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎとのアミノ酸α炭素のｒ．ｍ．ｓ．（二乗平均平方根）偏差は０．５Å程度である。トリプトファン１７は６分子全てが同じ側鎖のコンフォーマーを持っており（図２６参照）、この側鎖の位置・配向が一般解であることが分かった。
【００８０】
図２９は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＡ鎖におけるトリプトファン１７近傍の構造を比較したものである。図３０は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＣ鎖におけるトリプトファン１７近傍の構造を比較したものである。図２９および図３０において、トリプトファン１７、グルタミン８８、アラニン９１、ロイシン９４を棒モデルで示す。その他はアミノ酸α炭素のトレースである。Ｉ１７Ｗは４ヘリックスバンドルの中心に位置している。１７番目のアミノ酸がイソロイシンからトリプトファンに変わったことで、アラニン９０、アラニン９１付近の配置が野生型よりも１〜２Å、分子表面側へ押し退けられている。それによって、ロイシン９４の向きが変わる。
【００８１】
シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 との全体構造に大きな違いは見られないため（図２７および図２８）、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎは野生型シトクロムｂ562 と同じように金電極に吸着するものと考えられる。
【００８２】
以上のように、この第１の実施の形態によれば、シトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質１２が金電極１１上に固定化されたタンパク質固定化電極を得ることができる。本発明者らの知る限り、金電極１１上へのシトクロムｂ562 、金属置換シトクロムｂ562 、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 などの固定化に成功したのは本発明らが初めてである。そして、例えば、タンパク質１２として亜鉛置換シトクロムｂ562 を用いることにより、青色光に応答するタンパク質固定化電極を得ることができ、このタンパク質固定化電極を用いることにより青色光のタンパク質光電変換素子を実現することができる。また、タンパク質１２として亜鉛クロリンシトクロムｂ562 を用いることにより、赤色光に応答するタンパク質固定化電極を得ることができ、このタンパク質固定化電極を用いることにより赤色光のタンパク質光電変換素子を実現することができる。
【００８３】
〈２．第２の実施の形態〉
［タンパク質光電変換素子］
図３１に第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子を示し、特にタンパク質固定化電極を示す。
【００８４】
図３１に示すように、このタンパク質光電変換素子は、金電極２１上に亜鉛置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 からなるタンパク質２２が固定化されたタンパク質固定化電極を有する。このタンパク質固定化電極のその他のことは第１の実施の形態と同様である。
【００８５】
このタンパク質光電変換素子は、金電極２１上に亜鉛置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 からなるタンパク質２２が固定化されたタンパク質固定化電極に加えて対極を有する。この対極は、タンパク質固定化電極に対して間隔を空けて対向するように設けられる。この対極の材料としては、例えば、金、アルミニウム、パラジウム、銀、クロムなどの金属、ＩＴＯ（インジウム−スズ複合酸化物）、ＦＴＯ（フッ素ドープ酸化スズ）、ネサガラス（ＳｎＯ2 ガラス）などの金属酸化物あるいはガラスなどに代表される無機材料を用いることができる。この対極の材料としては、導電性高分子（ポリチオフェン、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリジアセチレン、ポリパラフェニレン、ポリパラフェニレンスルフィドなど）、テトラチアフルバレン誘導体（ＴＴＦ、ＴＭＴＳＦ、ＢＥＤＴ−ＴＴＦなど）を含む電荷移動錯体（例えば、ＴＴＦ−ＴＣＮＱなど）などを用いることもできる。金電極２１に固定化されたタンパク質２２の全部またはほぼ全部に対極を通して光が照射されるようにするためには、この対極は、好適には、このタンパク質２２の光励起に用いられる光に対して透明に構成される。例えば、この対極は、タンパク質２２の光励起に用いられる光に対して透明な導電性材料、例えばＩＴＯ、ＦＴＯ、ネサガラスなどにより構成され、あるいは、光の透過が可能な極薄い金属膜などにより構成される。
【００８６】
このタンパク質光電変換素子は、タンパク質２２の光電変換機能および電子伝達機能を損なわない限り、溶液（電解質溶液または緩衝液）中、ドライな環境中のいずれでも動作させることが可能である。このタンパク質光電変換素子を電解質溶液または緩衝液中で動作させる場合には、典型的には、タンパク質固定化電極に対して間隔を空けて対向するように対極が設けられ、これらのタンパク質固定化電極および対極が電解質溶液または緩衝液中に浸漬される。電解質溶液の電解質（あるいはレドックス種）としてはタンパク質固定化電極で酸化反応が起こり、対極で還元反応が起こるもの、または、タンパク質固定化電極で還元反応が起こり、対極で酸化反応が起こるものが用いられる。具体的には、電解質（あるいはレドックス種）としては、例えば、Ｋ4 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］や［Ｃｏ（ＮＨ3 ）6 ］Ｃｌ3 などが用いられる。このタンパク質光電変換素子をドライな環境中で動作させる場合には、典型的には、例えば、タンパク質２２を吸着しない固体電解質、具体的には例えば寒天やポリアクリルアミドゲルなどの湿潤な固体電解質が、タンパク質固定化電極と対極との間に挟み込まれ、好適にはこの固体電解質の周囲にこの固体電解質の乾燥を防ぐための封止壁が設けられる。これらの場合においては、タンパク質固定化電極と対極との自然電極電位の差に基づいた極性で、タンパク質２２からなる受光部で光を受光したときに光電流を得ることができる。
【００８７】
［タンパク質光電変換素子の使用形態］
図３２はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第１の例を示す。
図３２に示すように、この第１の例では、金電極２１上にタンパク質２２が固定化されたタンパク質固定化電極と対極２３とが互いに対向して設けられる。これらのタンパク質固定化電極および対極２３は、容器２４中に入れられた電解質溶液２５中に浸漬される。電解質溶液２５は、タンパク質２２の機能を損なわないものが用いられる。また、この電解質溶液２５の電解質（あるいはレドックス種）は、タンパク質固定化電極で酸化反応が起こり、対極２３で還元反応が起こるもの、または、タンパク質固定化電極で還元反応が起こり、対極２３で酸化反応が起こるものが用いられる。
【００８８】
このタンパク質光電変換素子により光電変換を行うには、バイアス電源２６により参照電極２７に対してタンパク質固定化電極にバイアス電圧を印加した状態で、タンパク質固定化電極のタンパク質２２に光を照射する。この光は、タンパク質２２の光励起が可能な光の単色光またはこの光の成分を有する光である。この場合、タンパク質固定化電極に印加するバイアス電圧、照射する光の強度および照射する光の波長のうちの少なくとも一つを調節することによって、素子内部を流れる光電流の大きさおよび／または極性を変化させることができる。光電流は端子２８ａ、２８ｂより外部に取り出される。
【００８９】
図３３はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第２の例を示す。
図３３に示すように、この第２の例では、第１の例のようにバイアス電源２６を用いてバイアス電圧を発生させるのではなく、タンパク質固定化電極および対極２３が持つ自然電極電位の差をバイアス電圧として用いる。この場合、参照電極２７は用いる必要がない。したがって、このタンパク質光電変換素子は、タンパク質固定化電極および対極２３を用いる二電極系である。第２の例の上記以外のことは第１の例と同様である。
【００９０】
図３４はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第３の例を示す。第１および第２の例によるタンパク質光電変換素子が溶液中で動作させるものであるのに対し、このタンパク質光電変換素子はドライな環境中で動作させることができるものである。
【００９１】
図３４に示すように、このタンパク質光電変換素子においては、タンパク質固定化電極と対極２３との間に固体電解質２９が挟み込まれている。さらに、この固体電解質２９の周囲を取り巻くように、固体電解質２９の乾燥を防ぐための封止壁３０が設けられている。固体電解質２９としては、タンパク質２２の機能を損なわないものが用いられ、具体的には、タンパク質を吸着しない寒天やポリアクリルアミドゲルなどが用いられる。このタンパク質光電変換素子により光電変換を行うには、タンパク質固定化電極および対極２３が持つ自然電極電位の差をバイアス電圧として用い、タンパク質固定化電極のタンパク質２２に光を照射する。この光は、タンパク質２２の光励起が可能な単色光またはこの光の成分を有する光である。この場合、タンパク質固定化電極および対極２３が持つ自然電極電位の差、照射する光の強度および照射する光の波長のうちの少なくとも一つを調節することによって、素子内部を流れる光電流の大きさおよび／または極性を変化させることができる。第３の例の上記以外のことは第１の例と同様である。
【００９２】
［タンパク質光電変換素子の製造方法］
このタンパク質光電変換素子の製造方法の一例について説明する。
まず、電極２１をタンパク質２２と緩衝液とを含む溶液に浸漬し、タンパク質２２を電極２１上に固定化する。こうしてタンパク質固定化電極が形成される。
次に、このタンパク質固定化電極と対極２３とを用いて例えば図３２、図３３または図３４に示すタンパク質光電変換素子を製造する。
【００９３】
［タンパク質光電変換素子の動作］
このタンパク質光電変換素子のタンパク質２２が亜鉛置換シトクロムｂ562 である場合は、波長４１８〜４２０ｎｍの青色の単色光またはこの波長成分を含む光が入射すると、タンパク質２２から光励起により電子が発生し、電子伝達により金電極２１に電子が移動する。また、このタンパク質光電変換素子のタンパク質２２が亜鉛クロリンシトクロムｂ562 である場合は、波長４１８〜４２０ｎｍの青色の単色光あるいは波長６３６ｎｍ付近の赤色の単色光またはこの波長成分を含む光が入射すると、タンパク質２２から光励起により電子が発生し、電子伝達により金電極２１に電子が移動する。そして、金電極２１と対極２３とから外部に光電流が取り出される。
【００９４】
以上のように、この第２の実施の形態によれば、シトクロムｂ562 をベースとするタンパク質を用いて青色または赤色のタンパク質光電変換素子を実現することができる。
【００９５】
このタンパク質光電変換素子は、例えば光センサーあるいは撮像素子に用いることができ、必要に応じて光電流の増幅回路などを併せて用いることができる。光センサーは光信号の検出などの各種の用途に用いることができ、人工網膜などに応用することも可能である。
【００９６】
このタンパク質光電変換素子は、光電変換を利用する各種の装置や機器などに用いることができ、具体的には、例えば、受光部を有する電子機器などに用いることができる。このような電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含むが、具体例を挙げると、デジタルカメラ、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）などである。
【００９７】
〈３．第３の実施の形態〉
［非接液全固体型タンパク質光電変換素子］
図３５は第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子を示す。この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては固体タンパク質層を用いる。ここで、固体タンパク質層とは、水などの液体を含まずにタンパク質が集合して層状の固体をなすものを意味する。また、非接液全固体型タンパク質光電変換素子の「非接液」とは、タンパク質光電変換素子の内外が水などの液体と接触しない状態で使用されることを意味する。また、非接液全固体型タンパク質光電変換素子の「全固体型」とは、素子の全ての部位が水などの液体を含まないものであることを意味する。
【００９８】
図３５に示すように、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては、電極４１と電極４２との間に、タンパク質からなる固体タンパク質層４３が挟まれた構造を有する。固体タンパク質層４３は電極４１、４２に対して固定化されている。固体タンパク質層４３は典型的には電極４１、４２に対して直接固定化されるが、必要に応じて、固体タンパク質層４３と電極４１、４２との間に水などの液体が含まれていない中間層を設けてもよい。この固体タンパク質層４３には水などの液体が含まれていない。この固体タンパク質層４３はタンパク質の単分子膜または多分子膜からなる。
【００９９】
この固体タンパク質層４３が多分子膜からなる場合の構造の一例を図３６に示す。図３６に示すように、固体タンパク質層４３は、スズ置換ウマ心筋シトクロムｃまたはスズ置換ウシ心筋シトクロムｃからなるタンパク質４３ａが二次元的に集合して形成された単分子膜がｎ層（ｎは２以上の整数）積層されたものからなる。図３６ではｎ＝３の場合が示されている。
【０１００】
電極４１、４２の少なくとも一方として透明電極を用いる。電極４１、４２の間に挟まれた固体タンパク質層４３に光が照射されるようにするためには、電極４１、４２のうちの固体タンパク質層４３の光励起に用いられる光が入射する側の一方の電極を透明電極により構成する。透明電極は、具体的には、この光励起に用いられる光に対して透明な導電材料、例えばＩＴＯ、ＦＴＯ、ネサガラスなどにより構成したり、光の透過が可能な極薄い金属膜などにより構成したりする。また、電極４１、４２のうちの他方の電極は、上記の透明な導電材料、あるいは、より効率的に光を照射したい場合には非透明な導電材料、例えば金、銅、アルミニウムなどにより構成する。
【０１０１】
［非接液全固体型タンパク質光電変換素子の製造方法］
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の製造方法について説明する。
まず、電極４１、４２の一方、例えば電極４１上に、タンパク質４３ａを含む溶液、典型的にはタンパク質４３ａを水を含む緩衝液に溶解したタンパク質溶液を液滴下法、スピンコート法、ディップ法、スプレー法、インクジェット法などにより付着させる。
【０１０２】
次に、電極４１上にタンパク質溶液を付着させたものを、室温またはより低い温度に保持することにより、付着させたタンパク質溶液中のタンパク質４３ａを電極４１に固定化させる。
【０１０３】
次に、こうしてタンパク質溶液中のタンパク質４３ａを電極４１に固定化させたものをこのタンパク質４３ａが変性しない範囲で加熱して乾燥させることにより、タンパク質溶液に含まれる液を全て蒸発させて除去する。
【０１０４】
こうして、タンパク質４３ａのみが電極４１に固定化され、固体タンパク質層４３が形成される。この固体タンパク質層４３の厚さは、電極４１上に付着させるタンパク質溶液の量やタンパク質溶液の濃度などにより容易に制御することができる。
【０１０５】
次に、この固体タンパク質層４３上に電極４２を形成する。この電極４２は、スパッタリング法、真空蒸着法、インクジェット法などにより導電材料を堆積させることにより形成することができる。
以上のようにして目的とする非接液全固体型タンパク質光電変換素子が製造される。
【０１０６】
［非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作］
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作について説明する。
非接液全固体型タンパク質光電変換素子の電極４１と電極４２との間に電極４２側が低電位となるように電圧（バイアス電圧）を印加しておく。ここでは、電極４１が透明電極であるとする。この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の固体タンパク質層４３に光が入射しないときには、この固体タンパク質層４３は絶縁性であり、電極４１と電極４２との間に電流は流れない。この状態が非接液全固体型タンパク質光電変換素子のオフ状態である。これに対して、図３７に示すように、電極４１を透過して固体タンパク質層４３に光（ｈν）が入射すると、この固体タンパク質層４３を構成するタンパク質４３ａが光励起され、その結果、この固体タンパク質層４３が導電性となる。そして、電極４２から電子（ｅ）が固体タンパク質層４３を通って電極４１に流れ、電極４１と電極４２との間に光電流が流れる。この状態が非接液全固体型タンパク質光電変換素子のオン状態である。このように固体タンパク質層４３は光導電体として振る舞い、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子への光の入射の有無によりオン／オフ動作が可能である。
【０１０７】
上述のように固体タンパク質層４３が光導電体として振る舞うのは、固体タンパク質層４３を構成する電子伝達タンパク質４３ａが光励起されたときに分子軌道間の電子の遷移が起き、その結果、この電子伝達タンパク質４３ａのある部位から他の部位に電子または正孔が移動する。そして、この電子または正孔の移動が固体タンパク質層１３を構成する多数の電子伝達タンパク質１３ａで次々と起き、その結果、電極４１と電極４２との間に光電流が流れる。
【０１０８】
この第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子によれば、次のような種々の利点を得ることができる。すなわち、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、素子の内部に水が存在せず、しかも水に接触させないでも動作が可能であるため、従来の半導体を用いた光電変換素子に代わる光電変換素子として電子機器に搭載することが可能となる。また、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、内部に水が存在しないため、水の存在に起因するタンパク質の熱変性、ラジカルダメージ、腐敗などを防止することができ、安定性が高く、耐久性が優れている。また、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、素子の内外に水が存在しないため、感電のおそれがなく、強度の確保も容易である。
【０１０９】
また、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては、固体タンパク質層４３は電極４１、４２に対し、リンカー分子などを介することなく直接固定化されていることにより、リンカー分子などを介して固定化される場合に比べて大きな光電流を得ることができる。さらに、固体タンパク質層４３が電極４１、４２に対して直接固定化されていることに加えて、固体タンパク質層４３は極薄く形成することができるので、電極４１と電極２２との間の距離を極めて短くすることができる。このため、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は薄型に構成することができ、しかも電極４１、４２を透明化することにより、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子を多層積層して使用することができる。さらに、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては、固体タンパク質層４３を構成するタンパク質４３ａのサイズは２ｎｍ程度と極めて小さいので、例えば固体タンパク質層４３のどの位置に光が入射したかを極めて精密に検出することが可能である。このため、高精細の光センサーあるいは撮像素子を実現することができる。
【０１１０】
さらに、タンパク質４３ａの光導電効果は「一光子−多電子発生」によるものと推測される。ところが、液系タンパク質光電変換素子においては、電極間に存在する溶液の抵抗（溶液抵抗）が高いため、この「一光子−多電子発生」が妨げられていたと考えられる。これに対し、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子では、この溶液抵抗が存在しないため、この「一光子−多電子発生」が可能となり、光電変換効率の大幅な向上を図ることができ、より大きな光電流を得ることができる。
【０１１１】
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、光スイッチ素子、光センサー、撮像素子などを実現することができる。上述のようにこの非接液全固体型タンパク質光電変換素子は周波数応答が速いため、高速スイッチングが可能な光スイッチ素子、高速応答の光センサー、高速で動く物体の撮像が可能な撮像素子などを実現することができる。そして、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子を光スイッチ素子、光センサー、撮像素子などに用いることにより優れた電子機器を実現することができる。
【０１１２】
〈４．第４の実施の形態〉
［カラー撮像素子］
第４の実施の形態によるカラー撮像素子においては、赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子を用いる。これらのタンパク質光電変換素子は同一基板上に形成してもよいし、赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子をそれぞれ別の基板上に形成し、これらの基板を配列することでカラー撮像素子を構成してもよい。
【０１１３】
図３８はこのカラー撮像素子の一例を示し、特に一画素の領域を示す。
図３８に示すように、このカラー撮像素子においては、基板６１上の一画素の領域における赤色光、緑色光および青色光のタンパク質光電変換素子形成領域に、それぞれ金電極６２ａ、６２ｂ、６２ｃが設けられている。これらの金電極６２ａ、６２ｂ、６２ｃは互いに電気的に絶縁されている。基板６１としては各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、例えば、シリコン基板などの半導体基板、ガラス基板などの透明基板などを用いることができる。特に、基板６１としてシリコン基板などの半導体基板を用いることにより、従来公知の半導体テクノロジーを用いてカラー撮像素子の信号処理回路や駆動回路などをこの半導体基板に容易に形成することができる。基板６１として導電性基板を用いる場合には、例えば、この基板６１の表面にＳｉＯ2 膜などの絶縁膜を形成し、その上に金電極６２ａ、６２ｂ、６２ｃを形成してもよい。
【０１１４】
赤色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ａ上に自己組織化単分子膜６３ａを介して赤色光を吸収する亜鉛クロリンシトクロムｂ562 ６４が固定化されている。また、緑色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｂ上に自己組織化単分子膜６３ｂを介して緑色光を吸収する修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２ ６５が固定化されている（特許文献２参照）。また、青色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｃ上に自己組織化単分子膜６３ｃを介して青色光を吸収する亜鉛クロリンシトクロムｂ562 ６６が固定化されている。
【０１１５】
赤色光、緑色光および青色光のタンパク質光電変換素子としては、蛍光タンパク質を用いた次のようなものを用いてもよい。すなわち、図３９に示すように、赤色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ａ上に自己組織化単分子膜６３ａを介してシトクロムｂ562 ６７を固定化し、このシトクロムｂ562 ６７に赤色光を吸収する蛍光タンパク質６８を静電結合する。この蛍光タンパク質６８としては、市販の蛍光タンパク質や修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２などを用いることができる。また、緑色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｂ上に自己組織化単分子膜６３ｂを介してシトクロムｂ562 ６９を固定化し、このシトクロムｂ562 ６９に緑色光を吸収する蛍光タンパク質７０を静電結合する。この蛍光タンパク質７０としては、例えば市販の蛍光タンパク質や修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２などを用いることができる。また、青色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｃ上に自己組織化単分子膜６３ｃを介してシトクロムｂ562 ７１を固定化し、このシトクロムｂ562 ７１に青色光を吸収する蛍光タンパク質、例えば亜鉛置換シトクロムｃ５５２や市販の蛍光タンパク質などを静電結合する。
【０１１６】
赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子の基板６１上における配置の仕方は、従来公知のＣＣＤカラー撮像素子やＭＯＳカラー撮像素子などと同様であり、必要に応じて決められる。
上記以外のことは第１の実施の形態と同様である。
この第４の実施の形態によれば、タンパク質を用いた新規なカラー撮像素子を実現することができる。
【０１１７】
以上、この発明の実施の形態および実施例について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施の形態および実施例に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施の形態および実施例において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【符号の説明】
【０１１８】
１１…金電極、１２…タンパク質、１３…自己組織化単分子膜、１４…対極、１５…容器、１６…電解質溶液、１７…バイアス電源、１８…参照電極、２０…固体電解質、２１…封止壁、６１…基板、６２ａ、６２ｂ、６２ｃ…金電極、６３ａ、６３ｂ、６３ｃ…自己組織化単分子膜、６４…赤色光の光電変換素子、６５…緑色光の光電変換素子、６６…青色光の光電変換素子、６７、６９、７１…シトクロムｂ562
【技術分野】
【０００１】
この発明は、タンパク質光電変換素子、光電変換システム、タンパク質光電変換素子の製造方法、光電変換システムの製造方法およびタンパク質固定化電極に関する。この発明は、より詳細には、シトクロムｂ562 をベースとするタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子、光電変換システム、タンパク質光電変換素子の製造方法、光電変換システムの製造方法およびタンパク質固定化電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は半導体素子に代わる次世代の機能素子として期待されている。半導体素子の微細化は数十ｎｍのサイズが限界とされるなか、タンパク質は２〜１０ｎｍというはるかに小さいサイズで高度で複雑な機能を発揮する。
【０００３】
従来、タンパク質を用いた光電変換素子として、ウマ心筋シトクロムｃのヘムの中心金属の鉄を亜鉛に置換した亜鉛置換シトクロムｃを金電極に固定化したタンパク質固定化電極を用いたものが提案されており、このタンパク質固定化電極から光電流が得られることが示されている（特許文献１参照）。タンパク質を用いた光電変換素子としては、亜鉛置換シトクロムｃ５５２を金電極に固定化したタンパク質固定化電極を用いたものも提案されている（特許文献２参照）。
【０００４】
なお、シトクロムｂ562 については、大腸菌による発現・精製方法（非特許文献１参照）、立体構造（２５６Ｂ．ｐｄｂ、非特許文献２参照）、ヘムの抜き方（非特許文献３参照）、亜鉛ポルフィリンの入れ方（非特許文献４参照）、分子内へのキノンの入れ方（非特許文献５参照）、銀電極への固定化方法（非特許文献６参照）が報告されている。また、亜鉛置換シトクロムｃ５５２を用いた青色光の光電変換素子、修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２を用いた赤色光または緑色光の光電変換素子が提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２２０４４５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１９０６４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nikkila,H.,Gennis,R.B.,and Sliger,S.G.Eur.J.Biochem.202,309(1991)
【非特許文献２】Mathews,F.S.,Bethge,P.H.,and Czerwinski,E.W.J.Biol.Chem.254,1699(1979)
【非特許文献３】Itagaki,E.,Palmer,G.and Hager,L.P.J.Biol.Chem.242,2272(1967)
【非特許文献４】Hamachi,I.,Takashima,H.,Tsukiji,S.Shinkai,S.,Nagamune,T.andOishi,S.Chem.Lett.1999,551(1999)
【非特許文献５】Hay,S.,Wallace,B.B.,Smith,T.A.,Ghiggino,K.P.and Wydrzynski,T.Proc.Natl.Sci USA,101,17675(2004)
【非特許文献６】Zuo,P.,Albrecht,T.Baker,P.D.,Murgida,D.H.,and Hildebrandt,P.Phys.Chem.Chem.Phys.11,7430(2009)
【非特許文献７】Mennenga,A.,Gartner,W.,Lubitz,W.and Gorner,H.Phys.Chem.Chem.Phys.8,5444(2006)
【非特許文献８】Shih,C.,Museth,A.K.,Abrahamsson,M.,Blanco-Rodriguez,A.M.,Bilio,A.J.D.and 8 others,Science,320,1760(2008)
【非特許文献９】Yasutomi,S.,Morita,T.,Imanishi,Y.and Kimura,S.Science,304,1944(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１で提案された光電変換素子で用いられている亜鉛置換シトクロムｃの調製に用いられるウマ心筋シトクロムｃにおいては、補欠分子族であるポルフィリンはシステイン残基と共有結合をしている。このため、ウマ心筋シトクロムｃからポルフィリンを外すことは容易ではなく、中心の鉄を亜鉛やスズに置換するといった操作しかできなかった。この結果、使用可能なタンパク質の種類が極少数に限定されていた。
【０００８】
そこで、この発明が解決しようとする課題は、大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子およびその製造方法を提供することである。
【０００９】
この発明が解決しようとする他の課題は、大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子を用いた光電変換システムおよびその製造方法を提供することである。
【００１０】
この発明が解決しようとするさらに他の課題は、大腸菌由来のシトクロムｂ562 あるいこはこのシトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質が固定化されたタンパク質固定化電極およびその製造方法を提供することである。
上記課題および他の課題は、添付図面を参照した本明細書の記述から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、従来技術が有する上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、タンパク質光電変換素子のタンパク質として、大腸菌由来のシトクロムｂ562 をベースとしたものを用いることが有効であることを見出した。このシトクロムｂ562 はヘムあるいはポルフィリンの出し入れを簡単に行うことができ、中心金属の置換を行ったり、ポルフィリンの改変を行ったりすることにより、多色化を簡単に行うことができる。また、シトクロムｂ562 あるいはシトクロムｂ562 をベースとするタンパク質は金電極に容易に固定化することができることを見出した。また、π電子を有するレドックスアクティブな基をシトクロムｂ562 をベースとしたタンパク質の分子内に導入することにより、光電流を増幅することができることを見出した。
【００１２】
この発明は、本発明者らが独自に得た上記の知見に基づいて鋭意検討を行った結果、案出されたものである。
【００１３】
すなわち、上記課題を解決するために、この発明は、
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子である。
【００１４】
また、この発明は、
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子を有する光電変換システムである。
【００１５】
また、この発明は、
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有するタンパク質光電変換素子の製造方法である。
【００１６】
また、この発明は、
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有する光電変換システムの製造方法である。
【００１７】
また、この発明は、
金電極と、
上記金電極に固定化されたシトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質固定化電極である。
【００１８】
好適には、上記の金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体、あるいは、シトクロムｂ562 またはその誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を金電極側に向けて固定化される。必要に応じて、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入される。このレドックスアクティブな基としては、従来公知のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、好適にはトリプトファンまたはキノンが用いられる。金属置換シトクロムｂ562 の金属は、目的とする光電変換波長が得られるように適宜選ばれるが、例えば、亜鉛（Ｚｎ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、バリウム（Ｂａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、カドミウム（Ｃｄ）、アンチモン（Ｓｂ）、トリウム（Ｔｈ）、鉛（Ｐｂ）などである。シトクロムｂ562 、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の誘導体は、それらの骨格のアミノ酸残基もしくはポルフィリンが化学修飾されたものである。また、シトクロムｂ562 、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の変異体は、それらの骨格のアミノ酸残基の一部が他のアミノ酸残基に置換されたものである。
【００１９】
光電変換システムは、典型的には、互いに異なる波長の光に対して応答する二種類以上の光電変換素子を含み、少なくともこれらの光電変換素子のうちの一種類が、金電極と、この金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子である。光電変換システムを構成する光電変換素子の数は、光電変換システムの用途などに応じて適宜選ばれる。光電変換システムは、例えば、カラー撮像素子、光センサーなどである。
【００２０】
上記のタンパク質光電変換素子は、金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化したタンパク質固定化電極に加えて対極を有する。この対極は、このタンパク質固定化電極に対して間隔を空けて対向するように設けられる。
【００２１】
上述のように構成されたこの発明においては、大腸菌由来のシトクロムｂ562 は、シトクロムｃに比べてヘムあるいはポルフィリンの出し入れを容易に行うことができる。このため、シトクロムｂ562 をベースとして、金属置換シトクロムｂ562 や亜鉛クロリンシトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を容易に調製することができる。また、これらの金属置換シトクロムｂ562 や亜鉛クロリンシトクロムｂ562 やそれらの誘導体あるいは変異体をタンパク質光電変換素子に用いることにより、様々な波長の可視光を吸収する光電変換素子を得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
この発明によれば、シトクロムｂ562 をベースとして調製される金属置換シトクロムｂ562 などの各種のタンパク質を用いたタンパク質光電変換素子やこのタンパク質光電変換素子を用いた各種の光電変換システムなどを実現することができる。素子を実現することができる。そして、このように優れたカラー撮像素子、光センサーまたは光電変換素子を用いることにより優れた電子機器を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す略線図である。
【図２】精製されたシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを示す略線図である。
【図３】シトクロムｂ562 の構造を示す略線図である。
【図４】シトクロムｂ562 が自己組織化単分子膜を介して金電極に吸着した様子を模式的に示す略線図である。
【図５】シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られたサイクリックボルタモグラムを示す略線図である。
【図６】亜鉛置換シトクロムｂ562 の吸収スペクトルを示す略線図である。
【図７】亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流リアルタイムウェーブフォームを示す略線図である。
【図８】亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図９】亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図１０】亜鉛クロリンの構造を示す略線図である。
【図１１】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 のカラム溶出パターンを示す略線図である。
【図１２】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを示す略線図である。
【図１３】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図１４】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極およびクロリン固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図１５】亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図１６】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎの吸収スペクトルを示す略線図である。
【図１７】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎが自己組織化単分子膜を介して金電極に吸着した様子を模式的に示す略線図である。
【図１８】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図１９】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極および野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図２０】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極および野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流リアルタイムウェーブフォームを示す略線図である。
【図２１】亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極および野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた光電流アクションスペクトルを示す略線図である。
【図２２】メチルビオロゲンの添加量を変化させた野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図２３】メチルビオロゲンの添加量を変化させた亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いて得られた電流−電圧曲線を示す略線図である。
【図２４】シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶の光学顕微鏡像を示す図面代用写真である。
【図２５】シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶の単位胞を示す略線図である。
【図２６】シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎのトリプトファン１７付近の構造を示す略線図である。
【図２７】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＡ鎖を比較して示す略線図である。
【図２８】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＣ鎖を比較して示す略線図である。
【図２９】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＡ鎖のトリプトファン１７近傍の構造を示す略線図である。
【図３０】野生型シトクロムｂ562 およびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３ＮのＣ鎖のトリプトファン１７近傍の構造を示す略線図である。
【図３１】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子を示す略線図である。
【図３２】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子の使用形態の第１の例を示す略線図である。
【図３３】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子の使用形態の第２の例を示す略線図である。
【図３４】この発明の第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子の使用形態の第３の例を示す略線図である。
【図３５】この発明の第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子を示す断面図である。
【図３６】図３５に示す非接液全固体型タンパク質光電変換素子の要部を拡大して示す断面図である。
【図３７】この発明の第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作を説明するための略線図である。
【図３８】この発明の第４の実施の形態によるカラー撮像素子の第１の例を示す略線図である。
【図３９】この発明の第４の実施の形態によるカラー撮像素子の第２の例を示す略線図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、発明を実施するための形態（以下「実施の形態」とする）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態（タンパク質固定化電極およびその製造方法）
２．第２の実施の形態（タンパク質光電変換素子）
３．第３の実施の形態（非接液全固体型タンパク質光電変換素子）
４．第４の実施の形態（カラー撮像素子）
【００２５】
〈１．第１の実施の形態〉
［タンパク質固定化電極］
図１は第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す。
【００２６】
図１に示すように、このタンパク質固定化電極においては、金電極１１上に大腸菌由来のシトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質１２が固定化されている。
【００２７】
図１においては一分子のタンパク質１２が示されているが、金電極１１上に固定化するタンパク質１２の数は必要に応じて決められ、一般的には複数のタンパク質１２が単分子膜または多分子膜として固定化される。また、図１においては、金電極１１は平坦な表面形状を有するように描かれているが、金電極１１の表面形状は任意であり、例えば凹面、凸面、凹凸面などのいずれであってもよく、いずれの形状の面にも容易にタンパク質１２を固定化することができる。また、金電極１１の全体形状も任意であり、例えば板状、ドロップ状などのいずれであってもよい。
【００２８】
タンパク質１２は、好適には、このタンパク質１２のヘムまたはポルフィリンのプロピオン酸が金電極１１側を向くように固定化される。この場合、このタンパク質１２のヘムまたはポルフィリンのプロピオン酸サイトは大きな負電荷を有するため、金電極１１の表面に正電荷を持たせると、タンパク質１２を静電引力により金電極１１に吸着させることができる。金電極１１の表面に正電荷を持たせる方法としては、従来公知の各種の方法を用いることができ、必要に応じて選ばれるが、例えば、金電極１１上に、最表面に正電荷が現れるように自己組織化単分子膜（self-assembled monolayer, ＳＡＭ）を形成する方法を用いることができる。
【００２９】
［タンパク質固定化電極の製造方法］
このタンパク質固定化電極は、例えば、金電極１１の表面に正電荷を持たせた後、タンパク質１２を溶解した緩衝液に金電極１１を浸漬して金電極１１の表面にタンパク質１２を吸着させることにより製造することができる。
【００３０】
［実施例１］
ａ．大腸菌由来シトクロムｂ562 の発現・精製方法
大腸菌由来シトクロムｂ562 の構造遺伝子を組み込んだプラスミド（Ｃｙｔ−ｂ５６２／ｐＫＫ２２３−３）を作製し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。発現・精製方法は非特許文献１に準じた。
【００３１】
ＬＢ−Ａｍｐ培地１００ｍＬで３７℃、オーバーナイト培養した前培養液を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ ４Ｌ（２Ｌ×２）に移し、３７℃で５〜６時間培養した。０．２ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに２５℃で１８時間培養することで、赤色の菌体７０ｇを得ることができた。凍結した菌体を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＤＴＴ（適当）、ＤＮａｓｅ（適当）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００ｍＬに懸濁し、超音波で細胞粉砕した。
【００３２】
遠心上澄みに２Ｍリン酸を加えてｐＨ４．５５に調整し、不要タンパク質を遠心沈殿させた。このサンプルを、ＣＭ５２陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（カラム体積８０ｍＬ、５０〜１５０ｍＭ ＫＣｌ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ／５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ４．５５））、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ Ｆｉｎｅゲルろ過クロマトグラフィー（カラム体積４８０ｍＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）により精製し、約８０ｍｇのシトクロムｂ562 を得ることができた。
【００３３】
精製されたシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを図２に示す。測定は、精製されたシトクロムｂ562 を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図２に示すように、精製された状態では、シトクロムｂ562 は、４１８ｎｍ、５３２ｎｍに吸収ピークのある酸化型であった。緩衝液に少量のジチオナイトを加えて還元型としたところ、４２６ｎｍ、５３１ｎｍ、５６２ｎｍの吸収ピークが確認された。
【００３４】
得られたシトクロムｂ562 のアミノ酸配列は下記のとおりである。このアミノ酸配列では、後述のように、下線を付したヘムの配位子メチオニン７およびヒスチジン１０２と、イソロイシン１７とが重要な役割を果たす。
【００３５】
ＡＤＬＥＤＮＭＥＴＬ ＮＤＮＬＫＶＩＥＫＡ ＤＮＡＡＱＶＫＤＡＬ ＴＫＭＲＡＡＡＬＤＡ ＱＫＡＴＰＰＫＬＥＤ ＫＳＰＤＳＰＥＭＫＤ ＦＲＨＧＦＤＩＬＶＧ ＱＩＤＤＡＬＫＬＡＮ ＥＧＫＶＫＥＡＱＡＡ ＡＥＱＬＫＴＴＲＮＡ ＹＨＱＫＹＲ
【００３６】
ｂ．シトクロムｂ562 の金ドロップ電極への固定化
１９７９年にＸ線結晶構造解析により決定されたシトクロムｂ562 の結晶構造（非特許文献２参照）を図３Ａ、ＢおよびＣに示す。ここで、図３Ａはリボンモデルを示し、ヘムとその配位子アミノ酸を棒モデルで示す。図３Ｂはシトクロムｂ562 が図３Ａと同じ向きの時の電荷分布を示し、楕円状の破線で囲まれた部分が一番強く負に帯電しているヘム−プロピオン酸露出面である（図３Ｃでも同様）。図３Ｃはシトクロムｂ562 を図３Ｂの状態から縦軸の周りに１８０度回転させた状態（図３Ｂに示す状態のシトクロムｂ562 の裏側）の電荷分布を示す。図３Ａ、ＢおよびＣに示すように、シトクロムｂ562 は４ヘリックスバンドル構造を有し、補欠分子族ヘムを１分子有する。そのヘムのプロピオン酸は分子から足を出すように露出している。図３Ｂに示す電荷分布を見ると、ちょうどそのヘムのプロピオン酸サイトに強い負電荷を持つことが分かる。したがって、金電極１１の表面に正電荷を持たせると、シトクロムｂ562 をヘムのプロピオン酸サイトで金電極１１に吸着させることができる。その模式図を図４に示す（ヘムのみ棒モデルで示す）。この例では、金電極１１上に、最表面に正電荷を有する自己組織化単分子膜１３を形成し、この自己組織化単分子膜１３の最表面の正電荷とシトクロムｂ562 のヘムのプロピオン酸サイトの負電荷との間に働く静電引力によりシトクロムｂ562 が自己組織化単分子膜１３に吸着している。
【００３７】
金電極１１として直径２ｍｍの金ドロップ電極を形成した。
この金ドロップ電極を熱濃硫酸（１２０℃）で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス（粗さ）を増した。この金ドロップ電極を０．１ｍＭ １１−アミノウンデカンチオール（Ｈ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ）／エタノール溶液に室温で１６時間以上浸し、金ドロップ電極の表面に自己組織化単分子膜１３としてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した。こうしてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した金ドロップ電極に圧縮エアを当てて乾燥後、５０μＭシトクロムｂ562 ／４．４ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）溶液６０μＬにソーキングし、４℃で一昼夜インキュベートした。
【００３８】
インキュベートした金ドロップ電極を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に浸漬して測定したサイクリックボルタモグラムを図５に示す。電位掃引速度は１Ｖ／ｓである。図５に示すように、吸着型のサイクリックボルタモグラムが得られた。金ドロップ電極の表面のシトクロムｂ562 の有効表面積は１．７±０．６ｐｍｏｌ／ｃｍ2 、酸化還元電位は−４±１１ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ、シトクロムｂ562 −金ドロップ電極間の電子伝達速度定数は９０±１２ｓ-1であった。同様の吸着効果は、金ドロップ電極の表面に形成する１１−アミノウンデカンチオールに０〜１０％のヒドロキシウンデカンチオールを混在させても得られる。図５に、１１−アミノウンデカンチオールに１０％のヒドロキシウンデカンチオールを混在させた場合のサイクリックボルタモグラムを示す。
【００３９】
［実施例２］
ａ．亜鉛置換シトクロムｂ562 の調製
亜鉛置換シトクロムｂ562 の調製法はすでにＨａｍａｃｈｉらによる報告（非特許文献４）があるため、それに準じて亜鉛置換シトクロムｂ562 の調製を行った。
【００４０】
まず、シトクロムｂ562 水溶液（３３μＭ）３ｍＬに、１Ｍ塩酸を加え、ｐＨを２〜３に調整した。このシトクロムｂ562 水溶液に、あらかじめ水冷しておいた２−ブタノンを３ｍＬ加え、穏やかに攪拌してシトクロムｂ562 からヘムを抽出し、ブタノン層をピペッティングで取り除いた。ブタノン層が色を呈さなくなるまで、この抽出操作を繰り返した。こうしてヘムの抽出操作を繰り返した水溶液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を極少量加え、ｐＨを７〜８に調整後、超純水に対して透析（２Ｌ×５回）を行い、アポシトクロムｂ562 を得た。
【００４１】
亜鉛プロトポルフィリンＩＸ（ＺｎＰＰ）をジメチルスルホキシドに溶かし、上記のアポシトクロムｂ562 溶液に２等量加えていった。これを、あらかじめ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化しておいたＢｉｏ−ｇｅｌ Ｐ１０脱塩カラムを用いて、タンパク質画分を回収し、精製亜鉛置換シトクロムｂ562 （Ｚｎ−Ｃｙｔ ｂ562 ）を得た。
【００４２】
得られた亜鉛置換シトクロムｂ562 の吸収スペクトルを図６に示す。測定は、亜鉛置換シトクロムｂ562 を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図６に示すように、２８０ｎｍ、３５７ｎｍ、４２９ｎｍ、５５４ｎｍ、５９３ｎｍに吸収ピークがあり、その位置は非特許文献４と一致していた。また、波長５５４ｎｍでの吸光度に対する波長４２９ｎｍでの吸光度の比（Ａ４２９／Ａ５５４）は１１．０５であった。
【００４３】
ｂ．亜鉛置換シトクロムｂ562 の金ドロップ電極への固定化と光電流測定
金電極１１として直径２ｍｍの金ドロップ電極を形成した。
【００４４】
この金ドロップ電極を熱濃硫酸（１２０℃）で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス（粗さ）を増した。この金ドロップ電極を０．１ｍＭ １１−アミノウンデカンチオール（Ｈ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ）／エタノール溶液に室温で１６時間以上浸し、金ドロップ電極の表面に自己組織化単分子膜１３としてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した。こうしてＨ2 Ｎ−Ｃ11−ＳＨ膜を形成した金ドロップ電極に圧縮エアを当てて乾燥後、５０μＭ亜鉛置換シトクロムｂ562 ／４．４ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）溶液６０μＬにソーキングし、４℃で一昼夜インキュベートした。
【００４５】
光電流測定は、窒素パージしておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用い、対極としてＰｔメッシュ電極を用いて行った。
【００４６】
バイアス電圧３００ｍＶ、０ｍＶ、−３００ｍＶにおける光電流の測定結果（光電流リアルタイムウェーブフォーム）を図７に示す。図７は、波長４２０ｎｍの光を３０秒照射し、１０秒オフしたときの電流値を時間に対してプロットしたものである。図７に示すように、このバイアス電圧の範囲では、全てカソーディックな光電流が観測された。光電流アクションスペクトルを図８に示す。図８に示すように、ピーク電流を示す波長は４１８〜４２０ｎｍ、５５０ｎｍ、５８６ｎｍであり、図６に示す亜鉛置換シトクロムｂ562 の溶液紫外可視吸収スペクトルにおける吸収極大波長４２９ｎｍ、５５４ｎｍ、５９３ｎｍと大きく異なっている。また、波長５５０ｎｍにおける光電流に対する波長４１８〜４２０ｎｍにおける光電流の比は３．７であり、図６に示す吸収スペクトルにおけるその光電流の比１１．０５に対して大きく下回っている。波長４２０ｎｍにおける光電流値を電位Ｅに対してプロットしたグラフを図９に示す。図９において、電流−電圧曲線に付けた数字はデータ取得順を示す。特許文献１によれば、亜鉛置換シトクロムｃを金電極に固定化した場合には−１００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）付近にスレッショルドを持ち、この電位を境に光電流の反転が見られるのに対し、図９に示すように、亜鉛置換シトクロムｂ562 ではそれが見られない。また、フェロシアン化カリウムを加えてもこの光電流はエンハンスされない。これは特許文献１とは異なる。
【００４７】
［実施例３］
ａ．亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の調製
実施例２と同様にしてアポシトクロムｂ562 を得た。
【００４８】
亜鉛クロリン（ＺｎＣｅ６、図１０）の合成は非特許文献７に従った。化合物を溶かす緩衝液は全て２５ｍＭグリシンと５０ｍＭ ＮａＣｌとの混合液（ｐＨ１０）（以下「緩衝液Ａ」という。）を用いた。１０ｍＭクロリンｅ６を５０μＬ、緩衝液Ａを４５μＬ、１００ｍＭ無水酢酸亜鉛を５μＬ混ぜ、氷中で３０分以上インキュベートした（ＺｎＣｅ６として５００ｎｍｏｌ）。溶液が深緑から鮮やかな緑になった。
【００４９】
この溶液に５５．６μＭのアポシトクロムｂ562 を等量加え（アポシトクロムｂ562 ：５．１ｎｍｏｌ）、さらに氷中で３０分以上、インキュベートした。混合液をＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ脱塩カラム（バイオラッド）にロードし、５０ｍＭ ＫＰｉ、１００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．２で溶出した。緩衝液としては、５０ｍＭ ＫＰｉ、１００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．２を用いた。フラクションを１ｍＬずつ集め、波長２８０ｎｍ、４１２ｎｍ、６３４ｎｍでの吸光度を測定した。溶出パターンを図１１に示す。図１１に示すように、一番下の曲線のバンドが二つに分かれて出てきた。初めて出てきたタンパク質フラクション（溶出体積４〜８ｍＬ）にも色素による吸収があった。溶出体積１０ｍＬ以上は色素である。
【００５０】
また、このとき、亜鉛を入れないとタンパク質フラクションに色素による吸収は見られなくなる。すなわち、亜鉛とシトクロムｂ562 との配位結合が色素の取り込みに重要である。この傾向は、亜鉛ビリベルジンｂ562 調製の際と同じである。
【００５１】
精製した亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の吸収スペクトルを図１２に示す。測定は、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 を１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図１２に示すように、波長４２５ｎｍおよび波長６４１ｎｍに吸収ピークがある。
【００５２】
ｂ．亜鉛クロリンシトクロムｂ562 の金ドロップ電極への固定化と光電流測定
金電極１１として直径２ｍｍの金ドロップ電極を形成した。
【００５３】
この金ドロップ電極を熱濃硫酸（１２０℃）で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス（粗さ）を増した。この金ドロップ電極を０．１ｍＭ １１−アミノウンデカンチオール塩酸塩／エタノール溶液に漬け込み、室温で１６時間以上インキュベートした。この金ドロップ電極をエタノールでリンス後、５０μＭ亜鉛クロリンシトクロムｂ562 ／４．４ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．２）溶液６０μＬに浸し、４℃で一昼夜インキュベートした。この亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極とは別に、亜鉛クロリン（ＺｎＣｅ６）のみ、クロリン（Ｃｅ６）のみに浸した金ドロップ電極も調製した。
【００５４】
光電流測定は、窒素パージしておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用い、対極としてＰｔメッシュ電極を用いて行った。
【００５５】
バイアス電圧２００ｍＶ〜−２００ｍＶにおける光電流アクションスペクトルを図１３に示す。測定は、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）緩衝液中に浸漬した状態で行った。図１３に示すように、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極では、カソーディックな光電流が観測される。また、青色帯の４２０ｎｍに加えて赤色帯の６３６ｎｍにも電流応答が観測される。これは、亜鉛ポルフィリン系タンパク質光電変換素子で初めて赤色光応答の光電流が観測された世界初の事例である。
【００５６】
図１４は、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合と、亜鉛クロリン（ＺｎＣｅ６）のみ、クロリン（Ｃｅ６）のみ固定化した金ドロップ電極を用いた場合との光電流アクションスペクトルを比較して示したものである。バイアス電圧は−２００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌである。図１４に示すように、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合には、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合に比べて、２ｎｍほどレッドシフト（赤方偏移）している。また、波長４６０ｎｍ付近のふくらみが、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合には見えていない。したがって、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 と亜鉛クロリンとでは色素周りの環境が異なっていると考えられる。光電流量は亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合の方が、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合より大きい。これは、金ドロップ電極への吸着量が、亜鉛クロリンの方が亜鉛クロリンシトクロムｂ562 より多いためであると考えられる。
【００５７】
図１５は、波長４２０ｎｍおよび波長６３６ｎｍにおける光電流値を電位Ｅに対してプロットしたグラフを示す。図１５に示すように、正電圧を印加してもアノーディック電流は観察されなかった。この図１５に示す電流−電圧曲線はダイオード様の挙動を示している。この傾向は、亜鉛クロリン固定化金ドロップ電極、クロリン固定化金ドロップ電極を用いた場合でも同じであった。また、実施例２の亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化金ドロップ電極を用いた場合にも同様の傾向が見られている（図９参照）。
【００５８】
［実施例４］
ａ．シトクロムｂ562 のトリプトファンおよびシステイン変異体の調製
実施例１の発現プラスミドと下記のプライマー（下線は変異箇所）を用いて、Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎ（イソロイシン１７をトリプトファンに、ヒスチジン６３をアスパラギンに変更）変異体、および、Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎ（イソロイシン１７をシステインに、ヒスチジン６３をアスパラギンに変更）変異体プラスミドをStratagene社製、QuickChange Lightning Site directed mutagenesis kit を用いて調製した。なお、Ｈ６３Ｎの変異は、亜鉛ポルフィリンの再構成時に、このヒスチジンに亜鉛ポルフィリンが配位結合するのを避けるためである（非特許文献７参照）。また、イソロイシン１７と異なるアミノ酸残基をトリプトファンに変更してもよい。
【００５９】
Ｉ１７Ｗ ｓｅｎ：５’−ＣＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ−３’
Ｉ１７Ｗ ａｎｓ：５’−ＣＣＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧ−３’
Ｉ１７Ｃ ｓｅｎ：５’−ＣＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ−３’
Ｉ１７Ｃ ａｎｓ：５’−ＣＣＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧ−３’
Ｈ６３Ｎ ｓｅｎ：５’−ＧＡＴＴＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−３’
Ｈ６３Ｎ ａｎｓ：５’−ＧＴＣＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＣ−３’
【００６０】
このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、実施例１と同様の培養・発現・精製過程を経て、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎおよびシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎを調製した。
【００６１】
ｂ．キノン導入アポシトクロムｂ562 変異体の調製
上記の精製シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎから実施例２と同様にして酸−ブタノン法により脱ヘムし、超純水（２Ｌ×３回）、１ｍＭ ＤＴＴ（２Ｌ×１回）、１ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ ｐＨ５．０、１００ｍＭ ＫＣｌ（２Ｌ×１回）に対して透析し、アポタンパク質を調製した。
【００６２】
得られたアポタンパク質に対して５倍モル量のパラベンゾキノン（ＢＱ）または２，３−ジトメキシ−５−メチルパラベンゾキノン（ＣｏＱ）を加え、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中、室温で３０分インキュベートした。反応溶液を１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）（１Ｌ×２回）、超純水（１Ｌ×１回）に対して透析し、キノン修飾体を調製した。ＢＱ体は薄いマゼンタ色、ＣｏＱ体は薄い黄色を呈した。
【００６３】
なお、この方法により遊離のシステイン残基に後述の図１７の右に示すようにキノンが結合することが報告されている。このタンパク質に唯一存在するシステイン１７にキノンが結合していると考えられる。
【００６４】
ｃ．亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎの調製
上記のキノン導入アポタンパク質に対し、２．２〜２．５倍量の亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）を加え、Ｂｉｏ−ｒａｄ ＥｃｏｎｏＰａｃ１０ ＤＧ脱塩カラム（緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）でタンパク質画分を回収した。こうして得られた亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎの吸収スペクトルを図１６に示す。図１６の右上の挿入図は野生型（ＷＴ）の吸収スペクトルを示す。
【００６５】
ｄ．亜鉛置換シトクロムｂ562 変異体の金ドロップ電極への固定と光電流測定
上記のようにして得られた亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎを実施例１と同様に、１１−アミノウンデカンチオールを用いて金ドロップ電極に固定化した。亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎを金ドロップ電極からなる金電極１１上の自己組織化単分子膜１３に吸着させた時の模式図を図１７に示す。図１７において、１７番目のアミノ酸（Ｗ、ＢＱ、ＣｏＱ）と６３番目のアスパラギン（Ｈ６３Ｎ）を棒モデルで示す。この亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｃ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極に光を照射すると、電子（ｅ- ）が破線で示すように電極から分子表面方向へと抜け出す。図１７には、トリプトファン（Ｔｒｐ）、システイン（Ｃｙｓ）に結合したパラベンゾキノン（ＢＱ）およびシステインに結合した２，３−ジメトキシ−５−メチルパラベンゾキノン（ＣｏＱ）の構造を示した。
【００６６】
光電流測定は、窒素パージしておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用い、対極としてＰｔメッシュ電極を用いて行った。
【００６７】
亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ（ただし、Ｘ＝ＣｏＱ、Ｗ、ＢＱ）または野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 を固定化した金ドロップ電極を用いた場合の光電流アクションスペクトルを図１８に示す。バイアス電圧は−３００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌである。図１８に示すように、カソーディック電流発生においては、Ｉ１７Ｗ、Ｉ１７ＣｏＱ、Ｉ１７ＢＱ変異体の光電流は野生型の２〜３倍であった。これらの変異残基が、光電流を増加させていると考えられる。波長４２０ｎｍにおける光電流値を電位Ｅに対してプロットしたグラフを図１９に示す。図１９において、電流−電圧曲線に付けた数字はデータ取得順を示す。
【００６８】
非特許文献８では、レニウム錯体で修飾した銅タンパク質・アズリンにトリプトファンを導入し（２１７０．ｐｄｂ）、レニウム−銅間の電子伝達速度を２桁向上させたことが報告されているが、これはタンパク質分子の表面に配置されたトリプトファンである。これに対し、実施例４は、タンパク質分子の内部に導入したトリプトファンが光電流を増加させたという世界初の事例である。
【００６９】
一方、金ドロップ電極を使った実験で得られた光電流値５０〜８０ｎＡは、特許文献１の実験で得られた光電流値の約５０〜８０倍に相当する。
【００７０】
亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いた場合、野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 またはＺｎＰＰのみを固定化した金ドロップ電極を用いた場合のバイアス電圧３００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）における光電流の測定結果（光電流リアルタイムウェーブフォーム）を図２０に示す。緩衝液としては、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いた。図２０は、波長４２０ｎｍの光を３０秒照射し、１０秒オフしたときの電流値を時間に対してプロットしたものである。図２０に示すように、亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極では、微弱ながらもカソーディックな光電流を発生しているのに対し、ＺｎＰＰ固定化金ドロップ電極ではそれがない。
【００７１】
亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎ固定化金ドロップ電極を用いた場合、野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 またはＺｎＰＰ単体を固定化した金ドロップ電極を用いた場合のバイアス電圧０ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）における光電流アクションスペクトルを図２１に示す。緩衝液としては、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いた。図２１に示すように、光電流アクションスペクトルも、ＺｎＰＰ単体と亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｘ／Ｈ６３Ｎに包括された状態とでは異なる。したがって、図１８で見られた光電流はタンパク質由来のものである。
【００７２】
［亜鉛置換シトクロムｂ562 の光電流の発生におけるメチルビオロゲンの効果］
特許文献１によると、亜鉛置換シトクロムｃ固定化電極にメディエーターとしてフェロ／フェリシアナイド（Ｅ0 ＝３６０ｍＶ ｖｓ ＮＨＥ）を入れると、光電流がエンハンスされる。光照射によりポルフィリンの電子が励起され、光励起に関わる分子軌道（Ｇｏｕｔｅｒｍａｎの４軌道）のうち、被占軌道の二つ（ポルフィリンπ軌道に亜鉛−硫黄のπ結合性軌道が混成したもの）に正孔（ホール）が発生する。その正孔がタンパク質の外殻アミノ酸に局在化した分子軌道と強くカップルし、色素上で発生した正孔はタンパク質の外殻（溶液側）に移動する。フェロ／フェリシアナイドはその正孔を埋めるというモデルが提唱されている。
【００７３】
しかしながら、亜鉛置換シトクロムｂ562 の一連の実験では、フェロ／フェリシアナイドを加えても光電流に影響はなかった。そして、亜鉛置換シトクロムｂ562 固定化電極からはカソーディックな光電流しか見られない。また、ダイオード様の発生挙動を示すことから、励起電子が分子表面方向へ抜けていくと考えられる。そこで、非特許文献９にならい、励起電子をエンハンスさせる効果があるメチルビオロゲン（Ｅ0 ＝−４４０ｍＶ ｖｓ ＮＨＥ）を加えて光電流測定を行った。
【００７４】
図２２は、野生型亜鉛置換シトクロムｂ562 を固定化した金ドロップ電極の光電流発生におけるメチルビオロゲン（ＭＶ）の効果を示す。また、図２３は、亜鉛置換シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎを固定化した金ドロップ電極の光電流発生におけるメチルビオロゲンの効果を示す。図２２および図２３においては、カソーディックな光電流の発生量の増加を分かりやすくするために、横軸（バイアス電圧）および縦軸（波長４２０ｎｍにおける光電流値）ともに反転させてある。図２２および図２３に示すように、野生型、トリプトファン変異型の両方で、メチルビオロゲンの添加により光電流量が増加するのが見られる。したがって、この亜鉛置換シトクロムｂ562 の光電流は正孔移動に由来するものではなく、励起電子の移動に由来するものである可能性が高い。亜鉛置換シトクロムｂ562 の全電子計算もこの現象を説明することができる。
【００７５】
［トリプトファン変異シトクロムｂ562 のＸ線結晶構造解析］
３０ｍｇ／ｍＬのシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎ溶液（１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ ｐＨ５．０）を等量の０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、４５％Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｐ４００（Ｉｎｄｅｘ−５８）と混ぜ、シッティングドロップ蒸気拡散法、ハンギングドロップ蒸気拡散法で２０℃、２日間インキュベートすることで、図２４に示すようなシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶が得られた。図２４中の両矢印は０．１ｍｍを示す。得られた結晶は空間群Ｐ１のツイン結晶で、２．５３Å分解能の回折データを得ることができた。その統計値を表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
野生型シトクロムｂ562 の構造（２５６Ｂ．ｐｄｂ）中、ｃｈａｉｎＡのみ（ヘム以外のヘテロ分子、ダイマー中のｃｈａｉｎＢを削除した座標データ）をテンプレートとして用い、プログラムＭｏｌｒｅｐ／ＣＣＰ４で分子置換を行った。図２５に示すように、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの結晶では、単位胞中に６分子が含まれる。図２６は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎのトリプトファン１７付近の構造を示すステレオ図であり、単位胞中の６分子全てを重ね合わせてある。トリプトファン１７（Ｔｒｐ１７）の側鎖の向きはいずれの分子も同じである。
【００７８】
プログラムＲｅｆｍａｃ５／ＣＣＰ４でＲｉｇｉｄｂｏｄｙ→Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ→ＴＬＳ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（全てＡｍｐｌｉｔｕｄｅ ｂａｓｅｄ ｔｗｉｎ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔを使用）、Ｃｏｏｔでマニュアルモデル構築を行った。Ｉ１７Ｗ、Ｈ６３Ｎの変異を入れた。精密化の統計値を表１に示す。
【００７９】
図２７は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＡ鎖（単位胞中に６分子あるうちの一つ）を比較したものである。図２８は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＣ鎖（単位胞中に６分子あるうちの一つ）を比較したものである。図２７および図２８において、ヘムおよびトリプトファン１７は棒モデルで示してある。図２７および図２８に示すように、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎの全体構造は野生型シトクロムｂ562 と同様の４ヘリックスバンドル構造を保っていた。図２７および図２８において、トリプトファン１７の向かい側にあるＨｅｌｉｘ ＩＶが分子の外側に押し退けられている（破線の矢印部分）。野生型シトクロムｂ562 とシトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎとのアミノ酸α炭素のｒ．ｍ．ｓ．（二乗平均平方根）偏差は０．５Å程度である。トリプトファン１７は６分子全てが同じ側鎖のコンフォーマーを持っており（図２６参照）、この側鎖の位置・配向が一般解であることが分かった。
【００８０】
図２９は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＡ鎖におけるトリプトファン１７近傍の構造を比較したものである。図３０は、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 とのＣ鎖におけるトリプトファン１７近傍の構造を比較したものである。図２９および図３０において、トリプトファン１７、グルタミン８８、アラニン９１、ロイシン９４を棒モデルで示す。その他はアミノ酸α炭素のトレースである。Ｉ１７Ｗは４ヘリックスバンドルの中心に位置している。１７番目のアミノ酸がイソロイシンからトリプトファンに変わったことで、アラニン９０、アラニン９１付近の配置が野生型よりも１〜２Å、分子表面側へ押し退けられている。それによって、ロイシン９４の向きが変わる。
【００８１】
シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎと野生型シトクロムｂ562 との全体構造に大きな違いは見られないため（図２７および図２８）、シトクロムｂ562 ＿Ｉ１７Ｗ／Ｈ６３Ｎは野生型シトクロムｂ562 と同じように金電極に吸着するものと考えられる。
【００８２】
以上のように、この第１の実施の形態によれば、シトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質１２が金電極１１上に固定化されたタンパク質固定化電極を得ることができる。本発明者らの知る限り、金電極１１上へのシトクロムｂ562 、金属置換シトクロムｂ562 、亜鉛クロリンシトクロムｂ562 などの固定化に成功したのは本発明らが初めてである。そして、例えば、タンパク質１２として亜鉛置換シトクロムｂ562 を用いることにより、青色光に応答するタンパク質固定化電極を得ることができ、このタンパク質固定化電極を用いることにより青色光のタンパク質光電変換素子を実現することができる。また、タンパク質１２として亜鉛クロリンシトクロムｂ562 を用いることにより、赤色光に応答するタンパク質固定化電極を得ることができ、このタンパク質固定化電極を用いることにより赤色光のタンパク質光電変換素子を実現することができる。
【００８３】
〈２．第２の実施の形態〉
［タンパク質光電変換素子］
図３１に第２の実施の形態によるタンパク質光電変換素子を示し、特にタンパク質固定化電極を示す。
【００８４】
図３１に示すように、このタンパク質光電変換素子は、金電極２１上に亜鉛置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 からなるタンパク質２２が固定化されたタンパク質固定化電極を有する。このタンパク質固定化電極のその他のことは第１の実施の形態と同様である。
【００８５】
このタンパク質光電変換素子は、金電極２１上に亜鉛置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 からなるタンパク質２２が固定化されたタンパク質固定化電極に加えて対極を有する。この対極は、タンパク質固定化電極に対して間隔を空けて対向するように設けられる。この対極の材料としては、例えば、金、アルミニウム、パラジウム、銀、クロムなどの金属、ＩＴＯ（インジウム−スズ複合酸化物）、ＦＴＯ（フッ素ドープ酸化スズ）、ネサガラス（ＳｎＯ2 ガラス）などの金属酸化物あるいはガラスなどに代表される無機材料を用いることができる。この対極の材料としては、導電性高分子（ポリチオフェン、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリジアセチレン、ポリパラフェニレン、ポリパラフェニレンスルフィドなど）、テトラチアフルバレン誘導体（ＴＴＦ、ＴＭＴＳＦ、ＢＥＤＴ−ＴＴＦなど）を含む電荷移動錯体（例えば、ＴＴＦ−ＴＣＮＱなど）などを用いることもできる。金電極２１に固定化されたタンパク質２２の全部またはほぼ全部に対極を通して光が照射されるようにするためには、この対極は、好適には、このタンパク質２２の光励起に用いられる光に対して透明に構成される。例えば、この対極は、タンパク質２２の光励起に用いられる光に対して透明な導電性材料、例えばＩＴＯ、ＦＴＯ、ネサガラスなどにより構成され、あるいは、光の透過が可能な極薄い金属膜などにより構成される。
【００８６】
このタンパク質光電変換素子は、タンパク質２２の光電変換機能および電子伝達機能を損なわない限り、溶液（電解質溶液または緩衝液）中、ドライな環境中のいずれでも動作させることが可能である。このタンパク質光電変換素子を電解質溶液または緩衝液中で動作させる場合には、典型的には、タンパク質固定化電極に対して間隔を空けて対向するように対極が設けられ、これらのタンパク質固定化電極および対極が電解質溶液または緩衝液中に浸漬される。電解質溶液の電解質（あるいはレドックス種）としてはタンパク質固定化電極で酸化反応が起こり、対極で還元反応が起こるもの、または、タンパク質固定化電極で還元反応が起こり、対極で酸化反応が起こるものが用いられる。具体的には、電解質（あるいはレドックス種）としては、例えば、Ｋ4 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］や［Ｃｏ（ＮＨ3 ）6 ］Ｃｌ3 などが用いられる。このタンパク質光電変換素子をドライな環境中で動作させる場合には、典型的には、例えば、タンパク質２２を吸着しない固体電解質、具体的には例えば寒天やポリアクリルアミドゲルなどの湿潤な固体電解質が、タンパク質固定化電極と対極との間に挟み込まれ、好適にはこの固体電解質の周囲にこの固体電解質の乾燥を防ぐための封止壁が設けられる。これらの場合においては、タンパク質固定化電極と対極との自然電極電位の差に基づいた極性で、タンパク質２２からなる受光部で光を受光したときに光電流を得ることができる。
【００８７】
［タンパク質光電変換素子の使用形態］
図３２はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第１の例を示す。
図３２に示すように、この第１の例では、金電極２１上にタンパク質２２が固定化されたタンパク質固定化電極と対極２３とが互いに対向して設けられる。これらのタンパク質固定化電極および対極２３は、容器２４中に入れられた電解質溶液２５中に浸漬される。電解質溶液２５は、タンパク質２２の機能を損なわないものが用いられる。また、この電解質溶液２５の電解質（あるいはレドックス種）は、タンパク質固定化電極で酸化反応が起こり、対極２３で還元反応が起こるもの、または、タンパク質固定化電極で還元反応が起こり、対極２３で酸化反応が起こるものが用いられる。
【００８８】
このタンパク質光電変換素子により光電変換を行うには、バイアス電源２６により参照電極２７に対してタンパク質固定化電極にバイアス電圧を印加した状態で、タンパク質固定化電極のタンパク質２２に光を照射する。この光は、タンパク質２２の光励起が可能な光の単色光またはこの光の成分を有する光である。この場合、タンパク質固定化電極に印加するバイアス電圧、照射する光の強度および照射する光の波長のうちの少なくとも一つを調節することによって、素子内部を流れる光電流の大きさおよび／または極性を変化させることができる。光電流は端子２８ａ、２８ｂより外部に取り出される。
【００８９】
図３３はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第２の例を示す。
図３３に示すように、この第２の例では、第１の例のようにバイアス電源２６を用いてバイアス電圧を発生させるのではなく、タンパク質固定化電極および対極２３が持つ自然電極電位の差をバイアス電圧として用いる。この場合、参照電極２７は用いる必要がない。したがって、このタンパク質光電変換素子は、タンパク質固定化電極および対極２３を用いる二電極系である。第２の例の上記以外のことは第１の例と同様である。
【００９０】
図３４はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第３の例を示す。第１および第２の例によるタンパク質光電変換素子が溶液中で動作させるものであるのに対し、このタンパク質光電変換素子はドライな環境中で動作させることができるものである。
【００９１】
図３４に示すように、このタンパク質光電変換素子においては、タンパク質固定化電極と対極２３との間に固体電解質２９が挟み込まれている。さらに、この固体電解質２９の周囲を取り巻くように、固体電解質２９の乾燥を防ぐための封止壁３０が設けられている。固体電解質２９としては、タンパク質２２の機能を損なわないものが用いられ、具体的には、タンパク質を吸着しない寒天やポリアクリルアミドゲルなどが用いられる。このタンパク質光電変換素子により光電変換を行うには、タンパク質固定化電極および対極２３が持つ自然電極電位の差をバイアス電圧として用い、タンパク質固定化電極のタンパク質２２に光を照射する。この光は、タンパク質２２の光励起が可能な単色光またはこの光の成分を有する光である。この場合、タンパク質固定化電極および対極２３が持つ自然電極電位の差、照射する光の強度および照射する光の波長のうちの少なくとも一つを調節することによって、素子内部を流れる光電流の大きさおよび／または極性を変化させることができる。第３の例の上記以外のことは第１の例と同様である。
【００９２】
［タンパク質光電変換素子の製造方法］
このタンパク質光電変換素子の製造方法の一例について説明する。
まず、電極２１をタンパク質２２と緩衝液とを含む溶液に浸漬し、タンパク質２２を電極２１上に固定化する。こうしてタンパク質固定化電極が形成される。
次に、このタンパク質固定化電極と対極２３とを用いて例えば図３２、図３３または図３４に示すタンパク質光電変換素子を製造する。
【００９３】
［タンパク質光電変換素子の動作］
このタンパク質光電変換素子のタンパク質２２が亜鉛置換シトクロムｂ562 である場合は、波長４１８〜４２０ｎｍの青色の単色光またはこの波長成分を含む光が入射すると、タンパク質２２から光励起により電子が発生し、電子伝達により金電極２１に電子が移動する。また、このタンパク質光電変換素子のタンパク質２２が亜鉛クロリンシトクロムｂ562 である場合は、波長４１８〜４２０ｎｍの青色の単色光あるいは波長６３６ｎｍ付近の赤色の単色光またはこの波長成分を含む光が入射すると、タンパク質２２から光励起により電子が発生し、電子伝達により金電極２１に電子が移動する。そして、金電極２１と対極２３とから外部に光電流が取り出される。
【００９４】
以上のように、この第２の実施の形態によれば、シトクロムｂ562 をベースとするタンパク質を用いて青色または赤色のタンパク質光電変換素子を実現することができる。
【００９５】
このタンパク質光電変換素子は、例えば光センサーあるいは撮像素子に用いることができ、必要に応じて光電流の増幅回路などを併せて用いることができる。光センサーは光信号の検出などの各種の用途に用いることができ、人工網膜などに応用することも可能である。
【００９６】
このタンパク質光電変換素子は、光電変換を利用する各種の装置や機器などに用いることができ、具体的には、例えば、受光部を有する電子機器などに用いることができる。このような電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含むが、具体例を挙げると、デジタルカメラ、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）などである。
【００９７】
〈３．第３の実施の形態〉
［非接液全固体型タンパク質光電変換素子］
図３５は第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子を示す。この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては固体タンパク質層を用いる。ここで、固体タンパク質層とは、水などの液体を含まずにタンパク質が集合して層状の固体をなすものを意味する。また、非接液全固体型タンパク質光電変換素子の「非接液」とは、タンパク質光電変換素子の内外が水などの液体と接触しない状態で使用されることを意味する。また、非接液全固体型タンパク質光電変換素子の「全固体型」とは、素子の全ての部位が水などの液体を含まないものであることを意味する。
【００９８】
図３５に示すように、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては、電極４１と電極４２との間に、タンパク質からなる固体タンパク質層４３が挟まれた構造を有する。固体タンパク質層４３は電極４１、４２に対して固定化されている。固体タンパク質層４３は典型的には電極４１、４２に対して直接固定化されるが、必要に応じて、固体タンパク質層４３と電極４１、４２との間に水などの液体が含まれていない中間層を設けてもよい。この固体タンパク質層４３には水などの液体が含まれていない。この固体タンパク質層４３はタンパク質の単分子膜または多分子膜からなる。
【００９９】
この固体タンパク質層４３が多分子膜からなる場合の構造の一例を図３６に示す。図３６に示すように、固体タンパク質層４３は、スズ置換ウマ心筋シトクロムｃまたはスズ置換ウシ心筋シトクロムｃからなるタンパク質４３ａが二次元的に集合して形成された単分子膜がｎ層（ｎは２以上の整数）積層されたものからなる。図３６ではｎ＝３の場合が示されている。
【０１００】
電極４１、４２の少なくとも一方として透明電極を用いる。電極４１、４２の間に挟まれた固体タンパク質層４３に光が照射されるようにするためには、電極４１、４２のうちの固体タンパク質層４３の光励起に用いられる光が入射する側の一方の電極を透明電極により構成する。透明電極は、具体的には、この光励起に用いられる光に対して透明な導電材料、例えばＩＴＯ、ＦＴＯ、ネサガラスなどにより構成したり、光の透過が可能な極薄い金属膜などにより構成したりする。また、電極４１、４２のうちの他方の電極は、上記の透明な導電材料、あるいは、より効率的に光を照射したい場合には非透明な導電材料、例えば金、銅、アルミニウムなどにより構成する。
【０１０１】
［非接液全固体型タンパク質光電変換素子の製造方法］
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の製造方法について説明する。
まず、電極４１、４２の一方、例えば電極４１上に、タンパク質４３ａを含む溶液、典型的にはタンパク質４３ａを水を含む緩衝液に溶解したタンパク質溶液を液滴下法、スピンコート法、ディップ法、スプレー法、インクジェット法などにより付着させる。
【０１０２】
次に、電極４１上にタンパク質溶液を付着させたものを、室温またはより低い温度に保持することにより、付着させたタンパク質溶液中のタンパク質４３ａを電極４１に固定化させる。
【０１０３】
次に、こうしてタンパク質溶液中のタンパク質４３ａを電極４１に固定化させたものをこのタンパク質４３ａが変性しない範囲で加熱して乾燥させることにより、タンパク質溶液に含まれる液を全て蒸発させて除去する。
【０１０４】
こうして、タンパク質４３ａのみが電極４１に固定化され、固体タンパク質層４３が形成される。この固体タンパク質層４３の厚さは、電極４１上に付着させるタンパク質溶液の量やタンパク質溶液の濃度などにより容易に制御することができる。
【０１０５】
次に、この固体タンパク質層４３上に電極４２を形成する。この電極４２は、スパッタリング法、真空蒸着法、インクジェット法などにより導電材料を堆積させることにより形成することができる。
以上のようにして目的とする非接液全固体型タンパク質光電変換素子が製造される。
【０１０６】
［非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作］
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作について説明する。
非接液全固体型タンパク質光電変換素子の電極４１と電極４２との間に電極４２側が低電位となるように電圧（バイアス電圧）を印加しておく。ここでは、電極４１が透明電極であるとする。この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の固体タンパク質層４３に光が入射しないときには、この固体タンパク質層４３は絶縁性であり、電極４１と電極４２との間に電流は流れない。この状態が非接液全固体型タンパク質光電変換素子のオフ状態である。これに対して、図３７に示すように、電極４１を透過して固体タンパク質層４３に光（ｈν）が入射すると、この固体タンパク質層４３を構成するタンパク質４３ａが光励起され、その結果、この固体タンパク質層４３が導電性となる。そして、電極４２から電子（ｅ）が固体タンパク質層４３を通って電極４１に流れ、電極４１と電極４２との間に光電流が流れる。この状態が非接液全固体型タンパク質光電変換素子のオン状態である。このように固体タンパク質層４３は光導電体として振る舞い、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子への光の入射の有無によりオン／オフ動作が可能である。
【０１０７】
上述のように固体タンパク質層４３が光導電体として振る舞うのは、固体タンパク質層４３を構成する電子伝達タンパク質４３ａが光励起されたときに分子軌道間の電子の遷移が起き、その結果、この電子伝達タンパク質４３ａのある部位から他の部位に電子または正孔が移動する。そして、この電子または正孔の移動が固体タンパク質層１３を構成する多数の電子伝達タンパク質１３ａで次々と起き、その結果、電極４１と電極４２との間に光電流が流れる。
【０１０８】
この第３の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子によれば、次のような種々の利点を得ることができる。すなわち、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、素子の内部に水が存在せず、しかも水に接触させないでも動作が可能であるため、従来の半導体を用いた光電変換素子に代わる光電変換素子として電子機器に搭載することが可能となる。また、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、内部に水が存在しないため、水の存在に起因するタンパク質の熱変性、ラジカルダメージ、腐敗などを防止することができ、安定性が高く、耐久性が優れている。また、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、素子の内外に水が存在しないため、感電のおそれがなく、強度の確保も容易である。
【０１０９】
また、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては、固体タンパク質層４３は電極４１、４２に対し、リンカー分子などを介することなく直接固定化されていることにより、リンカー分子などを介して固定化される場合に比べて大きな光電流を得ることができる。さらに、固体タンパク質層４３が電極４１、４２に対して直接固定化されていることに加えて、固体タンパク質層４３は極薄く形成することができるので、電極４１と電極２２との間の距離を極めて短くすることができる。このため、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は薄型に構成することができ、しかも電極４１、４２を透明化することにより、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子を多層積層して使用することができる。さらに、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては、固体タンパク質層４３を構成するタンパク質４３ａのサイズは２ｎｍ程度と極めて小さいので、例えば固体タンパク質層４３のどの位置に光が入射したかを極めて精密に検出することが可能である。このため、高精細の光センサーあるいは撮像素子を実現することができる。
【０１１０】
さらに、タンパク質４３ａの光導電効果は「一光子−多電子発生」によるものと推測される。ところが、液系タンパク質光電変換素子においては、電極間に存在する溶液の抵抗（溶液抵抗）が高いため、この「一光子−多電子発生」が妨げられていたと考えられる。これに対し、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子では、この溶液抵抗が存在しないため、この「一光子−多電子発生」が可能となり、光電変換効率の大幅な向上を図ることができ、より大きな光電流を得ることができる。
【０１１１】
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子は、光スイッチ素子、光センサー、撮像素子などを実現することができる。上述のようにこの非接液全固体型タンパク質光電変換素子は周波数応答が速いため、高速スイッチングが可能な光スイッチ素子、高速応答の光センサー、高速で動く物体の撮像が可能な撮像素子などを実現することができる。そして、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子を光スイッチ素子、光センサー、撮像素子などに用いることにより優れた電子機器を実現することができる。
【０１１２】
〈４．第４の実施の形態〉
［カラー撮像素子］
第４の実施の形態によるカラー撮像素子においては、赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子を用いる。これらのタンパク質光電変換素子は同一基板上に形成してもよいし、赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子をそれぞれ別の基板上に形成し、これらの基板を配列することでカラー撮像素子を構成してもよい。
【０１１３】
図３８はこのカラー撮像素子の一例を示し、特に一画素の領域を示す。
図３８に示すように、このカラー撮像素子においては、基板６１上の一画素の領域における赤色光、緑色光および青色光のタンパク質光電変換素子形成領域に、それぞれ金電極６２ａ、６２ｂ、６２ｃが設けられている。これらの金電極６２ａ、６２ｂ、６２ｃは互いに電気的に絶縁されている。基板６１としては各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、例えば、シリコン基板などの半導体基板、ガラス基板などの透明基板などを用いることができる。特に、基板６１としてシリコン基板などの半導体基板を用いることにより、従来公知の半導体テクノロジーを用いてカラー撮像素子の信号処理回路や駆動回路などをこの半導体基板に容易に形成することができる。基板６１として導電性基板を用いる場合には、例えば、この基板６１の表面にＳｉＯ2 膜などの絶縁膜を形成し、その上に金電極６２ａ、６２ｂ、６２ｃを形成してもよい。
【０１１４】
赤色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ａ上に自己組織化単分子膜６３ａを介して赤色光を吸収する亜鉛クロリンシトクロムｂ562 ６４が固定化されている。また、緑色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｂ上に自己組織化単分子膜６３ｂを介して緑色光を吸収する修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２ ６５が固定化されている（特許文献２参照）。また、青色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｃ上に自己組織化単分子膜６３ｃを介して青色光を吸収する亜鉛クロリンシトクロムｂ562 ６６が固定化されている。
【０１１５】
赤色光、緑色光および青色光のタンパク質光電変換素子としては、蛍光タンパク質を用いた次のようなものを用いてもよい。すなわち、図３９に示すように、赤色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ａ上に自己組織化単分子膜６３ａを介してシトクロムｂ562 ６７を固定化し、このシトクロムｂ562 ６７に赤色光を吸収する蛍光タンパク質６８を静電結合する。この蛍光タンパク質６８としては、市販の蛍光タンパク質や修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２などを用いることができる。また、緑色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｂ上に自己組織化単分子膜６３ｂを介してシトクロムｂ562 ６９を固定化し、このシトクロムｂ562 ６９に緑色光を吸収する蛍光タンパク質７０を静電結合する。この蛍光タンパク質７０としては、例えば市販の蛍光タンパク質や修飾亜鉛ポルフィリンシトクロムｃ５５２などを用いることができる。また、青色光のタンパク質光電変換素子の部位においては、金電極６２ｃ上に自己組織化単分子膜６３ｃを介してシトクロムｂ562 ７１を固定化し、このシトクロムｂ562 ７１に青色光を吸収する蛍光タンパク質、例えば亜鉛置換シトクロムｃ５５２や市販の蛍光タンパク質などを静電結合する。
【０１１６】
赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子の基板６１上における配置の仕方は、従来公知のＣＣＤカラー撮像素子やＭＯＳカラー撮像素子などと同様であり、必要に応じて決められる。
上記以外のことは第１の実施の形態と同様である。
この第４の実施の形態によれば、タンパク質を用いた新規なカラー撮像素子を実現することができる。
【０１１７】
以上、この発明の実施の形態および実施例について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施の形態および実施例に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施の形態および実施例において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【符号の説明】
【０１１８】
１１…金電極、１２…タンパク質、１３…自己組織化単分子膜、１４…対極、１５…容器、１６…電解質溶液、１７…バイアス電源、１８…参照電極、２０…固体電解質、２１…封止壁、６１…基板、６２ａ、６２ｂ、６２ｃ…金電極、６３ａ、６３ｂ、６３ｃ…自己組織化単分子膜、６４…赤色光の光電変換素子、６５…緑色光の光電変換素子、６６…青色光の光電変換素子、６７、６９、７１…シトクロムｂ562
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子。
【請求項２】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項１記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項３】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項２記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項４】
上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項３記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項５】
上記金属置換シトクロムｂ562 は亜鉛置換シトクロムｂ562 である請求項４記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項６】
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子を有する光電変換システム。
【請求項７】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項６記載の光電変換システム。
【請求項８】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項７記載の光電変換システム。
【請求項９】
上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項８記載の光電変換システム。
【請求項１０】
上記金属置換シトクロムｂ562 は亜鉛置換シトクロムｂ562 である請求項９記載の光電変換システム。
【請求項１１】
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有するタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１２】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項１１記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１３】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項１２記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１４】
上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項１３記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１５】
上記金属置換シトクロムｂ562 は亜鉛置換シトクロムｂ562 である請求項１４記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１６】
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有する光電変換システムの製造方法。
【請求項１７】
金電極と、
上記金電極に固定化されたシトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質固定化電極。
【請求項１】
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子。
【請求項２】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項１記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項３】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項２記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項４】
上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項３記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項５】
上記金属置換シトクロムｂ562 は亜鉛置換シトクロムｂ562 である請求項４記載のタンパク質光電変換素子。
【請求項６】
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子を有する光電変換システム。
【請求項７】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項６記載の光電変換システム。
【請求項８】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項７記載の光電変換システム。
【請求項９】
上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項８記載の光電変換システム。
【請求項１０】
上記金属置換シトクロムｂ562 は亜鉛置換シトクロムｂ562 である請求項９記載の光電変換システム。
【請求項１１】
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有するタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１２】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項１１記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１３】
上記金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項１２記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１４】
上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項１３記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１５】
上記金属置換シトクロムｂ562 は亜鉛置換シトクロムｂ562 である請求項１４記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
【請求項１６】
金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有する光電変換システムの製造方法。
【請求項１７】
金電極と、
上記金電極に固定化されたシトクロムｂ562 または金属置換シトクロムｂ562 または亜鉛クロリンシトクロムｂ562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質固定化電極。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【公開番号】特開２０１２−１４６５６６（Ｐ２０１２−１４６５６６Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０５５（Ｐ２０１１−５０５５）
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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