タンパク質分画デバイス
【課題】 血清、血漿等をはじめとする２種類以上のタンパク質を含有する溶液から数多くの低分子量タンパク質を分画し、さらに、その低分子タンパク質から特定のタンパク質を回収する。
【解決手段】 中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を精製するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させ、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイスである。
【解決手段】 中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を精製するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させ、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイスである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分画されたタンパク質から、選択的にタンパク質を吸着できる精製モジュールを具備したタンパク質分画デバイスに関する。また本発明は、該タンパク質分画デバイスを用いた溶液中に含まれるタンパク質の分画方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究として、プロテオーム解析研究（プロテオミクス）が注目されている。遺伝子産物であるタンパク質は、疾患の病態に直接リンクしていると考えられることから、タンパク質を網羅的に調べるプロテオーム解析の研究成果は診断と治療に広く応用できると期待されている。しかも、プロテオーム解析により、ゲノム解析では発見できなかった病因タンパク質や疾患関連因子を多く発見できる可能性が高いとみられている。
【０００３】
従来のプロテオーム解析研究が、タンパク質を網羅的に検出・同定するのみにとどまっていたのに対し、さらに最近では、それらのタンパク質の翻訳後修飾を解析するなどといった、幅広い解析手法を用いた研究が注目され始めている。タンパク質は、細胞内で合成された後に、リン酸化、糖鎖付加、アセチル化、脂質付加、ユビキチン付加などの様々な修飾をうけることが知られている。そして、その修飾がタンパク質の活性に大きく影響し、ひいてはタンパク質群全体の挙動に影響を与えている。生体内において疾患が発症する際には、複数のタンパク質の発現量そのものが変化することに加えて、いくつかのタンパク質の翻訳後修飾の状態が変化しており、それによってタンパク質群の正常な挙動が失われていると考えられている。例えば、タンパク質のリン酸化は生命現象において細胞内の情報伝達に深く関わっており、細胞の癌化などの疾患の発症に深く関与していると考えられている。これらのタンパク質の翻訳後修飾については、ゲノム情報からでは決して解析することができず、プロテオーム解析の重要な分析対象となっている。タンパク質の翻訳後修飾の網羅的解析については、まず修飾されているタンパク質そのものを同定し、さらにそのタンパク質のどの部位が修飾されているのかを決定し、さらにどの程度修飾をうけているのかを調べる、といった解析が主な流れとなっている。
【０００４】
このようなプロテオーム解析が急速に進展したのは、技術的には質量分析装置（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＭＳ）による高速構造分析が可能となってきたことが大きい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の実用化によって、ポリペプチドのハイスループット超微量分析が可能となり、従来検出し得なかった微量なタンパク質を、短時間の測定で非常に多種類にわたって同定することが可能となった。また、翻訳後修飾の解析についても、適切な測定条件を設定することにより、修飾タンパク質の検出とその修飾部位の同定とを行うことができるようになりつつある。これらの分析技術は、現在では疾患関連因子の探索に非常に強力なツールとなっている。
【０００５】
プロテオーム解析を臨床に応用する第一の目的は、その発現量や修飾の状態が、疾患によって大きく変動するようなバイオマーカータンパク質を発見することである。バイオマーカーは病態に関連して挙動するため、診断マーカーとなり得るほか、創薬ターゲットとなる可能性も高い。すなわち、プロテオーム解析の成果は、診断マーカーや創薬ターゲットの創出に直接繋がるため、ポストゲノム時代の診断・治療の切り札（エビデンス）技術となる。さらに、同定されたバイオマーカーは患者の薬剤応答性評価や副作用発現予測といった直接的に患者が享受しうる利益につながることから、いわゆるテーラーメード医療（オーダーメード医療）の推進にも大きな役割を果たすといえる。
【０００６】
臨床研究でのプロテオーム解析（臨床プロテオミクス）においては、多数の検体を迅速、確実に解析することが求められている。しかも臨床検体は微量かつ貴重であることから、高分解能・高感度・高機能測定を迅速に行う必要がある。この大きな推進力となったのは質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であるが、これは先に述べたような質量分析装置が有する超高感度でハイスループットであるという特性の貢献するところが大きい。しかしながら、その手法や機器が急速に改良されてきてはいるものの、現在のところプロテオーム解析が臨床現場で簡便かつ迅速に実施できる状況にはないのが実状である。
【０００７】
その原因のひとつに、臨床検体の前処理が必要であることが挙げられる。質量分析により解析する前に、臨床検体のタンパク質を分画、精製する必要があるが、この処理には数日かかるのが実態であり、さらには前処理の操作が煩雑かつ経験を要することが、臨床への応用の大きな障害となっている。少量の血液や体液から全身の疾患の診断や病態管理ができるならば、その有用性は極めて大きいものの、血清、血漿中に含まれるタンパク質の多様性のために、多くの課題を抱えているのが現状である。
【０００８】
ヒトタンパク質は１０万種以上あるとも推定されているが、血清中に含まれるタンパク質だけでも約1万種類にものぼるといわれ、それらすべてを合わせた血清中濃度は約６０〜１００ｍｇ／ｍＬと推定される。血清中の高含量タンパク質は、アルブミン（分子量６６ｋＤａ）、免疫グロブリン（１５０〜１９０ｋＤａ）、トランスフェリン（８０ｋＤａ）、ハプトグロビン（＞８５ｋＤａ）、リポタンパク質（数１００ｋＤａ）等であり、いずれも大量（＞ｍｇ／ｍＬ）に存在する。一方、病態のバイオマーカーや病因関連因子と考えられているペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質の多くは、極微量（＜ｎｇ／ｍＬ）しか存在せず。その含有量比は高分子量の高含量成分に比べると、実にナノ〜ピコレベルである。タンパク質の大きさという観点では、タンパク質全種類の７０％以下は分子量６０ｋＤａ以下であり、上記の極微量なバイオマーカータンパク質はいずれもこの領域に含まれる場合がほとんどである（例えば非特許文献１）。これらのタンパク質は、腎臓を通過して尿中に一部排泄されるため、血液のみならず尿を検体として測定することも可能である。
【０００９】
また、翻訳後修飾に関しては、修飾の種類によっては、タンパク質のうち実際に細胞内で修飾をうけているタンパク質の割合は極めて少ない。たとえば、タンパク質のリン酸化の場合は、タンパク質の全量に比べて実際にリン酸化を受けているタンパク質の割合は極めて少ない。従って、血清・血漿をはじめとする生体サンプルから得られるタンパク質のリン酸化修飾を解析しようとしても、アルブミン、ＩｇＧといった高含量かつ高分子量の非修飾タンパク質のシグナルに埋もれてしまい、修飾タンパク質のみを正確に測定するのは困難であるのが実状である。
【００１０】
そこで、一般的な血清学的検査でプロテオーム解析を行うには、病因関連の微量成分検出の妨害となるアルブミン、ＩｇＧといった高含量、高分子量のタンパク質成分を除外することが必須となる。これらのタンパク質を分離する手段として、現状では高速液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）や二次元電気泳動（Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：２Ｄ ＰＡＧＥ）が用いられているが、これらの作業だけでも１〜２日を要する。この所要時間は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳやＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の数分という分析時間に比べて非常に長く、ＭＳのもつハイスループットという大きな利点が臨床プロテオーム解析では十分発揮できずにいる。このため、医療現場で診断や治療のためにできるだけ短時間に分析結果がほしいという目的には、現時点では実用性に極めて乏しいと言わざるを得ず、日常の臨床検査にＭＳが利用しにくいひとつの大きな原因になっている。
【００１１】
この点が解決されれば、臨床プロテオーム解析による臨床検査の診断の迅速性は飛躍的に向上すると期待できる。具体的には、ＬＣや２Ｄ−ＰＡＧＥの代替となるような、微量の検体から高速で目的タンパク質群を分画・分離できるデバイスがあればよい。
【００１２】
アルブミンを除去対象物質として、すでに実用化されている製品あるいは開示されている技術としては、ブルー色素などのアフィニティーリガンドを固定化した担体（たとえば、日本ミリポア社：“Ｍｏｎｔａｇｅ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｅ Ｋｉｔ（登録商標）”、日本バイオ・ラッド社：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（登録商標）ゲル）、高分子量成分を遠心分離ろ過によって分画する遠心管形式の濾過濃縮ユニット（たとえば、日本ミリポア社：“アミコンウルトラ（登録商標）”、ザルトリウス社：“ビバスピン”）、電気泳動原理によって分画する方法（たとえば、グラディポア社：“Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ（登録商標）”システム）、Ｃｏｈｎのエタノール沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画する方法（例えば非特許文献２）などがある。また、抗アルブミン抗体を固定化した担体とプロテインＧを固定化した担体を用いて血漿中のアルブミンとＩｇＧを除去し、二次元電気泳動により解析を行った報告（例えば非特許文献３）がある他、アルブミンと免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を同時に除去する製品が上市されている（ＧＥヘルスケア社：Ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ＩｇＧ Ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ）。また、これらのアルブミン除去製品について、４社の代表的な製品についてアルブミンの除去効率を、二次元電気泳動により比較して解析をおこなった報告もある（非特許文献４）。しかしながら、これらはいずれも分離分画性能が不十分であったり、微量サンプルには不適当であったり、サンプルが希釈されてしまったり、固定化抗体の溶出がみられたり、あるいは質量分析等に障害となる薬剤が混入したりするなどの問題点があるのが実状である。
【００１３】
電気泳動の手法でタンパク質を分取する製品としては、バイオラッド社の“モデル４９１プレップセル”、“ミニプレップセル”、アトー（株）の“プレップフォレーシス（登録商標）”等がある。これらの製品は、円筒状のゲルの上部にアプライしたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、分離されたタンパク質をゲルの下部から回収することで分取を行う。これらの製品は、一度にある程度まとまった量のタンパク質を処理できる利点があるものの、電気泳動のゲルを準備するのに時間と手間がかかる上、分取したサンプル中にゲルに含まれる未反応のアクリルアミド等の夾雑物が混入することがあるため、質量分析に供する試料としては適さない。
【００１４】
タンパク質試料を濃縮する技術としては、限外濾過膜を用いる方法、一旦沈殿させて少量の溶媒に再溶解する方法、凍結乾燥して少量の溶媒に再溶解する方法、乾燥ゲルで溶媒を吸収する方法などがある。限外濾過膜を用いた方法は一般的に用いられる手法で、具体的には、遠心分離でタンパク質溶液試料をろ過することにより濃縮を行うための遠心管型濾過濃縮ユニット（たとえば、日本ミリポア社：“アミコンウルトラ（登録商標）”、ザルトリウス社：“ビバスピン”）を用いる。しかしながら、膜の細孔径には分布があり、規定された分画分子量以上の物質が通過できる細孔も存在するため、実際は膜の分画分子量以上の分子量であるタンパク質が細孔を通過して濾液に漏出することがあり、したがって、回収率の低下は避けられないのが実状である。
【００１５】
また、タンパク質の修飾タンパク質を分画、精製する技術として、現在すでに実用化されている製品あるいは技術としては、解析目的の化学修飾基に特異的に結合する抗体を固定化したビーズを用いる方法や、金属錯体やレクチンなど個々の化学的修飾に特異的に結合する物質を固定化したビーズを用いた方法が一般的に用いられる。現在実用化されているあるいは開示されている市販されているものとしては、ＰｈｏｓｐｈｏＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。しかしながら、これらの方法では、上記のアルブミンなどの高含量かつ高分子量のタンパク質が、非特異的にそれらのビーズに吸着してしまい、解析目的の修飾タンパク質のビーズへの結合を阻害してしまったり、また、それらの高含有量タンパク質が修飾タンパク質の回収時に共に溶出されてしまい、リン酸化タンパク質のみを特異的に回収する事が困難であるといった問題がある。さらに、抗体を固定化したビーズを用いる方法では、その化学的修飾に対して厳密に高い結合特異性を持った抗体の作成が困難であるといった問題もある。これらのことから、生体サンプルから、修飾タンパク質のみを特異的に回収するのは非常に困難であるのが実状である。
【非特許文献１】アンダーソン・ＮＬ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ）,アンダーソン・ＮＧ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＧ）著，「ザ・ヒューマン・プラズマ・プロテオーム：ヒストリー・キャラクター・アンド・ダイアグノスティック・プロスペクツ（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｏｍｅ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」，モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ），２００２年，第１巻，ｐ８４５−８６７．
【非特許文献２】日本生化学会編，「新生化学実験講座（第１巻）タンパク質（１）分離・精製・性質」，東京化学同人，１９９０年
【非特許文献３】グリーノウ・キャリー（Ｃａｒｒｉｅ Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ）ら著，「ア・メソッド・フォー・ザ・ラピッド・ディプレーション・オブ・アルブミン・アンド・イムノグロブリン・フロム・ヒューマン・プラズマ（Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ）」，プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ），２００４年，第４巻，ｐ３１０７−３１１１．
【非特許文献４】クロミー・ＢＡ（Ｃｈｒｏｍｙ ＢＡ）ら著，「プロテオミック・アナリシス・オブ・ヒューマン・シーラム・バイ・トゥー−ディメンショナル・ディファレンシャル・ゲル・エレクトロフォレシス・アフター・デプレション・オブ・ハイ−アバンダント・プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ），２００４年，第３巻，ｐ１１２０−１１２７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明者らはかかる従来技術の問題点に鑑み、鋭意検討した結果、溶液中に含まれる少なくとも２種類以上のタンパク質を分画する際に、中空糸膜を充填した分画モジュールによって分画されたタンパク質から、特定のタンパク質を、一つあるいは複数個連結された精製モジュールに吸着させ、溶出用緩衝液を用いて溶出させることによって回収できることを見いだし、本発明に到達した。
【００１７】
すなわち本発明は、分画されたタンパク質から、吸着方式によって選択的にタンパク質を精製できる精製モジュールを具備したタンパク質分画デバイスを提供することを目的とする。また本発明は、前記タンパク質分画デバイスを用いたタンパク質の分画方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、上記目的を達成するために以下の構成を有する。
「（１）中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を回収するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させて、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイス。」
「（２）分画モジュールにより処理されたタンパク質を含む溶液を、精製モジュールに循環させて処理することを特徴とする（１）に記載のタンパク質分画デバイス。」
「（３）分画モジュールと、精製モジュールが溶液流路によって連結され、連続して稼働できることを特徴とする（１）または（２）に記載のタンパク質分画デバイス。」
「（４）精製モジュールが、金属キレート樹脂、タンパク質固定化樹脂、抗体固定化樹脂、レクチン固定化樹脂、群特異性アフィニティー樹脂、および疎水性化合物固定化樹脂、イオン交換樹脂、逆相樹脂、からなる群より１種類以上選択される樹脂を含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（５）相異なる樹脂を含む精製モジュールを複数具備してなることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（６）全ての精製モジュールが溶液流路に対して連結されていることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（７）特定のタンパク質をフラクションとして回収することを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（８）特定のタンパク質を２０％以上回収することを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（９）タンパク質を含む溶液が、タンパク質を含む体液であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（１０）特定のタンパク質が、疾患マーカータンパク質であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（１１）（１）〜（１０）のタンパク質分画デバイスを用いて、タンパク質を含む溶液を分子量の大きさの違いで分画する方法。」
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、血清、血漿をはじめとする溶液に含まれる少なくとも２種類以上のタンパク質をそれらの物理的性状の違いにより分画でき、さらに、その分画されたタンパク質から、特定のタンパク質をさらに精製モジュールに吸着させ、精製モジュールに吸着したタンパク質を溶出用緩衝液を用いて溶出させることにより、特定のタンパク質を回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を回収するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させて、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイスである。
【００２１】
本発明でいう“分画”とは、溶液中の溶質を分離することであり、溶質が複数種類含まれる場合には、その全部または一部を分離することを指す。例えば体液成分を解析するための試料を調製する場合、回収成分と廃棄成分とを弁別することになる。また、本発明でいう“分画モジュール”とは、溶液中のタンパク質を物理的性状の違いにより弁別する用途で用いる器具のことである。すなわち、本発明の分画モジュールを用いることにより、タンパク質を分子量、等電点といった物理的性状の違いで二群以上に分画することができる。
【００２２】
本発明において、分画モジュールに充填する中空糸膜は、液体中に含まれる低分子量物質が膜を界面として双方向に移動可能な細孔を有する。このような機能を有する中空糸膜の製造方法は、湿式紡糸、乾湿式紡糸等、一般的に用いられる中空糸膜の製造方法であれば特に限定されない。例えば、二重環式口金を用いて中空糸膜を製膜する場合、ポリマー流体を口金を用いて中空糸状に紡糸し、流下過程で多孔質を形成し、凝固浴を通すことで固化し、洗浄浴にて芯側流体を洗浄し、乾燥、捲縮付与後巻き取ると、中空糸膜が得られる。これらの作業はオンラインで行うことが好ましい。なお、得られた中空糸膜は表面の擦過傷や、折り曲げ、押圧などによる中空部の潰れ等の無いことが好ましい。
【００２３】
本発明で用いる中空糸膜は、ドライタイプ、ウェットタイプともに利用可能である。ドライタイプの中空糸膜を用いる場合は、膜の表面をグリセリン等で処理して乾燥を防ぐことが好ましい。
【００２４】
本発明において分画モジュールに充填する中空糸膜の素材は、工業的に中空糸膜を形成可能な材料であれば特に限定されず、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体などの合成高分子およびそれらの誘導体、それらを含む共重合体あるいは複合体、もしくはセルロース、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、硝酸セルロース、ジエチルアミノエチルセルロースなどの天然高分子およびそれらの誘導体、それらを含む共重合体あるいは複合体が好適に用いられる。
【００２５】
また、これらの素材が２種以上混合されていてもよく、素材の性質を改良する目的で種々の添加物が混合されていてもよい。例えば、親水性高分子あるいは疎水性高分子を中空糸膜の素材となる高分子とブレンドして製膜し、中空糸膜表面の親水化、疎水化を図ることは好ましい。
【００２６】
また、中空糸膜の表面に親水性高分子あるいは疎水性高分子をコーティングする方法や、グラフト重合する方法も好ましい。ここで用いられる親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリビニルメチルエーテル、ポリアクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体およびこれらの金属塩、エステルなどの合成化合物や、デンプン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、キトサン、リグニン、ポリリジン、絹フィブロイン、カラギーナン、カゼイン、グリコール酸、コラーゲン、ゼラチンおよびこれらの金属塩、エステルなどの天然化合物が好適に利用される。なお、上述の合成高分子化合物と天然高分子化合物を組み合わせてもよい。その他の親水化方法としては、酸素プラズマを照射する方法やポリシラザンをコーティングする方法も利用できる。一方、疎水化方法としては、シリコンコーティング、フッ素コーティング、プラズマ照射による表面処理が好適に用いられる。上述の親水化、疎水化いずれの方法によっても、タンパク質の吸着を抑制することができる。
【００２７】
本発明でいう“特定のタンパク質”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質のうち、解析の対象となるタンパク質を指す。解析の対象となるタンパク質としては、例えば、翻訳後修飾をうけているタンパク質を解析する目的であれば、リン酸化タンパク質、糖タンパク質などが、核酸や低分子化合物に結合するタンパク質を解析する目的であれば、核酸結合タンパク質やアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合タンパク質などが、分画モジュールで分画された全てのタンパク質を解析する目的であれば分画モジュールで分画された全てのタンパク質があげられるが、特にこれらに限定されない。
【００２８】
本発明でいう“選択的に吸着させる”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質のうち、特定のタンパク質をそのタンパク質の持つ性質に応じて精製モジュールに吸着させることを指す。選択的な吸着としては、リン酸化タンパク質の金属キレート基への吸着、抗原タンパク質の抗体への吸着、糖タンパク質のレクチンタンパク質への吸着、核酸結合タンパク質の核酸への吸着、タンパク質のイオン交換基への吸着、などがあげられるが、特にこれに限定されるものではない。
【００２９】
本発明でいう“精製”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質から、解析の対象となる特定のタンパク質を含む群を回収することを指す。例えば血液成分を解析するための試料を調製する場合、リン酸化タンパク質、糖タンパク質、核酸結合タンパク質などのタンパク質を回収することがあげられるが、特にこれらに限定されない。
【００３０】
本発明でいう“精製モジュール”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質から、特定のタンパク質を選択的に吸着させることにより、吸着させた特定のタンパク質を溶出用緩衝液で溶出させて回収する用途で用いる器具のことをいう。
【００３１】
本発明における精製モジュールの充填物は、タンパク質試料に混入して測定に悪影響を及ぼす溶出物がなければ特に限定されない。その好ましい形態として、例えばビーズ、ゲル、布地、編み地、中空糸膜、平膜などが挙げられる。処理効率を考慮した場合、ビーズ、ゲルを用いるのが好ましく、操作中に起こる圧力上昇をできるだけ防ぐことができる多孔質のビーズ、ゲルを用いるのがいっそう好ましい。
【００３２】
本発明における精製モジュールの充填物の材質は、上記ビーズ、ゲル、布地、編み地、中空糸膜、平膜などを形成できるものであれば特に限定されない。充填物の表面には、タンパク質を吸着させるための修飾を施すことが好ましく、この場合、修飾の効果を発揮させるために充填物の基材そのものには非特異的にタンパク質が吸着しないことが好ましい。よって、タンパク質の非特異的吸着を防止するために、充填物の基材表面を親水化あるいは疎水化処理することが好ましい。
【００３３】
本発明における精製モジュールの形状は、溶液を漏出することなく通過させることができれば特に限定されず、パックドカラム、オープンカラム、キャピラリーカラムなどが好ましく利用できる。
【００３４】
本発明でいう“回収”とは、精製モジュールから溶出されてくる特定のタンパク質を、溶液の状態で容器に得ることを指す。
さらに本発明では、好ましくは、溶出用緩衝液の組成を変化させて精製モジュールに導入し、個々のタンパク質が溶出されてくる時間を変え、また、時間に応じて回収容器を変えて回収することにより、特定のタンパク質を個別に“フラクションとして回収”する。溶出用緩衝液の組成を変化させて精製モジュールに導入するには、市販のグラジエント形成装置や、グラジエント形成が可能なポンプを用いて、組成の異なる二つの溶出用緩衝液を混合し、その混合割合を変化させながら導入する方法が好適に用いられるが、特にこれに限定されない。
【００３５】
本発明で特定のタンパク質の回収に用いる装置は、回収容器を時間ごとに変えられるものであれば特に限定されないが、好ましくは市販のフラクションコレクターが用いられる。
【００３６】
本発明で特定のタンパク質を回収する容器の素材は、溶液を回収できるものであれば特に限定されず、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などの合成高分子およびそれらの誘導体、それらを含む共重合体あるいは複合体が好適に用いられる。タンパク質の吸着を抑制するために、容器の内表面に親水化あるいは疎水化処理を施すことも好ましい。
【００３７】
本発明のタンパク質分画デバイスは、好ましくは分画モジュールにより処理されたタンパク質を含む溶液を精製モジュールに循環させて処理する。分画されたタンパク質を含む溶液を精製モジュールに循環させることで、タンパク質を確実に精製モジュールに吸着させることが可能となる。
【００３８】
本発明において、分画モジュールと精製モジュールとを溶液流路によって連結させることは好ましい。
【００３９】
ここでいう”溶液流路”とは、分画モジュールにより処理された分画液の出口と精製モジュールの入り口との間に設置した管のことを指し、溶液流路で分画モジュールと精製モジュールを連結することで、分画液を直接精製モジュールで処理できるようにすることを指す。こうすることによって、回路内の表面積を減らすことができ、タンパク質の回路への吸着による損失を減少させることができる。また、分画されたタンパク質を含む溶液を直接処理することが可能となることから、操作が格段に簡便になる。
【００４０】
本発明のタンパク質分画デバイスでは、精製モジュールが、特定のタンパク質を選択的に吸着させる性質を持つ物質が固定化された樹脂を含むことが好ましい。特定のタンパク質を選択的に吸着させる性質を持つ物質が固定化された樹脂を用いることで、選択的な相互作用により分画されたタンパク質を効率よく吸着させることが可能となる。
【００４１】
本発明においては、精製モジュールが、金属キレート樹脂、タンパク質固定化樹脂、レクチン固定化樹脂、群特異性アフィニティー樹脂、および疎水性化合物固定化樹脂、イオン交換樹脂、逆相樹脂、からなる群より１種類以上選択される樹脂を含むことが好ましい。
【００４２】
本発明でいう“金属イオンキレート樹脂”とは、分画されたタンパク質から、リン酸化タンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、金属原子が配位されたキレートを固定化した樹脂のことを指す。キレート基には、ニトリロ酢酸基、イミノ二酢酸基などがそれぞれ好適に用いられる。また、配位させる金属原子は、金属イオンであれば特に限定されず、例えば、鉄、亜鉛、ガリウム、ジルコニウムなどがそれぞれ好適に用いられる。また、複数種の金属原子が混合して配位されているようなキレート樹脂を調製することにより、分画されたリン酸化タンパク質をより効率よく吸着させ、回収しようとすることは好ましい。
【００４３】
本発明でいう“タンパク質固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、他のタンパク質と相互作用するようなタンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、特定のタンパク質を固定化した樹脂のことである。固定されるタンパク質は、特に限定されない。例えば、β２ミクログロブリンを固定化した樹脂を精製モジュールに用いることで、血清や細胞抽出液などから分画モジュールを用いて分画された低分子量タンパク質から、β２ミクログロブリンと相互作用するタンパク質を網羅的に回収することができる。また、酵素活性を持つタンパク質を固定化することにより、分画モジュールによって分画されたタンパク質を吸着させ、同時に酵素反応を進めていくことができ好ましい。酵素活性を持つタンパク質としては、プロテアーゼ、核酸分解酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、糖鎖付加酵素、糖鎖切断酵素、制限酵素等があげられるが、酵素活性を持つものであればこれらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明でいう“抗体固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、特定の抗体と相互作用する抗原タンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、特定の抗体を固定化した樹脂のことである。固定される抗体は、特に限定されない。例えば、抗アルブミン抗体を固定化した樹脂を精製モジュールに用いることで、血清や細胞抽出液などから分画モジュールを用いて分画された低分子量タンパク質から、残存するアルブミンを網羅的に回収することができる。また、モジュールに充填する液体を適切に選択することにより抗原タンパク質と相互作用するタンパク質も同様に回収することが可能となる。例えば、抗アルブミン抗体を固定化した樹脂であれば、アルブミンと相互作用するタンパク質がアルブミンとともに回収される。さらに、タンパク質の種類によっては、溶出開始用緩衝液および溶出用緩衝液の組成を適切に選択することにより、抗原タンパク質と、抗原タンパク質に相互作用するタンパク質とを別々にフラクションとして回収することができる。
【００４５】
本発明でいう“レクチン固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、糖タンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、レクチンと呼ばれる糖に親和性を持つタンパク質を固定化したものである。レクチンタンパク質としては、タチナタマメレクチン（コンカナバリン）、スノードロップレクチン、イヌレンジュレクチン、レンチルレクチン、ピーナッツレクチン、エルダベリーレクチン、コムギ胚芽レクチン、等があげられるが、特にこれらに限定されるものではない。これらのタンパク質を使い分けることによって、また、複数種のレクチンタンパク質が固定化された樹脂を組み合わせて用いることにより、より確実に糖タンパク質を回収しようとすることは好ましい。
【００４６】
本発明でいう“群特異性アフィニティー樹脂”とは、三次元的な網目構造を有する高分子に、一部のタンパク質群が特異的に結合する低分子化合物を固定化した樹脂のことである。その化合物としては例えば、ベンザミジン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、オリゴヌクレオチド、グルタチオン、ヘパリン、ストレプトアビジン、核酸、ブルー色素等があげられるが、特にこれらに限定されない。
【００４７】
本発明でいう“疎水性化合物固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、疎水性タンパク質を回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、疎水性の化合物を固定化した樹脂のことである。疎水性の化合物としては、ブチル基、メチル基、ベンジル基、フェニル基、オクチル基、イソプロピル基、エーテル基、等があげられるが、特にこれらに限定されるものではない。また、好ましくは、これらの樹脂を使い分けることによって、様々なタンパク質を回収することができる。
【００４８】
本発明でいう“イオン交換樹脂”とは、三次元的な網目構造を有する高分子にイオン交換を行うためのイオン交換基を付与した樹脂のことである。イオン交換基には、大きく分類して陽イオン交換基、陰イオン交換基の２種類あり、陽イオン交換基としては、例えばカルボキシメチル基、スルホプロピル基などが、陰イオン交換基としては、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、ジエチルアミノプロピル基、四級アンモニウム基、トリメチルアミノエチル基、トリメチルアミノプロピル基などがそれぞれ好適に用いられる。緩衝液の組成、ｐＨに応じてイオン交換樹脂を使い分けることで、分画されたタンパク質を効率よく吸着させることができ、その結果分画したタンパク質を高い収率で回収することが可能となる。
【００４９】
本発明でいう“逆相樹脂”とは、分画されたタンパク質を網羅的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に疎水性の官能基を固定化したものである。固定化する官能基としては、フェニル基、シアノプロピル基、直鎖アルキル基が好ましく用いられる。直鎖アルキル基はＣ２−Ｃ２０までのものが用いられるが、一般に市販されているもので、特に好ましくは、Ｃ３（トリメチル基）、Ｃ４（ブチル基）、Ｃ８（オクチル基）、Ｃ１８（オクタデシル基）が用いられ、これらの官能基を使い分けることによって、分画したタンパク質を高い収率で回収することができる。
【００５０】
本発明における精製モジュールは、単段で用いても効果があるが、異なる樹脂を含む精製モジュールを複数具備することが好ましい。複数の精製モジュールを具備することにより、分画モジュールで分画されたタンパク質を、確実に吸着させることが可能となるばかりか、吸着対象の異なる吸着剤が装填された精製モジュールを連結して用いることで、タンパク質の性質の違いにより分別して精製することが可能となる。
多種類の精製モジュールを並列に連結するときは、市販のマルチポジションバルブ（例えば、Ｖａｌｃｏ社製マルチポジションバルブ）を用いて連結すると、３種類以上の精製モジュールを容易に連結することができ好ましい。さらに、精製モジュールに連結しないバイパスの流路を設けておくと、分画モジュールのみで分画処理をおこなった後で、精製モジュールに流路を切り替えて、分画モジュールと精製モジュールとを連結して精製モジュールへのタンパク質の吸着を開始できる。また、精製モジュールを通過したタンパク質溶液を循環させて精製モジュールに通過させることにより、確実により多くのタンパク質を回収することができるため好ましい。
【００５１】
本発明による分画デバイスでは、好ましくは、精製モジュール同士を溶液流路に対して連結させて処理する。
【００５２】
本発明における精製モジュールは、全ての精製モジュールが溶液流路に対して連結されていることが好ましい。
【００５３】
精製モジュール同士を溶液流路に対して連結させることにより、分画されたタンパク質を含む溶液を、精製モジュールに効率よく吸着させることが可能となる。また、回路内の表面積を減らすことができ、タンパク質の回路への吸着による損失を減少させることができる。また、分画されたタンパク質を含む溶液を直接処理することが可能となることから、操作が格段に簡便になる。
【００５４】
本発明におけるタンパク質分画デバイスを用いてタンパク質を分画する場合、好ましくは、以下の手法で行う。
【００５５】
はじめに回路に投入したタンパク質を含む溶液を分画モジュールにより分画し、分画された溶液を精製モジュールに通過させることで、タンパク質の性状に応じて特定のタンパク質を吸着させる。このとき、特定のタンパク質を確実に吸着させるために、複数の精製モジュールを設置することが望ましい。
【００５６】
本発明におけるモジュールおよび回路内に充填される液体は、タンパク質を溶解可能なものであれば任意でよい。ただし、特定のタンパク質が精製モジュールへ吸着することを妨げる物質が含まれないことが好ましい。例えば、精製モジュールの充填物に金属キレート樹脂を用いて、リン酸化タンパク質を選択的に吸着してその後に回収する目的であれば、充填する液体のリン酸濃度は０〜５ｍＭが好ましく、０ｍＭであることがより好ましい。リン酸濃度が５ｍＭを越える場合は、リン酸分子がリン酸化タンパク質の樹脂への吸着を阻害してしまうので好ましくない。また例えば、精製モジュールの充填物にイオン交換樹脂を用いて、タンパク質を網羅的に吸着回収する目的であれば、塩濃度は５ｍＭ〜１Ｍが好ましく、１０〜３０ｍＭがより好ましい。５ｍＭ未満だと緩衝液の緩衝能が損なわれてしまい、ｐＨ変化がおきやすくなってしまうばかりか、タンパク質が析出してしまう可能性があるため、また、１Ｍを超える濃度ではタンパク質が塩析効果により析出したり、流路が詰まりやすくなったりしてしまうためそれぞれ好ましくない。
【００５７】
上記の点を満たすものであれば、モジュールおよび回路内に充填された液体は任意でよく、例えば緩衝液、水、水溶性有機溶媒およびそれらの混合物が挙げられる。ここで緩衝液として好適に用いられるのは、例えばリン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、炭酸水素塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、ギ酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが挙げられる。また、本発明において好適に用いられる水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、ピリジン等の含窒素化合物、１，４−ジオキサン、プロピレンオキシド等の環状エーテル化合物、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン化合物、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド類、スルホラン、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄化合物、メタノール、エタノール、２−プロパノール等の一価アルコール類、２−メトキシエタノール（メチルセロソルブ）、２−エトキシエタノール（エチルセロゾルブ）などのセロソルブ類、２−アミノエタノール（モノエタノールアミン）、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のエタノールアミン類、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類が挙げられる。さらに、タンパク質の膜透過性を向上させたり、低分子量タンパク質の透過性を高めたりすることを目的として、添加物が含まれていてもよい。本発明において好適に用いられる添加物の例としては、タンパク質変性剤、カオトロピックイオン等が挙げられ、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリウムが好適に用いられる。
【００５８】
モジュールに充填する液体のｐＨは、タンパク質が変性せず、安定に存在することができる４〜１０のｐＨが好ましく、さらに５〜９の中性付近のｐＨがより好ましい。４より小さい、あるいは１０を超えるｐＨでは、タンパク質が変性し析出してしまう可能性があるので好ましくない。さらに、特定のタンパク質が精製モジュールへ吸着することを妨げないｐＨがより望ましい。例えば、精製モジュールで金属イオンを用いて、リン酸化タンパク質を特異的に吸着精製する目的であれば、その分画用緩衝液のｐＨは５〜８が好ましい。８を超えるｐＨでは精製モジュールへのリン酸化タンパク質の吸着効果が弱まってしまうため好ましくない。
【００５９】
本発明でいう“溶出用緩衝液”は、精製モジュールの充填物に吸着したタンパク質の相互作用を解離させることができる溶液であれば特に限定されない。また、“溶出開始用緩衝液”は、精製モジュールの充填物に吸着したタンパク質の相互作用を妨げない溶液であれば特に限定されない。溶出用緩衝液には、塩、有機溶媒、低分子化合物等の添加物が緩衝液に添加される。また、溶出開始用緩衝液には、それらの添加物が含まれないか、またはタンパク質と精製モジュールの充填物に吸着したタンパク質の相互作用を妨げない程度に含まれる。また、モジュールおよび回路内に充填された液体をそのまま溶出開始用緩衝液として用いることも好ましい。
【００６０】
例えば、リン酸化タンパク質を回収する目的で、精製モジュールの充填物として金属キレート樹脂を用いる場合、緩衝液にはリン酸塩が添加される。リン酸塩を添加する場合、溶出用緩衝液のリン酸濃度は１０ｍＭ〜５Ｍが好ましく、５０ｍＭ〜１Ｍがより好ましい。また溶出開始用緩衝液のリン酸濃度は０ｍＭ〜１ｍＭが好ましく、０ｍＭがより好ましい。また例えば、糖タンパク質を回収する目的で、精製モジュールの充填物としてレクチン固定化樹脂を用いる場合、溶出用緩衝液には糖が添加される。この場合、溶出用緩衝液の糖濃度は１０ｍＭ〜１Ｍが好ましく、１００ｍＭ〜２００ｍＭがより好ましい。また、溶出開始用緩衝液の糖濃度は０ｍＭ〜５ｍＭが好ましい。また例えば、イオン交換樹脂を用いる場合、緩衝液には塩が添加される。この場合、溶出用緩衝液の塩濃度は１０ｍＭ〜１０Ｍが好ましく、５０ｍＭ〜５Ｍがより好ましい。また、溶出開始用緩衝液の塩濃度は０ｍＭ〜５ｍＭが好ましい。
【００６１】
また、吸着したタンパク質を溶出させるために、緩衝液のｐＨを変えることにより、溶出用緩衝液と溶出開始用緩衝液を調製し、精製モジュールの充填物とタンパク質との相互作用を徐々に弱めることもできる。この場合は、溶出用緩衝液に添加される塩、有機溶媒、低分子化合物等の物質の濃度はｐＨを変化させない場合と比べて低くすることができる。例えば、イオン交換樹脂を用いる場合は、溶出用緩衝液の塩濃度を５０〜１００ｍＭの低い濃度に調製してタンパク質を溶出することが可能となる。
【００６２】
上記の通り、本発明における“タンパク質分画デバイス”を用いてタンパク質が含まれる溶液を処理することで、特定のタンパク質を選択的に回収することができる。このとき、対象となる特定のタンパク質の回収率は、２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。また、血清中のタンパク質を分画する場合、分画、濃縮処理後のタンパク質含量が、血清アルブミンや免疫グロブリンなど高分子量かつ高含量のタンパク質については処理前の１％未満となることが好ましい。もし、分画後のタンパク質溶液中に高分子量、高含量タンパク質が処理前の１％以上残存した場合、質量分析や二次元電気泳動等により解析する際、特定のタンパク質の検出を妨げることがあるため好ましくない。逆に、高分子量、高含量タンパク質が処理前の１％未満とした試料では、質量分析、二次元電気泳動で特定のタンパク質を数多く検出することが可能となる。
【００６３】
さらに、本発明のタンパク質の分画方法では、タンパク質を含む溶液は、好ましくは、タンパク質を含む体液である。これにより、特に血液、尿などの体液中に含まれるタンパク質を効率よく分画し、その分画した溶液中に含まれる特定のタンパク質を除去あるいは回収できる。
本発明でいう“タンパク質を含む溶液”とは、タンパク質が溶存した液体全般を指し、そこに含まれるタンパク質の種類、含有量、濃度は特に限定されない。また、溶媒の種類についても、タンパク質を溶解可能であれば特に限定されない。また、本発明でいう“タンパク質を含む体液”とは、一般的な生体を構成する液体のことを指し、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、骨髄液、腹水、胸水、汗、涙、母乳などが挙げられる。
本発明のタンパク質分画デバイスは、好ましくは“疾患マーカータンパク質”を回収する。疾患マーカータンパク質とは、その発現量や修飾の状態が、疾患によって大きく変動するようなタンパク質を指す。
【００６４】
また、本発明のタンパク質分画方法は、中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を精製するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させる機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイスを用いて、タンパク質を含む溶液から特定のタンパク質を除去あるいは回収する。これにより溶液中に含まれているタンパク質を効率よく分画し、分画されたタンパク質から特定のタンパク質を高い効率で除去あるいは回収することができる。
【００６５】
さらに、本発明のタンパク質の分画方法では、好ましくは、タンパク質を含む溶液を分子量の大きさの違いで分画・回収する。これにより、体液中に含まれるタンパク質を分子量の大きさの違いを利用して効率よく分画し、その分画した溶液中に含まれる、特定のタンパク質を除去あるいは回収できる。
【００６６】
本発明のタンパク質分画デバイスにより、上述の通りタンパク質を含有する溶液から目的のタンパク質を効率よく回収することができる。したがって、本発明のタンパク質分画デバイスを用いて、例えば血清、血漿中に含まれるタンパク質から、目的のタンパク質を効率よく回収し、それらのタンパク質を質量分析、二次元電気泳動等で解析することにより、患者の血清、血漿に含まれる疾患マーカータンパク質の発現量を健常者のそれと定量的に比較したり、疾患マーカータンパク質が翻訳後修飾をうけている度合を比較したりすることができるようになり、疾患によるタンパク質発現量の増減や、翻訳後修飾状態の変化を知ることができる。したがって、本発明のタンパク質分画デバイスは、疾患関連タンパク質の同定や新規創薬ターゲットの創出において特に有用である。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６８】
実施例１
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、１００μＬのリン酸化タンパク質回収ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ社製ＰｈｏｓｐｈｏＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ付属のビーズ）を充填してカラムを作製し、精製モジュールＡとした。また、精製モジュールＡの概略図を図１に示す。
【００６９】
血液透析器（東レ製ＴＳ１．６ＭＬ）の両端の樹脂接着部分を切り、ポリスルホン製中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の寸法は、内直径２００μｍ、膜厚４０μｍであり、液が透過する部分の断面を観察したところ非対称構造を有していた。この中空糸膜を１００本束ね、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をプラスチック管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。ミニモジュールの直径は約８ｍｍ、長さは約１３ｃｍであり、一般的な中空糸膜型透析器同様に、中空糸内に液体を循環させるためのポート（循環ポート）と透析液ポートをそれぞれ２個有している。作製したミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて十分に洗浄したものを、分画モジュールとした。
【００７０】
上記の分画モジュールおよび外径４ｍｍ、内径２ｍｍのシリコンチューブ（アズワン製）を用いて、分画循環回路を作製した。分画循環回路の途中に定量送液ポンプ（東京理化器械製）を設置し、回路内の液体を循環させることを可能とした。また、血液透析用回路（東レ製）のポートを切り出して分画循環回路内に設置し、サンプルの注入口を設けた。分画モジュールの濾液出口と精製モジュールＡの入口をシリコンチューブで接続した。分画モジュールと精製モジュールＡの間には、定量送液ポンプ（以下、送液ポンプＢ）を設置した。さらに三方バルブを設置し、グラジエント形成ポンプに接続した。グラジエント形成ポンプの先には、洗浄液および溶出用緩衝液を入れることのできる容器を接続した。精製モジュールＡを接続し、三方バルブとシリコンチューブを用いて、精製モジュールＡの出口を二つの流路に分け、片方の先端部をリザーバーに向け、もう片方の先端部をフクラクションコレクター（ＧＥヘルスケア製、Ｆ−９５０型）に向けた。さらに、リザーバーと精製モジュールＡの入口を定量送液ポンプ、三方バルブを設置したシリコンチューブで接続し、濃縮循環回路を形成した。分画循環回路内に５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、緩衝液Ａ）を充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＡと表記）。分画デバイスＡの概略図を図２に示す。
【００７１】
実施例２
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、１００μＬのＣｏｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア製）を充填して実施例１と同様のカラムを作製し、精製モジュールＢとした。そして、実施例１と同様に回路を作成し、分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＢと表記）。
【００７２】
実施例３
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、１００μＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア製）を充填して実施例１と同様のカラムを作製し、精製モジュールＣとした。
【００７３】
精製モジュールＡおよび精製モジュールＣをシリコンチューブと三方バルブを用いて並列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成し、分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＣと表記）。分画デバイスＣの概略図を図３に示す。
【００７４】
実施例４
ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製の平板（荷重たわみ温度９２℃）を７９×２３×２ｍｍの大きさに加工し、幅１ｍｍ×高さ１ｍｍ×長さ４０ｍｍの流路を形成した。流路内に、２０μｌのＰＯＲＯＳ ２０ ＨＱビーズ（アプライドバイオシステムズ製）を充填し、さらに上板を貼りあわせ、精製モジュールＤとした。精製モジュールＤの概略図を図４に示す。
【００７５】
精製モジュールＡおよび精製モジュールＤをシリコンチューブと三方バルブを用いて並列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成し、分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＤと表記）。分画デバイスＤの概略図を図５に示す。
【００７６】
実施例５
精製モジュールＡおよび精製モジュールＣをシリコンチューブと三方バルブを用いて並列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成した。ただし、以下のように回路を変更した。まず、分画モジュールの濾液出口にシリコンチューブを接続し、濾液をリザーバーに回収できるようにした。容器中の溶液を精製モジュールに循環させるため、以下の精製循環回路を組んだ。両精製モジュールの入口側に接続したシリコンチューブの端部は、リザーバー中の溶液に浸漬できるようにし、定量送液ポンプを設置することで送液できるようにした。また、両精製モジュールの出口側に接続したシリコンチューブも、中を通過した溶液がリザーバーへと入るように設置した。なお、このシリコンチューブ回路の途中に三方バルブを設置し、それを切り替えることでフラクションコレクターに溶液を回収できるようにした。分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＥと表記）。分画デバイスＥの概略図を図６に示す。
【００７７】
実施例６
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、逆相樹脂であるＯＡＳＩＳ（登録商標） ＨＬＢ（ウォーターズ）を１００μＬ充填して実施例１と同様のカラムを作製し、精製モジュールＥとした。
【００７８】
精製モジュールＣおよび精製モジュールＥをシリコンチューブと三方バルブを用いて直列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成した。分画モジュールと精製モジュールＡの間に三方バルブを設置し、グラジエント形成ポンプ（以下、グラジエント形成ポンプＡ）に接続した。グラジエント形成ポンプの先には、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液（以下、それぞれ溶出開始用緩衝液Ａと溶出用緩衝液Ａ）を入れることのできる容器を接続した。さらに、精製モジュールＣの出口と精製モジュールＥの入り口の間に、三方バルブを設置し、グラジエント形成ポンプ（以下、グラジエント形成ポンプＢ）に接続した。
【００７９】
グラジエント形成ポンプの先には、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液（以下それぞれ溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂ）を入れることのできる容器を接続した。分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＦと表記）。分画デバイスＦの概略図を図７に示す。
【００８０】
実施例７
実施例１に記載の中空糸膜を１００本充填した分画モジュールＡを２本（以下、分画モジュールＡ１、分画モジュールＡ２と表記）、および同様の方法で中空糸膜を４０本充填した分画モジュールＢを１本作製した。各モジュールについて、外径４ｍｍ、内径２ｍｍのシリコンチューブを用いて、中空糸膜内側を液が通過する循環回路をそれぞれ作製した。さらに、分画モジュールＡ１の中空糸膜外側の出口と分画モジュールＡ２の中空糸膜内側の入口、および分画モジュールＡ２の中空糸膜外側の出口と分画モジュールＢ中空糸膜内側の入口をそれぞれシリコンチューブで接続した。さらに、血液透析用回路（東レ製）のポートを切り出して分画部の入口に設置し、サンプルおよび緩衝液の注入口を設けた。このようにして、分画部Ａを作製した。精製モジュールＡと精製モジュールＣをシリコンチューブで並列に接続し、さらに分画部の濾液出口と両精製モジュールの入口をシリコンチューブで接続した。分画部と両精製モジュールの間に、定量送液ポンプを設置した。また、両モジュールの出口にシリコンチューブを接続し、その先端部をリザーバーＡに向けた。また、シリコンチューブでリザーバーＡ内の液体を精製モジュールに循環させるための回路を設け、濃縮循環回路を形成した。このとき、回路の途中に定量送液ポンプを設置し、一端をリザーバーＡ内に、もう一端を回路に設置した三方バルブに接続した。分画部の回路に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＧと表記）。分画デバイスＧの概略図を図８に示す。
【００８１】
実施例８
ヒト市販血清（シグマ製、Ｃａｔ．Ｈ１３８８）１ｍＬを遠心して不溶物を沈殿させ、ポアサイズが０．２２μｍのＭＩＬＬＥＸ−ＧＬフィルター（ミリポア製）を用いて上清を濾過し、緩衝液Ａで４倍希釈した（以下、希釈血清Ａと表記）。４．５ｍＬの希釈血清を５ｍＬのシリンジ（テルモ製）にとり、その先端部にシリコンチューブを取り付けて、マイクロシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にセットした。また、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬのシリンジ（ニプロ製）にとり、希釈血清を針の先まで充填し、気泡が混入していないことを確認した後、針先をタンパク質分画デバイスＡの回路に設けた注入口に刺して接続した。送液ポンプＡを作動させて循環回路内に充填した緩衝液Ａを５ｍＬ／ｍｉｎで循環させ、次いでシリンジポンプを作動させて希釈血清を０．２ｍＬ／ｍｉｎで押し出すと同時に、送液ポンプＢを作動させて分画モジュールの濾液を０．２ｍＬ／ｍｉｎで、精製循環回路内へと送り、１時間循環させた。すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また、処理前の溶液および回収された溶液に含まれるタンパク質を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって酵素消化し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置（マイクロマス製）を用いて、溶出タンパク質溶液内のリン酸化タンパク質の検出を試みた。その結果、処理前の溶液からはリン酸化タンパク質を検出できなかったのに対し、リン酸化タンパク質を４種類検出することができた。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８２】
実施例９
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＢの回路と接続した。実施例６と同様に、血清Ａを回路に導入し、１時間循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって精製モジュールＢに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液には緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には２００ｍＭのアルファ−マンノースを含む５０ｍＭトリス−緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でそれぞれのフラクション中の糖蛋白質の質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、糖蛋白質の回収率が３０％であった。また、処理前の溶液および回収された溶液に含まれるタンパク質を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって酵素消化し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置（マイクロマス製）を用いて、溶出タンパク質溶液内の糖タンパク質の検出を試みた。その結果、処理前の溶液からは糖タンパク質を検出できなかったのに対し、糖タンパク質を６種類検出することができた。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８３】
実施例１０
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＣの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＣに接続して循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＢに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＣから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０４％であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は３０％、４０％、４３％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８４】
実施例１１
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＤの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＤに接続して流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎにして循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＤに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＤから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０２％であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は２０％、２３％、２０％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８５】
実施例１２
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＥの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＣに接続して循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＣから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０４％であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は３０％、４０％、４３％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８６】
実施例１３
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＦの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、１時間にわたり循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液Ｂは１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を２ｍｌ、溶出用緩衝液Ｂには７０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含む１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を２ｍＬ用いた。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液Ａと溶出用緩衝液Ａとを１：９の混合比で送液することよって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を部分的に溶出させ、精製モジュールＥに吸着させた。このときの溶出開始用緩衝液Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用い、溶出用緩衝液Ａには５００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。三方バルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させ、フラクションコレクターを用いて回収した。 次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液Ａと溶出用緩衝液Ａとを１：４の混合比で送液することよって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を部分的に溶出させ、精製モジュールＥに吸着させた。先述と同様に三方バルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させ、フラクションコレクターを用いて回収した。さらに三方バルブを切り替え、溶出用緩衝液Ａのみを送液することよって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質をすべて完全に溶出させ、精製モジュールＥに吸着させた。さらにバルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させ、フラクションコレクターを用いて回収した。
【００８７】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で回収したそれぞれのフラクション中のＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が検出限界以下であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は１８％、２０％、１７％であった。
【００８８】
実施例１４
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＧの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＣに接続して循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＣから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡ検出限界以下であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は２４％、３２％、３１％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８９】
比較例１
精製モジュールＡの入り口と出口をシリコンチューブで接続した、精製循環回路Ｂを作成した。入口側と出口側の両方のシリコンチューブの端部は、リザーバー中の溶液に浸漬できるようにし、定量送液ポンプを設置することで送液できるようにした。さらに三方バルブを設置し、溶出開始用緩衝液および溶出用緩衝液を送液するためのシリンジを取り付けられるようにした。また、精製モジュールＡの出口側に三方バルブを用いて、シリコンチューブを接続し、端部を回収部に向けた。希釈血清Ａをリザーバーに入れ、ポンプを作動させて２時間精製循環回路Ｂに循環させた。その後、ポンプを止め、精製モジュールＡに５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を０．５ｍＬ流し、精製モジュールＡに吸着したリン酸化タンパク質を溶出させた。実施例７と同様にして酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でこの溶液中の除去対象タンパク質に含まれるＨＳＡの濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０５％であった。また、回収されたタンパク質溶液を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって酵素消化し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置（マイクロマス製）を用いて、標準的な方法で溶出タンパク質溶液内のリン酸化タンパク質の検出を試みた。しかしながら、リン酸化タンパク質は検出されず、ほとんどがアルブミンのシグナルであった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明における精製モジュールの一態様を示した断面図を表す。
【図２】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図３】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図４】本発明における精製モジュールの一態様を示した断面図を表す。
【図５】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図６】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図７】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図８】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【符号の説明】
【００９１】
１０１ 充填ビーズ
１０２ フィルター
２０１ａ 試料入りシリンジ
２０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
２０２ａ、２０２ｂ、２０２ｃ、２０２ｄ 三方バルブ
２０３ サンプル注入口
２０４ 分画循環流路
２０５ａ、２０５ｂ、２０５ｃ 送液ポンプ
２０６ 分画モジュール
２０７ 精製モジュール
２０８ リザーバー
２０９ フラクションコレクター
２１０ グラジエント送液ポンプ
２１１ａ、２１１ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
３０１ａ 試料入りシリンジ
３０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
３０２ａ、３０２ｂ、３０２ｃ、３０２ｄ、３０２ｅ、３０２ｆ 三方バルブ
３０３ サンプル注入口
３０４ 分画循環流路
３０５ａ、３０５ｂ、３０５ｃ 送液ポンプ
３０６ 分画モジュール
３０７ 精製モジュール
３０８ 精製モジュール
３０９ リザーバー
３１０ フラクションコレクター
３１１ グラジエント送液ポンプ
３１２ａ、３１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
４０１ ＰＥＥＫチューブ
４０２ ねじ式コネクタ
４０３ 上板
４０４ 下板
４０５ 充填ビーズ
４０６ フィルター
５０１ａ 試料入りシリンジ
５０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
５０２ａ、５０２ｂ、５０２ｃ、５０２ｄ、５０２ｆ 三方バルブ
５０３ サンプル注入口
５０４ 分画循環流路
５０５ａ、５０５ｂ、５０５ｃ 送液ポンプ
５０６ 分画モジュール
５０７ 精製モジュール
５０８ 精製モジュール
５０９ リザーバー
５１０ フラクションコレクター
５１１ グラジエント送液ポンプ
５１２ａ、５１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液４０１ａ 試料入りシリンジ
６０１ａ 試料入りシリンジ
６０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
６０２ａ、６０２ｂ、６０２ｃ、６０２ｄ、６０２ｅ 三方バルブ
６０３ サンプル注入口
６０４ 分画循環流路
６０５ａ、６０５ｂ 送液ポンプ
６０６ 分画モジュール
６０７ 精製モジュール
６０８ 精製モジュール
６０９ リザーバー
６１０ フラクションコレクター
６１１ グラジエント送液ポンプ
６１２ａ、６１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
７０１ａ 試料入りシリンジ
７０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
７０２ａ、７０２ｂ、７０２ｃ、７０２ｄ、７０２ｅ 三方バルブ
７０３ サンプル注入口
７０４ 分画循環流路
７０５ａ、７０５ｂ、７０５ｃ 送液ポンプ
７０６ 分画モジュール
７０７ 精製モジュール
７０８ 精製モジュール
７０９ リザーバー
７１０ フラクションコレクター
７１１ａ、７１１ｂ グラジエント送液ポンプ
７１２ａ、７１２ｂ、７１２ｃ、７１２ｄ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
８０１ａ 試料入りシリンジ
８０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
８０２ａ、８０２ｂ、８０２ｃ、８０２ｄ、８０２ｅ、８０２ｆ 三方バルブ
８０３ａ、８０３ｂ、８０３ｃ サンプル注入口
８０４ａ、８０４ｂ、８０４ｃ、８０４ｄ、８０４ｅ 送液ポンプ
８０５ａ、８０５ｂ、８０５ｃ 分画モジュール
８０６ 精製モジュール
８０７ 精製モジュール
８０８ リザーバー
８０９ フラクションコレクター
８１０ グラジエント送液ポンプ
８１１ａ、８１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分画されたタンパク質から、選択的にタンパク質を吸着できる精製モジュールを具備したタンパク質分画デバイスに関する。また本発明は、該タンパク質分画デバイスを用いた溶液中に含まれるタンパク質の分画方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究として、プロテオーム解析研究（プロテオミクス）が注目されている。遺伝子産物であるタンパク質は、疾患の病態に直接リンクしていると考えられることから、タンパク質を網羅的に調べるプロテオーム解析の研究成果は診断と治療に広く応用できると期待されている。しかも、プロテオーム解析により、ゲノム解析では発見できなかった病因タンパク質や疾患関連因子を多く発見できる可能性が高いとみられている。
【０００３】
従来のプロテオーム解析研究が、タンパク質を網羅的に検出・同定するのみにとどまっていたのに対し、さらに最近では、それらのタンパク質の翻訳後修飾を解析するなどといった、幅広い解析手法を用いた研究が注目され始めている。タンパク質は、細胞内で合成された後に、リン酸化、糖鎖付加、アセチル化、脂質付加、ユビキチン付加などの様々な修飾をうけることが知られている。そして、その修飾がタンパク質の活性に大きく影響し、ひいてはタンパク質群全体の挙動に影響を与えている。生体内において疾患が発症する際には、複数のタンパク質の発現量そのものが変化することに加えて、いくつかのタンパク質の翻訳後修飾の状態が変化しており、それによってタンパク質群の正常な挙動が失われていると考えられている。例えば、タンパク質のリン酸化は生命現象において細胞内の情報伝達に深く関わっており、細胞の癌化などの疾患の発症に深く関与していると考えられている。これらのタンパク質の翻訳後修飾については、ゲノム情報からでは決して解析することができず、プロテオーム解析の重要な分析対象となっている。タンパク質の翻訳後修飾の網羅的解析については、まず修飾されているタンパク質そのものを同定し、さらにそのタンパク質のどの部位が修飾されているのかを決定し、さらにどの程度修飾をうけているのかを調べる、といった解析が主な流れとなっている。
【０００４】
このようなプロテオーム解析が急速に進展したのは、技術的には質量分析装置（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＭＳ）による高速構造分析が可能となってきたことが大きい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の実用化によって、ポリペプチドのハイスループット超微量分析が可能となり、従来検出し得なかった微量なタンパク質を、短時間の測定で非常に多種類にわたって同定することが可能となった。また、翻訳後修飾の解析についても、適切な測定条件を設定することにより、修飾タンパク質の検出とその修飾部位の同定とを行うことができるようになりつつある。これらの分析技術は、現在では疾患関連因子の探索に非常に強力なツールとなっている。
【０００５】
プロテオーム解析を臨床に応用する第一の目的は、その発現量や修飾の状態が、疾患によって大きく変動するようなバイオマーカータンパク質を発見することである。バイオマーカーは病態に関連して挙動するため、診断マーカーとなり得るほか、創薬ターゲットとなる可能性も高い。すなわち、プロテオーム解析の成果は、診断マーカーや創薬ターゲットの創出に直接繋がるため、ポストゲノム時代の診断・治療の切り札（エビデンス）技術となる。さらに、同定されたバイオマーカーは患者の薬剤応答性評価や副作用発現予測といった直接的に患者が享受しうる利益につながることから、いわゆるテーラーメード医療（オーダーメード医療）の推進にも大きな役割を果たすといえる。
【０００６】
臨床研究でのプロテオーム解析（臨床プロテオミクス）においては、多数の検体を迅速、確実に解析することが求められている。しかも臨床検体は微量かつ貴重であることから、高分解能・高感度・高機能測定を迅速に行う必要がある。この大きな推進力となったのは質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であるが、これは先に述べたような質量分析装置が有する超高感度でハイスループットであるという特性の貢献するところが大きい。しかしながら、その手法や機器が急速に改良されてきてはいるものの、現在のところプロテオーム解析が臨床現場で簡便かつ迅速に実施できる状況にはないのが実状である。
【０００７】
その原因のひとつに、臨床検体の前処理が必要であることが挙げられる。質量分析により解析する前に、臨床検体のタンパク質を分画、精製する必要があるが、この処理には数日かかるのが実態であり、さらには前処理の操作が煩雑かつ経験を要することが、臨床への応用の大きな障害となっている。少量の血液や体液から全身の疾患の診断や病態管理ができるならば、その有用性は極めて大きいものの、血清、血漿中に含まれるタンパク質の多様性のために、多くの課題を抱えているのが現状である。
【０００８】
ヒトタンパク質は１０万種以上あるとも推定されているが、血清中に含まれるタンパク質だけでも約1万種類にものぼるといわれ、それらすべてを合わせた血清中濃度は約６０〜１００ｍｇ／ｍＬと推定される。血清中の高含量タンパク質は、アルブミン（分子量６６ｋＤａ）、免疫グロブリン（１５０〜１９０ｋＤａ）、トランスフェリン（８０ｋＤａ）、ハプトグロビン（＞８５ｋＤａ）、リポタンパク質（数１００ｋＤａ）等であり、いずれも大量（＞ｍｇ／ｍＬ）に存在する。一方、病態のバイオマーカーや病因関連因子と考えられているペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質の多くは、極微量（＜ｎｇ／ｍＬ）しか存在せず。その含有量比は高分子量の高含量成分に比べると、実にナノ〜ピコレベルである。タンパク質の大きさという観点では、タンパク質全種類の７０％以下は分子量６０ｋＤａ以下であり、上記の極微量なバイオマーカータンパク質はいずれもこの領域に含まれる場合がほとんどである（例えば非特許文献１）。これらのタンパク質は、腎臓を通過して尿中に一部排泄されるため、血液のみならず尿を検体として測定することも可能である。
【０００９】
また、翻訳後修飾に関しては、修飾の種類によっては、タンパク質のうち実際に細胞内で修飾をうけているタンパク質の割合は極めて少ない。たとえば、タンパク質のリン酸化の場合は、タンパク質の全量に比べて実際にリン酸化を受けているタンパク質の割合は極めて少ない。従って、血清・血漿をはじめとする生体サンプルから得られるタンパク質のリン酸化修飾を解析しようとしても、アルブミン、ＩｇＧといった高含量かつ高分子量の非修飾タンパク質のシグナルに埋もれてしまい、修飾タンパク質のみを正確に測定するのは困難であるのが実状である。
【００１０】
そこで、一般的な血清学的検査でプロテオーム解析を行うには、病因関連の微量成分検出の妨害となるアルブミン、ＩｇＧといった高含量、高分子量のタンパク質成分を除外することが必須となる。これらのタンパク質を分離する手段として、現状では高速液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）や二次元電気泳動（Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：２Ｄ ＰＡＧＥ）が用いられているが、これらの作業だけでも１〜２日を要する。この所要時間は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳやＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の数分という分析時間に比べて非常に長く、ＭＳのもつハイスループットという大きな利点が臨床プロテオーム解析では十分発揮できずにいる。このため、医療現場で診断や治療のためにできるだけ短時間に分析結果がほしいという目的には、現時点では実用性に極めて乏しいと言わざるを得ず、日常の臨床検査にＭＳが利用しにくいひとつの大きな原因になっている。
【００１１】
この点が解決されれば、臨床プロテオーム解析による臨床検査の診断の迅速性は飛躍的に向上すると期待できる。具体的には、ＬＣや２Ｄ−ＰＡＧＥの代替となるような、微量の検体から高速で目的タンパク質群を分画・分離できるデバイスがあればよい。
【００１２】
アルブミンを除去対象物質として、すでに実用化されている製品あるいは開示されている技術としては、ブルー色素などのアフィニティーリガンドを固定化した担体（たとえば、日本ミリポア社：“Ｍｏｎｔａｇｅ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｅ Ｋｉｔ（登録商標）”、日本バイオ・ラッド社：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（登録商標）ゲル）、高分子量成分を遠心分離ろ過によって分画する遠心管形式の濾過濃縮ユニット（たとえば、日本ミリポア社：“アミコンウルトラ（登録商標）”、ザルトリウス社：“ビバスピン”）、電気泳動原理によって分画する方法（たとえば、グラディポア社：“Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ（登録商標）”システム）、Ｃｏｈｎのエタノール沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画する方法（例えば非特許文献２）などがある。また、抗アルブミン抗体を固定化した担体とプロテインＧを固定化した担体を用いて血漿中のアルブミンとＩｇＧを除去し、二次元電気泳動により解析を行った報告（例えば非特許文献３）がある他、アルブミンと免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を同時に除去する製品が上市されている（ＧＥヘルスケア社：Ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ＩｇＧ Ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ）。また、これらのアルブミン除去製品について、４社の代表的な製品についてアルブミンの除去効率を、二次元電気泳動により比較して解析をおこなった報告もある（非特許文献４）。しかしながら、これらはいずれも分離分画性能が不十分であったり、微量サンプルには不適当であったり、サンプルが希釈されてしまったり、固定化抗体の溶出がみられたり、あるいは質量分析等に障害となる薬剤が混入したりするなどの問題点があるのが実状である。
【００１３】
電気泳動の手法でタンパク質を分取する製品としては、バイオラッド社の“モデル４９１プレップセル”、“ミニプレップセル”、アトー（株）の“プレップフォレーシス（登録商標）”等がある。これらの製品は、円筒状のゲルの上部にアプライしたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、分離されたタンパク質をゲルの下部から回収することで分取を行う。これらの製品は、一度にある程度まとまった量のタンパク質を処理できる利点があるものの、電気泳動のゲルを準備するのに時間と手間がかかる上、分取したサンプル中にゲルに含まれる未反応のアクリルアミド等の夾雑物が混入することがあるため、質量分析に供する試料としては適さない。
【００１４】
タンパク質試料を濃縮する技術としては、限外濾過膜を用いる方法、一旦沈殿させて少量の溶媒に再溶解する方法、凍結乾燥して少量の溶媒に再溶解する方法、乾燥ゲルで溶媒を吸収する方法などがある。限外濾過膜を用いた方法は一般的に用いられる手法で、具体的には、遠心分離でタンパク質溶液試料をろ過することにより濃縮を行うための遠心管型濾過濃縮ユニット（たとえば、日本ミリポア社：“アミコンウルトラ（登録商標）”、ザルトリウス社：“ビバスピン”）を用いる。しかしながら、膜の細孔径には分布があり、規定された分画分子量以上の物質が通過できる細孔も存在するため、実際は膜の分画分子量以上の分子量であるタンパク質が細孔を通過して濾液に漏出することがあり、したがって、回収率の低下は避けられないのが実状である。
【００１５】
また、タンパク質の修飾タンパク質を分画、精製する技術として、現在すでに実用化されている製品あるいは技術としては、解析目的の化学修飾基に特異的に結合する抗体を固定化したビーズを用いる方法や、金属錯体やレクチンなど個々の化学的修飾に特異的に結合する物質を固定化したビーズを用いた方法が一般的に用いられる。現在実用化されているあるいは開示されている市販されているものとしては、ＰｈｏｓｐｈｏＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。しかしながら、これらの方法では、上記のアルブミンなどの高含量かつ高分子量のタンパク質が、非特異的にそれらのビーズに吸着してしまい、解析目的の修飾タンパク質のビーズへの結合を阻害してしまったり、また、それらの高含有量タンパク質が修飾タンパク質の回収時に共に溶出されてしまい、リン酸化タンパク質のみを特異的に回収する事が困難であるといった問題がある。さらに、抗体を固定化したビーズを用いる方法では、その化学的修飾に対して厳密に高い結合特異性を持った抗体の作成が困難であるといった問題もある。これらのことから、生体サンプルから、修飾タンパク質のみを特異的に回収するのは非常に困難であるのが実状である。
【非特許文献１】アンダーソン・ＮＬ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ）,アンダーソン・ＮＧ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＧ）著，「ザ・ヒューマン・プラズマ・プロテオーム：ヒストリー・キャラクター・アンド・ダイアグノスティック・プロスペクツ（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｏｍｅ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」，モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ），２００２年，第１巻，ｐ８４５−８６７．
【非特許文献２】日本生化学会編，「新生化学実験講座（第１巻）タンパク質（１）分離・精製・性質」，東京化学同人，１９９０年
【非特許文献３】グリーノウ・キャリー（Ｃａｒｒｉｅ Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ）ら著，「ア・メソッド・フォー・ザ・ラピッド・ディプレーション・オブ・アルブミン・アンド・イムノグロブリン・フロム・ヒューマン・プラズマ（Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ）」，プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ），２００４年，第４巻，ｐ３１０７−３１１１．
【非特許文献４】クロミー・ＢＡ（Ｃｈｒｏｍｙ ＢＡ）ら著，「プロテオミック・アナリシス・オブ・ヒューマン・シーラム・バイ・トゥー−ディメンショナル・ディファレンシャル・ゲル・エレクトロフォレシス・アフター・デプレション・オブ・ハイ−アバンダント・プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ），２００４年，第３巻，ｐ１１２０−１１２７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明者らはかかる従来技術の問題点に鑑み、鋭意検討した結果、溶液中に含まれる少なくとも２種類以上のタンパク質を分画する際に、中空糸膜を充填した分画モジュールによって分画されたタンパク質から、特定のタンパク質を、一つあるいは複数個連結された精製モジュールに吸着させ、溶出用緩衝液を用いて溶出させることによって回収できることを見いだし、本発明に到達した。
【００１７】
すなわち本発明は、分画されたタンパク質から、吸着方式によって選択的にタンパク質を精製できる精製モジュールを具備したタンパク質分画デバイスを提供することを目的とする。また本発明は、前記タンパク質分画デバイスを用いたタンパク質の分画方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、上記目的を達成するために以下の構成を有する。
「（１）中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を回収するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させて、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイス。」
「（２）分画モジュールにより処理されたタンパク質を含む溶液を、精製モジュールに循環させて処理することを特徴とする（１）に記載のタンパク質分画デバイス。」
「（３）分画モジュールと、精製モジュールが溶液流路によって連結され、連続して稼働できることを特徴とする（１）または（２）に記載のタンパク質分画デバイス。」
「（４）精製モジュールが、金属キレート樹脂、タンパク質固定化樹脂、抗体固定化樹脂、レクチン固定化樹脂、群特異性アフィニティー樹脂、および疎水性化合物固定化樹脂、イオン交換樹脂、逆相樹脂、からなる群より１種類以上選択される樹脂を含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（５）相異なる樹脂を含む精製モジュールを複数具備してなることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（６）全ての精製モジュールが溶液流路に対して連結されていることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（７）特定のタンパク質をフラクションとして回収することを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（８）特定のタンパク質を２０％以上回収することを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（９）タンパク質を含む溶液が、タンパク質を含む体液であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（１０）特定のタンパク質が、疾患マーカータンパク質であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。」
「（１１）（１）〜（１０）のタンパク質分画デバイスを用いて、タンパク質を含む溶液を分子量の大きさの違いで分画する方法。」
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、血清、血漿をはじめとする溶液に含まれる少なくとも２種類以上のタンパク質をそれらの物理的性状の違いにより分画でき、さらに、その分画されたタンパク質から、特定のタンパク質をさらに精製モジュールに吸着させ、精製モジュールに吸着したタンパク質を溶出用緩衝液を用いて溶出させることにより、特定のタンパク質を回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を回収するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させて、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイスである。
【００２１】
本発明でいう“分画”とは、溶液中の溶質を分離することであり、溶質が複数種類含まれる場合には、その全部または一部を分離することを指す。例えば体液成分を解析するための試料を調製する場合、回収成分と廃棄成分とを弁別することになる。また、本発明でいう“分画モジュール”とは、溶液中のタンパク質を物理的性状の違いにより弁別する用途で用いる器具のことである。すなわち、本発明の分画モジュールを用いることにより、タンパク質を分子量、等電点といった物理的性状の違いで二群以上に分画することができる。
【００２２】
本発明において、分画モジュールに充填する中空糸膜は、液体中に含まれる低分子量物質が膜を界面として双方向に移動可能な細孔を有する。このような機能を有する中空糸膜の製造方法は、湿式紡糸、乾湿式紡糸等、一般的に用いられる中空糸膜の製造方法であれば特に限定されない。例えば、二重環式口金を用いて中空糸膜を製膜する場合、ポリマー流体を口金を用いて中空糸状に紡糸し、流下過程で多孔質を形成し、凝固浴を通すことで固化し、洗浄浴にて芯側流体を洗浄し、乾燥、捲縮付与後巻き取ると、中空糸膜が得られる。これらの作業はオンラインで行うことが好ましい。なお、得られた中空糸膜は表面の擦過傷や、折り曲げ、押圧などによる中空部の潰れ等の無いことが好ましい。
【００２３】
本発明で用いる中空糸膜は、ドライタイプ、ウェットタイプともに利用可能である。ドライタイプの中空糸膜を用いる場合は、膜の表面をグリセリン等で処理して乾燥を防ぐことが好ましい。
【００２４】
本発明において分画モジュールに充填する中空糸膜の素材は、工業的に中空糸膜を形成可能な材料であれば特に限定されず、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体などの合成高分子およびそれらの誘導体、それらを含む共重合体あるいは複合体、もしくはセルロース、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、硝酸セルロース、ジエチルアミノエチルセルロースなどの天然高分子およびそれらの誘導体、それらを含む共重合体あるいは複合体が好適に用いられる。
【００２５】
また、これらの素材が２種以上混合されていてもよく、素材の性質を改良する目的で種々の添加物が混合されていてもよい。例えば、親水性高分子あるいは疎水性高分子を中空糸膜の素材となる高分子とブレンドして製膜し、中空糸膜表面の親水化、疎水化を図ることは好ましい。
【００２６】
また、中空糸膜の表面に親水性高分子あるいは疎水性高分子をコーティングする方法や、グラフト重合する方法も好ましい。ここで用いられる親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリビニルメチルエーテル、ポリアクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体およびこれらの金属塩、エステルなどの合成化合物や、デンプン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、キトサン、リグニン、ポリリジン、絹フィブロイン、カラギーナン、カゼイン、グリコール酸、コラーゲン、ゼラチンおよびこれらの金属塩、エステルなどの天然化合物が好適に利用される。なお、上述の合成高分子化合物と天然高分子化合物を組み合わせてもよい。その他の親水化方法としては、酸素プラズマを照射する方法やポリシラザンをコーティングする方法も利用できる。一方、疎水化方法としては、シリコンコーティング、フッ素コーティング、プラズマ照射による表面処理が好適に用いられる。上述の親水化、疎水化いずれの方法によっても、タンパク質の吸着を抑制することができる。
【００２７】
本発明でいう“特定のタンパク質”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質のうち、解析の対象となるタンパク質を指す。解析の対象となるタンパク質としては、例えば、翻訳後修飾をうけているタンパク質を解析する目的であれば、リン酸化タンパク質、糖タンパク質などが、核酸や低分子化合物に結合するタンパク質を解析する目的であれば、核酸結合タンパク質やアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合タンパク質などが、分画モジュールで分画された全てのタンパク質を解析する目的であれば分画モジュールで分画された全てのタンパク質があげられるが、特にこれらに限定されない。
【００２８】
本発明でいう“選択的に吸着させる”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質のうち、特定のタンパク質をそのタンパク質の持つ性質に応じて精製モジュールに吸着させることを指す。選択的な吸着としては、リン酸化タンパク質の金属キレート基への吸着、抗原タンパク質の抗体への吸着、糖タンパク質のレクチンタンパク質への吸着、核酸結合タンパク質の核酸への吸着、タンパク質のイオン交換基への吸着、などがあげられるが、特にこれに限定されるものではない。
【００２９】
本発明でいう“精製”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質から、解析の対象となる特定のタンパク質を含む群を回収することを指す。例えば血液成分を解析するための試料を調製する場合、リン酸化タンパク質、糖タンパク質、核酸結合タンパク質などのタンパク質を回収することがあげられるが、特にこれらに限定されない。
【００３０】
本発明でいう“精製モジュール”とは、分画モジュールで分画されたタンパク質から、特定のタンパク質を選択的に吸着させることにより、吸着させた特定のタンパク質を溶出用緩衝液で溶出させて回収する用途で用いる器具のことをいう。
【００３１】
本発明における精製モジュールの充填物は、タンパク質試料に混入して測定に悪影響を及ぼす溶出物がなければ特に限定されない。その好ましい形態として、例えばビーズ、ゲル、布地、編み地、中空糸膜、平膜などが挙げられる。処理効率を考慮した場合、ビーズ、ゲルを用いるのが好ましく、操作中に起こる圧力上昇をできるだけ防ぐことができる多孔質のビーズ、ゲルを用いるのがいっそう好ましい。
【００３２】
本発明における精製モジュールの充填物の材質は、上記ビーズ、ゲル、布地、編み地、中空糸膜、平膜などを形成できるものであれば特に限定されない。充填物の表面には、タンパク質を吸着させるための修飾を施すことが好ましく、この場合、修飾の効果を発揮させるために充填物の基材そのものには非特異的にタンパク質が吸着しないことが好ましい。よって、タンパク質の非特異的吸着を防止するために、充填物の基材表面を親水化あるいは疎水化処理することが好ましい。
【００３３】
本発明における精製モジュールの形状は、溶液を漏出することなく通過させることができれば特に限定されず、パックドカラム、オープンカラム、キャピラリーカラムなどが好ましく利用できる。
【００３４】
本発明でいう“回収”とは、精製モジュールから溶出されてくる特定のタンパク質を、溶液の状態で容器に得ることを指す。
さらに本発明では、好ましくは、溶出用緩衝液の組成を変化させて精製モジュールに導入し、個々のタンパク質が溶出されてくる時間を変え、また、時間に応じて回収容器を変えて回収することにより、特定のタンパク質を個別に“フラクションとして回収”する。溶出用緩衝液の組成を変化させて精製モジュールに導入するには、市販のグラジエント形成装置や、グラジエント形成が可能なポンプを用いて、組成の異なる二つの溶出用緩衝液を混合し、その混合割合を変化させながら導入する方法が好適に用いられるが、特にこれに限定されない。
【００３５】
本発明で特定のタンパク質の回収に用いる装置は、回収容器を時間ごとに変えられるものであれば特に限定されないが、好ましくは市販のフラクションコレクターが用いられる。
【００３６】
本発明で特定のタンパク質を回収する容器の素材は、溶液を回収できるものであれば特に限定されず、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などの合成高分子およびそれらの誘導体、それらを含む共重合体あるいは複合体が好適に用いられる。タンパク質の吸着を抑制するために、容器の内表面に親水化あるいは疎水化処理を施すことも好ましい。
【００３７】
本発明のタンパク質分画デバイスは、好ましくは分画モジュールにより処理されたタンパク質を含む溶液を精製モジュールに循環させて処理する。分画されたタンパク質を含む溶液を精製モジュールに循環させることで、タンパク質を確実に精製モジュールに吸着させることが可能となる。
【００３８】
本発明において、分画モジュールと精製モジュールとを溶液流路によって連結させることは好ましい。
【００３９】
ここでいう”溶液流路”とは、分画モジュールにより処理された分画液の出口と精製モジュールの入り口との間に設置した管のことを指し、溶液流路で分画モジュールと精製モジュールを連結することで、分画液を直接精製モジュールで処理できるようにすることを指す。こうすることによって、回路内の表面積を減らすことができ、タンパク質の回路への吸着による損失を減少させることができる。また、分画されたタンパク質を含む溶液を直接処理することが可能となることから、操作が格段に簡便になる。
【００４０】
本発明のタンパク質分画デバイスでは、精製モジュールが、特定のタンパク質を選択的に吸着させる性質を持つ物質が固定化された樹脂を含むことが好ましい。特定のタンパク質を選択的に吸着させる性質を持つ物質が固定化された樹脂を用いることで、選択的な相互作用により分画されたタンパク質を効率よく吸着させることが可能となる。
【００４１】
本発明においては、精製モジュールが、金属キレート樹脂、タンパク質固定化樹脂、レクチン固定化樹脂、群特異性アフィニティー樹脂、および疎水性化合物固定化樹脂、イオン交換樹脂、逆相樹脂、からなる群より１種類以上選択される樹脂を含むことが好ましい。
【００４２】
本発明でいう“金属イオンキレート樹脂”とは、分画されたタンパク質から、リン酸化タンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、金属原子が配位されたキレートを固定化した樹脂のことを指す。キレート基には、ニトリロ酢酸基、イミノ二酢酸基などがそれぞれ好適に用いられる。また、配位させる金属原子は、金属イオンであれば特に限定されず、例えば、鉄、亜鉛、ガリウム、ジルコニウムなどがそれぞれ好適に用いられる。また、複数種の金属原子が混合して配位されているようなキレート樹脂を調製することにより、分画されたリン酸化タンパク質をより効率よく吸着させ、回収しようとすることは好ましい。
【００４３】
本発明でいう“タンパク質固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、他のタンパク質と相互作用するようなタンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、特定のタンパク質を固定化した樹脂のことである。固定されるタンパク質は、特に限定されない。例えば、β２ミクログロブリンを固定化した樹脂を精製モジュールに用いることで、血清や細胞抽出液などから分画モジュールを用いて分画された低分子量タンパク質から、β２ミクログロブリンと相互作用するタンパク質を網羅的に回収することができる。また、酵素活性を持つタンパク質を固定化することにより、分画モジュールによって分画されたタンパク質を吸着させ、同時に酵素反応を進めていくことができ好ましい。酵素活性を持つタンパク質としては、プロテアーゼ、核酸分解酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、糖鎖付加酵素、糖鎖切断酵素、制限酵素等があげられるが、酵素活性を持つものであればこれらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明でいう“抗体固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、特定の抗体と相互作用する抗原タンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、特定の抗体を固定化した樹脂のことである。固定される抗体は、特に限定されない。例えば、抗アルブミン抗体を固定化した樹脂を精製モジュールに用いることで、血清や細胞抽出液などから分画モジュールを用いて分画された低分子量タンパク質から、残存するアルブミンを網羅的に回収することができる。また、モジュールに充填する液体を適切に選択することにより抗原タンパク質と相互作用するタンパク質も同様に回収することが可能となる。例えば、抗アルブミン抗体を固定化した樹脂であれば、アルブミンと相互作用するタンパク質がアルブミンとともに回収される。さらに、タンパク質の種類によっては、溶出開始用緩衝液および溶出用緩衝液の組成を適切に選択することにより、抗原タンパク質と、抗原タンパク質に相互作用するタンパク質とを別々にフラクションとして回収することができる。
【００４５】
本発明でいう“レクチン固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、糖タンパク質を選択的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、レクチンと呼ばれる糖に親和性を持つタンパク質を固定化したものである。レクチンタンパク質としては、タチナタマメレクチン（コンカナバリン）、スノードロップレクチン、イヌレンジュレクチン、レンチルレクチン、ピーナッツレクチン、エルダベリーレクチン、コムギ胚芽レクチン、等があげられるが、特にこれらに限定されるものではない。これらのタンパク質を使い分けることによって、また、複数種のレクチンタンパク質が固定化された樹脂を組み合わせて用いることにより、より確実に糖タンパク質を回収しようとすることは好ましい。
【００４６】
本発明でいう“群特異性アフィニティー樹脂”とは、三次元的な網目構造を有する高分子に、一部のタンパク質群が特異的に結合する低分子化合物を固定化した樹脂のことである。その化合物としては例えば、ベンザミジン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、オリゴヌクレオチド、グルタチオン、ヘパリン、ストレプトアビジン、核酸、ブルー色素等があげられるが、特にこれらに限定されない。
【００４７】
本発明でいう“疎水性化合物固定化樹脂”とは、分画されたタンパク質から、疎水性タンパク質を回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に、疎水性の化合物を固定化した樹脂のことである。疎水性の化合物としては、ブチル基、メチル基、ベンジル基、フェニル基、オクチル基、イソプロピル基、エーテル基、等があげられるが、特にこれらに限定されるものではない。また、好ましくは、これらの樹脂を使い分けることによって、様々なタンパク質を回収することができる。
【００４８】
本発明でいう“イオン交換樹脂”とは、三次元的な網目構造を有する高分子にイオン交換を行うためのイオン交換基を付与した樹脂のことである。イオン交換基には、大きく分類して陽イオン交換基、陰イオン交換基の２種類あり、陽イオン交換基としては、例えばカルボキシメチル基、スルホプロピル基などが、陰イオン交換基としては、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、ジエチルアミノプロピル基、四級アンモニウム基、トリメチルアミノエチル基、トリメチルアミノプロピル基などがそれぞれ好適に用いられる。緩衝液の組成、ｐＨに応じてイオン交換樹脂を使い分けることで、分画されたタンパク質を効率よく吸着させることができ、その結果分画したタンパク質を高い収率で回収することが可能となる。
【００４９】
本発明でいう“逆相樹脂”とは、分画されたタンパク質を網羅的に回収するために、三次元的な網目構造を有する高分子に疎水性の官能基を固定化したものである。固定化する官能基としては、フェニル基、シアノプロピル基、直鎖アルキル基が好ましく用いられる。直鎖アルキル基はＣ２−Ｃ２０までのものが用いられるが、一般に市販されているもので、特に好ましくは、Ｃ３（トリメチル基）、Ｃ４（ブチル基）、Ｃ８（オクチル基）、Ｃ１８（オクタデシル基）が用いられ、これらの官能基を使い分けることによって、分画したタンパク質を高い収率で回収することができる。
【００５０】
本発明における精製モジュールは、単段で用いても効果があるが、異なる樹脂を含む精製モジュールを複数具備することが好ましい。複数の精製モジュールを具備することにより、分画モジュールで分画されたタンパク質を、確実に吸着させることが可能となるばかりか、吸着対象の異なる吸着剤が装填された精製モジュールを連結して用いることで、タンパク質の性質の違いにより分別して精製することが可能となる。
多種類の精製モジュールを並列に連結するときは、市販のマルチポジションバルブ（例えば、Ｖａｌｃｏ社製マルチポジションバルブ）を用いて連結すると、３種類以上の精製モジュールを容易に連結することができ好ましい。さらに、精製モジュールに連結しないバイパスの流路を設けておくと、分画モジュールのみで分画処理をおこなった後で、精製モジュールに流路を切り替えて、分画モジュールと精製モジュールとを連結して精製モジュールへのタンパク質の吸着を開始できる。また、精製モジュールを通過したタンパク質溶液を循環させて精製モジュールに通過させることにより、確実により多くのタンパク質を回収することができるため好ましい。
【００５１】
本発明による分画デバイスでは、好ましくは、精製モジュール同士を溶液流路に対して連結させて処理する。
【００５２】
本発明における精製モジュールは、全ての精製モジュールが溶液流路に対して連結されていることが好ましい。
【００５３】
精製モジュール同士を溶液流路に対して連結させることにより、分画されたタンパク質を含む溶液を、精製モジュールに効率よく吸着させることが可能となる。また、回路内の表面積を減らすことができ、タンパク質の回路への吸着による損失を減少させることができる。また、分画されたタンパク質を含む溶液を直接処理することが可能となることから、操作が格段に簡便になる。
【００５４】
本発明におけるタンパク質分画デバイスを用いてタンパク質を分画する場合、好ましくは、以下の手法で行う。
【００５５】
はじめに回路に投入したタンパク質を含む溶液を分画モジュールにより分画し、分画された溶液を精製モジュールに通過させることで、タンパク質の性状に応じて特定のタンパク質を吸着させる。このとき、特定のタンパク質を確実に吸着させるために、複数の精製モジュールを設置することが望ましい。
【００５６】
本発明におけるモジュールおよび回路内に充填される液体は、タンパク質を溶解可能なものであれば任意でよい。ただし、特定のタンパク質が精製モジュールへ吸着することを妨げる物質が含まれないことが好ましい。例えば、精製モジュールの充填物に金属キレート樹脂を用いて、リン酸化タンパク質を選択的に吸着してその後に回収する目的であれば、充填する液体のリン酸濃度は０〜５ｍＭが好ましく、０ｍＭであることがより好ましい。リン酸濃度が５ｍＭを越える場合は、リン酸分子がリン酸化タンパク質の樹脂への吸着を阻害してしまうので好ましくない。また例えば、精製モジュールの充填物にイオン交換樹脂を用いて、タンパク質を網羅的に吸着回収する目的であれば、塩濃度は５ｍＭ〜１Ｍが好ましく、１０〜３０ｍＭがより好ましい。５ｍＭ未満だと緩衝液の緩衝能が損なわれてしまい、ｐＨ変化がおきやすくなってしまうばかりか、タンパク質が析出してしまう可能性があるため、また、１Ｍを超える濃度ではタンパク質が塩析効果により析出したり、流路が詰まりやすくなったりしてしまうためそれぞれ好ましくない。
【００５７】
上記の点を満たすものであれば、モジュールおよび回路内に充填された液体は任意でよく、例えば緩衝液、水、水溶性有機溶媒およびそれらの混合物が挙げられる。ここで緩衝液として好適に用いられるのは、例えばリン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、炭酸水素塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、ギ酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが挙げられる。また、本発明において好適に用いられる水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、ピリジン等の含窒素化合物、１，４−ジオキサン、プロピレンオキシド等の環状エーテル化合物、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン化合物、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド類、スルホラン、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄化合物、メタノール、エタノール、２−プロパノール等の一価アルコール類、２−メトキシエタノール（メチルセロソルブ）、２−エトキシエタノール（エチルセロゾルブ）などのセロソルブ類、２−アミノエタノール（モノエタノールアミン）、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のエタノールアミン類、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類が挙げられる。さらに、タンパク質の膜透過性を向上させたり、低分子量タンパク質の透過性を高めたりすることを目的として、添加物が含まれていてもよい。本発明において好適に用いられる添加物の例としては、タンパク質変性剤、カオトロピックイオン等が挙げられ、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリウムが好適に用いられる。
【００５８】
モジュールに充填する液体のｐＨは、タンパク質が変性せず、安定に存在することができる４〜１０のｐＨが好ましく、さらに５〜９の中性付近のｐＨがより好ましい。４より小さい、あるいは１０を超えるｐＨでは、タンパク質が変性し析出してしまう可能性があるので好ましくない。さらに、特定のタンパク質が精製モジュールへ吸着することを妨げないｐＨがより望ましい。例えば、精製モジュールで金属イオンを用いて、リン酸化タンパク質を特異的に吸着精製する目的であれば、その分画用緩衝液のｐＨは５〜８が好ましい。８を超えるｐＨでは精製モジュールへのリン酸化タンパク質の吸着効果が弱まってしまうため好ましくない。
【００５９】
本発明でいう“溶出用緩衝液”は、精製モジュールの充填物に吸着したタンパク質の相互作用を解離させることができる溶液であれば特に限定されない。また、“溶出開始用緩衝液”は、精製モジュールの充填物に吸着したタンパク質の相互作用を妨げない溶液であれば特に限定されない。溶出用緩衝液には、塩、有機溶媒、低分子化合物等の添加物が緩衝液に添加される。また、溶出開始用緩衝液には、それらの添加物が含まれないか、またはタンパク質と精製モジュールの充填物に吸着したタンパク質の相互作用を妨げない程度に含まれる。また、モジュールおよび回路内に充填された液体をそのまま溶出開始用緩衝液として用いることも好ましい。
【００６０】
例えば、リン酸化タンパク質を回収する目的で、精製モジュールの充填物として金属キレート樹脂を用いる場合、緩衝液にはリン酸塩が添加される。リン酸塩を添加する場合、溶出用緩衝液のリン酸濃度は１０ｍＭ〜５Ｍが好ましく、５０ｍＭ〜１Ｍがより好ましい。また溶出開始用緩衝液のリン酸濃度は０ｍＭ〜１ｍＭが好ましく、０ｍＭがより好ましい。また例えば、糖タンパク質を回収する目的で、精製モジュールの充填物としてレクチン固定化樹脂を用いる場合、溶出用緩衝液には糖が添加される。この場合、溶出用緩衝液の糖濃度は１０ｍＭ〜１Ｍが好ましく、１００ｍＭ〜２００ｍＭがより好ましい。また、溶出開始用緩衝液の糖濃度は０ｍＭ〜５ｍＭが好ましい。また例えば、イオン交換樹脂を用いる場合、緩衝液には塩が添加される。この場合、溶出用緩衝液の塩濃度は１０ｍＭ〜１０Ｍが好ましく、５０ｍＭ〜５Ｍがより好ましい。また、溶出開始用緩衝液の塩濃度は０ｍＭ〜５ｍＭが好ましい。
【００６１】
また、吸着したタンパク質を溶出させるために、緩衝液のｐＨを変えることにより、溶出用緩衝液と溶出開始用緩衝液を調製し、精製モジュールの充填物とタンパク質との相互作用を徐々に弱めることもできる。この場合は、溶出用緩衝液に添加される塩、有機溶媒、低分子化合物等の物質の濃度はｐＨを変化させない場合と比べて低くすることができる。例えば、イオン交換樹脂を用いる場合は、溶出用緩衝液の塩濃度を５０〜１００ｍＭの低い濃度に調製してタンパク質を溶出することが可能となる。
【００６２】
上記の通り、本発明における“タンパク質分画デバイス”を用いてタンパク質が含まれる溶液を処理することで、特定のタンパク質を選択的に回収することができる。このとき、対象となる特定のタンパク質の回収率は、２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。また、血清中のタンパク質を分画する場合、分画、濃縮処理後のタンパク質含量が、血清アルブミンや免疫グロブリンなど高分子量かつ高含量のタンパク質については処理前の１％未満となることが好ましい。もし、分画後のタンパク質溶液中に高分子量、高含量タンパク質が処理前の１％以上残存した場合、質量分析や二次元電気泳動等により解析する際、特定のタンパク質の検出を妨げることがあるため好ましくない。逆に、高分子量、高含量タンパク質が処理前の１％未満とした試料では、質量分析、二次元電気泳動で特定のタンパク質を数多く検出することが可能となる。
【００６３】
さらに、本発明のタンパク質の分画方法では、タンパク質を含む溶液は、好ましくは、タンパク質を含む体液である。これにより、特に血液、尿などの体液中に含まれるタンパク質を効率よく分画し、その分画した溶液中に含まれる特定のタンパク質を除去あるいは回収できる。
本発明でいう“タンパク質を含む溶液”とは、タンパク質が溶存した液体全般を指し、そこに含まれるタンパク質の種類、含有量、濃度は特に限定されない。また、溶媒の種類についても、タンパク質を溶解可能であれば特に限定されない。また、本発明でいう“タンパク質を含む体液”とは、一般的な生体を構成する液体のことを指し、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、骨髄液、腹水、胸水、汗、涙、母乳などが挙げられる。
本発明のタンパク質分画デバイスは、好ましくは“疾患マーカータンパク質”を回収する。疾患マーカータンパク質とは、その発現量や修飾の状態が、疾患によって大きく変動するようなタンパク質を指す。
【００６４】
また、本発明のタンパク質分画方法は、中空糸膜が充填された分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を精製するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させる機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイスを用いて、タンパク質を含む溶液から特定のタンパク質を除去あるいは回収する。これにより溶液中に含まれているタンパク質を効率よく分画し、分画されたタンパク質から特定のタンパク質を高い効率で除去あるいは回収することができる。
【００６５】
さらに、本発明のタンパク質の分画方法では、好ましくは、タンパク質を含む溶液を分子量の大きさの違いで分画・回収する。これにより、体液中に含まれるタンパク質を分子量の大きさの違いを利用して効率よく分画し、その分画した溶液中に含まれる、特定のタンパク質を除去あるいは回収できる。
【００６６】
本発明のタンパク質分画デバイスにより、上述の通りタンパク質を含有する溶液から目的のタンパク質を効率よく回収することができる。したがって、本発明のタンパク質分画デバイスを用いて、例えば血清、血漿中に含まれるタンパク質から、目的のタンパク質を効率よく回収し、それらのタンパク質を質量分析、二次元電気泳動等で解析することにより、患者の血清、血漿に含まれる疾患マーカータンパク質の発現量を健常者のそれと定量的に比較したり、疾患マーカータンパク質が翻訳後修飾をうけている度合を比較したりすることができるようになり、疾患によるタンパク質発現量の増減や、翻訳後修飾状態の変化を知ることができる。したがって、本発明のタンパク質分画デバイスは、疾患関連タンパク質の同定や新規創薬ターゲットの創出において特に有用である。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６８】
実施例１
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、１００μＬのリン酸化タンパク質回収ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ社製ＰｈｏｓｐｈｏＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ付属のビーズ）を充填してカラムを作製し、精製モジュールＡとした。また、精製モジュールＡの概略図を図１に示す。
【００６９】
血液透析器（東レ製ＴＳ１．６ＭＬ）の両端の樹脂接着部分を切り、ポリスルホン製中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の寸法は、内直径２００μｍ、膜厚４０μｍであり、液が透過する部分の断面を観察したところ非対称構造を有していた。この中空糸膜を１００本束ね、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をプラスチック管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。ミニモジュールの直径は約８ｍｍ、長さは約１３ｃｍであり、一般的な中空糸膜型透析器同様に、中空糸内に液体を循環させるためのポート（循環ポート）と透析液ポートをそれぞれ２個有している。作製したミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて十分に洗浄したものを、分画モジュールとした。
【００７０】
上記の分画モジュールおよび外径４ｍｍ、内径２ｍｍのシリコンチューブ（アズワン製）を用いて、分画循環回路を作製した。分画循環回路の途中に定量送液ポンプ（東京理化器械製）を設置し、回路内の液体を循環させることを可能とした。また、血液透析用回路（東レ製）のポートを切り出して分画循環回路内に設置し、サンプルの注入口を設けた。分画モジュールの濾液出口と精製モジュールＡの入口をシリコンチューブで接続した。分画モジュールと精製モジュールＡの間には、定量送液ポンプ（以下、送液ポンプＢ）を設置した。さらに三方バルブを設置し、グラジエント形成ポンプに接続した。グラジエント形成ポンプの先には、洗浄液および溶出用緩衝液を入れることのできる容器を接続した。精製モジュールＡを接続し、三方バルブとシリコンチューブを用いて、精製モジュールＡの出口を二つの流路に分け、片方の先端部をリザーバーに向け、もう片方の先端部をフクラクションコレクター（ＧＥヘルスケア製、Ｆ−９５０型）に向けた。さらに、リザーバーと精製モジュールＡの入口を定量送液ポンプ、三方バルブを設置したシリコンチューブで接続し、濃縮循環回路を形成した。分画循環回路内に５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、緩衝液Ａ）を充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＡと表記）。分画デバイスＡの概略図を図２に示す。
【００７１】
実施例２
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、１００μＬのＣｏｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア製）を充填して実施例１と同様のカラムを作製し、精製モジュールＢとした。そして、実施例１と同様に回路を作成し、分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＢと表記）。
【００７２】
実施例３
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、１００μＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア製）を充填して実施例１と同様のカラムを作製し、精製モジュールＣとした。
【００７３】
精製モジュールＡおよび精製モジュールＣをシリコンチューブと三方バルブを用いて並列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成し、分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＣと表記）。分画デバイスＣの概略図を図３に示す。
【００７４】
実施例４
ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製の平板（荷重たわみ温度９２℃）を７９×２３×２ｍｍの大きさに加工し、幅１ｍｍ×高さ１ｍｍ×長さ４０ｍｍの流路を形成した。流路内に、２０μｌのＰＯＲＯＳ ２０ ＨＱビーズ（アプライドバイオシステムズ製）を充填し、さらに上板を貼りあわせ、精製モジュールＤとした。精製モジュールＤの概略図を図４に示す。
【００７５】
精製モジュールＡおよび精製モジュールＤをシリコンチューブと三方バルブを用いて並列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成し、分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＤと表記）。分画デバイスＤの概略図を図５に示す。
【００７６】
実施例５
精製モジュールＡおよび精製モジュールＣをシリコンチューブと三方バルブを用いて並列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成した。ただし、以下のように回路を変更した。まず、分画モジュールの濾液出口にシリコンチューブを接続し、濾液をリザーバーに回収できるようにした。容器中の溶液を精製モジュールに循環させるため、以下の精製循環回路を組んだ。両精製モジュールの入口側に接続したシリコンチューブの端部は、リザーバー中の溶液に浸漬できるようにし、定量送液ポンプを設置することで送液できるようにした。また、両精製モジュールの出口側に接続したシリコンチューブも、中を通過した溶液がリザーバーへと入るように設置した。なお、このシリコンチューブ回路の途中に三方バルブを設置し、それを切り替えることでフラクションコレクターに溶液を回収できるようにした。分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＥと表記）。分画デバイスＥの概略図を図６に示す。
【００７７】
実施例６
内径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの空カラムに、逆相樹脂であるＯＡＳＩＳ（登録商標） ＨＬＢ（ウォーターズ）を１００μＬ充填して実施例１と同様のカラムを作製し、精製モジュールＥとした。
【００７８】
精製モジュールＣおよび精製モジュールＥをシリコンチューブと三方バルブを用いて直列に接続し、実験例１および２と同様に回路を作成した。分画モジュールと精製モジュールＡの間に三方バルブを設置し、グラジエント形成ポンプ（以下、グラジエント形成ポンプＡ）に接続した。グラジエント形成ポンプの先には、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液（以下、それぞれ溶出開始用緩衝液Ａと溶出用緩衝液Ａ）を入れることのできる容器を接続した。さらに、精製モジュールＣの出口と精製モジュールＥの入り口の間に、三方バルブを設置し、グラジエント形成ポンプ（以下、グラジエント形成ポンプＢ）に接続した。
【００７９】
グラジエント形成ポンプの先には、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液（以下それぞれ溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂ）を入れることのできる容器を接続した。分画循環回路内に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＦと表記）。分画デバイスＦの概略図を図７に示す。
【００８０】
実施例７
実施例１に記載の中空糸膜を１００本充填した分画モジュールＡを２本（以下、分画モジュールＡ１、分画モジュールＡ２と表記）、および同様の方法で中空糸膜を４０本充填した分画モジュールＢを１本作製した。各モジュールについて、外径４ｍｍ、内径２ｍｍのシリコンチューブを用いて、中空糸膜内側を液が通過する循環回路をそれぞれ作製した。さらに、分画モジュールＡ１の中空糸膜外側の出口と分画モジュールＡ２の中空糸膜内側の入口、および分画モジュールＡ２の中空糸膜外側の出口と分画モジュールＢ中空糸膜内側の入口をそれぞれシリコンチューブで接続した。さらに、血液透析用回路（東レ製）のポートを切り出して分画部の入口に設置し、サンプルおよび緩衝液の注入口を設けた。このようにして、分画部Ａを作製した。精製モジュールＡと精製モジュールＣをシリコンチューブで並列に接続し、さらに分画部の濾液出口と両精製モジュールの入口をシリコンチューブで接続した。分画部と両精製モジュールの間に、定量送液ポンプを設置した。また、両モジュールの出口にシリコンチューブを接続し、その先端部をリザーバーＡに向けた。また、シリコンチューブでリザーバーＡ内の液体を精製モジュールに循環させるための回路を設け、濃縮循環回路を形成した。このとき、回路の途中に定量送液ポンプを設置し、一端をリザーバーＡ内に、もう一端を回路に設置した三方バルブに接続した。分画部の回路に緩衝液Ａを充填し、タンパク質分画デバイスを作製した（以下、分画デバイスＧと表記）。分画デバイスＧの概略図を図８に示す。
【００８１】
実施例８
ヒト市販血清（シグマ製、Ｃａｔ．Ｈ１３８８）１ｍＬを遠心して不溶物を沈殿させ、ポアサイズが０．２２μｍのＭＩＬＬＥＸ−ＧＬフィルター（ミリポア製）を用いて上清を濾過し、緩衝液Ａで４倍希釈した（以下、希釈血清Ａと表記）。４．５ｍＬの希釈血清を５ｍＬのシリンジ（テルモ製）にとり、その先端部にシリコンチューブを取り付けて、マイクロシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にセットした。また、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬのシリンジ（ニプロ製）にとり、希釈血清を針の先まで充填し、気泡が混入していないことを確認した後、針先をタンパク質分画デバイスＡの回路に設けた注入口に刺して接続した。送液ポンプＡを作動させて循環回路内に充填した緩衝液Ａを５ｍＬ／ｍｉｎで循環させ、次いでシリンジポンプを作動させて希釈血清を０．２ｍＬ／ｍｉｎで押し出すと同時に、送液ポンプＢを作動させて分画モジュールの濾液を０．２ｍＬ／ｍｉｎで、精製循環回路内へと送り、１時間循環させた。すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また、処理前の溶液および回収された溶液に含まれるタンパク質を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって酵素消化し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置（マイクロマス製）を用いて、溶出タンパク質溶液内のリン酸化タンパク質の検出を試みた。その結果、処理前の溶液からはリン酸化タンパク質を検出できなかったのに対し、リン酸化タンパク質を４種類検出することができた。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８２】
実施例９
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＢの回路と接続した。実施例６と同様に、血清Ａを回路に導入し、１時間循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって精製モジュールＢに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液には緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には２００ｍＭのアルファ−マンノースを含む５０ｍＭトリス−緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でそれぞれのフラクション中の糖蛋白質の質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、糖蛋白質の回収率が３０％であった。また、処理前の溶液および回収された溶液に含まれるタンパク質を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって酵素消化し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置（マイクロマス製）を用いて、溶出タンパク質溶液内の糖タンパク質の検出を試みた。その結果、処理前の溶液からは糖タンパク質を検出できなかったのに対し、糖タンパク質を６種類検出することができた。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８３】
実施例１０
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＣの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＣに接続して循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＢに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＣから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０４％であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は３０％、４０％、４３％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８４】
実施例１１
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＤの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＤに接続して流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎにして循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＤに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＤから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０２％であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は２０％、２３％、２０％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８５】
実施例１２
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＥの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＣに接続して循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＣから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０４％であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は３０％、４０％、４３％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８６】
実施例１３
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＦの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、１時間にわたり循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液Ｂは１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を２ｍｌ、溶出用緩衝液Ｂには７０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含む１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を２ｍＬ用いた。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液Ａと溶出用緩衝液Ａとを１：９の混合比で送液することよって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を部分的に溶出させ、精製モジュールＥに吸着させた。このときの溶出開始用緩衝液Ａは１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用い、溶出用緩衝液Ａには５００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。三方バルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させ、フラクションコレクターを用いて回収した。 次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液Ａと溶出用緩衝液Ａとを１：４の混合比で送液することよって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を部分的に溶出させ、精製モジュールＥに吸着させた。先述と同様に三方バルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させ、フラクションコレクターを用いて回収した。さらに三方バルブを切り替え、溶出用緩衝液Ａのみを送液することよって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質をすべて完全に溶出させ、精製モジュールＥに吸着させた。さらにバルブを切り替え、精製モジュールＥを溶出開始用緩衝液Ｂで洗ったのち、溶出開始用緩衝液Ｂと溶出用緩衝液Ｂとの直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＥに吸着したタンパク質を溶出させ、フラクションコレクターを用いて回収した。
【００８７】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で回収したそれぞれのフラクション中のＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が検出限界以下であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は１８％、２０％、１７％であった。
【００８８】
実施例１４
実施例８と同様にして、希釈血清Ａを入れたシリンジをシリンジポンプにセットし、タンパク質分画デバイスＧの回路と接続した。実施例５と同様に血清Ａを回路に導入し、最初の１時間は流路を精製モジュールＡに接続して循環させ、次の１時間は流路を精製モジュールＣに接続して循環させた。その後、すべてのポンプを止め、三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によってまず、精製モジュールＡに吸着したタンパク質を溶出させた。溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。次に、さらに三方バルブを切り替え、溶出開始用緩衝液と溶出用緩衝液との直線グラジエント勾配によって、精製モジュールＣに吸着したタンパク質を溶出させた。このときの溶出開始用緩衝液は緩衝液Ａを２ｍｌ、溶出用緩衝液には１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）を２ｍＬ流した。溶出されたタンパク質溶液は１００μｌごとにフラクションコレクターを用いて回収した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で精製モジュールＡから回収したそれぞれのフラクション中のリン酸化タンパク質量を測定し、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、リン酸化タンパク質の回収率が３０％であった。また同様に精製モジュールＣから溶出されてきたフラクションの、ＨＳＡおよび回収対象タンパク質に含まれるβ２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の各濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡ検出限界以下であるのに対し、β２ＭＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−８の回収率は２４％、３２％、３１％であった。したがって、回収対象タンパク質を選択的かつ高回収率で得ることができた。
【００８９】
比較例１
精製モジュールＡの入り口と出口をシリコンチューブで接続した、精製循環回路Ｂを作成した。入口側と出口側の両方のシリコンチューブの端部は、リザーバー中の溶液に浸漬できるようにし、定量送液ポンプを設置することで送液できるようにした。さらに三方バルブを設置し、溶出開始用緩衝液および溶出用緩衝液を送液するためのシリンジを取り付けられるようにした。また、精製モジュールＡの出口側に三方バルブを用いて、シリコンチューブを接続し、端部を回収部に向けた。希釈血清Ａをリザーバーに入れ、ポンプを作動させて２時間精製循環回路Ｂに循環させた。その後、ポンプを止め、精製モジュールＡに５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を０．５ｍＬ流し、精製モジュールＡに吸着したリン酸化タンパク質を溶出させた。実施例７と同様にして酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でこの溶液中の除去対象タンパク質に含まれるＨＳＡの濃度を測定して含有量を求め、処理前の含有量と比較することで回収率を算定した。その結果、ＨＳＡの回収率が０．０５％であった。また、回収されたタンパク質溶液を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって酵素消化し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置（マイクロマス製）を用いて、標準的な方法で溶出タンパク質溶液内のリン酸化タンパク質の検出を試みた。しかしながら、リン酸化タンパク質は検出されず、ほとんどがアルブミンのシグナルであった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明における精製モジュールの一態様を示した断面図を表す。
【図２】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図３】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図４】本発明における精製モジュールの一態様を示した断面図を表す。
【図５】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図６】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図７】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【図８】本発明におけるタンパク質分画デバイスの一態様を示した概念図を表す。
【符号の説明】
【００９１】
１０１ 充填ビーズ
１０２ フィルター
２０１ａ 試料入りシリンジ
２０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
２０２ａ、２０２ｂ、２０２ｃ、２０２ｄ 三方バルブ
２０３ サンプル注入口
２０４ 分画循環流路
２０５ａ、２０５ｂ、２０５ｃ 送液ポンプ
２０６ 分画モジュール
２０７ 精製モジュール
２０８ リザーバー
２０９ フラクションコレクター
２１０ グラジエント送液ポンプ
２１１ａ、２１１ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
３０１ａ 試料入りシリンジ
３０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
３０２ａ、３０２ｂ、３０２ｃ、３０２ｄ、３０２ｅ、３０２ｆ 三方バルブ
３０３ サンプル注入口
３０４ 分画循環流路
３０５ａ、３０５ｂ、３０５ｃ 送液ポンプ
３０６ 分画モジュール
３０７ 精製モジュール
３０８ 精製モジュール
３０９ リザーバー
３１０ フラクションコレクター
３１１ グラジエント送液ポンプ
３１２ａ、３１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
４０１ ＰＥＥＫチューブ
４０２ ねじ式コネクタ
４０３ 上板
４０４ 下板
４０５ 充填ビーズ
４０６ フィルター
５０１ａ 試料入りシリンジ
５０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
５０２ａ、５０２ｂ、５０２ｃ、５０２ｄ、５０２ｆ 三方バルブ
５０３ サンプル注入口
５０４ 分画循環流路
５０５ａ、５０５ｂ、５０５ｃ 送液ポンプ
５０６ 分画モジュール
５０７ 精製モジュール
５０８ 精製モジュール
５０９ リザーバー
５１０ フラクションコレクター
５１１ グラジエント送液ポンプ
５１２ａ、５１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液４０１ａ 試料入りシリンジ
６０１ａ 試料入りシリンジ
６０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
６０２ａ、６０２ｂ、６０２ｃ、６０２ｄ、６０２ｅ 三方バルブ
６０３ サンプル注入口
６０４ 分画循環流路
６０５ａ、６０５ｂ 送液ポンプ
６０６ 分画モジュール
６０７ 精製モジュール
６０８ 精製モジュール
６０９ リザーバー
６１０ フラクションコレクター
６１１ グラジエント送液ポンプ
６１２ａ、６１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
７０１ａ 試料入りシリンジ
７０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
７０２ａ、７０２ｂ、７０２ｃ、７０２ｄ、７０２ｅ 三方バルブ
７０３ サンプル注入口
７０４ 分画循環流路
７０５ａ、７０５ｂ、７０５ｃ 送液ポンプ
７０６ 分画モジュール
７０７ 精製モジュール
７０８ 精製モジュール
７０９ リザーバー
７１０ フラクションコレクター
７１１ａ、７１１ｂ グラジエント送液ポンプ
７１２ａ、７１２ｂ、７１２ｃ、７１２ｄ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
８０１ａ 試料入りシリンジ
８０１ｂ ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）入りシリンジ
８０２ａ、８０２ｂ、８０２ｃ、８０２ｄ、８０２ｅ、８０２ｆ 三方バルブ
８０３ａ、８０３ｂ、８０３ｃ サンプル注入口
８０４ａ、８０４ｂ、８０４ｃ、８０４ｄ、８０４ｅ 送液ポンプ
８０５ａ、８０５ｂ、８０５ｃ 分画モジュール
８０６ 精製モジュール
８０７ 精製モジュール
８０８ リザーバー
８０９ フラクションコレクター
８１０ グラジエント送液ポンプ
８１１ａ、８１２ｂ 溶出用緩衝液、溶出開始用緩衝液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空糸膜が充填されている分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を回収するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させて、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイス。
【請求項２】
分画モジュールにより処理されたタンパク質を含む溶液を、精製モジュールに循環させて処理することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項３】
分画モジュールと、精製モジュールが溶液流路によって連結され、連続して稼働できることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項４】
精製モジュールが、金属キレート樹脂、タンパク質固定化樹脂、抗体固定化樹脂、レクチン固定化樹脂、群特異性アフィニティー樹脂、および疎水性化合物固定化樹脂、イオン交換樹脂、逆相樹脂、からなる群より１種類以上選択される樹脂を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項５】
相異なる樹脂を含む精製モジュールを複数具備してなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項６】
全ての精製モジュールが溶液流路に対して連結されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項７】
特定のタンパク質をフラクションとして回収することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項８】
特定のタンパク質を２０％以上回収することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項９】
タンパク質を含む溶液が、タンパク質を含む体液であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項１０】
特定のタンパク質が、疾患マーカータンパク質であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のタンパク質分画デバイスを用いて、タンパク質を含む溶液を分子量の大きさの違いで分画する方法。
【請求項１】
中空糸膜が充填されている分画モジュールにより処理された溶液中のタンパク質を回収するための精製モジュールを具備するタンパク質分画デバイスであって、該精製モジュールが溶液中の特定のタンパク質を選択的に吸着させて、回収する機能を有することを特徴とするタンパク質分画デバイス。
【請求項２】
分画モジュールにより処理されたタンパク質を含む溶液を、精製モジュールに循環させて処理することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項３】
分画モジュールと、精製モジュールが溶液流路によって連結され、連続して稼働できることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項４】
精製モジュールが、金属キレート樹脂、タンパク質固定化樹脂、抗体固定化樹脂、レクチン固定化樹脂、群特異性アフィニティー樹脂、および疎水性化合物固定化樹脂、イオン交換樹脂、逆相樹脂、からなる群より１種類以上選択される樹脂を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項５】
相異なる樹脂を含む精製モジュールを複数具備してなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項６】
全ての精製モジュールが溶液流路に対して連結されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項７】
特定のタンパク質をフラクションとして回収することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項８】
特定のタンパク質を２０％以上回収することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項９】
タンパク質を含む溶液が、タンパク質を含む体液であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項１０】
特定のタンパク質が、疾患マーカータンパク質であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質分画デバイス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のタンパク質分画デバイスを用いて、タンパク質を含む溶液を分子量の大きさの違いで分画する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−３４２１５４（Ｐ２００６−３４２１５４Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２４７２４（Ｐ２００６−１２４７２４）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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