タンパク質発現を増強し、精製する方法及び組成物
【解決手段】 宿主細胞における異種性融合タンパク質の発現レベル及び分泌を増強する方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００３年６月２６日に出願された米国特許仮出願第６０／４８２，８１７号に対して優先権を主張するものであり、その内容は本明細書に完全に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、組換え遺伝子の発現と発現タンパク質の精製の分野に関連するものである。さらに具体的には、本発明は様々な異なる宿主種からの異種タンパク質の精製を容易にする物質と方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
幾つかの刊行物および特許書類は、本発明に関連する技術状況を説明するために、本明細書を通じて引用されるものである。これらの文献に対する完全な引用は本明細書の全般にわたって見出されえる。これらの引用はそれぞれ完全に説明するように本明細書に組み込まれる。
【０００４】
機能的遺伝子研究は、異種性発現システムにおいて生物学的に活性なタンパク質を均一に発現及び精製することができないために妨げられてきた（１）。既知の発現ベクターにおいて同一の転写および翻訳シグナルを使用しているにもかかわらず、発現タンパク質レベルは劇的に変化することが観察されてきた（２）。このような理由により、細菌、酵母、哺乳類および昆虫の細胞において遺伝子融合として異種タンパク質を発現するための様々な方法が開発されてきた。
【０００５】
細菌における前記異種間遺伝子の発現は、明らかに最も単純でありかつ研究又は商業の目的において最も安価な方法である。ただし、一部の異種間遺伝子産物は大腸菌においてそれらの正確な三次元構造を実現できておらず、過剰に生産された場合、その他の異種間遺伝子産物は大きな不溶性凝集体または"封入体"に隔離される（７、８）。主な変性剤誘導性可溶化法では、その後再折り畳み（リフォールディング）が好ましい条件下で変性剤の除去が続き、組み換えタンパク質を適当な収率で産生するために必要とされる場合が多い。構造的遺伝子計画に対するＯＲＦｓの選択によって、大腸菌において発現した遺伝子のわずか約２０％が溶解性または正しく折り畳まれたタンパク質を与えることも示している（９）。特にほとんどの科学者は遺伝子産物を発現させるための最初の試みを大腸菌に依存しているため、これらは驚くほど期待はずれな数字である。例えばＮＵＳＡ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びチオレドキシン（ＴＲＸ）などの幾つかの遺伝子融合システムが開発されてきた（７）。これらのシステムは全て、非効率的な発現から、目的の構造からの不均一な切断に及ぶ特定の欠点を有している。
【０００６】
ユビキチン（Ｕｂ）およびユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌｓ）は文献で説明されている（１０〜１２）。ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）はセントリン（Ｓｅｎｔｒｉｎ）、ＳＭＴ３、ＰＩＣ１、ＧＭＰ１、およびＵＢＬ１としても知られている。ＳＵＭＯとこのＳＵＭＯ経路は真核生物界全体に存在し、前記タンパク質は酵母からヒトまで高度に保存されている（１４）。酵母は一本鎖ＳＵＭＯ遺伝子しかなく、それはＳＭＴ３とも呼ばれている。前記酵母のＳＭＴ３遺伝子は生存に必須のものである（１３）。酵母とは異なり、３つのＳＵＭＯのメンバーが脊椎動物で示されており、それらはＳＵＭＯ−１および近接相同体であるＳＵＭＯ−２およびＳＵＭＯ−３である。１０１アミノ酸ポリペプチドから成るヒトＳＵＭＯ−１は、ヒトＳＵＭＯ−２／ＳＵＭＯ−３と５０％の配列同一性を共有している（１５）。酵母ＳＵＭＯ（ＳＭＴ３）は哺乳類ＳＵＭＯ−１と４７％の配列同一性を共有している。ユビキチンとＳＵＭＯ間の全長配列相同性はわずか１８％であるが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）による構造決定によって、２つのタンパク質が、αへリックスの１つを包み込んだβシートを折り畳んだ密集した球形によって特徴付けられる共通の３次元構造を持っていることが明らかになった。ＳＵＭＯのシャペロン特性の試験によって、密集した球形構造とタンパク質のＮ末端との付着が、折り畳み構造の核として作用し、不安定なタンパク質を保護することができることを明らかにしている。全てのＳＵＭＯ遺伝子は、保存されたＣ末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙモチーフから伸びた短いＣ−末端配列を有する前駆タンパク質をエンコードする（１３）。２〜１２のアミノ酸長である前記伸長配列は、全ての場合において異なる。細胞は前記Ｃ末端の伸長を除去する強力なＳＵＭＯプロテアーゼ（加水分解酵素としても知られている）を含む（１８）。ＳＵＭＯの前記Ｃ末端は、標的タンパク質のリジン残基のε−アミノ基と接合している。ＳＵＭＯ化経路酵素とユビキチン経路酵素の類似性は顕著であり、これらの２つのタンパク質の修飾経路に異なる影響を与える（１９）。細胞性タンパク質のＳＵＭＯ化は、核輸送、シグナル変換、ストレス反応、および細胞周期の進行を調節していると考えられている。これは様々な細胞区画の中でタンパク質のＳＵＭＯシャペロン転座に非常に類似しているが、このようなＳＵＭＯの機能の正確なメカニズムの詳細は知られていない。
【０００７】
その他の融合がパートナータンパク質の溶解性を促進するのはおそらくそれらが大きいサイズであることに起因している（例えばＮｕｓＡ）（２１）。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（２２）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（２３）を有するタンパク質の融合は、融合タンパク質の発現と収率を促進すると提案されている。しかし、ＧＳＴがＧＳＴ二量体の形態で使用されタンパク質の溶解性を遅らせることができる場合であっても、発現の増強が常に観察されるわけではない。前記目的タンパク質が前記融合から除去されなければならないかもしれないというのが、ＧＳＴまたは他の融合システムのもう１つの問題である。このような問題を回避するために、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、またはＴｅｖプロテアーゼ部位などのプロテアーゼ部位は、前記融合パートナーの下流にしばしば設計される。しかし、このような場合の多くは、前記融合タンパク質内において不完全な切断と不適切な切断が頻繁に観察される（７）。本発明はこのような問題を回避するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明に従って目的タンパク質の発現レベルを増強する組成物と方法が提供される。典型的な方法は、ｉ）前記目的タンパク質がエンコードされた核酸配列に対して、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、およびＩＳＧ１５から成る群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を機能的に連結させることによって、融合タンパク質をコード化したコンストラクトを産生する工程と、ｉｉ）宿主細胞に前記融合タンパク質をコード化した核酸を導入する工程と、を有するものである。前記目的タンパク質を精製するために、前記方法はさらに、ｉｉｉ）前記融合タンパク質を発現する細胞の溶解する工程、ｉｖ）選択的に前記アミノ末端ドメインに付着した精製標識によって、固相に固定された前記と同様のＵｂ１のアミノ末端ドメインと細胞溶解物が接触し、それにより前記Ｕｂ１が再構成される工程、及びｖ）再構成されここで切断可能になったＵｂ１を適切なＵｂ１プロテアーゼと接触させ、前記融合タンパク質から前記目的タンパク質を放出する工程、を含む。本発明の別の態様によると、工程ｉｖ）から得られる再構成された前記Ｕｂ１はカラムから溶出され、更にその後前記Ｕｂ１は溶液中で適切なプロテアーゼと接触され、前記目的タンパク質を前記融合タンパク質から放出する。本発明の別の態様によると、前記再構成されたＵｂ１は溶液中で形成され、その後固体の支持体上で精製される。さらに本発明の別の態様によると、Ｕｂ１が再構成される間、Ｕｂ１プロテアーゼ阻害剤が含まれており、これは更にその後前記Ｕｂ１プロテアーゼを添加する前に除去されるものである。
【０００９】
本発明の別の態様によると、目的タンパク質を精製するための組成物及びその方法が提供される。典型的な方法は、ｉ）目的タンパク質をコード化した核酸配列、及び目的タンパク質のアミノ末端に結合したカルボキシ末端ドメインのアミノ末端に付加された精製標識の少なくとも１つにおいてコード化した核酸に対して、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を機能的に連結することにより、融合タンパク質をコード化したコンストラクトを産生する工程、ｉｉ）宿主細胞に融合タンパク質をコード化した核酸を導入する工程、ｉｉｉ）前記融解タンパク質を発現する細胞を溶解する工程、ｉｖ）少なくとも１つの精製標識において結合可能な固形支持体と前記融解タンパク質とが接触することにより選択的に前記融合タンパク質を精製する工程、ｖ）選択的にアミノ末端ドメインに付着した精製標識によって、固相に固定された前記と同じＵｂ１のアミノ末端ドメインと溶液を含む融解タンパク質が接触し、それによりＵｂ１が再構成される工程、及びｖｉ）再構成され、ここで切断可能になったＵｂ１が適切なＵｂ１プロテアーゼと接触し、前記融合タンパク質から前記目的タンパク質を放出される工程、を含む。本発明の別の態様によると、工程ｉｖ）から得られる再構成された前記Ｕｂ１はカラムから溶出され、その後溶液中で適切なプロテアーゼと接触して融合タンパク質から前記目的タンパク質が放出される。本発明の別の実施態様によると、前記再構成されたＵｂ１は溶液中で形成され、更にその後固体支持体上で精製される。さらに本発明の別の実施態様によると、Ｕｂ１が再構成される間、Ｕｂ１プロテアーゼ阻害剤が含まれており、これはその後Ｕｂ１プロテアーゼを添加する前に除去される。さらに本発明の別の実施態様によると、前記Ｕｂ１は精製スキームの間に除去されることを確実にするために、精製標識を含んでいても良い。
【００１０】
さらに本発明の別の実施形態において、前記目的タンパク質と共に融解タンパク質を産生するために使用される分子は、配列ＩＤ番号：１０の配列を含む核酸によってエンコードされたＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端部位である。前記融解タンパク質を精製および切断するために使用される分子は、配列ＩＤ番号：６の配列を含む核酸によってエンコードされたＳＵＭＯ（ＮＴＨＳ）のアミノ末端部位である。前記再構成されたＵｂ１を切断し、それにより目的タンパク質を放出するために使用される特定の加水分解酵素（すなわちプロテアーゼ）は、配列ＩＤ番号：３０の配列を含む核酸によってエンコードされたＳＵＭＯ加水分解酵素である。
【００１１】
さらに本発明の別の実施形態おいて、改変アミノ末端を有する目的タンパク質を産生する典型的な方法が提供される。そのような方法は、目的タンパク質のアミノ末端を改変する工程と、本明細書において実証される精製方法の実施する工程とを含む。本発明の別の態様に従って、改変アミノ末端を有する目的の前記タンパク質は、ｉ）改変アミノ末端を有する前記目的タンパク質をコード化した核酸配列に対して、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を機能的に連結することにより、融合タンパク質をコード化したコンストラクトを産生する工程と、ｉｉ）宿主細胞に前記融合タンパク質をコード化した核酸を導入する工程と、ｉｉｉ）望ましい時間に、前記宿主細胞に前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端ドメインをコード化した核酸を導入する工程と、ｉｖ）再構成Ｕｂｌの切断が不十分である場合、前記宿主細胞へのＵｂｌ特異的プロテアーゼをコード化した核酸を選択的に導入する工程とを含む方法によって、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されてもよい。
【００１２】
さらに本発明の別の実施形態において、ユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂ１）分子のアミノ末端ドメインの間の親和性を増強する方法が提供される。典型的な方法は、カルボキシ末端ドメインとアミノ末端ドメインに対して機能的に連結した部位であって、前記連結部位は逆平行βシート構造、逆平行αへリックス構造、または負および正に荷電したアミノ酸を含む。本発明の別の態様に従って、ユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂ１）分子のアミノ末端ドメインの間の親和性が増強された方法が提供され、前記カルボキシ末端ドメインとアミノ末端ドメインに突然変異を挿入する工程を含み、前記突然変異は前記２つのドメインの間の疎水性を増強するか、または前記突然変異は荷電したアミノ酸を導入するものである。
【００１３】
さらに本発明の別の実施形態において、本明細書で説明される方法を実行するためのキットが提供される。そのようなキットは、所望の宿主細胞における発現に望ましいプロモーターと、目的タンパク質をコード化した核酸のクローニングに適した多重クローニング部位とに機能的に連結している、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、およびＩＳＧ１５の群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクターを含む。前記組換えベクターは精製標識の少なくとも１つをコード化した核酸配列を含んでいてもよい。前記キットはさらに、前記融合タンパク質から再構成Ｕｂ１分子を切断できるプロテアーゼの調整を含み、選択的に、精製標識、選択的に少なくとも１つの精製標識を含むＵｂ１分子のアミノ末端部位の調整、選択的に少なくとも１つの精製標識を含むＵｂ１分子網の末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクター、少なくとも１つの精製標識に結合することができる少なくとも１つの固相、洗浄および切断緩衝剤を含む適切な緩衝剤、使用説明書、および宿主細胞の凍結ストックを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
宿主において効果的な組み換えタンパク質の発現が欠如していることに関して多くの原因があるが、例えば、半減期が短いこと、折り畳み構造が不適切であること、局在化およびコドンの偏りなどが含まれる。ヒトゲノム計画によって、ヒトゲノムのＤＮＡ"マップ"を作ることに成功したが、異なる発現基盤において均一に機能し、すべてのタンパク質モチーフに対するタンパク質発現技術の開発はまだ達成されていない。
【００１５】
本発明にしたがって、真核生物及び原核生物両方において、タンパク質の発現を改良する方法、特に無発現或いは発現力に乏しいタンパク質の発現を改良する方法が提供される。前記方法は、Ｕｂ１のカルボキシ末端部位が前記タンパク質のアミノ末端部位（すなわち目的タンパク質）に結合して発現する工程を含む。前記タンパク質のＵｂ１ファミリーは、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、Ｒｕｂ１、Ｈｕｂ１、ＩＳＧ１５、Ｕｂｉ−Ｌ（ＭＮＳＦ）、ＦＡＴ１０、Ａｐｇ１２、Ａｐｇ８、及びＵｒｍ１を含むがこれに限らない（１２）（表１参照）。ＡＰＧ１２とＵＲＭ１を除くこれらのタンパク質の特徴は、それらが前駆体として合成されることであり、通常はジ−グリシンモチーフであるカルボキシ末端に近い位置において加水分解酵素（またはプロテアーゼ）によって処理され、成熟配列を産生することである。特に、すべての前記Ｕｂｌｓは一般的な構造を共有する（２４、２５）。
【００１６】
発現と精製を得るために全長のＳＵＭＯと他のＵｂｌｓを含む融合タンパク質を使用する方法はすでに説明されている（米国出願第１０／３３８，４４１号明細書および第１０／３８９，６４０号明細書）。全長のＳＵＭＯと目的タンパク質を含む融合タンパク質は大腸菌においてのみ原型を保つものであった。しかし、プロリンが目的タンパク質のアミノ末端残基になっている場合を除いて、酵母または昆虫細胞において前記融合タンパク質は直ちに切断されてしまった。
【００１７】
本明細書において提供される方法は、真核生物および原核生物の両方において切断される構成要素として融合タンパク質の発現を可能にする方法を提供する。重要なことは、この方法は、発現した目的タンパク質への結合を維持するために、精製、検出、或いは他の目的に使用される、選択的に結合したアフィニティー標識（例えば精製標識）又は他のタンパク質又はペプチドのいずれにおいても可能であることである。前記Ｕｂ１融合タンパク質の目的タンパク質のカルボキシ末端部位（ドメイン）のタンパク質が前記Ｕｂ１のアミノ末端部位と接触し、その後特異的な加水分解酵素と接触することによって前記Ｕｂ１が再構成される場合、切断のみが得られる。
【００１８】
本発明は、真核生物細胞において新規なＮ−末端を有するタンパク質を産生するためにも利用できる可能性がある。タンパク質の前記Ｎ−末端の同定は、その半減期によって制御されていると提案されている（Ｎ末端則 Ｎ−ｅｎｄ Ｒｕｌｅ）（３５）。成長因子、ケモカイン、及び他の細胞タンパク質など多くの生物薬剤が、治療活性のために望ましいＮ末端を必要としている。メチオニンから翻訳を開始する性質として、望ましいＮ末端を産生することは可能になっていない。さらに、１またはそれ以上のアミノ酸がＮ末端から除去されてもよく、他のアミノ酸が加えられ、暴露したＮ末端のために様々な共有結合の変化が導入されても良い（２６）。このような変化システムは、複雑であり、真核生物と原核生物の両方において存在し、特異性と性能はある程度変化する（２７）。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特異性が既知のプロテアーゼによる処理を受けなかった組み換え技術によって産生されたそれぞれのタンパク質が、予想外及び／又は異種のＮ末端を有する可能性がある。米国出願第１０／３３８，４４１号明細書及び第１０／３８９，６４０号明細書において説明されているような全長ＳＵＭＯシステムは、真核生物の発現システムに対するこのような問題を回避するための新規な方法を提供している。本発明に従うと、目的タンパク質をコード化した核酸において適切なコドンを変化することにより、任意のアミノ酸が目的タンパク質のＮ末端残基として組み込まれ得る。前記Ｕｂｌはその後、前記Ｕｂｌのアミノ末端部位と接触することによって再構成した後、特異的なプロテアーゼによって再構成されたＵｂｌが切断されることを経て、前記変性目的タンパク質がその後、Ｕｂｌのカルボキシ末端部位に結合し、望ましい細胞において発現し、さらに本明細書で説明するように精製される。あるいは、前記Ｕｂｌのアミノ末端ドメインは、細胞内（すなわち天然または外から供給されたもの）において特異的なプロテアーゼ活性が存在する限り、目的タンパク質を産生するために前記融合タンパク質と共にｉｎ ｖｉｖｏで発現されても良い。プロリンを除くすべてのアミノ酸は、これらの方法によってアミノ末端残基として使用されてもよい。前記目的タンパク質のアミノ末端残基としてプロリンを使用するために、融合タンパク質は前記Ｕｂｌプロテアーゼの切断部位の後にＭｅｔ−Ｐｒアミノ酸配列が続く。適切なプロテアーゼによる再構成と切断の後、前記目的タンパク質のＭｅｔ−Ｐｒｏアミノ末端はさらにメチオニンアミノペプチダーゼ（例えばＰｉｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ；（２８））によって処理され、メチオニンを除去し、アミノ末端としてプロリンを残す。
【００１９】
さらに、本明細書において提供される方法は、ＳＵＭＯのカルボキシ末端（ＣＴＨＳ）の半分とアミノ末端（ＮＴＨＳ）の半分（ドメイン）の間で表される部分的な配列の間における天然の親和性の活用を通じて、前記融合タンパク質の高性能親和性精製を可能にする。重要なことには、前記ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界が柔軟性を有することである。注目すべきことは、本発明がＳＵＭＯのカルボキシ末端ドメイン：ＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）及びＣＴＨＳ−１（配列ＩＤ番号：３１）の特異的かつ機能的な２つの形態を提供することである。従って、本発明は、ＣＴＨＳおよびＣＴＨＳ−１を包含し、すなわち対立遺伝子及び種の変異、及びおよそ２、４、６、８、１０、１５、及び２０のアミノ酸によって配列が延長または短縮するＣＴＨＳｓの任意のその他の変性（または相当するヌクレオチドの変化）を包含する。好ましくは、前記変性ＣＴＨＳｓは、ＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）の活性の少なくとも１つが維持されている（例えば、発現の増強、ＮＴＨＳ（配列ＩＤ番号：５）或いは変性ＮＴＨＳの結合、及び／又はＮＴＨＳ或いは変性ＮＴＨＳを有する切断可能な複合体の形成）。好ましくは、前記変性ＣＴＨＳは図３で描かれているような２つのβシートを完全にまたは重要な部位のみを含む。
【００２０】
同様に、前記ＮＴＨＳの長さを変えることが本発明に含まれる。ＳＵＭＯの前記アミノ末端ドメインの特異的かつ機能的形態によって、ＮＴＨＳ（配列ＩＤ番号：５）及びＮＴＨＳ−１（配列ＩＤ番号：９１）も提供される。本発明は、ＮＴＨＳ及びＮＴＨＳ−１、対立遺伝子及び種の変異、及びおよそ２、４、６、８、１０、１５、及び２０のアミノ酸によって前記配列が延長または短縮するＮＴＨＳｓの任意のその他の変性（又は対応するヌクレオチドにおける変化）を包含する。好ましくは、前記変性ＮＴＨＳは、ＮＴＨＳ（配列ＩＤ番号：５）の活性の少なくとも１つが維持されている（例えばＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）又は変性ＣＴＨＳに対する結合能、及び／又はＣＴＨＳ或いは変性ＣＴＨＳを有する切断可能な複合体の形成）。好ましくは、前記変性ＮＴＨＳは、図３で描かれているような２つのβシートとαへリックスを完全にまたは重要な部位のみ含む。
【００２１】
表１で説明するＵｂｌｓ（すなわち、それらの部分的な配列は図２６を参照）はいずれも、１）目的タンパク質の異種融合の発現を促進するため、２）前記融合タンパク質の親和性精製を可能にするため、３）切断のために前記Ｕｂｌを再構成するために、本発明の組成物及び方法に利用されてもよいが、ＳＵＭＯは本明細書で提供される遺伝子融合システムにおいて実証される。表２で説明する特異的な加水分解酵素（すなわちプロテアーゼ）はいずれも、前記目的タンパク質からＣＴＨＳ（或いはＳＵＭＯタンパク質又は他のＵｂｌの部分的な他の配列）を除去するために、本発明の組成物と方法に利用されるが、Ｕｌｐ１は本明細書において提供される遺伝子融合システムにおいて実証される。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
本発明の切断ＳＵＭＯ融合システムは、大腸菌と真核生物における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する適用、及びすべてのシステムから得られる最終産生物の精製に成功している。さらに具体的には、前記システムは、（１）未発現タンパク質の発現促進；（２）不溶性タンパク質の溶解性の増強；（３）部分的なＵｂｌ配列がそのＮ末端に対して融合することによって、目的タンパク質を細胞内プロテアーゼによる分解から保護すること；（４）前記Ｕｂｌそれぞれに対して固定され補足したＮ末端部位を利用した前記融合タンパク質の精製；（５）前記Ｕｂｌ或いはその一部に対して固定された特異的な抗体を利用した前記融合タンパク質の精製；（６）本物のタンパク質を効果的に産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける前記融合タンパク質の切断；（７）新規なＮ末端を有するタンパク質の産生；及び（８）例えばＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１などのＵｂｌ加水分解酵素を用いることによる、前記融合タンパク質のＮ末端配列に関係なく顕著な効果を有する融合タンパク質のすべてを切断することを可能にする。
【００２５】
重要なことは、Ｕｂｌプロテアーゼは、Ｕｂｌのアミノ酸残基数個だけでなく、各Ｕｂｌの全体構造を認識する構造特異的酵素であるということである（１６、２９、３０）。一方、組み換えタンパク質の工程において一般的に使用されるものを含む他の既知のプロテアーゼの多くは、小さいものを認識し（４〜８）、更にアミノ酸配列伸長を分解し、それにより目的タンパク質内において切断することが多い。前記各プロテアーゼの特異性と頑強性を伴った前記Ｕｂｌのプロペプチドの組み合せ（前述したような）は、組み換えタンパク質の発現、精製及び加工に対して優れたシステムを作り出す。
【００２６】
細胞内においてユビキチン化またはＳＵＭＯ化されたタンパク質の最終的な運命は変化する。タンパク質は、モノユビキチン化またはポリユビキチン化されうる。タンパク質のモノユビキチン化は主にタンパク質内在化によって調節されている（３３）。ユビキチン化は主に、２６Ｓプロテアソームに対するタンパク質を分解の標的としている（３４）。一方、標的タンパク質のＳＵＭＯ化は分解されず、むしろ直接または間接的にタンパク質の局在性を変える（１０）。脱ユビキチン化酵素は、ヒトにおいては約５０、酵素ゲノムにおいては１７存在する。これらの酵素は標的タンパク質から接合ユビキチンを切断すると同時に、ユビキチン−ユビキチン、およびユビキチン人工融合タンパク質から接合ユビキチンを切断する（３５、３６）。酵母はＵｌｐ１とＵｌｐ２と呼ばれている２つのプロテアーゼを有しており、それはリジンのε−アミノ基からＳＵＭＯを除去すると同時に、直鎖ＳＵＭＯ融合からＳＵＭＯを除去する（２９、３０）。
【００２７】
不安定であることが周知である脱ユビキチン化酵素と比較して、Ｕｌｐ１はその分解特性において際立った収率で生産し、さらに非常に安定かつ頑強であることで知られている。ＵＢＰとＵｌｐ酵素分類のこの劇的な相違は、この２つのアミノ酸配列または三次元構造に本質的に類似性がないことからすれば、驚くべきことではない（１６、３８）。ＣＴＨＳ融合は、組み換えタンパク質の収率を増進し、タンパク質精製の方法を提供し、さらに新たなＮ末端を産生し得ることから、この技術はゲノムバイオテクノロジー後の重要な分析手段を提供する。
【００２８】
本発明はまた、発現、分泌、精製、局在化、及び目的タンパク質のアミノ末端の変化の促進をもたらすために用いるキットも包含する。そのようなキットは、望ましい宿主細胞における発現に適したプロモーターと、ＵＢＬ分子のカルボキシ末端部位をコード化した核酸配列をインフレームに有する目的タンパク質をコード化した核酸をクローニングするのに適した多重クローニング部位と、に機能的に結合したＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、およびＩＳＧ１５の群から選択されるＵＢＬ分子のカルボキシ末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクターを含む。前記プロモーターは、好ましくは強いプロモーターであり、さらに構成的または制御されていても良い。そのようなプロモーターは当業者によく知られており、ＡＤＨ１、Ｔ７、およびＣＵＰ１プロモーターなど後述で提供されるプロモーターを含むがこれに限らない。
【００２９】
前記組換えベクターは、前記Ｕｂｌ分子のカルボキシ末端部位をコード化した配列と共に、構造内に精製標識を少なくとも１つコード化した核酸配列を含んでいてもよい。精製標識は当業者に周知のものであり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）、ポリヒスチジン標識、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ（その後のビオチン化のため）、およびｃ−ｍｙｃエピトープを含むが、これらに限らない。精製標識を通じて融合タンパク質を精製するための物質と方法は当業者に周知であり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔａｌｏｇ，２００２，および以下の実施例を参照）。試薬は、前記精製標識に結合可能な固形支持体の少なくとも1つ、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液を含むがこれに限らず、これらがキットに含まれても良い。
【００３０】
前記キットはさらに、前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端部位の調整を有する組成物を含んでも良い。前記キットは、選択的に精製標識の少なくとも１つに機能的に連結した前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクターを含んでも良い。前記キットはさらに、融合タンパク質からＵＢＬ分子を切断できるプロテアーゼを少なくとも１つを有する組成物、切断緩衝液、宿主細胞の凍結ストック、および使用説明書をさらに含んでもよい。前記キットはさらに、野生型タンパク質を原産とするものとは異なるアミノ末端を産生するために、目的タンパク質をコード化した核酸を変性するための試薬を含んでも良い。前記核酸を変化する方法は、当業者に周知であり、部位特異的な突然変異産生、及びオリゴヌクレオチドに基づく部位特異的な突然変異産生を含むがこれに限らない（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ，２００１；Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）。
【００３１】
本明細書で用いられている"使用説明書"は、本発明方法を行なうために、本発明の組成物の実用性を伝達するために使用されうる出版物、記録、図表、又は他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの前記使用説明書は、前記キットを含む容器と一緒に出荷するために、例えば本発明のキットを含む容器に貼り付けられていても良い。或いは、前記使用説明書は、前記容器と別々に出荷されてもよく、この場合は前記使用説明書とキットは受容者が協働で使用する意向が添えてある。
【００３２】
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００３３】
本明細書で使用される"核酸"又は"核酸分子"は、一本鎖又は二重鎖の任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指しており、一本鎖の場合、その相補配列の分子は直線または円形である。核酸分子について議論する場合、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’の方向で配列を与える通常の約束事に従って本明細書に説明されてもよい。本発明の核酸に関して、"分離された核酸"という用語が時折使用される。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、それが由来する生物体の天然に生じるゲノムにおいて、直接隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、"単離された核酸"は、例えばプラスミッド又はウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子を含んでも良く、或いは原核性又は真核性細胞又は宿主生物体のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでも良い。
【００３４】
ＲＮＡに適用する場合、"単離された核酸"という用語は、上記で定義したような分離されたＤＮＡ分子によってエンコードされたＲＮＡ分子を指しても良い。或いは、前記用語は、ＲＮＡ分子がその自然状態（すなわち細胞内又は組織内）に関連した他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指してもよい。分離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）はさらに、生物学的または合成的方法によって直接産生され、その産生の間に存在する他の成分から分離された分子を意味しても良い。
【００３５】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、"特異的なハイブリダイゼーション"という用語は、当業者において一般的に使用される規定の条件下において、そのようなハイブリダイゼーションを許容するために十分に相補的な配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の関連性を指すものである（"実質的に相補的"と時折呼ばれる）。特に、前記用語は、非相補的な配列の一本鎖核酸を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に除いたものに対して、本発明の一本鎖ＤＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。様々な相補性を有する一本鎖核酸の特異的なハイブリダイゼーションを可能にするための適切な条件は、当業者に周知である。
【００３６】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密な条件を計算するための一般式の１つは、以下に説明する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％＋Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ二本鎖
【００３７】
上記の式の説明としては、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及びＧＣ含有量が４２％の５０％ホルムアミドを用い、平均プローブサイズは２００塩基であり、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖の前記Ｔｍは、相同性が１％減少するに伴い１〜１．５℃減少する。従って、約７５％より大きい配列同一性を有する目的物は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いることで観察される。例えば、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト試薬、１．０％ＳＤＳ、サケ精子の変性ＤＮＡ断片１００μｇ／ｍｌ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び最大５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いたＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（上述）の方法に従って、ハイブリダイゼーションが実施されても良い。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間で達成される。ハイブリダイゼーション後、フィルターは以下のように洗浄される：（１）２ＸＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２ＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間；（３）１ＸＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間；（４）１ＸＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、４２〜６５℃で２時間、前記溶液は３０分毎に変える。
【００３８】
前記ハイブリダイゼーションと洗浄の厳密性は、主に前記塩濃度と前記溶液の温度に依存する。一般的に、プローブをその目的物とアニーリングする速度を最大にするために、前記ハイブリダイゼーションは通常、前記ハイブリッドのＴｍ計算値が２０〜２５℃以下になる塩と温度条件下で実行される。洗浄条件は前記目的物に対する前記プローブの同一性の程度に合わせてできるだけ厳密にすべきである。一般的に、洗浄条件は前記ハイブリッドのＴｍのおよそ１２〜２０℃以下になるように選択される。本発明の核酸に関して、ある程度厳密なハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中、サケ精子の変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを４２℃でハイブリダイゼーションすることとして定義され、２ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、５５℃で１５分洗浄される。高度に厳密なハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中、サケ精子変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを４２℃でハイブリダイゼーションすることとして定義され、さらに１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間洗浄される。超高度に厳密なハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中、サケ精子変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを４２℃でハイブリダイゼーションすることとして定義され、さらに０．１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分洗浄される。
【００３９】
本明細書で用いられる"プローブ"という用語は、精製された制限酵素消化物として天然に生じる或いは合成的に産生されたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＤＮＡ分子を指し、前記プローブに対して相補的な配列を有する核酸にアニーリング可能または特異的にハイブリダイズ可能なものである。プローブは一本鎖または二本鎖であっても良い。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブの発生源、及び使用方法を含む様々な要因によって決まる。例えば、診断的適用に対しては標的配列の複雑さによって決まり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、より少ないヌクレオチドを含む可能性があるが、一般的に１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチドを含む。本発明の前記プローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に対して相補的になるように選択される。これは、前記プローブが"特異的にハイブリダイズする"ことが可能となるように、または一連の規定の条件下において標的鎖がそれぞれアニールすることが可能となるように、十分に相補的でなくてはならない。従って、前記プローブの配列は、前記標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、前記プローブの５’または３’末端に結合し、前記プローブ配列の残りは前記標的鎖に対して相補的になっている。或いは、前記プローブ配列は前記標的核酸の配列と十分に相補的な状態になっておりその後特異的にアニールするのであれば、非相補的塩基又はより長い配列は、前記プローブに散在してもよい。
【００４０】
本明細書で用いる"プライマー"という用語は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドを指し、生体系由来、制限酵素の消化による産生、又は合成的な産生、いずれに由来してもよく、適切な環境にある場合には鋳型依存核酸合成の開始剤として機能的に作用し得る。適切な核酸鋳型、適切な核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な共同因子、及び適切な温度とｐＨなどの条件が提示されている場合、前記プライマーは、ヌクレオチドの添加とポリメラーゼの作用または類似の作用によりその３’末端において伸長し、プライマーが伸長した産生物が得られる。前記プライマーは特定の条件とその適用に対する必要条件によって長さが変わってもよい。例えば、診断的適用においては、前記オリゴヌクレオチドプライマーは一般的に１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチドの長さである。前記プライマーは、目的とする伸長産生物の合成を刺激するために目的の鋳型に対して十分に相補的でなくてはならなく、これによって、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合成を開始する使用に対して適切な近位における前記プライマーの３’ヒドロキシ部位を提供するのに十分な方法で、目的とする鋳型鎖とアニールし得る。前記プライマー配列が前記目的の鋳型の正確な相補体に相当する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列は、別の相補的なプライマーの５’末端に結合されてもよい。或いは、前記プライマー配列が目的の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有し、伸長産生物を合成するために鋳型プライマー複合体が機能的に提供されるのであれば、非相補的塩基は、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在してもよい。
【００４１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は米国特許第４，６８３，１９５号公報、第４，８００，１９５号公報、および第４，９６５，１８８号公報において説明されており、これらの刊行物は本明細書に完全に組み込まれる。
【００４２】
"百分率類似性""百分率同一性"及び"百分率相同性"は、特定の配列を指す場合、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧソフトウェアプログラムにおいて説明されているものとして使用される。
【００４３】
本明細書で使用される"機能的"という用語は、核酸又はアミノ酸配列が列挙した試験又は目的に対して機能的であることを意味する。
【００４４】
核酸の特定の配列に対する"天然対立遺伝子多型""突然変異体"及び"誘導体"は、特定の配列に密接に関連した核酸配列を指すが、天然に又は設計によって、配列又は配列の変化を有していても良い。密接に関連することによって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも約７５％、しばしば９０％以上が、特定の配列ＩＤ番号を用いて参照される定義された長さの核酸配列と一致することを意味する。密接に関連する核酸配列間のヌクレオチド配列の変化または相違は、特定の核酸配列の性質において、通常の複製又は重複の過程の間に起こるヌクレオチド配列の変化に相当しても良い。その他の変化は、例えばアミノ酸コドン或いは核酸の調整領域における配列を変化させるなど、特定の目的のために前記配列が明確に設計され導入されても良い。そのような特定の変化は、様々な突然変異誘発技術を用いてｉｎ ｖｉｔｏで行われてもよく、或いは前記変化のために誘発又は選択する特定の選択条件下に置かれた宿主生命体において引き起こされても良い。発生したそのような配列の変形は具体的に、最初の配列の"突然変異体"または"誘導体"と呼ばれても良い。
【００４５】
「本質的に〜から成る」という用語は、特定のヌクレオチド又はアミノ酸を指す場合は、与えられた配列ＩＤ番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、前記用語は、配列それ自体と、前記配列の基本的な特性及び新規な特性に影響を与えない分子修飾とを含む。本明細書で用いられる"プロモーター"という用語は、組み換え産生物をコード化したＤＮＡ配列に隣接しているＤＮＡ配列を指しうる。プロモーターは隣接ＤＮＡ配列に機能的に連結されているのが好ましい。プロモーターは一般的に、プロモーターが存在しない場合に発現される組み換え産生物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現される組み換え産生物の量を増加させる。ある生命体のプロモーターは、別の生命体に由来するＤＮＡ配列の組み換え産生物の発現を増強するために利用されうる。例えば、脊椎動物のプロモーターは、脊椎動物においてクラゲＧＦＰを発現するために使用されても良い。さらに、あるプロモーターの成分が、直列に結合した多重ＤＮＡ配列によって発現される組み換え産生物の量を増加させることも可能である。従って、あるプロモーター成分は１若しくはそれ以上の組み換え産生物の発現を増強することが可能である。多重プロモーター成分は当業者に周知である。
【００４６】
本明細書で用いられる"エンハンサー"という用語は、組み換え産生物をコード化したＤＮＡ配列に隣接したＤＮＡ配列を指しうる。エンハンサー要素は一般的にプロモーター成分の上流に位置するか、或いは下流に位置しうるものであり、又はコーディングＤＮＡ配列内（例えば組み換え産生物或いは産生物に転写或いは翻訳されたＤＮＡ配列）に位置しうる。従って、エンハンサー要素は組み換え産生物をコード化したＤＮＡ配列の上流或いは下流の１００塩基対、２００塩基対、又は３００或いはそれ以上の塩基対に位置しうる。エンハンサー要素は、プロモーター要素によってもたらされる増強された発現を超えて、ＤＮＡから発現される組み換え産生物の量を増加させることが可能である。多重エンハンサー要素は当業者が容易に入手可能なものである。
【００４７】
本明細書で用いられる"形質移入した（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）"及び"形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）"という用語は、外来性ＤＮＡを細胞に誘導する方法を指す。このような方法は、例えば高濃度の塩、電場、リポソーム、ポリカチオンミセル、又は洗浄剤を用いて細胞を処理するなど様々な技術を含むものであり、目的核酸分子に対して透過性の宿主細胞の外膜或いは外壁を与える。これらの特定の方法は、限定されているものではなく、本発明は当業者に周知の任意の形質転換技術に関連するものである。
【００４８】
"レプリコン"は任意の遺伝に関する要素であり、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージ或いはウイルスであり、そのもの自身の制御の下で大部分は複製可能なものである。
【００４９】
"ベクター"は、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージ或いはウイルスなどのレプリコンであり、結合した配列或いは要素の複製をもたらすために別の遺伝子配列或いは要素（ＤＮＡ或いはＲＮＡ）が結合しうるものである。
【００５０】
"発現オペロン"は、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始信号（例えばＡＴＧ、ＡＵＧコドン）、ポリアデニル化信号、転写終結区（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）、及び同種のものなど、転写と翻訳の制御配列を有しうる核酸セグメントを指し、宿主細胞或いは生命体においてポリペプチドコード配列の発現を増強するものである。
【００５１】
本明細書で用いられる"オリゴヌクレオチド"という用語は本発明の配列、プライマー、及びプローブを指し、２若しくはそれ以上、好ましくは３以上のリボ−或いはデオキシリボヌクレオチドを有する核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、様々な因子と、前記オリゴヌクレオチドの特定の用途及び使用方法によって決まる。
【００５２】
"実質的に純粋"という用語は、与えられた物質を重量で少なくとも５０〜６０％含む調整物を指す（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、など）。さらに好ましくは、前記調整物は与えられた化合物を重量で少なくとも７５％含み、最も好ましくは重量で９０〜９５％含む。純度は与えられた化合物に適切な方法で測定される（例えば、クロマトグラフ法、アガロース或いはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析、及び類似のもの）。
【００５３】
"遺伝子"という用語は、ポリペプチドをコード化した翻訳領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を有する核酸を指し、エクソン配列および（選択的に）イントロン配列の両方を含む。前記核酸は選択的に、プロモーター或いはエンハンサー配列のような非コード配列を含んでもよい。前記"イントロン"という用語は、タンパク質には翻訳されず、一般的にエクソン間で見出される与えられた遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる"機能的に連結"という用語は、核酸配列が別の核酸配列と機能的に関連するように配置されていることを指しても良い。機能的に連結した核酸配列の実施例は、プロモーター、切断部位、精製標識、転写終結区、転写或いは適切な場合は翻訳された場合に例えばタンパク質、リボザイム、またはＲＮＡ分子などの機能的産生物を産生するエンハンサー或いはアクチベータ及び異種遺伝子、を含むが限定されない。"機能的に連結"という用語は、例えば、タンパク質の形態におけるＵｂｌのカルボキシ末端ドメインの触媒的切断活性によって目的タンパク質が放出されるように、Ｕｂｌのカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸と機能的に関連するように配置された目的タンパク質をコード化した核酸配列を指しても良い。
【００５５】
"固形支持体"という用語は、任意のチップ（例えばシリカを基盤にしたもの、ガラス、または金チップなど）、スライドガラス、膜、ビーズ、固形粒子（例えばアガロース、セファロース、ポリスチレン、又は電磁ビーズなど）、カラム（或いはカラム材料）、テストチューブ、又はマイクロタイターディッシュなど含むが限定されない任意の固形表面を指す。
【００５６】
"アフィニティー（親和性）標識""精製標識"及び"エピトープ標識"という用語は全て、目的タンパク質の精製を達成するために使用されうる標識を指しても良い。精製／アフィニティー／エピトープ標識は当業者に周知であり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）、ポリヒスチジン標識（例えば６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ（その後のビオチン化のため）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、抗体エピトープ（例えば抗体に認識され結合するアミノ酸配列）、ｃ−ｍｙｃエピトープを含むがこれらに限定されない。
【００５７】
以下に説明する物質と方法は本発明の実行を容易にするために提供される。
【００５８】
大腸菌発現ベクターの設計と作成
原型ベクターの骨格は、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２４ｄベクターを用いて作成した（図１３Ｂおよび図１５Ｃ参照）。ｐＥＴ２４ｄはＩＰＴＧを用いて誘導可能なＴ７プロモーターシステムを用いた。前記ベクターはカナマイシン選択マーカーを有しており、翻訳終結区を全く含まないものであった。アンピシリン耐性遺伝子を持っているｐＥＴ２２骨格を用いた類似のベクターも産生した。
【００５９】
６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ切断可能および切断不可能融合体の作成
アミノ末端６ｘＨｉｓ標識ＳＵＭＯ融合ベクターは以下のように作成した。ＰＣＲ産生物はプライマー５’ＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：６９）及び５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：７０）と共に変性ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）遺伝子を鋳型（（３９）Ｅｒｉｃａ Ｊｏｈｎｓｏｎ寄贈）として用いて産生した。特に、本明細書において提供される実施例全体で使用される前記ＳＵＭＯ（配列ＩＤ番号：２）は、報告されているＳＵＭＯ配列における（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２７２３３）グアニンヌクレオチドの代わりに、２２９の位置にアデニンヌクレオチドを含む。この変化によって、エンコードされたアミノ酸配列において、トレオニンの代わりにアラニンを産生する（配列ＩＤ番号：１とＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ１２３０６を比較）。以下の実施例はＳＵＭＯの変性した種類のものを使用しているが、本発明は上記に記載したＧｅｎＢａｎｋ受入番号で提供されるような"野生型"のＳＵＭＯの利用を含む。
【００６０】
ＰＣＲ断片は、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて２回の消化した後、同様に消化しておいたｐＥＴ２４ｄにライゲートした。ｅＧＦＰ配列はプライマー５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：７１）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：７２）を用いて増幅した。ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合体の切断不可能な変異体を産生するために、メチオニン（太線で示す）の代わりにプロリンコドンを有するプライマーをＰＣＲ増幅に使用した：５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：７３）。前記ＰＣＲの産生物は精製し、ＢｓａＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて２回の消化をし、その後これらを同様に消化しておいたｐＥＴ２４ｄ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯベクターにライゲートした。其々において正しい配列が存在していることを確認するためにプラスミッドの配列を決定した。
【００６１】
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ及びｐＥＴ−Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳプラスミドの作成
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳプラスミド（図１４）は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミド（図１８）を用いた逆ＰＣＲによって作成した。前記プラスミドを増幅するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：７４）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＧＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：７５）を用い、ＳＵＭＯ遺伝子とＧＦＰ遺伝子のＣ末端の半分を除去した。前記増幅産生物はＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、自己ライゲート（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｅｄ）した。固形支持体に対して共有結合（例えばスルホ結合樹脂のＰｉｅｒｃｅ；及びチオプロピル、イオドプロピル、及び他の値オール反応基を有する支持体）を達成できるように、ＮＴＨＳのＮ末端付近にシステイン残基を導入するために（図２３、配列ＩＤ番号：２７）、以下の配列のプライマー、５’−ＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：７６）及び５’−ＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：７７）を逆ＰＣＲに用いた。鋳型はｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（図１４）であった。ＰＣＲ終了後、前記産生物を精製し、ＮｃｏＩで消化し、自己ライゲートした。
【００６２】
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−Ｅ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、及びｐＥＴ−Ｓ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰプラスミドの作成
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰプラスミドは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミドを用いた逆ＰＣＲによって作成した。前記プラスミドを増幅するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：７８）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：７９）を用い、ＳＵＭＯ遺伝子のＮ末端部位を除去した。前記増幅産生物はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、自己ライゲートした。
【００６３】
６ｘＨｉｓ標識がエンドペプチダーゼによって切取られることから保護できるように、６ｘＨｉｓ標識の後、リジンをグルタミン酸残基（単一文字表記でＥ、従って前記プラスミドの名前）に置き換えるために、（配列ＩＤ番号：７８）の代わりに、以下の配列５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：８０）のプライマーを用いることを除けば上述のように前記ＰＣＲとクローニングを行った。
【００６４】
６ｘＨｉｓ標識がエキソペプチダーゼによって切取りとられることから保護できるように、Ｓ−標識配列（４０）の部位を導入するために、２つのＮｃｏＩ適合性突出部である５’−ＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：８１）及び５’−ＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：８２）を形成するアニーリングのような方法で、以下の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。これらはＴ４ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、アニールし、さらにＮｃｏＩ消化されたｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰにクローニングした。
【００６５】
ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ及びｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰプラスミドの作成
ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミド（図２１、配列ＩＤ番号：２４）は、ＰＣＲによって増幅したＧＳＴ配列（図２０、配列ＩＤ番号：２２）をｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミッドのＮｃｏＩ部位に挿入することによって作成した。ＧＳＴ配列は、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＡＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：８３）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＴ−３’（配列ＩＤ番号：８４）を用いてｐＥＴ−ＧＳＴプラスミドから増幅し、このＰＣＲ産生物をＥｓｐ３及びＮｃｏＩを用いて消化した。ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（図２２、配列ＩＤ番号：２６）は、ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミッドを鋳型として用いた逆ＰＣＲによって産生した。前記プラスミドを増幅するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：７８）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：７９）を用い、ＳＵＭＯ遺伝子のＮ末端部位を除去した。前記増幅産生物はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、自己ライゲートした。
【００６６】
Ｕｌｐ１プラスミド、ＳＵＭＯプロテアーゼの発現及び精製
ＳＵＭＯ加水分解酵素／プロテアーゼＵｌｐ（４０３〜６２１）ｐ（１６，２９）の触媒ドメインは、酵母ゲノムＤＮＡから、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：８５）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：８６）を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産生物はＮｃｏＩとＸｈｏＩを用いて消化し、ｐＥＴ２４ｄベクターにクローン化し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩｗｏ用いて消化した。得られたクローンはＣ末端Ｈｉｓ標識と共に構造内にＵｌｐ１の触媒ドメインを持っていた。前記酵素はＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現した。組み換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ｍＭ β−メルカプトエタノールに対して広範囲に透析した。−８０℃で保存する前に、前記酵素の調整液は５０％のグリセロールで調整した。
【００６７】
酵母ベクターの設計と作成
酵母を含む検体のモデルとしてサッカロマイセス・セレヴィシエを用いた。これらの試験のための発現ベクターは全て、選択可能マーカーとしてトリプトファン、複製起源として２μ、さらに目的クローン化遺伝子の発現を誘導するプロモーターをもたらす銅と共に、多コピー酵母ベクターのｐＹｅｐ上に設計した（４１）。融合体の作成は（大腸菌ベクターから切取ったＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片）は、ｐＹｅｐに直接再クローン化し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩと共に消化した。
【００６８】
組み換えバキュロウイルスの設計と作成及び昆虫細胞における融合体の発現
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＮＴＨＳとＵｌｐ１を接触させることにより、後で開裂可能な非開裂タンパク質としてのＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合体を産生することを実証するために、我々はｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。融合コンストラクト（大腸菌ベクターｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰから切取ったＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片、図２２、配列ＩＤ番号：２６）は、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを用いて消化したｐＦａｓｔＢａｃに直接再クローン化した。
【００６９】
昆虫細胞コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）からのタンパク質の分析：バキュロウイルスストックの調整と細胞増殖
ｐＦａｓｔｂａｃ１シャトルプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に基づく移入ベクターのコンストラクトは、部位特異的な統合によってＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ配列を組み換えウイルスＤＮＡに転写するために、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌適格細胞に入れ替えた。組み換えウイルス（バクミド（ｂａｃｍｉｄ））ＤＮＡを含む形質転換（白いコロニー）大腸菌細胞のアルカリ溶菌法、及び組み換えバクミドＤＮＡの抽出の後、前記バクミドＤＮＡをハスモンヨウ近似種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）昆虫細胞を形質移入するために使用し、これによりウイルス複製が起きた。その後前記ウイルスは、２代継代（長期保存のため）及び３代継代（作用のため）ウイルスストックを産生するために、新鮮なＳｆ９細胞培養物を感染させることにより増幅し、融合タンパク質を発現させるため感染細胞に対して直接使用した。ウイルス感染力（ｐｆｕ／ｍｌ）は、Ｓｆ９細胞においてＢａｃＰＡＫ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた滴定によって測定した。１ｍｌあたり１×１０６細胞濃度のＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞の培養液５０ｍｌを、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ 培地（無血清培地）中、ＭＯＩ＝５で組み換えウイルスを用いて感染させた。前記細胞は、１００ｍｌのスピナーフラスコ中２７℃で増殖した。２４時間毎に、トリパンブルーと細胞計測懸濁液０．５ｍｌを用いて細胞生存を測定した。
【００７０】
細胞と培地中の組み換えタンパク質の存在は、上清及び細胞ペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって確認した。
【００７１】
サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の増殖とタンパク質発現
酵母培養は富栄養培地中で培養した。標準酵母と大腸菌の培地は記述されているように調整した（４２）。酵母菌株ＢＪ１９９１を宿主として使用した。自己複製プラスミドを有する酵母の形質転換細胞は、酵母選択培地中で維持した。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（切断可能或いは切断不可能変異株）及びＳ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ及び６ｘＨｉｓ−Ｅ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合体は、ＴＲＰ選択マーカーを有する多コピープラスミド２μｍ中、銅メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーターによる調整の下で発現した。
【００７２】
酵母細胞は適切な発現ベクターを用いて形質移入し、単一コロニーを選択可能マーカーのない合成培地中で培養した。各タンパク質に対して、タンパク質発現のために少なくとも２つの単一コロニーを個別に分析した。細胞は５ｍｌ培養液中一晩培養し、翌日、前記培養液は新鮮な培地でＯＤ６００＝０．５になるまで希釈した。この培養液はＯＤ６００＝２．０まで培養し、１００μＭになるように硫酸銅を加えた。前記培養液は３時間誘発した。この細胞を２０００×ｇ、５分間でペレット状にし、ｐＨ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。この細胞ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中に懸濁し、５分間煮沸し、短時間の超音波処理によりＤＮＡを剥奪した。前記懸濁液は遠心分離し、１０〜２０μｌずつ等分したものを１２％ＳＤＳ−ＰＡＣＥにかけた。
【００７３】
大腸菌の増殖とタンパク質の発現
タンパク質発現の研究は、Ｒｏｓｅｔｔａ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）において実施した。この菌株はラムダＤＥ３溶原菌株に由来し、ｐＡＣＹＣに基づくプラスミドにおいてｔＲＮＡｓと共にＩＰＴＧ誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを保有していた。培養液はＬＢ培地と最少培地中、３７℃の培養温度で、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンと３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと共に培養した。前記培養液は５０倍に希釈し、２６℃まで温度が下がる期間、ｍｉｄ ｌｏｇ（６００ｎｍの光学濃度が０．５〜０．７）になるまで培養し、この培養液を１ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。この誘発は２〜５時間続けた。前細胞へのタンパク質誘導を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルーによる染色の後、前記タンパク質を分析した。
【００７４】
溶解性及び不溶性画分の分離
大腸菌は穏やかな遠心分離によって集菌し、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。この細胞は４ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、超音波で数回パルスをかけて破壊した。穏やかな遠心分離（１５００×ｇで５分間）よって壊れなかった細胞を除去し、全細胞が溶解するのを確実にするために上清を再度超音波処理した。未破壊細胞の溶解のために検出される粘着がないことを確実にするために、等分化（５μｌ）したものを２％ＳＤＳと共に混合した。前記溶菌中に未破壊細胞が残っていないことを確実にした後、細胞壁、封入体、及び膜断片から成る不溶性物質を遠心分離（１８，０００×ｇで１０分間）により沈殿させた。前記上清は"溶解画分"とみなした。
【００７５】
前記ペレットは、以下の方法で、残った溶解性タンパク質、脂質、及びペプチドグリカンのいずれも洗い流した。このペレットを６００μｌのＰＢＳに再懸濁し、この懸濁液に、３Ｍ尿素と１％トリトンＸ１００とを含む溶液６００μｌを加えた。前記懸濁液は短時間ボルテックスにかけ、上述のように不溶性物質を遠心分離によって集めた。溶解タンパク質が全て除去されることを確実にするために、前記ＰＢＳ／尿素／トリトン洗浄をさらに２回繰り返した。前記洗浄ペレットは、主に過剰発現タンパク質によって形成される封入体から成る"不溶性画分"として指定した。各画分から得られる約１０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００７６】
蛍光（ＧＦＰ活性）評価
ＧＦＰ蛍光（９）は、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｃｃｅｎｔ ＦＬ蛍光光度計（ＬａｂＳｙｓｔｅｍ；Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて、励起４８５ｎｍ／発光５１０ｎｍのフィルターを照射０．４秒にセットし、溶解性画分（最終容積４０μｌ中、溶解性タンパク質約０．１ｍｇ）で測定した。このデータはＡｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔｓ（ＡＵ）で示した。
【００７７】
ウエスタンブロット法
各レーンあたり全酵母タンパク質が２０μｇのものを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルで分離し、ニトロセルロース膜を用いた標準的な方法で電気ブロットした。抗体を用いたブロッキングとインキュベーションの前に、検体中のタンパク質量が当量であることを確実にするために、前記膜をＰｎｃｅａｕ Ｓ溶液（Ｓｉｇｍａ）で染色した。この膜はＴＴＢＳ緩衝液中５％ミルクで固定し、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｔｅｃｈ，カタログ番号８３６７）と共に１：５００希釈で一晩４℃でインキュベートした。第二ＨＲＰ接合抗体はＡｍｅｒｓｈａｍから得た。
【００７８】
タンパク質精製とＵｌｐ１を用いたｉｎ ｖｉｒｏにおける切断
溶解物の溶解性画分から得られる組み換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、この製造会社が推奨する方法で精製し、さらに実施例ＶＩ（６）にて詳細は記載した。詳細を記載した実施例ＶＩ（６）のように、前記タンパク質の切断を実施した。
【００７９】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を説明するために提供される。ＳＵＭＯは以下の実施例の範例としたが、代わりに他のＵｂｌを使用しても良い。実施例は実例であり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００８０】
ＧＦＰのＮ末端に対するＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端半分の結合による大腸菌タンパク質の発現の増強
ＧＦＰを発現する全てのｐＥＴベクターの設計とコンストラクションは上記に記載している。ＤＮＡ配列、ＳＵＭＯ、ＣＴＨＳ、ＧＳＴ、ＧＦＰの受入番号、融合体コンストラクト、プラスミドマップ、及び翻訳構造については、図１２〜２４に示す。６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、及びＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰの発現パターンは図５に示す。誘導した大腸菌細胞は超音波処理によって破壊し、溶解性タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。前記染色ゲルは（図５Ａ）に示しており、融合体は溶解性であった。不融合ＧＦＰは一般的に大腸菌において発現性に乏しいものである。前記データは、ＳＵＭＯとＣＴＨＳがＧＳＴの結合の有無により、ＧＦＰの発現レベルを様々な度合いで増強することを示している。図５Ｂは、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｃｃｅｎｔ ＦＬ蛍光光度計（ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、最終容積４０μｌ中、約０．１ｍｇの溶解性タンパク質中のＧＦＰの蛍光を示している。前記データはＡｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔ（ＡＵ）で示しており、ＧＳＴを有するＳＵＭＯ、ＣＴＨＳ、及び融合体が蛍光を発し得るＧＦＰタンパク質を産生したため、正しく折り畳まれていたことを示す（９）。特に、ＣＴＨＳ融合タンパク質は、一貫して再生可能な方法で、全長のＳＵＭＯを有する融合体よりも多くＧＦＰを産生した。ここで示したデータに加えて、我々はより短い種類のＣＴＨＳを作成した（ＣＴＨＳ−１、図２５、配列ＩＤ：３１〜３４）。発現ＣＴＨＳ−１−ＧＦＰ融合体の分析によって、ＣＴＨＳと類似の発現レベルが得られる実証しており、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界は比較的柔軟性があり、特定の用途によって変わり得ることを示した。
【００８１】
概して、これらの結果は、細菌におけるＣＴＨＳのＧＦＰに対する融合によって、１０〜４０倍（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて出現するタンパク質バンドに基づく）或いは３〜１２倍（蛍光比較に基づく）発現レベルが増加することを示す。これらの推定値における相違は、細胞溶解物などの高濃度のタンパク質を伴った溶液においてＧＦＰを効果的にクエンチすることによって説明される。
【実施例２】
【００８２】
ＧＦＰのＮ末端に対するＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端半分の結合による切断なしでの酵母タンパク質の発現の増強
様々なＧＦＰ融合体を発現するＹｅｐに基づく全てのプラスミドの設計と作成、及びタンパク質発現分析の方法の詳細は上記に記載してきた。簡潔に述べると、ｐＥＴ２４ベクターにおいて最初に作られるコンストラクトを摘出し、ＹＥｐベクターに再クローン化した。トリプトファン欠損培地において形質転換細胞を選定した。発現は３時間誘導し、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。
【００８３】
図６は、ＹＰＤ富栄養培地において発現した場合、酵母によって産生されたＧＦＰ融合体の代表的なブロットを示している。ＣＴＨＳによる融合後、ＧＦＰの発現は１０〜２０倍増強した。しかしながら、合成倍地中、１００μＭ硫酸銅を用いて細胞を誘導した場合、５０倍近いＧＦＰの産生の増加が観察された。倍増するこのような変動は、銅イオンが富栄養培地に存在する様々な化合物とキレート化し、Ｃｕ２＋のＣＵＰプロモーター誘導機能を減少させるためだと思われる。
【００８４】
図６のデータは、明らかに、ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰ及びＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合体が切断されなかったのに対して、ＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰは酵母中で効果的に切断されたことを実証している。前記タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で予想した速度で移動し、部分的な切断は検出されなかった。
【００８５】
従って、前述の実施例は、（ａ）ＣＴＨＳがＧＦＰの発現を増強し得ること、及び（ｂ）ＣＴＨＳ−ＧＦＰが酵母中で非切断融合体を産生し得ること、を示した証拠を提供している。真核生物において非切断成分として融合体を産生することは、例えば：（１）結合親和性或いはエピトープ標識が発現した目的タンパク質に結合したままであること、（２）そのような標識がＳＵＭＯプロテアーゼによって除去され（実施例ＩＩＩ（３）参照）、さらに（３）大腸菌において産生されるあるタンパク質が、バクテリアではなく真核生物においてのみ導入され得る翻訳後の修飾がないために活性化されない、などの多大な利点を提供する。
【実施例３】
【００８６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＴＨＳ融合体の切断可能構造の再構成とＵｌｐ１による切断
切断可能な再構成構造が内在する分子基盤を図３と図４に纏めた。ＮＴＨＳと混合した場合にＣＴＨＳを有する融合体として精製されるタンパク質はＳＵＭＯ様構造になりうる。次の工程において、このＳＵＭＯ様構造を、上記で記載したような新しいアミノ末端を選択的に有する目的タンパク質を切断して放出する特異的な加水分解酵素によって認識させた。数ある中でも以下の特徴が、本発明の優位性を示すものである。
【００８７】
１）全長ＳＵＭＯ或いは他の全長Ｕｂｌｓを有する融合体とは異なるＣＴＨＳ融合タンパク質は、原核生物或いは真核生物細胞いずれにおいても切断されない（実施例ＩＩ（２）に示す）。
【００８８】
２）ＣＴＨＳ融合体とＮＴＨＳは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特異的な加水分解酵素によって認識され切断される構造になりうる（以下の実験と図７〜９を参照）。
【００８９】
３）ＳＵＭＯ加水分解酵素は高度に特異的であり、非常に耐久性のある酵素であり、例外的にｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるバイオプロセス用途に適した酵素である。
【００９０】
図７Ａは溶液中ＮＴＨＳとＣＴＨＳ−ＧＦＰを組み合わせた場合に得られる実験結果を描いており、切断可能複合体の集合と形成をもたらした。大腸菌から精製した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質は、ＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１と６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン４〜６）、６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン１〜３）、又はＵｌｐ１（レーン７〜９）と共にインキュベートした。遊離ＧＦＰの放出は全ての成分が前記反応混合物中に存在する場合にのみ観察することができた。図７Ｂは、ＮＴＨＳとＣＴＨＳの境界が固定されておらず、このシステムの機能的要素（例えばＣＴＨＳ及びＮＴＨＳ）が検出可能な切断能力への影響なしに変化しうることを示した。さらに、以下に限らないが、例えば６ｘＨｉｓ、ＧＳＴ、ＭＢＰなどの精製標識、例えばＣｙｓ残基などの固体支持体に共有結合するのを促進する配列は、ＮＴＨＳのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端いずれにも結合しうるものであった。
【００９１】
図８に表した実験は、融合タンパク質が酵母において開裂しないことを示した。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ―ＧＦＰ融合体は、ＹＥｐ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰによって形質転換された酵母細胞から部分的に精製した（図６と同様、レーン３）。Ｕｌｐ１単独或いはＮＴＨＳの存在下においてＵｌｐ１と共に、前記タンパク質をインキュベートした。全ての成分が反応混合物中に存在する場合に、遊離ＧＦＰの放出が再び観察された。
【００９２】
図９の実験は、この技術が他の融合体に適応性があることを示した。すなわち、ＣＴＨＳ−ＧＦＰは、前記融合タンパク質の産生及び精製のために使用される、例えばＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）などの大きなアフィニティー標識を持ちうるものであった。精製ＧＳＴ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質は、精製ＮＴＨＳ及びＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン４及び５）と共に、或いは前記成分の何れか１つが存在しない状態（レーン２及び３）でインキュベートした。遊離ＧＦＰは、全ての成分が前記反応混合物中に存在する場合に、効率的に放出されうるものであった。従って、ＧＳＴなどの大きな標識が使用する場合、ＳＵＭＯの再構成或いはＵｌｐ１による切断に対して障害（立体障害など）はなかった。
【００９３】
従って本発明は、真核細胞における目的タンパク質の発現とその後に続く目的タンパク質の精製を可能にするものであった。特に、大腸菌において産生される特定のタンパク質は、真核生物においてのみ発生する翻訳後修飾がないために、活性化しなかった。
【実施例４】
【００９４】
固定化ＮＴＨＳのアフィニティークロマトグラフィーによるＣＴＨＳ融合タンパク質の精製
例えば６ｘＨｉｓ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｆｌａｇ、及びＨＡエピトープなど、これらに限らないが、そのようなＣＴＨＳのアミノ末端に融合するアフィニティー標識を用いることに加えて、本発明は、更にもう１つのＣＴＨＳ精製方法を提供する。特に、ＣＴＨＳは、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの間の天然親和性を使用することによって精製した。同様に、ＵｂｌｓのＮ末端ドメインは、個別のＵｂｌｓのＣ末端ドメインに対する親和性を有すると期待されている。ＮＴＨＳ（或いは他のｕｂ様タンパク質のＮ末端ドメイン）は、例えばクロマトグラフ支持体などの固体支持体に対して結合（共有結合的或いは非共有結合的）した。さらに、例えばＣｙｓ残基或いは精製標識など固体支持体に対する共有結合を促進する配列は、ＮＴＨＳのアミノ末端或いはカルボキシ末端のいずれにも結合した。目的融合タンパク質のＣＴＨＳタンパク質（パッセンジャータンパク質としても称される）を含む溶液（例えば細胞溶解物）を、固定したＮＴＨＳを含む固体支持体に接触させることによって、目的融合タンパク質のＣＴＨＳタンパク質のアフィニティー精製を可能にした。この精製後、前記目的タンパク質は効率的に且つ正確に特定のプロテアーゼによる接合から切断した。
【００９５】
図１０に表されるデータは、固定ＮＴＨＳにおけるＣＴＨＳ融合体のアフィニティー精製の実現可能性に対して実験的証拠を提供した。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する大腸菌から得られる全溶解性タンパク質（１ｍｇ）は、特異的なタンパク質が共有結合している樹脂１５μｌ（床体積）とインキュベートした。前記樹脂は以下のように作成した。ＮＴＨＳはＮ末端（Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ）において、設計したシステイン残基と共にクローン化した。Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳが発現し、これを精製し、スルホ結合樹脂と結合させた（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。同様に処置し遮断した樹脂（空樹脂）は結合反応から得られるＣｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳを除外することによって得た。還元ＢＳＡ（レーン４）はＣｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳと同様の方法で結合した。ＩｇＧを固定化した樹脂は以下のように作成した。ウサギＩｇＧの全画分を、ＳＵＭＯ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）の免疫性を持つウサギの血清から精製した。その後ＩｇＧをグリオキサール活性化ビーズ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ；Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）に結合させた。
【００９６】
前記樹脂とタンパク質を室温で継続的に混合して１時間インキュベーションした後、前記樹脂を穏やかな遠心分離によって沈殿させて、増大濃度のＰＢＳで４回洗浄した。洗浄した樹脂を３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検体緩衝液と混合し、２分間沸騰した。各検体１０μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散させて、クーマシーで染色した。ＮＴＨＳを固定した樹脂上にあるＣＴＨＳ−ＧＦＰの顕著な存在によって、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの間の特異的な相互作用と、ＣＴＨＳ融合体の精製アプローチとを示唆した。
【００９７】
重要なことは、固定化したＮＴＨＳにおける前記ＣＴＨＳ融合タンパク質の精製によって、再構成された切断可能なＳＵＭＯ構造が得られることである。しかしながら、そのような構造は、低濃度（〜２ｍＭ）の安価な阻害剤を添加することにより、真核細胞中に元来存在するＳＵＭＯプロテアーゼによる切断から確実に保護しうるものであった。そのような阻害物質の実施例は、亜鉛、コバルト、及びその他の金属の塩を含むが、これらに限らない。ＣＴＨＳ融合タンパク質の精製後、これらの阻害物質は前記切断の進行を可能にするために、効率的にＥＤＴＡとキレート化した。
【００９８】
図１０は、ＳＵＭＯに対して産生したＩｇＧが固体支持体に結合した場合にアフィニティー基質としても使用できることも示した。このような方法で精製したＣＴＨＳ融合体は、ＮＴＨＳと接触し、目的タンパク質を切断し放出するために再構成ＳＵＭＯを産生した。
【実施例５】
【００９９】
親和性を増強させて精製効果を高めるためのＮＴＨＳ及びＣＴＨＳのアミノ酸配列の変性
ＮＴＨＳ、ＣＴＨＳ、或いはその両方の配列に突然変異を導入することにより、ＮＴＨＳとＣＴＨＳ間の親和性をさらに強化した。ＳＵＭＯ、Ｕｂ、Ｒｕｂ１、及び他のＵｂｌ１の詳細な３Ｄ構造が得られる場合、理論的アプローチを通じて様々な突然変異が予期された。指示された突然変異誘発は、例えば高い疎水性を有するアミノ酸を導入することなどに起因して、ＣＴＨＳとＮＴＨＳ間の相互作用を増強した。例えば、Ｌｅｕ８１（ＣＴＨＳ中のＥＤＬ８１ＤＭＥ（配列ＩＤ番号：８８）に位置する）近辺に存在すると思われる、Ｌｙｓ４１（ＮＴＨＳ中のＫＩＫＫ４１ＴＴＰＬ（配列ＩＤ番号：８７）に位置する）は、メチオニンなどの疎水性アミノ酸に置き換えられる。ヒトのＳＵＭＯ−１の同じ位置はメチオニンが占めているために、そのような置換は、再構成ＳＵＭＯの一部における場合は、例えばＵｌｐ１に対する基質として役立つ能力など、ＮＴＨＳのその他の特性に大概影響を与えない。
【０１００】
或いは、ＣＴＨＳ及びＮＴＨＳにおいて帯電した残基を導入しても良い。例えば、Ｌｙｓ２７（ＮＴＨＳ中のＩＮＬＫ２７ＶＳＤ（配列ＩＤ番号：９０）に位置する）の近辺に存在すると思われる、Ｉｌｅ８８（ＣＴＨＳ中のＤＮＤＩ８８ＩＥＡＨ（配列ＩＤ番号：８９）に位置する）は、例えばＧｌｕ８８などの陰性に帯電したアミノ酸と置き換えても良い。
【０１０１】
指令突然変異誘発に加えて、ランダムなＣＴＨＳ或いはＮＴＨＳの突然変異誘発を行うことも可能である。突然変異分子を結合親和性によってスクリーニングし、よい強い親和性を示すものを選別し、発現とアフィニティー精製のために使用した。
【０１０２】
ＮＴＨＳとＣＴＨＳの間の親和性を増強する別の方法は、ＮＴＨＳのＣ末端とＣＴＨＳのＮ末端に新しいアミノ酸を付加することから成る（図３の"境界"として示されている）。例えば、ＮＴＨＳのＣ末端に対して陽性に帯電した幾つかのアミノ酸残基（例えばＬｙｓ或いはＡｒｇ）を付加すること、及びＣＴＨＳのＮ末端に対して幾つかの陰性に帯電したアミノ酸残基（例えばＧｌｕ或いはＡｓｐ）を付加することは、逆帯電したアミノ酸残基の間に多様な塩橋の形成をもたらし、ＣＴＨＳとＮＴＨＳ間の相互作用を安定化する。その他の構造、ペプチド、或いは逆平行βシート、逆平行αへリックス（例えばロイシンジッパー或いはコイルドコイル）などこれらに限らないが強力に相互作用していることで知られているタンパク質、及び二両体を形成するタンパク質を、帯電したアミノ酸に対する代替物として使用しても良い。
【０１０３】
本発明の別の態様は、通常はＮＴＨＳと相互作用するＣＴＨＳの暴露された表面（ＣＴＨＳ表面とＮＴＨＳの相互作用）に強固に結合した小分子を同定するために、アフィニティー標識としてＣＴＨＳを使用することを含む。そのような分子の同定は、コンピューターに基づいて、ＣＴＨＳ表面とＮＴＨＳの相互作用（シリカにおける）の予測原子座標に対して、化学化合物の原子座標のライブラリーを選別することによって行うことが可能である。或いは、ＣＴＨＳ及びＳＵＭＯは、クロマトグラフの支持体に固定した化合物のライブラリーに対して選別することも可能である（ペプチド模倣アプローチ）。ＣＴＨＳに選択的に結合しておりＳＵＭＯには結合していない小分子の候補物質を同定することは、ＣＴＨＳ表面と相互作用するＮＴＨＳとその化合物が相互作用していることを示している。同定した化合物はその後、ＣＴＨＳ融合タンパク質を選択的に精製するために使用するが、ＳＵＭＯ化されたタンパク質及び真核生物中に元来存在する遊離ＳＵＭＯを産生するためには使用しない。シリカ或いは従来のアプローチによる化学的同定は、クロマトグラフ分離に対する親和性リガンドとしての使用に適した新たな構造を提供するためにさらに変性することが可能である。
【実施例６】
【０１０４】
ＣＴＨＳ融合タンパク質の従来のアフィニティー精製とＳＵＭＯ加水分解酵素による切断
図４Ａと４ＢはＣＴＨＳ融合タンパク質の精製と切断の実施形態を表した図及びフローチャートである。この実施例はこれらの実施形態をより詳細に説明したものである。以下の表は様々なアフィニティー標識を有するＣＴＨＳ融合体の親和性精製とその後の切断に使用可能な溶液を一覧表にしたものである。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
典型的な２５０ｍｌ培養液から、遠心分離によって検体をペレット化し、デカンテーションによって上清を除去した。一般的には、２５０ｍｌ培養液から１．０〜１．５グラムの湿潤細胞が産生した。ペレット化した細胞はその後５〜１０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。この検体は超音波処理の間、氷上に保持した。適切なチップを用いて前記検体を５０％の負荷サイクルで３〜５回超音波処理した（１０秒パルス）。ＣＴＨＳ融合体のより良く再生するために、超音波処理した検体を１％トリトンＸ−１００に調整し、４℃で３０分間インキュベートした。溶解した検体（溶解溶液中）は、１ｍｌカラムにロードした。前記カラムを５〜１０容積の洗浄緩衝液で洗浄した。このカラムを２．５ｍｌの溶出緩衝液で展開した。
【０１０７】
１ｍｌのカラムからの一般的な収率は、融合タンパク質５ｍｇであった。ＳＵＭＯ加水分解酵素による切断方法の２つの実施例は以下のように行った：すなわち１）５ｍｇのＮＴＨＳ（タンパク質予測収率と当量の濃度）の入った透析袋に５００ユニットのＳＵＭＯプロテアーゼを加えて切断を行い、４℃で一晩インキュベートした；さらに２）透析或いは脱塩（ゲルろ過）によって溶出試薬を除去し、さらにその後この検体に５ｍｇのＮＴＨＳと５００ユニットのＳＵＭＯプロテアーゼを加え、さらに室温で２時間或いは４℃で一晩インキュベートした。この切断は電気泳動ゲルで監視しても良い。上記切断法から得られる前記反応産生物は、適切なアフィニティー樹脂で充填したカラムにロードした。目的タンパク質はＮＴＨＳ、ＣＴＨＳ、及びＵｌｐ１のない流出の間に再生した。本明細書で記載したように、前記切断反応はカラムで直接行っても良い。ＳＵＭＯプロテアーゼ（Ｕｌｐ１）の１ユニットは、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、室温６０分で１５μｇの純粋なＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰ（上限９５％）を切断する酵素の量として定義した。
【０１０８】
前記切断の後、目的タンパク質を保存し、目的とする用途に直接使用するか、更なる精製工程に用いた。溶出試薬の除去（透析或いは脱塩による）及びＣＴＨＳ融合体を精製するために最初に使用した樹脂に検体を通過することによって、夾雑タンパク質の大部分を捕捉し、目的タンパク質の純度は９５％になった。
【０１０９】
当記載方法は図４に示し、３つのタンパク質成分全てにおいて同一のアフィニティー標識を使用することを主に意図した（例えば標識−ＮＴＨＳ，標識−ＣＴＨＳ−ＰａｓｓｅｎｇｅｒＰｒｏｔｅｉｎ、標識−Ｕｌｐ１）。しかしながら、用途によっては、前記標識は必ずしも同一ではなく、３つの成分全てが標識を必ずしも有するものではない。さらに、２若しくはそれ以上の標識が同じタンパク質に兼ね備えられていても良い（例えば図９に表したＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰを参照）。以下の方法で２つの標識を使用することは、精製手順を迅速化する利点がある：（１）ＧＳＴ樹脂上でのＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰの精製及びＧＳＨを用いた溶出後；（２）融合体を６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳと６ｘＨｉｓ−Ｕｌｐ１に接触させ、切断可能にするためにインキュベートした；（３）ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ、及び６ｘＨｉｓ−Ｕｌｐ１を除去するために、前記混合体を直接Ｎｉ−樹脂カラムに適用した；さらに（４）ＧＦＰ或いは目的タンパク質を流出中に再生した。選択的に、前記ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰコンストラクトは６ｘＨｉｓ標識を含まなくて良く、６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳに対するその親和性のためにＮｉ樹脂上に保持していてもよい。これらの方法は前記除去工程の前に溶出試薬を除去する必要性をなくした。
【実施例７】
【０１１０】
記載技術の使用に対する他のユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌｓ）の適合
上記で提示した実施例は、目的タンパク質の発現、精製、及び放出に対する部分的なＳＵＭＯ配列（ＣＴＨＳ及びＮＴＨＳ）の実用性を示した。原則として、ユビキチンを含むＵｂｌ（例えば表１及び図１）はいずれも類似の方法に利用し得るものである。この実施例は、他のＵｂｌの半分或いはドメインの産生方法と、類似の用途の使用方法を記述している。図３にＳＵＭＯの３Ｄ構造及びＮＴＨＳとＣＴＨＳの境界の位置を示した。図１４、１５、及び２５に、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの正確な境界位置と２種類の配列を提供したる。前記ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界は、図１４或いは図２５に示した。ＣＴＨＳとＮＴＨＳのバージョン１及びバージョン２が適合する場合でも、効率的な切断を達成した（図７Ｂ）ことに留意することが重要である。図２６は、表１に記載した各Ｕｂｌに対するＮ末端ドメイン（ＮＴＤｓ）とカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤｓ）の実施例である。ＮＴＤ及びＣＴＤ各々に対して２種類のものが与えられている。他のＵｂｌに対するＮＴＤ及びＣＴＤ（すなわち図２６に記載していないもの）は、以下のように推測し利用できる。（１）前記Ｕｂｌのアミノ酸配列は、手動或いは専門のソフトウエアを用いて、ＳＵＭＯ（図１４或いは２５）或いは他のＵｂｌ（図２６）のアミノ酸配列と協調する（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ＢＬＡＳＴにおけるアライメント対）。密接に関連することで知られている別の１つのＵｂｌ（例えばＲｕｂ１はＮｅｄｄ８と協調する）と協調するのに十分である；（２）図２６で与えられる実施例に関して境界線を測定する；（３）個別にコードされたＤＮＡ配列を遺伝子配列から推測する；（４）上述した標準的な方法によって、ＣＴＤとＮＴＤをコード化した配列をクローニングする；（５）上記で記載したように、目的タンパク質のコード配列に対してＣＴＤを機能的に連結する；（６）上記に記載したように、タンパク質を発現し精製する；及び（７）切断可能構造の再構築と特異的加水分解酵素による切断（例えばＲｕｂ１のＣＴＤとＮＴＤを使用する場合のＤＥＮ−１；図１参照）。
【実施例８】
【０１１１】
記載技術の使用に対するユビキチン折り畳みタンパク質（Ｕｂｆｓ）の適合性
実施例ＶＩＩ（７）は、ＳＵＭＯとユビキチンを含む、任意のＵｂｌの部分的な配列の（例えば表１及び図１参照）目的タンパク質の発現、精製、及び切断に対する利用可能な方法に関する情報を提供する。構造的にはＵｂｌｓは特異ではないが、進化的ではないか或いは機能的に関連しておらず、最小限の配列類似性或いは全く配列類似性がない他のタンパク質に対して容易に追跡可能な構造的類維持性を有し得ることを重視することが重要である（４４）。これらのタンパク質はユビキチン折り畳みを有するものとして分類してもよい（ベータ−Ｇｒａｓｐ折り畳み或いはベータ−Ｇｒａｓｐドメインとも呼ばれる）（２４，５４〜５９）。ユビキチン折り畳みタンパク質（Ｕｂｆｓ）の実施例は表４に提供した（文献５４〜５９も参照）。これらのタンパク質を他のものと分離し特異的な分類に定めた構造的特徴は、２１４３の順位にβシートが特異的に位置する構造中に折り畳まれた分子中にある、βシート及びαへリックスの配列（β−β−α−β−β）であった（２５）。興味深いことに、前記最初の２つのβシート（２と１）は、後の２つ（４と３）と同様に逆平行であり、最初と最後のもの（１と４）は平行であった。この配置は、β２、逆平行β１、平行β４、逆平行β３と呼ばれる。前記ユビキチン折り畳みに対してわずかな変化が観察された。構造決定基（βシートとαへリックス）の長さと接続ループは異なっていても良い。幾つかのタンパク質は更なるβシート或いはαへリックスを含んでいても良いが（例えば前記βシートにおいて過剰ならせん構造と、前記ループにおいて非常に短いヘリックスをＵｂｌｓが有する）、全体の折り畳みが（β２、逆平行β１、平行β４、逆平行β３）容易かつ明らかに認識された。毎年更新されるＵｂｆファミリーは、以下のＵＲＬにおけるＳＣＯＰデータベース（タンパク質の構造分類）において見出された（ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／ｄａｔａ／ｓｃｏｐ．ｂ．ｅ．ｂｉ．ｈｔｍｌ）。
【０１１２】
これらの配列の一部としてユビキチン折り畳み（ベータ−Ｇｒａｓｐドメイン）を含むタンパク質で利用できる文献の主要部分の注意深い分析によって、全てのドメインが組み換えタンパク質として容易に産生することを明らかにした。さらに、幾つかのデータは、これらのドメインがそのようなベータ−Ｇｒａｓｐドメインを含む大きなタンパク質を安定化する天然シャペロンとしての機能を果たすことを示した。従って、ベータ−Ｇｒａｓｐ折り畳みが、その全体或いは部分的に（例えばＣＴＨＳ）、Ｃ末端で融合した組み換えタンパク質の発現、安定性、及び溶解性を増強するために、融合パートナーとしてうまく利用できるということが、我々の結論である。重要なことは、以上に記載した全ての方法が任意のＵｂｆｓを用いて直接利用できることである。さらに、任意のＵｂｆのＮＴＤを、発現し、固体支持体に固定し、さらにＣＴＤの精製のために親和性基質として使用し、目的タンパク質と融合することが可能である。
【０１１３】
本明細書において、前記融合タンパク質の発現、安定性、及び溶解性を増強する標識としてのＵｂｆｓの使用方法と、前記目的タンパク質を有する前記ＵｂｆのＣＴＤの前記融合体を精製するための親和性基質の一部として前記ＵｂｆのＮＴＤの使用方法を提供する。図３において、ＳＵＭＯの３Ｄ構造、及びＮＴＨＤとＣＴＨＤ間のおおよその境界位置を示した。図１４、１５、及び２５において、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの正確な境界位置と２種類の配列を提供した。ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界は、図１４或いは図２５としていずれにも紹介した。図２６において表１に記載した各Ｕｂ１に対するＮＴＤとＣＴＤの実施例を提供した。図２７において表４に記載した幾つかのＵｆｄに対するＮＴＤとＣＴＤの実施例を提供した。ＮＴＤとＣＴＤ其々に対して２つのバージョンを提供した。他のＵｆｄに対するＮＴＤとＣＴＤ（すなわち図２７には記載していないもの）は、以下のように推定し利用することができる。（１）前記Ｕｆｄのアミノ酸配列（ユビキチン折り畳みドメイン）は、手動或いは専門的なソフトウエアを用いて、図２７で見出された同種のＵｆｄのアミノ酸配列と協調する（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおけるアライメント対）。密接に関連していることで知られている別のＵｆｄの１つとの協調が十分に行われる（例えばＣＩＤＡはＣＰＡＮと協調可能である）；（２）前記境界線は図２７において提供した実施例に関して決定される；（３）コーディングＤＮＡ配列はそれぞれ、遺伝子配列から推測される；（４）ＣＴＤとＮＴＤをコード化した配列のクローニングは、上述のように標準的な方法によって行われる；（５）ＣＴＤは、上述したように、目的タンパク質のコーディング配列に機能的に連結する；（６）特異的なプロテアーゼに対する認識部位（例えばＲｖＲＲなどの多塩基切断、及びトロンビン、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、及びＴｅｖの認識配列）は前記ＣＴＤの後及び前記プロテアーゼの前にコンストラクト中に設計可能である；（７）タンパク質は上述のように発現し精製される；及び（８）切断は特異的なプロテアーゼによって行われ、この反応産生物は上述したように精製される。とりわけ、本発明の観点において前記切断部位は移動可能な実体であってもよく、また、前記融合タンパク質は前記ＮＴＤ、前記切断部位、及び前記目的タンパク質を含んでいても良く、固定されたＣＴＤによって精製されても良い。
【０１１４】
仮に、溶解した第二構造に基づき、新たなタンパク質或いはその一部がユビキチン折り畳みを有するものとして分類される場合、融合標識としての使用に適した前記配列の境界は以下の基準を用いて決定することが可能である：（１）全長標識は、２つのβシート、αへリックス、及び二つのβシートに対してコーディング配列を含まなくてはならない（β２、逆平行−β１、平行−β４、逆平行−β３）；（２）次に続くβシートと共にαへリックスに接触下ループの有無にかかわらず、ＮＴＤは２つの逆平行βシートとαへリックスを含まなくてはならない（β−β−α−、しかし、前記αへリックスは必ずしも全長にあるものではない）；及び（３）余分なシート及び／又はヘリックスによって遮断されるか否かに関らず、ＣＴＤは２つの逆平行βシートを含まなくてはならない（しかし、最初のβシートは必ずしも全長でなくてもよい）。
【０１１５】
【表４】
【実施例９】
【０１１６】
タンパク質の量と質を改善するＳＵＭＯのカルボキシ末端の半分を有する融合体のタンパク質の様々な分類の実施例
ＧＦＰを発現する全てのｐＥＴベクターの設計と作成は上記に記載してきた。ＧＦＰと同様に、任意のＤＮＡ配列は６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳを有する融合体としてクローン化可能であった。さらに、例えば、上述のものと同一或いは類似の単純な切り貼り方法によって、目的の融合タンパク質の前記６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−タンパク質は、酵母（例えばＹｅｐ）、バキュロウイルス（すなわちｐＦａｓｔＢａｃ）、哺乳類（例えばｐＣＤＮＡ３）或いは他の宿主ベクターのいずれにも再クローン化することが可能であった。細胞増殖、タンパク質発現、集菌、溶解、及び融合体の精製は、上述のように行うか、或いは他の場所で記載された確立した方法の１つに従って行った。融合体の切断とＮＴＨＳとＵｌｐ１の除去は、例えば実施例ＩＩＩ（３）に記載したように行った。本明細書に記載したシステムは現在使用されている他のシステムと比べると幾つかの素晴らしい利点を有するものであった。１若しくはそれ以上のこのような利点は、本明細書で記載したシステムの使用方法が他のシステムよりも好ましいものであるという前例をつくりうるものであった。タンパク質製造に対する工業的必要性によって、以下のタンパク質分類或いはタンパク質群が、本発明の使用方法から得られる利点が最も高いものの１つとして実証されることを提案しうるものであった。発現システムを選択する場合に考慮されうる幾つかの因子は、（１）様々なシステムにおけるタンパク質の発現の成功、（２）特異的Ｎ末端の必要性、及び（３）グリコシル化の必要性、であった。これらの因子は其々、本明細書で記載したシステムによってうまく解決しうるものであった：（１）ＣＴＨＳがタンパク質の産生を増強する、（２）Ｕｌｐ１による頑強な切断が任意のアミノ末端の産生を可能にする、及び（３）昆虫或いは哺乳類細胞における発現が必要な翻訳後変性の導入を可能にする。表５において、本発明の方法で記載し使用した代表的な分子とタンパク質発現のＧｅｎＢａｎｋ受入番号を提供した。
【０１１７】
【表５】
【実施例１０】
【０１１８】
大腸菌、酵母、昆虫、及び哺乳類細胞におけるタンパク質分泌物を高めるためのＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端の半分の使用
ＣＴＨＳの基本的な特性（例えば小さいサイズでありコンパクトな構造であるなど）は、分泌信号と組み合わせてＣＴＨＳを使用することを可能にするはずである。上述した全てのベクターの設計と作成は、ＣＴＨＳのＮ末端とアフィニティー標識に機能的に連結することによって、適切な分泌信号を可能にするために使用可能であった（表６参照）。
【０１１９】
【表６】
【０１２０】
大腸菌は効率的に発現せず、中程度の大きさと大きなタンパク質を分泌し、従って、生体には好ましくなかった。しかし、特定のペプチドは効率的に発現し、非常に大量に大腸菌から分泌され（５３）、更にＣＴＨＳを有する融合体によって前記ペプチドの収率と量を更に改善することが可能であった。原核生物におけるタンパク質の細胞外産生物に対してより頻繁に用いられるシステムは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、及びその他の幾つかのものを含むものであった。他の宿主（酵母、昆虫、及び哺乳類細胞）は、細胞外タンパク質の産生にも使用した。前記分泌物は、適切に折り畳まれたタンパク質のみが分泌されることを確実にする経路を媒介する小胞体を含んでいた。従って、少なくとも幾つかの場合には、細胞外におけるタンパク質産生物は、（１）開始物質がほとんど汚染されていないタンパク質と非タンパク質性の物質を含み、さらに（２）ほとんどのタンパク質が適切に折り畳まれている、という理由により都合が良い可能性があった。捕獲においては、もし必要であれば更に精製し、ＣＴＨＳをＵｌｐ１によって都合よく切断し、適切な親和性支持体を使用して除去した。
【０１２１】
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２０．Ｋｒｅｔｚ−Ｒｅｍｙ，Ｃ．ａｎｄＲ．Ｍ．Ｔａｎｇｕａｙ，ＳＵＭＯ／ｓｅｎｔｒｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９９．７７（４）：ｐ．２９９−３０９．
２１．Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｇｉｖｅ ｓｏｌＵｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９９．６５（４）：ｐ．３８２−８．
２２．Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｋ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｚｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓ ｆｕｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｇｅｎｅ，１９８８．６７（１）：ｐ．３１−４０．２３．ｄｉ Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｅｚｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅ，１９８８．６７（１）：２１−３０．
２４．Ｌｏ Ｃｏｎｔｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＳＣＯＰ：ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０００．２８（１）：ｐ．２５７−９．
２５．Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＵＢＸ ｄｏｍａｉｎ：ａ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｍｏｄｕｌｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１．３０７（１）：ｐ．１７−２４．
２６．Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．，Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９７．１８（８）：ｐ．１２５９−３１３．
２７．Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．，Ｔｈｅ Ｎ−ｅｎｄ ｒｕｌｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００３．５（５）：ｐ．３７３−６．
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２９．Ｌｉ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｍ．Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ａ ｎｅｗ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９９．３９８（６７２４）：２４６−５１．
３０．Ｌｉ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｍ．Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ＵＬＰ２（ＳＭＴ４）ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ Ｓｍｔ３ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００．２０（７）：ｐ．２３６７−７７．
３１．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ３０−ｋＤａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ＳＵＭＯ−１ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９．２７４（４４）：ｐ．３１１３１−４．
３２．Ｇｏｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｎｔｒｉｎｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｅｎｔｒｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００．２７５（５）：ｐ．３３５５−９．
３３．Ｐｏｌｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｉｒｅ，２００２．４１６（６８７９）：ｐ．４５１−４．
３４．Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８．６７：ｐ．４２５−７９．
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３６．Ｌａｙｆｉｅｌｄ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｔｅｃｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９９．２７４（１）：ｐ．４０−９．
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４０．Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ：ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｔｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３．６０（５）：ｐ．５２３−３３．
４１．Ｌｙｔｔｌｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｙｅａｓｔ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９２．４２（７）：ｐ．６７７−８５．
４２．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，Ｇ．Ｆｌｉｎｋ，ａｎｄ Ｊ．Ｈｉｃｋｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８６．
４３．Ｗｏｏｄｓ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｇｉｅｔｚ，Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｉｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｙｅａｓｔ．ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１．１７７：ｐ．８５−９７．
４４．Ｏｒｅｎｇｏ，Ｃ．Ａ．，Ｄ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｄｏｍａｉｎ ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９４．３７２（６５０７）：ｐ．６３１−４．
４５．Ｌｉｎ，Ｚ．，Ｔ．Ｔｈｏｒｓｅｎ，ａｎｄ Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，１９９．１５（３）：ｐ．４６７−７１．
４６．ｂｉｎｇｌｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｊ．Ｆ．Ｎｏｍｅｌｌｉｎｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｓｍｉｔ，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｓ−ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｆｕｒｔｈｅｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２０００．１８２（１１）：ｐ．３２９８−３０１．
４７．Ｎｇａｍｋｉｔｉｄｅｃｈａｋｕｌ，Ｃ．ａｎｄ Ｓ．Ｓ．Ｔｗｉｎｉｎｇ，Ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｎｏｎ−ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｌａｂ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００２．３３（６）：ｐ．１２９６−３００．
４８．Ｌａｗｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｔ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ７ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２００２．２５（２）：ｐ．２５６−６２．
４９．Ｅｌｌｉｏｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｒａｌ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８６．２６１（６）：ｐ．２９３６−４１．
５０．Ｒｕｐｐ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｚｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９５．２１６（２）：ｐ．５９５−６０１．
５１．Ｔｅｓｓｉｅｒ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｏｎｅｙｂｅｅ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｇｅｎｅ，１９９１．９８（２）：ｐ．１７７−８３．
５２．Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９２．１５２（１）：ｐ．８９−１０４．
５３．Ｒａｙ，Ｍ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｍｏｎ ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２００２．２６（２）：ｐ．２４９−５９．
５４．Ｓａｋａｔａ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｋｉｎ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ Ｒｐｎ１０ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２００３ Ｍａｒ；４（３）：３０１−６．
５５．Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＭｏｅＢ−ＭｏａＤ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１ Ｎｏｖ１５；４１４（６８６１）：３２５−９．
５６．Ｔｅｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＢ１ ｄｏｍａｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＰＣ ｍｏｔｉｆ．ＥＭＢＯ Ｊ．２００１ Ａｕｇ１；２０（１５）：３９４７−５６．
５７．Ｚｈｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＦＦ４０ ａｎｄ ＤＦＦ４５ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｍｕｔｕａｌ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＦＦ４０ ａｎｄ ＤＦＦ４５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１ Ｍａｙ ２２；９８（１１）６０５１−５．
５８．Ａｒｃｕｓ ＶＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００ Ｍａｙ ２６；２９９（１）：１５７−６８．
５９．Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰ ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｙ ＤＢ．Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｆａｂ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９４ Ｎｏｖ １１；２４３（５）：９０６−１８．６０．Ｋｙｃｉａ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＦ３ ｉｓ ａｎ ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９５ Ｍａｙ ９；３４（１８）：６１８３−７．
上記において本発明の好ましい実施形態を記載し、具体的に実証してきたが、そのような実施形態が本発明を限定することを意図するものではない。以下の請求項に記載したような本発明の要旨を逸脱しない範囲でそこに様々な改良が加えられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、ユビキチンとユビキチン様タンパク質（Ｕｂ１ｓ）の接合経路を図解した模式図である。"Ｃ末端加水分解酵素"列における矢印はタンパク質前駆体の切断を示している。今までに説明した酵素のみが与えられている。特定の経路における特定の酵素を記載していないのはそのような酵素の存在を否定しているものではない。
【図２】図２は、ＣＴＨＳ融合タンパク質を産生するために使用されるクローニング方法を図で説明したものである。このクローニング方法において、ＣＴＨＳを有する融合として発現されるために前記タンパク質をコード化した核酸配列は、５’末端におけるＢｓａＩサイトと３’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓａＩサイトを導入したプライマーと共にＰＣＲによって増幅される。前記ＣＴＨＳのためにコード化したベクターは、例えばＣＴＨＳエンコード領域の前記３’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩサイトとＥｓｐ３１サイトなどを含む。前記ＰＣＲ産生物はＢｓａＩで切断され、前記ベクターはＨｉｎｄＩＩによって切断され、さらに適切な制限酵素（ここではＥｓｐ３１を意味する）によって前記ベクターに切断されたＰＣＲ産生物を挿入することが可能となる。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）タンパク質の３次元構造を示しており（１６、１７）、アミノおよびカルボキシ末端と、ＮＴＨＳとＣＴＳの間の境界を矢印で示している。図３Ａおよび３Ｂの違いは同じタンパク質の異なる眺望によるものである。前記分子の骨格は棒状の構造で示しており、高度な秩序構造は厚い矢印（βシート）またはコイル状の矢印（αへリックス）で示している。下段の２つのパネルは、ＣＴＨＳの骨格のみを示したＮＴＨＳの構造（左のパネル）と、ＮＴＨＳの構造のみを示したＣＴＨＳの構造（右のパネル）とを示したものである。ＮＴＨＳとＣＴＨＳの正確な配列は図１４と図１５に描かれている。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）タンパク質の３次元構造を示しており（１６、１７）、アミノおよびカルボキシ末端と、ＮＴＨＳとＣＴＳの間の境界を矢印で示している。図３Ａおよび３Ｂの違いは同じタンパク質の異なる眺望によるものである。前記分子の骨格は棒状の構造で示しており、高度な秩序構造は厚い矢印（βシート）またはコイル状の矢印（αへリックス）で示している。下段の２つのパネルは、ＣＴＨＳの骨格のみを示したＮＴＨＳの構造（左のパネル）と、ＮＴＨＳの構造のみを示したＣＴＨＳの構造（右のパネル）とを示したものである。ＮＴＨＳとＣＴＨＳの正確な配列は図１４と図１５に描かれている。
【図４Ａ】図４Ａは従来のアフィニティー標識と基質を用いた特定の精製スキームを含む工程を図で説明したものである。
【図４Ｂ】図４Ｂは精製スキームのフローチャートである。簡潔に述べると、切断可能なＳＵＭＯ構造は、精製ＣＴＨＳ融合タンパク質と精製ＮＴＨＳを補足することにより再構成される。再構成において、前記ＮＴＨＳ−ＣＴＨＳ構造はＵｌｐ１プロテアーゼによって切断可能になり、前記目的タンパク質は放出される。ＣＴＨＳ、ＮＴＨＳ、及びプロテアーゼの除去は、適切なアフィニティー基質のクロマトグラフィーによって成し遂げられる。アフィニティー標識の実施例は、ＧＳＴ、６ｘＨｉｓ、ＭＢＰ、およびＨＡエピトープが含まれるが、これらに制限されない。精製スキームを示すさらに詳細な説明は実施例ＶＩ（６）を参照。
【図５Ａ】図５Ａは、目的タンパク質のアミノ末端に対するＣＴＨＳの結合よって、大腸菌における発現の増強および／または前記タンパク質の溶解性を促進していることを示したクーマシー着色ゲルを示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、様々なコンストラクトを発現する細胞から得られた溶解性分画物における蛍光強度（ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓのＦｌｕｏｒｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬで測定した場合のＡｒｂｉｔａｒｙ Ｕｎｉｔｓ（ＡＵ））のグラフである。ｐＥＴ２４ｄ大腸菌において緑色蛍光タンパク質（６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ）、６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、およびＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合がエンコードされた発現ベクターは、大腸菌Ｒｏｐｓｅｔｔａ ｐＬｙｓＳ菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現された。発現は、ＬＢ培地中、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて、２６℃、２時間で誘導された。１〜６のレーン（ｌａｎｅｓ）は全細胞タンパク質を表し、７〜１２のレーンは溶解タンパク質を表す。分子量マーカーを含んだ最初のレーンのゲルは、ゲルの左側の数によってその数が示されている。矢印は前記融合タンパク質の移動位置を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、酵母細胞において発現した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロットであり、目的タンパク質のアミノ末端に対するＣＴＨＳの結合において、前記タンパク質の発現が増強し、ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合が酵母において切断されていないことを実証したものである。酵母ＢＪ１９９１株は以下のプラスミドの１つによって形質転換された：６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰ（切断可能）、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰ（切断不可）、または６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ。前記プラスミドは硫酸銅調整プロモーターの条件下において前記融合タンパク質を発現する。前記細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で沸騰させて、このサンプルの粘性を下げるために短時間超音波処理することにより全細胞抽出物を調整した。全酵母タンパク質の２０μｇを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに分散させ、ＧＦＰに対するウサギポリクローナル抗体および第２ＨＲＰ接合抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、昆虫細胞において発現した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロットであり、昆虫細胞においてＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合は切断されていないことを示したものである（レーン４と８）。ＣＴＨＳ−ＧＦＰを有するバキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞は感染後７２時間で収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で前記細胞を沸騰させ、このサンプルの粘性を下げるために短時間超音波処理して全細胞抽出物を調整した。前記全タンパク質の２０μｇを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに分散させた。酵母細胞からの抽出物は（図６Ａと同様にレーン１〜３および５〜７）は標準として使用した。抗ＧＦＰ（レーン１〜４）または抗ＳＵＭＯ抗体、および第２ＨＲＰ接合抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ＧＦＰ単独（レーン１と４）、ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（レーン２、４、６、及び８）、及びＳＵＭＯ−プロリンＧＦＰ（３と７）をロードして各タンパク質の移動位置を示した。
【図７Ａ】図７Ａは、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン１〜３）、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ、及びＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン４〜６）、またはＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン７〜９）とインキュベートした大腸菌から精製した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のクーマシー染色ゲルである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散させて、クーマシーで染色した。標準分子量は右に示している。明らかに、反応混合物中にすべての成分がある場合のみ、遊離ＧＦＰの放出が観察される。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン５〜８）及び精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン５〜６）或いは６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１（レーン７〜８）とインキュベートした大腸菌から精製した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（レーン３、５、７）及び６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−１−ＧＦＰ（レーン４、６、８）融合タンパク質のクーマシー染色ゲルである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散しクーマシーで染色した。レーン１と２は精製した６ｘＨｉｓＮＴＨＳと６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１の対照である。標準分子量は左に示している。明らかに、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの組み合わせが使用されている場合はいずれも遊離ＧＦＰが観察される。タンパク質バンドの同定はゲル右側である。
【図８】図８は、酵母細胞から部分的に精製し、ＮＴＨＳの存在下、単独（レーン１）、Ｕｌｐ１と共に（レーン２）、或いはＵｌｐ１と共に（レーン３）インキュベートした６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロットである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散し、ニトロセルロース上に転写して、抗ＧＦＰ抗体をプローブした。レーン４は、前記６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰを大腸菌から精製したレーン３と類似の反応結果を示した。
【図９】図９は、精製ＧＳＴ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のクーマシー染色ゲルであり、単独で（レーン１）、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン２）と共に、Ｕｌｐ１と共に（レーン３）、或いは精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳとＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１と共に（レーン４と５）インキュベートしたものである。レーン６はレーン４と５と類似の反応を示しているが、精製６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰと共に行ったものである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分散し、クーマシーで染色した。標準分子量の位置は左に示した。タンパク質バンドの同定はゲル右側にある。
【図１０】図１０は、固定ＮＴＨＳまたは抗ＳＵＭＯＩｇＧｓ上におけるＣＴＨＳ−ＧＦＰの精製を表したクーマシー染色ゲルである。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合を発現する大腸菌からの全溶解タンパク質（１ｍｇ）は、特定のタンパク質が共有結合で結合した樹脂１５μｌ（床容積）と共にインキュベートした。このサンプルは洗浄し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分散し、クーマシーで染色した。標準分子量は右に示している。ＣＴＨＳ−ＧＦＰの位置は右に示している。
【図１１】図１１は、昆虫細胞から精製されたＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のクーマシー染色ゲルであり、単独で（レーン２〜３）、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳと共に（レーン５〜６）、或いは精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳとＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１と共に（レーン８〜９）インキュベートしたものである。反応産生物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分散し、クーマシーで染色した。標準分子量は右に示している。明らかに、反応混合物中においてすべての成分が存在する場合のみ、遊離ＧＦＰが観察される。大腸菌から精製したＣＴＨＳ−ＧＦＰを有する反応対照は、レーン４と７に表している。タンパク質バンドの同定はゲル右側である。
【図１２】図１２は、ＳＵＭＯのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２）である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）である。
【図１３Ｂ】図１３ＢはｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯプラスミドのマップである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ（配列ＩＤ番号：３）の配列の側面に位置する領域（配列ＩＤ番号：３５）を示したものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＮＴＨＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）を示したものである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ標識ＮＴＨＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）を示したものである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＣＴＨＳのアミノ酸配列を（配列ＩＤ番号：５）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１０）を示したものである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）を示してものである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳプラスミッドのマップである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：１１）配列の側面に位置する領域（配列ＩＤ番号：３６）を示したものである。
【図１６】図１６は、ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１４）である（強化緑色蛍光タンパク質）。
【図１７】図１７は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１５）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）を示したものである。
【図１８】図１８は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１７）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１８）を示したものである。
【図１９】図１９は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１９）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２０）を示したものである。
【図２０】図２０は、Ｔｅｖプロテアーゼ認識部位のあるＧＳＴタンパク質（グルタチオントランスフェラーゼ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２２）を示したものである。
【図２１】図２１は、ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、Ｙｅｐ、およびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて発現した場合のＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）を示したものである。
【図２２】図２２は、ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合のＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）とヌクレオチド（配列ＩＤ番号：２６）を示したものである。
【図２３】図２３は、ｐＥＴ−Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳをコード化した場合のＣｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳタンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）とヌクレオチド配列を示したものである。
【図２４】図２４は、Ｕｌｐ１ＳＵＭＯプロテアーゼ（加水分解酵素）の触媒ドメインのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）とヌクレオチド（配列ＩＤ番号：３０）を示したものである。
【図２５】図２５は、ＣＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−１プラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）、ＮＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：９２）、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１プラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：９４）を示したものである。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｃは、様々なＵｂｌ１のカルボキシ末端とアミノ末端部分の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、ＳＵＭＯタンパク質で得られる結果から推定されるものであり、実施例で説明されている。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｃは、様々なＵｂｌ１のカルボキシ末端とアミノ末端部分の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、ＳＵＭＯタンパク質で得られる結果から推定されるものであり、実施例で説明されている。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜Ｃは、様々なＵｂｌ１のカルボキシ末端とアミノ末端部分の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、ＳＵＭＯタンパク質で得られる結果から推定されるものであり、実施例で説明されている。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜Ｃは、様々なＵｆｄｓ（ドメインを折り畳んだユビキチン）のカルボキシ末端とアミノ末端の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、実施例ＶＩＩＩ（８）で説明されているように、溶解性３Ｄ構造から推定される。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜Ｃは、様々なＵｆｄｓ（ドメインを折り畳んだユビキチン）のカルボキシ末端とアミノ末端の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、実施例ＶＩＩＩ（８）で説明されているように、溶解性３Ｄ構造から推定される。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜Ｃは、様々なＵｆｄｓ（ドメインを折り畳んだユビキチン）のカルボキシ末端とアミノ末端の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、実施例ＶＩＩＩ（８）で説明されているように、溶解性３Ｄ構造から推定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００３年６月２６日に出願された米国特許仮出願第６０／４８２，８１７号に対して優先権を主張するものであり、その内容は本明細書に完全に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、組換え遺伝子の発現と発現タンパク質の精製の分野に関連するものである。さらに具体的には、本発明は様々な異なる宿主種からの異種タンパク質の精製を容易にする物質と方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
幾つかの刊行物および特許書類は、本発明に関連する技術状況を説明するために、本明細書を通じて引用されるものである。これらの文献に対する完全な引用は本明細書の全般にわたって見出されえる。これらの引用はそれぞれ完全に説明するように本明細書に組み込まれる。
【０００４】
機能的遺伝子研究は、異種性発現システムにおいて生物学的に活性なタンパク質を均一に発現及び精製することができないために妨げられてきた（１）。既知の発現ベクターにおいて同一の転写および翻訳シグナルを使用しているにもかかわらず、発現タンパク質レベルは劇的に変化することが観察されてきた（２）。このような理由により、細菌、酵母、哺乳類および昆虫の細胞において遺伝子融合として異種タンパク質を発現するための様々な方法が開発されてきた。
【０００５】
細菌における前記異種間遺伝子の発現は、明らかに最も単純でありかつ研究又は商業の目的において最も安価な方法である。ただし、一部の異種間遺伝子産物は大腸菌においてそれらの正確な三次元構造を実現できておらず、過剰に生産された場合、その他の異種間遺伝子産物は大きな不溶性凝集体または"封入体"に隔離される（７、８）。主な変性剤誘導性可溶化法では、その後再折り畳み（リフォールディング）が好ましい条件下で変性剤の除去が続き、組み換えタンパク質を適当な収率で産生するために必要とされる場合が多い。構造的遺伝子計画に対するＯＲＦｓの選択によって、大腸菌において発現した遺伝子のわずか約２０％が溶解性または正しく折り畳まれたタンパク質を与えることも示している（９）。特にほとんどの科学者は遺伝子産物を発現させるための最初の試みを大腸菌に依存しているため、これらは驚くほど期待はずれな数字である。例えばＮＵＳＡ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びチオレドキシン（ＴＲＸ）などの幾つかの遺伝子融合システムが開発されてきた（７）。これらのシステムは全て、非効率的な発現から、目的の構造からの不均一な切断に及ぶ特定の欠点を有している。
【０００６】
ユビキチン（Ｕｂ）およびユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌｓ）は文献で説明されている（１０〜１２）。ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）はセントリン（Ｓｅｎｔｒｉｎ）、ＳＭＴ３、ＰＩＣ１、ＧＭＰ１、およびＵＢＬ１としても知られている。ＳＵＭＯとこのＳＵＭＯ経路は真核生物界全体に存在し、前記タンパク質は酵母からヒトまで高度に保存されている（１４）。酵母は一本鎖ＳＵＭＯ遺伝子しかなく、それはＳＭＴ３とも呼ばれている。前記酵母のＳＭＴ３遺伝子は生存に必須のものである（１３）。酵母とは異なり、３つのＳＵＭＯのメンバーが脊椎動物で示されており、それらはＳＵＭＯ−１および近接相同体であるＳＵＭＯ−２およびＳＵＭＯ−３である。１０１アミノ酸ポリペプチドから成るヒトＳＵＭＯ−１は、ヒトＳＵＭＯ−２／ＳＵＭＯ−３と５０％の配列同一性を共有している（１５）。酵母ＳＵＭＯ（ＳＭＴ３）は哺乳類ＳＵＭＯ−１と４７％の配列同一性を共有している。ユビキチンとＳＵＭＯ間の全長配列相同性はわずか１８％であるが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）による構造決定によって、２つのタンパク質が、αへリックスの１つを包み込んだβシートを折り畳んだ密集した球形によって特徴付けられる共通の３次元構造を持っていることが明らかになった。ＳＵＭＯのシャペロン特性の試験によって、密集した球形構造とタンパク質のＮ末端との付着が、折り畳み構造の核として作用し、不安定なタンパク質を保護することができることを明らかにしている。全てのＳＵＭＯ遺伝子は、保存されたＣ末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙモチーフから伸びた短いＣ−末端配列を有する前駆タンパク質をエンコードする（１３）。２〜１２のアミノ酸長である前記伸長配列は、全ての場合において異なる。細胞は前記Ｃ末端の伸長を除去する強力なＳＵＭＯプロテアーゼ（加水分解酵素としても知られている）を含む（１８）。ＳＵＭＯの前記Ｃ末端は、標的タンパク質のリジン残基のε−アミノ基と接合している。ＳＵＭＯ化経路酵素とユビキチン経路酵素の類似性は顕著であり、これらの２つのタンパク質の修飾経路に異なる影響を与える（１９）。細胞性タンパク質のＳＵＭＯ化は、核輸送、シグナル変換、ストレス反応、および細胞周期の進行を調節していると考えられている。これは様々な細胞区画の中でタンパク質のＳＵＭＯシャペロン転座に非常に類似しているが、このようなＳＵＭＯの機能の正確なメカニズムの詳細は知られていない。
【０００７】
その他の融合がパートナータンパク質の溶解性を促進するのはおそらくそれらが大きいサイズであることに起因している（例えばＮｕｓＡ）（２１）。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（２２）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（２３）を有するタンパク質の融合は、融合タンパク質の発現と収率を促進すると提案されている。しかし、ＧＳＴがＧＳＴ二量体の形態で使用されタンパク質の溶解性を遅らせることができる場合であっても、発現の増強が常に観察されるわけではない。前記目的タンパク質が前記融合から除去されなければならないかもしれないというのが、ＧＳＴまたは他の融合システムのもう１つの問題である。このような問題を回避するために、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、またはＴｅｖプロテアーゼ部位などのプロテアーゼ部位は、前記融合パートナーの下流にしばしば設計される。しかし、このような場合の多くは、前記融合タンパク質内において不完全な切断と不適切な切断が頻繁に観察される（７）。本発明はこのような問題を回避するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明に従って目的タンパク質の発現レベルを増強する組成物と方法が提供される。典型的な方法は、ｉ）前記目的タンパク質がエンコードされた核酸配列に対して、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、およびＩＳＧ１５から成る群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を機能的に連結させることによって、融合タンパク質をコード化したコンストラクトを産生する工程と、ｉｉ）宿主細胞に前記融合タンパク質をコード化した核酸を導入する工程と、を有するものである。前記目的タンパク質を精製するために、前記方法はさらに、ｉｉｉ）前記融合タンパク質を発現する細胞の溶解する工程、ｉｖ）選択的に前記アミノ末端ドメインに付着した精製標識によって、固相に固定された前記と同様のＵｂ１のアミノ末端ドメインと細胞溶解物が接触し、それにより前記Ｕｂ１が再構成される工程、及びｖ）再構成されここで切断可能になったＵｂ１を適切なＵｂ１プロテアーゼと接触させ、前記融合タンパク質から前記目的タンパク質を放出する工程、を含む。本発明の別の態様によると、工程ｉｖ）から得られる再構成された前記Ｕｂ１はカラムから溶出され、更にその後前記Ｕｂ１は溶液中で適切なプロテアーゼと接触され、前記目的タンパク質を前記融合タンパク質から放出する。本発明の別の態様によると、前記再構成されたＵｂ１は溶液中で形成され、その後固体の支持体上で精製される。さらに本発明の別の態様によると、Ｕｂ１が再構成される間、Ｕｂ１プロテアーゼ阻害剤が含まれており、これは更にその後前記Ｕｂ１プロテアーゼを添加する前に除去されるものである。
【０００９】
本発明の別の態様によると、目的タンパク質を精製するための組成物及びその方法が提供される。典型的な方法は、ｉ）目的タンパク質をコード化した核酸配列、及び目的タンパク質のアミノ末端に結合したカルボキシ末端ドメインのアミノ末端に付加された精製標識の少なくとも１つにおいてコード化した核酸に対して、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を機能的に連結することにより、融合タンパク質をコード化したコンストラクトを産生する工程、ｉｉ）宿主細胞に融合タンパク質をコード化した核酸を導入する工程、ｉｉｉ）前記融解タンパク質を発現する細胞を溶解する工程、ｉｖ）少なくとも１つの精製標識において結合可能な固形支持体と前記融解タンパク質とが接触することにより選択的に前記融合タンパク質を精製する工程、ｖ）選択的にアミノ末端ドメインに付着した精製標識によって、固相に固定された前記と同じＵｂ１のアミノ末端ドメインと溶液を含む融解タンパク質が接触し、それによりＵｂ１が再構成される工程、及びｖｉ）再構成され、ここで切断可能になったＵｂ１が適切なＵｂ１プロテアーゼと接触し、前記融合タンパク質から前記目的タンパク質を放出される工程、を含む。本発明の別の態様によると、工程ｉｖ）から得られる再構成された前記Ｕｂ１はカラムから溶出され、その後溶液中で適切なプロテアーゼと接触して融合タンパク質から前記目的タンパク質が放出される。本発明の別の実施態様によると、前記再構成されたＵｂ１は溶液中で形成され、更にその後固体支持体上で精製される。さらに本発明の別の実施態様によると、Ｕｂ１が再構成される間、Ｕｂ１プロテアーゼ阻害剤が含まれており、これはその後Ｕｂ１プロテアーゼを添加する前に除去される。さらに本発明の別の実施態様によると、前記Ｕｂ１は精製スキームの間に除去されることを確実にするために、精製標識を含んでいても良い。
【００１０】
さらに本発明の別の実施形態において、前記目的タンパク質と共に融解タンパク質を産生するために使用される分子は、配列ＩＤ番号：１０の配列を含む核酸によってエンコードされたＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端部位である。前記融解タンパク質を精製および切断するために使用される分子は、配列ＩＤ番号：６の配列を含む核酸によってエンコードされたＳＵＭＯ（ＮＴＨＳ）のアミノ末端部位である。前記再構成されたＵｂ１を切断し、それにより目的タンパク質を放出するために使用される特定の加水分解酵素（すなわちプロテアーゼ）は、配列ＩＤ番号：３０の配列を含む核酸によってエンコードされたＳＵＭＯ加水分解酵素である。
【００１１】
さらに本発明の別の実施形態おいて、改変アミノ末端を有する目的タンパク質を産生する典型的な方法が提供される。そのような方法は、目的タンパク質のアミノ末端を改変する工程と、本明細書において実証される精製方法の実施する工程とを含む。本発明の別の態様に従って、改変アミノ末端を有する目的の前記タンパク質は、ｉ）改変アミノ末端を有する前記目的タンパク質をコード化した核酸配列に対して、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を機能的に連結することにより、融合タンパク質をコード化したコンストラクトを産生する工程と、ｉｉ）宿主細胞に前記融合タンパク質をコード化した核酸を導入する工程と、ｉｉｉ）望ましい時間に、前記宿主細胞に前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端ドメインをコード化した核酸を導入する工程と、ｉｖ）再構成Ｕｂｌの切断が不十分である場合、前記宿主細胞へのＵｂｌ特異的プロテアーゼをコード化した核酸を選択的に導入する工程とを含む方法によって、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されてもよい。
【００１２】
さらに本発明の別の実施形態において、ユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂ１）分子のアミノ末端ドメインの間の親和性を増強する方法が提供される。典型的な方法は、カルボキシ末端ドメインとアミノ末端ドメインに対して機能的に連結した部位であって、前記連結部位は逆平行βシート構造、逆平行αへリックス構造、または負および正に荷電したアミノ酸を含む。本発明の別の態様に従って、ユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂ１）分子のアミノ末端ドメインの間の親和性が増強された方法が提供され、前記カルボキシ末端ドメインとアミノ末端ドメインに突然変異を挿入する工程を含み、前記突然変異は前記２つのドメインの間の疎水性を増強するか、または前記突然変異は荷電したアミノ酸を導入するものである。
【００１３】
さらに本発明の別の実施形態において、本明細書で説明される方法を実行するためのキットが提供される。そのようなキットは、所望の宿主細胞における発現に望ましいプロモーターと、目的タンパク質をコード化した核酸のクローニングに適した多重クローニング部位とに機能的に連結している、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、およびＩＳＧ１５の群から選択されるＵｂ１分子のカルボキシ末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクターを含む。前記組換えベクターは精製標識の少なくとも１つをコード化した核酸配列を含んでいてもよい。前記キットはさらに、前記融合タンパク質から再構成Ｕｂ１分子を切断できるプロテアーゼの調整を含み、選択的に、精製標識、選択的に少なくとも１つの精製標識を含むＵｂ１分子のアミノ末端部位の調整、選択的に少なくとも１つの精製標識を含むＵｂ１分子網の末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクター、少なくとも１つの精製標識に結合することができる少なくとも１つの固相、洗浄および切断緩衝剤を含む適切な緩衝剤、使用説明書、および宿主細胞の凍結ストックを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
宿主において効果的な組み換えタンパク質の発現が欠如していることに関して多くの原因があるが、例えば、半減期が短いこと、折り畳み構造が不適切であること、局在化およびコドンの偏りなどが含まれる。ヒトゲノム計画によって、ヒトゲノムのＤＮＡ"マップ"を作ることに成功したが、異なる発現基盤において均一に機能し、すべてのタンパク質モチーフに対するタンパク質発現技術の開発はまだ達成されていない。
【００１５】
本発明にしたがって、真核生物及び原核生物両方において、タンパク質の発現を改良する方法、特に無発現或いは発現力に乏しいタンパク質の発現を改良する方法が提供される。前記方法は、Ｕｂ１のカルボキシ末端部位が前記タンパク質のアミノ末端部位（すなわち目的タンパク質）に結合して発現する工程を含む。前記タンパク質のＵｂ１ファミリーは、ＳＵＭＯ、Ｕｂ、Ｒｕｂ１、Ｈｕｂ１、ＩＳＧ１５、Ｕｂｉ−Ｌ（ＭＮＳＦ）、ＦＡＴ１０、Ａｐｇ１２、Ａｐｇ８、及びＵｒｍ１を含むがこれに限らない（１２）（表１参照）。ＡＰＧ１２とＵＲＭ１を除くこれらのタンパク質の特徴は、それらが前駆体として合成されることであり、通常はジ−グリシンモチーフであるカルボキシ末端に近い位置において加水分解酵素（またはプロテアーゼ）によって処理され、成熟配列を産生することである。特に、すべての前記Ｕｂｌｓは一般的な構造を共有する（２４、２５）。
【００１６】
発現と精製を得るために全長のＳＵＭＯと他のＵｂｌｓを含む融合タンパク質を使用する方法はすでに説明されている（米国出願第１０／３３８，４４１号明細書および第１０／３８９，６４０号明細書）。全長のＳＵＭＯと目的タンパク質を含む融合タンパク質は大腸菌においてのみ原型を保つものであった。しかし、プロリンが目的タンパク質のアミノ末端残基になっている場合を除いて、酵母または昆虫細胞において前記融合タンパク質は直ちに切断されてしまった。
【００１７】
本明細書において提供される方法は、真核生物および原核生物の両方において切断される構成要素として融合タンパク質の発現を可能にする方法を提供する。重要なことは、この方法は、発現した目的タンパク質への結合を維持するために、精製、検出、或いは他の目的に使用される、選択的に結合したアフィニティー標識（例えば精製標識）又は他のタンパク質又はペプチドのいずれにおいても可能であることである。前記Ｕｂ１融合タンパク質の目的タンパク質のカルボキシ末端部位（ドメイン）のタンパク質が前記Ｕｂ１のアミノ末端部位と接触し、その後特異的な加水分解酵素と接触することによって前記Ｕｂ１が再構成される場合、切断のみが得られる。
【００１８】
本発明は、真核生物細胞において新規なＮ−末端を有するタンパク質を産生するためにも利用できる可能性がある。タンパク質の前記Ｎ−末端の同定は、その半減期によって制御されていると提案されている（Ｎ末端則 Ｎ−ｅｎｄ Ｒｕｌｅ）（３５）。成長因子、ケモカイン、及び他の細胞タンパク質など多くの生物薬剤が、治療活性のために望ましいＮ末端を必要としている。メチオニンから翻訳を開始する性質として、望ましいＮ末端を産生することは可能になっていない。さらに、１またはそれ以上のアミノ酸がＮ末端から除去されてもよく、他のアミノ酸が加えられ、暴露したＮ末端のために様々な共有結合の変化が導入されても良い（２６）。このような変化システムは、複雑であり、真核生物と原核生物の両方において存在し、特異性と性能はある程度変化する（２７）。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特異性が既知のプロテアーゼによる処理を受けなかった組み換え技術によって産生されたそれぞれのタンパク質が、予想外及び／又は異種のＮ末端を有する可能性がある。米国出願第１０／３３８，４４１号明細書及び第１０／３８９，６４０号明細書において説明されているような全長ＳＵＭＯシステムは、真核生物の発現システムに対するこのような問題を回避するための新規な方法を提供している。本発明に従うと、目的タンパク質をコード化した核酸において適切なコドンを変化することにより、任意のアミノ酸が目的タンパク質のＮ末端残基として組み込まれ得る。前記Ｕｂｌはその後、前記Ｕｂｌのアミノ末端部位と接触することによって再構成した後、特異的なプロテアーゼによって再構成されたＵｂｌが切断されることを経て、前記変性目的タンパク質がその後、Ｕｂｌのカルボキシ末端部位に結合し、望ましい細胞において発現し、さらに本明細書で説明するように精製される。あるいは、前記Ｕｂｌのアミノ末端ドメインは、細胞内（すなわち天然または外から供給されたもの）において特異的なプロテアーゼ活性が存在する限り、目的タンパク質を産生するために前記融合タンパク質と共にｉｎ ｖｉｖｏで発現されても良い。プロリンを除くすべてのアミノ酸は、これらの方法によってアミノ末端残基として使用されてもよい。前記目的タンパク質のアミノ末端残基としてプロリンを使用するために、融合タンパク質は前記Ｕｂｌプロテアーゼの切断部位の後にＭｅｔ−Ｐｒアミノ酸配列が続く。適切なプロテアーゼによる再構成と切断の後、前記目的タンパク質のＭｅｔ−Ｐｒｏアミノ末端はさらにメチオニンアミノペプチダーゼ（例えばＰｉｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ；（２８））によって処理され、メチオニンを除去し、アミノ末端としてプロリンを残す。
【００１９】
さらに、本明細書において提供される方法は、ＳＵＭＯのカルボキシ末端（ＣＴＨＳ）の半分とアミノ末端（ＮＴＨＳ）の半分（ドメイン）の間で表される部分的な配列の間における天然の親和性の活用を通じて、前記融合タンパク質の高性能親和性精製を可能にする。重要なことには、前記ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界が柔軟性を有することである。注目すべきことは、本発明がＳＵＭＯのカルボキシ末端ドメイン：ＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）及びＣＴＨＳ−１（配列ＩＤ番号：３１）の特異的かつ機能的な２つの形態を提供することである。従って、本発明は、ＣＴＨＳおよびＣＴＨＳ−１を包含し、すなわち対立遺伝子及び種の変異、及びおよそ２、４、６、８、１０、１５、及び２０のアミノ酸によって配列が延長または短縮するＣＴＨＳｓの任意のその他の変性（または相当するヌクレオチドの変化）を包含する。好ましくは、前記変性ＣＴＨＳｓは、ＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）の活性の少なくとも１つが維持されている（例えば、発現の増強、ＮＴＨＳ（配列ＩＤ番号：５）或いは変性ＮＴＨＳの結合、及び／又はＮＴＨＳ或いは変性ＮＴＨＳを有する切断可能な複合体の形成）。好ましくは、前記変性ＣＴＨＳは図３で描かれているような２つのβシートを完全にまたは重要な部位のみを含む。
【００２０】
同様に、前記ＮＴＨＳの長さを変えることが本発明に含まれる。ＳＵＭＯの前記アミノ末端ドメインの特異的かつ機能的形態によって、ＮＴＨＳ（配列ＩＤ番号：５）及びＮＴＨＳ−１（配列ＩＤ番号：９１）も提供される。本発明は、ＮＴＨＳ及びＮＴＨＳ−１、対立遺伝子及び種の変異、及びおよそ２、４、６、８、１０、１５、及び２０のアミノ酸によって前記配列が延長または短縮するＮＴＨＳｓの任意のその他の変性（又は対応するヌクレオチドにおける変化）を包含する。好ましくは、前記変性ＮＴＨＳは、ＮＴＨＳ（配列ＩＤ番号：５）の活性の少なくとも１つが維持されている（例えばＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）又は変性ＣＴＨＳに対する結合能、及び／又はＣＴＨＳ或いは変性ＣＴＨＳを有する切断可能な複合体の形成）。好ましくは、前記変性ＮＴＨＳは、図３で描かれているような２つのβシートとαへリックスを完全にまたは重要な部位のみ含む。
【００２１】
表１で説明するＵｂｌｓ（すなわち、それらの部分的な配列は図２６を参照）はいずれも、１）目的タンパク質の異種融合の発現を促進するため、２）前記融合タンパク質の親和性精製を可能にするため、３）切断のために前記Ｕｂｌを再構成するために、本発明の組成物及び方法に利用されてもよいが、ＳＵＭＯは本明細書で提供される遺伝子融合システムにおいて実証される。表２で説明する特異的な加水分解酵素（すなわちプロテアーゼ）はいずれも、前記目的タンパク質からＣＴＨＳ（或いはＳＵＭＯタンパク質又は他のＵｂｌの部分的な他の配列）を除去するために、本発明の組成物と方法に利用されるが、Ｕｌｐ１は本明細書において提供される遺伝子融合システムにおいて実証される。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
本発明の切断ＳＵＭＯ融合システムは、大腸菌と真核生物における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する適用、及びすべてのシステムから得られる最終産生物の精製に成功している。さらに具体的には、前記システムは、（１）未発現タンパク質の発現促進；（２）不溶性タンパク質の溶解性の増強；（３）部分的なＵｂｌ配列がそのＮ末端に対して融合することによって、目的タンパク質を細胞内プロテアーゼによる分解から保護すること；（４）前記Ｕｂｌそれぞれに対して固定され補足したＮ末端部位を利用した前記融合タンパク質の精製；（５）前記Ｕｂｌ或いはその一部に対して固定された特異的な抗体を利用した前記融合タンパク質の精製；（６）本物のタンパク質を効果的に産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける前記融合タンパク質の切断；（７）新規なＮ末端を有するタンパク質の産生；及び（８）例えばＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１などのＵｂｌ加水分解酵素を用いることによる、前記融合タンパク質のＮ末端配列に関係なく顕著な効果を有する融合タンパク質のすべてを切断することを可能にする。
【００２５】
重要なことは、Ｕｂｌプロテアーゼは、Ｕｂｌのアミノ酸残基数個だけでなく、各Ｕｂｌの全体構造を認識する構造特異的酵素であるということである（１６、２９、３０）。一方、組み換えタンパク質の工程において一般的に使用されるものを含む他の既知のプロテアーゼの多くは、小さいものを認識し（４〜８）、更にアミノ酸配列伸長を分解し、それにより目的タンパク質内において切断することが多い。前記各プロテアーゼの特異性と頑強性を伴った前記Ｕｂｌのプロペプチドの組み合せ（前述したような）は、組み換えタンパク質の発現、精製及び加工に対して優れたシステムを作り出す。
【００２６】
細胞内においてユビキチン化またはＳＵＭＯ化されたタンパク質の最終的な運命は変化する。タンパク質は、モノユビキチン化またはポリユビキチン化されうる。タンパク質のモノユビキチン化は主にタンパク質内在化によって調節されている（３３）。ユビキチン化は主に、２６Ｓプロテアソームに対するタンパク質を分解の標的としている（３４）。一方、標的タンパク質のＳＵＭＯ化は分解されず、むしろ直接または間接的にタンパク質の局在性を変える（１０）。脱ユビキチン化酵素は、ヒトにおいては約５０、酵素ゲノムにおいては１７存在する。これらの酵素は標的タンパク質から接合ユビキチンを切断すると同時に、ユビキチン−ユビキチン、およびユビキチン人工融合タンパク質から接合ユビキチンを切断する（３５、３６）。酵母はＵｌｐ１とＵｌｐ２と呼ばれている２つのプロテアーゼを有しており、それはリジンのε−アミノ基からＳＵＭＯを除去すると同時に、直鎖ＳＵＭＯ融合からＳＵＭＯを除去する（２９、３０）。
【００２７】
不安定であることが周知である脱ユビキチン化酵素と比較して、Ｕｌｐ１はその分解特性において際立った収率で生産し、さらに非常に安定かつ頑強であることで知られている。ＵＢＰとＵｌｐ酵素分類のこの劇的な相違は、この２つのアミノ酸配列または三次元構造に本質的に類似性がないことからすれば、驚くべきことではない（１６、３８）。ＣＴＨＳ融合は、組み換えタンパク質の収率を増進し、タンパク質精製の方法を提供し、さらに新たなＮ末端を産生し得ることから、この技術はゲノムバイオテクノロジー後の重要な分析手段を提供する。
【００２８】
本発明はまた、発現、分泌、精製、局在化、及び目的タンパク質のアミノ末端の変化の促進をもたらすために用いるキットも包含する。そのようなキットは、望ましい宿主細胞における発現に適したプロモーターと、ＵＢＬ分子のカルボキシ末端部位をコード化した核酸配列をインフレームに有する目的タンパク質をコード化した核酸をクローニングするのに適した多重クローニング部位と、に機能的に結合したＳＵＭＯ、Ｕｂ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、Ｕｂｉ−Ｌ、ＦＡＴ１０、およびＩＳＧ１５の群から選択されるＵＢＬ分子のカルボキシ末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクターを含む。前記プロモーターは、好ましくは強いプロモーターであり、さらに構成的または制御されていても良い。そのようなプロモーターは当業者によく知られており、ＡＤＨ１、Ｔ７、およびＣＵＰ１プロモーターなど後述で提供されるプロモーターを含むがこれに限らない。
【００２９】
前記組換えベクターは、前記Ｕｂｌ分子のカルボキシ末端部位をコード化した配列と共に、構造内に精製標識を少なくとも１つコード化した核酸配列を含んでいてもよい。精製標識は当業者に周知のものであり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）、ポリヒスチジン標識、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ（その後のビオチン化のため）、およびｃ−ｍｙｃエピトープを含むが、これらに限らない。精製標識を通じて融合タンパク質を精製するための物質と方法は当業者に周知であり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔａｌｏｇ，２００２，および以下の実施例を参照）。試薬は、前記精製標識に結合可能な固形支持体の少なくとも1つ、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液を含むがこれに限らず、これらがキットに含まれても良い。
【００３０】
前記キットはさらに、前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端部位の調整を有する組成物を含んでも良い。前記キットは、選択的に精製標識の少なくとも１つに機能的に連結した前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端部位をコード化した核酸配列を含む組換えベクターを含んでも良い。前記キットはさらに、融合タンパク質からＵＢＬ分子を切断できるプロテアーゼを少なくとも１つを有する組成物、切断緩衝液、宿主細胞の凍結ストック、および使用説明書をさらに含んでもよい。前記キットはさらに、野生型タンパク質を原産とするものとは異なるアミノ末端を産生するために、目的タンパク質をコード化した核酸を変性するための試薬を含んでも良い。前記核酸を変化する方法は、当業者に周知であり、部位特異的な突然変異産生、及びオリゴヌクレオチドに基づく部位特異的な突然変異産生を含むがこれに限らない（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ，２００１；Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）。
【００３１】
本明細書で用いられている"使用説明書"は、本発明方法を行なうために、本発明の組成物の実用性を伝達するために使用されうる出版物、記録、図表、又は他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの前記使用説明書は、前記キットを含む容器と一緒に出荷するために、例えば本発明のキットを含む容器に貼り付けられていても良い。或いは、前記使用説明書は、前記容器と別々に出荷されてもよく、この場合は前記使用説明書とキットは受容者が協働で使用する意向が添えてある。
【００３２】
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００３３】
本明細書で使用される"核酸"又は"核酸分子"は、一本鎖又は二重鎖の任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指しており、一本鎖の場合、その相補配列の分子は直線または円形である。核酸分子について議論する場合、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’の方向で配列を与える通常の約束事に従って本明細書に説明されてもよい。本発明の核酸に関して、"分離された核酸"という用語が時折使用される。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、それが由来する生物体の天然に生じるゲノムにおいて、直接隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、"単離された核酸"は、例えばプラスミッド又はウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子を含んでも良く、或いは原核性又は真核性細胞又は宿主生物体のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでも良い。
【００３４】
ＲＮＡに適用する場合、"単離された核酸"という用語は、上記で定義したような分離されたＤＮＡ分子によってエンコードされたＲＮＡ分子を指しても良い。或いは、前記用語は、ＲＮＡ分子がその自然状態（すなわち細胞内又は組織内）に関連した他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指してもよい。分離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）はさらに、生物学的または合成的方法によって直接産生され、その産生の間に存在する他の成分から分離された分子を意味しても良い。
【００３５】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、"特異的なハイブリダイゼーション"という用語は、当業者において一般的に使用される規定の条件下において、そのようなハイブリダイゼーションを許容するために十分に相補的な配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の関連性を指すものである（"実質的に相補的"と時折呼ばれる）。特に、前記用語は、非相補的な配列の一本鎖核酸を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に除いたものに対して、本発明の一本鎖ＤＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。様々な相補性を有する一本鎖核酸の特異的なハイブリダイゼーションを可能にするための適切な条件は、当業者に周知である。
【００３６】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密な条件を計算するための一般式の１つは、以下に説明する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％＋Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ二本鎖
【００３７】
上記の式の説明としては、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及びＧＣ含有量が４２％の５０％ホルムアミドを用い、平均プローブサイズは２００塩基であり、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖の前記Ｔｍは、相同性が１％減少するに伴い１〜１．５℃減少する。従って、約７５％より大きい配列同一性を有する目的物は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いることで観察される。例えば、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト試薬、１．０％ＳＤＳ、サケ精子の変性ＤＮＡ断片１００μｇ／ｍｌ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び最大５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いたＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（上述）の方法に従って、ハイブリダイゼーションが実施されても良い。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間で達成される。ハイブリダイゼーション後、フィルターは以下のように洗浄される：（１）２ＸＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２ＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間；（３）１ＸＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間；（４）１ＸＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、４２〜６５℃で２時間、前記溶液は３０分毎に変える。
【００３８】
前記ハイブリダイゼーションと洗浄の厳密性は、主に前記塩濃度と前記溶液の温度に依存する。一般的に、プローブをその目的物とアニーリングする速度を最大にするために、前記ハイブリダイゼーションは通常、前記ハイブリッドのＴｍ計算値が２０〜２５℃以下になる塩と温度条件下で実行される。洗浄条件は前記目的物に対する前記プローブの同一性の程度に合わせてできるだけ厳密にすべきである。一般的に、洗浄条件は前記ハイブリッドのＴｍのおよそ１２〜２０℃以下になるように選択される。本発明の核酸に関して、ある程度厳密なハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中、サケ精子の変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを４２℃でハイブリダイゼーションすることとして定義され、２ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、５５℃で１５分洗浄される。高度に厳密なハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中、サケ精子変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを４２℃でハイブリダイゼーションすることとして定義され、さらに１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間洗浄される。超高度に厳密なハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中、サケ精子変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを４２℃でハイブリダイゼーションすることとして定義され、さらに０．１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分洗浄される。
【００３９】
本明細書で用いられる"プローブ"という用語は、精製された制限酵素消化物として天然に生じる或いは合成的に産生されたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＤＮＡ分子を指し、前記プローブに対して相補的な配列を有する核酸にアニーリング可能または特異的にハイブリダイズ可能なものである。プローブは一本鎖または二本鎖であっても良い。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブの発生源、及び使用方法を含む様々な要因によって決まる。例えば、診断的適用に対しては標的配列の複雑さによって決まり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、より少ないヌクレオチドを含む可能性があるが、一般的に１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチドを含む。本発明の前記プローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に対して相補的になるように選択される。これは、前記プローブが"特異的にハイブリダイズする"ことが可能となるように、または一連の規定の条件下において標的鎖がそれぞれアニールすることが可能となるように、十分に相補的でなくてはならない。従って、前記プローブの配列は、前記標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、前記プローブの５’または３’末端に結合し、前記プローブ配列の残りは前記標的鎖に対して相補的になっている。或いは、前記プローブ配列は前記標的核酸の配列と十分に相補的な状態になっておりその後特異的にアニールするのであれば、非相補的塩基又はより長い配列は、前記プローブに散在してもよい。
【００４０】
本明細書で用いる"プライマー"という用語は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドを指し、生体系由来、制限酵素の消化による産生、又は合成的な産生、いずれに由来してもよく、適切な環境にある場合には鋳型依存核酸合成の開始剤として機能的に作用し得る。適切な核酸鋳型、適切な核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な共同因子、及び適切な温度とｐＨなどの条件が提示されている場合、前記プライマーは、ヌクレオチドの添加とポリメラーゼの作用または類似の作用によりその３’末端において伸長し、プライマーが伸長した産生物が得られる。前記プライマーは特定の条件とその適用に対する必要条件によって長さが変わってもよい。例えば、診断的適用においては、前記オリゴヌクレオチドプライマーは一般的に１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチドの長さである。前記プライマーは、目的とする伸長産生物の合成を刺激するために目的の鋳型に対して十分に相補的でなくてはならなく、これによって、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合成を開始する使用に対して適切な近位における前記プライマーの３’ヒドロキシ部位を提供するのに十分な方法で、目的とする鋳型鎖とアニールし得る。前記プライマー配列が前記目的の鋳型の正確な相補体に相当する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列は、別の相補的なプライマーの５’末端に結合されてもよい。或いは、前記プライマー配列が目的の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有し、伸長産生物を合成するために鋳型プライマー複合体が機能的に提供されるのであれば、非相補的塩基は、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在してもよい。
【００４１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は米国特許第４，６８３，１９５号公報、第４，８００，１９５号公報、および第４，９６５，１８８号公報において説明されており、これらの刊行物は本明細書に完全に組み込まれる。
【００４２】
"百分率類似性""百分率同一性"及び"百分率相同性"は、特定の配列を指す場合、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧソフトウェアプログラムにおいて説明されているものとして使用される。
【００４３】
本明細書で使用される"機能的"という用語は、核酸又はアミノ酸配列が列挙した試験又は目的に対して機能的であることを意味する。
【００４４】
核酸の特定の配列に対する"天然対立遺伝子多型""突然変異体"及び"誘導体"は、特定の配列に密接に関連した核酸配列を指すが、天然に又は設計によって、配列又は配列の変化を有していても良い。密接に関連することによって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも約７５％、しばしば９０％以上が、特定の配列ＩＤ番号を用いて参照される定義された長さの核酸配列と一致することを意味する。密接に関連する核酸配列間のヌクレオチド配列の変化または相違は、特定の核酸配列の性質において、通常の複製又は重複の過程の間に起こるヌクレオチド配列の変化に相当しても良い。その他の変化は、例えばアミノ酸コドン或いは核酸の調整領域における配列を変化させるなど、特定の目的のために前記配列が明確に設計され導入されても良い。そのような特定の変化は、様々な突然変異誘発技術を用いてｉｎ ｖｉｔｏで行われてもよく、或いは前記変化のために誘発又は選択する特定の選択条件下に置かれた宿主生命体において引き起こされても良い。発生したそのような配列の変形は具体的に、最初の配列の"突然変異体"または"誘導体"と呼ばれても良い。
【００４５】
「本質的に〜から成る」という用語は、特定のヌクレオチド又はアミノ酸を指す場合は、与えられた配列ＩＤ番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、前記用語は、配列それ自体と、前記配列の基本的な特性及び新規な特性に影響を与えない分子修飾とを含む。本明細書で用いられる"プロモーター"という用語は、組み換え産生物をコード化したＤＮＡ配列に隣接しているＤＮＡ配列を指しうる。プロモーターは隣接ＤＮＡ配列に機能的に連結されているのが好ましい。プロモーターは一般的に、プロモーターが存在しない場合に発現される組み換え産生物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現される組み換え産生物の量を増加させる。ある生命体のプロモーターは、別の生命体に由来するＤＮＡ配列の組み換え産生物の発現を増強するために利用されうる。例えば、脊椎動物のプロモーターは、脊椎動物においてクラゲＧＦＰを発現するために使用されても良い。さらに、あるプロモーターの成分が、直列に結合した多重ＤＮＡ配列によって発現される組み換え産生物の量を増加させることも可能である。従って、あるプロモーター成分は１若しくはそれ以上の組み換え産生物の発現を増強することが可能である。多重プロモーター成分は当業者に周知である。
【００４６】
本明細書で用いられる"エンハンサー"という用語は、組み換え産生物をコード化したＤＮＡ配列に隣接したＤＮＡ配列を指しうる。エンハンサー要素は一般的にプロモーター成分の上流に位置するか、或いは下流に位置しうるものであり、又はコーディングＤＮＡ配列内（例えば組み換え産生物或いは産生物に転写或いは翻訳されたＤＮＡ配列）に位置しうる。従って、エンハンサー要素は組み換え産生物をコード化したＤＮＡ配列の上流或いは下流の１００塩基対、２００塩基対、又は３００或いはそれ以上の塩基対に位置しうる。エンハンサー要素は、プロモーター要素によってもたらされる増強された発現を超えて、ＤＮＡから発現される組み換え産生物の量を増加させることが可能である。多重エンハンサー要素は当業者が容易に入手可能なものである。
【００４７】
本明細書で用いられる"形質移入した（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）"及び"形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）"という用語は、外来性ＤＮＡを細胞に誘導する方法を指す。このような方法は、例えば高濃度の塩、電場、リポソーム、ポリカチオンミセル、又は洗浄剤を用いて細胞を処理するなど様々な技術を含むものであり、目的核酸分子に対して透過性の宿主細胞の外膜或いは外壁を与える。これらの特定の方法は、限定されているものではなく、本発明は当業者に周知の任意の形質転換技術に関連するものである。
【００４８】
"レプリコン"は任意の遺伝に関する要素であり、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージ或いはウイルスであり、そのもの自身の制御の下で大部分は複製可能なものである。
【００４９】
"ベクター"は、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージ或いはウイルスなどのレプリコンであり、結合した配列或いは要素の複製をもたらすために別の遺伝子配列或いは要素（ＤＮＡ或いはＲＮＡ）が結合しうるものである。
【００５０】
"発現オペロン"は、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始信号（例えばＡＴＧ、ＡＵＧコドン）、ポリアデニル化信号、転写終結区（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）、及び同種のものなど、転写と翻訳の制御配列を有しうる核酸セグメントを指し、宿主細胞或いは生命体においてポリペプチドコード配列の発現を増強するものである。
【００５１】
本明細書で用いられる"オリゴヌクレオチド"という用語は本発明の配列、プライマー、及びプローブを指し、２若しくはそれ以上、好ましくは３以上のリボ−或いはデオキシリボヌクレオチドを有する核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、様々な因子と、前記オリゴヌクレオチドの特定の用途及び使用方法によって決まる。
【００５２】
"実質的に純粋"という用語は、与えられた物質を重量で少なくとも５０〜６０％含む調整物を指す（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、など）。さらに好ましくは、前記調整物は与えられた化合物を重量で少なくとも７５％含み、最も好ましくは重量で９０〜９５％含む。純度は与えられた化合物に適切な方法で測定される（例えば、クロマトグラフ法、アガロース或いはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析、及び類似のもの）。
【００５３】
"遺伝子"という用語は、ポリペプチドをコード化した翻訳領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を有する核酸を指し、エクソン配列および（選択的に）イントロン配列の両方を含む。前記核酸は選択的に、プロモーター或いはエンハンサー配列のような非コード配列を含んでもよい。前記"イントロン"という用語は、タンパク質には翻訳されず、一般的にエクソン間で見出される与えられた遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる"機能的に連結"という用語は、核酸配列が別の核酸配列と機能的に関連するように配置されていることを指しても良い。機能的に連結した核酸配列の実施例は、プロモーター、切断部位、精製標識、転写終結区、転写或いは適切な場合は翻訳された場合に例えばタンパク質、リボザイム、またはＲＮＡ分子などの機能的産生物を産生するエンハンサー或いはアクチベータ及び異種遺伝子、を含むが限定されない。"機能的に連結"という用語は、例えば、タンパク質の形態におけるＵｂｌのカルボキシ末端ドメインの触媒的切断活性によって目的タンパク質が放出されるように、Ｕｂｌのカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸と機能的に関連するように配置された目的タンパク質をコード化した核酸配列を指しても良い。
【００５５】
"固形支持体"という用語は、任意のチップ（例えばシリカを基盤にしたもの、ガラス、または金チップなど）、スライドガラス、膜、ビーズ、固形粒子（例えばアガロース、セファロース、ポリスチレン、又は電磁ビーズなど）、カラム（或いはカラム材料）、テストチューブ、又はマイクロタイターディッシュなど含むが限定されない任意の固形表面を指す。
【００５６】
"アフィニティー（親和性）標識""精製標識"及び"エピトープ標識"という用語は全て、目的タンパク質の精製を達成するために使用されうる標識を指しても良い。精製／アフィニティー／エピトープ標識は当業者に周知であり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）、ポリヒスチジン標識（例えば６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ（その後のビオチン化のため）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、抗体エピトープ（例えば抗体に認識され結合するアミノ酸配列）、ｃ−ｍｙｃエピトープを含むがこれらに限定されない。
【００５７】
以下に説明する物質と方法は本発明の実行を容易にするために提供される。
【００５８】
大腸菌発現ベクターの設計と作成
原型ベクターの骨格は、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２４ｄベクターを用いて作成した（図１３Ｂおよび図１５Ｃ参照）。ｐＥＴ２４ｄはＩＰＴＧを用いて誘導可能なＴ７プロモーターシステムを用いた。前記ベクターはカナマイシン選択マーカーを有しており、翻訳終結区を全く含まないものであった。アンピシリン耐性遺伝子を持っているｐＥＴ２２骨格を用いた類似のベクターも産生した。
【００５９】
６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ切断可能および切断不可能融合体の作成
アミノ末端６ｘＨｉｓ標識ＳＵＭＯ融合ベクターは以下のように作成した。ＰＣＲ産生物はプライマー５’ＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：６９）及び５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：７０）と共に変性ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）遺伝子を鋳型（（３９）Ｅｒｉｃａ Ｊｏｈｎｓｏｎ寄贈）として用いて産生した。特に、本明細書において提供される実施例全体で使用される前記ＳＵＭＯ（配列ＩＤ番号：２）は、報告されているＳＵＭＯ配列における（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２７２３３）グアニンヌクレオチドの代わりに、２２９の位置にアデニンヌクレオチドを含む。この変化によって、エンコードされたアミノ酸配列において、トレオニンの代わりにアラニンを産生する（配列ＩＤ番号：１とＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ１２３０６を比較）。以下の実施例はＳＵＭＯの変性した種類のものを使用しているが、本発明は上記に記載したＧｅｎＢａｎｋ受入番号で提供されるような"野生型"のＳＵＭＯの利用を含む。
【００６０】
ＰＣＲ断片は、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて２回の消化した後、同様に消化しておいたｐＥＴ２４ｄにライゲートした。ｅＧＦＰ配列はプライマー５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：７１）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：７２）を用いて増幅した。ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合体の切断不可能な変異体を産生するために、メチオニン（太線で示す）の代わりにプロリンコドンを有するプライマーをＰＣＲ増幅に使用した：５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：７３）。前記ＰＣＲの産生物は精製し、ＢｓａＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて２回の消化をし、その後これらを同様に消化しておいたｐＥＴ２４ｄ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯベクターにライゲートした。其々において正しい配列が存在していることを確認するためにプラスミッドの配列を決定した。
【００６１】
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ及びｐＥＴ−Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳプラスミドの作成
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳプラスミド（図１４）は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミド（図１８）を用いた逆ＰＣＲによって作成した。前記プラスミドを増幅するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：７４）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＧＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：７５）を用い、ＳＵＭＯ遺伝子とＧＦＰ遺伝子のＣ末端の半分を除去した。前記増幅産生物はＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、自己ライゲート（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｅｄ）した。固形支持体に対して共有結合（例えばスルホ結合樹脂のＰｉｅｒｃｅ；及びチオプロピル、イオドプロピル、及び他の値オール反応基を有する支持体）を達成できるように、ＮＴＨＳのＮ末端付近にシステイン残基を導入するために（図２３、配列ＩＤ番号：２７）、以下の配列のプライマー、５’−ＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：７６）及び５’−ＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：７７）を逆ＰＣＲに用いた。鋳型はｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（図１４）であった。ＰＣＲ終了後、前記産生物を精製し、ＮｃｏＩで消化し、自己ライゲートした。
【００６２】
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−Ｅ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、及びｐＥＴ−Ｓ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰプラスミドの作成
ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰプラスミドは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミドを用いた逆ＰＣＲによって作成した。前記プラスミドを増幅するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：７８）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：７９）を用い、ＳＵＭＯ遺伝子のＮ末端部位を除去した。前記増幅産生物はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、自己ライゲートした。
【００６３】
６ｘＨｉｓ標識がエンドペプチダーゼによって切取られることから保護できるように、６ｘＨｉｓ標識の後、リジンをグルタミン酸残基（単一文字表記でＥ、従って前記プラスミドの名前）に置き換えるために、（配列ＩＤ番号：７８）の代わりに、以下の配列５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：８０）のプライマーを用いることを除けば上述のように前記ＰＣＲとクローニングを行った。
【００６４】
６ｘＨｉｓ標識がエキソペプチダーゼによって切取りとられることから保護できるように、Ｓ−標識配列（４０）の部位を導入するために、２つのＮｃｏＩ適合性突出部である５’−ＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：８１）及び５’−ＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：８２）を形成するアニーリングのような方法で、以下の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。これらはＴ４ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、アニールし、さらにＮｃｏＩ消化されたｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰにクローニングした。
【００６５】
ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ及びｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰプラスミドの作成
ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミド（図２１、配列ＩＤ番号：２４）は、ＰＣＲによって増幅したＧＳＴ配列（図２０、配列ＩＤ番号：２２）をｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミッドのＮｃｏＩ部位に挿入することによって作成した。ＧＳＴ配列は、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＡＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：８３）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＴ−３’（配列ＩＤ番号：８４）を用いてｐＥＴ−ＧＳＴプラスミドから増幅し、このＰＣＲ産生物をＥｓｐ３及びＮｃｏＩを用いて消化した。ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（図２２、配列ＩＤ番号：２６）は、ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰプラスミッドを鋳型として用いた逆ＰＣＲによって産生した。前記プラスミドを増幅するために、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：７８）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：７９）を用い、ＳＵＭＯ遺伝子のＮ末端部位を除去した。前記増幅産生物はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、自己ライゲートした。
【００６６】
Ｕｌｐ１プラスミド、ＳＵＭＯプロテアーゼの発現及び精製
ＳＵＭＯ加水分解酵素／プロテアーゼＵｌｐ（４０３〜６２１）ｐ（１６，２９）の触媒ドメインは、酵母ゲノムＤＮＡから、プライマー５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：８５）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：８６）を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産生物はＮｃｏＩとＸｈｏＩを用いて消化し、ｐＥＴ２４ｄベクターにクローン化し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩｗｏ用いて消化した。得られたクローンはＣ末端Ｈｉｓ標識と共に構造内にＵｌｐ１の触媒ドメインを持っていた。前記酵素はＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現した。組み換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ｍＭ β−メルカプトエタノールに対して広範囲に透析した。−８０℃で保存する前に、前記酵素の調整液は５０％のグリセロールで調整した。
【００６７】
酵母ベクターの設計と作成
酵母を含む検体のモデルとしてサッカロマイセス・セレヴィシエを用いた。これらの試験のための発現ベクターは全て、選択可能マーカーとしてトリプトファン、複製起源として２μ、さらに目的クローン化遺伝子の発現を誘導するプロモーターをもたらす銅と共に、多コピー酵母ベクターのｐＹｅｐ上に設計した（４１）。融合体の作成は（大腸菌ベクターから切取ったＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片）は、ｐＹｅｐに直接再クローン化し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩと共に消化した。
【００６８】
組み換えバキュロウイルスの設計と作成及び昆虫細胞における融合体の発現
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＮＴＨＳとＵｌｐ１を接触させることにより、後で開裂可能な非開裂タンパク質としてのＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合体を産生することを実証するために、我々はｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。融合コンストラクト（大腸菌ベクターｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰから切取ったＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片、図２２、配列ＩＤ番号：２６）は、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを用いて消化したｐＦａｓｔＢａｃに直接再クローン化した。
【００６９】
昆虫細胞コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）からのタンパク質の分析：バキュロウイルスストックの調整と細胞増殖
ｐＦａｓｔｂａｃ１シャトルプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に基づく移入ベクターのコンストラクトは、部位特異的な統合によってＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ配列を組み換えウイルスＤＮＡに転写するために、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌適格細胞に入れ替えた。組み換えウイルス（バクミド（ｂａｃｍｉｄ））ＤＮＡを含む形質転換（白いコロニー）大腸菌細胞のアルカリ溶菌法、及び組み換えバクミドＤＮＡの抽出の後、前記バクミドＤＮＡをハスモンヨウ近似種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）昆虫細胞を形質移入するために使用し、これによりウイルス複製が起きた。その後前記ウイルスは、２代継代（長期保存のため）及び３代継代（作用のため）ウイルスストックを産生するために、新鮮なＳｆ９細胞培養物を感染させることにより増幅し、融合タンパク質を発現させるため感染細胞に対して直接使用した。ウイルス感染力（ｐｆｕ／ｍｌ）は、Ｓｆ９細胞においてＢａｃＰＡＫ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた滴定によって測定した。１ｍｌあたり１×１０６細胞濃度のＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞の培養液５０ｍｌを、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ 培地（無血清培地）中、ＭＯＩ＝５で組み換えウイルスを用いて感染させた。前記細胞は、１００ｍｌのスピナーフラスコ中２７℃で増殖した。２４時間毎に、トリパンブルーと細胞計測懸濁液０．５ｍｌを用いて細胞生存を測定した。
【００７０】
細胞と培地中の組み換えタンパク質の存在は、上清及び細胞ペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって確認した。
【００７１】
サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の増殖とタンパク質発現
酵母培養は富栄養培地中で培養した。標準酵母と大腸菌の培地は記述されているように調整した（４２）。酵母菌株ＢＪ１９９１を宿主として使用した。自己複製プラスミドを有する酵母の形質転換細胞は、酵母選択培地中で維持した。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（切断可能或いは切断不可能変異株）及びＳ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ及び６ｘＨｉｓ−Ｅ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合体は、ＴＲＰ選択マーカーを有する多コピープラスミド２μｍ中、銅メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーターによる調整の下で発現した。
【００７２】
酵母細胞は適切な発現ベクターを用いて形質移入し、単一コロニーを選択可能マーカーのない合成培地中で培養した。各タンパク質に対して、タンパク質発現のために少なくとも２つの単一コロニーを個別に分析した。細胞は５ｍｌ培養液中一晩培養し、翌日、前記培養液は新鮮な培地でＯＤ６００＝０．５になるまで希釈した。この培養液はＯＤ６００＝２．０まで培養し、１００μＭになるように硫酸銅を加えた。前記培養液は３時間誘発した。この細胞を２０００×ｇ、５分間でペレット状にし、ｐＨ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。この細胞ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中に懸濁し、５分間煮沸し、短時間の超音波処理によりＤＮＡを剥奪した。前記懸濁液は遠心分離し、１０〜２０μｌずつ等分したものを１２％ＳＤＳ−ＰＡＣＥにかけた。
【００７３】
大腸菌の増殖とタンパク質の発現
タンパク質発現の研究は、Ｒｏｓｅｔｔａ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）において実施した。この菌株はラムダＤＥ３溶原菌株に由来し、ｐＡＣＹＣに基づくプラスミドにおいてｔＲＮＡｓと共にＩＰＴＧ誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを保有していた。培養液はＬＢ培地と最少培地中、３７℃の培養温度で、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンと３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと共に培養した。前記培養液は５０倍に希釈し、２６℃まで温度が下がる期間、ｍｉｄ ｌｏｇ（６００ｎｍの光学濃度が０．５〜０．７）になるまで培養し、この培養液を１ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。この誘発は２〜５時間続けた。前細胞へのタンパク質誘導を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルーによる染色の後、前記タンパク質を分析した。
【００７４】
溶解性及び不溶性画分の分離
大腸菌は穏やかな遠心分離によって集菌し、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。この細胞は４ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、超音波で数回パルスをかけて破壊した。穏やかな遠心分離（１５００×ｇで５分間）よって壊れなかった細胞を除去し、全細胞が溶解するのを確実にするために上清を再度超音波処理した。未破壊細胞の溶解のために検出される粘着がないことを確実にするために、等分化（５μｌ）したものを２％ＳＤＳと共に混合した。前記溶菌中に未破壊細胞が残っていないことを確実にした後、細胞壁、封入体、及び膜断片から成る不溶性物質を遠心分離（１８，０００×ｇで１０分間）により沈殿させた。前記上清は"溶解画分"とみなした。
【００７５】
前記ペレットは、以下の方法で、残った溶解性タンパク質、脂質、及びペプチドグリカンのいずれも洗い流した。このペレットを６００μｌのＰＢＳに再懸濁し、この懸濁液に、３Ｍ尿素と１％トリトンＸ１００とを含む溶液６００μｌを加えた。前記懸濁液は短時間ボルテックスにかけ、上述のように不溶性物質を遠心分離によって集めた。溶解タンパク質が全て除去されることを確実にするために、前記ＰＢＳ／尿素／トリトン洗浄をさらに２回繰り返した。前記洗浄ペレットは、主に過剰発現タンパク質によって形成される封入体から成る"不溶性画分"として指定した。各画分から得られる約１０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００７６】
蛍光（ＧＦＰ活性）評価
ＧＦＰ蛍光（９）は、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｃｃｅｎｔ ＦＬ蛍光光度計（ＬａｂＳｙｓｔｅｍ；Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて、励起４８５ｎｍ／発光５１０ｎｍのフィルターを照射０．４秒にセットし、溶解性画分（最終容積４０μｌ中、溶解性タンパク質約０．１ｍｇ）で測定した。このデータはＡｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔｓ（ＡＵ）で示した。
【００７７】
ウエスタンブロット法
各レーンあたり全酵母タンパク質が２０μｇのものを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルで分離し、ニトロセルロース膜を用いた標準的な方法で電気ブロットした。抗体を用いたブロッキングとインキュベーションの前に、検体中のタンパク質量が当量であることを確実にするために、前記膜をＰｎｃｅａｕ Ｓ溶液（Ｓｉｇｍａ）で染色した。この膜はＴＴＢＳ緩衝液中５％ミルクで固定し、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｔｅｃｈ，カタログ番号８３６７）と共に１：５００希釈で一晩４℃でインキュベートした。第二ＨＲＰ接合抗体はＡｍｅｒｓｈａｍから得た。
【００７８】
タンパク質精製とＵｌｐ１を用いたｉｎ ｖｉｒｏにおける切断
溶解物の溶解性画分から得られる組み換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、この製造会社が推奨する方法で精製し、さらに実施例ＶＩ（６）にて詳細は記載した。詳細を記載した実施例ＶＩ（６）のように、前記タンパク質の切断を実施した。
【００７９】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を説明するために提供される。ＳＵＭＯは以下の実施例の範例としたが、代わりに他のＵｂｌを使用しても良い。実施例は実例であり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００８０】
ＧＦＰのＮ末端に対するＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端半分の結合による大腸菌タンパク質の発現の増強
ＧＦＰを発現する全てのｐＥＴベクターの設計とコンストラクションは上記に記載している。ＤＮＡ配列、ＳＵＭＯ、ＣＴＨＳ、ＧＳＴ、ＧＦＰの受入番号、融合体コンストラクト、プラスミドマップ、及び翻訳構造については、図１２〜２４に示す。６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、及びＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰの発現パターンは図５に示す。誘導した大腸菌細胞は超音波処理によって破壊し、溶解性タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。前記染色ゲルは（図５Ａ）に示しており、融合体は溶解性であった。不融合ＧＦＰは一般的に大腸菌において発現性に乏しいものである。前記データは、ＳＵＭＯとＣＴＨＳがＧＳＴの結合の有無により、ＧＦＰの発現レベルを様々な度合いで増強することを示している。図５Ｂは、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｃｃｅｎｔ ＦＬ蛍光光度計（ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、最終容積４０μｌ中、約０．１ｍｇの溶解性タンパク質中のＧＦＰの蛍光を示している。前記データはＡｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔ（ＡＵ）で示しており、ＧＳＴを有するＳＵＭＯ、ＣＴＨＳ、及び融合体が蛍光を発し得るＧＦＰタンパク質を産生したため、正しく折り畳まれていたことを示す（９）。特に、ＣＴＨＳ融合タンパク質は、一貫して再生可能な方法で、全長のＳＵＭＯを有する融合体よりも多くＧＦＰを産生した。ここで示したデータに加えて、我々はより短い種類のＣＴＨＳを作成した（ＣＴＨＳ−１、図２５、配列ＩＤ：３１〜３４）。発現ＣＴＨＳ−１−ＧＦＰ融合体の分析によって、ＣＴＨＳと類似の発現レベルが得られる実証しており、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界は比較的柔軟性があり、特定の用途によって変わり得ることを示した。
【００８１】
概して、これらの結果は、細菌におけるＣＴＨＳのＧＦＰに対する融合によって、１０〜４０倍（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて出現するタンパク質バンドに基づく）或いは３〜１２倍（蛍光比較に基づく）発現レベルが増加することを示す。これらの推定値における相違は、細胞溶解物などの高濃度のタンパク質を伴った溶液においてＧＦＰを効果的にクエンチすることによって説明される。
【実施例２】
【００８２】
ＧＦＰのＮ末端に対するＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端半分の結合による切断なしでの酵母タンパク質の発現の増強
様々なＧＦＰ融合体を発現するＹｅｐに基づく全てのプラスミドの設計と作成、及びタンパク質発現分析の方法の詳細は上記に記載してきた。簡潔に述べると、ｐＥＴ２４ベクターにおいて最初に作られるコンストラクトを摘出し、ＹＥｐベクターに再クローン化した。トリプトファン欠損培地において形質転換細胞を選定した。発現は３時間誘導し、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。
【００８３】
図６は、ＹＰＤ富栄養培地において発現した場合、酵母によって産生されたＧＦＰ融合体の代表的なブロットを示している。ＣＴＨＳによる融合後、ＧＦＰの発現は１０〜２０倍増強した。しかしながら、合成倍地中、１００μＭ硫酸銅を用いて細胞を誘導した場合、５０倍近いＧＦＰの産生の増加が観察された。倍増するこのような変動は、銅イオンが富栄養培地に存在する様々な化合物とキレート化し、Ｃｕ２＋のＣＵＰプロモーター誘導機能を減少させるためだと思われる。
【００８４】
図６のデータは、明らかに、ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰ及びＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合体が切断されなかったのに対して、ＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰは酵母中で効果的に切断されたことを実証している。前記タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で予想した速度で移動し、部分的な切断は検出されなかった。
【００８５】
従って、前述の実施例は、（ａ）ＣＴＨＳがＧＦＰの発現を増強し得ること、及び（ｂ）ＣＴＨＳ−ＧＦＰが酵母中で非切断融合体を産生し得ること、を示した証拠を提供している。真核生物において非切断成分として融合体を産生することは、例えば：（１）結合親和性或いはエピトープ標識が発現した目的タンパク質に結合したままであること、（２）そのような標識がＳＵＭＯプロテアーゼによって除去され（実施例ＩＩＩ（３）参照）、さらに（３）大腸菌において産生されるあるタンパク質が、バクテリアではなく真核生物においてのみ導入され得る翻訳後の修飾がないために活性化されない、などの多大な利点を提供する。
【実施例３】
【００８６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＴＨＳ融合体の切断可能構造の再構成とＵｌｐ１による切断
切断可能な再構成構造が内在する分子基盤を図３と図４に纏めた。ＮＴＨＳと混合した場合にＣＴＨＳを有する融合体として精製されるタンパク質はＳＵＭＯ様構造になりうる。次の工程において、このＳＵＭＯ様構造を、上記で記載したような新しいアミノ末端を選択的に有する目的タンパク質を切断して放出する特異的な加水分解酵素によって認識させた。数ある中でも以下の特徴が、本発明の優位性を示すものである。
【００８７】
１）全長ＳＵＭＯ或いは他の全長Ｕｂｌｓを有する融合体とは異なるＣＴＨＳ融合タンパク質は、原核生物或いは真核生物細胞いずれにおいても切断されない（実施例ＩＩ（２）に示す）。
【００８８】
２）ＣＴＨＳ融合体とＮＴＨＳは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特異的な加水分解酵素によって認識され切断される構造になりうる（以下の実験と図７〜９を参照）。
【００８９】
３）ＳＵＭＯ加水分解酵素は高度に特異的であり、非常に耐久性のある酵素であり、例外的にｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるバイオプロセス用途に適した酵素である。
【００９０】
図７Ａは溶液中ＮＴＨＳとＣＴＨＳ−ＧＦＰを組み合わせた場合に得られる実験結果を描いており、切断可能複合体の集合と形成をもたらした。大腸菌から精製した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質は、ＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１と６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン４〜６）、６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン１〜３）、又はＵｌｐ１（レーン７〜９）と共にインキュベートした。遊離ＧＦＰの放出は全ての成分が前記反応混合物中に存在する場合にのみ観察することができた。図７Ｂは、ＮＴＨＳとＣＴＨＳの境界が固定されておらず、このシステムの機能的要素（例えばＣＴＨＳ及びＮＴＨＳ）が検出可能な切断能力への影響なしに変化しうることを示した。さらに、以下に限らないが、例えば６ｘＨｉｓ、ＧＳＴ、ＭＢＰなどの精製標識、例えばＣｙｓ残基などの固体支持体に共有結合するのを促進する配列は、ＮＴＨＳのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端いずれにも結合しうるものであった。
【００９１】
図８に表した実験は、融合タンパク質が酵母において開裂しないことを示した。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ―ＧＦＰ融合体は、ＹＥｐ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰによって形質転換された酵母細胞から部分的に精製した（図６と同様、レーン３）。Ｕｌｐ１単独或いはＮＴＨＳの存在下においてＵｌｐ１と共に、前記タンパク質をインキュベートした。全ての成分が反応混合物中に存在する場合に、遊離ＧＦＰの放出が再び観察された。
【００９２】
図９の実験は、この技術が他の融合体に適応性があることを示した。すなわち、ＣＴＨＳ−ＧＦＰは、前記融合タンパク質の産生及び精製のために使用される、例えばＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）などの大きなアフィニティー標識を持ちうるものであった。精製ＧＳＴ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質は、精製ＮＴＨＳ及びＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン４及び５）と共に、或いは前記成分の何れか１つが存在しない状態（レーン２及び３）でインキュベートした。遊離ＧＦＰは、全ての成分が前記反応混合物中に存在する場合に、効率的に放出されうるものであった。従って、ＧＳＴなどの大きな標識が使用する場合、ＳＵＭＯの再構成或いはＵｌｐ１による切断に対して障害（立体障害など）はなかった。
【００９３】
従って本発明は、真核細胞における目的タンパク質の発現とその後に続く目的タンパク質の精製を可能にするものであった。特に、大腸菌において産生される特定のタンパク質は、真核生物においてのみ発生する翻訳後修飾がないために、活性化しなかった。
【実施例４】
【００９４】
固定化ＮＴＨＳのアフィニティークロマトグラフィーによるＣＴＨＳ融合タンパク質の精製
例えば６ｘＨｉｓ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｆｌａｇ、及びＨＡエピトープなど、これらに限らないが、そのようなＣＴＨＳのアミノ末端に融合するアフィニティー標識を用いることに加えて、本発明は、更にもう１つのＣＴＨＳ精製方法を提供する。特に、ＣＴＨＳは、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの間の天然親和性を使用することによって精製した。同様に、ＵｂｌｓのＮ末端ドメインは、個別のＵｂｌｓのＣ末端ドメインに対する親和性を有すると期待されている。ＮＴＨＳ（或いは他のｕｂ様タンパク質のＮ末端ドメイン）は、例えばクロマトグラフ支持体などの固体支持体に対して結合（共有結合的或いは非共有結合的）した。さらに、例えばＣｙｓ残基或いは精製標識など固体支持体に対する共有結合を促進する配列は、ＮＴＨＳのアミノ末端或いはカルボキシ末端のいずれにも結合した。目的融合タンパク質のＣＴＨＳタンパク質（パッセンジャータンパク質としても称される）を含む溶液（例えば細胞溶解物）を、固定したＮＴＨＳを含む固体支持体に接触させることによって、目的融合タンパク質のＣＴＨＳタンパク質のアフィニティー精製を可能にした。この精製後、前記目的タンパク質は効率的に且つ正確に特定のプロテアーゼによる接合から切断した。
【００９５】
図１０に表されるデータは、固定ＮＴＨＳにおけるＣＴＨＳ融合体のアフィニティー精製の実現可能性に対して実験的証拠を提供した。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する大腸菌から得られる全溶解性タンパク質（１ｍｇ）は、特異的なタンパク質が共有結合している樹脂１５μｌ（床体積）とインキュベートした。前記樹脂は以下のように作成した。ＮＴＨＳはＮ末端（Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ）において、設計したシステイン残基と共にクローン化した。Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳが発現し、これを精製し、スルホ結合樹脂と結合させた（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。同様に処置し遮断した樹脂（空樹脂）は結合反応から得られるＣｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳを除外することによって得た。還元ＢＳＡ（レーン４）はＣｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳと同様の方法で結合した。ＩｇＧを固定化した樹脂は以下のように作成した。ウサギＩｇＧの全画分を、ＳＵＭＯ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）の免疫性を持つウサギの血清から精製した。その後ＩｇＧをグリオキサール活性化ビーズ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ；Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）に結合させた。
【００９６】
前記樹脂とタンパク質を室温で継続的に混合して１時間インキュベーションした後、前記樹脂を穏やかな遠心分離によって沈殿させて、増大濃度のＰＢＳで４回洗浄した。洗浄した樹脂を３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検体緩衝液と混合し、２分間沸騰した。各検体１０μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散させて、クーマシーで染色した。ＮＴＨＳを固定した樹脂上にあるＣＴＨＳ−ＧＦＰの顕著な存在によって、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの間の特異的な相互作用と、ＣＴＨＳ融合体の精製アプローチとを示唆した。
【００９７】
重要なことは、固定化したＮＴＨＳにおける前記ＣＴＨＳ融合タンパク質の精製によって、再構成された切断可能なＳＵＭＯ構造が得られることである。しかしながら、そのような構造は、低濃度（〜２ｍＭ）の安価な阻害剤を添加することにより、真核細胞中に元来存在するＳＵＭＯプロテアーゼによる切断から確実に保護しうるものであった。そのような阻害物質の実施例は、亜鉛、コバルト、及びその他の金属の塩を含むが、これらに限らない。ＣＴＨＳ融合タンパク質の精製後、これらの阻害物質は前記切断の進行を可能にするために、効率的にＥＤＴＡとキレート化した。
【００９８】
図１０は、ＳＵＭＯに対して産生したＩｇＧが固体支持体に結合した場合にアフィニティー基質としても使用できることも示した。このような方法で精製したＣＴＨＳ融合体は、ＮＴＨＳと接触し、目的タンパク質を切断し放出するために再構成ＳＵＭＯを産生した。
【実施例５】
【００９９】
親和性を増強させて精製効果を高めるためのＮＴＨＳ及びＣＴＨＳのアミノ酸配列の変性
ＮＴＨＳ、ＣＴＨＳ、或いはその両方の配列に突然変異を導入することにより、ＮＴＨＳとＣＴＨＳ間の親和性をさらに強化した。ＳＵＭＯ、Ｕｂ、Ｒｕｂ１、及び他のＵｂｌ１の詳細な３Ｄ構造が得られる場合、理論的アプローチを通じて様々な突然変異が予期された。指示された突然変異誘発は、例えば高い疎水性を有するアミノ酸を導入することなどに起因して、ＣＴＨＳとＮＴＨＳ間の相互作用を増強した。例えば、Ｌｅｕ８１（ＣＴＨＳ中のＥＤＬ８１ＤＭＥ（配列ＩＤ番号：８８）に位置する）近辺に存在すると思われる、Ｌｙｓ４１（ＮＴＨＳ中のＫＩＫＫ４１ＴＴＰＬ（配列ＩＤ番号：８７）に位置する）は、メチオニンなどの疎水性アミノ酸に置き換えられる。ヒトのＳＵＭＯ−１の同じ位置はメチオニンが占めているために、そのような置換は、再構成ＳＵＭＯの一部における場合は、例えばＵｌｐ１に対する基質として役立つ能力など、ＮＴＨＳのその他の特性に大概影響を与えない。
【０１００】
或いは、ＣＴＨＳ及びＮＴＨＳにおいて帯電した残基を導入しても良い。例えば、Ｌｙｓ２７（ＮＴＨＳ中のＩＮＬＫ２７ＶＳＤ（配列ＩＤ番号：９０）に位置する）の近辺に存在すると思われる、Ｉｌｅ８８（ＣＴＨＳ中のＤＮＤＩ８８ＩＥＡＨ（配列ＩＤ番号：８９）に位置する）は、例えばＧｌｕ８８などの陰性に帯電したアミノ酸と置き換えても良い。
【０１０１】
指令突然変異誘発に加えて、ランダムなＣＴＨＳ或いはＮＴＨＳの突然変異誘発を行うことも可能である。突然変異分子を結合親和性によってスクリーニングし、よい強い親和性を示すものを選別し、発現とアフィニティー精製のために使用した。
【０１０２】
ＮＴＨＳとＣＴＨＳの間の親和性を増強する別の方法は、ＮＴＨＳのＣ末端とＣＴＨＳのＮ末端に新しいアミノ酸を付加することから成る（図３の"境界"として示されている）。例えば、ＮＴＨＳのＣ末端に対して陽性に帯電した幾つかのアミノ酸残基（例えばＬｙｓ或いはＡｒｇ）を付加すること、及びＣＴＨＳのＮ末端に対して幾つかの陰性に帯電したアミノ酸残基（例えばＧｌｕ或いはＡｓｐ）を付加することは、逆帯電したアミノ酸残基の間に多様な塩橋の形成をもたらし、ＣＴＨＳとＮＴＨＳ間の相互作用を安定化する。その他の構造、ペプチド、或いは逆平行βシート、逆平行αへリックス（例えばロイシンジッパー或いはコイルドコイル）などこれらに限らないが強力に相互作用していることで知られているタンパク質、及び二両体を形成するタンパク質を、帯電したアミノ酸に対する代替物として使用しても良い。
【０１０３】
本発明の別の態様は、通常はＮＴＨＳと相互作用するＣＴＨＳの暴露された表面（ＣＴＨＳ表面とＮＴＨＳの相互作用）に強固に結合した小分子を同定するために、アフィニティー標識としてＣＴＨＳを使用することを含む。そのような分子の同定は、コンピューターに基づいて、ＣＴＨＳ表面とＮＴＨＳの相互作用（シリカにおける）の予測原子座標に対して、化学化合物の原子座標のライブラリーを選別することによって行うことが可能である。或いは、ＣＴＨＳ及びＳＵＭＯは、クロマトグラフの支持体に固定した化合物のライブラリーに対して選別することも可能である（ペプチド模倣アプローチ）。ＣＴＨＳに選択的に結合しておりＳＵＭＯには結合していない小分子の候補物質を同定することは、ＣＴＨＳ表面と相互作用するＮＴＨＳとその化合物が相互作用していることを示している。同定した化合物はその後、ＣＴＨＳ融合タンパク質を選択的に精製するために使用するが、ＳＵＭＯ化されたタンパク質及び真核生物中に元来存在する遊離ＳＵＭＯを産生するためには使用しない。シリカ或いは従来のアプローチによる化学的同定は、クロマトグラフ分離に対する親和性リガンドとしての使用に適した新たな構造を提供するためにさらに変性することが可能である。
【実施例６】
【０１０４】
ＣＴＨＳ融合タンパク質の従来のアフィニティー精製とＳＵＭＯ加水分解酵素による切断
図４Ａと４ＢはＣＴＨＳ融合タンパク質の精製と切断の実施形態を表した図及びフローチャートである。この実施例はこれらの実施形態をより詳細に説明したものである。以下の表は様々なアフィニティー標識を有するＣＴＨＳ融合体の親和性精製とその後の切断に使用可能な溶液を一覧表にしたものである。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
典型的な２５０ｍｌ培養液から、遠心分離によって検体をペレット化し、デカンテーションによって上清を除去した。一般的には、２５０ｍｌ培養液から１．０〜１．５グラムの湿潤細胞が産生した。ペレット化した細胞はその後５〜１０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。この検体は超音波処理の間、氷上に保持した。適切なチップを用いて前記検体を５０％の負荷サイクルで３〜５回超音波処理した（１０秒パルス）。ＣＴＨＳ融合体のより良く再生するために、超音波処理した検体を１％トリトンＸ−１００に調整し、４℃で３０分間インキュベートした。溶解した検体（溶解溶液中）は、１ｍｌカラムにロードした。前記カラムを５〜１０容積の洗浄緩衝液で洗浄した。このカラムを２．５ｍｌの溶出緩衝液で展開した。
【０１０７】
１ｍｌのカラムからの一般的な収率は、融合タンパク質５ｍｇであった。ＳＵＭＯ加水分解酵素による切断方法の２つの実施例は以下のように行った：すなわち１）５ｍｇのＮＴＨＳ（タンパク質予測収率と当量の濃度）の入った透析袋に５００ユニットのＳＵＭＯプロテアーゼを加えて切断を行い、４℃で一晩インキュベートした；さらに２）透析或いは脱塩（ゲルろ過）によって溶出試薬を除去し、さらにその後この検体に５ｍｇのＮＴＨＳと５００ユニットのＳＵＭＯプロテアーゼを加え、さらに室温で２時間或いは４℃で一晩インキュベートした。この切断は電気泳動ゲルで監視しても良い。上記切断法から得られる前記反応産生物は、適切なアフィニティー樹脂で充填したカラムにロードした。目的タンパク質はＮＴＨＳ、ＣＴＨＳ、及びＵｌｐ１のない流出の間に再生した。本明細書で記載したように、前記切断反応はカラムで直接行っても良い。ＳＵＭＯプロテアーゼ（Ｕｌｐ１）の１ユニットは、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、室温６０分で１５μｇの純粋なＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰ（上限９５％）を切断する酵素の量として定義した。
【０１０８】
前記切断の後、目的タンパク質を保存し、目的とする用途に直接使用するか、更なる精製工程に用いた。溶出試薬の除去（透析或いは脱塩による）及びＣＴＨＳ融合体を精製するために最初に使用した樹脂に検体を通過することによって、夾雑タンパク質の大部分を捕捉し、目的タンパク質の純度は９５％になった。
【０１０９】
当記載方法は図４に示し、３つのタンパク質成分全てにおいて同一のアフィニティー標識を使用することを主に意図した（例えば標識−ＮＴＨＳ，標識−ＣＴＨＳ−ＰａｓｓｅｎｇｅｒＰｒｏｔｅｉｎ、標識−Ｕｌｐ１）。しかしながら、用途によっては、前記標識は必ずしも同一ではなく、３つの成分全てが標識を必ずしも有するものではない。さらに、２若しくはそれ以上の標識が同じタンパク質に兼ね備えられていても良い（例えば図９に表したＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰを参照）。以下の方法で２つの標識を使用することは、精製手順を迅速化する利点がある：（１）ＧＳＴ樹脂上でのＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰの精製及びＧＳＨを用いた溶出後；（２）融合体を６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳと６ｘＨｉｓ−Ｕｌｐ１に接触させ、切断可能にするためにインキュベートした；（３）ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ、及び６ｘＨｉｓ−Ｕｌｐ１を除去するために、前記混合体を直接Ｎｉ−樹脂カラムに適用した；さらに（４）ＧＦＰ或いは目的タンパク質を流出中に再生した。選択的に、前記ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰコンストラクトは６ｘＨｉｓ標識を含まなくて良く、６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳに対するその親和性のためにＮｉ樹脂上に保持していてもよい。これらの方法は前記除去工程の前に溶出試薬を除去する必要性をなくした。
【実施例７】
【０１１０】
記載技術の使用に対する他のユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌｓ）の適合
上記で提示した実施例は、目的タンパク質の発現、精製、及び放出に対する部分的なＳＵＭＯ配列（ＣＴＨＳ及びＮＴＨＳ）の実用性を示した。原則として、ユビキチンを含むＵｂｌ（例えば表１及び図１）はいずれも類似の方法に利用し得るものである。この実施例は、他のＵｂｌの半分或いはドメインの産生方法と、類似の用途の使用方法を記述している。図３にＳＵＭＯの３Ｄ構造及びＮＴＨＳとＣＴＨＳの境界の位置を示した。図１４、１５、及び２５に、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの正確な境界位置と２種類の配列を提供したる。前記ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界は、図１４或いは図２５に示した。ＣＴＨＳとＮＴＨＳのバージョン１及びバージョン２が適合する場合でも、効率的な切断を達成した（図７Ｂ）ことに留意することが重要である。図２６は、表１に記載した各Ｕｂｌに対するＮ末端ドメイン（ＮＴＤｓ）とカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤｓ）の実施例である。ＮＴＤ及びＣＴＤ各々に対して２種類のものが与えられている。他のＵｂｌに対するＮＴＤ及びＣＴＤ（すなわち図２６に記載していないもの）は、以下のように推測し利用できる。（１）前記Ｕｂｌのアミノ酸配列は、手動或いは専門のソフトウエアを用いて、ＳＵＭＯ（図１４或いは２５）或いは他のＵｂｌ（図２６）のアミノ酸配列と協調する（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ＢＬＡＳＴにおけるアライメント対）。密接に関連することで知られている別の１つのＵｂｌ（例えばＲｕｂ１はＮｅｄｄ８と協調する）と協調するのに十分である；（２）図２６で与えられる実施例に関して境界線を測定する；（３）個別にコードされたＤＮＡ配列を遺伝子配列から推測する；（４）上述した標準的な方法によって、ＣＴＤとＮＴＤをコード化した配列をクローニングする；（５）上記で記載したように、目的タンパク質のコード配列に対してＣＴＤを機能的に連結する；（６）上記に記載したように、タンパク質を発現し精製する；及び（７）切断可能構造の再構築と特異的加水分解酵素による切断（例えばＲｕｂ１のＣＴＤとＮＴＤを使用する場合のＤＥＮ−１；図１参照）。
【実施例８】
【０１１１】
記載技術の使用に対するユビキチン折り畳みタンパク質（Ｕｂｆｓ）の適合性
実施例ＶＩＩ（７）は、ＳＵＭＯとユビキチンを含む、任意のＵｂｌの部分的な配列の（例えば表１及び図１参照）目的タンパク質の発現、精製、及び切断に対する利用可能な方法に関する情報を提供する。構造的にはＵｂｌｓは特異ではないが、進化的ではないか或いは機能的に関連しておらず、最小限の配列類似性或いは全く配列類似性がない他のタンパク質に対して容易に追跡可能な構造的類維持性を有し得ることを重視することが重要である（４４）。これらのタンパク質はユビキチン折り畳みを有するものとして分類してもよい（ベータ−Ｇｒａｓｐ折り畳み或いはベータ−Ｇｒａｓｐドメインとも呼ばれる）（２４，５４〜５９）。ユビキチン折り畳みタンパク質（Ｕｂｆｓ）の実施例は表４に提供した（文献５４〜５９も参照）。これらのタンパク質を他のものと分離し特異的な分類に定めた構造的特徴は、２１４３の順位にβシートが特異的に位置する構造中に折り畳まれた分子中にある、βシート及びαへリックスの配列（β−β−α−β−β）であった（２５）。興味深いことに、前記最初の２つのβシート（２と１）は、後の２つ（４と３）と同様に逆平行であり、最初と最後のもの（１と４）は平行であった。この配置は、β２、逆平行β１、平行β４、逆平行β３と呼ばれる。前記ユビキチン折り畳みに対してわずかな変化が観察された。構造決定基（βシートとαへリックス）の長さと接続ループは異なっていても良い。幾つかのタンパク質は更なるβシート或いはαへリックスを含んでいても良いが（例えば前記βシートにおいて過剰ならせん構造と、前記ループにおいて非常に短いヘリックスをＵｂｌｓが有する）、全体の折り畳みが（β２、逆平行β１、平行β４、逆平行β３）容易かつ明らかに認識された。毎年更新されるＵｂｆファミリーは、以下のＵＲＬにおけるＳＣＯＰデータベース（タンパク質の構造分類）において見出された（ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／ｄａｔａ／ｓｃｏｐ．ｂ．ｅ．ｂｉ．ｈｔｍｌ）。
【０１１２】
これらの配列の一部としてユビキチン折り畳み（ベータ−Ｇｒａｓｐドメイン）を含むタンパク質で利用できる文献の主要部分の注意深い分析によって、全てのドメインが組み換えタンパク質として容易に産生することを明らかにした。さらに、幾つかのデータは、これらのドメインがそのようなベータ−Ｇｒａｓｐドメインを含む大きなタンパク質を安定化する天然シャペロンとしての機能を果たすことを示した。従って、ベータ−Ｇｒａｓｐ折り畳みが、その全体或いは部分的に（例えばＣＴＨＳ）、Ｃ末端で融合した組み換えタンパク質の発現、安定性、及び溶解性を増強するために、融合パートナーとしてうまく利用できるということが、我々の結論である。重要なことは、以上に記載した全ての方法が任意のＵｂｆｓを用いて直接利用できることである。さらに、任意のＵｂｆのＮＴＤを、発現し、固体支持体に固定し、さらにＣＴＤの精製のために親和性基質として使用し、目的タンパク質と融合することが可能である。
【０１１３】
本明細書において、前記融合タンパク質の発現、安定性、及び溶解性を増強する標識としてのＵｂｆｓの使用方法と、前記目的タンパク質を有する前記ＵｂｆのＣＴＤの前記融合体を精製するための親和性基質の一部として前記ＵｂｆのＮＴＤの使用方法を提供する。図３において、ＳＵＭＯの３Ｄ構造、及びＮＴＨＤとＣＴＨＤ間のおおよその境界位置を示した。図１４、１５、及び２５において、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの正確な境界位置と２種類の配列を提供した。ＣＴＨＳとＮＴＨＳの境界は、図１４或いは図２５としていずれにも紹介した。図２６において表１に記載した各Ｕｂ１に対するＮＴＤとＣＴＤの実施例を提供した。図２７において表４に記載した幾つかのＵｆｄに対するＮＴＤとＣＴＤの実施例を提供した。ＮＴＤとＣＴＤ其々に対して２つのバージョンを提供した。他のＵｆｄに対するＮＴＤとＣＴＤ（すなわち図２７には記載していないもの）は、以下のように推定し利用することができる。（１）前記Ｕｆｄのアミノ酸配列（ユビキチン折り畳みドメイン）は、手動或いは専門的なソフトウエアを用いて、図２７で見出された同種のＵｆｄのアミノ酸配列と協調する（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおけるアライメント対）。密接に関連していることで知られている別のＵｆｄの１つとの協調が十分に行われる（例えばＣＩＤＡはＣＰＡＮと協調可能である）；（２）前記境界線は図２７において提供した実施例に関して決定される；（３）コーディングＤＮＡ配列はそれぞれ、遺伝子配列から推測される；（４）ＣＴＤとＮＴＤをコード化した配列のクローニングは、上述のように標準的な方法によって行われる；（５）ＣＴＤは、上述したように、目的タンパク質のコーディング配列に機能的に連結する；（６）特異的なプロテアーゼに対する認識部位（例えばＲｖＲＲなどの多塩基切断、及びトロンビン、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、及びＴｅｖの認識配列）は前記ＣＴＤの後及び前記プロテアーゼの前にコンストラクト中に設計可能である；（７）タンパク質は上述のように発現し精製される；及び（８）切断は特異的なプロテアーゼによって行われ、この反応産生物は上述したように精製される。とりわけ、本発明の観点において前記切断部位は移動可能な実体であってもよく、また、前記融合タンパク質は前記ＮＴＤ、前記切断部位、及び前記目的タンパク質を含んでいても良く、固定されたＣＴＤによって精製されても良い。
【０１１４】
仮に、溶解した第二構造に基づき、新たなタンパク質或いはその一部がユビキチン折り畳みを有するものとして分類される場合、融合標識としての使用に適した前記配列の境界は以下の基準を用いて決定することが可能である：（１）全長標識は、２つのβシート、αへリックス、及び二つのβシートに対してコーディング配列を含まなくてはならない（β２、逆平行−β１、平行−β４、逆平行−β３）；（２）次に続くβシートと共にαへリックスに接触下ループの有無にかかわらず、ＮＴＤは２つの逆平行βシートとαへリックスを含まなくてはならない（β−β−α−、しかし、前記αへリックスは必ずしも全長にあるものではない）；及び（３）余分なシート及び／又はヘリックスによって遮断されるか否かに関らず、ＣＴＤは２つの逆平行βシートを含まなくてはならない（しかし、最初のβシートは必ずしも全長でなくてもよい）。
【０１１５】
【表４】
【実施例９】
【０１１６】
タンパク質の量と質を改善するＳＵＭＯのカルボキシ末端の半分を有する融合体のタンパク質の様々な分類の実施例
ＧＦＰを発現する全てのｐＥＴベクターの設計と作成は上記に記載してきた。ＧＦＰと同様に、任意のＤＮＡ配列は６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳを有する融合体としてクローン化可能であった。さらに、例えば、上述のものと同一或いは類似の単純な切り貼り方法によって、目的の融合タンパク質の前記６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−タンパク質は、酵母（例えばＹｅｐ）、バキュロウイルス（すなわちｐＦａｓｔＢａｃ）、哺乳類（例えばｐＣＤＮＡ３）或いは他の宿主ベクターのいずれにも再クローン化することが可能であった。細胞増殖、タンパク質発現、集菌、溶解、及び融合体の精製は、上述のように行うか、或いは他の場所で記載された確立した方法の１つに従って行った。融合体の切断とＮＴＨＳとＵｌｐ１の除去は、例えば実施例ＩＩＩ（３）に記載したように行った。本明細書に記載したシステムは現在使用されている他のシステムと比べると幾つかの素晴らしい利点を有するものであった。１若しくはそれ以上のこのような利点は、本明細書で記載したシステムの使用方法が他のシステムよりも好ましいものであるという前例をつくりうるものであった。タンパク質製造に対する工業的必要性によって、以下のタンパク質分類或いはタンパク質群が、本発明の使用方法から得られる利点が最も高いものの１つとして実証されることを提案しうるものであった。発現システムを選択する場合に考慮されうる幾つかの因子は、（１）様々なシステムにおけるタンパク質の発現の成功、（２）特異的Ｎ末端の必要性、及び（３）グリコシル化の必要性、であった。これらの因子は其々、本明細書で記載したシステムによってうまく解決しうるものであった：（１）ＣＴＨＳがタンパク質の産生を増強する、（２）Ｕｌｐ１による頑強な切断が任意のアミノ末端の産生を可能にする、及び（３）昆虫或いは哺乳類細胞における発現が必要な翻訳後変性の導入を可能にする。表５において、本発明の方法で記載し使用した代表的な分子とタンパク質発現のＧｅｎＢａｎｋ受入番号を提供した。
【０１１７】
【表５】
【実施例１０】
【０１１８】
大腸菌、酵母、昆虫、及び哺乳類細胞におけるタンパク質分泌物を高めるためのＳＵＭＯ（ＣＴＨＳ）のカルボキシ末端の半分の使用
ＣＴＨＳの基本的な特性（例えば小さいサイズでありコンパクトな構造であるなど）は、分泌信号と組み合わせてＣＴＨＳを使用することを可能にするはずである。上述した全てのベクターの設計と作成は、ＣＴＨＳのＮ末端とアフィニティー標識に機能的に連結することによって、適切な分泌信号を可能にするために使用可能であった（表６参照）。
【０１１９】
【表６】
【０１２０】
大腸菌は効率的に発現せず、中程度の大きさと大きなタンパク質を分泌し、従って、生体には好ましくなかった。しかし、特定のペプチドは効率的に発現し、非常に大量に大腸菌から分泌され（５３）、更にＣＴＨＳを有する融合体によって前記ペプチドの収率と量を更に改善することが可能であった。原核生物におけるタンパク質の細胞外産生物に対してより頻繁に用いられるシステムは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、及びその他の幾つかのものを含むものであった。他の宿主（酵母、昆虫、及び哺乳類細胞）は、細胞外タンパク質の産生にも使用した。前記分泌物は、適切に折り畳まれたタンパク質のみが分泌されることを確実にする経路を媒介する小胞体を含んでいた。従って、少なくとも幾つかの場合には、細胞外におけるタンパク質産生物は、（１）開始物質がほとんど汚染されていないタンパク質と非タンパク質性の物質を含み、さらに（２）ほとんどのタンパク質が適切に折り畳まれている、という理由により都合が良い可能性があった。捕獲においては、もし必要であれば更に精製し、ＣＴＨＳをＵｌｐ１によって都合よく切断し、適切な親和性支持体を使用して除去した。
【０１２１】
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５７．Ｚｈｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＦＦ４０ ａｎｄ ＤＦＦ４５ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｍｕｔｕａｌ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＦＦ４０ ａｎｄ ＤＦＦ４５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１ Ｍａｙ ２２；９８（１１）６０５１−５．
５８．Ａｒｃｕｓ ＶＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００ Ｍａｙ ２６；２９９（１）：１５７−６８．
５９．Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰ ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｙ ＤＢ．Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｆａｂ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９４ Ｎｏｖ １１；２４３（５）：９０６−１８．６０．Ｋｙｃｉａ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＦ３ ｉｓ ａｎ ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９５ Ｍａｙ ９；３４（１８）：６１８３−７．
上記において本発明の好ましい実施形態を記載し、具体的に実証してきたが、そのような実施形態が本発明を限定することを意図するものではない。以下の請求項に記載したような本発明の要旨を逸脱しない範囲でそこに様々な改良が加えられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、ユビキチンとユビキチン様タンパク質（Ｕｂ１ｓ）の接合経路を図解した模式図である。"Ｃ末端加水分解酵素"列における矢印はタンパク質前駆体の切断を示している。今までに説明した酵素のみが与えられている。特定の経路における特定の酵素を記載していないのはそのような酵素の存在を否定しているものではない。
【図２】図２は、ＣＴＨＳ融合タンパク質を産生するために使用されるクローニング方法を図で説明したものである。このクローニング方法において、ＣＴＨＳを有する融合として発現されるために前記タンパク質をコード化した核酸配列は、５’末端におけるＢｓａＩサイトと３’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓａＩサイトを導入したプライマーと共にＰＣＲによって増幅される。前記ＣＴＨＳのためにコード化したベクターは、例えばＣＴＨＳエンコード領域の前記３’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩサイトとＥｓｐ３１サイトなどを含む。前記ＰＣＲ産生物はＢｓａＩで切断され、前記ベクターはＨｉｎｄＩＩによって切断され、さらに適切な制限酵素（ここではＥｓｐ３１を意味する）によって前記ベクターに切断されたＰＣＲ産生物を挿入することが可能となる。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）タンパク質の３次元構造を示しており（１６、１７）、アミノおよびカルボキシ末端と、ＮＴＨＳとＣＴＳの間の境界を矢印で示している。図３Ａおよび３Ｂの違いは同じタンパク質の異なる眺望によるものである。前記分子の骨格は棒状の構造で示しており、高度な秩序構造は厚い矢印（βシート）またはコイル状の矢印（αへリックス）で示している。下段の２つのパネルは、ＣＴＨＳの骨格のみを示したＮＴＨＳの構造（左のパネル）と、ＮＴＨＳの構造のみを示したＣＴＨＳの構造（右のパネル）とを示したものである。ＮＴＨＳとＣＴＨＳの正確な配列は図１４と図１５に描かれている。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）タンパク質の３次元構造を示しており（１６、１７）、アミノおよびカルボキシ末端と、ＮＴＨＳとＣＴＳの間の境界を矢印で示している。図３Ａおよび３Ｂの違いは同じタンパク質の異なる眺望によるものである。前記分子の骨格は棒状の構造で示しており、高度な秩序構造は厚い矢印（βシート）またはコイル状の矢印（αへリックス）で示している。下段の２つのパネルは、ＣＴＨＳの骨格のみを示したＮＴＨＳの構造（左のパネル）と、ＮＴＨＳの構造のみを示したＣＴＨＳの構造（右のパネル）とを示したものである。ＮＴＨＳとＣＴＨＳの正確な配列は図１４と図１５に描かれている。
【図４Ａ】図４Ａは従来のアフィニティー標識と基質を用いた特定の精製スキームを含む工程を図で説明したものである。
【図４Ｂ】図４Ｂは精製スキームのフローチャートである。簡潔に述べると、切断可能なＳＵＭＯ構造は、精製ＣＴＨＳ融合タンパク質と精製ＮＴＨＳを補足することにより再構成される。再構成において、前記ＮＴＨＳ−ＣＴＨＳ構造はＵｌｐ１プロテアーゼによって切断可能になり、前記目的タンパク質は放出される。ＣＴＨＳ、ＮＴＨＳ、及びプロテアーゼの除去は、適切なアフィニティー基質のクロマトグラフィーによって成し遂げられる。アフィニティー標識の実施例は、ＧＳＴ、６ｘＨｉｓ、ＭＢＰ、およびＨＡエピトープが含まれるが、これらに制限されない。精製スキームを示すさらに詳細な説明は実施例ＶＩ（６）を参照。
【図５Ａ】図５Ａは、目的タンパク質のアミノ末端に対するＣＴＨＳの結合よって、大腸菌における発現の増強および／または前記タンパク質の溶解性を促進していることを示したクーマシー着色ゲルを示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、様々なコンストラクトを発現する細胞から得られた溶解性分画物における蛍光強度（ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓのＦｌｕｏｒｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬで測定した場合のＡｒｂｉｔａｒｙ Ｕｎｉｔｓ（ＡＵ））のグラフである。ｐＥＴ２４ｄ大腸菌において緑色蛍光タンパク質（６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ）、６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、およびＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合がエンコードされた発現ベクターは、大腸菌Ｒｏｐｓｅｔｔａ ｐＬｙｓＳ菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現された。発現は、ＬＢ培地中、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて、２６℃、２時間で誘導された。１〜６のレーン（ｌａｎｅｓ）は全細胞タンパク質を表し、７〜１２のレーンは溶解タンパク質を表す。分子量マーカーを含んだ最初のレーンのゲルは、ゲルの左側の数によってその数が示されている。矢印は前記融合タンパク質の移動位置を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、酵母細胞において発現した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロットであり、目的タンパク質のアミノ末端に対するＣＴＨＳの結合において、前記タンパク質の発現が増強し、ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合が酵母において切断されていないことを実証したものである。酵母ＢＪ１９９１株は以下のプラスミドの１つによって形質転換された：６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰ（切断可能）、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰ（切断不可）、または６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ。前記プラスミドは硫酸銅調整プロモーターの条件下において前記融合タンパク質を発現する。前記細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で沸騰させて、このサンプルの粘性を下げるために短時間超音波処理することにより全細胞抽出物を調整した。全酵母タンパク質の２０μｇを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに分散させ、ＧＦＰに対するウサギポリクローナル抗体および第２ＨＲＰ接合抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、昆虫細胞において発現した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロットであり、昆虫細胞においてＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合は切断されていないことを示したものである（レーン４と８）。ＣＴＨＳ−ＧＦＰを有するバキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞は感染後７２時間で収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で前記細胞を沸騰させ、このサンプルの粘性を下げるために短時間超音波処理して全細胞抽出物を調整した。前記全タンパク質の２０μｇを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに分散させた。酵母細胞からの抽出物は（図６Ａと同様にレーン１〜３および５〜７）は標準として使用した。抗ＧＦＰ（レーン１〜４）または抗ＳＵＭＯ抗体、および第２ＨＲＰ接合抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ＧＦＰ単独（レーン１と４）、ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（レーン２、４、６、及び８）、及びＳＵＭＯ−プロリンＧＦＰ（３と７）をロードして各タンパク質の移動位置を示した。
【図７Ａ】図７Ａは、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン１〜３）、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ、及びＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン４〜６）、またはＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン７〜９）とインキュベートした大腸菌から精製した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のクーマシー染色ゲルである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散させて、クーマシーで染色した。標準分子量は右に示している。明らかに、反応混合物中にすべての成分がある場合のみ、遊離ＧＦＰの放出が観察される。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１（レーン５〜８）及び精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン５〜６）或いは６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１（レーン７〜８）とインキュベートした大腸菌から精製した６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ（レーン３、５、７）及び６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−１−ＧＦＰ（レーン４、６、８）融合タンパク質のクーマシー染色ゲルである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散しクーマシーで染色した。レーン１と２は精製した６ｘＨｉｓＮＴＨＳと６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１の対照である。標準分子量は左に示している。明らかに、ＣＴＨＳとＮＴＨＳの組み合わせが使用されている場合はいずれも遊離ＧＦＰが観察される。タンパク質バンドの同定はゲル右側である。
【図８】図８は、酵母細胞から部分的に精製し、ＮＴＨＳの存在下、単独（レーン１）、Ｕｌｐ１と共に（レーン２）、或いはＵｌｐ１と共に（レーン３）インキュベートした６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロットである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに分散し、ニトロセルロース上に転写して、抗ＧＦＰ抗体をプローブした。レーン４は、前記６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰを大腸菌から精製したレーン３と類似の反応結果を示した。
【図９】図９は、精製ＧＳＴ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のクーマシー染色ゲルであり、単独で（レーン１）、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ（レーン２）と共に、Ｕｌｐ１と共に（レーン３）、或いは精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳとＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１と共に（レーン４と５）インキュベートしたものである。レーン６はレーン４と５と類似の反応を示しているが、精製６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰと共に行ったものである。反応産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分散し、クーマシーで染色した。標準分子量の位置は左に示した。タンパク質バンドの同定はゲル右側にある。
【図１０】図１０は、固定ＮＴＨＳまたは抗ＳＵＭＯＩｇＧｓ上におけるＣＴＨＳ−ＧＦＰの精製を表したクーマシー染色ゲルである。６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合を発現する大腸菌からの全溶解タンパク質（１ｍｇ）は、特定のタンパク質が共有結合で結合した樹脂１５μｌ（床容積）と共にインキュベートした。このサンプルは洗浄し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分散し、クーマシーで染色した。標準分子量は右に示している。ＣＴＨＳ−ＧＦＰの位置は右に示している。
【図１１】図１１は、昆虫細胞から精製されたＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のクーマシー染色ゲルであり、単独で（レーン２〜３）、精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳと共に（レーン５〜６）、或いは精製６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳとＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１と共に（レーン８〜９）インキュベートしたものである。反応産生物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分散し、クーマシーで染色した。標準分子量は右に示している。明らかに、反応混合物中においてすべての成分が存在する場合のみ、遊離ＧＦＰが観察される。大腸菌から精製したＣＴＨＳ−ＧＦＰを有する反応対照は、レーン４と７に表している。タンパク質バンドの同定はゲル右側である。
【図１２】図１２は、ＳＵＭＯのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２）である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）である。
【図１３Ｂ】図１３ＢはｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯプラスミドのマップである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ（配列ＩＤ番号：３）の配列の側面に位置する領域（配列ＩＤ番号：３５）を示したものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＮＴＨＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）を示したものである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ標識ＮＴＨＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）を示したものである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＣＴＨＳのアミノ酸配列を（配列ＩＤ番号：５）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１０）を示したものである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）を示してものである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳプラスミッドのマップである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：１１）配列の側面に位置する領域（配列ＩＤ番号：３６）を示したものである。
【図１６】図１６は、ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１４）である（強化緑色蛍光タンパク質）。
【図１７】図１７は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１５）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）を示したものである。
【図１８】図１８は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１７）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１８）を示したものである。
【図１９】図１９は、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１９）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２０）を示したものである。
【図２０】図２０は、Ｔｅｖプロテアーゼ認識部位のあるＧＳＴタンパク質（グルタチオントランスフェラーゼ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２２）を示したものである。
【図２１】図２１は、ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、Ｙｅｐ、およびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて発現した場合のＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）を示したものである。
【図２２】図２２は、ｐＥＴ−ＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ、ＹｅｐおよびｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにおいて出現した場合のＧＳＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−ＧＦＰ融合のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）とヌクレオチド（配列ＩＤ番号：２６）を示したものである。
【図２３】図２３は、ｐＥＴ−Ｃｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳをコード化した場合のＣｙｓ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳタンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）とヌクレオチド配列を示したものである。
【図２４】図２４は、Ｕｌｐ１ＳＵＭＯプロテアーゼ（加水分解酵素）の触媒ドメインのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）とヌクレオチド（配列ＩＤ番号：３０）を示したものである。
【図２５】図２５は、ＣＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−１プラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＣＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）、ＮＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９１）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：９２）、ｐＥＴ−６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１プラスミドにおいて出現した場合の６ｘＨｉｓ−ＮＴＨＳ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９３）とヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：９４）を示したものである。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｃは、様々なＵｂｌ１のカルボキシ末端とアミノ末端部分の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、ＳＵＭＯタンパク質で得られる結果から推定されるものであり、実施例で説明されている。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｃは、様々なＵｂｌ１のカルボキシ末端とアミノ末端部分の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、ＳＵＭＯタンパク質で得られる結果から推定されるものであり、実施例で説明されている。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜Ｃは、様々なＵｂｌ１のカルボキシ末端とアミノ末端部分の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、ＳＵＭＯタンパク質で得られる結果から推定されるものであり、実施例で説明されている。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜Ｃは、様々なＵｆｄｓ（ドメインを折り畳んだユビキチン）のカルボキシ末端とアミノ末端の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、実施例ＶＩＩＩ（８）で説明されているように、溶解性３Ｄ構造から推定される。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜Ｃは、様々なＵｆｄｓ（ドメインを折り畳んだユビキチン）のカルボキシ末端とアミノ末端の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、実施例ＶＩＩＩ（８）で説明されているように、溶解性３Ｄ構造から推定される。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜Ｃは、様々なＵｆｄｓ（ドメインを折り畳んだユビキチン）のカルボキシ末端とアミノ末端の配列を示したものである。各ドメインにおいて２つのバージョンが与えられる。前記ドメインの配列は、実施例ＶＩＩＩ（８）で説明されているように、溶解性３Ｄ構造から推定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における目的タンパク質の発現を増強する方法であって、
ａ）融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）機能的に結合したユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸配列、を含む工程と、
ｂ）前記宿主細胞において、前記核酸コンストラクトを発現する工程であって、前記融合タンパク質における前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインの存在が、前記宿主細胞において前記目的タンパク質の発現レベルを増強するものである工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子は、ＳＵＭＯ、ユビキチン、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、Ｕｂｉ−Ｌ、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるものである。
【請求項３】
請求項２の方法において、
前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子はＳＵＭＯである。
【請求項４】
請求項１の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した前記核酸配列は、配列ＩＤ番号：９及び配列ＩＤ番号：３１から成る群から選択される配列を有するものである。
【請求項５】
請求項１の方法において、
前記宿主細胞は、酵母細胞、大腸菌、細菌性細胞、哺乳類細胞、及び昆虫細胞から成る群から選択されるものである。
【請求項６】
請求項１の方法において、
融合タンパク質をコード化した前記核酸コンストラクトは、ベクター内にあるものである。
【請求項７】
目的タンパク質を産生する方法であって、
ａ）融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）機能的に結合したユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸を含み、前記融合タンパク質は、発現した場合、前記Ｕｂ１分子の切断部位は即座に前記目的タンパク質のアミノ末端になるように、前記目的タンパク質のアミノ末端に結合したユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインを有するものである、核酸コンストラクトを提供する工程と、
ｂ）前記宿主細胞において前記核酸コンストラクトを発現する工程と、
ｃ）前記発現された融合タンパク質を同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ末端ドメインと接触させ、それにより再構成されたＵｂｌを産生する工程と、
ｄ）前記再構成されたＵｂ１分子を前記Ｕｂ１分子に対して特異的なプロテアーゼと接触させ、前記目的タンパク質が産生されるように、前記融合タンパク質を切断する工程と
を有する方法。
【請求項８】
目的タンパク質を精製する方法であって、
ａ）融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）機能的に結合したユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸を含み、前記融合タンパク質は、発現した場合、前記Ｕｂ１分子の切断部位は即座に前記目的タンパク質のアミノ末端になるように、前記目的タンパク質のアミノ末端に結合したユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインを有するものである、核酸コンストラクトを提供する工程と、
ｂ）前記宿主細胞において前記核酸コンストラクトを発現する工程と、
ｃ）前記発現した融合タンパク質を、精製標識を有する同じユビキチン様（Ｕｂ１）分子のアミノ末端ドメインと接触させ、それにより再構成されたＵｂｌを産生する工程と、
ｄ）前記精製標識と特異的に結合することが可能な固体支持体上において前記再構成されたＵｂｌを精製する工程と、
ｅ）前記精製され再構成されたＵｂｌを、前記Ｕｂｌに対して特異的なプロテアーゼと接触させ、それにより前記目的タンパク質が精製されるように前記融合タンパク質を切断する工程と
を有する方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、
前記精製標識は、ポリヒスチジン標識（６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ、及びｃ−ｍｙｃエピトープ、から成る群から選択されるものである。
【請求項１０】
請求項８の方法において、
前記融合タンパク質は、前記と同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインが免疫沈降によって、ＳＵＭＯ（配列ＩＤ番号：１）及びＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）から成る群から選択されるタンパク質に対して特異的な抗体と接触する前に精製されるものである。
【請求項１１】
目的タンパク質を精製する方法であって、
融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸配列、及びｉｉｉ）少なくとも１つの第１の精製標識をコード化した核酸配列を含み、前記融合タンパク質は、発現した場合、ユビキチン様（Ｕｂ１）分子の切断部位が即座に前記目的タンパク質のアミノ末端になるように目的タンパク質のアミノ末端に結合した、ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインのアミノ末端に結合した少なくとも１つの第１の精製標識を有する、核酸コンストラクトを提供する工程と、
ｂ）前記宿主細胞において前記融合タンパク質をコード化した前記核酸コンストラクトを発現する工程と、
ｃ）少なくとも１つの第１の精製標識に特異的に結合することが可能である固体支持体上において、前記再構成された融合タンパク質を精製する工と、
ｄ）前記精製された融合タンパク質を第２の精製標識を有する同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ末端ドメインに接触させ、それにより再構成されたＵｂｌを産生する工程と、
ｅ）前記第２の精製標識に特異的に結合することが可能な固体支持体上において、前記再構成されたＵｂｌを精製する工程と、
ｆ）前記精製され再構成されたＵｂｌを前記Ｕｂｌ分子に対して特異的なプロテアーゼと接触させ、それにより前記目的タンパク質が精製されるように、前記融合タンパク質を切断する工程と
を有する方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの第１の精製標識及び前記第２の精製標識は、ポリヒスチジン標識（６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、及びｃ−ｍｙｃエピトープから成る群から選択されるものである。
【請求項１３】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの第１の精製標識及び前記第２の精製標識は、同じである。
【請求項１４】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの最初の精製標識及び前記第２の精製標識は、異なるものである。
【請求項１５】
請求項１１の方法において、
同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインは、前記精製された融合タンパク質に接触する前に、前記第２の精製標識に特異的に結合することが可能な前記固体支持体に結合されるものである。
【請求項１６】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの第１の精製標識は、１つ以上であり、且つ前記第１の精製標識は、異なるものである。
【請求項１７】
請求項１５の方法において、
前記第２の精製標識は、システイン残基であり、且つ前記固体支持体は、チオール活性基を有するものである。
【請求項１８】
請求項１１の方法において、
前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼは、Ｕｌｐ１である。
【請求項１９】
請求項１１の方法において、
前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼは、更に第３の精製標識を含むものである。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、
前記第３の精製標識は、前記第２の精製標識と同じである。
【請求項２１】
請求項１９の方法において、
前記第３の精製標識は、前記第２の精製標識と異なるものである。
【請求項２２】
請求項１９の方法であって、さらに、
前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼを前記第３の精製標識と結合可能な固体支持体と接触させ、それにより前記特異的プロテアーゼを前記目的タンパク質から除去し、前記目的タンパク質を精製する工程とを有する方法。
【請求項２３】
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインと、ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ末端ドメインとの間の親和性を増強する方法であって、
前記カルボキシ末端ドメインと前記アミノ末端ドメインに対して機能的に結合する部位を有する方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法において、ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端とユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインとはそれぞれＣＴＨＳとＮＴＨＳである、前記方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインとに結合している前記部位は、逆平行βシート構造を有するものである。
【請求項２６】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインとに結合している前記部位は、逆平行αへリックス構造を有するものである。
【請求項２７】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインに結合した前記部位は、負に帯電したアミノ酸を有し、さらにユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ酸ドメインに結合した前記部位は、正に帯電したアミノ酸を有するものである。
【請求項２８】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインに結合した前記部位は、正に帯電したアミノ酸を有し、さらにユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ酸ドメインに結合した前記部位は、負に帯電したアミノ酸を有するものである。
【請求項２９】
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の記カルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ酸ドメインとの間の親和性を増強する方法であって、
前記カルボキシ末端ドメインと前記アミノ末端ドメインとに突然変異を挿入する工程を有する方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法において、
前記突然変異は、前記カルボキシ末端ドメインと前記アミノ末端ドメインとの間の疎水性を増強するものである。
【請求項３１】
請求項３０の方法において、
Ｌｙｓ４１は、疎水性アミノ酸で置換されるものである。
【請求項３２】
請求項２９の方法において、
前記突然変異は、帯電したアミノ酸を導入するものである。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
Ｉｌｅ８８は、負に帯電したアミノ酸で置換されるものである。
【請求項３４】
請求項８の方法であって、さらに、
工程ｃ）の間に前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼの阻害剤を有する方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、
前記プロテアーゼ阻害剤は、重金属の塩から選択されるものである。
【請求項３６】
請求項３５の方法において、
前記重金属は、亜鉛及びコバルトから成る群から選択されるものである。
【請求項３７】
請求項３４の方法であって、さらに、
金属イオンキレートを用いることによって、前記プロテアーゼ阻害剤を除去する工程を有する方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、
前記金属イオンキレートは、ＥＤＴＡである。
【請求項３９】
請求項１１の方法であって、さらに、
前記特異的プロテアーゼとの接触の前に、前記固体支持体から前記再構成されたＵｂｌを溶出する工程を有する方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記再構成されたＵｂｌは、Ｕｂｌ分子の過剰な前記アミノ末端ドメイン、或いはそれらの誘導体を添加することによって溶出されるものである。
【請求項４１】
請求項３９の方法において、
前記再構成されたＵｂｌは、ｐＨ、塩濃度、カオトロピック状態、及び極性から成る群から選択された溶媒の特性を変化させることにより溶出されるものである。
【請求項４２】
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を含む組換えベクターを有するキットであって、
前記Ｕｂｌ分子は、ＳＵＭＯ、ユビキチン、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、Ｕｂｉ−Ｌ、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるものであって、さらに前記Ｕｂｌ分子は、望ましい宿主細胞において発現に適したプロモーター、及び、前記ＵＢＬ分子をコード化した核酸配列を有する、フレーム内（ｉｎ‐ｆｒａｍｅ）で目的タンパク質をコード化した核酸をクローニングするのに適した多重クローニング部位が機能的に結合されているものであるキット。
【請求項４３】
請求項４２のキットにおいて、
前記キットはさらに、前記ベクターの発現に適した宿主細胞を有するものである。
【請求項４４】
請求項４２のキットにおいて、
前記宿主細胞は、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞からなる群から選択されるものである。
【請求項４５】
請求項４２のキットにおいて、
前記キットはさらに、未変性な野生型タンパク質とは異なるアミノ末端を産生するために、前記目的タンパク質をコード化した核酸配列を変化させるための試薬を有するものである。
【請求項４６】
請求項４５のキットにおいて、
前記キットは、部位特異的突然変異に適した試薬を有するものである。
【請求項４７】
請求項４６のキットにおいて、
前記キットは、オリゴヌクレオチドに基づいた部位特異的突然変異法を行うためのオリゴヌクレオチドを有するものである。
【請求項４８】
宿主細胞からのタンパク質を精製するためのキットであって、
ａ）ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を有する組換えベクターであって、前記Ｕｂｌ分子は、ＳＵＭＯ、ユビキチン、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、Ｕｂｉ−Ｌ、及びＩＳＧ１５の群から選択されるものであり、さらに前記Ｕｂｌ分子は、望ましい宿主における発現に適したプロモーター、前記Ｕｂｌ分子の前記カルボキシ末端をコード化した核酸配列を有する、フレーム内で精製標識をコード化した核酸配列、及び、前記Ｕｂｌ分子の前記カルボキシ末端をコード化した前記核酸配列を有する、フレーム内で前記目的タンパク質をコード化した核酸をクローニングするのに適した多重クローニング部位と機能的に結合されるものである、組換えベクターと、
ｂ）前記融合タンパク質から再構成されたＵｂｌ分子を切断することが可能なプロテアーゼ組成物と
を有するキット。
【請求項４９】
請求項４８において、
前記キットはさらに、前記ベクターの発現に適した宿主を有するものである。
【請求項５０】
請求項４９において、
前記宿主細胞は、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞、及び哺乳類細胞の群から選択されるものである。
【請求項５１】
請求項４８の前記キットであって、さらに、
ａ）前記精製標識に結合するための少なくとも１つの固体支持体と、
ｂ）溶解緩衝液と、
ｃ）洗浄緩衝液と、
ｄ）溶出緩衝液と、
ｅ）切断緩衝液と、
ｆ）タンパク質の形態における前記Ｕｂｌ分子の前記アミノ末端ドメインと、
ｇ）第２の精製標識に機能的に結合した前記Ｕｂｌ分子の前記アミノ末端ドメインをコード化した核酸と、
ｈ）使用説明書と
から成る群から選択される少なくとも１つの項目を有するキット。
【請求項５２】
宿主細胞において目的タンパク質の改変アミノ末端を産生するための方法であって、
ａ）前記目的タンパク質をコード化した核酸配列を提供する工程と、
ｂ）前記核酸配列において前記Ｎ末端アミノ酸のコード配列を改変する工程と、
ｃ）ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を前記核酸配列へ機能的に結合し、それにより融合タンパク質をコード化した核酸を産生する工程であって、前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインは、前記目的タンパク質のアミノ末端に存在するものである工程と、
ｄ）真核細胞において前記融合タンパク質をコード化した前記核酸を発現させる工程と、
ｅ）前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端ドメインをコード化した核酸分子を発現し、それにより前記細胞において前記目的タンパク質を産生する工程であって、前記目的タンパク質は改変アミノ末端を有しているものである工程と
を有する方法。
【請求項１】
宿主細胞における目的タンパク質の発現を増強する方法であって、
ａ）融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）機能的に結合したユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸配列、を含む工程と、
ｂ）前記宿主細胞において、前記核酸コンストラクトを発現する工程であって、前記融合タンパク質における前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインの存在が、前記宿主細胞において前記目的タンパク質の発現レベルを増強するものである工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子は、ＳＵＭＯ、ユビキチン、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、Ｕｂｉ−Ｌ、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるものである。
【請求項３】
請求項２の方法において、
前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子はＳＵＭＯである。
【請求項４】
請求項１の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した前記核酸配列は、配列ＩＤ番号：９及び配列ＩＤ番号：３１から成る群から選択される配列を有するものである。
【請求項５】
請求項１の方法において、
前記宿主細胞は、酵母細胞、大腸菌、細菌性細胞、哺乳類細胞、及び昆虫細胞から成る群から選択されるものである。
【請求項６】
請求項１の方法において、
融合タンパク質をコード化した前記核酸コンストラクトは、ベクター内にあるものである。
【請求項７】
目的タンパク質を産生する方法であって、
ａ）融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）機能的に結合したユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸を含み、前記融合タンパク質は、発現した場合、前記Ｕｂ１分子の切断部位は即座に前記目的タンパク質のアミノ末端になるように、前記目的タンパク質のアミノ末端に結合したユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインを有するものである、核酸コンストラクトを提供する工程と、
ｂ）前記宿主細胞において前記核酸コンストラクトを発現する工程と、
ｃ）前記発現された融合タンパク質を同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ末端ドメインと接触させ、それにより再構成されたＵｂｌを産生する工程と、
ｄ）前記再構成されたＵｂ１分子を前記Ｕｂ１分子に対して特異的なプロテアーゼと接触させ、前記目的タンパク質が産生されるように、前記融合タンパク質を切断する工程と
を有する方法。
【請求項８】
目的タンパク質を精製する方法であって、
ａ）融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）機能的に結合したユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸を含み、前記融合タンパク質は、発現した場合、前記Ｕｂ１分子の切断部位は即座に前記目的タンパク質のアミノ末端になるように、前記目的タンパク質のアミノ末端に結合したユビキチン様（Ｕｂ１）分子のカルボキシ末端ドメインを有するものである、核酸コンストラクトを提供する工程と、
ｂ）前記宿主細胞において前記核酸コンストラクトを発現する工程と、
ｃ）前記発現した融合タンパク質を、精製標識を有する同じユビキチン様（Ｕｂ１）分子のアミノ末端ドメインと接触させ、それにより再構成されたＵｂｌを産生する工程と、
ｄ）前記精製標識と特異的に結合することが可能な固体支持体上において前記再構成されたＵｂｌを精製する工程と、
ｅ）前記精製され再構成されたＵｂｌを、前記Ｕｂｌに対して特異的なプロテアーゼと接触させ、それにより前記目的タンパク質が精製されるように前記融合タンパク質を切断する工程と
を有する方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、
前記精製標識は、ポリヒスチジン標識（６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ、及びｃ−ｍｙｃエピトープ、から成る群から選択されるものである。
【請求項１０】
請求項８の方法において、
前記融合タンパク質は、前記と同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインが免疫沈降によって、ＳＵＭＯ（配列ＩＤ番号：１）及びＣＴＨＳ（配列ＩＤ番号：９）から成る群から選択されるタンパク質に対して特異的な抗体と接触する前に精製されるものである。
【請求項１１】
目的タンパク質を精製する方法であって、
融合タンパク質をコード化した核酸コンストラクトを提供する工程であって、前記コンストラクトは、ｉ）ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列、ｉｉ）前記目的タンパク質をコード化した核酸配列、及びｉｉｉ）少なくとも１つの第１の精製標識をコード化した核酸配列を含み、前記融合タンパク質は、発現した場合、ユビキチン様（Ｕｂ１）分子の切断部位が即座に前記目的タンパク質のアミノ末端になるように目的タンパク質のアミノ末端に結合した、ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインのアミノ末端に結合した少なくとも１つの第１の精製標識を有する、核酸コンストラクトを提供する工程と、
ｂ）前記宿主細胞において前記融合タンパク質をコード化した前記核酸コンストラクトを発現する工程と、
ｃ）少なくとも１つの第１の精製標識に特異的に結合することが可能である固体支持体上において、前記再構成された融合タンパク質を精製する工と、
ｄ）前記精製された融合タンパク質を第２の精製標識を有する同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ末端ドメインに接触させ、それにより再構成されたＵｂｌを産生する工程と、
ｅ）前記第２の精製標識に特異的に結合することが可能な固体支持体上において、前記再構成されたＵｂｌを精製する工程と、
ｆ）前記精製され再構成されたＵｂｌを前記Ｕｂｌ分子に対して特異的なプロテアーゼと接触させ、それにより前記目的タンパク質が精製されるように、前記融合タンパク質を切断する工程と
を有する方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの第１の精製標識及び前記第２の精製標識は、ポリヒスチジン標識（６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニン標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、インフルエンザウイルスＨＡ標識、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａ標識、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、及びｃ−ｍｙｃエピトープから成る群から選択されるものである。
【請求項１３】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの第１の精製標識及び前記第２の精製標識は、同じである。
【請求項１４】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの最初の精製標識及び前記第２の精製標識は、異なるものである。
【請求項１５】
請求項１１の方法において、
同じユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインは、前記精製された融合タンパク質に接触する前に、前記第２の精製標識に特異的に結合することが可能な前記固体支持体に結合されるものである。
【請求項１６】
請求項１１の方法において、
前記少なくとも１つの第１の精製標識は、１つ以上であり、且つ前記第１の精製標識は、異なるものである。
【請求項１７】
請求項１５の方法において、
前記第２の精製標識は、システイン残基であり、且つ前記固体支持体は、チオール活性基を有するものである。
【請求項１８】
請求項１１の方法において、
前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼは、Ｕｌｐ１である。
【請求項１９】
請求項１１の方法において、
前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼは、更に第３の精製標識を含むものである。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、
前記第３の精製標識は、前記第２の精製標識と同じである。
【請求項２１】
請求項１９の方法において、
前記第３の精製標識は、前記第２の精製標識と異なるものである。
【請求項２２】
請求項１９の方法であって、さらに、
前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼを前記第３の精製標識と結合可能な固体支持体と接触させ、それにより前記特異的プロテアーゼを前記目的タンパク質から除去し、前記目的タンパク質を精製する工程とを有する方法。
【請求項２３】
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインと、ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ末端ドメインとの間の親和性を増強する方法であって、
前記カルボキシ末端ドメインと前記アミノ末端ドメインに対して機能的に結合する部位を有する方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法において、ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端とユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインとはそれぞれＣＴＨＳとＮＴＨＳである、前記方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインとに結合している前記部位は、逆平行βシート構造を有するものである。
【請求項２６】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ末端ドメインとに結合している前記部位は、逆平行αへリックス構造を有するものである。
【請求項２７】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインに結合した前記部位は、負に帯電したアミノ酸を有し、さらにユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ酸ドメインに結合した前記部位は、正に帯電したアミノ酸を有するものである。
【請求項２８】
請求項２３の方法において、
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインに結合した前記部位は、正に帯電したアミノ酸を有し、さらにユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記アミノ酸ドメインに結合した前記部位は、負に帯電したアミノ酸を有するものである。
【請求項２９】
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の記カルボキシ末端ドメインとユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のアミノ酸ドメインとの間の親和性を増強する方法であって、
前記カルボキシ末端ドメインと前記アミノ末端ドメインとに突然変異を挿入する工程を有する方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法において、
前記突然変異は、前記カルボキシ末端ドメインと前記アミノ末端ドメインとの間の疎水性を増強するものである。
【請求項３１】
請求項３０の方法において、
Ｌｙｓ４１は、疎水性アミノ酸で置換されるものである。
【請求項３２】
請求項２９の方法において、
前記突然変異は、帯電したアミノ酸を導入するものである。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
Ｉｌｅ８８は、負に帯電したアミノ酸で置換されるものである。
【請求項３４】
請求項８の方法であって、さらに、
工程ｃ）の間に前記Ｕｂｌ分子に対して特異的な前記プロテアーゼの阻害剤を有する方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、
前記プロテアーゼ阻害剤は、重金属の塩から選択されるものである。
【請求項３６】
請求項３５の方法において、
前記重金属は、亜鉛及びコバルトから成る群から選択されるものである。
【請求項３７】
請求項３４の方法であって、さらに、
金属イオンキレートを用いることによって、前記プロテアーゼ阻害剤を除去する工程を有する方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、
前記金属イオンキレートは、ＥＤＴＡである。
【請求項３９】
請求項１１の方法であって、さらに、
前記特異的プロテアーゼとの接触の前に、前記固体支持体から前記再構成されたＵｂｌを溶出する工程を有する方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、
前記再構成されたＵｂｌは、Ｕｂｌ分子の過剰な前記アミノ末端ドメイン、或いはそれらの誘導体を添加することによって溶出されるものである。
【請求項４１】
請求項３９の方法において、
前記再構成されたＵｂｌは、ｐＨ、塩濃度、カオトロピック状態、及び極性から成る群から選択された溶媒の特性を変化させることにより溶出されるものである。
【請求項４２】
ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を含む組換えベクターを有するキットであって、
前記Ｕｂｌ分子は、ＳＵＭＯ、ユビキチン、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、Ｕｂｉ−Ｌ、及びＩＳＧ１５から成る群から選択されるものであって、さらに前記Ｕｂｌ分子は、望ましい宿主細胞において発現に適したプロモーター、及び、前記ＵＢＬ分子をコード化した核酸配列を有する、フレーム内（ｉｎ‐ｆｒａｍｅ）で目的タンパク質をコード化した核酸をクローニングするのに適した多重クローニング部位が機能的に結合されているものであるキット。
【請求項４３】
請求項４２のキットにおいて、
前記キットはさらに、前記ベクターの発現に適した宿主細胞を有するものである。
【請求項４４】
請求項４２のキットにおいて、
前記宿主細胞は、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞からなる群から選択されるものである。
【請求項４５】
請求項４２のキットにおいて、
前記キットはさらに、未変性な野生型タンパク質とは異なるアミノ末端を産生するために、前記目的タンパク質をコード化した核酸配列を変化させるための試薬を有するものである。
【請求項４６】
請求項４５のキットにおいて、
前記キットは、部位特異的突然変異に適した試薬を有するものである。
【請求項４７】
請求項４６のキットにおいて、
前記キットは、オリゴヌクレオチドに基づいた部位特異的突然変異法を行うためのオリゴヌクレオチドを有するものである。
【請求項４８】
宿主細胞からのタンパク質を精製するためのキットであって、
ａ）ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を有する組換えベクターであって、前記Ｕｂｌ分子は、ＳＵＭＯ、ユビキチン、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、Ｕｂｉ−Ｌ、及びＩＳＧ１５の群から選択されるものであり、さらに前記Ｕｂｌ分子は、望ましい宿主における発現に適したプロモーター、前記Ｕｂｌ分子の前記カルボキシ末端をコード化した核酸配列を有する、フレーム内で精製標識をコード化した核酸配列、及び、前記Ｕｂｌ分子の前記カルボキシ末端をコード化した前記核酸配列を有する、フレーム内で前記目的タンパク質をコード化した核酸をクローニングするのに適した多重クローニング部位と機能的に結合されるものである、組換えベクターと、
ｂ）前記融合タンパク質から再構成されたＵｂｌ分子を切断することが可能なプロテアーゼ組成物と
を有するキット。
【請求項４９】
請求項４８において、
前記キットはさらに、前記ベクターの発現に適した宿主を有するものである。
【請求項５０】
請求項４９において、
前記宿主細胞は、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞、及び哺乳類細胞の群から選択されるものである。
【請求項５１】
請求項４８の前記キットであって、さらに、
ａ）前記精製標識に結合するための少なくとも１つの固体支持体と、
ｂ）溶解緩衝液と、
ｃ）洗浄緩衝液と、
ｄ）溶出緩衝液と、
ｅ）切断緩衝液と、
ｆ）タンパク質の形態における前記Ｕｂｌ分子の前記アミノ末端ドメインと、
ｇ）第２の精製標識に機能的に結合した前記Ｕｂｌ分子の前記アミノ末端ドメインをコード化した核酸と、
ｈ）使用説明書と
から成る群から選択される少なくとも１つの項目を有するキット。
【請求項５２】
宿主細胞において目的タンパク質の改変アミノ末端を産生するための方法であって、
ａ）前記目的タンパク質をコード化した核酸配列を提供する工程と、
ｂ）前記核酸配列において前記Ｎ末端アミノ酸のコード配列を改変する工程と、
ｃ）ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子のカルボキシ末端ドメインをコード化した核酸配列を前記核酸配列へ機能的に結合し、それにより融合タンパク質をコード化した核酸を産生する工程であって、前記ユビキチン様（Ｕｂｌ）分子の前記カルボキシ末端ドメインは、前記目的タンパク質のアミノ末端に存在するものである工程と、
ｄ）真核細胞において前記融合タンパク質をコード化した前記核酸を発現させる工程と、
ｅ）前記Ｕｂｌ分子のアミノ末端ドメインをコード化した核酸分子を発現し、それにより前記細胞において前記目的タンパク質を産生する工程であって、前記目的タンパク質は改変アミノ末端を有しているものである工程と
を有する方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【公表番号】特表２００７−５２９１９１（Ｐ２００７−５２９１９１Ａ）
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７７４９（Ｐ２００６−５１７７４９）
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０７７８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３１３
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０４２６２１３３）ライフセンサーズ、インク． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０７７８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３１３
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０４２６２１３３）ライフセンサーズ、インク． (2)
【Ｆターム（参考）】
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