タンパク質精製方法
【課題】より簡単な方法で、ＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を確実に除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供する。
【解決手段】以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点よりも低いｐＨの低伝導度水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
【解決手段】以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点よりも低いｐＨの低伝導度水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の精製方法に関し、さらに詳しくは抗体などの生理活性タンパク質を含有する試料中から夾雑物としてのＤＮＡといった不純物を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。
【０００３】
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主ＤＮＡやウイルスの汚染による不純物、例えばＤＮＡ夾雑物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品におけるＤＮＡの許容量は１００ｐｇＤＮＡ／一投与量以下であることが世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地を陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せで処理することによりＤＮＡを除去している。
【０００４】
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテインＡもしくはプロテインＧがＩｇＧのＦｃ鎖に結合する性質を利用して、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティカラムクロマトグラフィー処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで精製している。
【０００５】
例えば、特表平５−５０４５７９号では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０−３．５）を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。
【０００６】
しかし、これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、労力、コストがかかり、煩雑であり、また効果も安定していない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、より簡単な方法で、確実にＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供することである。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、生理活性タンパク質含有試料を、生理活性タンパク質の等電点より低いｐＨで低伝導度水溶液にし、生じた粒子をフィルター濾過することにより、煩雑なクロマトグラフィー工程を行わずにＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を効率よく除去できることを見出してして本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度の水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
（２）低伝導度の水溶液の伝導度が、0〜100ｍＭのモル濃度である前記（１）記載の方法。
（３）低伝導度の水溶液のイオン強度が、0〜0.2である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）低伝導度の水溶液の導電率が、0〜300 mS/mである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）水溶液のｐＨが生理活性タンパク質の等電点以下、かつｐＨ２．０以上である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）不純物がＤＮＡ夾雑物である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）不純物がウイルスである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）DNA夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のDNA夾雑物がDNA濃度22.5pg/ml以下である（７）に記載の方法。
（１０）生理活性タンパク質が抗体である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）抗体がＩｇＧ抗体である前記（１０）に記載の方法。
（１２）抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である前記（１２）記載の方法。
（１４）抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である前記（１２）記載の方法。
（１５）抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である前記（１２）記載の方法。
（１６）生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法
（１７）粒子をフィルター濾過によって除去する前記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、（１）の方法。
（１９）生理活性タンパク質が抗体であって、該抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該抗体の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、（１）の方法。
（２０）緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である前記（１８）又は（１９）記載の方法。
（２１）前記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
（２２）前記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子(ＴＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、Ｇ−ＣＳＦ、モノクロナール抗体等の抗体が好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。プロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて実施する本発明の態様では、モノクローナル抗体が好ましい。抗体はＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭに分類されるが、ＩｇＧ抗体が好ましい。
【００１１】
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法による生理活性タンパク質は、大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
【００１２】
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
【００１３】
生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）により大腸菌などの細菌類、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
【００１４】
生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
【００１５】
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
【００１６】
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV 領域をコードするDNA が得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNA と連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV 領域をコードするDNA を、抗体C 領域のDNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００１７】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト型化（Humanized ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNA をヒト抗体の定常領域をコードするDNA と連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
【００１８】
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDR とヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA 配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR 法により合成する。得られたDNA をヒト抗体定常領域をコードするDNA と連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576 参照）。CDR を介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００１９】
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１４５８０を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１３３８８を参照）、ヒト型化抗組織因子抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９９−５１７４３を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。
【００２０】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
【００２１】
さらに、トランスジェニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
さらに、抗体にはFab, (Fab')2, Fc, Fc', Fdなどの抗体断片や、１価又は２価以上の一本鎖抗体（scFV）などの再構成したものも含む。
【００２２】
本発明では、生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
【００２３】
本発明の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。
【００２４】
本発明の方法によって除去される不純物は、目的のタンパク質以外の物質であれば、いかなる物質でもよい。不純物の例としては、ＤＮＡ夾雑物、ウイルス、プロテインA（カラムからの溶出物）、エンドトキシン、HCP（細胞由来蛋白質）、培地成分であるHy-Fish(FL)、IGFなどを挙げることができるが、好ましくはＤＮＡ夾雑物又はウイルスである。ここでＤＮＡ夾雑物とは、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡであり、宿主由来のＤＮＡや汚染したウイルス由来のＤＮＡが含まれる。
【００２５】
本発明の方法によって除去されるウイルスには特に制限はなく、どのようなウイルスを除去してもよく、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。ＲＮＡウイルスとしては、X-MuLVといったレトロウイルス、Reo 3といったレオウイルス、MVMといったパラボウイルスが挙げられる。本発明の方法によって除去されるウイルスの具体的な例としては、例えば、X-MuLV、PRV、Reo 3、MVM、VSV、ヘルペスシンプレックス、CHV、シンドビス、ムンプス、ワクチニア、Measle、Rubella、インフルエンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフルエンザ、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO、バルポなどを挙げることができるが、好ましくは、X-MuLV、Reo 3、MVM、PRVである。
【００２６】
本発明において、低伝導度水溶液とは、通常、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０.２、好ましくは０〜0.12の水溶液または、導電率が０〜300ｍS/m、好ましくは０〜200ｍS/m、さらに好ましくは０〜150ｍS/mの水溶液をいう。
【００２７】
生理活性タンパク質の等電点とは、水溶液中において生理活性タンパク質の電荷が見かけ上なくなるｐＨの値である。等電点は当業者に公知に方法により測定することが可能であり、例えば、種々のｐＨの溶液中で電気泳動を行い生理活性タンパク質が移動しなくなるｐＨを求める等電点電気泳動などにより測定することが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨは、好ましくは生理活性タンパク質の等電点未満のｐＨである。
【００２８】
本発明の方法において、不純物がＤＮＡである場合、生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨにすることにより生理活性タンパク質を正に帯電させ、さらにＤＮＡを負に帯電させることが好ましい。
【００２９】
通常、ＤＮＡはバックボーン中のリン酸基により非常に強い負イオンの電荷を有している（核酸の強酸性リン酸ジエステル結合内のリン酸基のｐK値は約１である）ので、ＤＮＡを負に帯電させるｐＨは特に限定されず、生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨを用いることが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨは、生理活性タンパク質ごとに異なると考えられるので、当業者は公知の方法（例えば、実施例に記載されているように複数の異なるｐＨの試料を調製し、ＤＮＡ除去率やタンパク質回収率などを測定する、などの方法）により生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨを選択することが可能である。そのようなｐＨとしては、通常ｐＨ２．０以上、好ましくはｐＨ３．０以上、特に好ましくはｐＨ４．０以上である。
【００３０】
ＤＮＡが負に帯電していることを確認するには公知の方法、例えば電気泳動によるタイトレーションカーブ（ＥＴＣ）を用いた方法（Ion Exchange Chromatography Principles and Methods, Pharmacia(現Amersham Biosciences),p52〜ｐ56）により調べることができる。
【００３１】
さらに、本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することも可能である。
【００３２】
従って、本発明の別の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、
２）得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整し、
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
【００３３】
本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０.２、好ましくは０〜0.12の水溶液または、導電率が０〜300ｍS/m、好ましくは０〜200ｍS/m、さらに好ましくは０〜150ｍS/mの水溶液であって、ｐＨ2.0〜3.9、好ましくはｐＨ2.0〜3.0の水溶液をいう。酸性水溶液は、塩酸、クエン酸、酢酸などの水溶液から選択してよい。精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、伝導度、ｐＨはそれぞれ異なっており、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、これらの最適条件を容易に設定できる。
【００３４】
また、本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０.２、好ましくは０〜0.12の水溶液または、導電率が０〜300ｍS/m、好ましくは０〜200ｍS/m、さらに好ましくは０〜150ｍS/mの水溶液であって、一般にはｐＨ７．５〜１３である（ｐＨは精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっている）。
【００３５】
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とした後、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整する。緩衝液としては、例えばTris-HCl、リン酸、Tris、Na2HPO4、NaOHなどを挙げることができる。
【００３６】
さらに本発明では、例えば、生理活性タンパク質が抗体の場合、一般的に、抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを生理活性タンパク質の等電点以下で好ましいものに調整することが可能である。
【００３７】
従って、本発明のさらに別の好ましい態様では、以下の段階：
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマト
グラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整し、
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
【００３８】
この方法で使用する低伝導度の酸性水溶液は上記したものを使用することができ、また緩衝液としては、例えばTris-HCl、リン酸、Tris、Na2HPO4、NaOHなどを挙げることができる。
【００３９】
本発明の方法では、上記段階で生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨになった溶液は粒子（白濁）を生じる。この粒子をフィルター濾過によって除去することによって、ＤＮＡ夾雑物といった不純物を効率よく除去することができる。濾過に用いるフィルターは、例えば、1.0〜0.2μｍのCellulose Acetate Filter System（Corning製）もしくはTFFなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
また、上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、粒子を効率的に除去できる手法であればよく、フィルター濾過に限定されるものではない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、不純物がＤＮＡである場合、上記粒子は生理活性タンパク質とＤＮＡとによって形成される複合体であると推定している。タンパク質が等電点より低いｐＨになることにより正に帯電し、一方、ＤＮＡが負に帯電することにより、ＤＮＡとタンパク質の複合体が形成されると推定している。さらに、低伝導度の水溶液にすることにより、より複合体が形成されやすくなると考えている。粒子をフィルター除去することによってDNA-生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数％であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約９０％を回収することができた。
【００４１】
また、このDNA-生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィー単独ではDNA夾雑物とタンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、と推測している。 本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることができる。
【００４２】
DNA定量法としてはスレッシュホールド総DNA定量法により測定し、測定に先だってDNA抽出操作を実施するが、これらに限定されるものではない。
ウイルス定量法としては、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50（tissue culture infective dose (50%)；50％培養細胞感染量）、並びに画分中のウイルス量を定量できるRT/Q-PCRおよびQ-PCRにより測定するが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの緩衝液組成の検討
１．１．試験方法
(1)検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）産生CHO細胞培養上清液(以下CMと略す)(細胞遠心除去済み：-80℃保存)含有試料は、上記CMを0.22μm Cellulose Acetate(CAと略す)Filter System (CORNING)を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９号公報の実施例１０に記載されたヒトエロンゲーションファクターＩαプロモーターを利用し、特開平８−９９９０２号公報の参考例２に記載された方法に準じて作成した（等電点：ｐＨ９．０）。
(2)使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC：L-6200 Intelligent Pump(HITACHI)
L-4200 UV-VIS Detector(HITACHI)
D-2500 Chromato-Integrator(HITACHI)
カラム：HR5/2(Pharmacia社),5mmI.D.×20mmH
Media：POROS 50A(PerSeptive社),0.4ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
粒子検討時
HPLC：Waters PrepLC4000 System(Waters)
Waters2000 System Controller(Waters)
Waters486 Tunable Absorbance Detector(Waters)
Waters741 Data Module(Waters)
分光光度計：U-2000(HITACHI)
カラム：XK26(Pharmacia社),26mmI.D.×100mmH
Media：POROS 50A(PerSeptive社),53ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
(3)分析、定量法
ｈＰＭ−１定量法：直線濃度勾配法によるPLRP-Sカラム(ポリマーラボラトリーズ社)を用いる逆相HPLCにより定量する。
DNA量測定法：スレッシュホールド総DNA定量法により測定する。測定に先だってDNA抽出操作（ＤＮＡエキストラクターキット＜和光純薬＞等）を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量キット（モレキュラーデバイス社製）を用いる。
濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計U-2000(HITACHI)に供し、660nmにおける吸収を測定する。
１．２．溶出条件の検討
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、ｈＰＭ−１回収率及び溶出液によるDNA除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表１に示す条件でカラムにかけた。
表１に示す平衡化緩衝液にてプロテインＡ樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷、その後、洗浄１、洗浄２、溶出と実施する。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中C-P Bufferはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
溶出法1、２，３において、クロマトグラム上で差異は確認されなかった。
また、各溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したところ、塩酸溶出画分(溶出法２、溶出法3)では粒子が生じた。更に、粒子形成とｈＰＭ−１回収率及び残存DNA量との相関を求める検討をも行った。
【００４７】
粒子相関検討として、溶出法２における溶出液塩酸中にNaClを添加し、添加NaCl濃度(0mM,50mM,100mM)と各種要因との相関を求めた。添加NaCl濃度と各種要因との相関検討として、それぞれのNaCl添加によるProtein A溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したサンプルを濾過前、そのpH調整後サンプルを0.22μm CA Filterにて濾過したサンプルを濾過後とした。濾過前及び濾過後サンプルを上記測定法でｈＰＭ−１回収率(濾過後のみ)を測定し、残存DNA量を測定した。
１．３．回収率
各溶出条件におけるｈＰＭ−１回収率を測定した。その結果、溶出法１における回収率は98.6%と良好であった。また溶出法２における回収率では83.8%〜97.1%、溶出法2における回収率では83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因(樹脂量:0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討（溶出法2）では安定してｈＰＭ−１回収率90%以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、ｈＰＭ−１の回収率は良好であることが判明した。
１．４．溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
濾過後のｈＰＭ−１回収率は100mM NaCl添加サンプルで88%を示し、順に50mM NaCl添加の86%、0mM NaCl添加の81%であった。残存DNA量に関しては、濾過前後のサンプルでともに、0mM NaCl添加サンプルが低値を示し、特に濾過後の0mM NaCl添加サンプルでは11pg DNA/mg ｈＰＭ−１と極めて低値であった。
【００５０】
また、pH調整後サンプルにおいて濁度の高値なサンプル程、濾過後のｈＰＭ−１回収率及び残存DNA量が低値を示している。この結果は、粒子形成にｈＰＭ−１及びDNAが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらくpHを7.0に調整する事によりｈＰＭ−１とDNAが相互作用し粒子を生じると推測される。ｈＰＭ−１回収率を高くするという点からは、添加NaCl濃度を増加させることが好ましく、逆に残存DNA量減少を重視するという点からは、溶出液塩酸中にNaClを無添加とすることが望ましい。
【００５１】
実施例２：ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体の精製
ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清を0.45+0.2μm CA SARTOBRAN Pフィルター（sartorius）で濾過したもの）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、ＰＴＨｒＰ抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法によって作成した（等電点：ｐＨ８．３）。
２．１．実験条件
精製装置：AKTA explorer (Amersham Pharmacia Biotech)
カラム：HR5/5, C10, XK-26 (Amersham Pharmacia Biotech)
樹脂：rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷：培養上清直接負荷(pH6.6〜7.5)
溶出画分調整：1M Tris水溶液により各種pHに調整し、0.2μm Cellulose Acetate(以下CAと略す)フィルター濾過によりDNAを除去（以下の（１）において条件を検討）。
【００５２】
プロテインAカラムを150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有CMを負荷した。続いて結合していない不純物を150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄を行い、その後20mMクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインA溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
２．２．溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH（未調整(2.7), 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ）に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量を行った。表３に各検討pH及び放置時間と残存DNAの結果示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表から明らかなように、pH5.5、6.0における0,6,24時間放置すべてにおいてDNAが検出限界以下となった。またDNA除去状況に関してはpH5.5、6.0を中心としてpHが高く、又は低くなるにつれてDNA除去の効率が悪くなることが観察された。
【００５５】
実施例３：ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の精製
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表４に記載の条件により精製した。なお、ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１４５８０号公報に記載の方法によって作成した（等電点：ｐＨ９．０）。
３．１．実験条件
カラム：rProtein A FF, 5 mL (16 mmID x 25 mmH)
流速 ：5 mL / min (150 cm / h)
サンプル：培養上清直接負荷
【００５６】
【表４】
【００５７】
プロテインAカラムを150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有CMを負荷した。続いて結合していない不純物を150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄を行い、その後20mMクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインA溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
３．２．溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(pH = 4.5 - 7.5)に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量及び逆相カラムによるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表５にDNA量の測定結果を、また表６にヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【００６０】
Protein Aアフィニティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいては大量のDNAが存在していたが、実験１ではpH 7.5, 6.5, 5.5とpHの低下に従ってDNA量が減少しており、また時間は0時間の方がDNA除去率が高い傾向があった。実験２では pH = 4.5, 5.0, 5.5の条件で同様の実験を行ったが、この間においてはpHおよび時間に関係なく十分にDNAが同程度に除去されていた。更に回収量の計算からヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体はほとんど消失していないことが判明した。
【００６１】
実施例４：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の精製
Ｇ−ＣＳＦ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施した（等電点：ｐＨ５．５〜５．７）。
４．１．溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。Ｇ−ＣＳＦ含有試料に低伝導度の酸性溶液（2.5mM HCl水溶液）を添加し、更に20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料DNAを添加した。1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(pH = 4.3又は6.6)に調整し、続いて0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後、ろ過前後の画分のDNA定量を行った。表７にDNA量の測定結果を示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
上記検討結果より濾過時pH4.3の場合においてDNAを多量に含んだＧ−ＣＳＦ含有試料からDNA量が効率的に減少し定量限界以下であった。
実施例５：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるウイルス除去効果
５．１ 検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化ＩＬ−６レセプター抗体）産生ＣＨＯ細胞培養上清液（ＣＭ）（細胞遠心済み：−８０℃保存）含有試料に、それぞれX-MuLV、Reo３、MVMを添加後、各ＣＭを0.45μmフィルター（ボトルトップフィルター：CORNING社製）を用いてろ過し、精製検討用に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、実施例１と同様に作成した。なお、使用した各ウイルスはATCC（American Type Culture Collection）から入手した。
５．２ rProtein Column Chromatographyでの精製
５．１で作製したウイルス添加試料をrProtein Column Chromatographyで精製した。具体的な条件は以下の通りである。
【００６４】
樹脂：rProteinA Sepharose Fast Flow
機器：AKTA explorer100、AKTApurifier
カラム：XK16/20、XK16/40
樹脂高：11.5 cm
溶出条件
平衡化：1 mol/L NaCl, 20 mmol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄１：1 mol/L NaCl, 20 mmol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄２：10 mmol/L C-P Buffer,
pH7.7±0.2, Conductivity 165±20 mS/m
溶出：2.5 mmol/L HCl,
pH2.7±0.2, Conductivity 107±10 mS/m
５．３ 低ｐＨ処理
５．２で得られた溶出画分を1 mol/L 塩酸でpH3.2 ± 0.1に調整し、室温15±5℃で30分以上保持した。その後、各溶出画分を300 mmol/L Tris溶液でpH7.2 ± 0.1に調整した。そのうちの40.0 mLを、グラスファイバーフィルター（Millipore社製）（0.2μm、ＰＡＬＬ社製）を一次側、バイオイナート（0.2μm、ＰＡＬＬ社製）（PALL社製のフィルターホルダーに直径15 mmのアジャスターを装着）を二次側になるよう連結したろ過ユニットを用いて0.03 ± 0.01 MPaで加圧ろ過した。
５．４ ウイルスの検出
採取したサンプルは全てTCID50で測定を行った。また、X-MuLVおよびMVMのクリアランス能試験では、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50に加え、画分中のウイルス量を定量できるRT/Q-PCRおよびQ-PCRによる測定を行った。
５．５ 結果
５．４の測定の結果を以下の表に示す。
【００６５】
【表８】
【００６６】
【表９】
【００６７】
以上のように、本発明の精製工程により、いずれのウイルスについても非常に高いLRV（Logarithmic Reduction Value）が得られ、低pH処理・ろ過後では定量限界以下にまで除去されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の方法により、ＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を極めて簡単な方法で、効率よく除去することが可能となり、生理活性タンパク質、特に抗体の精製がはるかに効果的となった。不純物がＤＮＡである場合には、ＤＮＡ濃度を極めて低濃度に（例えば22.5pg/ml）、不純物がウイルスである場合には、ウイルス力価を極めて低い値に（例えばTCID50法で１．０３（Log10/mLの表記による））することができた。また、本発明の方法によりコストを低減することができ、格別の技術的意義を有するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の精製方法に関し、さらに詳しくは抗体などの生理活性タンパク質を含有する試料中から夾雑物としてのＤＮＡといった不純物を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。
【０００３】
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主ＤＮＡやウイルスの汚染による不純物、例えばＤＮＡ夾雑物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品におけるＤＮＡの許容量は１００ｐｇＤＮＡ／一投与量以下であることが世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地を陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せで処理することによりＤＮＡを除去している。
【０００４】
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテインＡもしくはプロテインＧがＩｇＧのＦｃ鎖に結合する性質を利用して、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティカラムクロマトグラフィー処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで精製している。
【０００５】
例えば、特表平５−５０４５７９号では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０−３．５）を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。
【０００６】
しかし、これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、労力、コストがかかり、煩雑であり、また効果も安定していない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、より簡単な方法で、確実にＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供することである。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、生理活性タンパク質含有試料を、生理活性タンパク質の等電点より低いｐＨで低伝導度水溶液にし、生じた粒子をフィルター濾過することにより、煩雑なクロマトグラフィー工程を行わずにＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を効率よく除去できることを見出してして本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度の水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
（２）低伝導度の水溶液の伝導度が、0〜100ｍＭのモル濃度である前記（１）記載の方法。
（３）低伝導度の水溶液のイオン強度が、0〜0.2である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）低伝導度の水溶液の導電率が、0〜300 mS/mである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）水溶液のｐＨが生理活性タンパク質の等電点以下、かつｐＨ２．０以上である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）不純物がＤＮＡ夾雑物である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）不純物がウイルスである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）DNA夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のDNA夾雑物がDNA濃度22.5pg/ml以下である（７）に記載の方法。
（１０）生理活性タンパク質が抗体である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）抗体がＩｇＧ抗体である前記（１０）に記載の方法。
（１２）抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である前記（１２）記載の方法。
（１４）抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である前記（１２）記載の方法。
（１５）抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である前記（１２）記載の方法。
（１６）生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法
（１７）粒子をフィルター濾過によって除去する前記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、（１）の方法。
（１９）生理活性タンパク質が抗体であって、該抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該抗体の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、（１）の方法。
（２０）緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である前記（１８）又は（１９）記載の方法。
（２１）前記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
（２２）前記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子(ＴＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、Ｇ−ＣＳＦ、モノクロナール抗体等の抗体が好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。プロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて実施する本発明の態様では、モノクローナル抗体が好ましい。抗体はＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭに分類されるが、ＩｇＧ抗体が好ましい。
【００１１】
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法による生理活性タンパク質は、大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
【００１２】
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
【００１３】
生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）により大腸菌などの細菌類、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
【００１４】
生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
【００１５】
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
【００１６】
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV 領域をコードするDNA が得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNA と連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV 領域をコードするDNA を、抗体C 領域のDNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００１７】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト型化（Humanized ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNA をヒト抗体の定常領域をコードするDNA と連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
【００１８】
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDR とヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA 配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR 法により合成する。得られたDNA をヒト抗体定常領域をコードするDNA と連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576 参照）。CDR を介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００１９】
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１４５８０を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１３３８８を参照）、ヒト型化抗組織因子抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９９−５１７４３を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。
【００２０】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
【００２１】
さらに、トランスジェニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
さらに、抗体にはFab, (Fab')2, Fc, Fc', Fdなどの抗体断片や、１価又は２価以上の一本鎖抗体（scFV）などの再構成したものも含む。
【００２２】
本発明では、生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
【００２３】
本発明の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。
【００２４】
本発明の方法によって除去される不純物は、目的のタンパク質以外の物質であれば、いかなる物質でもよい。不純物の例としては、ＤＮＡ夾雑物、ウイルス、プロテインA（カラムからの溶出物）、エンドトキシン、HCP（細胞由来蛋白質）、培地成分であるHy-Fish(FL)、IGFなどを挙げることができるが、好ましくはＤＮＡ夾雑物又はウイルスである。ここでＤＮＡ夾雑物とは、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡであり、宿主由来のＤＮＡや汚染したウイルス由来のＤＮＡが含まれる。
【００２５】
本発明の方法によって除去されるウイルスには特に制限はなく、どのようなウイルスを除去してもよく、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。ＲＮＡウイルスとしては、X-MuLVといったレトロウイルス、Reo 3といったレオウイルス、MVMといったパラボウイルスが挙げられる。本発明の方法によって除去されるウイルスの具体的な例としては、例えば、X-MuLV、PRV、Reo 3、MVM、VSV、ヘルペスシンプレックス、CHV、シンドビス、ムンプス、ワクチニア、Measle、Rubella、インフルエンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフルエンザ、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO、バルポなどを挙げることができるが、好ましくは、X-MuLV、Reo 3、MVM、PRVである。
【００２６】
本発明において、低伝導度水溶液とは、通常、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０.２、好ましくは０〜0.12の水溶液または、導電率が０〜300ｍS/m、好ましくは０〜200ｍS/m、さらに好ましくは０〜150ｍS/mの水溶液をいう。
【００２７】
生理活性タンパク質の等電点とは、水溶液中において生理活性タンパク質の電荷が見かけ上なくなるｐＨの値である。等電点は当業者に公知に方法により測定することが可能であり、例えば、種々のｐＨの溶液中で電気泳動を行い生理活性タンパク質が移動しなくなるｐＨを求める等電点電気泳動などにより測定することが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨは、好ましくは生理活性タンパク質の等電点未満のｐＨである。
【００２８】
本発明の方法において、不純物がＤＮＡである場合、生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨにすることにより生理活性タンパク質を正に帯電させ、さらにＤＮＡを負に帯電させることが好ましい。
【００２９】
通常、ＤＮＡはバックボーン中のリン酸基により非常に強い負イオンの電荷を有している（核酸の強酸性リン酸ジエステル結合内のリン酸基のｐK値は約１である）ので、ＤＮＡを負に帯電させるｐＨは特に限定されず、生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨを用いることが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨは、生理活性タンパク質ごとに異なると考えられるので、当業者は公知の方法（例えば、実施例に記載されているように複数の異なるｐＨの試料を調製し、ＤＮＡ除去率やタンパク質回収率などを測定する、などの方法）により生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨを選択することが可能である。そのようなｐＨとしては、通常ｐＨ２．０以上、好ましくはｐＨ３．０以上、特に好ましくはｐＨ４．０以上である。
【００３０】
ＤＮＡが負に帯電していることを確認するには公知の方法、例えば電気泳動によるタイトレーションカーブ（ＥＴＣ）を用いた方法（Ion Exchange Chromatography Principles and Methods, Pharmacia(現Amersham Biosciences),p52〜ｐ56）により調べることができる。
【００３１】
さらに、本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することも可能である。
【００３２】
従って、本発明の別の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、
２）得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整し、
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
【００３３】
本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０.２、好ましくは０〜0.12の水溶液または、導電率が０〜300ｍS/m、好ましくは０〜200ｍS/m、さらに好ましくは０〜150ｍS/mの水溶液であって、ｐＨ2.0〜3.9、好ましくはｐＨ2.0〜3.0の水溶液をいう。酸性水溶液は、塩酸、クエン酸、酢酸などの水溶液から選択してよい。精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、伝導度、ｐＨはそれぞれ異なっており、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、これらの最適条件を容易に設定できる。
【００３４】
また、本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０.２、好ましくは０〜0.12の水溶液または、導電率が０〜300ｍS/m、好ましくは０〜200ｍS/m、さらに好ましくは０〜150ｍS/mの水溶液であって、一般にはｐＨ７．５〜１３である（ｐＨは精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっている）。
【００３５】
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とした後、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整する。緩衝液としては、例えばTris-HCl、リン酸、Tris、Na2HPO4、NaOHなどを挙げることができる。
【００３６】
さらに本発明では、例えば、生理活性タンパク質が抗体の場合、一般的に、抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを生理活性タンパク質の等電点以下で好ましいものに調整することが可能である。
【００３７】
従って、本発明のさらに別の好ましい態様では、以下の段階：
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマト
グラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整し、
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
【００３８】
この方法で使用する低伝導度の酸性水溶液は上記したものを使用することができ、また緩衝液としては、例えばTris-HCl、リン酸、Tris、Na2HPO4、NaOHなどを挙げることができる。
【００３９】
本発明の方法では、上記段階で生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨになった溶液は粒子（白濁）を生じる。この粒子をフィルター濾過によって除去することによって、ＤＮＡ夾雑物といった不純物を効率よく除去することができる。濾過に用いるフィルターは、例えば、1.0〜0.2μｍのCellulose Acetate Filter System（Corning製）もしくはTFFなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
また、上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、粒子を効率的に除去できる手法であればよく、フィルター濾過に限定されるものではない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、不純物がＤＮＡである場合、上記粒子は生理活性タンパク質とＤＮＡとによって形成される複合体であると推定している。タンパク質が等電点より低いｐＨになることにより正に帯電し、一方、ＤＮＡが負に帯電することにより、ＤＮＡとタンパク質の複合体が形成されると推定している。さらに、低伝導度の水溶液にすることにより、より複合体が形成されやすくなると考えている。粒子をフィルター除去することによってDNA-生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数％であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約９０％を回収することができた。
【００４１】
また、このDNA-生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィー単独ではDNA夾雑物とタンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、と推測している。 本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることができる。
【００４２】
DNA定量法としてはスレッシュホールド総DNA定量法により測定し、測定に先だってDNA抽出操作を実施するが、これらに限定されるものではない。
ウイルス定量法としては、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50（tissue culture infective dose (50%)；50％培養細胞感染量）、並びに画分中のウイルス量を定量できるRT/Q-PCRおよびQ-PCRにより測定するが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの緩衝液組成の検討
１．１．試験方法
(1)検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）産生CHO細胞培養上清液(以下CMと略す)(細胞遠心除去済み：-80℃保存)含有試料は、上記CMを0.22μm Cellulose Acetate(CAと略す)Filter System (CORNING)を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９号公報の実施例１０に記載されたヒトエロンゲーションファクターＩαプロモーターを利用し、特開平８−９９９０２号公報の参考例２に記載された方法に準じて作成した（等電点：ｐＨ９．０）。
(2)使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC：L-6200 Intelligent Pump(HITACHI)
L-4200 UV-VIS Detector(HITACHI)
D-2500 Chromato-Integrator(HITACHI)
カラム：HR5/2(Pharmacia社),5mmI.D.×20mmH
Media：POROS 50A(PerSeptive社),0.4ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
粒子検討時
HPLC：Waters PrepLC4000 System(Waters)
Waters2000 System Controller(Waters)
Waters486 Tunable Absorbance Detector(Waters)
Waters741 Data Module(Waters)
分光光度計：U-2000(HITACHI)
カラム：XK26(Pharmacia社),26mmI.D.×100mmH
Media：POROS 50A(PerSeptive社),53ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
(3)分析、定量法
ｈＰＭ−１定量法：直線濃度勾配法によるPLRP-Sカラム(ポリマーラボラトリーズ社)を用いる逆相HPLCにより定量する。
DNA量測定法：スレッシュホールド総DNA定量法により測定する。測定に先だってDNA抽出操作（ＤＮＡエキストラクターキット＜和光純薬＞等）を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量キット（モレキュラーデバイス社製）を用いる。
濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計U-2000(HITACHI)に供し、660nmにおける吸収を測定する。
１．２．溶出条件の検討
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、ｈＰＭ−１回収率及び溶出液によるDNA除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表１に示す条件でカラムにかけた。
表１に示す平衡化緩衝液にてプロテインＡ樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷、その後、洗浄１、洗浄２、溶出と実施する。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中C-P Bufferはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
溶出法1、２，３において、クロマトグラム上で差異は確認されなかった。
また、各溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したところ、塩酸溶出画分(溶出法２、溶出法3)では粒子が生じた。更に、粒子形成とｈＰＭ−１回収率及び残存DNA量との相関を求める検討をも行った。
【００４７】
粒子相関検討として、溶出法２における溶出液塩酸中にNaClを添加し、添加NaCl濃度(0mM,50mM,100mM)と各種要因との相関を求めた。添加NaCl濃度と各種要因との相関検討として、それぞれのNaCl添加によるProtein A溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したサンプルを濾過前、そのpH調整後サンプルを0.22μm CA Filterにて濾過したサンプルを濾過後とした。濾過前及び濾過後サンプルを上記測定法でｈＰＭ−１回収率(濾過後のみ)を測定し、残存DNA量を測定した。
１．３．回収率
各溶出条件におけるｈＰＭ−１回収率を測定した。その結果、溶出法１における回収率は98.6%と良好であった。また溶出法２における回収率では83.8%〜97.1%、溶出法2における回収率では83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因(樹脂量:0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討（溶出法2）では安定してｈＰＭ−１回収率90%以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、ｈＰＭ−１の回収率は良好であることが判明した。
１．４．溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
濾過後のｈＰＭ−１回収率は100mM NaCl添加サンプルで88%を示し、順に50mM NaCl添加の86%、0mM NaCl添加の81%であった。残存DNA量に関しては、濾過前後のサンプルでともに、0mM NaCl添加サンプルが低値を示し、特に濾過後の0mM NaCl添加サンプルでは11pg DNA/mg ｈＰＭ−１と極めて低値であった。
【００５０】
また、pH調整後サンプルにおいて濁度の高値なサンプル程、濾過後のｈＰＭ−１回収率及び残存DNA量が低値を示している。この結果は、粒子形成にｈＰＭ−１及びDNAが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらくpHを7.0に調整する事によりｈＰＭ−１とDNAが相互作用し粒子を生じると推測される。ｈＰＭ−１回収率を高くするという点からは、添加NaCl濃度を増加させることが好ましく、逆に残存DNA量減少を重視するという点からは、溶出液塩酸中にNaClを無添加とすることが望ましい。
【００５１】
実施例２：ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体の精製
ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清を0.45+0.2μm CA SARTOBRAN Pフィルター（sartorius）で濾過したもの）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、ＰＴＨｒＰ抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法によって作成した（等電点：ｐＨ８．３）。
２．１．実験条件
精製装置：AKTA explorer (Amersham Pharmacia Biotech)
カラム：HR5/5, C10, XK-26 (Amersham Pharmacia Biotech)
樹脂：rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷：培養上清直接負荷(pH6.6〜7.5)
溶出画分調整：1M Tris水溶液により各種pHに調整し、0.2μm Cellulose Acetate(以下CAと略す)フィルター濾過によりDNAを除去（以下の（１）において条件を検討）。
【００５２】
プロテインAカラムを150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有CMを負荷した。続いて結合していない不純物を150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄を行い、その後20mMクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインA溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
２．２．溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH（未調整(2.7), 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ）に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量を行った。表３に各検討pH及び放置時間と残存DNAの結果示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表から明らかなように、pH5.5、6.0における0,6,24時間放置すべてにおいてDNAが検出限界以下となった。またDNA除去状況に関してはpH5.5、6.0を中心としてpHが高く、又は低くなるにつれてDNA除去の効率が悪くなることが観察された。
【００５５】
実施例３：ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の精製
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表４に記載の条件により精製した。なお、ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１４５８０号公報に記載の方法によって作成した（等電点：ｐＨ９．０）。
３．１．実験条件
カラム：rProtein A FF, 5 mL (16 mmID x 25 mmH)
流速 ：5 mL / min (150 cm / h)
サンプル：培養上清直接負荷
【００５６】
【表４】
【００５７】
プロテインAカラムを150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有CMを負荷した。続いて結合していない不純物を150mM NaCl入りクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸-リン酸緩衝液pH7.5で洗浄を行い、その後20mMクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインA溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
３．２．溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(pH = 4.5 - 7.5)に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量及び逆相カラムによるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表５にDNA量の測定結果を、また表６にヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【００６０】
Protein Aアフィニティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいては大量のDNAが存在していたが、実験１ではpH 7.5, 6.5, 5.5とpHの低下に従ってDNA量が減少しており、また時間は0時間の方がDNA除去率が高い傾向があった。実験２では pH = 4.5, 5.0, 5.5の条件で同様の実験を行ったが、この間においてはpHおよび時間に関係なく十分にDNAが同程度に除去されていた。更に回収量の計算からヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体はほとんど消失していないことが判明した。
【００６１】
実施例４：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の精製
Ｇ−ＣＳＦ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施した（等電点：ｐＨ５．５〜５．７）。
４．１．溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。Ｇ−ＣＳＦ含有試料に低伝導度の酸性溶液（2.5mM HCl水溶液）を添加し、更に20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料DNAを添加した。1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(pH = 4.3又は6.6)に調整し、続いて0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後、ろ過前後の画分のDNA定量を行った。表７にDNA量の測定結果を示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
上記検討結果より濾過時pH4.3の場合においてDNAを多量に含んだＧ−ＣＳＦ含有試料からDNA量が効率的に減少し定量限界以下であった。
実施例５：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるウイルス除去効果
５．１ 検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化ＩＬ−６レセプター抗体）産生ＣＨＯ細胞培養上清液（ＣＭ）（細胞遠心済み：−８０℃保存）含有試料に、それぞれX-MuLV、Reo３、MVMを添加後、各ＣＭを0.45μmフィルター（ボトルトップフィルター：CORNING社製）を用いてろ過し、精製検討用に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、実施例１と同様に作成した。なお、使用した各ウイルスはATCC（American Type Culture Collection）から入手した。
５．２ rProtein Column Chromatographyでの精製
５．１で作製したウイルス添加試料をrProtein Column Chromatographyで精製した。具体的な条件は以下の通りである。
【００６４】
樹脂：rProteinA Sepharose Fast Flow
機器：AKTA explorer100、AKTApurifier
カラム：XK16/20、XK16/40
樹脂高：11.5 cm
溶出条件
平衡化：1 mol/L NaCl, 20 mmol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄１：1 mol/L NaCl, 20 mmol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄２：10 mmol/L C-P Buffer,
pH7.7±0.2, Conductivity 165±20 mS/m
溶出：2.5 mmol/L HCl,
pH2.7±0.2, Conductivity 107±10 mS/m
５．３ 低ｐＨ処理
５．２で得られた溶出画分を1 mol/L 塩酸でpH3.2 ± 0.1に調整し、室温15±5℃で30分以上保持した。その後、各溶出画分を300 mmol/L Tris溶液でpH7.2 ± 0.1に調整した。そのうちの40.0 mLを、グラスファイバーフィルター（Millipore社製）（0.2μm、ＰＡＬＬ社製）を一次側、バイオイナート（0.2μm、ＰＡＬＬ社製）（PALL社製のフィルターホルダーに直径15 mmのアジャスターを装着）を二次側になるよう連結したろ過ユニットを用いて0.03 ± 0.01 MPaで加圧ろ過した。
５．４ ウイルスの検出
採取したサンプルは全てTCID50で測定を行った。また、X-MuLVおよびMVMのクリアランス能試験では、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50に加え、画分中のウイルス量を定量できるRT/Q-PCRおよびQ-PCRによる測定を行った。
５．５ 結果
５．４の測定の結果を以下の表に示す。
【００６５】
【表８】
【００６６】
【表９】
【００６７】
以上のように、本発明の精製工程により、いずれのウイルスについても非常に高いLRV（Logarithmic Reduction Value）が得られ、低pH処理・ろ過後では定量限界以下にまで除去されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の方法により、ＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を極めて簡単な方法で、効率よく除去することが可能となり、生理活性タンパク質、特に抗体の精製がはるかに効果的となった。不純物がＤＮＡである場合には、ＤＮＡ濃度を極めて低濃度に（例えば22.5pg/ml）、不純物がウイルスである場合には、ウイルス力価を極めて低い値に（例えばTCID50法で１．０３（Log10/mLの表記による））することができた。また、本発明の方法によりコストを低減することができ、格別の技術的意義を有するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、アフィニティーカラムに適用すること、
２）０〜１００ｍＭのモル濃度である低伝導度の水溶液でカラムを洗浄すること、
３）０〜１００ｍＭのモル濃度である低伝導度の溶出液で溶出すること、
４）該溶出液を、該生理活性タンパク質の等電点以下かつ４．３以上のｐＨであり、モル濃度が０〜１００ｍＭの低伝導度の水溶液状態とすること、及び
５）生じる粒子を除去すること、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
【請求項２】
低伝導度の水溶液のイオン強度が、０〜０．２である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
低伝導度の水溶液の導電率が、０〜３００ｍＳ／ｍである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
不純物がＤＮＡ夾雑物である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
不純物がウイルスである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物が、ＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アフィニティーカラムが、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティーカラムである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
生理活性タンパク質が抗体である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗体がＩｇＧ抗体である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
粒子をフィルター濾過によって除去する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該溶出液に緩衝液を添加することによって４）の工程を行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。
【請求項１】
以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、アフィニティーカラムに適用すること、
２）０〜１００ｍＭのモル濃度である低伝導度の水溶液でカラムを洗浄すること、
３）０〜１００ｍＭのモル濃度である低伝導度の溶出液で溶出すること、
４）該溶出液を、該生理活性タンパク質の等電点以下かつ４．３以上のｐＨであり、モル濃度が０〜１００ｍＭの低伝導度の水溶液状態とすること、及び
５）生じる粒子を除去すること、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
【請求項２】
低伝導度の水溶液のイオン強度が、０〜０．２である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
低伝導度の水溶液の導電率が、０〜３００ｍＳ／ｍである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
不純物がＤＮＡ夾雑物である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
不純物がウイルスである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物が、ＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アフィニティーカラムが、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティーカラムである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
生理活性タンパク質が抗体である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗体がＩｇＧ抗体である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
粒子をフィルター濾過によって除去する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該溶出液に緩衝液を添加することによって４）の工程を行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−６４８９（Ｐ２０１１−６４８９Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３１７１９（Ｐ２０１０−２３１７１９）
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【分割の表示】特願２００４−５３５９４８（Ｐ２００４−５３５９４８）の分割
【原出願日】平成１５年９月１１日（２００３．９．１１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【分割の表示】特願２００４−５３５９４８（Ｐ２００４−５３５９４８）の分割
【原出願日】平成１５年９月１１日（２００３．９．１１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
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