タンパク質蓄積による神経変性疾患治療薬物のスクリーニング系
【課題】タンパク質凝集に起因する神経変性疾患治療薬をスクリーニングする系を提供する。
【解決手段】脊髄小脳変性症におけるタンパク質凝集に起因する変異γＰＫＣをコードする遺伝子、ＧＦＰをコードする遺伝子、およびｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅという薬剤により蛋白質の発現調節可能なＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ蛋白質をコードする遺伝子またはテトラサイクリンにより蛋白質の発現調節可能なＴｅｔ制御システムを含むベクターを含有する細胞を用いて神経変性疾患治療薬をスクリーニングする系。
【解決手段】脊髄小脳変性症におけるタンパク質凝集に起因する変異γＰＫＣをコードする遺伝子、ＧＦＰをコードする遺伝子、およびｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅという薬剤により蛋白質の発現調節可能なＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ蛋白質をコードする遺伝子またはテトラサイクリンにより蛋白質の発現調節可能なＴｅｔ制御システムを含むベクターを含有する細胞を用いて神経変性疾患治療薬をスクリーニングする系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患において異常凝集タンパク質の蓄積に起因するタンパク質蓄積による神経変性疾患を治療する薬物をスクリーニングするためのベクター、それを導入した細胞、およびそれらを含むスクリーニング系に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患発症に共通の性質とは１つには遺伝性発症であり、他の臓器疾患と比較して遺伝性のものが圧倒的に多い。神経変性疾患に共通する特徴の第２は選択的な細胞死を伴っていることが多いことである。神経変性疾患に関連して指摘すべきもう１つの点は、神経変性疾患における神経細胞死がアポトーシスではないかと考えられていることである（非特許文献１）。 また神経変性疾患にはポリグルタミン病、ハンチントン病、ピック病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳変性症、プリオン病などのタンパク質の凝集に起因すると考えられていることが多く、例えば、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病などはポリグルタミン、アルツハイマー病ではβアミロイド（Ａβ）、Ｔａｕタンパク質、プレセニリン、パーキンソン病ではαーシヌクレイン、ＡＬＳではスーパーオキシドムターゼ１（ＳＯＤ１）、脊髄小脳変性症においてガンマプロテインキナーゼ（γＰＫＣ）などの変異によりタンパク質が核内を含む細胞内外で凝集、蓄積することにより神経変性疾患が発症すると考えられている(非特許文献２)。これらの疾患は変異する遺伝子の位置など分かっているものもあり、例えば脊髄小脳変性症においてγＰＫＣ遺伝子の制御ドメインのＣ１Ｂ変異が多く発見されている（図１）。しかしながら点変異で変異が起こるものについては、通常の核酸のハイブリダイゼーションなどで異常を発見するのは困難である。また、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングとしてトランスジェニックマウスを用いた方法（特許文献１）が開示されているが、トランスジェニックマウスを用いたアッセイ系では多くの化合物のスクリーニングが困難である。
【非特許文献１】最新内科学体系、第６８巻、神経変性疾患、編集：井村裕夫、尾形悦郎、高久史麿、垂井清一郎、発行所：中山書店（１９９７年）、３〜７ｐ
【非特許文献２】細胞工学、第２０巻、第１１号、岩坪威、１４７４〜１４７７（２００１）
【特許文献１】特開２００３−２６７８７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のごとくタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患は多岐にわたり、それらの治療薬候補を的確に、簡便にできるスクリーニング方法の確立が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記実情を鑑み鋭意研究した結果、凝集体を形成する変異タンパク質をコードする遺伝子、タンパク質の凝集を追跡可能とする緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、薬剤により変異タンパク質と緑色蛍光タンパク質の発現を薬剤で調節可能な遺伝子を含むベクターを哺乳類の細胞に導入して、タンパク質凝集に起因する神経変性疾患の治療のための薬剤をスクリーニングする系を確立した。例えば、脊髄小脳変性症におけるタンパク質凝集に起因する変異タンパク質γＰＫＣをコードする遺伝子、タンパク質凝集を追跡するための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、および薬剤により前記タンパク質の発現を調節可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ遺伝子を含むベクターを用いてタンパク質が凝集する系を確立した。しかしながらタンパク質の凝集体が形成されると
細胞はアポトーシスを起こしたり、また小脳プルキンエ細胞では樹状突起の広がりが小さくなり形態的に異なるものになって適切な評価はできなくなる。例えばＣＨＯ細胞を用いる場合、ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅでタンパク質発現を調節可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質をコードする遺伝子を用いたり、小脳プルキンエ細胞を使用する場合には、テトラサイクリンにより制御可能なテトラサイクリントランスアクティベーター遺伝子を用いて細胞のアポトーシス、または小脳プルキンエ細胞の場合は樹状突起の形態の異常を抑制して、タンパク質凝集を治療するための薬物の評価を行うこと可能にし、さらにそのような薬剤で処理することにより凝集体の形成を改善させたことを確認し、本発明にいたった。
【０００５】
変異γＰＫＣ、ＧＦＰおよびＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【０００６】
変異γＰＫＣ、ＧＦＰおよびテトラサイクリンによりγＰＫＣ−ＧＦＰ発現が制御可能遺伝子を含むベクターを提供するものである。
【０００７】
上記ベクターを用いてタンパク質蓄積による神経変性疾患治療薬物候補のスクリーニングキット及び方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明について詳細について説明する。
【０００９】
本明細書では、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従い、塩基配列、核酸配列、遺伝子配列、アミノ酸配列等を各種略号により表示する。
【００１０】
本明細書では、変異を表す、例えば「Ｈ１０１Ｙ」とはアミノ末端から１０１位のヒスチジンがチロシンに変異したことを示す。 例えば「Ｓ１１９Ｆ」とはアミノ酸末端から１１９位のセリンがフェニルアラニンに変異したことを示す。
【００１１】
凝集体を形成する変異タンパク質をコードする遺伝子、タンパク質の凝集を追跡可能とする緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、薬剤により変異タンパク質と緑色蛍光タンパク質の発現を薬剤で調節可能な遺伝子を含むベクターを哺乳類の細胞に導入して、タンパク質凝集に起因する神経変性疾患の治療のための薬剤をスクリーニングする系を確立した。変異タンパク質としてはポリグルタミン、βアミロイド（Ａβ）、Ｔａｕタンパク質、プレセニリン、αーシヌクレイン、スーパーオキシドムターゼ１（ＳＯＤ１）、ガンマプロテインキナーゼ（γＰＫＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
また、薬剤によりタンパク質の発現を調節可能とする遺伝子としては、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ遺伝子およびテトラサイクリントランスアクティベーター遺伝子などが挙げられるが。これらに限定されない。例えば、より詳細には脊髄小脳変性症におけるタンパク質凝集に起因する変異タンパク質γＰＫＣ−ＧＦＰをコードする遺伝子、タンパク質凝集を追跡するための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、および薬剤により前記タンパク質の発現を調節可能とする遺伝子を含むベクターを細胞に導入して、タンパク質凝集を抑制する系を確立した。導入する細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト神経由来細胞、小脳プルキンエ細胞が挙げられ、それらは株化されていても良く、プライマリーカルチャーでも良いが、これらに限定されない。
【００１３】
タンパク質の凝集体が形成されると細胞はアポトーシスを起こしたり、また小脳プルキンエ細胞では樹状突起の広がりが小さくなり形態的に異なるものになって適切な評価はで
きなくなる。例えばＣＨＯ細胞を用いる場合、ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅでタンパク質発現を調節可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質をコードする遺伝子を用いることにより発現を調節することが可能である。またヒト神経由来細胞（ＳＨ−ＳＹ ５Ｙ）を用いる場合においては、テトラサイクリンにより発現調節可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である。この場合高効率に発現させることが可能であり、細胞死に対する薬物をスクリーニングするのに適している。また小脳プルキンエ細胞を使用する場合には、テトラサイクリンにより制御可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である。ＳＣＡ１４の病変の主座となるプルキンエ細胞を用いたスクリーニング系であるので、臨床的価値も高い。
【００１４】
（細胞内でのタンパク質凝集体発現）
遺伝性脊髄小脳失調症１４型（ＳＣＡ１４）の原因遺伝子としてγＰＫＣの変異ということが分かっている。またこれらの変異はγＰＫＣ発現遺伝子のＣ１Ｂ制御ドメインに多くの変異が発見されている（図１）。
【００１５】
この遺伝子と凝集を追跡するためのＧＦＰをコードする遺伝子を細胞、例えばＣＨＯに導入して、タンパク質を発現させる場合、野生型のγＰＫＣと変異γＰＫＣと比較すると変異γＰＫＣを用いた場合の方が細胞質内での凝集が顕著であった（図２）。細胞質内でのタンパク質凝集の度合いをＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ、ＭｅｔａＭｏｒｐｈなどの画像解析ソフトを用いて行うことができる。
【００１６】
またＦＲＡＰ解析を用いて、タンパク質の流動性を測定すれば、タンパク質の凝集の指標として定量的な解析も可能である（図１２）。
【００１７】
しかしながら、細胞質内でたんぱく質凝集が起こると細胞死が誘発され（図３）、薬物のスクリーニング系には不適切である。そこで特定の薬物が存在する場合にのみ変異γＰＫＣ−ＧＦＰが発現するように変異γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子の５’側に発現調節領域としてＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ遺伝子を導入したベクターを作成した（図４、図５）。即ち、γＰＫＣ−ＧＦＰｃＤＮＡをｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓへサブクローニングし、ｐＳｗｉｔｃｈが組み込まれたＣＨＯ細胞へｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓにサブクローニングされたγＰＫＣ−ＧＦＰをリポフェクションし、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ／Ｚｅｏｃｉｎ入り培地で培養し、上記ベクターが組み込まれた細胞をクローニングしてγＰＫＣ−ＧＦＰの発現が観察されるＣＨＯ株を樹立した。誘導薬物としてＭｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ １０ｎＭを用いて処置後３日目でγＰＫＣ−ＧＦＰの発現が確認できた。また誘導薬物が存在しない場合にはγＰＫＣ−ＧＦＰの発現しないことが確認できた（図６）。変異γＰＫＣ−ＧＦＰの発現についても同様に薬物誘導について検討した。野生型よりは発現量が低いが発現した（図７）。
【００１８】
タンパク質凝集改善効果を有するトレハロースの効果をＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈシステムにより確認した（図８、９ 表６）。
【００１９】
またヒト神経由来細胞（ＳＨ−ＳＹ ５Ｙ）を用いる場合においては、テトラサイクリンにより発現調節可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である。この場合高効率に発現させることが可能であり、細胞死に対する薬物をスクリーニングするのに適している。Ｔｅｔ制御システムの概略を図１０に示した。このシステムを用いて、ヒト神経由来細胞（ＳＨ−ＳＹ ５Ｙ）に変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能であり（図１１）、この系においてもタンパク質凝集改善効果を有するトレハロースの効果を確認した。
【００２０】
また小脳プルキンエ細胞にも、テトラサイクリンにより制御可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である（図１１）。ＳＣＡ１４の病変の主座となるプルキンエ細胞を用いたスクリーニング系であるので、臨床的価値も高い。小脳プルキンエ細胞を用いた際にも変異γＰＫＣ−ＧＦＰは凝集体を形成し（図１３）、ＦＲＡＰ解析を行ったところ、流動性の低下が観察されたので（図１２、１４）、薬物スクリーニングの定量的な解析法としてＦＲＡＰ解析の有用性が確認された。
【実施例】
【００２１】
（実験材料）
細胞培養に用いたＦ−１２、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ） およびｔｒｅｈａｌｏｓｅはＳｉｇｍａ社、ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ） はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、ペニシリン、ストレプトマイシン、ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体はナカライテスク社、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からそれぞれ購入した。
【００２２】
（細胞培養）
ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞はそれぞれＦ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２／ＤＭＥＭ混合培地で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。これらの培地には１０％ＦＢＳ及びペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００２３】
（実施例１：ＧＦＰ融合γＰＫＣのタンパク質をコードするＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡの作製）
Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い、以下の手順で ２種類の一塩基変異（Ｓ１１９Ｐ： Ｓｅｒ１１９をＰｒｏに置換、Ｇ１２８Ｄ： Ｇｌｙ１２８をＡｓｐに置換、図１−１）をｈｕｍａｎ γＰＫＣ ｃＤＮＡに導入した。
【００２４】
（変異を導入したγＰＫＣ ｃＤＮＡの合成）
目的遺伝子変異を導入し、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして５’末端をリン酸化したオリゴヌクレオチドを合成した（Ｓｉｇｍａ社に依頼）。
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔのプロトコールに従い、以下の条件でサーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｐｅｒｓｏｎａｌ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いてＤＮＡ合成反応を行った。
【００２５】
反応液の組成を表1に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
反応条件を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
反応終了後、反応液にＤｐｎＩを１μｌ加え、３７℃で１．５〜２時間反応させることにより、鋳型ＤＮＡを切断した。これにより、変異γＰＫＣ ｃＤＮＡを含む一本鎖プラスミドが残る。
【００３０】
（大腸菌への形質導入）
ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ（一本鎖プラスミドを二本鎖にして増幅することが可能な大腸菌）コンピテントセルを氷上で融解させ、４５μｌのＸＬ−１０ Ｇｏｌｄに２μｌのメルカプトエタノールを加え、氷上で１０分インキュベートした。次にＤｐｎＩ処置済み反応液１．５μｌをＸＬ−１０ Ｇｏｌｄに加えて氷上で３０分インキュベートした。さらに、Ｂｌｏｃｋ ｉｎｃｕｂａｔｏｒを用いて、４２℃で３０秒間ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋを与え、氷上で２分間インキュベートし、４２℃に温めておいたＮＺＹ ｍｅｄｉｕｍを５００μｌ加え、３７℃でバイオシェーカー（タイテック社、ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて１時間振とうさせた。その後３０００ｒｐｍで５分遠心して菌を沈殿させ、上清４００μｌを除去して、残りの液に菌を懸濁させてアンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）Ｌ−Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ） 寒天培地（１０ｇ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ５ｇ Ｂａｃｔ−ｙｅａｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １０ｇ ＮａＣｌ， １．５％（ｗ／ｖ） Ｂａｃｔｏ−ａｇｅｒ／Ｌ）へ植菌し、３７℃で一晩培養した。
【００３１】
（変異γＰＫＣ ｃＤＮＡを含むプラスミドの単離）
２ｍｌのアンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）液体ＬＢ培地に、ＬＢプレートからコロニーを植菌し、３７℃でバイオシェーカーにより振とうさせた。植菌の際にアンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地にも植菌し、マスタープレートとし、１２〜１６時間後、プラスミド精製機（Ｋｕｒａｂｏ社、ＰＩ−５０）を用いて培養液からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド適当量をＡｐａＩを用いて３７℃で１時間反応させ、制限酵素処理を行った。反応物にローディングバッファーを適当量加え、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、制限酵素断片の長さにより、γＰＫＣ ｃＤＮＡを含むプラスミドであるかどうかを確認した。
【００３２】
（アガロースゲル）
必要量のアガロースを０．５×ＴＢＥ（４３．２ｇ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ，
２２ｇ ホウ酸， １６ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０／ｔｏｔａｌ ８Ｌ）に加え、オートクレープをかけた後、６５℃程度まで冷却させ、１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液を１００μｌ／Ｌで加え、ゲル作製器に流し込み固化させ、サイクルシークエンス法により、変異を入れた部位の遺伝子配列を確認し、変異の導入されたγＰＫＣのｃＤＮＡを含むプラスミドを選び出した。
【００３３】
（サイクルシークエンス法）
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、サーマルサイク
ラーによりシークエンス反応を行った。シークエンス反応液の組成を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
反応条件を表４に示す。
【００３６】
【表４】
【００３７】
ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ−Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｓｉｇｍａ社）を用いてＤＮＡを精製し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を確認した。
【００３８】
（変異γＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡの発現ベクターｐｃＤＮＡ３へのサブクローニング）
シークエンスにより塩基配列の確認された、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）をコードするプラスミドを、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩ を用いて３７℃で１時間反応させ、制限酵素処理を行い、アガロースゲルに泳動した。目的のバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社） を用いてＤＮＡ断片を３０μｌのＡＣ水に溶出した。既に作製済みの野生型γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３を、Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて３７℃で１時間反応させ、制限酵素処理を行いＤＮＡ断片を１と同様の方法で回収し、ｐｃＤＮＡ３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて３７℃で１時間制限酵素処理を行い、８０℃で１０分インキュベートすることにより、制限酵素を失活させた。上記で得られた２つのＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔ Ｉ ｓｉｔｅへ挿入するため、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２ （Ｔａｋａｒａ社）を用いて、１６℃で２時間インキュベートすることでｌｉｇａｔｉｏｎを行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応液組成を表５に示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】
（大腸菌への形質導入）
コンピテントセルＤＨ５αを氷上で融解させ、ｌｉｇａｔｉｏｎ終了後のチューブに、
コンピテントセルを１００μｌ／ｔｕｂｅ加え、混和し、氷上で３０分間インキュベートした。さらにブロックインキュベーターにて４２℃、４５秒間ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋを加え、氷上で３分インキュベートし、ＳＯＣ培地（２０．０ｇ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ５．０ｇ Ｂａｃｔ−ｙｅａｔ ｅｘｔｒａｃｔ， ２．０ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ， １．２５ｍｌ ２Ｍ ＫＣｌ ／ ｔｏｔａｌ ９７０ｍｌに別の試薬瓶でオートクレーブした２Ｍ Ｍｇ２＋液（１Ｍ ＭｇＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ＋１Ｍ ＭｇＣｌ２・６
Ｈ２Ｏ）を１０ｍｌと、フィルター滅菌した１Ｍ ｇｌｕｃｏｓｅ液を２０ｍｌ加えた）を９００μｌ／ｔｕｂｅ加え、３７℃で３０〜６０分バイオシェーカーで振とう培養させた。３０００ｒｐｍで５分間遠心、上清のうち８８０μｌを捨て、残りの液で菌を懸濁し、アンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した。ＩＩＩと同様の方法により変異γＰＫＣ−ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを単離・確認した。
【００４１】
（プラスミドの大量精製）
目的のｃＤＮＡ（γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ）を含むプラスミドが形質導入された大腸菌をマスタープレートから２５０ｍｌの アンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）液体ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間以上振とう培養した。Ｇｅｎｏｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドの精製を行った。抽出したプラスミドを適当量取り、制限酵素処理およびサイクルシークエンスを行うことにより、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含むプラスミドであると同定した。
【００４２】
（変異γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を持つＣＨＯ細胞株の樹立）
変異γＰＫＣ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞株の樹立にはｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅを用いて遺伝子発現を誘導するＧｅｎｅＳｗｉｔｈｃｈ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。このシステムの概要を図４に示す。
【００４３】
図４に示すように、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍは、誘導薬物ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅの存在時のみに目的遺伝子を発現させるシステムであり、細胞障害性のあるタンパク質などを任意の時期に発現させることができるシステムである。これを用いて、以下に記した方法により、細胞障害性のあると考えられるγＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰの遺伝子を安定的に保持するＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯを作製した。
【００４４】
（ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａへの変異γＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡのサブクローニング）
γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３をそれぞれＨｉｎｄ ＩＩＩ ／ Ｘｂａ Ｉを用いて制限酵素処理を行い、ＤＮＡ断片を回収した。ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａ（図５）を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ／ Ｓｐｅ Ｉを用いて切断し、１で得たＤＮＡ断片とｌｉｇａｔｉｏｎした。ＤＨ５αへｌｉｇａｔｉｏｎ産物を形質導入し、アンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。上記ＩＩＩと同様の方法により、変異γＰＫＣ−ＧＦＰを含むｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａを精製・単離した。上記Ｖと同様の方法により、変異γＰＫＣ−ＧＦＰを含むｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａを大量精製した。
【００４５】
（安定的に変異γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を持つＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯの作製）
ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞（ｐＳｗｉｔｃｈ（図５）をすでに安定的に組み込んであるＣＨＯ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６ｃｈ ｄｉｓｈ ３枚に播種した。野生型（ＷＴ）γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫ
Ｃ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ をそれぞれサブクローニングしたｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓの３種のプラスミドを、ＦｕＧｅｎｅ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて５μｇ／ｄｉｓｈで６ｃｈ ｄｉｓｈ へｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎし、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）入りのＦ−１２培地にて培養した。
【００４６】
（リポフェクション法による培養細胞内への遺伝子導入）
細胞を６ｃｍ ｄｉｓｈへ用意し、１．５ｍｌエッペンチューブに１０μｌのＦｕＧｅｎｅ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを入れ、そこへ無血清培地を５００μｌ加えた。プラスミド液５μｇ分を上記液に加え、Ｖｏｒｔｅｘ、遠心し、室温で１０分間インキュベートし、上記６ｃｍ ｄｉｓｈへ上記リポフェクション液を添加し、３７℃インキュベーター中で培養した。
翌日、Ｚｅｏｃｉｎ （２４０μｇ／ｍｌ）／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ （１００μｇ／ｍｌ）入りのＦ−１２培地に交換し、６ｃｍ ｄｉｓｈにｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で細胞を回収し、１０ｍｌの培養液に浮遊させた。単一細胞由来のコロニーを得るために、３枚の１０ｃｍ ｄｉｓｈへ１μｌ（１／１００００）、２μｌ（１／５０００）、１０μｌ（１／１０００）ずつまき、Ｚｅｏｃｉｎ／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ入りのＦ−１２培地にて培養した。コロニーの形成を確認後、顕微鏡下でそれぞれのコロニーから細胞をマイクロピペットで回収し、あらかじめ１ｍｌの培地（Ｚｅｏｃｉｎ／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ入り）を入れておいた２４プレートに移植し培養した。細胞が増殖したら、各ウェルの細胞をトリプシンではがし、一部を別の２４ウェルプレートあるいは６ｃｍ ｄｉｓｈに移して、誘導薬物ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ （１０ｎＭ）存在下で培養した。数日後、６で発現誘導をかけた細胞を蛍光顕微鏡での観察あるいはＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析を行い、γＰＫＣ−ＧＦＰの発現の見られるクローンを選び出し、選出したクローンの細胞を３．５ｃｍ ｄｉｓｈガラスボトムディッシュに播種し、１０ｎＭ ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎ存在下、あるいは非存在下で３日間培養した。３日後に細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察し、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ存在時のみにγＰＫＣ−ＧＦＰが全ての細胞で発現するクローンを、γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を安定的に持つＣＨＯ細胞株とした。
【００４７】
（ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞における変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成に対するｔｒｅｈａｌｏｓｅの効果の検討）
上記で樹立したＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞株を３×１０４ｃｅｌｌｓ／１ｍｌで培地中に懸濁し、３．５ｃｍガラスボトムディッシュに播種し。細胞接着後、最終濃度１０ｎＭのｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅを処置し、６日間培養を行った。これにより、γＰＫＣ−ＧＦＰの発現が誘導され、変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成が観察された。その後Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅと同時に最終濃度０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭのｔｒｅｈａｌｏｓｅ処置を行い、６日間培養を行った。変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成に対し、ｔｒｅｈａｌｏｓｅがどのような影響を及ぼすかを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞を観察し検討した。凝集細胞／発現細胞の割合とχ二乗検定の結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】
・ ｐ＜０．０１
Ｓ１１９ＰおよびＧ１２８ＤともにＴｒｅｈａｒｏｓｅ０．１ｍＭで凝集形成が有意に抑制された。Ｓ１１９ＰにおいてはＴｒｅｈａｒｏｓｅ０．５ｍＭにおいても効果が見られた。
【００５０】
（実施例２：組換えアデノウイルスベクターの作製）
アデノウイルスベクターによるγＰＫＣ−ＧＦＰの遺伝子導入は発現誘導可能なテトラサイクリン（Ｔｅｔ）制御システムを用いて行った（図１０）。このシステムを用いることにより、テトラサイクリン添加により発現を抑制することができるため、一過性の遺伝子発現誘導が可能となる［３３］。アデノウイルスベクターの作製はＡｄＥａｓｙ Ａｄｅｎｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ＴｅｔＯｐプロモーターの下流でＷＴ γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ を発現させるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ）の作製を行った。それをＣＭＶプロモーターの下流でｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ
（ｔＴＡ）を発現させるアデノウイルスベクターと共感染させることで、γＰＫＣ−ＧＦＰを培養細胞に発現させた（図１１）。
【００５１】
ＴｅｔＯｐ ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｏｒは、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔＴＡ）が結合することにより下流の目的遺伝子を発現させることができる。その際、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅが存在すると、ｔＴＡはＴｅｔＯｐ
ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｏｒに結合できなくなり、目的遺伝子の発現が妨げられる。よって、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅにより遺伝子発現制御が可能となる。
【００５２】
（ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターへのγＰＫＣ−ＧＦＰの組み込み）
ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターには、ｐｏｌｙ
Ａ ｓｉｇｎａｌがないため、ＷＴ γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰが発現ベクターｐｃＤＮＡ３に組み込まれたプラスミドを鋳型とし、ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌとγＰＫＣ−ＧＦＰを含む断片をＰＣＲ反応により増幅させた。
【００５３】
ＰＣＲ反応液の組成を表６に示す。
【００５４】
【表７】
【００５５】
ＰＣＲ反応条件を表７に示す。
【００５６】
【表８】
【００５７】
プライマーの配列は以下の通りである。
【００５８】
ＰＫＣ−ＥｃｏＲＩ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ＧＡＡＴＴＣＧＣＣ
ＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧ
ｃＤＮＡ３−ｐｏｌｙＡ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ＡＴＣＣＣＣＡＧ
ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴ
ＰＣＲ産物２５μｌにローディングバッファーを適当量加え、１％アガロー
スゲルを用いて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて３０００ｂ．ｐ．のバンドをゲルから回収した。その際ＤＮＡ断片は１００μｌＡＣ水に溶出させた。
【００５９】
（エタノール沈殿）
ＡＣ水１００μｌに溶出させたＤＮＡと１０μｌの２．５Ｍ 酢酸ナトリウム、２５０μｌの１００％エタノールを混和し、１５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清をピペットで吸引し、７０％エタノール１００μｌを加え、さらに１分遠心し、上清をピペットで吸引した。ＤＮＡ Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＴＯＹＯＢＯ社） を用いてγＰＫＣ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片の両端をリン酸化し、７５μｌのＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに溶かし、９０℃で２分インキュベートし、さらに氷上で２分インキュベートし、急速に冷却して、表８に示す液を加え、混和し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６０】
【表９】
【００６１】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ断片を回収し、３０μｌのＡＣ水へ溶出させた。上記で得られたＰＣＲ断片は平滑末端であるため、それを組み込むためのベクターも平滑末端にする必要がある。そのために、ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断した後、ＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、制限酵素切断片の平滑化を行った。ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ切断産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、上記で示したエタノール沈殿を行い、８μｌのＡＣ水に溶かし、１μｌの１０×ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で５分インキュベートし、さらに１μｌのＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加し、３７℃で５分インキュベートし、Ｖ
ｏｒｔｅｘして酵素を失活させた後、直ちにＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、４４μｌのＡＣ水に溶出した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ時のｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎを抑制するため、ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ＣＩＡＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて脱リン酸化を行った。４４ μｌで溶出したｂｌｕｎｔｉｎｇ産物に、１μｌのＣＩＡＰと５μｌのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ ＰＬＵＳ ｂｕｆｆｅｒを加えて、３７℃で３０分インキュベートし、さらに、１μｌのＣＩＡＰを加え、５５℃で１時間インキュベートした。１％アガロースゲルに泳動し、約７０００ｂ．ｐ．のバンドをゲルから切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を回収し、３０μｌのＡＣ水へ溶出した。γＰＫＣ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片とＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅを上記と同様の手順でｌｉｇａｔｉｏｎした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ終了後、ＤＨ５αコンピテントセルへトランスフォームし、カナマイシン含有（３０ｍｇ／ｌ））寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、２ｍｌのカナマイシン含有（３０ｍｇ／ｌ）液体ＬＢ培地に、ＬＢプレートからコロニーを植菌し、３７℃でバイオシェーカーにより振とうさせた。植菌の際にカナマイシン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地にも植菌し、マスタープレートとした。上記と同様の方法により、γＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含むＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＳｈｕｔｔｌｅ）を精製・単離した。ＰＣＲにより増幅したγＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡの遺伝子配列は上記と同様にサイクルシークエンス法により確認した。上述と同様の方法により、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＳｈｕｔｔｌｅを大量精製した。
【００６２】
（大腸菌内での組換えアデノウイルスプラスミドの作製）
ＷＴ γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ を組み込んだシャトルベクター（ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＳｈｕｔｔｌｅ）をＰｍｅ Ｉにより切断し、直鎖化した。１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで４０分程度電気泳動した後、ゲルからバンドのやや上方を切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて直鎖化したプラスミドＤＮＡを精製し、３０μｌのＡＣ水へ溶出させた。アデノウイルスバックボーンベクター（ｐＡｄＥａｓｙ−１）を１μｇ／μｌになるようＡＣ水１μｌに懸濁し、１で精製したプラスミドＤＮＡを１５μｇ加え、混和した。
【００６３】
さらに氷上で融解した大腸菌ＢＪ５１８３ （エレクトロポレーション用に調整したコンピテントセル） を２０μｌ加え、２．０ｍｍキュベットに移した。２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦＤの条件下でＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてエレクトロポレーションし、シャトルベクターとアデノウイルスバックボーンベクターのｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。これにより、大腸菌内で相同組換えが起こると、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰを含むアデノウイルスプラスミド（ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １）ができる。
【００６４】
エレクトロポレーション後、キュベットに５００μｌのＬＢ培地を加え、１．５ｍｌエッペンチューブへ移し、３７℃で１時間程度振とうさせた。３０００ｒｐｍで５分遠心。
【００６５】
上清４５０μｌを捨て、残りをカナマイシン含有（６０ｍｇ／ｌ））寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間以上培養した。翌日数個のコロニーをカナマイシン入りのＬＢ培地２ｍｌに植菌し、１２〜１６時間振とうさせ、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法でプラスミドを精製した。
【００６６】
電気泳動により、スーパーコイル状態でのプラスミドのサイズ（３５ｋｂ）及びＰａｃ
Ｉによる切断パターン（２０ｋｂ以上と３．５ｋｂ（あるいは４ｋｂ））を調べ、それ
らを参考にシャトルベクターとアデノウイルスバックボーンベクターの相同組換えが起こり、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １ができたことを確認した。
【００６７】
相同組換えの起こったクローン１０μｌをＤＨ５α コンピテントセル１００μｌにトランスフォームし、カナマイシン含有（３０ｍｇ／ｌ））寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１２〜１６時間培養した。翌日コロニーを拾ってカナマイシン入りのＬＢ培地２ｍｌ中で１２〜１６時間振とうさせ、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法でプラスミドを精製した。
【００６８】
抽出したプラスミドをＰａｃＩで処理し、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １であることを確認した。上記と同様の方法により、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １を大量精製した。
【００６９】
サイクルシークエンス法により、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １中のγＰＫＣ（ＷＴ、Ｓ１１９Ｐ、Ｇ１２８Ｄ）の配列が正しいことを確認した（図１０）。
【００７０】
（マウス小脳初代培養プルキンエ細胞におけるγＰＫＣ−ＧＦＰの蛍光観察）
（生細胞の観察）
ＤＩＶ２８にマウス小脳初代培養細胞のγＰＫＣ−ＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡で観察し、野生型及び変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現するプルキンエ細胞中にγＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体が見られる細胞が何個あるかを計数した。共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて、プルキンエ細胞のＧＦＰ蛍光画像を取り込んだ。ＧＦＰ蛍光は４８８ｎｍアルゴンレーザーで励起させ、５０５−５３５ｎｍ ｂａｎｄ
ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒを用いて検出した。プルキンエ細胞は厚みがあるため、１つのプルキンエ細胞に対し、１０〜３０枚のＺ軸連続画像を取り込み、ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡソフトウェアを用いて、Ｚ軸連続画像の重ね合わせ画像を作製した。ＧＦＰ蛍光の分布を指標として、γＰＫＣ−ＧＦＰ発現プルキンエ細胞の表面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５．１Ｊ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を用いて計測した。
【００７１】
（生細胞におけるγＰＫＣ−ＧＦＰの刺激誘発トランスロケーション観察） ＤＩＶ２８にマウス小脳初代培養細胞の培地をＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＣｌ
１６５ｍＭ ， ＫＣｌ ５ｍＭ ， ＣａＣｌ２ １ｍＭ ， ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
， ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ ， Ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ ｐＨ７．４）９５０μＬに置換した。
【００７２】
最終濃度の２０倍に調製した刺激薬物を５０μＬ添加し、γＰＫＣ−ＧＦＰの刺激を行った。刺激誘発γＰＫＣ−ＧＦＰのトランスロケーションの観察は、刺激前後のＧＦＰ蛍光を共焦点レーザー顕微鏡を用いて一定時間毎の連続画像を取り込むことにより行った。野生型と変異γＰＫＣ−ＧＦＰとの間でトランスロケーションに違いが見られるかを検討した。
【００７３】
５０ｍＭ ＫＣｌ ＋ ５０μＭグルタミン酸刺激を与え、連続画像の取り込みは１秒間隔で行い、１０分間の画像を取得した。
【００７４】
１μＭ ＴＰＡ （１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｏｐｈｏｒｂｏ１−１３−ａｃｅｔａｔｅ）刺激を与え、連続画像の取り込みは３０秒間隔で行い、３０分間の画像を取得した。
【００７５】
（生細胞におけるγＰＫＣ−ＧＦＰのＦＲＡＰ解析）
ＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）とは、蛍光タンパク質を発現した生細胞の一部に強い励起光を照射し、その部分の蛍光を退色させた（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）後、周囲から移動してきた蛍光タンパク質により退色部分の蛍光がどれくらいの速さで回復するかを解析する実験手法である（図１２）。これにより、発現した蛍光タンパク質の細胞内での流動性を検討することができる（Ｍｅｙｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００７６】
ＤＩＶ２８にマウス小脳初代培養細胞の培地をＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬに置換し、野生型及び変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現するプルキンエ細胞中で凝集体のない細胞のＧＦＰ蛍光画像を共焦点レーザー顕微鏡で取り込んだ。その細胞の細胞体の一部に強い励起光を連続照射して、その部分のＧＦＰ蛍光を退色させた。その後のＧＦＰ蛍光の変化を一定時間毎の連続画像を取り込むことにより観察した。
【００７７】
照射部分の蛍光強度の経時変化をＬＳＭ５１０ＭＥＴＡソフトウェアにより解析し、野生型と変異γＰＫＣ−ＧＦＰの間で細胞内の流動性に違いが見られるかどうかを検討した。同一ディッシュ内細胞を用いて上記の手順を３回繰り返し、その平均を一回の実験結果とした。そして、この実験を３回行い、野生型及び変異型の蛍光回復を比較した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、γＰＫＣの遺伝子の構造とＳＣＡ１４で発見された遺伝子変異である。
【図２】図２は、ＣＨＯ細胞に発現させた変異γＰＫＣ−ＧＦＰの観察結果である。野生型γＰＫＣ−ＧＦＰは細胞質に均質に分布している。変異γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰおよび変異γＰＫＣ（Ｑ１２７Ｒ）−ＧＦＰの場合は細胞質に凝集体が観察される。下段の図は凝集体を形成する変異γＰＫＣの過剰発現により細胞死が起こる。
【図３】図３は変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることにより細胞死が引き起こされることを示す図である。Ｓ１１９Ｐ変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させると野生型γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させたときと比較して死細胞の割合が高くなる。
【図４】図４は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈシステムの概要を示す。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅが存在しないときはプラスミド１とプラスミド２は結合せずＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質およびγＰＫＣ−ＧＦＰは殆ど発現されず、一方Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅが存在するときはそれを介してプラスミド１およびプラスミド２が２量体化し、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質およびγＰＫＣ−ＧＦＰの発現が増大する。
【図５】図５は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質のｃＤＮＡを組み込んだプラスミド１の構造、および変異γＰＫＣ−ＧＦＰのｃＤＮＡを組み込んだプラスミド２の構造である。
【図６】図６は、野生型γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を含有するＣＨＯ細胞が、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅの存在下および非存在下で野生型γＰＫＣ−ＧＦＰの発現が異なることを示す。
【図７】図７は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈシステムよる野生型γＰＫＣ−ＧＦＰおよび変異γＰＫＣ−ＧＦＰの発現を示す。野生型γＰＫＣ−ＧＦＰの場合は凝集を示さないが、変異型γＰＫＣ−ＧＦＰの場合は、凝集体を形成する。
【図８】図８は、変異型γＰＫＣ−ＧＦＰ（Ｓ１１９Ｐ）にトレハロース処理した場合の凝集体の形成の減少を示す。
【図９】図９は、変異型γＰＫＣ−ＧＦＰ（Ｇ１２８Ｄ）にトレハロース処理した場合の凝集体の形成の減少を示す。
【図１０】図１０は、アデノウイルスベクターによるγＰＫＣ−ＧＦＰの遺伝子導入に用いた発現誘導可能なテトラサイクリン’Ｔｅｔ）制御システムを示す。
【図１１】図１１は、アデノウイルスベクターによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞へのγＰＫＣ−ＧＦＰの発現と変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成を示す。
【図１２】図１２は、ＦＲＡＰ解析の模式図（Ａ）と退色部分の蛍光強度変化の例（Ｂ）を示す。Ａ （ａ）：Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ前。（ｂ）：Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ直後は照射部分の蛍光強度が著しく低下。（ｃ）：時間経過とともに周囲の蛍光タンパク質が照射部分に移動することで、蛍光回復。（ｄ）：しばらくすると、照射部分の蛍光が周囲と同じにまで回復する。
【００７９】
Ｂ 流動性の高い蛍光タンパク質は励起光照射中もタンパク質が照射部分に素早く移
動し続けているため、ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ直後の蛍光強度の低下が弱く、その後の蛍光回復は早い。一方、流動性の低い蛍光タンパク質は細胞内をゆっくりとしか移動できないため、ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ直後の 蛍光強度は著しく低下し、その後の蛍光回復も遅い。
【図１３】図１３は、γＰＫＣ−ＧＦＰ発現プルキンエ細胞中の凝集体が観察される細胞の割合（％）を示す。変異γＰＫＣ−ＧＦＰはプルキンエ細胞内で凝集体を形成しやすい。
【図１４】図１４は、γＰＫＣ−ＧＦＰ発現プルキンエ細胞についてＦＲＡＰ解析（退色部位の蛍光強度の経時変化、回復時間）の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１は、変異γＰＫＣ−ＧＦＰ（Ｓ１１９Ｐ）遺伝子の核酸配列である。
【００８１】
配列番号２は、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質遺伝子の核酸配列である。
【００８２】
配列番号３は、ｐＧｅｎｅＶ５Ｈｉｓの核酸配列である。
【００８３】
配列番号４は、ｐＳｗｉｔｃｈの核酸配列である。
配列番号５は、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ （ｔＴＡ）の核酸配列である。
配列番号６は、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の核酸配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患において異常凝集タンパク質の蓄積に起因するタンパク質蓄積による神経変性疾患を治療する薬物をスクリーニングするためのベクター、それを導入した細胞、およびそれらを含むスクリーニング系に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患発症に共通の性質とは１つには遺伝性発症であり、他の臓器疾患と比較して遺伝性のものが圧倒的に多い。神経変性疾患に共通する特徴の第２は選択的な細胞死を伴っていることが多いことである。神経変性疾患に関連して指摘すべきもう１つの点は、神経変性疾患における神経細胞死がアポトーシスではないかと考えられていることである（非特許文献１）。 また神経変性疾患にはポリグルタミン病、ハンチントン病、ピック病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳変性症、プリオン病などのタンパク質の凝集に起因すると考えられていることが多く、例えば、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病などはポリグルタミン、アルツハイマー病ではβアミロイド（Ａβ）、Ｔａｕタンパク質、プレセニリン、パーキンソン病ではαーシヌクレイン、ＡＬＳではスーパーオキシドムターゼ１（ＳＯＤ１）、脊髄小脳変性症においてガンマプロテインキナーゼ（γＰＫＣ）などの変異によりタンパク質が核内を含む細胞内外で凝集、蓄積することにより神経変性疾患が発症すると考えられている(非特許文献２)。これらの疾患は変異する遺伝子の位置など分かっているものもあり、例えば脊髄小脳変性症においてγＰＫＣ遺伝子の制御ドメインのＣ１Ｂ変異が多く発見されている（図１）。しかしながら点変異で変異が起こるものについては、通常の核酸のハイブリダイゼーションなどで異常を発見するのは困難である。また、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングとしてトランスジェニックマウスを用いた方法（特許文献１）が開示されているが、トランスジェニックマウスを用いたアッセイ系では多くの化合物のスクリーニングが困難である。
【非特許文献１】最新内科学体系、第６８巻、神経変性疾患、編集：井村裕夫、尾形悦郎、高久史麿、垂井清一郎、発行所：中山書店（１９９７年）、３〜７ｐ
【非特許文献２】細胞工学、第２０巻、第１１号、岩坪威、１４７４〜１４７７（２００１）
【特許文献１】特開２００３−２６７８７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のごとくタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患は多岐にわたり、それらの治療薬候補を的確に、簡便にできるスクリーニング方法の確立が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記実情を鑑み鋭意研究した結果、凝集体を形成する変異タンパク質をコードする遺伝子、タンパク質の凝集を追跡可能とする緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、薬剤により変異タンパク質と緑色蛍光タンパク質の発現を薬剤で調節可能な遺伝子を含むベクターを哺乳類の細胞に導入して、タンパク質凝集に起因する神経変性疾患の治療のための薬剤をスクリーニングする系を確立した。例えば、脊髄小脳変性症におけるタンパク質凝集に起因する変異タンパク質γＰＫＣをコードする遺伝子、タンパク質凝集を追跡するための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、および薬剤により前記タンパク質の発現を調節可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ遺伝子を含むベクターを用いてタンパク質が凝集する系を確立した。しかしながらタンパク質の凝集体が形成されると
細胞はアポトーシスを起こしたり、また小脳プルキンエ細胞では樹状突起の広がりが小さくなり形態的に異なるものになって適切な評価はできなくなる。例えばＣＨＯ細胞を用いる場合、ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅでタンパク質発現を調節可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質をコードする遺伝子を用いたり、小脳プルキンエ細胞を使用する場合には、テトラサイクリンにより制御可能なテトラサイクリントランスアクティベーター遺伝子を用いて細胞のアポトーシス、または小脳プルキンエ細胞の場合は樹状突起の形態の異常を抑制して、タンパク質凝集を治療するための薬物の評価を行うこと可能にし、さらにそのような薬剤で処理することにより凝集体の形成を改善させたことを確認し、本発明にいたった。
【０００５】
変異γＰＫＣ、ＧＦＰおよびＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【０００６】
変異γＰＫＣ、ＧＦＰおよびテトラサイクリンによりγＰＫＣ−ＧＦＰ発現が制御可能遺伝子を含むベクターを提供するものである。
【０００７】
上記ベクターを用いてタンパク質蓄積による神経変性疾患治療薬物候補のスクリーニングキット及び方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明について詳細について説明する。
【０００９】
本明細書では、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従い、塩基配列、核酸配列、遺伝子配列、アミノ酸配列等を各種略号により表示する。
【００１０】
本明細書では、変異を表す、例えば「Ｈ１０１Ｙ」とはアミノ末端から１０１位のヒスチジンがチロシンに変異したことを示す。 例えば「Ｓ１１９Ｆ」とはアミノ酸末端から１１９位のセリンがフェニルアラニンに変異したことを示す。
【００１１】
凝集体を形成する変異タンパク質をコードする遺伝子、タンパク質の凝集を追跡可能とする緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、薬剤により変異タンパク質と緑色蛍光タンパク質の発現を薬剤で調節可能な遺伝子を含むベクターを哺乳類の細胞に導入して、タンパク質凝集に起因する神経変性疾患の治療のための薬剤をスクリーニングする系を確立した。変異タンパク質としてはポリグルタミン、βアミロイド（Ａβ）、Ｔａｕタンパク質、プレセニリン、αーシヌクレイン、スーパーオキシドムターゼ１（ＳＯＤ１）、ガンマプロテインキナーゼ（γＰＫＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
また、薬剤によりタンパク質の発現を調節可能とする遺伝子としては、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ遺伝子およびテトラサイクリントランスアクティベーター遺伝子などが挙げられるが。これらに限定されない。例えば、より詳細には脊髄小脳変性症におけるタンパク質凝集に起因する変異タンパク質γＰＫＣ−ＧＦＰをコードする遺伝子、タンパク質凝集を追跡するための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、および薬剤により前記タンパク質の発現を調節可能とする遺伝子を含むベクターを細胞に導入して、タンパク質凝集を抑制する系を確立した。導入する細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト神経由来細胞、小脳プルキンエ細胞が挙げられ、それらは株化されていても良く、プライマリーカルチャーでも良いが、これらに限定されない。
【００１３】
タンパク質の凝集体が形成されると細胞はアポトーシスを起こしたり、また小脳プルキンエ細胞では樹状突起の広がりが小さくなり形態的に異なるものになって適切な評価はで
きなくなる。例えばＣＨＯ細胞を用いる場合、ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅでタンパク質発現を調節可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質をコードする遺伝子を用いることにより発現を調節することが可能である。またヒト神経由来細胞（ＳＨ−ＳＹ ５Ｙ）を用いる場合においては、テトラサイクリンにより発現調節可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である。この場合高効率に発現させることが可能であり、細胞死に対する薬物をスクリーニングするのに適している。また小脳プルキンエ細胞を使用する場合には、テトラサイクリンにより制御可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である。ＳＣＡ１４の病変の主座となるプルキンエ細胞を用いたスクリーニング系であるので、臨床的価値も高い。
【００１４】
（細胞内でのタンパク質凝集体発現）
遺伝性脊髄小脳失調症１４型（ＳＣＡ１４）の原因遺伝子としてγＰＫＣの変異ということが分かっている。またこれらの変異はγＰＫＣ発現遺伝子のＣ１Ｂ制御ドメインに多くの変異が発見されている（図１）。
【００１５】
この遺伝子と凝集を追跡するためのＧＦＰをコードする遺伝子を細胞、例えばＣＨＯに導入して、タンパク質を発現させる場合、野生型のγＰＫＣと変異γＰＫＣと比較すると変異γＰＫＣを用いた場合の方が細胞質内での凝集が顕著であった（図２）。細胞質内でのタンパク質凝集の度合いをＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ、ＭｅｔａＭｏｒｐｈなどの画像解析ソフトを用いて行うことができる。
【００１６】
またＦＲＡＰ解析を用いて、タンパク質の流動性を測定すれば、タンパク質の凝集の指標として定量的な解析も可能である（図１２）。
【００１７】
しかしながら、細胞質内でたんぱく質凝集が起こると細胞死が誘発され（図３）、薬物のスクリーニング系には不適切である。そこで特定の薬物が存在する場合にのみ変異γＰＫＣ−ＧＦＰが発現するように変異γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子の５’側に発現調節領域としてＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ遺伝子を導入したベクターを作成した（図４、図５）。即ち、γＰＫＣ−ＧＦＰｃＤＮＡをｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓへサブクローニングし、ｐＳｗｉｔｃｈが組み込まれたＣＨＯ細胞へｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓにサブクローニングされたγＰＫＣ−ＧＦＰをリポフェクションし、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ／Ｚｅｏｃｉｎ入り培地で培養し、上記ベクターが組み込まれた細胞をクローニングしてγＰＫＣ−ＧＦＰの発現が観察されるＣＨＯ株を樹立した。誘導薬物としてＭｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ １０ｎＭを用いて処置後３日目でγＰＫＣ−ＧＦＰの発現が確認できた。また誘導薬物が存在しない場合にはγＰＫＣ−ＧＦＰの発現しないことが確認できた（図６）。変異γＰＫＣ−ＧＦＰの発現についても同様に薬物誘導について検討した。野生型よりは発現量が低いが発現した（図７）。
【００１８】
タンパク質凝集改善効果を有するトレハロースの効果をＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈシステムにより確認した（図８、９ 表６）。
【００１９】
またヒト神経由来細胞（ＳＨ−ＳＹ ５Ｙ）を用いる場合においては、テトラサイクリンにより発現調節可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である。この場合高効率に発現させることが可能であり、細胞死に対する薬物をスクリーニングするのに適している。Ｔｅｔ制御システムの概略を図１０に示した。このシステムを用いて、ヒト神経由来細胞（ＳＨ−ＳＹ ５Ｙ）に変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能であり（図１１）、この系においてもタンパク質凝集改善効果を有するトレハロースの効果を確認した。
【００２０】
また小脳プルキンエ細胞にも、テトラサイクリンにより制御可能なＴｅｔ制御システムを用いたアデノウイルスベクターで変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることが可能である（図１１）。ＳＣＡ１４の病変の主座となるプルキンエ細胞を用いたスクリーニング系であるので、臨床的価値も高い。小脳プルキンエ細胞を用いた際にも変異γＰＫＣ−ＧＦＰは凝集体を形成し（図１３）、ＦＲＡＰ解析を行ったところ、流動性の低下が観察されたので（図１２、１４）、薬物スクリーニングの定量的な解析法としてＦＲＡＰ解析の有用性が確認された。
【実施例】
【００２１】
（実験材料）
細胞培養に用いたＦ−１２、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ） およびｔｒｅｈａｌｏｓｅはＳｉｇｍａ社、ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ） はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、ペニシリン、ストレプトマイシン、ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体はナカライテスク社、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からそれぞれ購入した。
【００２２】
（細胞培養）
ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞はそれぞれＦ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２／ＤＭＥＭ混合培地で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。これらの培地には１０％ＦＢＳ及びペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００２３】
（実施例１：ＧＦＰ融合γＰＫＣのタンパク質をコードするＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡの作製）
Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い、以下の手順で ２種類の一塩基変異（Ｓ１１９Ｐ： Ｓｅｒ１１９をＰｒｏに置換、Ｇ１２８Ｄ： Ｇｌｙ１２８をＡｓｐに置換、図１−１）をｈｕｍａｎ γＰＫＣ ｃＤＮＡに導入した。
【００２４】
（変異を導入したγＰＫＣ ｃＤＮＡの合成）
目的遺伝子変異を導入し、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして５’末端をリン酸化したオリゴヌクレオチドを合成した（Ｓｉｇｍａ社に依頼）。
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔのプロトコールに従い、以下の条件でサーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｐｅｒｓｏｎａｌ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いてＤＮＡ合成反応を行った。
【００２５】
反応液の組成を表1に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
反応条件を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
反応終了後、反応液にＤｐｎＩを１μｌ加え、３７℃で１．５〜２時間反応させることにより、鋳型ＤＮＡを切断した。これにより、変異γＰＫＣ ｃＤＮＡを含む一本鎖プラスミドが残る。
【００３０】
（大腸菌への形質導入）
ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ（一本鎖プラスミドを二本鎖にして増幅することが可能な大腸菌）コンピテントセルを氷上で融解させ、４５μｌのＸＬ−１０ Ｇｏｌｄに２μｌのメルカプトエタノールを加え、氷上で１０分インキュベートした。次にＤｐｎＩ処置済み反応液１．５μｌをＸＬ−１０ Ｇｏｌｄに加えて氷上で３０分インキュベートした。さらに、Ｂｌｏｃｋ ｉｎｃｕｂａｔｏｒを用いて、４２℃で３０秒間ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋを与え、氷上で２分間インキュベートし、４２℃に温めておいたＮＺＹ ｍｅｄｉｕｍを５００μｌ加え、３７℃でバイオシェーカー（タイテック社、ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて１時間振とうさせた。その後３０００ｒｐｍで５分遠心して菌を沈殿させ、上清４００μｌを除去して、残りの液に菌を懸濁させてアンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）Ｌ−Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ） 寒天培地（１０ｇ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ５ｇ Ｂａｃｔ−ｙｅａｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １０ｇ ＮａＣｌ， １．５％（ｗ／ｖ） Ｂａｃｔｏ−ａｇｅｒ／Ｌ）へ植菌し、３７℃で一晩培養した。
【００３１】
（変異γＰＫＣ ｃＤＮＡを含むプラスミドの単離）
２ｍｌのアンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）液体ＬＢ培地に、ＬＢプレートからコロニーを植菌し、３７℃でバイオシェーカーにより振とうさせた。植菌の際にアンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地にも植菌し、マスタープレートとし、１２〜１６時間後、プラスミド精製機（Ｋｕｒａｂｏ社、ＰＩ−５０）を用いて培養液からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド適当量をＡｐａＩを用いて３７℃で１時間反応させ、制限酵素処理を行った。反応物にローディングバッファーを適当量加え、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、制限酵素断片の長さにより、γＰＫＣ ｃＤＮＡを含むプラスミドであるかどうかを確認した。
【００３２】
（アガロースゲル）
必要量のアガロースを０．５×ＴＢＥ（４３．２ｇ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ，
２２ｇ ホウ酸， １６ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０／ｔｏｔａｌ ８Ｌ）に加え、オートクレープをかけた後、６５℃程度まで冷却させ、１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液を１００μｌ／Ｌで加え、ゲル作製器に流し込み固化させ、サイクルシークエンス法により、変異を入れた部位の遺伝子配列を確認し、変異の導入されたγＰＫＣのｃＤＮＡを含むプラスミドを選び出した。
【００３３】
（サイクルシークエンス法）
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、サーマルサイク
ラーによりシークエンス反応を行った。シークエンス反応液の組成を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
反応条件を表４に示す。
【００３６】
【表４】
【００３７】
ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ−Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｓｉｇｍａ社）を用いてＤＮＡを精製し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を確認した。
【００３８】
（変異γＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡの発現ベクターｐｃＤＮＡ３へのサブクローニング）
シークエンスにより塩基配列の確認された、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）をコードするプラスミドを、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩ を用いて３７℃で１時間反応させ、制限酵素処理を行い、アガロースゲルに泳動した。目的のバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社） を用いてＤＮＡ断片を３０μｌのＡＣ水に溶出した。既に作製済みの野生型γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３を、Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて３７℃で１時間反応させ、制限酵素処理を行いＤＮＡ断片を１と同様の方法で回収し、ｐｃＤＮＡ３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて３７℃で１時間制限酵素処理を行い、８０℃で１０分インキュベートすることにより、制限酵素を失活させた。上記で得られた２つのＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔ Ｉ ｓｉｔｅへ挿入するため、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２ （Ｔａｋａｒａ社）を用いて、１６℃で２時間インキュベートすることでｌｉｇａｔｉｏｎを行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応液組成を表５に示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】
（大腸菌への形質導入）
コンピテントセルＤＨ５αを氷上で融解させ、ｌｉｇａｔｉｏｎ終了後のチューブに、
コンピテントセルを１００μｌ／ｔｕｂｅ加え、混和し、氷上で３０分間インキュベートした。さらにブロックインキュベーターにて４２℃、４５秒間ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋを加え、氷上で３分インキュベートし、ＳＯＣ培地（２０．０ｇ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ５．０ｇ Ｂａｃｔ−ｙｅａｔ ｅｘｔｒａｃｔ， ２．０ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ， １．２５ｍｌ ２Ｍ ＫＣｌ ／ ｔｏｔａｌ ９７０ｍｌに別の試薬瓶でオートクレーブした２Ｍ Ｍｇ２＋液（１Ｍ ＭｇＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ＋１Ｍ ＭｇＣｌ２・６
Ｈ２Ｏ）を１０ｍｌと、フィルター滅菌した１Ｍ ｇｌｕｃｏｓｅ液を２０ｍｌ加えた）を９００μｌ／ｔｕｂｅ加え、３７℃で３０〜６０分バイオシェーカーで振とう培養させた。３０００ｒｐｍで５分間遠心、上清のうち８８０μｌを捨て、残りの液で菌を懸濁し、アンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した。ＩＩＩと同様の方法により変異γＰＫＣ−ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを単離・確認した。
【００４１】
（プラスミドの大量精製）
目的のｃＤＮＡ（γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ）を含むプラスミドが形質導入された大腸菌をマスタープレートから２５０ｍｌの アンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）液体ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間以上振とう培養した。Ｇｅｎｏｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドの精製を行った。抽出したプラスミドを適当量取り、制限酵素処理およびサイクルシークエンスを行うことにより、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含むプラスミドであると同定した。
【００４２】
（変異γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を持つＣＨＯ細胞株の樹立）
変異γＰＫＣ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞株の樹立にはｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅを用いて遺伝子発現を誘導するＧｅｎｅＳｗｉｔｈｃｈ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。このシステムの概要を図４に示す。
【００４３】
図４に示すように、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍは、誘導薬物ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅの存在時のみに目的遺伝子を発現させるシステムであり、細胞障害性のあるタンパク質などを任意の時期に発現させることができるシステムである。これを用いて、以下に記した方法により、細胞障害性のあると考えられるγＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰの遺伝子を安定的に保持するＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯを作製した。
【００４４】
（ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａへの変異γＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡのサブクローニング）
γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３をそれぞれＨｉｎｄ ＩＩＩ ／ Ｘｂａ Ｉを用いて制限酵素処理を行い、ＤＮＡ断片を回収した。ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａ（図５）を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ／ Ｓｐｅ Ｉを用いて切断し、１で得たＤＮＡ断片とｌｉｇａｔｉｏｎした。ＤＨ５αへｌｉｇａｔｉｏｎ産物を形質導入し、アンピシリン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。上記ＩＩＩと同様の方法により、変異γＰＫＣ−ＧＦＰを含むｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａを精製・単離した。上記Ｖと同様の方法により、変異γＰＫＣ−ＧＦＰを含むｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａを大量精製した。
【００４５】
（安定的に変異γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を持つＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯの作製）
ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞（ｐＳｗｉｔｃｈ（図５）をすでに安定的に組み込んであるＣＨＯ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６ｃｈ ｄｉｓｈ ３枚に播種した。野生型（ＷＴ）γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫ
Ｃ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ をそれぞれサブクローニングしたｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓの３種のプラスミドを、ＦｕＧｅｎｅ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて５μｇ／ｄｉｓｈで６ｃｈ ｄｉｓｈ へｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎし、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）入りのＦ−１２培地にて培養した。
【００４６】
（リポフェクション法による培養細胞内への遺伝子導入）
細胞を６ｃｍ ｄｉｓｈへ用意し、１．５ｍｌエッペンチューブに１０μｌのＦｕＧｅｎｅ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを入れ、そこへ無血清培地を５００μｌ加えた。プラスミド液５μｇ分を上記液に加え、Ｖｏｒｔｅｘ、遠心し、室温で１０分間インキュベートし、上記６ｃｍ ｄｉｓｈへ上記リポフェクション液を添加し、３７℃インキュベーター中で培養した。
翌日、Ｚｅｏｃｉｎ （２４０μｇ／ｍｌ）／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ （１００μｇ／ｍｌ）入りのＦ−１２培地に交換し、６ｃｍ ｄｉｓｈにｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で細胞を回収し、１０ｍｌの培養液に浮遊させた。単一細胞由来のコロニーを得るために、３枚の１０ｃｍ ｄｉｓｈへ１μｌ（１／１００００）、２μｌ（１／５０００）、１０μｌ（１／１０００）ずつまき、Ｚｅｏｃｉｎ／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ入りのＦ−１２培地にて培養した。コロニーの形成を確認後、顕微鏡下でそれぞれのコロニーから細胞をマイクロピペットで回収し、あらかじめ１ｍｌの培地（Ｚｅｏｃｉｎ／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ入り）を入れておいた２４プレートに移植し培養した。細胞が増殖したら、各ウェルの細胞をトリプシンではがし、一部を別の２４ウェルプレートあるいは６ｃｍ ｄｉｓｈに移して、誘導薬物ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ （１０ｎＭ）存在下で培養した。数日後、６で発現誘導をかけた細胞を蛍光顕微鏡での観察あるいはＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析を行い、γＰＫＣ−ＧＦＰの発現の見られるクローンを選び出し、選出したクローンの細胞を３．５ｃｍ ｄｉｓｈガラスボトムディッシュに播種し、１０ｎＭ ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎ存在下、あるいは非存在下で３日間培養した。３日後に細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察し、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ存在時のみにγＰＫＣ−ＧＦＰが全ての細胞で発現するクローンを、γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を安定的に持つＣＨＯ細胞株とした。
【００４７】
（ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞における変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成に対するｔｒｅｈａｌｏｓｅの効果の検討）
上記で樹立したＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＣＨＯ細胞株を３×１０４ｃｅｌｌｓ／１ｍｌで培地中に懸濁し、３．５ｃｍガラスボトムディッシュに播種し。細胞接着後、最終濃度１０ｎＭのｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅを処置し、６日間培養を行った。これにより、γＰＫＣ−ＧＦＰの発現が誘導され、変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成が観察された。その後Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅと同時に最終濃度０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭのｔｒｅｈａｌｏｓｅ処置を行い、６日間培養を行った。変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成に対し、ｔｒｅｈａｌｏｓｅがどのような影響を及ぼすかを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞を観察し検討した。凝集細胞／発現細胞の割合とχ二乗検定の結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】
・ ｐ＜０．０１
Ｓ１１９ＰおよびＧ１２８ＤともにＴｒｅｈａｒｏｓｅ０．１ｍＭで凝集形成が有意に抑制された。Ｓ１１９ＰにおいてはＴｒｅｈａｒｏｓｅ０．５ｍＭにおいても効果が見られた。
【００５０】
（実施例２：組換えアデノウイルスベクターの作製）
アデノウイルスベクターによるγＰＫＣ−ＧＦＰの遺伝子導入は発現誘導可能なテトラサイクリン（Ｔｅｔ）制御システムを用いて行った（図１０）。このシステムを用いることにより、テトラサイクリン添加により発現を抑制することができるため、一過性の遺伝子発現誘導が可能となる［３３］。アデノウイルスベクターの作製はＡｄＥａｓｙ Ａｄｅｎｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ＴｅｔＯｐプロモーターの下流でＷＴ γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ を発現させるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ）の作製を行った。それをＣＭＶプロモーターの下流でｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ
（ｔＴＡ）を発現させるアデノウイルスベクターと共感染させることで、γＰＫＣ−ＧＦＰを培養細胞に発現させた（図１１）。
【００５１】
ＴｅｔＯｐ ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｏｒは、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔＴＡ）が結合することにより下流の目的遺伝子を発現させることができる。その際、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅが存在すると、ｔＴＡはＴｅｔＯｐ
ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｏｒに結合できなくなり、目的遺伝子の発現が妨げられる。よって、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅにより遺伝子発現制御が可能となる。
【００５２】
（ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターへのγＰＫＣ−ＧＦＰの組み込み）
ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターには、ｐｏｌｙ
Ａ ｓｉｇｎａｌがないため、ＷＴ γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰが発現ベクターｐｃＤＮＡ３に組み込まれたプラスミドを鋳型とし、ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌとγＰＫＣ−ＧＦＰを含む断片をＰＣＲ反応により増幅させた。
【００５３】
ＰＣＲ反応液の組成を表６に示す。
【００５４】
【表７】
【００５５】
ＰＣＲ反応条件を表７に示す。
【００５６】
【表８】
【００５７】
プライマーの配列は以下の通りである。
【００５８】
ＰＫＣ−ＥｃｏＲＩ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ＧＡＡＴＴＣＧＣＣ
ＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧ
ｃＤＮＡ３−ｐｏｌｙＡ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ＡＴＣＣＣＣＡＧ
ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴ
ＰＣＲ産物２５μｌにローディングバッファーを適当量加え、１％アガロー
スゲルを用いて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて３０００ｂ．ｐ．のバンドをゲルから回収した。その際ＤＮＡ断片は１００μｌＡＣ水に溶出させた。
【００５９】
（エタノール沈殿）
ＡＣ水１００μｌに溶出させたＤＮＡと１０μｌの２．５Ｍ 酢酸ナトリウム、２５０μｌの１００％エタノールを混和し、１５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清をピペットで吸引し、７０％エタノール１００μｌを加え、さらに１分遠心し、上清をピペットで吸引した。ＤＮＡ Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＴＯＹＯＢＯ社） を用いてγＰＫＣ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片の両端をリン酸化し、７５μｌのＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに溶かし、９０℃で２分インキュベートし、さらに氷上で２分インキュベートし、急速に冷却して、表８に示す液を加え、混和し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６０】
【表９】
【００６１】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ断片を回収し、３０μｌのＡＣ水へ溶出させた。上記で得られたＰＣＲ断片は平滑末端であるため、それを組み込むためのベクターも平滑末端にする必要がある。そのために、ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断した後、ＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、制限酵素切断片の平滑化を行った。ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ切断産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、上記で示したエタノール沈殿を行い、８μｌのＡＣ水に溶かし、１μｌの１０×ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で５分インキュベートし、さらに１μｌのＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加し、３７℃で５分インキュベートし、Ｖ
ｏｒｔｅｘして酵素を失活させた後、直ちにＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、４４μｌのＡＣ水に溶出した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ時のｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎを抑制するため、ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ＣＩＡＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて脱リン酸化を行った。４４ μｌで溶出したｂｌｕｎｔｉｎｇ産物に、１μｌのＣＩＡＰと５μｌのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ ＰＬＵＳ ｂｕｆｆｅｒを加えて、３７℃で３０分インキュベートし、さらに、１μｌのＣＩＡＰを加え、５５℃で１時間インキュベートした。１％アガロースゲルに泳動し、約７０００ｂ．ｐ．のバンドをゲルから切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を回収し、３０μｌのＡＣ水へ溶出した。γＰＫＣ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片とＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅを上記と同様の手順でｌｉｇａｔｉｏｎした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ終了後、ＤＨ５αコンピテントセルへトランスフォームし、カナマイシン含有（３０ｍｇ／ｌ））寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、２ｍｌのカナマイシン含有（３０ｍｇ／ｌ）液体ＬＢ培地に、ＬＢプレートからコロニーを植菌し、３７℃でバイオシェーカーにより振とうさせた。植菌の際にカナマイシン含有（５０ｍｇ／ｌ）寒天ＬＢ培地にも植菌し、マスタープレートとした。上記と同様の方法により、γＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含むＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＳｈｕｔｔｌｅ）を精製・単離した。ＰＣＲにより増幅したγＰＫＣ−ＧＦＰ ｃＤＮＡの遺伝子配列は上記と同様にサイクルシークエンス法により確認した。上述と同様の方法により、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＳｈｕｔｔｌｅを大量精製した。
【００６２】
（大腸菌内での組換えアデノウイルスプラスミドの作製）
ＷＴ γＰＫＣ−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰ、γＰＫＣ（Ｇ１２８Ｄ）−ＧＦＰ を組み込んだシャトルベクター（ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＳｈｕｔｔｌｅ）をＰｍｅ Ｉにより切断し、直鎖化した。１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで４０分程度電気泳動した後、ゲルからバンドのやや上方を切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて直鎖化したプラスミドＤＮＡを精製し、３０μｌのＡＣ水へ溶出させた。アデノウイルスバックボーンベクター（ｐＡｄＥａｓｙ−１）を１μｇ／μｌになるようＡＣ水１μｌに懸濁し、１で精製したプラスミドＤＮＡを１５μｇ加え、混和した。
【００６３】
さらに氷上で融解した大腸菌ＢＪ５１８３ （エレクトロポレーション用に調整したコンピテントセル） を２０μｌ加え、２．０ｍｍキュベットに移した。２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦＤの条件下でＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてエレクトロポレーションし、シャトルベクターとアデノウイルスバックボーンベクターのｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。これにより、大腸菌内で相同組換えが起こると、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰを含むアデノウイルスプラスミド（ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １）ができる。
【００６４】
エレクトロポレーション後、キュベットに５００μｌのＬＢ培地を加え、１．５ｍｌエッペンチューブへ移し、３７℃で１時間程度振とうさせた。３０００ｒｐｍで５分遠心。
【００６５】
上清４５０μｌを捨て、残りをカナマイシン含有（６０ｍｇ／ｌ））寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間以上培養した。翌日数個のコロニーをカナマイシン入りのＬＢ培地２ｍｌに植菌し、１２〜１６時間振とうさせ、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法でプラスミドを精製した。
【００６６】
電気泳動により、スーパーコイル状態でのプラスミドのサイズ（３５ｋｂ）及びＰａｃ
Ｉによる切断パターン（２０ｋｂ以上と３．５ｋｂ（あるいは４ｋｂ））を調べ、それ
らを参考にシャトルベクターとアデノウイルスバックボーンベクターの相同組換えが起こり、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １ができたことを確認した。
【００６７】
相同組換えの起こったクローン１０μｌをＤＨ５α コンピテントセル１００μｌにトランスフォームし、カナマイシン含有（３０ｍｇ／ｌ））寒天ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１２〜１６時間培養した。翌日コロニーを拾ってカナマイシン入りのＬＢ培地２ｍｌ中で１２〜１６時間振とうさせ、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法でプラスミドを精製した。
【００６８】
抽出したプラスミドをＰａｃＩで処理し、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １であることを確認した。上記と同様の方法により、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １を大量精製した。
【００６９】
サイクルシークエンス法により、ＴｅｔＯｐ−γＰＫＣ−ＧＦＰ ｉｎ ｐＡｄＥａｓｙ １中のγＰＫＣ（ＷＴ、Ｓ１１９Ｐ、Ｇ１２８Ｄ）の配列が正しいことを確認した（図１０）。
【００７０】
（マウス小脳初代培養プルキンエ細胞におけるγＰＫＣ−ＧＦＰの蛍光観察）
（生細胞の観察）
ＤＩＶ２８にマウス小脳初代培養細胞のγＰＫＣ−ＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡で観察し、野生型及び変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現するプルキンエ細胞中にγＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体が見られる細胞が何個あるかを計数した。共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて、プルキンエ細胞のＧＦＰ蛍光画像を取り込んだ。ＧＦＰ蛍光は４８８ｎｍアルゴンレーザーで励起させ、５０５−５３５ｎｍ ｂａｎｄ
ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒを用いて検出した。プルキンエ細胞は厚みがあるため、１つのプルキンエ細胞に対し、１０〜３０枚のＺ軸連続画像を取り込み、ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡソフトウェアを用いて、Ｚ軸連続画像の重ね合わせ画像を作製した。ＧＦＰ蛍光の分布を指標として、γＰＫＣ−ＧＦＰ発現プルキンエ細胞の表面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５．１Ｊ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を用いて計測した。
【００７１】
（生細胞におけるγＰＫＣ−ＧＦＰの刺激誘発トランスロケーション観察） ＤＩＶ２８にマウス小脳初代培養細胞の培地をＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＣｌ
１６５ｍＭ ， ＫＣｌ ５ｍＭ ， ＣａＣｌ２ １ｍＭ ， ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
， ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ ， Ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ ｐＨ７．４）９５０μＬに置換した。
【００７２】
最終濃度の２０倍に調製した刺激薬物を５０μＬ添加し、γＰＫＣ−ＧＦＰの刺激を行った。刺激誘発γＰＫＣ−ＧＦＰのトランスロケーションの観察は、刺激前後のＧＦＰ蛍光を共焦点レーザー顕微鏡を用いて一定時間毎の連続画像を取り込むことにより行った。野生型と変異γＰＫＣ−ＧＦＰとの間でトランスロケーションに違いが見られるかを検討した。
【００７３】
５０ｍＭ ＫＣｌ ＋ ５０μＭグルタミン酸刺激を与え、連続画像の取り込みは１秒間隔で行い、１０分間の画像を取得した。
【００７４】
１μＭ ＴＰＡ （１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｏｐｈｏｒｂｏ１−１３−ａｃｅｔａｔｅ）刺激を与え、連続画像の取り込みは３０秒間隔で行い、３０分間の画像を取得した。
【００７５】
（生細胞におけるγＰＫＣ−ＧＦＰのＦＲＡＰ解析）
ＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）とは、蛍光タンパク質を発現した生細胞の一部に強い励起光を照射し、その部分の蛍光を退色させた（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）後、周囲から移動してきた蛍光タンパク質により退色部分の蛍光がどれくらいの速さで回復するかを解析する実験手法である（図１２）。これにより、発現した蛍光タンパク質の細胞内での流動性を検討することができる（Ｍｅｙｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００７６】
ＤＩＶ２８にマウス小脳初代培養細胞の培地をＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬに置換し、野生型及び変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現するプルキンエ細胞中で凝集体のない細胞のＧＦＰ蛍光画像を共焦点レーザー顕微鏡で取り込んだ。その細胞の細胞体の一部に強い励起光を連続照射して、その部分のＧＦＰ蛍光を退色させた。その後のＧＦＰ蛍光の変化を一定時間毎の連続画像を取り込むことにより観察した。
【００７７】
照射部分の蛍光強度の経時変化をＬＳＭ５１０ＭＥＴＡソフトウェアにより解析し、野生型と変異γＰＫＣ−ＧＦＰの間で細胞内の流動性に違いが見られるかどうかを検討した。同一ディッシュ内細胞を用いて上記の手順を３回繰り返し、その平均を一回の実験結果とした。そして、この実験を３回行い、野生型及び変異型の蛍光回復を比較した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、γＰＫＣの遺伝子の構造とＳＣＡ１４で発見された遺伝子変異である。
【図２】図２は、ＣＨＯ細胞に発現させた変異γＰＫＣ−ＧＦＰの観察結果である。野生型γＰＫＣ−ＧＦＰは細胞質に均質に分布している。変異γＰＫＣ（Ｓ１１９Ｐ）−ＧＦＰおよび変異γＰＫＣ（Ｑ１２７Ｒ）−ＧＦＰの場合は細胞質に凝集体が観察される。下段の図は凝集体を形成する変異γＰＫＣの過剰発現により細胞死が起こる。
【図３】図３は変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させることにより細胞死が引き起こされることを示す図である。Ｓ１１９Ｐ変異γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させると野生型γＰＫＣ−ＧＦＰを発現させたときと比較して死細胞の割合が高くなる。
【図４】図４は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈシステムの概要を示す。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅが存在しないときはプラスミド１とプラスミド２は結合せずＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質およびγＰＫＣ−ＧＦＰは殆ど発現されず、一方Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅが存在するときはそれを介してプラスミド１およびプラスミド２が２量体化し、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質およびγＰＫＣ−ＧＦＰの発現が増大する。
【図５】図５は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質のｃＤＮＡを組み込んだプラスミド１の構造、および変異γＰＫＣ−ＧＦＰのｃＤＮＡを組み込んだプラスミド２の構造である。
【図６】図６は、野生型γＰＫＣ−ＧＦＰ遺伝子を含有するＣＨＯ細胞が、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅの存在下および非存在下で野生型γＰＫＣ−ＧＦＰの発現が異なることを示す。
【図７】図７は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈシステムよる野生型γＰＫＣ−ＧＦＰおよび変異γＰＫＣ−ＧＦＰの発現を示す。野生型γＰＫＣ−ＧＦＰの場合は凝集を示さないが、変異型γＰＫＣ−ＧＦＰの場合は、凝集体を形成する。
【図８】図８は、変異型γＰＫＣ−ＧＦＰ（Ｓ１１９Ｐ）にトレハロース処理した場合の凝集体の形成の減少を示す。
【図９】図９は、変異型γＰＫＣ−ＧＦＰ（Ｇ１２８Ｄ）にトレハロース処理した場合の凝集体の形成の減少を示す。
【図１０】図１０は、アデノウイルスベクターによるγＰＫＣ−ＧＦＰの遺伝子導入に用いた発現誘導可能なテトラサイクリン’Ｔｅｔ）制御システムを示す。
【図１１】図１１は、アデノウイルスベクターによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞へのγＰＫＣ−ＧＦＰの発現と変異γＰＫＣ−ＧＦＰの凝集体形成を示す。
【図１２】図１２は、ＦＲＡＰ解析の模式図（Ａ）と退色部分の蛍光強度変化の例（Ｂ）を示す。Ａ （ａ）：Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ前。（ｂ）：Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ直後は照射部分の蛍光強度が著しく低下。（ｃ）：時間経過とともに周囲の蛍光タンパク質が照射部分に移動することで、蛍光回復。（ｄ）：しばらくすると、照射部分の蛍光が周囲と同じにまで回復する。
【００７９】
Ｂ 流動性の高い蛍光タンパク質は励起光照射中もタンパク質が照射部分に素早く移
動し続けているため、ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ直後の蛍光強度の低下が弱く、その後の蛍光回復は早い。一方、流動性の低い蛍光タンパク質は細胞内をゆっくりとしか移動できないため、ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ直後の 蛍光強度は著しく低下し、その後の蛍光回復も遅い。
【図１３】図１３は、γＰＫＣ−ＧＦＰ発現プルキンエ細胞中の凝集体が観察される細胞の割合（％）を示す。変異γＰＫＣ−ＧＦＰはプルキンエ細胞内で凝集体を形成しやすい。
【図１４】図１４は、γＰＫＣ−ＧＦＰ発現プルキンエ細胞についてＦＲＡＰ解析（退色部位の蛍光強度の経時変化、回復時間）の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１は、変異γＰＫＣ−ＧＦＰ（Ｓ１１９Ｐ）遺伝子の核酸配列である。
【００８１】
配列番号２は、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質遺伝子の核酸配列である。
【００８２】
配列番号３は、ｐＧｅｎｅＶ５Ｈｉｓの核酸配列である。
【００８３】
配列番号４は、ｐＳｗｉｔｃｈの核酸配列である。
配列番号５は、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ （ｔＴＡ）の核酸配列である。
配列番号６は、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＴｅｔＯｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の核酸配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質蓄積による神経変性疾患と関連するタンパク質を発現させるベクターであって、
ｉ）γＰＫＣ、Ａβ、Ｔａｕタンパク質、ポリグルタミン、プレセリニン、α―シヌクレインおよびＳＯＤ１ならびにそれらの変異体からなる群より選択される１つのタンパク質またはその変異体をコードする遺伝子の核酸配列；
ｉｉ）ＧＦＰをコードする遺伝子の核酸配列および
１１１）ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質およびＴｅｔ制御システムからなる群より選択される、薬剤によりタンパク質発現を調節可能にする核酸配列を含むベクター。
【請求項２】
配列番号１で示される核酸配列および配列番号２で示される核酸配列および配列番号３で示される核酸配列および配列番号4で示される核酸配列を含むベクター。
【請求項３】
配列番号１で示される核酸配列および配列番号２で示される核酸配列および配列番号５で示される核酸配列および配列番号６で示される核酸配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６】
タンパク質変性疾患治療薬物候補または神経変性疾患治療薬物候補をスクリーニングするための請求項１〜請求項３に記載のベクター。
【請求項７】
タンパク質変性疾患治療薬物候補または神経変性疾患治療薬物候補をスクリーニングするための請求項４または請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、プリオン病からなる群より選択される、請求項１〜請求項３に記載のベクター。
【請求項９】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、プリオン病からなる群より選択される、請求項４、請求項５または請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
薬物によりタンパク質の発現を調節することを利用する、神経変性疾患治療薬物候補をスクリーニングするための請求項４、請求項５または請求項７に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載の細胞を含む、神経変性疾患治療薬物のスクリーニングキット。
【請求項１２】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載の細胞を利用する、神経変性疾患のスクリーニング方法。
【請求項１】
タンパク質蓄積による神経変性疾患と関連するタンパク質を発現させるベクターであって、
ｉ）γＰＫＣ、Ａβ、Ｔａｕタンパク質、ポリグルタミン、プレセリニン、α―シヌクレインおよびＳＯＤ１ならびにそれらの変異体からなる群より選択される１つのタンパク質またはその変異体をコードする遺伝子の核酸配列；
ｉｉ）ＧＦＰをコードする遺伝子の核酸配列および
１１１）ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質およびＴｅｔ制御システムからなる群より選択される、薬剤によりタンパク質発現を調節可能にする核酸配列を含むベクター。
【請求項２】
配列番号１で示される核酸配列および配列番号２で示される核酸配列および配列番号３で示される核酸配列および配列番号4で示される核酸配列を含むベクター。
【請求項３】
配列番号１で示される核酸配列および配列番号２で示される核酸配列および配列番号５で示される核酸配列および配列番号６で示される核酸配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６】
タンパク質変性疾患治療薬物候補または神経変性疾患治療薬物候補をスクリーニングするための請求項１〜請求項３に記載のベクター。
【請求項７】
タンパク質変性疾患治療薬物候補または神経変性疾患治療薬物候補をスクリーニングするための請求項４または請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、プリオン病からなる群より選択される、請求項１〜請求項３に記載のベクター。
【請求項９】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、プリオン病からなる群より選択される、請求項４、請求項５または請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
薬物によりタンパク質の発現を調節することを利用する、神経変性疾患治療薬物候補をスクリーニングするための請求項４、請求項５または請求項７に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載の細胞を含む、神経変性疾患治療薬物のスクリーニングキット。
【請求項１２】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載の細胞を利用する、神経変性疾患のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−２２０３０２（Ｐ２００８−２２０３０２Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６５４４８（Ｐ２００７−６５４４８）
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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