チトクロームＰ４５０誘導アッセイ
チトクロームＰ４５０の発現、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの発現を誘導することができる化合物の同定方法について記載する。本方法は活性化プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）と結合する１個以上のタンデムに配置されたシス作用性エレメントを異種プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を提供する。ＰＸＲ活性化を介するＣＹＰ３Ａ４発現のインデューサーである検体はレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチトクロームＰ４５０の発現、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの発現を誘導することができる検体の同定方法に関する。本方法は活性化プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）と結合する１個以上のタンデムに配置されたシス作用性エレメントを異種プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を提供する。ＰＸＲ活性化を介するＣＹＰ３Ａ４発現のインデューサーである検体はレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）は多数の薬剤、発癌性物質、農薬及び生体異物の水酸化に関与しており、多くのＣＹＰは生体異物により５０〜１００倍まで強力に誘導可能である。薬物療法では、ＣＹＰ誘導に関して２つの大きな問題がある。第１に、誘導により薬物代謝の増加の結果として全身循環が低下することにより治療効果が低下する可能性がある。第２に、誘導により反応代謝物形成が増加する結果として中毒と解毒の間に望ましくない不均衡が生じる可能性がある（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｌｕ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８））。
【０００３】
ＣＹＰ酵素の多くは誘導性であることが知られているが、ＣＹＰ３Ａ４誘導は文献に記載されている誘導による薬物−ＣＹＰ相互作用の最重要原因であると思われる（Ｗｈｉｔｌｏｃｋら，Ｉｎ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ（Ｅｄ．）．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）．ｐｐ．３６７−３９０）。これはＣＹＰ３Ａ４がヒト肝の総ＣＹＰ含量の約４０％を占め、臨床使用される薬剤の６０％を上回る量を代謝するためである。薬剤候補は望ましくないＣＹＰ３Ａ４誘導による相互作用を招く可能性があるので、新規薬剤候補についてそのＣＹＰ３Ａ４誘導可能性を評価することが重要になってきている。
【０００４】
ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルは誘導データのｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ外挿に影響を与える因子に関する多少の有用な情報を提供することができるが、誘導応答差が種によって有意であるため、新規薬剤候補のヒトＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために動物モデルを使用することはできない。新規薬剤候補のＣＹＰ３Ａ４誘導可能性を評価するために、肝スライス、不死化細胞株、及び初代肝細胞等の数種のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが確立されている（Ｓｉｌｖａら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２６：４９０−４９６（１９９８）；Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２７：８８７−８９４（１９９９）；Ｍａｕｒｅｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｖ．２２：１０５−１３２（１９９６）；ＬｅＣｌｕｙｓｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１３：３４３−３６８（２００１））。これらのモデルのうちで、ヒト初代培養肝細胞は学術及び産業実験室でＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために広く使用されている。初代培養肝細胞はＣＹＰ誘導を評価するための最も有望なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルであるが、ヒト肝細胞の入手可能性は非常に限られていることが多い。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムの使用はヒトＣＹＰ３Ａ４誘導の可能性を高スループットスクリーニング方式で評価することができる唯一の手段である。
【０００５】
その近位領域のヌクレオチド配列が発表されて以来（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５８５−５９５（１９９３））、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子のプロモーターは生体異物に対する応答性を付与するシス作用性エレメントについて詳細に分析されている。数種の重要なエレメントが同定されている。近位エレメントｐｒＰＸＲＥ（近位ＥＲ６又はｐＥＲ６）は転写因子の核内受容体ファミリー（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，Ｃｅｌｌ ８３：８３５−８３９（１９９５））の認識配列であり、ＥＲ６（塩基間隔６のエバーテッドリピート）と呼ばれるＴＧＡ（Ａ／Ｃ）ＣＴヘキサマーモチーフ２コピーを含む。ｐｒＰＸＲＥはリファンピシンによるレポーター遺伝子発現の比較的低度の活性化を付与する（Ｂａｒｗｉｃｋら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１０−１６（１９９６）；Ｏｇｇら，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ２９：２６９−２７９（１９９９））。ｐｒＰＸＲＥエンハンサーエレメントはリファンピシン応答性活性化が比較的低い。他方、Ｇｏｏｄｗｉｎら，（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））とＬｉｄｄｌｅ ａｎｄ Ｇｏｏｄｗｉｎ（ＷＯ９９６１６２２）はＣＹＰ３Ａ４転写開始部位から約８ｋｂ上流の生体異物応答性エンハンサーモジュール（ＸＲＥＭ）と呼ぶ２３０ｂｐ遠位エレメントを同定し、ヒトＰＸＲ活性のアクチベーターによるＣＹＰ３Ａ４の強力なエンハンサーであると特徴付けた。ＸＲＥＭは塩基間隔２９で２個の核内受容体（ＮＲ）結合部位ｄＮＲ１（遠位ＤＲ３又はｄＤＲ３）及びｄＮＲ２（遠位ＥＲ６又はｄＥＲ６）を含む。ｄＮＲ１（遠位ＤＲ３又はｄＤＲ３）エレメントは塩基間隔３のダイレクトリピートと呼ばれるＴＧＡ（Ａ／Ｃ）Ｃ（Ｔ／Ｃ）ヘキサマー２コピーを含む。ｄＮＲ２（遠位ＥＲ６又はｄＥＲ６）エレメントは塩基間隔６のエバーテッドリピートと呼ばれるＴＧＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｔ／Ｃ）ヘキサマー２コピーを含む。Ｓｕｅｙｏｓｈｉ ａｎｄ Ｎｅｇｉｓｈｉ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：１２３−１４３（２００１）はＣＹＰ３Ａファミリーのエンハンサーエレメントについて考察している。
【０００６】
ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの調節は非常に複雑であることが分かっている。例えば、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、グルココルチコイド受容体及び転写因子等の多くのヒト核内受容体はＣＹＰ３Ａ４転写活性の調節に関与している（Ｐａｓｃｕｓｓｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６１９，２４３−２５３（２００３））が、これらの核内受容体のうちで、ＰＸＲはＲＸＲと一緒になってＣＹＰ３Ａ４転写活性の調節に主要な役割を果たすと思われる（ＰＸＲとＲＸＲの結合を開示するＷＯ９９３５２４６（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）参照）。ＰＸＲは各種親油性化合物により活性化され、その多く（例えばリファンピシンや他の薬剤等）は公知ＣＹＰ３Ａインデューサーである（Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２２０８−１２２１３（１９９８）；Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５（１９９８）；Ｌｅｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１０１６−１０２３（１９９８））。ＷＯ９９３５２４６（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）、ＷＯ９９４８９１５（Ｋｌｉｅｗｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｓｏｎ）及びＫｌｉｅｗｅｒら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２（１９９８）はヒトＰＸＲのヌクレオチド配列とヒトＰＸＲを活性化又は阻害する能力について化合物をスクリーニングするためのアッセイでヒトＰＸＲを使用する方法を開示している。ヒトＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は米国特許第６，５７９，６８６号（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｐａｒｋ）に開示されており、ＷＯ９３１７０４１（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｂａｅｓ）はＣＡＲに関連すると思われるポリペプチドを開示している。
【０００７】
ＨｅｐＧ２等の細胞株は一般に大量のＲＸＲを発現するが、ＰＸＲはほんの僅かしか発現しない。レポーター遺伝子に融合したＣＹＰ３Ａ４プロモーター（その全部又は一部）をＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションすると、リファンピシンによる明白な誘導が生じるが、ヒトＰＸＲとコトランスフェクトした場合に限られる（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５（１９９８）；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））。これらの知見に基づき、薬剤の誘導可能性をスクリーニングするためのＰＸＲレポーター遺伝子アッセイが開発された（Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７（２０００）；Ｅｌ−Ｓａｎｋａｒｙら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２９：１４９９−１５０４（２００１）；Ｌｕｏら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３０：７９５−８０４（２００２）；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．，２９，１３２５−１３３１（２００１））。
【０００８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によると、ヒトＰＸＲはヒトＲＸＲと一緒になってＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列モチーフｐｒＰＸＲＥ、ｄＮＲ１、及びｄＮＲ２と直接結合することが判明した（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５（１９９８）；Ｌｅｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１０１６−１０２３（１９９８）；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））。例えば、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのヌクレオチド−７８３９〜−７２０８及び−３６２〜＋６４から構成される発現ベクター（ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーター）をレポーター遺伝子と機能的に連結し、発現ベクターをヒトＰＸＲ発現ベクターとＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトすると、リファンピシン処理後にレポーター遺伝子の発現の誘導が観察された（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９）；ＷＯ９９６１６２２（Ｌｉｄｄｌｅ ａｎｄ Ｇｏｏｄｗｉｎ））。最近、同様のＥＭＳＡ実験により、ヒトＣＡＲがｐｒＰＸＲＥ及びｄＮＲ１の両者と直接結合し、程度は低いが、ｄＮＲ２とも結合することが実証されており、ＣＹＰ３Ａ４がＣＡＲリガンドにより誘導可能であることが示されている（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：３５９−３６５２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記ヒトＰＸＲレポーターアッセイはＣＹＰ誘導可能性について薬剤をスクリーニングするのに有用であることが分かっている。しかし、上記アッセイでは低レベルでＣＹＰ誘導を生じる薬剤を検出することができない。従って、ＣＹＰ誘導レベルの低い薬剤を検出できるような誘導応答を提供することが可能なアッセイが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は活性化プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）と結合する１個以上のタンデムに配置されたシス作用性エレメントを異種プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターと、チトクロームＰ４５０の発現、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの発現を誘導することができる検体を同定するために、レポーター遺伝子と機能的に連結した前記複合プロモーターを使用する方法を提供する。ＰＸＲを介するＣＹＰ３Ａ４発現のインデューサーである検体はレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【００１１】
従って、本発明はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能な異種プロモーターをもつ核酸と機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む複合プロモーターを提供する。これはＰＸＲ結合部位を各々もつ１個以上の核酸を異種プロモーター、好ましくはＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能な異種プロモーターをもつ核酸と機能的に連結した複合プロモーターである。各々ＰＸＲ結合部位を含む２個以上の核酸が存在する場合には、核酸は異種プロモーターとタンデムに連結される。異種プロモーターと機能的に連結されたＰＸＲ結合部位は異種プロモーターをプロモーターからの転写のＰＸＲ誘導に対して応答性にする。
【００１２】
上記プロモーターの別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
上記プロモーターの更に別の態様では、上記複合プロモーターは少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、複合プロモーターは少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記複合プロモーターの特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位をもつ核酸は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、複合プロモーターは配列番号１３を含むＣＭＶプロモーターと機能的に連結した配列番号１８を含む。
【００１４】
本発明は更にＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを提供する。
【００１５】
更に別の側面では、レポーター遺伝子発現カセットはＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結した２個以上のＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含む。
【００１６】
従って、本発明はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結した各々ＰＸＲ結合部位をもつ２個以上のタンデムに配置された核酸を含む第１の核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを提供する。
【００１７】
上記レポーター遺伝子発現カセットのいずれか１種の別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
上記レポーター遺伝子発現カセットの更に別の態様では、第１の核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記レポーター遺伝子発現カセットの特に好ましい１態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様では、レポーター遺伝子発現カセットはクローン１０２−ＳＥＡＰのレポーター遺伝子発現カセットを含む。
【００１９】
上記レポーター遺伝子カセットの特定態様では、レポーターは分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００２０】
本発明は更にＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む細胞を提供する。
【００２１】
別の側面では、前記細胞はＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む第１の核酸と、異種プロモーターと機能的に連結したＰＸＲをコードする第２の核酸を含む。
【００２２】
別の側面では、細胞はＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、異種プロモーターと機能的に連結したＣＡＲをコードする第２の核酸を含む。
【００２３】
従って、本発明はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結したＰＸＲ結合部位をもつ２個以上のタンデムに配置された核酸を含む第１の核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを含む細胞を提供する。
【００２４】
上記細胞のいずれか１種の別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
上記細胞の更に別の態様では、第１の核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記細胞の特に好ましい１態様では、２個以上のＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
上記細胞の特定態様では、細胞は更にＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸を含む。更に別の態様では、細胞は内在ＰＸＲを発現するか又は細胞は内在ＲＸＲを発現する。更に別の態様では、ＰＸＲはヒトＰＸＲであるか又はＣＡＲはヒトＣＡＲである。
【００２７】
更に別の態様では、細胞はＨｅｐＧ２である。更に別の態様では、細胞は肝細胞、特にラット、マウス、及びヒト肝細胞から構成される群から選択される肝細胞である。肝細胞は初代肝細胞が好ましい。
【００２８】
更に別の態様では、レポーターは分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００２９】
本発明の別の側面では、検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸を含む細胞を提供する段階と；検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。別の態様では、異種プロモーターは２個以上のＰＸＲ結合部位の不在下で誘導不能である。
【００３０】
別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む細胞を提供する段階と；検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３１】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、好ましくはＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含む細胞を提供する段階と；検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３２】
上記方法のいずれか１種の別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
上記方法の更に別の態様では、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。上記方法の特に好ましい態様では、核酸の２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
上記方法の特定態様では、細胞は更にＰＸＲをコードする第２の核酸を含む。更に別の態様では、細胞は内在ＰＸＲを発現するか又は細胞は内在ＲＸＲを発現する。更に別の態様では、ＰＸＲはヒトＰＸＲである。
【００３５】
更に別の態様では、細胞はＨｅｐＧ２又は初代肝細胞である。
【００３６】
更に別の態様では、レポーターは分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００３７】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３８】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＣＡＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３９】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＣＡＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００４０】
更に別の側面では、本発明は検体がＰＸＲ又はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導するか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸とＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞と、第１の核酸とＣＡＲをコードする第３の核酸を含む第２の初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で各培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、第１の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第２の培養液では増加しないならば、検体はＰＸＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断し、第２の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第１の培養液では増加しないならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００４１】
上記方法の他の態様では、肝細胞はラット、マウス、及びヒト肝細胞から構成される群から選択される。特定態様では、肝細胞はラット肝細胞が好ましい。
【００４２】
上記方法のいずれか１種の更に別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
上記方法の更に他の態様では、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。上記方法の特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００４５】
上記方法のいずれか１種の更に別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
上記方法の更に別の態様では、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。上記方法の特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明は更にレポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含む第１の容器を含むキットを提供する。異種プロモーターはＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であることが好ましい。場合により、ＰＸＲをコードし、異種プロモーターと機能的に連結した第２の核酸を含む第２の容器が提供される。前記キットの別の側面では、第１の容器はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを含む。
【００４８】
前記キットの別の側面では、キットは更にレポーター遺伝子の発現を測定するための試薬を含む。更に別の側面では、キットは更に核酸を細胞にトランスフェクトするための試薬を含む。更に別の側面では、キットは更に細胞を含む。
【００４９】
上記キットの別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
上記キットの更に別の態様では、第１の核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記方法の特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
キットの特定態様では、レポーターは分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００５２】
上記方法及びキットにおいて、第１の核酸は上記のようなレポーター遺伝子発現カセットであることが好ましい。本明細書に記載する上記方法の特定態様では、第２の核酸は異種プロモーター、好ましくはＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導不能なプロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第１の核酸を含む遺伝子発現カセットであることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明はヘモプロテインのチトクロームＰ−４５０（Ｐ４５０）スーパーファミリーの各種メンバー、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの転写活性化（又は発現）を媒介する能力について検体（分子、化合物、薬剤候補等）をスクリーニングするためのアッセイを提供する。前記アッセイはプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）又は構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）を発現し、最小プロモーターと機能的に連結したタンデムアレーに配置されたＣＹＰ３Ａ４プロモーターの３種のエンハンサーエレメントのうちの少なくとも１種の多重コピーを含むＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な新規複合又は合成プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を含む組換え細胞を提供する段階と、検体の存在下で組換え細胞をインキュベートする段階と、レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターからの転写活性のメディエーターである検体はＰＸＲ又はＣＡＲと結合し、ＰＸＲ又はＣＡＲを活性化することによりアッセイでその効果を発揮する。その後、活性化されたＰＸＲ又はＣＡＲはＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な複合プロモーターを介してレポーター遺伝子の発現を誘導する。ＰＸＲ又はＣＡＲの転写活性のメディエーターでない検体はＰＸＲ又はＣＡＲと結合せず、活性化しないか、あるいはＰＸＲ又はＣＡＲと結合するが、ＰＸＲ又はＣＡＲを活性化しない。いずれの場合も、ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な複合プロモーターからの転写は生じない。
【００５４】
本発明の新規複合プロモーターは転写活性化に応答して天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターよりも高い誘導倍率を提供する。例えば、ＣＹＰ３Ａ４転写インデューサーリファンピシンは天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子又は約−７８３９〜−６０００ｂｐのＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域を約−３６２〜５３ｂｐの領域と連結し、更にレポーター遺伝子と機能的に連結した従来技術の欠失ＣＹＰ３Ａ４（ΔＣＹＰ３Ａ４）プロモーター等のその変異体と比較して、本発明の複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子の誘導倍率のほうが高い（図２Ａ又は４；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９）；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら，Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２９：１３２５−１３３１（２００１）；実施例２参照）。本発明の複合プロモーターは天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーター又はΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターよりも感度が高いため、化合物及び薬剤候補をＣＹＰ３Ａ４誘導能についてスクリーニングするためのより高感度のアッセイを提供する。本発明は更にＰＸＲ又はＣＡＲ結合又は活性化に対して応答性の複合プロモーターの作製方法を提供する。
【００５５】
一般に、プロモーターは（１）コアプロモーターと転写単位の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む最小プロモーターと、（２）転写アクチベーターの結合部位から構成される１個以上のエンハンサーエレメントの２個のエレメントから構成される。コアプロモーターは転写の開始を媒介する短いヌクレオチド配列である。一般に、コアプロモーターはＴＡＴＡボックスとＣＡＡＴボックスに関連するＧ−Ｃリッチ領域を含む。これらのエレメントはＲＮＡポリメラーゼＩＩをプロモーターと結合させ、ポリメラーゼがＲＮＡ開始部位を見いだすのを助ける。プロモーターによってはＴＡＴＡボックス又はＣＡＡＴボックスをもたないものもあり、その代わりに転写開始部位を含む開始エレメントを含む。５’ＵＴＲはＲＮＡ転写産物の安定性を強化する役割を果たす。長い５’ＵＴＲは通常、転写又は翻訳レベルで遺伝子発現を調節する調節配列をもつイントロンを含む。エンハンサーエレメントは特定プロモーターから転写されるＲＮＡの量を増加するヌクレオチド配列である。エンハンサーエレメントはコアプロモーターのすぐ上流（近位エンハンサー）の場合と、プロモーターから数千塩基対上流又は下流（遠位エンハンサー）の場合がある。エンハンサーエレメントは応答エレメントと呼ぶ１個以上の短いヌクレオチド配列を含む。応答エレメントはＲＮＡ転写開始複合体の形成を強化する転写因子と結合する。天然プロモーター（又は最小プロモーター）は転写単位の５’末端に由来する単一ヌクレオチドフラグメントから構成される。一般に、天然プロモーターはコアプロモーターと５’ＵＴＲを含み、ヌクレオチドフラグメント長に応じて所定の天然プロモーターは更にそのエンハンサーエレメントの１個以上と、場合により、イントロンを含む場合がある。一般に、複合プロモーターはコアプロモーターと、１個以上のエンハンサーエレメントと、少なくとも２個が異なる起源に由来する５’ＵＴＲから構成されるか、又は遠位エンハンサーエレメントを同一起源の最小プロモーターと組合わせたものである。
【００５６】
ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な本発明の複合プロモーターはプロモーターからの転写をＰＸＲ又はＣＡＲにより調節又は誘導できるようにＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位から構成される少なくとも２個のエンハンサーエレメントを含む複合エンハンサーと機能的にシス連結した最小又はコアプロモーターを含む。各エンハンサーエレメント（又は結合部位）は複合エンハンサーにおいて一般にタンデムに配置された１個のＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位を含むオリゴマーを含む。各エンハンサーエレメントオリゴマーとその隣接エンハンサーエレメントオリゴマーの関係は頭−尾、頭−頭、又は尾−尾のいずれでもよい（オリゴマーの配置例については図６参照）。所定態様では、エンハンサーエレメントオリゴマーの１個以上はタンデム配置ではなく、複合エンハンサーの他のエンハンサーエレメントオリゴマーから離して配置される。複合エンハンサーのエンハンサーエレメントオリゴマーは最小又はコアプロモーターの上流に配置してもよいし、下流に配置してもよい。複合エンハンサーのエンハンサーエレメントオリゴマーは最小又はコアプロモーターに隣接して配置してもよいし、最小又はコアプロモーターから離して配置してもよい。例えば、複合エンハンサーは最小又はコアプロモーターの遠位末端に配置してもよいし、最小又はコアプロモーターの遠位末端（５’）から約１３ｋｂ上流に配置してもよい。あるいは、複合エンハンサーは最小又はコアプロモーターの近位末端（３’）に配置してもよいし、最小又はコアの近位末端から約１３ｋｂ下流に配置してもよい。例えば、ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能なレポーターはレポーター遺伝子の近位末端（５’末端）に配置された最小又はコアプロモーターと、レポーターの遠位末端（３’）に配置されたエンハンサーエレメントを含むことができる。他の態様では、複合エンハンサーは複合エンハンサーの一部が最小プロモーターの上流に配置され、複合エンハンサーの別の部分が別の位置（例えば、最小プロモーターの下流）に配置されるように、最小プロモーターとその周囲の各位置に配置されたエンハンサーエレメントオリゴマーから構成される。本明細書で使用する機能的に連結とは最小プロモーターが複合エンハンサーの（部分的又は完全な）制御下にあることを意味する。エンハンサーエレメント又は複合エンハンサーが最小プロモーターにすぐ隣接する必要はない。最小又はコアプロモーターはＣＹＰ３Ａ４に由来しないことが好ましく、エンハンサーエレメントの不在下でＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導されないことが好ましい。
【００５７】
天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターはＣＹＰ３Ａ４プロモーターのＰＸＲ又はＣＡＲ誘導を可能にする３個のエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位をもつ。これらのエンハンサーエレメントはヌクレオチド−１７６〜−１４６に由来するＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域に配置されたエバーテッドリピートから構成される近位エンハンサーエレメントｐＥＲ６（ｐｒＰＸＲＥ又はＥＲ６）と、ヌクレオチド−７８３９〜−７２０８に由来するＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域（ＸＲＥＭ領域）に配置された夫々第１及び第２の遠位エンハンサーエレメントｄＤＲ３（ダイレクトリピート又はｄＮＲ１又はＤＲ３）及びｄＥＲ６（エバーテッドリピート又はｄＮＲ２又はＥＲ６）である。完全なＣＹＰ３Ａ４プロモーターは約７．８ｋｂである。これに対して、ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターは約２２５４ｂｐである。図２ＡはΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターにおけるエンハンサーエレメントの位置を示す。
【００５８】
近位エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位ｐＥＲ６はそのエバーテッドリピート５’−ＡＧＫＴＣＡ−３’に由来する塩基間隔６のヘキサマー５’−ＴＧＡＭＣＴ−３’から構成され、前記式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴである。従って、ｐＥＲ６はフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＴ−Ｎ６−ＡＧＫＴＣＡ−３’（配列番号１）（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、Ｎは任意ヌクレオチドである）とそのと相補鎖を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのｐＥＲ６エンハンサーエレメントはフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２）をもつヌクレオチド−１７６〜−１４６に含まれるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域に由来する。エバーテッドリピートを下線で示す。
【００５９】
第１の遠位エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位ｄＤＲ３はヘキサマー５’−ＴＧＡＭＣＹ−３’（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＹはＴ又はＣである）の１対のダイレクトリピートから構成され、各ヘキサマーは塩基間隔３である。従って、ｄＤＲ３はフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＹ−Ｎ３−ＴＧＡＭＣＹ−３’（配列番号４）（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＹはＴ又はＣである）とそのと相補鎖を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのｄＤＲ３エンハンサーエレメントはフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴ−３’（配列番号５）をもつヌクレオチド−７７３６〜−７７１６に含まれる。ダイレクトリピートを下線で示す。
【００６０】
第２の遠位エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位ｄＥＲ６はそのエバーテッドリピート５’−ＫＲＴＴＣＡ−３’（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＹはＴ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、ＲはＧ又はＡである）に由来する塩基間隔６のヘキサマー５’−ＴＧＡＡＭＹ−３’から構成される。従って、ｄＥＲ６はフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＡＭＹ−Ｎ６−ＫＲＴＴＣＡ−３’（配列番号７）（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、ＲはＧ又はＡであり、Ｎは任意ヌクレオチドである）とそのと相補鎖を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのｄＥＲ６エンハンサーエレメントはフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号８）をもつヌクレオチド−７６９３〜−７６６８に含まれるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域に由来する。エバーテッドリピートを下線で示す。
【００６１】
本発明の複合プロモーターでは、ｐＥＲ６はヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＴ−Ｎ６−ＡＧＫＴＣＡ−３’（配列番号１）を含むオリゴマーを含み、ｄＤＲ３はヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＹ−Ｎ３−ＴＧＡＭＣＹ−３’（配列番号４）を含むオリゴマーを含み、ｄＥＲ６はヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＡＭＹ−Ｎ６−ＫＲＴＴＣＡ−３’（配列番号７）を含むオリゴマーを含み、前記式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、ＲはＧ又はＡであり、ＹはＴ又はＣであり、Ｎは任意ヌクレオチドである。本発明の複合プロモーターに含まれるｐＥＲ６エンハンサーエレメントの例としては５’−ＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡ−３’（配列番号１０）と５’−ＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２）が挙げられる。ｄＤＲエンハンサーエレメントの例としては５’−ＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１１）と５’−ＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴ−３’（配列番号５）が挙げられる。ｄＥＲ６エンハンサーエレメントの例としては５’−ＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号１２）と５’−ＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号８）が挙げられる。
【００６２】
本発明の複合プロモーターはタンデムに配置された２個以上のオリゴマーを含み、各オリゴマーは異種プロモーター、好ましくは異種最小プロモーターと機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位を含む。従って、複合プロモーターは異種プロモーターと機能的に連結した複合エンハンサーを含む。好ましい側面では、複合エンハンサーは各種配置、向き、及びコピー数で配置されたｄＤＲ３及びｄＥＲ６エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位各１コピー以上と、場合により、ｐＥＲ６エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位１コピー以上を含むか、あるいはｐＥＲ６及びｄＥＲ６エンハンサーエレメント各１コピー以上と、場合により、ｄＤＲ３エンハンサーエレメント１コピー以上を含む。複合エンハンサーは少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｄＤＲ３及びｄＥＲ６各１個）を含むことが好ましい。特定側面では、複合エンハンサーは少なくとも３個のｄＤＲ３エンハンサーエレメントを含むことが好ましい。例として、図６は本発明の複合プロモーターの数種におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターと機能的に連結したエンハンサーエレメントの数種の配置を示す。図６に示すように、本発明の複合エンハンサーは各ＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位が別のＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位と隣接するタンデム配置でＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位を含む。更に図６に示すように、複合エンハンサーにおけるＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位の向きは頭−頭、尾−頭、又は尾−尾の任意組合わせでを含む。例えば、実施例１のクローン２６−ＳＥＡＰの複合プロモーターはｐＥＲ６を２コピーとｄＥＲ６を１コピーから構成される複合エンハンサーを含み、全３個のエンハンサーエレメントは天然の向きでＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結されている。実施例１のクローン１０２−ＳＥＡＰはｄＥＲ６を１コピーとｄＤＲ３を４コピーから構成される複合エンハンサーを含み、ｄＤＲ３エレメント１コピーのみが天然の向きでＣＭＶプロモーターと機能的に連結されている。
【００６３】
図６に示す複合プロモーターのうちの数種は従来技術ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの応答に比較してＣＹＰ３Ａ４アクチベーターリファンピシンに応答して特に強いシグナルを発生することが認められた。図９に示すように、クローン１０２−ＳＥＡＰはバックグラウンドの２３倍のシグナルを発生し、クローン３３−ＳＥＡＰはバックグラウンドの１４倍のシグナルを発生し、クローン６１−ＳＥＡＰはバックグラウンドの１１倍のシグナルを発生した。これに対して、従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターはバックグラウンドの６倍のシグナルしか発生しなかった。上記複合プロモーターの予想外のシグナル強度の増加により、従来技術アッセイよりも高感度で堅牢なＣＹＰ３Ａ４アクチベーターの同定用アッセイを開発することが可能になった。クローン１０２−ＳＥＡＰのシグナル強度はバックグラウンドの２３倍であったため、ＰＸＲのアクチベーターである検体からＣＡＲのアクチベーターである検体を同定するために使用可能なアッセイを開発することが可能になった。
【００６４】
下記実施例に示すように、複合プロモーターはサイトメガロウイルス極初期１（ＣＭＶ）最小プロモーターと機能的に連結したｐＥＲ６及びｄＥＲ６エンハンサーエレメント１コピー以上と好ましくは更にｄＤＲ３エンハンサーエレメント１コピー以上を任意順序で含む複合エンハンサーを含むことができる。ＣＭＶ最小プロモーターのヌクレオチド配列は５’−ＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ ＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧ ＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧ ＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴ ＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣ ＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣ ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣ ＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴ ＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴ ＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡ ＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣ ＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴ−３’（配列番号１３）を含む。本発明はＣＭＶ最小プロモーターに限定されず、代替最小プロモーターを含むこともできる。他の最小プロモーター又はその最小部分を得ることができるプロモーターの例としては限定されないが、β−アクチン（β−Ａｃｔ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫グロブリンβ（Ｂ２９）、細菌ＬＰＳの単球受容体（ＣＤ１４）、ロイコシアリン、シアロフォリン（ＣＤ４３）、白血球共通抗原（ＬＣＡ）（ＣＤ４５）、マクロシアリンホモログ（ＣＤ６８）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ２）、シクロオキシゲナーゼ２アイソフォーム（プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２）（ＣＯＸ−２）、ｄｅｓｍａｎ、延長因子１（ＥＦ１）、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ−１）、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、真核生物開始因子４Ａ１（ｅＩＦ４Ａ１）、エラスターゼ−１、エンドグリン（ＥＮＧ）、フェリチン重鎖（ＦｅｒＨ）、フェリチン軽鎖（ＦｅｒＬ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＶＥＧＦ−受容体１（Ｆｌｔ−Ｉ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、グリア線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、グルコース調節蛋白質７８（ＧＲＰ７８）、グルコース調節蛋白質９４（ＧＲＰ９４）、熱ショック蛋白質７０（ＨＳＰ７０）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖＴＫ）、細胞間接着分子２（ＣＤ１０２）（ＩＣＡＭ−２）、インターフェロンβ（ＩＦＮＢ）、β−キネシン（β−Ｋｉｎ）、Ｌ−プラスチン（リンパ球細胞質蛋白質１）（ＬＰ）、ミオグロビン（Ｍｂ）、ムチン様糖蛋白質（乳癌関連抗原、ＤＦ３）（ＭＵＣ１）、オステオカルシン−２（ＯＧ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ−１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、界面活性剤蛋白質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、シナプシンＩ（ＳＹＮ１）、チロシナーゼ関連蛋白質（ＴＲＰ１）、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）、及びユビキチンＢ（Ｕｂｉ Ｂ）の天然プロモーターが挙げられる。
【００６５】
最小プロモーターと機能的に連結したエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位を含む２個以上のオリゴマーを含む複合エンハンサーを含む複合プロモーターを更にアッセイ可能な産物をコードするレポーター遺伝子と機能的に連結し、レポーター遺伝子発現カセットとする。複合エンハンサーは少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｐＥＲ６及びｄＥＲ６各１個）を含むことが好ましく、３個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｐｒＥＲ６、ｄＥＲ６、及びｄＤＲ３各１個）を含むことがより好ましい。レポーター遺伝子発現カセットはレポーター遺伝子の下流にポリアデニル化部位と転写終結部位をもつ３’ＵＴＲを含むことが更に好ましい。特に好ましい１態様では、レポーター遺伝子発現カセットのプロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰ又はＣＭＶ最小プロモーター等の異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列の複合プロモーターを含む。
【００６６】
一般に、レポーター遺伝子発現カセットはプラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、バクテリオファージ、トランスポゾン、人工染色体、又は真核細胞にトランスフェクトすることができる他のベクター等のベクターの成分として含まれる。一般に、ベクターがプラスミドの場合には、ベクターはベクターを真核細胞で増殖できるようにＳＶ４０複製起点等の複製起点を含むことが好ましい。ベクターはベクターを含む組換え細胞を選択又は同定するための手段を含むことが更に好ましい。例えば、ベクターはベクターを含むトランスフェクトされた細胞にネオマイシン又はカナマイシン耐性を付与する遺伝子あるいはセルソーター等を使用してトランスフェクトされた細胞をトランスフェクトされていない細胞から分離することができるグリーン蛍光蛋白質又はルシフェラーゼ等の遺伝子を含むことができる。１例として、ｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶベクターはＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結した分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を含む。実施例に示すように、このベクターを使用してＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結したＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位のタンデムアレーを各々含む数種のベクターを構築し、ＳＥＡＰレポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターを得た。上記ベクターのうちの数種を使用し、検体がＰＸＲ又はＣＡＲ活性化を介してＣＹＰ３Ａ４発現を誘導できるか否かを調べた。
【００６７】
本発明は更に上記核酸分子のいずれか１種を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトした組換え宿主細胞、特に少なくともレポーター遺伝子発現カセットレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトした組換え宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞はクローン１０２−ＳＥＡＰ又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列の複合プロモーターをレポーター遺伝子と機能的に連結したレポーター遺伝子発現カセットで形質転換又はトランスフェクトすることができる。特定態様では、ＳＥＡＰをコードするレポーター遺伝子に複合プロモーターを機能的に連結することが好ましい。特定態様では、ＰＸＲ又はＣＡＲ又は両者をコードする遺伝子発現カセットを含むベクターで宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする。組換え宿主細胞としては大腸菌等の細菌、酵母等の真菌細胞、植物細胞、限定されないが、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、ヒト、又は齧歯類起源の細胞株等の哺乳動物細胞、及び限定されないが、ショウジョウバエやカイコ由来細胞株等の昆虫細胞が挙げられる。例えば、昆虫発現システムの１例はバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とタンデムに配置されたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。
【００６８】
組換え細胞は哺乳動物細胞が好ましく、ラット、マウス、霊長類、又はヒト細胞が好ましい。組換え細胞は初代細胞又は不死細胞株のいずれから作製してもよい。特定態様では、組換え細胞はＲＸＲを内在的に産生する細胞に由来することが好ましい。下記実施例に開示するように、ヒト肝細胞癌に由来する不死細胞株であるＨｅｐＧ２細胞、又は初代ラットもしくはヒト肝細胞にレポーター遺伝子発現カセットをトランスフェクトし、本発明の方法で使用する新規組換え細胞を作製した。ＨｅｐＧ２細胞は特に好ましい表現型である内在ＲＸＲを一般に高レベルで産生する。ＨｅｐＧ２細胞は米国特許第４，３９３，１３３号（Ｋｎｏｗｌｅｓ）に開示されている。ＨｅｐＧ２細胞ソースとしてはＩｓｔｉｔｕｔｏ Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（アクセション番号ＩＺＳＢＳ ＢＳ ＴＣＬ７９；ＩＺＳＢＳ，Ｖｉａ Ａ．Ｂｉａｎｃｈｉ ７，Ｂｒｅｓｃｉａ，２５１００，イタリー）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アクセション番号ＨＢ８０６５及びＣＲＬ−１１９９７；ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；２０１１０）；及びＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（アクセション番号ＡＣＣ １８０；ＤＳＭＺ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｄ−３８１２４，ドイツ）が挙げられる。他の細胞株としては限定されないが、Ｈ−４ＩＩＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５４８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、Ｈｅｐ３ｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６４）、ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、及び２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）が挙げられる。
【００６９】
特に、本発明はレポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターとするためにエンハンサーエレメント又はＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能な異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位を含む複合エンハンサーを含むレポーター遺伝子発現カセットを含む組換え細胞を提供する。異種プロモーターはＣＭＶ最小プロモーター等の最小プロモーターが好ましい。複合エンハンサーは少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｄＤＲ３及びｄＥＲ６各１個）を含むことが好ましい。特定側面では、複合エンハンサーは少なくとも３個のｄＤＲ３エンハンサーエレメントを含むことが好ましい（例えば、図６に示す複合エンハンサーは各々ｄＤＲ３少なくとも３コピーを含む）。特に好ましい態様では、複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰ又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列の複合プロモーターを含む。ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能なレポーターを含むレポーター遺伝子発現カセットは組換え細胞に一過性にトランスフェクトするか又は組換え細胞のゲノムに安定的に組込むことができる。
【００７０】
組換え細胞でＰＸＲ又はＣＡＲを内在的又は異所的に発現させることができる。組換え細胞は更にＰＸＲ又はＣＡＲの異所発現用構成的プロモーター又は誘導的プロモーターと機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸を含むことが好ましい。ヒトＰＸＲのヌクレオチド配列はＷｉｌｌｓｏｎ ａｎｄ Ｋｌｉｅｗｅｒら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２（１９９８）、ＷＯ９９３５２４６（及びＵＳ ６，７５６，４９１）（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）、ＷＯ９９４８９１５（Ｋｌｉｅｗｅｒら）、及びＷＯ９９１９３５４（Ｂｅｒｋｅｎｓｔａｍ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）に開示されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０６１０５６である。マウス、ラット、及びウサギに由来するＰＸＲがクローニングされ、配列決定されている（Ｋｌｉｅｗｅｅｒら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２（１９９８）；Ｊｏｎｅｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：２７−３９（２０００）；Ｚｈａｎｇ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６８：１４−２２（１９９９））。他の非ヒトＰＸＲの例はＷＯ０２０９４８６５（Ｋｌｉｅｗｅｒら）に開示されている。ヒトＣＡＲのヌクレオチド配列はＷＯ９３１７０４１（Ｍｏｏｒｅ（並びにＵＳ ５，６８６，５７４、５，７１０，０１７、及び５，７５６，４４８）ａｎｄ Ｂａｅｓ）及びＵＳ ６，５７９，６８６（Ｃｏｌｌｉｎｓら）に開示されている。ＰＸＲ又はＣＡＲと機能的に連結されたプロモーターは構成的プロモーターが好ましく、天然プロモーターでも複合プロモーターでもよい。第２の核酸を組換え細胞に一過性にトランスフェクトするか又は組換え細胞のゲノムに安定的に組込むことができる。組換え細胞はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）も発現することが好ましい。ＲＸＲの発現は内在性でもよいし、組換え細胞に一過性にトランスフェクトするか又は組換え細胞のゲノムに安定的に組込まれる構成的又は誘導的プロモーターと機能的に連結したＲＸＲをコードする第３の核酸を提供することにより異所性でもよい。ＲＸＲ発現は内在性であることが好ましい、第１、第２、及び場合により第３の核酸を細胞に安定的に組込むと、予めトランスフェクション段階を実施する必要がなくなるため、ＣＹＰ３Ａ４の発現に影響を与える検体の同定方法を簡略化する細胞株が得られる。
【００７１】
一過性又は安定的にトランスフェクトされた真核細胞を作製する方法は当分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））に記載されている。
【００７２】
例えば、遺伝子発現レポーターカセットとＰＸＲ又はＣＡＲをコードする核酸を含む一過性にトランスフェクトされた細胞を作製するためには、細胞を組織培養プレートにプレーティングし、レポーター遺伝子発現カセットを含む第１の核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸をトランスフェクトする。現今では、ＰＸＲ又はＣＡＲはヒト又は霊長類に由来するものが好ましい。核酸は上記ベクターのいずれか１種の成分、例えば、プラスミドの成分として提供することができる。遺伝子発現レポーターカセットをコードする核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする核酸は別々のベクターで提供することもできるし、同一ベクターの成分として提供することもできる。所定側面では、トランスフェクションはＲＸＲをコードする第３の核酸を含む。第３の核酸は第１の核酸と第２の核酸を含む同一ベクターの成分とすることができる。核酸が細胞に取込まれるために十分な時間、細胞をインキュベートした後に、トランスフェクション培地を捨て、ＣＹＰ３Ａ４活性を試験しようとする検体を含む培地に交換する。トランスフェクトした核酸が発現するために十分な時間、通常は約４８時間後にレポーター遺伝子の発現をアッセイする。
【００７３】
例えば、安定的にトランスフェクトされた細胞を作製するためには、細胞を組織培養プレートにプレーティングし、レポーター遺伝子発現カセットを含む第１の核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸をトランスフェクトする。現今では、ＰＸＲ又はＣＡＲはヒト又は霊長類に由来するものが好ましい。核酸は核酸を含む細胞を選択するための手段をコードする遺伝子を更に含む。組換え細胞を選択するために有用な遺伝子としては限定されないが、Ｇ４１８又はカナマイシン耐性を付与するネオマイシン遺伝子、ピューロマイシン耐性を付与するｐａｃ遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性を付与するハイグロマイシン耐性遺伝子、及びミコフェノール酸耐性を付与するキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。核酸は上記ベクターのいずれか１種の成分、例えば、プラスミドの成分として提供することができる。遺伝子発現レポーターカセットをコードする核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする核酸は別々のベクターで提供することもできるし、同一ベクターの成分として提供することもできる。所定側面では、トランスフェクションはＲＸＲをコードする第３の核酸を含む。第３の核酸は第１の核酸と第２の核酸を含む同一ベクターの成分とすることができる。核酸が細胞に取込まれるために十分な時間、細胞をインキュベートした後に、トランスフェクション培地を捨て、トランスフェクトされていない細胞からトランスフェクトされた細胞を選択するための手段を加えた培地に交換する。選択手段の例としては限定されないが、Ｇ４１８、カナマイシン、ハイグロマイシンＢ、ミコフェノール酸、及びピューロマイシンが挙げられる。Ｇ１４８を使用して組換え細胞を選択するためには、上記ベクターは更にネオマイシンをコードする遺伝子を含む。選択手段を含む培地で細胞を数回継代後に、トランスフェクトされてない細胞は死滅し、組換え細胞は残存する。組換え細胞を培養すると、検体がＣＹＰ３Ａ４発現のアクチベーターであるか否かを判定するために下記のように使用することができる組換え細胞のストックが得られる。
【００７４】
一般に、ＣＹＰ３Ａ４発現のアクチベーターである検体を同定するための本発明の方法は以下の段階を含む。本明細書に開示するように作製され、本明細書に開示するような複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む核酸を含む組換え細胞を提供する。好ましい１態様では、複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーター又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列を含む複合プロモーターを含む。遺伝子発現カセットは細胞で自律複製することができるベクター上に提供することができる。例えば、ベクターは真核細胞で機能的な複製起点をもつプラスミドとすることができる。他の態様では、遺伝子発現カセットは細胞のゲノムに安定的に組込まれる。好ましい側面では、組換え細胞は更にプロモーターと機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲ、好ましくはヒトＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む第２の核酸を含む。ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットは細胞で自律複製することができるベクター上に提供することができる。例えば、ベクターは真核細胞で機能的な複製起点（例えばＳＶ４０複製起点）をもつプラスミドとすることができる。他の態様では、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットは細胞のゲノムに安定的に組込まれる。
【００７５】
ＣＹＰ３Ａ４の発現誘導能を試験する検体を加えた培地に組換え細胞を加え、公知ＣＹＰ３Ａ４インデューサーの存在下で組換え細胞をインキュベートする陽性対照を基準として細胞が検出可能なレポーター遺伝子産物を産生するために十分な時間、組織培養皿又は組織培養プレートのウェルで増殖させる。一過性にトランスフェクトされた細胞の場合には、４８時間で通常は十分である。その後、レポーター遺伝子産物の生産量又は基質に対するレポーター遺伝子の活性を測定することによりレポーター遺伝子の発現を判定する。
【００７６】
細胞により分泌されるか又は細胞の外膜に結合したレポーター遺伝子産物の場合には、培地を取出し、レポーター遺伝子産物を分析するか、又はレポーター遺伝子産物の基質を添加し、産物に対するレポーター遺伝子の活性を測定する。ＳＥＡＰは標識基質に対するその活性を測定することによりその発現を判定する分泌レポーター遺伝子産物の１例である。胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）は細胞外膜に結合したレポーター遺伝子産物の１例である。分泌されず、外膜に結合しないレポーター遺伝子の場合には、組織培養プレートから細胞を回収し、細胞を溶解させ、レポーター遺伝子産物生産量を測定するか又は基質に対するレポーター遺伝子産物の活性を測定することにより発現を判定することができる。あるいは、細胞により取込まれるレポーター遺伝子産物の基質を組換え細胞に添加し、細胞により取込まれた基質に対するレポーター遺伝子の活性を測定する。１例は米国特許第６，４７２，２０５号、６，２９１，１６２号、５，９５５，６０４号、及び５，７４１，６５７号、並びにＷＯ９６３０５４０（いずれもＴｓｉｅｎら）に開示されているβ−ラクタマーゼレポーターシステムと基質である。
【００７７】
現今ではレポーター遺伝子はＳＥＡＰ遺伝子が好ましいが、本発明の他の態様では、レポーター遺伝子はグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｃｏｂＡ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β−グルクロニターゼ（Ｇｌｕｃ）遺伝子、β−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ルシフェラーゼ、ＰＬＡＰ遺伝子等でもよい。
【００７８】
分析されている細胞株の大半では、ＣＡＲは構成的に活性化されると思われ、肝細胞株等の多くの細胞ではＣＹＰ３Ａ４の活性化におけるＣＡＲの関与をＰＸＲの関与から区別することができないので、ＣＡＲを介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を同定するための簡単な細胞アッセイは現今では当分野で入手できないと考えられている。クローン１０２−ＳＥＡＰとＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットをラット初代培養肝細胞にコトランスフェクトすると、ＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体からＰＸＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を区別できることを本発明者らは発見した。例えば、図１４に示し、実施例６に記載するように、ラット初代培養肝細胞にレポーター遺伝子発現カセットとしてクローン１０２−ＳＥＡＰをトランスフェクトするか、又はヒトＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットをコトランスフェクトした。クローン１０２−ＳＥＡＰをラット初代肝細胞に単独トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞をＣＡＲのインデューサーであることが分かっている化合物で処理すると、レポーター遺伝子の有意誘導は認められなかった。クローン１０２−ＳＥＡＰをラット初代肝細胞にヒトＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットとコトランスフェクトすると、多少の構成的ＣＡＲ活性化が認められた。他方、ＣＡＲを介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導することが分かっている化合物はコトランスフェクトしたヒトＣＡＲを介してレポーター遺伝子の有意発現を誘導することができた（図１４）。クローン１０２−ＳＥＡＰをラット初代肝細胞にヒトＰＸＲをコードする遺伝子発現カセットとコトランスフェクトすると、この場合も多少の構成的ＰＸＲ活性化が認められた。他方、ＰＸＲを介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導することが分かっている化合物はレポーター遺伝子の有意発現を誘導することができた（図１４）。以上の結果によると、レポーター遺伝子の発現は化合物とコトランスフェクトしたヒトＰＸＲ又はＣＡＲの相互作用のみを介して誘導され、相互作用は受容体に特異的であることが分かった。
【００７９】
図９に示すように、クローン１０２−ＳＥＡＰにおけるレポーター遺伝子の発現誘導はバックグラウンドの約２３倍であった。プロモーターの２３倍の誘導能は初代肝細胞におけるＰＸＲ及びＣＡＲ発現を検出するのに重要な因子であった。クローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターに比較して同等以上の誘導能をもつ他の配置のＰＸＲ結合部位を含む複合プロモーターも初代肝細胞を使用する上記アッセイで使用することができた。従って、本発明は更にＣＡＲとの相互作用のみによりＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体と、ＰＸＲとの相互作用のみによりＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体と、ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用によりＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体の同定方法を提供する。
【００８０】
ＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を同定するためには，本明細書に開示するようなレポーター遺伝子発現カセット、好ましくはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーター又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列を含む複合プロモーターとレポーター遺伝子を機能的に連結したレポーター遺伝子発現カセットと、ＣＡＲ、好ましくはヒトＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットを初代培養肝細胞、好ましくはラット肝細胞にコトランスフェクトし、組換え細胞培養液を作製する。細胞にバッチトランスフェクトし、組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルにプレーティングするか、あるいは組織培養皿又はウェルの表面に既に結合している場合にはトランスフェクトする。いずれの場合も、レポーター遺伝子とＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットの取込みに十分な時間、組換え細胞を増殖培地でインキュベートした後に被験検体を加えた培地で組換え細胞をインキュベートする。
【００８１】
ＣＡＲによるＣＹＰ３Ａ４活性の公知インデューサーの存在下で組換え細胞をインキュベートする陽性対照で判定できるようなＣＡＲの活性化によるレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。検体を含まず、検体のビヒクルを含む陰性対照を加えることが望ましい。ＳＥＡＰをコードするレポーター遺伝子の場合には、培地のアリコート中でＳＥＡＰの活性を測定することにより発現を判定することができる。好ましい１態様では、レポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰを含む複合プロモーターである。
【００８２】
ＰＸＲを介してＣＹＰ３Ａ４を活性化する検体を同定するためには、ＰＸＲをコードするが、ＣＡＲをコードしない遺伝子発現カセットを使用して上記コトランスフェクションを実施する。ＰＸＲはヒトＰＸＲであることが好ましい。陽性対照はＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ４の公知インデューサーの存在下で組換え細胞のアリコートをインキュベートする。
【００８３】
ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用のみを介してＣＹＰ３Ａ４を活性化するかあるいはＰＸＲ又はＣＡＲを介してＣＹＰ３Ａ４を活性化する検体を同定するためには、上記コトランスフェクションの各々からの組換え細胞培養液を提供する。コトランスフェクションの各々からの組換え細胞と共に同一検体をインキュベートした後にレポーター遺伝子の発現を検出する。ＰＸＲとの相互作用のみを介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体はＰＸＲをコードする遺伝子発現カセットを含む組換え細胞培養液中でしかレポーター遺伝子を発現しない。ＣＡＲとの相互作用のみを介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットを含む組換え細胞培養液中でしかレポーター遺伝子を発現しない。ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体は両者培養液中でレポーター遺伝子を発現する。
【００８４】
複数の検体を一度にスクリーニングするように上記のいずれか１種を応用することができる。例えば、多重培養に十分な量の細胞にレポーター遺伝子発現カセットをトランスフェクトする。トランスフェクションのアリコートを組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルに別々にプレーティングし、組換え細胞が皿又はウェルの表面に接着してレポーター遺伝子発現カセットを取込むために十分な時間インキュベートする。次に、プレーティングした組換え細胞の各アリコートを、被験検体を加えた培地でインキュベートする。陽性対照と陰性対照を加えることが好ましい。対照で判定できるようなＰＸＲ又はＣＡＲの活性化によるレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。
【００８５】
レポーター遺伝子発現カセットとしてクローン１０２−ＳＥＡＰを単独でトランスフェクトし、ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導することが分かっている化合物で処理したヒト初代培養肝細胞は前記化合物に対して応答性であることを本発明者らは更に発見した（実施例７及び図１５参照）。この結果、本明細書に開示するような複合プロモーター、好ましくはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターと比較して同等以上の誘導能をもつ複合プロモーターを含むレポーター遺伝子カセットをトランスフェクトしたヒト肝細胞はＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を同定するための簡単なスクリーニングアッセイを提供することが示唆された。
【００８６】
従って、本発明は更にＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体の同定方法として、本明細書に開示するようなレポーター遺伝子発現カセット、好ましくはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーター又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列を含む複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を初代培養肝細胞、好ましくはヒト肝細胞にトランスフェクトし、組換え細胞培養液を作製する段階を含む方法を提供する。細胞にバッチトランスフェクトし、組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルにプレーティングするか、あるいは組織培養皿又はウェルの表面に既に結合している場合にはトランスフェクトする。いずれの場合も、レポーター遺伝子発現カセットの取込みに十分な時間、組換え細胞を増殖培地でインキュベートした後に、被験検体を加えた培地で組換え細胞をインキュベートする。ＰＸＲ又はＣＡＲを介するＣＹＰ３Ａ４活性の公知インデューサーの存在下で組換え細胞をインキュベートする陽性対照で判定できるようなＰＸＲ又はＣＡＲの相互作用を介するレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。検体を含まず、検体のビヒクルを含む陰性対照を加えることが望ましい。ＳＥＡＰをコードするレポーター遺伝子の場合には、培地のアリコート中でＳＥＡＰの活性を測定することにより発現を判定することができる。好ましい１態様では、レポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰを含む複合プロモーターである。
【００８７】
複数の検体を一度にスクリーニングするように上記方法を応用することができる。例えば、多重培養に十分な量の細胞にレポーター遺伝子発現カセットをトランスフェクトする。トランスフェクションのアリコートを組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルに別々にプレーティングし、細胞が皿又はウェルの表面に接着してレポーター遺伝子発現カセットを取込むために十分な時間インキュベートする。次に、プレーティングした組換え細胞の各アリコートを、被験検体を加えた培地でインキュベートする。陽性対照としてＰＸＲ又はＣＡＲを介するＣＹＰ３Ａ４活性の公知インデューサーの存在下で少なくとも１個のアリコートをインキュベートすることが好ましい。検体のビヒクルから構成される陰性対照も加えることも望ましい。対照で判定できるようなＰＸＲ又はＣＡＲの活性化によるレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。
【００８８】
本発明の方法はＣＹＰ３Ａ４発現誘導を媒介することができる検体を同定するための検体の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に特に有用である。多くの場合、有用な特性をもつ化学物質は所定の望ましい特性又は活性をもつ化合物（「リード化合物」と言う）を同定し、リード化合物の変異体を作製し、変異体化合物の特性と活性を評価することにより作製される。最新の傾向は薬剤発見の全側面についてタイムスケールを短縮する方向にある。高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法は多数を迅速且つ効率的に試験することができるため、従来のリード化合物同定法に取って代わりつつある。
【００８９】
１側面では、高スループットスクリーニング法は、多数の薬剤候補を含むライブラリーを提供する段階を含む。次にこのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」を１回以上のアッセイでスクリーニングし、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバーの特定化学種又はサブクラスを同定する。こうして同定された化合物を従来の「リード化合物」として使用することができる。
【００９０】
コンビナトリアルライブラリーの作製装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ，３９０ ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ参照）。溶液相化学用の多数の周知ロボットシステムも開発されている。これらのシステムとしては武田薬品工業（大阪市）により開発された自動合成装置等の自動ワークステーションや、化学者により実施される手動合成操作を模倣したロボットアームを使用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ ＩＩ，Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；Ｏｒｃａ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。上記装置のいずれも本発明で使用するのに適している。（改造する場合には）本明細書に記載するように動作できるようにこれらの装置に加える改造の種類と実施は当業者に自明である。更に、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，ロシア；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ロシア；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ参照）。
【００９１】
本明細書に記載する任意アッセイを高スループットスクリーニングに利用することができる。上述したように、本明細書に開示する方法により検体をスクリーニングすることが好ましい。このようなスクリーニングの高スループットシステムは当業者に周知である。即ち、例えば、米国特許第５，５５９，４１０号は蛋白質結合の高スループットスクリーニング法を開示しており、米国特許第５，５７６，２２０号及び５，５４１，０６１号はリガンド／抗体結合の高スループットスクリーニング法を開示している。
【００９２】
更に、高スループットシステムは市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ参照）。これらのシステムは一般に全サンプル及び試薬ピペッティング、液体分配、時限インキュベーション、及びアッセイに適した検出器でのマイクロプレートの最終読取りを含む全工程を自動化する。これらのコンフィギュラブルシステムにより高スループットで迅速な始動と高度なフレキシビリティー及びカスタマイズが可能になる。このようなシステムの製造業者は詳細なプロトコールを提供している。即ち、例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．は遺伝子転写、リガンド結合等の変化を検出するためのスクリーニングシステムについて記載した技術報告を提供している。
【００９３】
本発明は更に検体がＣＹＰ３Ａ４のインデューサーであるか否かを判定するためのキットを提供し、前記キットは複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を含む核酸を含む容器を含む。レポーター遺伝子はＳＥＡＰをコードすることが好ましい。複合プロモーターは最小プロモーターと機能的に連結した少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｄＤＲ３及びｄＥＲ６各１個）を含む複合エンハンサーエレメントを含むことが更に好ましい。更に別の態様では、最小プロモーターはＣＭＶ最小プロモーターであることが好ましい。キットの更に別の態様では、キットは更にＰＸＲ又はＣＡＲ又は両者、好ましくはヒトＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子を含む第２の核酸を含む容器を含む。キットは更に細胞にトランスフェクトするための試薬を含む１個以上の付加容器を含む。更に付加又は代替態様として、キットはレポーター遺伝子を検出するための試薬又はレポーター遺伝子の活性を測定するための試薬又は両者を含む１個以上の容器を含むことができる。
【００９４】
以下の実施例は本発明を更に理解し易くすることを目的とする。
【実施例１】
【００９５】
従来技術よりも強力なＰＸＲ応答性プロモーターを構築できるか否かを調べるために、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの応答性シス作用性ヌクレオチドエレメントのヌクレオチド配列を短いオリゴマーに化学的に合成した後、複合プロモーターにランダムに組立て、複数の複合プロモーター構築物から構成される組換えライブラリーを作製した後、転写活性についてスクリーニングした。ストラテジーを図２Ｂに示す。天然に存在する筋組織由来プロモーターよりも強力な筋特異的複合プロモーターを作製するために、同様のストラテジーがＬｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４１−２４５（１９９９）により使用されている。
【００９６】
核酸操作はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））に記載の方法等の標準分子生物学法に従って実施した。プラスミド精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って使用してＬＢブロスで一晩培養した培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９７】
ヒトＰＸＲと結合できることからｐＥＲ６、ｄＤＲ３、及びｄＥＲ６エンハンサーエレメントを選択した。ＰＸＲ応答性合成プロモーター構築のストラテジーを図２Ｂに示す。前記３種のエレメント（ｐＥＲ６、ｄＤＲ３及びｄＥＲ６）の各々の両鎖と末端の数個のヌクレオチドから構成される特異的オリゴマーを作製した。
【００９８】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのヌクレオチド−１７６〜−１４６に由来するｐＥＲ６に対応する１本鎖オリゴマーの相補対を合成した。フォワードオリゴマーは５’−ＴＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧＴ ＧＡＧ Ｔ−３’（配列番号２）とし、相補的オリゴマーは５’−ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＣＴ Ａ−３’（配列番号３）とした。２本鎖ｐＥＲ６を図３Ａに示す。
【００９９】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−７７３６〜−７７１６に由来するｄＤＲ３に対応する１本鎖オリゴマーの相補対を合成した。フォワードオリゴマーは５’−ＧＡＡ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＣＣ ＴＣＴ−３’（配列番号５）とし、相補的オリゴマーは５’−ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＴＣ−３’（配列番号６）とした。２本鎖ｄＤＲ３を図３Ｂに示す。
【０１００】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−７６９３〜−７６６８に由来するｄＥＲ６に対応する１本鎖オリゴマーの相補対を合成した。フォワードオリゴマーは５’−ＣＣＣ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＣＡ ＴＧＴ ＣＧＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＡ−３’（配列番号８）とし、相補的オリゴマーは５’−ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＡＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＧ−３’（配列番号９）とした。２本鎖ｄＥＲ６を図３Ｃに示す。
【０１０１】
各オリゴマー対の相補的１本鎖オリゴマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次に、各オリゴマー対の相補的１本鎖オリゴマーをアニールさせ、エンハンサーエレメントの２本鎖デュプレクスを形成した。次に、ランダムライゲーション反応でＤＮＡリガーゼ６０００単位を含むライゲーション混合物にこれらの３種の２本鎖デュプレクス各等量を加えた。１６℃で１６時間ライゲーション反応を進行させた後、ライゲーション反応産物をアガロースゲルにアプライし、Ｖで電気泳動させた。ＤＮＡサイズマーカーをゲルに加えた。約１５０〜約３５０ｂｐの２本鎖ＤＮＡフラグメント集団（ＤＮＡフラグメント当たりエンハンサーエレメント約５〜１５コピー）を含むことがマーカーにより示される領域に対応するアガロースゲルの領域をゲルから切り出し、Ｇｅｎｏｍｅｄ，ＧｍｂＨ，Ｌｏｈｎｅ，ドイツ製品ＪＥＴＳＯＲＢを製造業者の指示に従って使用してゲルからＤＮＡを溶出させた。
【０１０２】
３４６ｂｐ ＳＶ４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ｐＡ）配列の上流に配置したＳＥＡＰレポーター遺伝子をコードする１５２１ｂｐ核酸と機能的に連結した１２０ｂｐ ＣＭＶ最小プロモーターの上流のプラスミドＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶのＥｃｏＲＶ部位に溶出した２本鎖ＤＮＡフラグメントを平滑末端ライゲーションし、ＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターを形成するように溶出した２本鎖ＤＮＡフラグメントの１個以上を任意順序及び任意組合わせで各々含む複数のプラスミドｐＶＩｊ−ｃｐｒ−ＳＥＡＰ（ここで「ｃｐｒ」は「複合プロモーター」である）を作製した。プラスミドｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ（図５Ａ）はＳａｌｕｃｃｉら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１４１５−１４２１（２００２）及びＲｉｚｚｕｔｏら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１８９１−１９００（２０００）に記載されている。ｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ＥｃｏＲＶプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号２１）を図５Ｂに示す。プラスミドｐＢＶＩｊ−ＳＥＡＰはＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３（１９９３））に記載されているｐＶ１Ｊプラスミドから誘導した。複合プロモーターを含むレポーター遺伝子カセットを含む上記プラスミドで大腸菌を形質転換し、複合プロモーターを特定配置で各々含む複数のクローンを含む組換えライブラリーを作製した。ライブラリーのアリコートを寒天プレートにプレーティングし、コロニーを生成した。ＥｃｏＲＶ部位を挟むＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲにより数百個のコロニーをスクリーニングし、任意エンハンサーエレメント約５コピーを含むプラスミドを含むクローンを同定した（データは示さず）。ＨｅｐＧ２細胞での機能試験用に百個を上回るクローンを選択した。
【実施例２】
【０１０３】
実施例１でライブラリーのコロニーから単離した各ＤＮＡクローンを下記のようにヒトＰＸＲをコードするプラスミドＤＮＡとＨｅｐＧ２細胞に別々にコトランスフェクトし、複合プロモーターの１個と機能的に連結したＳＥＡＰを各々発現する一過性トランスフェクトＨｅｐＧ２細胞を作製した。ＳＥＡＰ転写のＰＸＲ活性化のインデューサーとして１０μＭリファンピシンの存在下と不在下でＳＥＡＰの発現を測定した。
【０１０４】
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎仔血清を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）でヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を増殖させた。１：５分割比で細胞を週２回継代した。アッセイのためにＨｅｐＧ２細胞を分割し、６ウェル組織培養プレートに播種した。播種の翌日、ＳＥＡＰレポーター遺伝子と機能的に連結した従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターを含むライブラリー又は参照レポータープラスミドｐＺＤＣＶＳΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ（ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ）に由来するライブラリーレポータープラスミドＤＮＡ０．９μｇとヒトＰＸＲ遺伝子をコードする核内受容体（ＮＲ）ドナープラスミドＤＮＡ（ｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲ）０．１μｇを製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に推奨されているプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加えたＤＮＡ混合物をプレーティングした細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから３時間後に１０μＭリファンピシンを加えた新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに各ウェルの培地を交換し、Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してＳＥＡＰ発現アッセイを実施した。対照アッセイはＮＲドナープラスミド ＤＮＡを加えずにライブラリーレポータープラスミドＤＮＡ ０．９μｇから構成した。
【０１０５】
参照レポータープラスミド（ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ）の模式図を図７に示す。このプラスミドはｐＺＤＣＳプラスミド（プラスミドｐＺＤＣＳはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＣａｎａｄａでＹｖｅｓ Ｄｕｒｏｃｈｅｒ博士により作製され、その構築についてはＤｕｒｏｃｈｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８４：３１６−３２６（２０００）にも記載されている）において、ｄＤＲ３及びｄＥＲ６を含むＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−７８３９〜−７２０８の第１のＤＮＡフラグメントと、ｐＥＲ６を含むＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−３６２〜＋６４の第２のＤＮＡフラグメントから構成される複合プロモーターとＳＥＡＰをコードする１５２１ｂｐ核酸を機能的に連結したものである。ＳＥＡＰ遺伝子の下流に２１５ｂｐウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を配置した。プラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰは以下のように構築した。ＳＥＡＰ遺伝子をｐＳＥＡＰ−ＢＡＳＩＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から取出し、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。次に、ＳＥＡｐ遺伝子を取出し、ｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングし、プラスミドｐＺｅｏ／ＳＥＡＰを作製した。ＳＶ４０エンハンサー−プロモーター領域をｐＺｅｏ／ＳＥＡＰから除去し、プラスミドｐＺＤＣＶＳを作製した。次にプラスミドｐＺＤＣＶＳをＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ部位に挟まれるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの第１のＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド−７８３９〜−７２０８）と、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に挟まれる第２のＤＮＡフラグメント（ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのヌクレオチド−３６２〜＋６４）を作製するように設計されたＰＣＲプライマーを使用してヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅したＣＹＰ３Ａ４ゲノムフラグメントを消化したｐＺＤＣＶＳのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ部位間に挿入し、プラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰを作製した。ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰに配置した同様のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターもＧｏｏｄｗｉｎらによりＭｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａ．５６：１３２９−１３３９（１９９９）に記載されている。
【０１０６】
ヒトＰＸＲをコードするＮＲドナープラスミドｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲの模式図を図８Ａに示す。このプラスミドはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能なｐＳＧ５プラスミドにおいて、４３９ｂｐ ＳＶ４０プロモーターＳＶ４０起点と機能的に連結した５７３ｂｐ ヒトβ−グロビン第１イントロンと１３４ｂｐ ＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に位置するプラスミドの多重クローニング部位にＡＴＧ開始コドンを欠失させたヒトＰＸＲ（ｈＰＸＲ）をコードする１３３５ｂｐ核酸を挿入したものである。ヒトＰＸＲをコードするＤＮＡはヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。使用した５’ＰＣＲプライマーはヒトＰＸＲの公開配列に示されるＬｅｕ開始コドンの代わりにＡＴＧ開始コドンを加えた。ヒトＰＸＲをコードするＰＣＲ ＤＮＡ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＴＡクローニングベクターにより提供されるＥｃｏＲＩ部位に挟まれたヒトＰＸＲをコードするＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによりＴＡクローニングベクターから除去した。次にＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＳＧ５のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲを作製した。
【０１０７】
トランスフェクション実験を数回実施し、百個を上回る選択クローンを試験した。ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導倍率は恐らく細胞の状態により多少変動する（２〜７倍）が、各種ライブラリークローンの複合プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導とΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからの転写誘導の相対シグナル比は常に維持した。
【０１０８】
典型的なスクリーニングアッセイの結果を図９に示す。図面から明らかなように、参照プラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰからのＳＥＡＰの転写はリファンピシンの存在下で約６倍誘導されたが、ライブラリープラスミドのうちの数種からのＳＥＡＰの転写はより高レベルまで誘導された。例えば、ライブラリーからのクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導は一貫してΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導の約４〜５倍良好であり（夫々誘導倍率２３倍と６倍）、著しく高い総ＳＥＡＰシグナルが得られた。特筆すべき点として、ライブラリーからの所定のクローンをトランスフェクトした細胞におけるＳＥＡＰの発現はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰをトランスフェクトした細胞からのＳＥＡＰ発現よりも高レベルまで誘導された。例えば、クローン６１のＳＥＡＰ転写誘導率は約１１倍であったが、総ＳＥＡＰシグナルはΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰからのシグナルと同等以下であった。これらのクローンはヒトＰＸＲの存在下でバックグラウンド発現が低く、リファンピシンに対する応答性が高かった。試験したクローンのうちで、クローン１０２−ＳＥＡＰは誘導倍率と強力で堅牢なレポーター（ＳＥＡＰ）シグナルの両面でＣＹＰ３Ａ４インデューサーリファンピシンに対して高い応答性を生じることが確認された。以上に基づき、各種化合物に対して更に分析するためにクローン１０２−ＳＥＡＰを選択した。
【０１０９】
これらのクローンの複合プロモーターのうちの数種のもののエンハンサー又は結合部位配置を図６に示す。クローンの数種のもののエンハンサーの配置を図６に示す。図６に示すクローンのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１１０】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン２６−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号１４）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向に２個のｐｒＥＲ６エレメントと１個のｄＥＲ６エレメントを含む。
【０１１１】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン３３−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡ−３’（配列番号１５）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向にｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、ｐｒＥＲ６、２個のｄＤＲ３エレメント、及びｐｒＥＲ６エレメントを含む。
【０１１２】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン６１−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１６）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向に２個のｄＤＲ３エレメント、ｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、ｐｒＥ６エレメント、及びｄＤＲ３エレメントを含む。
【０１１３】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン７１−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡ−３’（配列番号１７）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向に２個のｄＥＲ６エレメント、ｐｒＥＲ６エレメント、ｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、２個のｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、ｐｒＥＲ６エレメント、及びｐｒＥＲ６エレメントを含む。
【０１１４】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン１０２−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴ−３’（配列番号１８）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向にｄＤＲ３エレメント、ｄＥＲ６エレメント、及び２個のｄＤＲ３エレメントを含む。この配列はｐｒＥＲ６エレメントを含まない。
【実施例３】
【０１１５】
クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞のＣＹＰ３Ａ４インデューサー同定能を評価した。
【０１１６】
実施例２に記載したように増殖させたヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を分割し、６ウェル組織培養プレートのウェルに播種した。播種の翌日、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ ＤＮＡ ０．９μｇとｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲ ＤＮＡ ０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加えたＤＮＡ混合物をプレーティングした細胞にトランスフェクトした。対照アッセイはＮＲドナープラスミドを加えずにクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ ０．９μｇから構成した。
【０１１７】
トランスフェクションから３時間後に、２００μＭオメプラゾール、１０μＭアンドロスタノール、１００μＭコール酸、６μＭクロトリマゾール、１２５ｎＭハイパーフォリン、１２．５μＭロバスタチン、１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１ｍＭフェノバルビタール、１０μＭリファンピシン、又は１０μＭ ＲＵ４８６を加えた新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに各ウェルの培地を交換した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後にＳＥＡＰアッセイ用にウェルから培地を採取した。ＳＥＡＰ発現アッセイはＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用して実施した。
【０１１８】
結果を図１０及び１１に示す。図１０は各種化合物によるＳＥＡＰ転写の誘導倍率を示す。図１１はリファンピシンによる誘導の百分率として表したＳＥＡＰ転写の誘導倍率を示す。これらの化合物による転写誘導に対するクローン１０２−ＳＥＡＰの応答はヒト肝細胞及びＨｅｐＧ２／ＣＹＰ３Ａ４誘導アッセイの両者で発表されている結果と一致した（Ｌｕｏら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３０：７９５−８０４（２００２）；Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７（２００２）；Ｒａｕｃｙ，Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３１：５３３−５３９（２００３））。参照ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰプラスミド（データは示さず）と比較すると、参照レポータープラスミドは同様に挙動するが、クローン１０２は一貫して著しく高いシグナルを発生することが判明した。
【０１１９】
ｐｒＥＲ６、ｄＥＲ６、ｄＤＲ３エンハンサー部位は天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターで相互に異なる距離に位置し、ｄＥＲ６及びｄＤＲ３では転写開始部位の約８ｋｂ上流であるが、本実施例に示す結果によると、ｄＥＲ６及びｄＤＲ３の転写強化能は距離に依存せず、それらの機能的効果は付加的である。クローン、特にクローン１０２−ＳＥＡＰにおける各種結合部位の分布と向きの効果を理由付けするのは非常に難しいが、ｄＤＲ３のマルチマー化と恐らく右向きがリファンピシン及び他のＰＸＲリガンドに対する強力な応答を付与するのに主要な役割を果たしていると予想することができる。これはｄＥＲ６及びｐＥＲ６に関するこの部位に対するヒトＰＸＲ／ヒトＲＸＲ複合体の高い親和性に一致する（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））。ＰＸＲの結合部位のみを含む人工プロモーターの使用に関する１つの問題は天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのほうがｉｎ ｖｉｖｏで得られる応答をより忠実に反映する応答を再現できるのではないかという点である。しかし、この疑問はｈＰＸＲの不在下でＨｅｐＧ２アッセイを実施すると、参照レポータープラスミドＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰもクローン１０２−ＳＥＡＰもリファンピシンに応答しなかったという事実により容易に解決される。どちらのレポータープラスミドもｈＰＸＲのコトランスフェクションに厳密に依存した。
【０１２０】
特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは非常に高いシグナルとＣＹＰ３Ａ４インデューサーに対する高い応答性の利点を明白に提供する。参照レポータープラスミドＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰと比較すると、特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは薬剤候補のｉｎ−ｖｉｔｒｏ高スループットスクリーニングで使用するのに適しており、従来よりも著しく堅牢なアッセイが得られる。
【実施例４】
【０１２１】
ＣＡＲは多数のＰＸＲ応答性遺伝子のプロモーターで同様の部位を認識する別の核内受容体であるため、ヒトＣＡＲを発現したプラスミドとのコトランスフェクションでクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡをを試験した。
【０１２２】
ヒトＣＡＲをコードするＮＲドナープラスミドを以下のように作製した。ヒトＣＡＲはヒト肝ｍＲＮＡ調製物からＲＴ−ＰＣＲにより作製した。使用したＰＣＲプライマーは５’−ＧＡＡＧＣ ＴＴＧＴＴ ＣＡＴＧＧ ＣＣＡＧＴ ＡＧＧＧＡ ＡＧＡＴＧ ＡＧＣ−３’（配列番号１９）及び５’−ＴＧＧＣＣ ＴＣＡＧＣ ＴＧＣＡＧ ＡＴＣＴＣ ＣＴＧＧＡ ＧＣ−３’（配列番号２０）とした。ＲＴ−ＰＣＲ条件は９４℃で１５秒、９４℃で３０秒後に６８℃で３分を３０サイクル、次いで６８℃で３分間とし、４℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲから得られたヒトＣＡＲ（ｈＣＡＲ）をコードする１０４７ｂｐ核酸をｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＴＡクローニング部位に挿入し、プラスミドｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲ（図８Ｂ）を作製した。５９６ｂｐ ＣＭＶ極初期プロモーターによりｈＣＡＲの発現を誘導した。
【０１２３】
実施例２に記載したように増殖させたヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を分割し、６ウェル組織培養プレートのウェルに播種した。播種の翌日、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ ＤＮＡ０．９μｇとＤＮＡ ｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲ ０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加えたＤＮＡ混合物をプレーティングした細胞にトランスフェクトした。対照はヒトＣＡＲをコードするＤＮＡを省略した。前の実施例のヒトＰＸＲをコードするＤＮＡから付加対照を構成した。
【０１２４】
トランスフェクションから３時間後に、２００μＭオメプラゾール、１０μＭアンドロスタノール、１００μＭコール酸、６μＭクロトリマゾール、１２５ｎＭハイパーフォリン、１２．５μＭロバスタチン、１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１ｍＭフェノバルビタール、１０μＭリファンピシン、又は１０μＭ ＲＵ４８６を加えた新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに各ウェルの培地を交換した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後にＳＥＡＰアッセイ用にウェルから培地を採取した。ＳＥＡＰ発現アッセイはＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用して実施した。
【０１２５】
実施例３の結果と対照的に、ヒトＣＡＲをコードするプラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクションすると、添加化合物の不在下でΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの転写活性化が生じた。図１２（ＳＥＡＰ任意単位として表した結果）及び図１３（ヒトＣＡＲにより誘導される転写の構成的活性化により得られる最大活性化の百分率として表した結果）に示すように、ヒトＣＡＲ ＤＮＡをクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ ＤＮＡとコトランスフェクションした結果、ＳＥＡＰ転写誘導率は夫々４４．２倍と３．４倍になった。クローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターからの転写誘導率のほうが著しく高いことから、複合プロモーターは核内受容体による活性化に対してΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターよりも高感度であることが確認される。
【０１２６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＡＲリプレッサーであることが既に知られているクロトリマゾールやオメプラゾール等の化合物はクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターとΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターのどちらからの転写にも明白に阻害効果を示した。また、抗黄体ホルモン薬であるＲＵ４８６はヒトＣＡＲの構成的活性化の阻害剤であることが判明した。Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７（２０００）では、ヒトＣＡＲにより３．３倍のレポータープラスミドからの転写が誘導されたが、ＲＵ４８６はＣＶ１細胞で阻害効果を示さなかった。所定の他の化合物（例えば、ハイパーフォリン、ロバスタチン、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）については、クローン１０２−ＳＥＡＰレポータープラスミドの複合プロモーターからの転写は影響を受けなかったが、ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからの転写の中等度阻害が観察された（図１３）。
【０１２７】
コトランスフェクトしたヒトＣＡＲによるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターからの転写の高い活性化はｄＤＲ３に対するヒトＣＡＲ／ヒトＲＸＲ複合体の高い親和性により説明することができる（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：３５９−３６５（２００２））。特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは非常に高いシグナルとＣＹＰ３Ａ４インデューサーに対する高い応答性の利点を明白に提供する。参照レポータープラスミドＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰと比較すると、特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは薬剤候補のｉｎ−ｖｉｔｒｏ高スループットスクリーニングで使用するのに適しており、従来よりも著しく堅牢なアッセイが得られる。
【実施例５】
【０１２８】
本発明のレポーター遺伝子発現カセットを含む細胞株は以下のように作製することができる。
【０１２９】
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎仔血清を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）にヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を保存する。細胞約２×１０５個を１００ｍｍ組織培養皿に播種し、実施例１からの遺伝子発現カセットとネオマイシン耐性を付与する遺伝子を含むプラスミド１μｇを製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に推奨されているプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加え、トランスフェクトする。トランスフェクションから３時間後に培地を新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに交換する。２４時間後に細胞を分割し、Ｇ４１８選択ＤＭＥＭ（１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８）で培養する。コロニーが形成されるまで培地を３日おきに交換する。個々のコロニーを単離し、６ウェルプレートに播種する。細胞がコンフルエントまで増殖した後、Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用して公知ＣＹＰ３Ａ４アクチベーターの存在下でそのＳＥＡＰ発現能を判定する。
【実施例６】
【０１３０】
本実施例は複合プロモーターとｈＣＡＲ又はｈＰＸＲをコードする発現ベクターを新鮮なラット肝細胞にコトランスフェクトすると、検体により活性化されたｈＰＸＲを介して誘導される発現から検体により活性化されたｈＣＡＲを介して誘導されるＣＹＰ３Ａ４発現を識別するアッセイが得られることを実証する。
【０１３１】
２４ウェルプレートでラット初代肝細胞へのＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３０１４２５）のトランスフェクション及びコトランスフェクションを以下のように実施した。
【０１３２】
トランスフェクションの前日に潅流したラット肝から肝細胞を単離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及びＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＤＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５４３５２）を補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１ｍＬ中、ＢＩＯＣＯＡＴ ２４ウェル（Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５４４０８）に細胞１×１０５個／ウェルをプレーティングした。４時間後に、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及びＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘを加えたＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１ｍＬに細胞培地を交換し、細胞を正常増殖条件下で一晩インキュベートした。
【０１３３】
翌日、レポータートランスフェクションの場合にはトランスフェクション毎にクローン１０２−ＳＥＡＰ ０．４μｇをＥＦＦＥＣＴＥＮＥ試薬ＤＮＡ−濃縮用緩衝液Ｂｕｆｆｅｒ ＥＣと総容量３５０μＬまで試験管で混合した。次にエンハンサー３．２μＬを加え、１秒間ボルテックスすることにより混合した。レポーター／核内受容体コトランスフェクションの場合には、トランスフェクション毎にクローン１０２−ＳＥＡＰ ０．３μｇとｈＰＸＲ（ＡＴＧ）／ｐＳＧＳ又はｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲ ０．１μｇをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬ＤＮＡ−濃縮用緩衝液Ｂｕｆｆｅｒ ＥＣと総容量３５０μＬまで試験管で混合した。対照トランスフェクションでは、クローン１０２−ＳＥＡＰ ０．３μｇと０．１μｇのｐＵＣ１９をコトランスフェクトした。コトランスフェクション後にエンハンサー３．２μＬを加え、１秒間ボルテックスすることにより混合した。トランスフェクション／コトランスフェクション混合物を室温で５分間インキュベートした。次に、混合物を数秒間遠心し、試験管の頂部から液滴を除去した。次に、各混合物にＥｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ５μＬを加え、混合物を１０秒間ボルテックスすることにより混合した。次に混合物を１０分間室温でインキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させた。
【０１３４】
一方、細胞を含む２４ウェルプレートの各ウェルの増殖培地をウェルから捨て、ウェル内の細胞を増殖培地１ｍＬで１回洗浄した。次に新鮮な増殖培地３５０μＬを各ウェルに加え、増殖培地３５０μＬをトランスフェクション複合体の各試験管に加えた後、混合し、すぐにウェル内の細胞に滴下した。プレートを穏和に旋回させ、トランスフェクション複合体を細胞に均質に分布させた。細胞を正常増殖条件下でトランスフェクション培地と共に６時間インキュベートした。その後、トランスフェクション複合体を含む培地を捨て、抗生物質、グルタミン、ＩＴＳ、及び１０μＭリファンピシン、１μＭ ＣＩＴＣＯ（６−（４−クロロフェニル）イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−５−カルボアルデヒドＯ−（３，４−ジクロロベンジル）オキシム）、１ｍＭフェノバルビタール又はＤＭＳＯ単独を加えたＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１ｍＬに交換した。細胞を４８時間３７℃でインキュベートした。培地を細胞から除去し、Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用してＳＥＡＰ活性をアッセイした。
【０１３５】
対照反応では、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡとｐＵＣ１９ ＤＮＡを新鮮なラット肝細胞にトランスフェクトし、クローン１０２−ＳＥＡＰがコトランスフェクトした核内受容体の不在下で内在ラットＣＡＲ又はＰＸＲを動員する化合物に対して応答するか否か（ＳＥＡＰシグナルを培地で測定できるか否か）を調べておいた。図１４に示すように、試験した検体の存在下で誘導は観察されなかった。リファンピシンの場合には、リファンピシンはラットでＣＡＲのインデューサーではないので予想通りであったが、マウスＣＡＲのインデューサーであることが知られているフェノバルビタールにより応答は誘発されなかった。齧歯類におけるＣＩＴＣＯの誘導可能性は不明であると考えられている。ラットＣＡＲを誘導するＴＣＰＯＢＯＰ（１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジルオキシ）］ベンゼン）等の強力な公知ＣＡＲインデューサーを使用し、安定したトランスフェクション効率レベルを確保する条件下で実験を繰返すならば、同様の結果が得られると予想される。従って、以上の結果はラット肝細胞におけるクローン１０２−ＳＥＡＰのバックグラウンド発現が無意味なまでに低かったことを示す。
【０１３６】
クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡとｈＣＡＲ又はｈＰＸＲをコードするＤＮＡをラット肝細胞にコトランスフェクトすると、公知ＣＡＲ又はＰＸＲインデューサーの存在下でレポーター遺伝子発現の活性化の有意誘導が認められ、誘導は受容体に特異的であった。図１４に示すように、リファンピシンはｈＣＡＲを介する発現を誘導せずにｈＰＸＲを介する約２．６倍の発現を誘導し、フェノバルビタールはｈＣＡＲを介する約４倍の発現とｈＰＸＲを介する約３．４倍の発現を誘導し、ＣＩＴＣＯはｈＰＸＲを介する発現を誘導せずにｈＣＡＲを介する約４．２倍の発現を誘導した。この結果、コトランスフェクションプロトコールは有効であり、クローン１０２−ＳＥＡＰは検体とトランスフェクトしたｈＣＡＲ又はｈＰＸＲの相互作用のみにより誘導されることが分かる。ＰＸＲインデューサーとｈＣＡＲ又はＣＡＲインデューサーとｈＰＸＲの間に明白な交差反応性は認められなかった。更に、ｈＣＡＲはヒト肝で調節されるので、ラット肝細胞で調節されると思われる。即ち、大半の細胞株と異なり、コトランスフェクトしたラット肝細胞では、ｈＣＡＲは構成的に活性化されず、誘導的である。これはヒト肝、ＨｅｐＧ２、及びラット肝細胞におけるｈＰＸＲの誘導能と同様である。以上の結果は肝細胞の状態、従ってトランスフェクション効率に強く依存したが、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡとヒトＣＡＲ又はＰＸＲをコードする発現ベクターをコトランスフェクトしたラット肝細胞はＣＡＲ又はＰＸＲ又は両者を活性化する検体を識別する高感度アッセイとなることが実証された。
【０１３７】
以上の結果から、クローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターと同等以上の強度をもつ複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子とｈＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットをコトランスフェクトしたラット肝細胞は、ｈＣＡＲ活性を誘導する可能性のみについて検体を試験するための手段となることが明らかである。以上の結果から更に、上記のような複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子とｈＰＸＲをコードする遺伝子発現カセットをコトランスフェクトしたラット肝細胞は、ｈＰＸＲ活性を誘導する可能性のみについて検体を試験するための手段となることも明らかである。
【実施例７】
【０１３８】
本実施例では、実施例６の方法を使用してクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡを新鮮なヒト肝細胞にトランスフェクトした。ＤＭＳＯ又は１０μＭリファンピシン、５μＭクロトリマゾール、１０μＭ ＴＰＰ、２５０μＭ ＣＩＴＣＯ、もしくは５０μＭアルテミシニンを加えた培地中、トランスフェクトした細胞を約４８時間３７℃でインキュベートした後にＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用してＳＥＡＰ活性をアッセイした。結果を図１５に示し、全５個の検体がレポーター遺伝子の発現のインデューサーであることが明らかである。
【０１３９】
これらの結果から明らかなように、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡはヒト肝細胞にトランスフェクトすることができ、検体がＣＡＲ又はＰＸＲを介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導する能力を評価するために使用することができる。本実施例から明らかなように、クローン１０２−ＳＥＡＰ又はクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターと同等以上の強度の複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子のみをトランスフェクトした新鮮なヒト肝細胞を使用してＣＡＲ又はＰＸＲを介するＣＹＰ３Ａ４活性をアッセイすると、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２のベクターとレポーターをコトランスフェクトする必要がある従来技術のアッセイよりも改善される。
【実施例８】
【０１４０】
本実施例は多重ウェルフォーマットで実施される本発明のアッセイで使用するためにＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトする効率的で迅速な方法について記載する。この方法の利点は液内バッチトランスフェクションであるため、細胞を懸濁状態でトランスフェクトした後に多重ウェルプレートのウェルにプレーティングできるという点である。この方法は、各ウェルで別々にトランスフェクトする方法（非常に煩瑣で１個以上の９６プレートで再現不能）及び大型（例えば１５ｃｍ又はフラスコ）組織培養皿でトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を分割し、適切な寸法の容器（例えば９６ウェル組織培養プレート）に再プレーティングする方法という時間がかかる低効率の２つの代替方法に比較して改善される。
【０１４１】
ＨｅｐＧ２細胞を組織培養皿で約８０％コンフルエントまで増殖させる。培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄する。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液でトリプシン処理する。細胞が分離し始めたら完全ＤＭＥＭを細胞に加えてトリプシンをブロックし、細胞を遠心管に移す。細胞を１２００ｒｐｍで約３〜５分間遠心する。上清フラクションを捨て、回収される細胞の１５ｃｍプレート当たり約１５〜２０ｍＬで細胞を培地に再懸濁する。適切な培地はＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２０４５−０８５）又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５１９８５−０２６）であるが、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭが好ましい。再懸濁した細胞を１２００ｒｐｍで約３〜５分間遠心し、回収される各１５ｃｍプレート当たり約１５〜２０ｍＬで上記培地に再懸濁する。２０ｍＬシリンジ（１．２×４０ゲージ）を使用し、細胞を約２回吸引排出することにより細胞塊を破砕する。細胞懸濁液をＣｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ ７０μｍ（Ｆａｌｃｏｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５−２３５０）に通し、懸濁液を細胞約５００，０００個／ｍＬまで希釈する。
【０１４２】
９６ウェルプレート用のトランスフェクション複合体の作製は以下の通りである。この方法は他の多重ウェルフォーマットにも適応させることができる。（クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又は別の複合プロモーターもしくは天然プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子）４．５μｇとｈＰＸＲ（ＡＴＧ）／ｐＳＧＳ ０．５μｇをＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ ５００μＬに加えることにより第１の混合物ＭｉｘＡを調製する。次にＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔ．＃ １１５１４−０１５）３０μＬを加え、混合物を１５分間室温でインキュベートする。
【０１４３】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３２４−０２０）２０μＬをＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ ５００μＬに加えることにより第２の混合物ＭｉｘＢを調製する。
【０１４４】
１５ｍＬポリプロピレンＦａｌｃｏｎ試験管でＭｉｘＡとＭｉｘＢを合わせた後、約５００，０００個／ｍＬの細胞４ｍＬを加え、トランスフェクション混合物を調製する。トランスフェクション混合物を穏和に混合した後、１５分間室温でインキュベートする。周期的に試験管を転倒させて細胞を懸濁状態に保つ。
【０１４５】
その後、各ウェルにトランスフェクション混合物の５０μＬアリコートを加える。この結果、細胞約２０，０００／ウェルとなる。細胞を少なくとも３時間３７℃でインキュベートし、細胞を接着させ、トランスフェクションを進行させる。約３時間後にトランスフェクション混合物を取出し、ＤＭＳＯ又は検体を添加するか又は添加しないＤＭＥＭ−ＧＭ培地１００μＬと交換する。３７℃で４８時間後に培地を取出し、ｈＰＸＲ活性の誘導をアッセイする。
【０１４６】
本明細書では図例態様を参照して本発明を記載するが、当然のことながら本発明はこれらの態様に限定されない。当分野に通常の知識をもつ者が本明細書の教示に接するならば、付加変形及び態様も発明の範囲内に含まれることを認識しよう。従って、本発明は特許請求の範囲のみに限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ヒトＰＸＲとＳＥＡＰレポーター遺伝子に機能的に連結した従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターから構成されるプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞を使用する従来技術のＣＹＰ３Ａ４誘導アッセイを示す模式図である。
【図２Ａ】図２ＡはＳＥＡＰレポーター遺伝子と機能的に連結した従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの模式図である。ヒトＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位ｄＤＲ３、ｄＥＲ６及びｐＥＲ６の位置を示す。
【図２Ｂ】図２ＢはヒトＰＸＲ又はＣＡＲ誘導に対して応答性の複合プロモーターを作製するためのストラテジーの模式図である。
【図３Ａ】図３ＡはｐＥＲ６フォワード鎖（配列番号２）と相補鎖（配列番号３）を含む２本鎖オリゴマーのヌクレオチド配列を示す。塩基番号はヒトＣＹＰ３Ａプロモーター領域を表す。
【図３Ｂ】図３ＢはｄＥＲ６フォワード鎖（配列番号５）と相補鎖（配列番号６）を含む２本鎖オリゴマーのヌクレオチド配列を示す。塩基番号はヒトＣＹＰ３Ａプロモーター領域を表す。
【図３Ｃ】図３ＣはｄＤＲ６フォワード鎖（配列番号８）と相補鎖（配列番号９）を含む２本鎖オリゴマーのヌクレオチド配列を示す。塩基番号はヒトＣＹＰ３Ａプロモーター領域を表す。
【図４Ａ】図４Ａはクローン１０２エンハンサーとＣＭＶ最小プロモーターを含む複合プロモーターに機能的に連結したＳＥＡＰレポーター遺伝子を含むＳＥＡＰレポーター遺伝子発現カセットを含むクローン１０２−ＳＥＡＰ（プラスミドｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶ−＃１０２）の模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂはクローン１０２−ＳＥＡＰレポーター遺伝子カセットの模式図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは図４Ｂに示すレポーター遺伝子カセットのヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。クローン１０２エンハンサーは大文字で表し、ＣＭＶ最小プロモーターは下線で表し、ＳＥＡＰレポーター遺伝子は斜体で表す。
【図５Ａ】図５ＡはプラスミドｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶの模式図である。
【図５Ｂ】図５ＢはｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。ＥｃｏＲＶ制限酵素部位に対応するヌクレオチド配列を下線で示す。
【図５Ｃ】５ＣはｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。ＥｃｏＲＶ制限酵素部位に対応するヌクレオチド配列を下線で示す。
【図６】本発明の複合プロモーターの数種のものの複合エンハンサーにおけるｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６エンハンサーエレメントの位置と分布を示す模式図である。エレメントの向きは矢印で示す。各クローンを含むエンハンサーエレメントについて、右向きの矢印はエンハンサーエレメントが天然の向きであることを示し、左向きの矢印は天然以外の向きであることを示す。ｄＤＲ３は白い矢印で示し、ｄＥＲ６は黒い矢印で示し、ｐｒＥＲ６は斜線の矢印で示す。
【図７】プラスミドｐＺＤＣＶＳ−ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰの模式図である。
【図８Ａ】図８ＡはプラスミドｐＳＧ５−ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲの模式図である。
【図８Ｂ】図８ＢはプラスミドｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲの模式図である。
【図９】ヒトＰＸＲをコードする核内受容体（ＮＲ）ドナープラスミドの存在下で複合プロモーターライブラリーに由来するクローン３、２１、２６、３３、５８、６１、７０、７１、及び１０２をＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトし、１０ｍＭリファンピシンの存在下と不在下でＳＥＡＰ転写誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陽性対照としてレポータープラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰを加えた。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。ＳＥＡＰの発現をＳＥＡＰ任意単位として報告する。棒線の上の数字はリファンピシンの存在下又は不在下におけるプロモーターからの転写誘導倍率を表す。
【図１０】ヒトＰＸＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。ＳＥＡＰの発現を任意ＳＥＡＰ単位として報告する。棒線の上の数字は指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。
【図１１】ヒトＰＸＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるライブラリークローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。リファンピシンによる転写誘導率を１００％とし、その百分率としてＳＥＡＰの発現を報告する。棒線の上の数字はリファンピシンによる誘導率に比較した指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰにおけるΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの誘導能と比較して結果を示す。
【図１２】ヒトＣＡＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。ＳＥＡＰの発現を任意ＳＥＡＰ単位として報告する。棒線の上の数字は指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。陽性対照としてΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰを加えた。
【図１３】ヒトＣＡＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。リファンピシンによる転写誘導率を１００％とし、その百分率としてＳＥＡＰの発現を報告する。棒線の上の数字はリファンピシンによる誘導率に比較した指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰにおけるΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの誘導能と比較して結果を示す。
【図１４】初代ラット肝細胞が肝細胞単独にトランスフェクトした場合にクローン１０２−ＳＥＡＰからの転写を活性化した内在ＰＸＲ又はＣＡＲ活性を含まないことを示す。図から明らかなように、ＣＡＲをコードする遺伝子カセットとクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡを肝細胞にコトランスフェクトした場合には、ＣＡＲアクチベーターのみがクローン１０２−ＳＥＡＰから転写を誘導することができた。同様に図から明らかなように、ＰＸＲをコードする遺伝子カセットとクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡを肝細胞にコトランスフェクトした場合には、ＰＸＲアクチベーターのみがクローン１０２−ＳＥＡＰから転写を誘導することができた。ＳＥＡＰ任意単位として結果を表す。
【図１５】クローン１０２−ＳＥＡＰをトランスフェクトした初代ヒト肝細胞がＰＸＲ又はＣＡＲを介するＣＹＰ３Ａ４のインデューサーを検出できることを示す。ＳＥＡＰ任意単位として結果を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はチトクロームＰ４５０の発現、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの発現を誘導することができる検体の同定方法に関する。本方法は活性化プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）と結合する１個以上のタンデムに配置されたシス作用性エレメントを異種プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を提供する。ＰＸＲ活性化を介するＣＹＰ３Ａ４発現のインデューサーである検体はレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）は多数の薬剤、発癌性物質、農薬及び生体異物の水酸化に関与しており、多くのＣＹＰは生体異物により５０〜１００倍まで強力に誘導可能である。薬物療法では、ＣＹＰ誘導に関して２つの大きな問題がある。第１に、誘導により薬物代謝の増加の結果として全身循環が低下することにより治療効果が低下する可能性がある。第２に、誘導により反応代謝物形成が増加する結果として中毒と解毒の間に望ましくない不均衡が生じる可能性がある（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｌｕ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８））。
【０００３】
ＣＹＰ酵素の多くは誘導性であることが知られているが、ＣＹＰ３Ａ４誘導は文献に記載されている誘導による薬物−ＣＹＰ相互作用の最重要原因であると思われる（Ｗｈｉｔｌｏｃｋら，Ｉｎ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ（Ｅｄ．）．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）．ｐｐ．３６７−３９０）。これはＣＹＰ３Ａ４がヒト肝の総ＣＹＰ含量の約４０％を占め、臨床使用される薬剤の６０％を上回る量を代謝するためである。薬剤候補は望ましくないＣＹＰ３Ａ４誘導による相互作用を招く可能性があるので、新規薬剤候補についてそのＣＹＰ３Ａ４誘導可能性を評価することが重要になってきている。
【０００４】
ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルは誘導データのｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ外挿に影響を与える因子に関する多少の有用な情報を提供することができるが、誘導応答差が種によって有意であるため、新規薬剤候補のヒトＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために動物モデルを使用することはできない。新規薬剤候補のＣＹＰ３Ａ４誘導可能性を評価するために、肝スライス、不死化細胞株、及び初代肝細胞等の数種のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが確立されている（Ｓｉｌｖａら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２６：４９０−４９６（１９９８）；Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２７：８８７−８９４（１９９９）；Ｍａｕｒｅｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｖ．２２：１０５−１３２（１９９６）；ＬｅＣｌｕｙｓｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１３：３４３−３６８（２００１））。これらのモデルのうちで、ヒト初代培養肝細胞は学術及び産業実験室でＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために広く使用されている。初代培養肝細胞はＣＹＰ誘導を評価するための最も有望なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルであるが、ヒト肝細胞の入手可能性は非常に限られていることが多い。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムの使用はヒトＣＹＰ３Ａ４誘導の可能性を高スループットスクリーニング方式で評価することができる唯一の手段である。
【０００５】
その近位領域のヌクレオチド配列が発表されて以来（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５８５−５９５（１９９３））、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子のプロモーターは生体異物に対する応答性を付与するシス作用性エレメントについて詳細に分析されている。数種の重要なエレメントが同定されている。近位エレメントｐｒＰＸＲＥ（近位ＥＲ６又はｐＥＲ６）は転写因子の核内受容体ファミリー（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，Ｃｅｌｌ ８３：８３５−８３９（１９９５））の認識配列であり、ＥＲ６（塩基間隔６のエバーテッドリピート）と呼ばれるＴＧＡ（Ａ／Ｃ）ＣＴヘキサマーモチーフ２コピーを含む。ｐｒＰＸＲＥはリファンピシンによるレポーター遺伝子発現の比較的低度の活性化を付与する（Ｂａｒｗｉｃｋら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１０−１６（１９９６）；Ｏｇｇら，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ２９：２６９−２７９（１９９９））。ｐｒＰＸＲＥエンハンサーエレメントはリファンピシン応答性活性化が比較的低い。他方、Ｇｏｏｄｗｉｎら，（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））とＬｉｄｄｌｅ ａｎｄ Ｇｏｏｄｗｉｎ（ＷＯ９９６１６２２）はＣＹＰ３Ａ４転写開始部位から約８ｋｂ上流の生体異物応答性エンハンサーモジュール（ＸＲＥＭ）と呼ぶ２３０ｂｐ遠位エレメントを同定し、ヒトＰＸＲ活性のアクチベーターによるＣＹＰ３Ａ４の強力なエンハンサーであると特徴付けた。ＸＲＥＭは塩基間隔２９で２個の核内受容体（ＮＲ）結合部位ｄＮＲ１（遠位ＤＲ３又はｄＤＲ３）及びｄＮＲ２（遠位ＥＲ６又はｄＥＲ６）を含む。ｄＮＲ１（遠位ＤＲ３又はｄＤＲ３）エレメントは塩基間隔３のダイレクトリピートと呼ばれるＴＧＡ（Ａ／Ｃ）Ｃ（Ｔ／Ｃ）ヘキサマー２コピーを含む。ｄＮＲ２（遠位ＥＲ６又はｄＥＲ６）エレメントは塩基間隔６のエバーテッドリピートと呼ばれるＴＧＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｔ／Ｃ）ヘキサマー２コピーを含む。Ｓｕｅｙｏｓｈｉ ａｎｄ Ｎｅｇｉｓｈｉ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：１２３−１４３（２００１）はＣＹＰ３Ａファミリーのエンハンサーエレメントについて考察している。
【０００６】
ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの調節は非常に複雑であることが分かっている。例えば、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、グルココルチコイド受容体及び転写因子等の多くのヒト核内受容体はＣＹＰ３Ａ４転写活性の調節に関与している（Ｐａｓｃｕｓｓｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６１９，２４３−２５３（２００３））が、これらの核内受容体のうちで、ＰＸＲはＲＸＲと一緒になってＣＹＰ３Ａ４転写活性の調節に主要な役割を果たすと思われる（ＰＸＲとＲＸＲの結合を開示するＷＯ９９３５２４６（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）参照）。ＰＸＲは各種親油性化合物により活性化され、その多く（例えばリファンピシンや他の薬剤等）は公知ＣＹＰ３Ａインデューサーである（Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２２０８−１２２１３（１９９８）；Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５（１９９８）；Ｌｅｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１０１６−１０２３（１９９８））。ＷＯ９９３５２４６（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）、ＷＯ９９４８９１５（Ｋｌｉｅｗｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｓｏｎ）及びＫｌｉｅｗｅｒら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２（１９９８）はヒトＰＸＲのヌクレオチド配列とヒトＰＸＲを活性化又は阻害する能力について化合物をスクリーニングするためのアッセイでヒトＰＸＲを使用する方法を開示している。ヒトＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は米国特許第６，５７９，６８６号（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｐａｒｋ）に開示されており、ＷＯ９３１７０４１（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｂａｅｓ）はＣＡＲに関連すると思われるポリペプチドを開示している。
【０００７】
ＨｅｐＧ２等の細胞株は一般に大量のＲＸＲを発現するが、ＰＸＲはほんの僅かしか発現しない。レポーター遺伝子に融合したＣＹＰ３Ａ４プロモーター（その全部又は一部）をＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションすると、リファンピシンによる明白な誘導が生じるが、ヒトＰＸＲとコトランスフェクトした場合に限られる（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５（１９９８）；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））。これらの知見に基づき、薬剤の誘導可能性をスクリーニングするためのＰＸＲレポーター遺伝子アッセイが開発された（Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７（２０００）；Ｅｌ−Ｓａｎｋａｒｙら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２９：１４９９−１５０４（２００１）；Ｌｕｏら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３０：７９５−８０４（２００２）；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．，２９，１３２５−１３３１（２００１））。
【０００８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によると、ヒトＰＸＲはヒトＲＸＲと一緒になってＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列モチーフｐｒＰＸＲＥ、ｄＮＲ１、及びｄＮＲ２と直接結合することが判明した（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３１９５−３２０５（１９９８）；Ｌｅｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１０１６−１０２３（１９９８）；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））。例えば、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのヌクレオチド−７８３９〜−７２０８及び−３６２〜＋６４から構成される発現ベクター（ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーター）をレポーター遺伝子と機能的に連結し、発現ベクターをヒトＰＸＲ発現ベクターとＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトすると、リファンピシン処理後にレポーター遺伝子の発現の誘導が観察された（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９）；ＷＯ９９６１６２２（Ｌｉｄｄｌｅ ａｎｄ Ｇｏｏｄｗｉｎ））。最近、同様のＥＭＳＡ実験により、ヒトＣＡＲがｐｒＰＸＲＥ及びｄＮＲ１の両者と直接結合し、程度は低いが、ｄＮＲ２とも結合することが実証されており、ＣＹＰ３Ａ４がＣＡＲリガンドにより誘導可能であることが示されている（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：３５９−３６５２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記ヒトＰＸＲレポーターアッセイはＣＹＰ誘導可能性について薬剤をスクリーニングするのに有用であることが分かっている。しかし、上記アッセイでは低レベルでＣＹＰ誘導を生じる薬剤を検出することができない。従って、ＣＹＰ誘導レベルの低い薬剤を検出できるような誘導応答を提供することが可能なアッセイが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は活性化プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）と結合する１個以上のタンデムに配置されたシス作用性エレメントを異種プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターと、チトクロームＰ４５０の発現、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの発現を誘導することができる検体を同定するために、レポーター遺伝子と機能的に連結した前記複合プロモーターを使用する方法を提供する。ＰＸＲを介するＣＹＰ３Ａ４発現のインデューサーである検体はレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【００１１】
従って、本発明はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能な異種プロモーターをもつ核酸と機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む複合プロモーターを提供する。これはＰＸＲ結合部位を各々もつ１個以上の核酸を異種プロモーター、好ましくはＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能な異種プロモーターをもつ核酸と機能的に連結した複合プロモーターである。各々ＰＸＲ結合部位を含む２個以上の核酸が存在する場合には、核酸は異種プロモーターとタンデムに連結される。異種プロモーターと機能的に連結されたＰＸＲ結合部位は異種プロモーターをプロモーターからの転写のＰＸＲ誘導に対して応答性にする。
【００１２】
上記プロモーターの別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
上記プロモーターの更に別の態様では、上記複合プロモーターは少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、複合プロモーターは少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記複合プロモーターの特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位をもつ核酸は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、複合プロモーターは配列番号１３を含むＣＭＶプロモーターと機能的に連結した配列番号１８を含む。
【００１４】
本発明は更にＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを提供する。
【００１５】
更に別の側面では、レポーター遺伝子発現カセットはＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結した２個以上のＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含む。
【００１６】
従って、本発明はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結した各々ＰＸＲ結合部位をもつ２個以上のタンデムに配置された核酸を含む第１の核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを提供する。
【００１７】
上記レポーター遺伝子発現カセットのいずれか１種の別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
上記レポーター遺伝子発現カセットの更に別の態様では、第１の核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記レポーター遺伝子発現カセットの特に好ましい１態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様では、レポーター遺伝子発現カセットはクローン１０２−ＳＥＡＰのレポーター遺伝子発現カセットを含む。
【００１９】
上記レポーター遺伝子カセットの特定態様では、レポーターは分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００２０】
本発明は更にＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む細胞を提供する。
【００２１】
別の側面では、前記細胞はＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む第１の核酸と、異種プロモーターと機能的に連結したＰＸＲをコードする第２の核酸を含む。
【００２２】
別の側面では、細胞はＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、異種プロモーターと機能的に連結したＣＡＲをコードする第２の核酸を含む。
【００２３】
従って、本発明はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結したＰＸＲ結合部位をもつ２個以上のタンデムに配置された核酸を含む第１の核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを含む細胞を提供する。
【００２４】
上記細胞のいずれか１種の別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
上記細胞の更に別の態様では、第１の核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記細胞の特に好ましい１態様では、２個以上のＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
上記細胞の特定態様では、細胞は更にＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸を含む。更に別の態様では、細胞は内在ＰＸＲを発現するか又は細胞は内在ＲＸＲを発現する。更に別の態様では、ＰＸＲはヒトＰＸＲであるか又はＣＡＲはヒトＣＡＲである。
【００２７】
更に別の態様では、細胞はＨｅｐＧ２である。更に別の態様では、細胞は肝細胞、特にラット、マウス、及びヒト肝細胞から構成される群から選択される肝細胞である。肝細胞は初代肝細胞が好ましい。
【００２８】
更に別の態様では、レポーターは分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００２９】
本発明の別の側面では、検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸を含む細胞を提供する段階と；検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。別の態様では、異種プロモーターは２個以上のＰＸＲ結合部位の不在下で誘導不能である。
【００３０】
別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む細胞を提供する段階と；検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３１】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、好ましくはＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含む細胞を提供する段階と；検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３２】
上記方法のいずれか１種の別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
上記方法の更に別の態様では、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。上記方法の特に好ましい態様では、核酸の２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
上記方法の特定態様では、細胞は更にＰＸＲをコードする第２の核酸を含む。更に別の態様では、細胞は内在ＰＸＲを発現するか又は細胞は内在ＲＸＲを発現する。更に別の態様では、ＰＸＲはヒトＰＸＲである。
【００３５】
更に別の態様では、細胞はＨｅｐＧ２又は初代肝細胞である。
【００３６】
更に別の態様では、レポーターは分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００３７】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３８】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＣＡＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００３９】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸と、ＣＡＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００４０】
更に別の側面では、本発明は検体がＰＸＲ又はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導するか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸とＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞と、第１の核酸とＣＡＲをコードする第３の核酸を含む第２の初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で各培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、第１の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第２の培養液では増加しないならば、検体はＰＸＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断し、第２の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第１の培養液では増加しないならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００４１】
上記方法の他の態様では、肝細胞はラット、マウス、及びヒト肝細胞から構成される群から選択される。特定態様では、肝細胞はラット肝細胞が好ましい。
【００４２】
上記方法のいずれか１種の更に別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
上記方法の更に他の態様では、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。上記方法の特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
更に別の側面では、本発明は検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法として、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む方法を提供する。
【００４５】
上記方法のいずれか１種の更に別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
上記方法の更に別の態様では、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。上記方法の特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明は更にレポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含む第１の容器を含むキットを提供する。異種プロモーターはＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能であることが好ましい。場合により、ＰＸＲをコードし、異種プロモーターと機能的に連結した第２の核酸を含む第２の容器が提供される。前記キットの別の側面では、第１の容器はＰＸＲ結合部位を含む核酸の不在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸と機能的に連結した異種プロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸を含むレポーター遺伝子発現カセットを含む。
【００４８】
前記キットの別の側面では、キットは更にレポーター遺伝子の発現を測定するための試薬を含む。更に別の側面では、キットは更に核酸を細胞にトランスフェクトするための試薬を含む。更に別の側面では、キットは更に細胞を含む。
【００４９】
上記キットの別の態様では、ＰＸＲ結合部位はｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される。更に別の態様では、ｄＤＲ３は配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、又はｄＤＲ３は配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
上記キットの更に別の態様では、第１の核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｐＥＲ６結合部位を含むか、前記核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３結合部位を含むか、又は前記核酸はｄＤＲ３結合部位３個とｄＥＲ６及びｐＥＲ６結合部位各１個を含む。更に別の態様では、核酸は少なくとも３個のｄＤＲ３部位を含む。上記方法の特に好ましい態様では、２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
キットの特定態様では、レポーターは分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。
【００５２】
上記方法及びキットにおいて、第１の核酸は上記のようなレポーター遺伝子発現カセットであることが好ましい。本明細書に記載する上記方法の特定態様では、第２の核酸は異種プロモーター、好ましくはＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導不能なプロモーターをもつ第２の核酸と機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第１の核酸を含む遺伝子発現カセットであることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明はヘモプロテインのチトクロームＰ−４５０（Ｐ４５０）スーパーファミリーの各種メンバー、特にＣＹＰ３Ａ４アイソフォームの転写活性化（又は発現）を媒介する能力について検体（分子、化合物、薬剤候補等）をスクリーニングするためのアッセイを提供する。前記アッセイはプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）又は構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）を発現し、最小プロモーターと機能的に連結したタンデムアレーに配置されたＣＹＰ３Ａ４プロモーターの３種のエンハンサーエレメントのうちの少なくとも１種の多重コピーを含むＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な新規複合又は合成プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を含む組換え細胞を提供する段階と、検体の存在下で組換え細胞をインキュベートする段階と、レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターからの転写活性のメディエーターである検体はＰＸＲ又はＣＡＲと結合し、ＰＸＲ又はＣＡＲを活性化することによりアッセイでその効果を発揮する。その後、活性化されたＰＸＲ又はＣＡＲはＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な複合プロモーターを介してレポーター遺伝子の発現を誘導する。ＰＸＲ又はＣＡＲの転写活性のメディエーターでない検体はＰＸＲ又はＣＡＲと結合せず、活性化しないか、あるいはＰＸＲ又はＣＡＲと結合するが、ＰＸＲ又はＣＡＲを活性化しない。いずれの場合も、ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な複合プロモーターからの転写は生じない。
【００５４】
本発明の新規複合プロモーターは転写活性化に応答して天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターよりも高い誘導倍率を提供する。例えば、ＣＹＰ３Ａ４転写インデューサーリファンピシンは天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子又は約−７８３９〜−６０００ｂｐのＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域を約−３６２〜５３ｂｐの領域と連結し、更にレポーター遺伝子と機能的に連結した従来技術の欠失ＣＹＰ３Ａ４（ΔＣＹＰ３Ａ４）プロモーター等のその変異体と比較して、本発明の複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子の誘導倍率のほうが高い（図２Ａ又は４；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９）；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら，Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２９：１３２５−１３３１（２００１）；実施例２参照）。本発明の複合プロモーターは天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーター又はΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターよりも感度が高いため、化合物及び薬剤候補をＣＹＰ３Ａ４誘導能についてスクリーニングするためのより高感度のアッセイを提供する。本発明は更にＰＸＲ又はＣＡＲ結合又は活性化に対して応答性の複合プロモーターの作製方法を提供する。
【００５５】
一般に、プロモーターは（１）コアプロモーターと転写単位の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む最小プロモーターと、（２）転写アクチベーターの結合部位から構成される１個以上のエンハンサーエレメントの２個のエレメントから構成される。コアプロモーターは転写の開始を媒介する短いヌクレオチド配列である。一般に、コアプロモーターはＴＡＴＡボックスとＣＡＡＴボックスに関連するＧ−Ｃリッチ領域を含む。これらのエレメントはＲＮＡポリメラーゼＩＩをプロモーターと結合させ、ポリメラーゼがＲＮＡ開始部位を見いだすのを助ける。プロモーターによってはＴＡＴＡボックス又はＣＡＡＴボックスをもたないものもあり、その代わりに転写開始部位を含む開始エレメントを含む。５’ＵＴＲはＲＮＡ転写産物の安定性を強化する役割を果たす。長い５’ＵＴＲは通常、転写又は翻訳レベルで遺伝子発現を調節する調節配列をもつイントロンを含む。エンハンサーエレメントは特定プロモーターから転写されるＲＮＡの量を増加するヌクレオチド配列である。エンハンサーエレメントはコアプロモーターのすぐ上流（近位エンハンサー）の場合と、プロモーターから数千塩基対上流又は下流（遠位エンハンサー）の場合がある。エンハンサーエレメントは応答エレメントと呼ぶ１個以上の短いヌクレオチド配列を含む。応答エレメントはＲＮＡ転写開始複合体の形成を強化する転写因子と結合する。天然プロモーター（又は最小プロモーター）は転写単位の５’末端に由来する単一ヌクレオチドフラグメントから構成される。一般に、天然プロモーターはコアプロモーターと５’ＵＴＲを含み、ヌクレオチドフラグメント長に応じて所定の天然プロモーターは更にそのエンハンサーエレメントの１個以上と、場合により、イントロンを含む場合がある。一般に、複合プロモーターはコアプロモーターと、１個以上のエンハンサーエレメントと、少なくとも２個が異なる起源に由来する５’ＵＴＲから構成されるか、又は遠位エンハンサーエレメントを同一起源の最小プロモーターと組合わせたものである。
【００５６】
ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能な本発明の複合プロモーターはプロモーターからの転写をＰＸＲ又はＣＡＲにより調節又は誘導できるようにＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位から構成される少なくとも２個のエンハンサーエレメントを含む複合エンハンサーと機能的にシス連結した最小又はコアプロモーターを含む。各エンハンサーエレメント（又は結合部位）は複合エンハンサーにおいて一般にタンデムに配置された１個のＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位を含むオリゴマーを含む。各エンハンサーエレメントオリゴマーとその隣接エンハンサーエレメントオリゴマーの関係は頭−尾、頭−頭、又は尾−尾のいずれでもよい（オリゴマーの配置例については図６参照）。所定態様では、エンハンサーエレメントオリゴマーの１個以上はタンデム配置ではなく、複合エンハンサーの他のエンハンサーエレメントオリゴマーから離して配置される。複合エンハンサーのエンハンサーエレメントオリゴマーは最小又はコアプロモーターの上流に配置してもよいし、下流に配置してもよい。複合エンハンサーのエンハンサーエレメントオリゴマーは最小又はコアプロモーターに隣接して配置してもよいし、最小又はコアプロモーターから離して配置してもよい。例えば、複合エンハンサーは最小又はコアプロモーターの遠位末端に配置してもよいし、最小又はコアプロモーターの遠位末端（５’）から約１３ｋｂ上流に配置してもよい。あるいは、複合エンハンサーは最小又はコアプロモーターの近位末端（３’）に配置してもよいし、最小又はコアの近位末端から約１３ｋｂ下流に配置してもよい。例えば、ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能なレポーターはレポーター遺伝子の近位末端（５’末端）に配置された最小又はコアプロモーターと、レポーターの遠位末端（３’）に配置されたエンハンサーエレメントを含むことができる。他の態様では、複合エンハンサーは複合エンハンサーの一部が最小プロモーターの上流に配置され、複合エンハンサーの別の部分が別の位置（例えば、最小プロモーターの下流）に配置されるように、最小プロモーターとその周囲の各位置に配置されたエンハンサーエレメントオリゴマーから構成される。本明細書で使用する機能的に連結とは最小プロモーターが複合エンハンサーの（部分的又は完全な）制御下にあることを意味する。エンハンサーエレメント又は複合エンハンサーが最小プロモーターにすぐ隣接する必要はない。最小又はコアプロモーターはＣＹＰ３Ａ４に由来しないことが好ましく、エンハンサーエレメントの不在下でＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導されないことが好ましい。
【００５７】
天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターはＣＹＰ３Ａ４プロモーターのＰＸＲ又はＣＡＲ誘導を可能にする３個のエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位をもつ。これらのエンハンサーエレメントはヌクレオチド−１７６〜−１４６に由来するＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域に配置されたエバーテッドリピートから構成される近位エンハンサーエレメントｐＥＲ６（ｐｒＰＸＲＥ又はＥＲ６）と、ヌクレオチド−７８３９〜−７２０８に由来するＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域（ＸＲＥＭ領域）に配置された夫々第１及び第２の遠位エンハンサーエレメントｄＤＲ３（ダイレクトリピート又はｄＮＲ１又はＤＲ３）及びｄＥＲ６（エバーテッドリピート又はｄＮＲ２又はＥＲ６）である。完全なＣＹＰ３Ａ４プロモーターは約７．８ｋｂである。これに対して、ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターは約２２５４ｂｐである。図２ＡはΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターにおけるエンハンサーエレメントの位置を示す。
【００５８】
近位エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位ｐＥＲ６はそのエバーテッドリピート５’−ＡＧＫＴＣＡ−３’に由来する塩基間隔６のヘキサマー５’−ＴＧＡＭＣＴ−３’から構成され、前記式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴである。従って、ｐＥＲ６はフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＴ−Ｎ６−ＡＧＫＴＣＡ−３’（配列番号１）（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、Ｎは任意ヌクレオチドである）とそのと相補鎖を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのｐＥＲ６エンハンサーエレメントはフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２）をもつヌクレオチド−１７６〜−１４６に含まれるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域に由来する。エバーテッドリピートを下線で示す。
【００５９】
第１の遠位エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位ｄＤＲ３はヘキサマー５’−ＴＧＡＭＣＹ−３’（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＹはＴ又はＣである）の１対のダイレクトリピートから構成され、各ヘキサマーは塩基間隔３である。従って、ｄＤＲ３はフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＹ−Ｎ３−ＴＧＡＭＣＹ−３’（配列番号４）（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＹはＴ又はＣである）とそのと相補鎖を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのｄＤＲ３エンハンサーエレメントはフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴ−３’（配列番号５）をもつヌクレオチド−７７３６〜−７７１６に含まれる。ダイレクトリピートを下線で示す。
【００６０】
第２の遠位エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位ｄＥＲ６はそのエバーテッドリピート５’−ＫＲＴＴＣＡ−３’（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＹはＴ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、ＲはＧ又はＡである）に由来する塩基間隔６のヘキサマー５’−ＴＧＡＡＭＹ−３’から構成される。従って、ｄＥＲ６はフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＡＭＹ−Ｎ６−ＫＲＴＴＣＡ−３’（配列番号７）（式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、ＲはＧ又はＡであり、Ｎは任意ヌクレオチドである）とそのと相補鎖を含む。ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのｄＥＲ６エンハンサーエレメントはフォワード鎖ヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号８）をもつヌクレオチド−７６９３〜−７６６８に含まれるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの領域に由来する。エバーテッドリピートを下線で示す。
【００６１】
本発明の複合プロモーターでは、ｐＥＲ６はヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＴ−Ｎ６−ＡＧＫＴＣＡ−３’（配列番号１）を含むオリゴマーを含み、ｄＤＲ３はヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＭＣＹ−Ｎ３−ＴＧＡＭＣＹ−３’（配列番号４）を含むオリゴマーを含み、ｄＥＲ６はヌクレオチド配列５’−ＴＧＡＡＭＹ−Ｎ６−ＫＲＴＴＣＡ−３’（配列番号７）を含むオリゴマーを含み、前記式中、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又はＴであり、ＲはＧ又はＡであり、ＹはＴ又はＣであり、Ｎは任意ヌクレオチドである。本発明の複合プロモーターに含まれるｐＥＲ６エンハンサーエレメントの例としては５’−ＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡ−３’（配列番号１０）と５’−ＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２）が挙げられる。ｄＤＲエンハンサーエレメントの例としては５’−ＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１１）と５’−ＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴ−３’（配列番号５）が挙げられる。ｄＥＲ６エンハンサーエレメントの例としては５’−ＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号１２）と５’−ＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号８）が挙げられる。
【００６２】
本発明の複合プロモーターはタンデムに配置された２個以上のオリゴマーを含み、各オリゴマーは異種プロモーター、好ましくは異種最小プロモーターと機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位を含む。従って、複合プロモーターは異種プロモーターと機能的に連結した複合エンハンサーを含む。好ましい側面では、複合エンハンサーは各種配置、向き、及びコピー数で配置されたｄＤＲ３及びｄＥＲ６エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位各１コピー以上と、場合により、ｐＥＲ６エンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位１コピー以上を含むか、あるいはｐＥＲ６及びｄＥＲ６エンハンサーエレメント各１コピー以上と、場合により、ｄＤＲ３エンハンサーエレメント１コピー以上を含む。複合エンハンサーは少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｄＤＲ３及びｄＥＲ６各１個）を含むことが好ましい。特定側面では、複合エンハンサーは少なくとも３個のｄＤＲ３エンハンサーエレメントを含むことが好ましい。例として、図６は本発明の複合プロモーターの数種におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターと機能的に連結したエンハンサーエレメントの数種の配置を示す。図６に示すように、本発明の複合エンハンサーは各ＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位が別のＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位と隣接するタンデム配置でＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位を含む。更に図６に示すように、複合エンハンサーにおけるＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位の向きは頭−頭、尾−頭、又は尾−尾の任意組合わせでを含む。例えば、実施例１のクローン２６−ＳＥＡＰの複合プロモーターはｐＥＲ６を２コピーとｄＥＲ６を１コピーから構成される複合エンハンサーを含み、全３個のエンハンサーエレメントは天然の向きでＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結されている。実施例１のクローン１０２−ＳＥＡＰはｄＥＲ６を１コピーとｄＤＲ３を４コピーから構成される複合エンハンサーを含み、ｄＤＲ３エレメント１コピーのみが天然の向きでＣＭＶプロモーターと機能的に連結されている。
【００６３】
図６に示す複合プロモーターのうちの数種は従来技術ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの応答に比較してＣＹＰ３Ａ４アクチベーターリファンピシンに応答して特に強いシグナルを発生することが認められた。図９に示すように、クローン１０２−ＳＥＡＰはバックグラウンドの２３倍のシグナルを発生し、クローン３３−ＳＥＡＰはバックグラウンドの１４倍のシグナルを発生し、クローン６１−ＳＥＡＰはバックグラウンドの１１倍のシグナルを発生した。これに対して、従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターはバックグラウンドの６倍のシグナルしか発生しなかった。上記複合プロモーターの予想外のシグナル強度の増加により、従来技術アッセイよりも高感度で堅牢なＣＹＰ３Ａ４アクチベーターの同定用アッセイを開発することが可能になった。クローン１０２−ＳＥＡＰのシグナル強度はバックグラウンドの２３倍であったため、ＰＸＲのアクチベーターである検体からＣＡＲのアクチベーターである検体を同定するために使用可能なアッセイを開発することが可能になった。
【００６４】
下記実施例に示すように、複合プロモーターはサイトメガロウイルス極初期１（ＣＭＶ）最小プロモーターと機能的に連結したｐＥＲ６及びｄＥＲ６エンハンサーエレメント１コピー以上と好ましくは更にｄＤＲ３エンハンサーエレメント１コピー以上を任意順序で含む複合エンハンサーを含むことができる。ＣＭＶ最小プロモーターのヌクレオチド配列は５’−ＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ ＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧ ＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧ ＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴ ＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣ ＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣ ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣ ＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴ ＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴ ＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡ ＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣ ＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴ−３’（配列番号１３）を含む。本発明はＣＭＶ最小プロモーターに限定されず、代替最小プロモーターを含むこともできる。他の最小プロモーター又はその最小部分を得ることができるプロモーターの例としては限定されないが、β−アクチン（β−Ａｃｔ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫グロブリンβ（Ｂ２９）、細菌ＬＰＳの単球受容体（ＣＤ１４）、ロイコシアリン、シアロフォリン（ＣＤ４３）、白血球共通抗原（ＬＣＡ）（ＣＤ４５）、マクロシアリンホモログ（ＣＤ６８）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ２）、シクロオキシゲナーゼ２アイソフォーム（プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２）（ＣＯＸ−２）、ｄｅｓｍａｎ、延長因子１（ＥＦ１）、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ−１）、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、真核生物開始因子４Ａ１（ｅＩＦ４Ａ１）、エラスターゼ−１、エンドグリン（ＥＮＧ）、フェリチン重鎖（ＦｅｒＨ）、フェリチン軽鎖（ＦｅｒＬ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＶＥＧＦ−受容体１（Ｆｌｔ−Ｉ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、グリア線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、グルコース調節蛋白質７８（ＧＲＰ７８）、グルコース調節蛋白質９４（ＧＲＰ９４）、熱ショック蛋白質７０（ＨＳＰ７０）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖＴＫ）、細胞間接着分子２（ＣＤ１０２）（ＩＣＡＭ−２）、インターフェロンβ（ＩＦＮＢ）、β−キネシン（β−Ｋｉｎ）、Ｌ−プラスチン（リンパ球細胞質蛋白質１）（ＬＰ）、ミオグロビン（Ｍｂ）、ムチン様糖蛋白質（乳癌関連抗原、ＤＦ３）（ＭＵＣ１）、オステオカルシン−２（ＯＧ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ−１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、界面活性剤蛋白質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、シナプシンＩ（ＳＹＮ１）、チロシナーゼ関連蛋白質（ＴＲＰ１）、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）、及びユビキチンＢ（Ｕｂｉ Ｂ）の天然プロモーターが挙げられる。
【００６５】
最小プロモーターと機能的に連結したエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位を含む２個以上のオリゴマーを含む複合エンハンサーを含む複合プロモーターを更にアッセイ可能な産物をコードするレポーター遺伝子と機能的に連結し、レポーター遺伝子発現カセットとする。複合エンハンサーは少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｐＥＲ６及びｄＥＲ６各１個）を含むことが好ましく、３個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｐｒＥＲ６、ｄＥＲ６、及びｄＤＲ３各１個）を含むことがより好ましい。レポーター遺伝子発現カセットはレポーター遺伝子の下流にポリアデニル化部位と転写終結部位をもつ３’ＵＴＲを含むことが更に好ましい。特に好ましい１態様では、レポーター遺伝子発現カセットのプロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰ又はＣＭＶ最小プロモーター等の異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列の複合プロモーターを含む。
【００６６】
一般に、レポーター遺伝子発現カセットはプラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、バクテリオファージ、トランスポゾン、人工染色体、又は真核細胞にトランスフェクトすることができる他のベクター等のベクターの成分として含まれる。一般に、ベクターがプラスミドの場合には、ベクターはベクターを真核細胞で増殖できるようにＳＶ４０複製起点等の複製起点を含むことが好ましい。ベクターはベクターを含む組換え細胞を選択又は同定するための手段を含むことが更に好ましい。例えば、ベクターはベクターを含むトランスフェクトされた細胞にネオマイシン又はカナマイシン耐性を付与する遺伝子あるいはセルソーター等を使用してトランスフェクトされた細胞をトランスフェクトされていない細胞から分離することができるグリーン蛍光蛋白質又はルシフェラーゼ等の遺伝子を含むことができる。１例として、ｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶベクターはＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結した分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を含む。実施例に示すように、このベクターを使用してＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結したＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位のタンデムアレーを各々含む数種のベクターを構築し、ＳＥＡＰレポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターを得た。上記ベクターのうちの数種を使用し、検体がＰＸＲ又はＣＡＲ活性化を介してＣＹＰ３Ａ４発現を誘導できるか否かを調べた。
【００６７】
本発明は更に上記核酸分子のいずれか１種を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトした組換え宿主細胞、特に少なくともレポーター遺伝子発現カセットレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトした組換え宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞はクローン１０２−ＳＥＡＰ又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列の複合プロモーターをレポーター遺伝子と機能的に連結したレポーター遺伝子発現カセットで形質転換又はトランスフェクトすることができる。特定態様では、ＳＥＡＰをコードするレポーター遺伝子に複合プロモーターを機能的に連結することが好ましい。特定態様では、ＰＸＲ又はＣＡＲ又は両者をコードする遺伝子発現カセットを含むベクターで宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする。組換え宿主細胞としては大腸菌等の細菌、酵母等の真菌細胞、植物細胞、限定されないが、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、ヒト、又は齧歯類起源の細胞株等の哺乳動物細胞、及び限定されないが、ショウジョウバエやカイコ由来細胞株等の昆虫細胞が挙げられる。例えば、昆虫発現システムの１例はバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とタンデムに配置されたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。
【００６８】
組換え細胞は哺乳動物細胞が好ましく、ラット、マウス、霊長類、又はヒト細胞が好ましい。組換え細胞は初代細胞又は不死細胞株のいずれから作製してもよい。特定態様では、組換え細胞はＲＸＲを内在的に産生する細胞に由来することが好ましい。下記実施例に開示するように、ヒト肝細胞癌に由来する不死細胞株であるＨｅｐＧ２細胞、又は初代ラットもしくはヒト肝細胞にレポーター遺伝子発現カセットをトランスフェクトし、本発明の方法で使用する新規組換え細胞を作製した。ＨｅｐＧ２細胞は特に好ましい表現型である内在ＲＸＲを一般に高レベルで産生する。ＨｅｐＧ２細胞は米国特許第４，３９３，１３３号（Ｋｎｏｗｌｅｓ）に開示されている。ＨｅｐＧ２細胞ソースとしてはＩｓｔｉｔｕｔｏ Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（アクセション番号ＩＺＳＢＳ ＢＳ ＴＣＬ７９；ＩＺＳＢＳ，Ｖｉａ Ａ．Ｂｉａｎｃｈｉ ７，Ｂｒｅｓｃｉａ，２５１００，イタリー）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アクセション番号ＨＢ８０６５及びＣＲＬ−１１９９７；ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；２０１１０）；及びＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（アクセション番号ＡＣＣ １８０；ＤＳＭＺ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｄ−３８１２４，ドイツ）が挙げられる。他の細胞株としては限定されないが、Ｈ−４ＩＩＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５４８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、Ｈｅｐ３ｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６４）、ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、及び２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）が挙げられる。
【００６９】
特に、本発明はレポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターとするためにエンハンサーエレメント又はＰＸＲ結合部位の不在下でＰＸＲにより誘導不能な異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位を含む複合エンハンサーを含むレポーター遺伝子発現カセットを含む組換え細胞を提供する。異種プロモーターはＣＭＶ最小プロモーター等の最小プロモーターが好ましい。複合エンハンサーは少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｄＤＲ３及びｄＥＲ６各１個）を含むことが好ましい。特定側面では、複合エンハンサーは少なくとも３個のｄＤＲ３エンハンサーエレメントを含むことが好ましい（例えば、図６に示す複合エンハンサーは各々ｄＤＲ３少なくとも３コピーを含む）。特に好ましい態様では、複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰ又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列の複合プロモーターを含む。ＰＸＲ又はＣＡＲにより誘導可能なレポーターを含むレポーター遺伝子発現カセットは組換え細胞に一過性にトランスフェクトするか又は組換え細胞のゲノムに安定的に組込むことができる。
【００７０】
組換え細胞でＰＸＲ又はＣＡＲを内在的又は異所的に発現させることができる。組換え細胞は更にＰＸＲ又はＣＡＲの異所発現用構成的プロモーター又は誘導的プロモーターと機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸を含むことが好ましい。ヒトＰＸＲのヌクレオチド配列はＷｉｌｌｓｏｎ ａｎｄ Ｋｌｉｅｗｅｒら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２（１９９８）、ＷＯ９９３５２４６（及びＵＳ ６，７５６，４９１）（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）、ＷＯ９９４８９１５（Ｋｌｉｅｗｅｒら）、及びＷＯ９９１９３５４（Ｂｅｒｋｅｎｓｔａｍ ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ）に開示されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０６１０５６である。マウス、ラット、及びウサギに由来するＰＸＲがクローニングされ、配列決定されている（Ｋｌｉｅｗｅｅｒら，Ｃｅｌｌ ９２：７３−８２（１９９８）；Ｊｏｎｅｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：２７−３９（２０００）；Ｚｈａｎｇ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６８：１４−２２（１９９９））。他の非ヒトＰＸＲの例はＷＯ０２０９４８６５（Ｋｌｉｅｗｅｒら）に開示されている。ヒトＣＡＲのヌクレオチド配列はＷＯ９３１７０４１（Ｍｏｏｒｅ（並びにＵＳ ５，６８６，５７４、５，７１０，０１７、及び５，７５６，４４８）ａｎｄ Ｂａｅｓ）及びＵＳ ６，５７９，６８６（Ｃｏｌｌｉｎｓら）に開示されている。ＰＸＲ又はＣＡＲと機能的に連結されたプロモーターは構成的プロモーターが好ましく、天然プロモーターでも複合プロモーターでもよい。第２の核酸を組換え細胞に一過性にトランスフェクトするか又は組換え細胞のゲノムに安定的に組込むことができる。組換え細胞はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）も発現することが好ましい。ＲＸＲの発現は内在性でもよいし、組換え細胞に一過性にトランスフェクトするか又は組換え細胞のゲノムに安定的に組込まれる構成的又は誘導的プロモーターと機能的に連結したＲＸＲをコードする第３の核酸を提供することにより異所性でもよい。ＲＸＲ発現は内在性であることが好ましい、第１、第２、及び場合により第３の核酸を細胞に安定的に組込むと、予めトランスフェクション段階を実施する必要がなくなるため、ＣＹＰ３Ａ４の発現に影響を与える検体の同定方法を簡略化する細胞株が得られる。
【００７１】
一過性又は安定的にトランスフェクトされた真核細胞を作製する方法は当分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））に記載されている。
【００７２】
例えば、遺伝子発現レポーターカセットとＰＸＲ又はＣＡＲをコードする核酸を含む一過性にトランスフェクトされた細胞を作製するためには、細胞を組織培養プレートにプレーティングし、レポーター遺伝子発現カセットを含む第１の核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸をトランスフェクトする。現今では、ＰＸＲ又はＣＡＲはヒト又は霊長類に由来するものが好ましい。核酸は上記ベクターのいずれか１種の成分、例えば、プラスミドの成分として提供することができる。遺伝子発現レポーターカセットをコードする核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする核酸は別々のベクターで提供することもできるし、同一ベクターの成分として提供することもできる。所定側面では、トランスフェクションはＲＸＲをコードする第３の核酸を含む。第３の核酸は第１の核酸と第２の核酸を含む同一ベクターの成分とすることができる。核酸が細胞に取込まれるために十分な時間、細胞をインキュベートした後に、トランスフェクション培地を捨て、ＣＹＰ３Ａ４活性を試験しようとする検体を含む培地に交換する。トランスフェクトした核酸が発現するために十分な時間、通常は約４８時間後にレポーター遺伝子の発現をアッセイする。
【００７３】
例えば、安定的にトランスフェクトされた細胞を作製するためには、細胞を組織培養プレートにプレーティングし、レポーター遺伝子発現カセットを含む第１の核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２の核酸をトランスフェクトする。現今では、ＰＸＲ又はＣＡＲはヒト又は霊長類に由来するものが好ましい。核酸は核酸を含む細胞を選択するための手段をコードする遺伝子を更に含む。組換え細胞を選択するために有用な遺伝子としては限定されないが、Ｇ４１８又はカナマイシン耐性を付与するネオマイシン遺伝子、ピューロマイシン耐性を付与するｐａｃ遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性を付与するハイグロマイシン耐性遺伝子、及びミコフェノール酸耐性を付与するキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。核酸は上記ベクターのいずれか１種の成分、例えば、プラスミドの成分として提供することができる。遺伝子発現レポーターカセットをコードする核酸と、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする核酸は別々のベクターで提供することもできるし、同一ベクターの成分として提供することもできる。所定側面では、トランスフェクションはＲＸＲをコードする第３の核酸を含む。第３の核酸は第１の核酸と第２の核酸を含む同一ベクターの成分とすることができる。核酸が細胞に取込まれるために十分な時間、細胞をインキュベートした後に、トランスフェクション培地を捨て、トランスフェクトされていない細胞からトランスフェクトされた細胞を選択するための手段を加えた培地に交換する。選択手段の例としては限定されないが、Ｇ４１８、カナマイシン、ハイグロマイシンＢ、ミコフェノール酸、及びピューロマイシンが挙げられる。Ｇ１４８を使用して組換え細胞を選択するためには、上記ベクターは更にネオマイシンをコードする遺伝子を含む。選択手段を含む培地で細胞を数回継代後に、トランスフェクトされてない細胞は死滅し、組換え細胞は残存する。組換え細胞を培養すると、検体がＣＹＰ３Ａ４発現のアクチベーターであるか否かを判定するために下記のように使用することができる組換え細胞のストックが得られる。
【００７４】
一般に、ＣＹＰ３Ａ４発現のアクチベーターである検体を同定するための本発明の方法は以下の段階を含む。本明細書に開示するように作製され、本明細書に開示するような複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む核酸を含む組換え細胞を提供する。好ましい１態様では、複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーター又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列を含む複合プロモーターを含む。遺伝子発現カセットは細胞で自律複製することができるベクター上に提供することができる。例えば、ベクターは真核細胞で機能的な複製起点をもつプラスミドとすることができる。他の態様では、遺伝子発現カセットは細胞のゲノムに安定的に組込まれる。好ましい側面では、組換え細胞は更にプロモーターと機能的に連結したＰＸＲ又はＣＡＲ、好ましくはヒトＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む第２の核酸を含む。ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットは細胞で自律複製することができるベクター上に提供することができる。例えば、ベクターは真核細胞で機能的な複製起点（例えばＳＶ４０複製起点）をもつプラスミドとすることができる。他の態様では、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットは細胞のゲノムに安定的に組込まれる。
【００７５】
ＣＹＰ３Ａ４の発現誘導能を試験する検体を加えた培地に組換え細胞を加え、公知ＣＹＰ３Ａ４インデューサーの存在下で組換え細胞をインキュベートする陽性対照を基準として細胞が検出可能なレポーター遺伝子産物を産生するために十分な時間、組織培養皿又は組織培養プレートのウェルで増殖させる。一過性にトランスフェクトされた細胞の場合には、４８時間で通常は十分である。その後、レポーター遺伝子産物の生産量又は基質に対するレポーター遺伝子の活性を測定することによりレポーター遺伝子の発現を判定する。
【００７６】
細胞により分泌されるか又は細胞の外膜に結合したレポーター遺伝子産物の場合には、培地を取出し、レポーター遺伝子産物を分析するか、又はレポーター遺伝子産物の基質を添加し、産物に対するレポーター遺伝子の活性を測定する。ＳＥＡＰは標識基質に対するその活性を測定することによりその発現を判定する分泌レポーター遺伝子産物の１例である。胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）は細胞外膜に結合したレポーター遺伝子産物の１例である。分泌されず、外膜に結合しないレポーター遺伝子の場合には、組織培養プレートから細胞を回収し、細胞を溶解させ、レポーター遺伝子産物生産量を測定するか又は基質に対するレポーター遺伝子産物の活性を測定することにより発現を判定することができる。あるいは、細胞により取込まれるレポーター遺伝子産物の基質を組換え細胞に添加し、細胞により取込まれた基質に対するレポーター遺伝子の活性を測定する。１例は米国特許第６，４７２，２０５号、６，２９１，１６２号、５，９５５，６０４号、及び５，７４１，６５７号、並びにＷＯ９６３０５４０（いずれもＴｓｉｅｎら）に開示されているβ−ラクタマーゼレポーターシステムと基質である。
【００７７】
現今ではレポーター遺伝子はＳＥＡＰ遺伝子が好ましいが、本発明の他の態様では、レポーター遺伝子はグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｃｏｂＡ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β−グルクロニターゼ（Ｇｌｕｃ）遺伝子、β−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ルシフェラーゼ、ＰＬＡＰ遺伝子等でもよい。
【００７８】
分析されている細胞株の大半では、ＣＡＲは構成的に活性化されると思われ、肝細胞株等の多くの細胞ではＣＹＰ３Ａ４の活性化におけるＣＡＲの関与をＰＸＲの関与から区別することができないので、ＣＡＲを介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を同定するための簡単な細胞アッセイは現今では当分野で入手できないと考えられている。クローン１０２−ＳＥＡＰとＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットをラット初代培養肝細胞にコトランスフェクトすると、ＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体からＰＸＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を区別できることを本発明者らは発見した。例えば、図１４に示し、実施例６に記載するように、ラット初代培養肝細胞にレポーター遺伝子発現カセットとしてクローン１０２−ＳＥＡＰをトランスフェクトするか、又はヒトＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットをコトランスフェクトした。クローン１０２−ＳＥＡＰをラット初代肝細胞に単独トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞をＣＡＲのインデューサーであることが分かっている化合物で処理すると、レポーター遺伝子の有意誘導は認められなかった。クローン１０２−ＳＥＡＰをラット初代肝細胞にヒトＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットとコトランスフェクトすると、多少の構成的ＣＡＲ活性化が認められた。他方、ＣＡＲを介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導することが分かっている化合物はコトランスフェクトしたヒトＣＡＲを介してレポーター遺伝子の有意発現を誘導することができた（図１４）。クローン１０２−ＳＥＡＰをラット初代肝細胞にヒトＰＸＲをコードする遺伝子発現カセットとコトランスフェクトすると、この場合も多少の構成的ＰＸＲ活性化が認められた。他方、ＰＸＲを介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導することが分かっている化合物はレポーター遺伝子の有意発現を誘導することができた（図１４）。以上の結果によると、レポーター遺伝子の発現は化合物とコトランスフェクトしたヒトＰＸＲ又はＣＡＲの相互作用のみを介して誘導され、相互作用は受容体に特異的であることが分かった。
【００７９】
図９に示すように、クローン１０２−ＳＥＡＰにおけるレポーター遺伝子の発現誘導はバックグラウンドの約２３倍であった。プロモーターの２３倍の誘導能は初代肝細胞におけるＰＸＲ及びＣＡＲ発現を検出するのに重要な因子であった。クローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターに比較して同等以上の誘導能をもつ他の配置のＰＸＲ結合部位を含む複合プロモーターも初代肝細胞を使用する上記アッセイで使用することができた。従って、本発明は更にＣＡＲとの相互作用のみによりＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体と、ＰＸＲとの相互作用のみによりＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体と、ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用によりＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体の同定方法を提供する。
【００８０】
ＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を同定するためには，本明細書に開示するようなレポーター遺伝子発現カセット、好ましくはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーター又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列を含む複合プロモーターとレポーター遺伝子を機能的に連結したレポーター遺伝子発現カセットと、ＣＡＲ、好ましくはヒトＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットを初代培養肝細胞、好ましくはラット肝細胞にコトランスフェクトし、組換え細胞培養液を作製する。細胞にバッチトランスフェクトし、組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルにプレーティングするか、あるいは組織培養皿又はウェルの表面に既に結合している場合にはトランスフェクトする。いずれの場合も、レポーター遺伝子とＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットの取込みに十分な時間、組換え細胞を増殖培地でインキュベートした後に被験検体を加えた培地で組換え細胞をインキュベートする。
【００８１】
ＣＡＲによるＣＹＰ３Ａ４活性の公知インデューサーの存在下で組換え細胞をインキュベートする陽性対照で判定できるようなＣＡＲの活性化によるレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。検体を含まず、検体のビヒクルを含む陰性対照を加えることが望ましい。ＳＥＡＰをコードするレポーター遺伝子の場合には、培地のアリコート中でＳＥＡＰの活性を測定することにより発現を判定することができる。好ましい１態様では、レポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰを含む複合プロモーターである。
【００８２】
ＰＸＲを介してＣＹＰ３Ａ４を活性化する検体を同定するためには、ＰＸＲをコードするが、ＣＡＲをコードしない遺伝子発現カセットを使用して上記コトランスフェクションを実施する。ＰＸＲはヒトＰＸＲであることが好ましい。陽性対照はＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ４の公知インデューサーの存在下で組換え細胞のアリコートをインキュベートする。
【００８３】
ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用のみを介してＣＹＰ３Ａ４を活性化するかあるいはＰＸＲ又はＣＡＲを介してＣＹＰ３Ａ４を活性化する検体を同定するためには、上記コトランスフェクションの各々からの組換え細胞培養液を提供する。コトランスフェクションの各々からの組換え細胞と共に同一検体をインキュベートした後にレポーター遺伝子の発現を検出する。ＰＸＲとの相互作用のみを介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体はＰＸＲをコードする遺伝子発現カセットを含む組換え細胞培養液中でしかレポーター遺伝子を発現しない。ＣＡＲとの相互作用のみを介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体はＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットを含む組換え細胞培養液中でしかレポーター遺伝子を発現しない。ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体は両者培養液中でレポーター遺伝子を発現する。
【００８４】
複数の検体を一度にスクリーニングするように上記のいずれか１種を応用することができる。例えば、多重培養に十分な量の細胞にレポーター遺伝子発現カセットをトランスフェクトする。トランスフェクションのアリコートを組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルに別々にプレーティングし、組換え細胞が皿又はウェルの表面に接着してレポーター遺伝子発現カセットを取込むために十分な時間インキュベートする。次に、プレーティングした組換え細胞の各アリコートを、被験検体を加えた培地でインキュベートする。陽性対照と陰性対照を加えることが好ましい。対照で判定できるようなＰＸＲ又はＣＡＲの活性化によるレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。
【００８５】
レポーター遺伝子発現カセットとしてクローン１０２−ＳＥＡＰを単独でトランスフェクトし、ＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導することが分かっている化合物で処理したヒト初代培養肝細胞は前記化合物に対して応答性であることを本発明者らは更に発見した（実施例７及び図１５参照）。この結果、本明細書に開示するような複合プロモーター、好ましくはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターと比較して同等以上の誘導能をもつ複合プロモーターを含むレポーター遺伝子カセットをトランスフェクトしたヒト肝細胞はＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体を同定するための簡単なスクリーニングアッセイを提供することが示唆された。
【００８６】
従って、本発明は更にＰＸＲ又はＣＡＲとの相互作用を介してＣＹＰ３Ａ４発現を活性化する検体の同定方法として、本明細書に開示するようなレポーター遺伝子発現カセット、好ましくはクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーター又は異種プロモーターと機能的に連結した配列番号１８のヌクレオチド配列を含む複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を初代培養肝細胞、好ましくはヒト肝細胞にトランスフェクトし、組換え細胞培養液を作製する段階を含む方法を提供する。細胞にバッチトランスフェクトし、組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルにプレーティングするか、あるいは組織培養皿又はウェルの表面に既に結合している場合にはトランスフェクトする。いずれの場合も、レポーター遺伝子発現カセットの取込みに十分な時間、組換え細胞を増殖培地でインキュベートした後に、被験検体を加えた培地で組換え細胞をインキュベートする。ＰＸＲ又はＣＡＲを介するＣＹＰ３Ａ４活性の公知インデューサーの存在下で組換え細胞をインキュベートする陽性対照で判定できるようなＰＸＲ又はＣＡＲの相互作用を介するレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。検体を含まず、検体のビヒクルを含む陰性対照を加えることが望ましい。ＳＥＡＰをコードするレポーター遺伝子の場合には、培地のアリコート中でＳＥＡＰの活性を測定することにより発現を判定することができる。好ましい１態様では、レポーター遺伝子と機能的に連結した複合プロモーターはクローン１０２−ＳＥＡＰを含む複合プロモーターである。
【００８７】
複数の検体を一度にスクリーニングするように上記方法を応用することができる。例えば、多重培養に十分な量の細胞にレポーター遺伝子発現カセットをトランスフェクトする。トランスフェクションのアリコートを組織培養皿又は多重ウェル組織培養皿のウェルに別々にプレーティングし、細胞が皿又はウェルの表面に接着してレポーター遺伝子発現カセットを取込むために十分な時間インキュベートする。次に、プレーティングした組換え細胞の各アリコートを、被験検体を加えた培地でインキュベートする。陽性対照としてＰＸＲ又はＣＡＲを介するＣＹＰ３Ａ４活性の公知インデューサーの存在下で少なくとも１個のアリコートをインキュベートすることが好ましい。検体のビヒクルから構成される陰性対照も加えることも望ましい。対照で判定できるようなＰＸＲ又はＣＡＲの活性化によるレポーター遺伝子の発現に十分な時間、組換え細胞をインキュベートした後、レポーター遺伝子の発現を判定する。
【００８８】
本発明の方法はＣＹＰ３Ａ４発現誘導を媒介することができる検体を同定するための検体の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に特に有用である。多くの場合、有用な特性をもつ化学物質は所定の望ましい特性又は活性をもつ化合物（「リード化合物」と言う）を同定し、リード化合物の変異体を作製し、変異体化合物の特性と活性を評価することにより作製される。最新の傾向は薬剤発見の全側面についてタイムスケールを短縮する方向にある。高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法は多数を迅速且つ効率的に試験することができるため、従来のリード化合物同定法に取って代わりつつある。
【００８９】
１側面では、高スループットスクリーニング法は、多数の薬剤候補を含むライブラリーを提供する段階を含む。次にこのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」を１回以上のアッセイでスクリーニングし、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバーの特定化学種又はサブクラスを同定する。こうして同定された化合物を従来の「リード化合物」として使用することができる。
【００９０】
コンビナトリアルライブラリーの作製装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ，３９０ ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ参照）。溶液相化学用の多数の周知ロボットシステムも開発されている。これらのシステムとしては武田薬品工業（大阪市）により開発された自動合成装置等の自動ワークステーションや、化学者により実施される手動合成操作を模倣したロボットアームを使用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ ＩＩ，Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；Ｏｒｃａ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。上記装置のいずれも本発明で使用するのに適している。（改造する場合には）本明細書に記載するように動作できるようにこれらの装置に加える改造の種類と実施は当業者に自明である。更に、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，ロシア；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ロシア；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ参照）。
【００９１】
本明細書に記載する任意アッセイを高スループットスクリーニングに利用することができる。上述したように、本明細書に開示する方法により検体をスクリーニングすることが好ましい。このようなスクリーニングの高スループットシステムは当業者に周知である。即ち、例えば、米国特許第５，５５９，４１０号は蛋白質結合の高スループットスクリーニング法を開示しており、米国特許第５，５７６，２２０号及び５，５４１，０６１号はリガンド／抗体結合の高スループットスクリーニング法を開示している。
【００９２】
更に、高スループットシステムは市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ参照）。これらのシステムは一般に全サンプル及び試薬ピペッティング、液体分配、時限インキュベーション、及びアッセイに適した検出器でのマイクロプレートの最終読取りを含む全工程を自動化する。これらのコンフィギュラブルシステムにより高スループットで迅速な始動と高度なフレキシビリティー及びカスタマイズが可能になる。このようなシステムの製造業者は詳細なプロトコールを提供している。即ち、例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．は遺伝子転写、リガンド結合等の変化を検出するためのスクリーニングシステムについて記載した技術報告を提供している。
【００９３】
本発明は更に検体がＣＹＰ３Ａ４のインデューサーであるか否かを判定するためのキットを提供し、前記キットは複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子を含む核酸を含む容器を含む。レポーター遺伝子はＳＥＡＰをコードすることが好ましい。複合プロモーターは最小プロモーターと機能的に連結した少なくとも２個の異なるエンハンサーエレメント又はＰＸＲ／ＣＡＲ結合部位（例えば、少なくともｄＤＲ３及びｄＥＲ６各１個）を含む複合エンハンサーエレメントを含むことが更に好ましい。更に別の態様では、最小プロモーターはＣＭＶ最小プロモーターであることが好ましい。キットの更に別の態様では、キットは更にＰＸＲ又はＣＡＲ又は両者、好ましくはヒトＰＸＲ又はＣＡＲをコードする遺伝子を含む第２の核酸を含む容器を含む。キットは更に細胞にトランスフェクトするための試薬を含む１個以上の付加容器を含む。更に付加又は代替態様として、キットはレポーター遺伝子を検出するための試薬又はレポーター遺伝子の活性を測定するための試薬又は両者を含む１個以上の容器を含むことができる。
【００９４】
以下の実施例は本発明を更に理解し易くすることを目的とする。
【実施例１】
【００９５】
従来技術よりも強力なＰＸＲ応答性プロモーターを構築できるか否かを調べるために、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの応答性シス作用性ヌクレオチドエレメントのヌクレオチド配列を短いオリゴマーに化学的に合成した後、複合プロモーターにランダムに組立て、複数の複合プロモーター構築物から構成される組換えライブラリーを作製した後、転写活性についてスクリーニングした。ストラテジーを図２Ｂに示す。天然に存在する筋組織由来プロモーターよりも強力な筋特異的複合プロモーターを作製するために、同様のストラテジーがＬｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４１−２４５（１９９９）により使用されている。
【００９６】
核酸操作はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））に記載の方法等の標準分子生物学法に従って実施した。プラスミド精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って使用してＬＢブロスで一晩培養した培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９７】
ヒトＰＸＲと結合できることからｐＥＲ６、ｄＤＲ３、及びｄＥＲ６エンハンサーエレメントを選択した。ＰＸＲ応答性合成プロモーター構築のストラテジーを図２Ｂに示す。前記３種のエレメント（ｐＥＲ６、ｄＤＲ３及びｄＥＲ６）の各々の両鎖と末端の数個のヌクレオチドから構成される特異的オリゴマーを作製した。
【００９８】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのヌクレオチド−１７６〜−１４６に由来するｐＥＲ６に対応する１本鎖オリゴマーの相補対を合成した。フォワードオリゴマーは５’−ＴＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧＴ ＧＡＧ Ｔ−３’（配列番号２）とし、相補的オリゴマーは５’−ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＣＴ Ａ−３’（配列番号３）とした。２本鎖ｐＥＲ６を図３Ａに示す。
【００９９】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−７７３６〜−７７１６に由来するｄＤＲ３に対応する１本鎖オリゴマーの相補対を合成した。フォワードオリゴマーは５’−ＧＡＡ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＣＣ ＴＣＴ−３’（配列番号５）とし、相補的オリゴマーは５’−ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＴＣ−３’（配列番号６）とした。２本鎖ｄＤＲ３を図３Ｂに示す。
【０１００】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−７６９３〜−７６６８に由来するｄＥＲ６に対応する１本鎖オリゴマーの相補対を合成した。フォワードオリゴマーは５’−ＣＣＣ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＣＡ ＴＧＴ ＣＧＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＡ−３’（配列番号８）とし、相補的オリゴマーは５’−ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＡＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＧ−３’（配列番号９）とした。２本鎖ｄＥＲ６を図３Ｃに示す。
【０１０１】
各オリゴマー対の相補的１本鎖オリゴマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次に、各オリゴマー対の相補的１本鎖オリゴマーをアニールさせ、エンハンサーエレメントの２本鎖デュプレクスを形成した。次に、ランダムライゲーション反応でＤＮＡリガーゼ６０００単位を含むライゲーション混合物にこれらの３種の２本鎖デュプレクス各等量を加えた。１６℃で１６時間ライゲーション反応を進行させた後、ライゲーション反応産物をアガロースゲルにアプライし、Ｖで電気泳動させた。ＤＮＡサイズマーカーをゲルに加えた。約１５０〜約３５０ｂｐの２本鎖ＤＮＡフラグメント集団（ＤＮＡフラグメント当たりエンハンサーエレメント約５〜１５コピー）を含むことがマーカーにより示される領域に対応するアガロースゲルの領域をゲルから切り出し、Ｇｅｎｏｍｅｄ，ＧｍｂＨ，Ｌｏｈｎｅ，ドイツ製品ＪＥＴＳＯＲＢを製造業者の指示に従って使用してゲルからＤＮＡを溶出させた。
【０１０２】
３４６ｂｐ ＳＶ４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ｐＡ）配列の上流に配置したＳＥＡＰレポーター遺伝子をコードする１５２１ｂｐ核酸と機能的に連結した１２０ｂｐ ＣＭＶ最小プロモーターの上流のプラスミドＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶのＥｃｏＲＶ部位に溶出した２本鎖ＤＮＡフラグメントを平滑末端ライゲーションし、ＣＭＶ最小プロモーターと機能的に連結した複合プロモーターを形成するように溶出した２本鎖ＤＮＡフラグメントの１個以上を任意順序及び任意組合わせで各々含む複数のプラスミドｐＶＩｊ−ｃｐｒ−ＳＥＡＰ（ここで「ｃｐｒ」は「複合プロモーター」である）を作製した。プラスミドｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ（図５Ａ）はＳａｌｕｃｃｉら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１４１５−１４２１（２００２）及びＲｉｚｚｕｔｏら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１８９１−１９００（２０００）に記載されている。ｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ＥｃｏＲＶプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号２１）を図５Ｂに示す。プラスミドｐＢＶＩｊ−ＳＥＡＰはＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３（１９９３））に記載されているｐＶ１Ｊプラスミドから誘導した。複合プロモーターを含むレポーター遺伝子カセットを含む上記プラスミドで大腸菌を形質転換し、複合プロモーターを特定配置で各々含む複数のクローンを含む組換えライブラリーを作製した。ライブラリーのアリコートを寒天プレートにプレーティングし、コロニーを生成した。ＥｃｏＲＶ部位を挟むＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲにより数百個のコロニーをスクリーニングし、任意エンハンサーエレメント約５コピーを含むプラスミドを含むクローンを同定した（データは示さず）。ＨｅｐＧ２細胞での機能試験用に百個を上回るクローンを選択した。
【実施例２】
【０１０３】
実施例１でライブラリーのコロニーから単離した各ＤＮＡクローンを下記のようにヒトＰＸＲをコードするプラスミドＤＮＡとＨｅｐＧ２細胞に別々にコトランスフェクトし、複合プロモーターの１個と機能的に連結したＳＥＡＰを各々発現する一過性トランスフェクトＨｅｐＧ２細胞を作製した。ＳＥＡＰ転写のＰＸＲ活性化のインデューサーとして１０μＭリファンピシンの存在下と不在下でＳＥＡＰの発現を測定した。
【０１０４】
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎仔血清を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）でヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を増殖させた。１：５分割比で細胞を週２回継代した。アッセイのためにＨｅｐＧ２細胞を分割し、６ウェル組織培養プレートに播種した。播種の翌日、ＳＥＡＰレポーター遺伝子と機能的に連結した従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターを含むライブラリー又は参照レポータープラスミドｐＺＤＣＶＳΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ（ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ）に由来するライブラリーレポータープラスミドＤＮＡ０．９μｇとヒトＰＸＲ遺伝子をコードする核内受容体（ＮＲ）ドナープラスミドＤＮＡ（ｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲ）０．１μｇを製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に推奨されているプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加えたＤＮＡ混合物をプレーティングした細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから３時間後に１０μＭリファンピシンを加えた新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに各ウェルの培地を交換し、Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してＳＥＡＰ発現アッセイを実施した。対照アッセイはＮＲドナープラスミド ＤＮＡを加えずにライブラリーレポータープラスミドＤＮＡ ０．９μｇから構成した。
【０１０５】
参照レポータープラスミド（ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ）の模式図を図７に示す。このプラスミドはｐＺＤＣＳプラスミド（プラスミドｐＺＤＣＳはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＣａｎａｄａでＹｖｅｓ Ｄｕｒｏｃｈｅｒ博士により作製され、その構築についてはＤｕｒｏｃｈｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８４：３１６−３２６（２０００）にも記載されている）において、ｄＤＲ３及びｄＥＲ６を含むＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−７８３９〜−７２０８の第１のＤＮＡフラグメントと、ｐＥＲ６を含むＣＹＰ３Ａ４プロモーターの−３６２〜＋６４の第２のＤＮＡフラグメントから構成される複合プロモーターとＳＥＡＰをコードする１５２１ｂｐ核酸を機能的に連結したものである。ＳＥＡＰ遺伝子の下流に２１５ｂｐウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を配置した。プラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰは以下のように構築した。ＳＥＡＰ遺伝子をｐＳＥＡＰ−ＢＡＳＩＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から取出し、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。次に、ＳＥＡｐ遺伝子を取出し、ｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングし、プラスミドｐＺｅｏ／ＳＥＡＰを作製した。ＳＶ４０エンハンサー−プロモーター領域をｐＺｅｏ／ＳＥＡＰから除去し、プラスミドｐＺＤＣＶＳを作製した。次にプラスミドｐＺＤＣＶＳをＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ部位に挟まれるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの第１のＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド−７８３９〜−７２０８）と、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に挟まれる第２のＤＮＡフラグメント（ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのヌクレオチド−３６２〜＋６４）を作製するように設計されたＰＣＲプライマーを使用してヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅したＣＹＰ３Ａ４ゲノムフラグメントを消化したｐＺＤＣＶＳのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ部位間に挿入し、プラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰを作製した。ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰに配置した同様のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターもＧｏｏｄｗｉｎらによりＭｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａ．５６：１３２９−１３３９（１９９９）に記載されている。
【０１０６】
ヒトＰＸＲをコードするＮＲドナープラスミドｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲの模式図を図８Ａに示す。このプラスミドはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能なｐＳＧ５プラスミドにおいて、４３９ｂｐ ＳＶ４０プロモーターＳＶ４０起点と機能的に連結した５７３ｂｐ ヒトβ−グロビン第１イントロンと１３４ｂｐ ＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に位置するプラスミドの多重クローニング部位にＡＴＧ開始コドンを欠失させたヒトＰＸＲ（ｈＰＸＲ）をコードする１３３５ｂｐ核酸を挿入したものである。ヒトＰＸＲをコードするＤＮＡはヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。使用した５’ＰＣＲプライマーはヒトＰＸＲの公開配列に示されるＬｅｕ開始コドンの代わりにＡＴＧ開始コドンを加えた。ヒトＰＸＲをコードするＰＣＲ ＤＮＡ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＴＡクローニングベクターにより提供されるＥｃｏＲＩ部位に挟まれたヒトＰＸＲをコードするＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによりＴＡクローニングベクターから除去した。次にＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＳＧ５のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲを作製した。
【０１０７】
トランスフェクション実験を数回実施し、百個を上回る選択クローンを試験した。ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導倍率は恐らく細胞の状態により多少変動する（２〜７倍）が、各種ライブラリークローンの複合プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導とΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからの転写誘導の相対シグナル比は常に維持した。
【０１０８】
典型的なスクリーニングアッセイの結果を図９に示す。図面から明らかなように、参照プラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰからのＳＥＡＰの転写はリファンピシンの存在下で約６倍誘導されたが、ライブラリープラスミドのうちの数種からのＳＥＡＰの転写はより高レベルまで誘導された。例えば、ライブラリーからのクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導は一貫してΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからのＳＥＡＰの転写誘導の約４〜５倍良好であり（夫々誘導倍率２３倍と６倍）、著しく高い総ＳＥＡＰシグナルが得られた。特筆すべき点として、ライブラリーからの所定のクローンをトランスフェクトした細胞におけるＳＥＡＰの発現はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰをトランスフェクトした細胞からのＳＥＡＰ発現よりも高レベルまで誘導された。例えば、クローン６１のＳＥＡＰ転写誘導率は約１１倍であったが、総ＳＥＡＰシグナルはΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰからのシグナルと同等以下であった。これらのクローンはヒトＰＸＲの存在下でバックグラウンド発現が低く、リファンピシンに対する応答性が高かった。試験したクローンのうちで、クローン１０２−ＳＥＡＰは誘導倍率と強力で堅牢なレポーター（ＳＥＡＰ）シグナルの両面でＣＹＰ３Ａ４インデューサーリファンピシンに対して高い応答性を生じることが確認された。以上に基づき、各種化合物に対して更に分析するためにクローン１０２−ＳＥＡＰを選択した。
【０１０９】
これらのクローンの複合プロモーターのうちの数種のもののエンハンサー又は結合部位配置を図６に示す。クローンの数種のもののエンハンサーの配置を図６に示す。図６に示すクローンのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１１０】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン２６−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号１４）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向に２個のｐｒＥＲ６エレメントと１個のｄＥＲ６エレメントを含む。
【０１１１】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン３３−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡ−３’（配列番号１５）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向にｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、ｐｒＥＲ６、２個のｄＤＲ３エレメント、及びｐｒＥＲ６エレメントを含む。
【０１１２】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン６１−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１６）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向に２個のｄＤＲ３エレメント、ｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、ｐｒＥ６エレメント、及びｄＤＲ３エレメントを含む。
【０１１３】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン７１−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡ−３’（配列番号１７）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向に２個のｄＥＲ６エレメント、ｐｒＥＲ６エレメント、ｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、２個のｄＥＲ６エレメント、ｄＤＲ３エレメント、ｐｒＥＲ６エレメント、及びｐｒＥＲ６エレメントを含む。
【０１１４】
最小ＣＭＶプロモーターの上流に挿入したＰＸＲ結合部位を含むクローン１０２−ＳＥＡＰに由来するヌクレオチド配列は５’−ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴ−３’（配列番号１８）である。図６に示す順に、前記配列は５’→３’方向にｄＤＲ３エレメント、ｄＥＲ６エレメント、及び２個のｄＤＲ３エレメントを含む。この配列はｐｒＥＲ６エレメントを含まない。
【実施例３】
【０１１５】
クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞のＣＹＰ３Ａ４インデューサー同定能を評価した。
【０１１６】
実施例２に記載したように増殖させたヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を分割し、６ウェル組織培養プレートのウェルに播種した。播種の翌日、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ ＤＮＡ ０．９μｇとｐＳＧ５ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲ ＤＮＡ ０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加えたＤＮＡ混合物をプレーティングした細胞にトランスフェクトした。対照アッセイはＮＲドナープラスミドを加えずにクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ ０．９μｇから構成した。
【０１１７】
トランスフェクションから３時間後に、２００μＭオメプラゾール、１０μＭアンドロスタノール、１００μＭコール酸、６μＭクロトリマゾール、１２５ｎＭハイパーフォリン、１２．５μＭロバスタチン、１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１ｍＭフェノバルビタール、１０μＭリファンピシン、又は１０μＭ ＲＵ４８６を加えた新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに各ウェルの培地を交換した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後にＳＥＡＰアッセイ用にウェルから培地を採取した。ＳＥＡＰ発現アッセイはＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用して実施した。
【０１１８】
結果を図１０及び１１に示す。図１０は各種化合物によるＳＥＡＰ転写の誘導倍率を示す。図１１はリファンピシンによる誘導の百分率として表したＳＥＡＰ転写の誘導倍率を示す。これらの化合物による転写誘導に対するクローン１０２−ＳＥＡＰの応答はヒト肝細胞及びＨｅｐＧ２／ＣＹＰ３Ａ４誘導アッセイの両者で発表されている結果と一致した（Ｌｕｏら，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３０：７９５−８０４（２００２）；Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７（２００２）；Ｒａｕｃｙ，Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３１：５３３−５３９（２００３））。参照ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰプラスミド（データは示さず）と比較すると、参照レポータープラスミドは同様に挙動するが、クローン１０２は一貫して著しく高いシグナルを発生することが判明した。
【０１１９】
ｐｒＥＲ６、ｄＥＲ６、ｄＤＲ３エンハンサー部位は天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターで相互に異なる距離に位置し、ｄＥＲ６及びｄＤＲ３では転写開始部位の約８ｋｂ上流であるが、本実施例に示す結果によると、ｄＥＲ６及びｄＤＲ３の転写強化能は距離に依存せず、それらの機能的効果は付加的である。クローン、特にクローン１０２−ＳＥＡＰにおける各種結合部位の分布と向きの効果を理由付けするのは非常に難しいが、ｄＤＲ３のマルチマー化と恐らく右向きがリファンピシン及び他のＰＸＲリガンドに対する強力な応答を付与するのに主要な役割を果たしていると予想することができる。これはｄＥＲ６及びｐＥＲ６に関するこの部位に対するヒトＰＸＲ／ヒトＲＸＲ複合体の高い親和性に一致する（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．５６：１３２９−１３３９（１９９９））。ＰＸＲの結合部位のみを含む人工プロモーターの使用に関する１つの問題は天然ＣＹＰ３Ａ４プロモーターのほうがｉｎ ｖｉｖｏで得られる応答をより忠実に反映する応答を再現できるのではないかという点である。しかし、この疑問はｈＰＸＲの不在下でＨｅｐＧ２アッセイを実施すると、参照レポータープラスミドＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰもクローン１０２−ＳＥＡＰもリファンピシンに応答しなかったという事実により容易に解決される。どちらのレポータープラスミドもｈＰＸＲのコトランスフェクションに厳密に依存した。
【０１２０】
特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは非常に高いシグナルとＣＹＰ３Ａ４インデューサーに対する高い応答性の利点を明白に提供する。参照レポータープラスミドＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰと比較すると、特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは薬剤候補のｉｎ−ｖｉｔｒｏ高スループットスクリーニングで使用するのに適しており、従来よりも著しく堅牢なアッセイが得られる。
【実施例４】
【０１２１】
ＣＡＲは多数のＰＸＲ応答性遺伝子のプロモーターで同様の部位を認識する別の核内受容体であるため、ヒトＣＡＲを発現したプラスミドとのコトランスフェクションでクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡをを試験した。
【０１２２】
ヒトＣＡＲをコードするＮＲドナープラスミドを以下のように作製した。ヒトＣＡＲはヒト肝ｍＲＮＡ調製物からＲＴ−ＰＣＲにより作製した。使用したＰＣＲプライマーは５’−ＧＡＡＧＣ ＴＴＧＴＴ ＣＡＴＧＧ ＣＣＡＧＴ ＡＧＧＧＡ ＡＧＡＴＧ ＡＧＣ−３’（配列番号１９）及び５’−ＴＧＧＣＣ ＴＣＡＧＣ ＴＧＣＡＧ ＡＴＣＴＣ ＣＴＧＧＡ ＧＣ−３’（配列番号２０）とした。ＲＴ−ＰＣＲ条件は９４℃で１５秒、９４℃で３０秒後に６８℃で３分を３０サイクル、次いで６８℃で３分間とし、４℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲから得られたヒトＣＡＲ（ｈＣＡＲ）をコードする１０４７ｂｐ核酸をｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＴＡクローニング部位に挿入し、プラスミドｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲ（図８Ｂ）を作製した。５９６ｂｐ ＣＭＶ極初期プロモーターによりｈＣＡＲの発現を誘導した。
【０１２３】
実施例２に記載したように増殖させたヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を分割し、６ウェル組織培養プレートのウェルに播種した。播種の翌日、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ ＤＮＡ０．９μｇとＤＮＡ ｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲ ０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加えたＤＮＡ混合物をプレーティングした細胞にトランスフェクトした。対照はヒトＣＡＲをコードするＤＮＡを省略した。前の実施例のヒトＰＸＲをコードするＤＮＡから付加対照を構成した。
【０１２４】
トランスフェクションから３時間後に、２００μＭオメプラゾール、１０μＭアンドロスタノール、１００μＭコール酸、６μＭクロトリマゾール、１２５ｎＭハイパーフォリン、１２．５μＭロバスタチン、１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１ｍＭフェノバルビタール、１０μＭリファンピシン、又は１０μＭ ＲＵ４８６を加えた新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに各ウェルの培地を交換した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後にＳＥＡＰアッセイ用にウェルから培地を採取した。ＳＥＡＰ発現アッセイはＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用して実施した。
【０１２５】
実施例３の結果と対照的に、ヒトＣＡＲをコードするプラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクションすると、添加化合物の不在下でΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの転写活性化が生じた。図１２（ＳＥＡＰ任意単位として表した結果）及び図１３（ヒトＣＡＲにより誘導される転写の構成的活性化により得られる最大活性化の百分率として表した結果）に示すように、ヒトＣＡＲ ＤＮＡをクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又はΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰ ＤＮＡとコトランスフェクションした結果、ＳＥＡＰ転写誘導率は夫々４４．２倍と３．４倍になった。クローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターからの転写誘導率のほうが著しく高いことから、複合プロモーターは核内受容体による活性化に対してΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターよりも高感度であることが確認される。
【０１２６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＡＲリプレッサーであることが既に知られているクロトリマゾールやオメプラゾール等の化合物はクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターとΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターのどちらからの転写にも明白に阻害効果を示した。また、抗黄体ホルモン薬であるＲＵ４８６はヒトＣＡＲの構成的活性化の阻害剤であることが判明した。Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５１２２−１５１２７（２０００）では、ヒトＣＡＲにより３．３倍のレポータープラスミドからの転写が誘導されたが、ＲＵ４８６はＣＶ１細胞で阻害効果を示さなかった。所定の他の化合物（例えば、ハイパーフォリン、ロバスタチン、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）については、クローン１０２−ＳＥＡＰレポータープラスミドの複合プロモーターからの転写は影響を受けなかったが、ΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターからの転写の中等度阻害が観察された（図１３）。
【０１２７】
コトランスフェクトしたヒトＣＡＲによるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターからの転写の高い活性化はｄＤＲ３に対するヒトＣＡＲ／ヒトＲＸＲ複合体の高い親和性により説明することができる（Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：３５９−３６５（２００２））。特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは非常に高いシグナルとＣＹＰ３Ａ４インデューサーに対する高い応答性の利点を明白に提供する。参照レポータープラスミドＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰと比較すると、特にクローン１０２−ＳＥＡＰにより例示される複合プロモーターは薬剤候補のｉｎ−ｖｉｔｒｏ高スループットスクリーニングで使用するのに適しており、従来よりも著しく堅牢なアッセイが得られる。
【実施例５】
【０１２８】
本発明のレポーター遺伝子発現カセットを含む細胞株は以下のように作製することができる。
【０１２９】
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎仔血清を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）にヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を保存する。細胞約２×１０５個を１００ｍｍ組織培養皿に播種し、実施例１からの遺伝子発現カセットとネオマイシン耐性を付与する遺伝子を含むプラスミド１μｇを製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に推奨されているプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔに加え、トランスフェクトする。トランスフェクションから３時間後に培地を新鮮なＤＭＥＭ−ＧＭに交換する。２４時間後に細胞を分割し、Ｇ４１８選択ＤＭＥＭ（１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８）で培養する。コロニーが形成されるまで培地を３日おきに交換する。個々のコロニーを単離し、６ウェルプレートに播種する。細胞がコンフルエントまで増殖した後、Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用して公知ＣＹＰ３Ａ４アクチベーターの存在下でそのＳＥＡＰ発現能を判定する。
【実施例６】
【０１３０】
本実施例は複合プロモーターとｈＣＡＲ又はｈＰＸＲをコードする発現ベクターを新鮮なラット肝細胞にコトランスフェクトすると、検体により活性化されたｈＰＸＲを介して誘導される発現から検体により活性化されたｈＣＡＲを介して誘導されるＣＹＰ３Ａ４発現を識別するアッセイが得られることを実証する。
【０１３１】
２４ウェルプレートでラット初代肝細胞へのＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３０１４２５）のトランスフェクション及びコトランスフェクションを以下のように実施した。
【０１３２】
トランスフェクションの前日に潅流したラット肝から肝細胞を単離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及びＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＤＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５４３５２）を補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１ｍＬ中、ＢＩＯＣＯＡＴ ２４ウェル（Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５４４０８）に細胞１×１０５個／ウェルをプレーティングした。４時間後に、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及びＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘを加えたＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１ｍＬに細胞培地を交換し、細胞を正常増殖条件下で一晩インキュベートした。
【０１３３】
翌日、レポータートランスフェクションの場合にはトランスフェクション毎にクローン１０２−ＳＥＡＰ ０．４μｇをＥＦＦＥＣＴＥＮＥ試薬ＤＮＡ−濃縮用緩衝液Ｂｕｆｆｅｒ ＥＣと総容量３５０μＬまで試験管で混合した。次にエンハンサー３．２μＬを加え、１秒間ボルテックスすることにより混合した。レポーター／核内受容体コトランスフェクションの場合には、トランスフェクション毎にクローン１０２−ＳＥＡＰ ０．３μｇとｈＰＸＲ（ＡＴＧ）／ｐＳＧＳ又はｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲ ０．１μｇをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬ＤＮＡ−濃縮用緩衝液Ｂｕｆｆｅｒ ＥＣと総容量３５０μＬまで試験管で混合した。対照トランスフェクションでは、クローン１０２−ＳＥＡＰ ０．３μｇと０．１μｇのｐＵＣ１９をコトランスフェクトした。コトランスフェクション後にエンハンサー３．２μＬを加え、１秒間ボルテックスすることにより混合した。トランスフェクション／コトランスフェクション混合物を室温で５分間インキュベートした。次に、混合物を数秒間遠心し、試験管の頂部から液滴を除去した。次に、各混合物にＥｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ５μＬを加え、混合物を１０秒間ボルテックスすることにより混合した。次に混合物を１０分間室温でインキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させた。
【０１３４】
一方、細胞を含む２４ウェルプレートの各ウェルの増殖培地をウェルから捨て、ウェル内の細胞を増殖培地１ｍＬで１回洗浄した。次に新鮮な増殖培地３５０μＬを各ウェルに加え、増殖培地３５０μＬをトランスフェクション複合体の各試験管に加えた後、混合し、すぐにウェル内の細胞に滴下した。プレートを穏和に旋回させ、トランスフェクション複合体を細胞に均質に分布させた。細胞を正常増殖条件下でトランスフェクション培地と共に６時間インキュベートした。その後、トランスフェクション複合体を含む培地を捨て、抗生物質、グルタミン、ＩＴＳ、及び１０μＭリファンピシン、１μＭ ＣＩＴＣＯ（６−（４−クロロフェニル）イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−５−カルボアルデヒドＯ−（３，４−ジクロロベンジル）オキシム）、１ｍＭフェノバルビタール又はＤＭＳＯ単独を加えたＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１ｍＬに交換した。細胞を４８時間３７℃でインキュベートした。培地を細胞から除去し、Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用してＳＥＡＰ活性をアッセイした。
【０１３５】
対照反応では、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡとｐＵＣ１９ ＤＮＡを新鮮なラット肝細胞にトランスフェクトし、クローン１０２−ＳＥＡＰがコトランスフェクトした核内受容体の不在下で内在ラットＣＡＲ又はＰＸＲを動員する化合物に対して応答するか否か（ＳＥＡＰシグナルを培地で測定できるか否か）を調べておいた。図１４に示すように、試験した検体の存在下で誘導は観察されなかった。リファンピシンの場合には、リファンピシンはラットでＣＡＲのインデューサーではないので予想通りであったが、マウスＣＡＲのインデューサーであることが知られているフェノバルビタールにより応答は誘発されなかった。齧歯類におけるＣＩＴＣＯの誘導可能性は不明であると考えられている。ラットＣＡＲを誘導するＴＣＰＯＢＯＰ（１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジルオキシ）］ベンゼン）等の強力な公知ＣＡＲインデューサーを使用し、安定したトランスフェクション効率レベルを確保する条件下で実験を繰返すならば、同様の結果が得られると予想される。従って、以上の結果はラット肝細胞におけるクローン１０２−ＳＥＡＰのバックグラウンド発現が無意味なまでに低かったことを示す。
【０１３６】
クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡとｈＣＡＲ又はｈＰＸＲをコードするＤＮＡをラット肝細胞にコトランスフェクトすると、公知ＣＡＲ又はＰＸＲインデューサーの存在下でレポーター遺伝子発現の活性化の有意誘導が認められ、誘導は受容体に特異的であった。図１４に示すように、リファンピシンはｈＣＡＲを介する発現を誘導せずにｈＰＸＲを介する約２．６倍の発現を誘導し、フェノバルビタールはｈＣＡＲを介する約４倍の発現とｈＰＸＲを介する約３．４倍の発現を誘導し、ＣＩＴＣＯはｈＰＸＲを介する発現を誘導せずにｈＣＡＲを介する約４．２倍の発現を誘導した。この結果、コトランスフェクションプロトコールは有効であり、クローン１０２−ＳＥＡＰは検体とトランスフェクトしたｈＣＡＲ又はｈＰＸＲの相互作用のみにより誘導されることが分かる。ＰＸＲインデューサーとｈＣＡＲ又はＣＡＲインデューサーとｈＰＸＲの間に明白な交差反応性は認められなかった。更に、ｈＣＡＲはヒト肝で調節されるので、ラット肝細胞で調節されると思われる。即ち、大半の細胞株と異なり、コトランスフェクトしたラット肝細胞では、ｈＣＡＲは構成的に活性化されず、誘導的である。これはヒト肝、ＨｅｐＧ２、及びラット肝細胞におけるｈＰＸＲの誘導能と同様である。以上の結果は肝細胞の状態、従ってトランスフェクション効率に強く依存したが、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡとヒトＣＡＲ又はＰＸＲをコードする発現ベクターをコトランスフェクトしたラット肝細胞はＣＡＲ又はＰＸＲ又は両者を活性化する検体を識別する高感度アッセイとなることが実証された。
【０１３７】
以上の結果から、クローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターと同等以上の強度をもつ複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子とｈＣＡＲをコードする遺伝子発現カセットをコトランスフェクトしたラット肝細胞は、ｈＣＡＲ活性を誘導する可能性のみについて検体を試験するための手段となることが明らかである。以上の結果から更に、上記のような複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子とｈＰＸＲをコードする遺伝子発現カセットをコトランスフェクトしたラット肝細胞は、ｈＰＸＲ活性を誘導する可能性のみについて検体を試験するための手段となることも明らかである。
【実施例７】
【０１３８】
本実施例では、実施例６の方法を使用してクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡを新鮮なヒト肝細胞にトランスフェクトした。ＤＭＳＯ又は１０μＭリファンピシン、５μＭクロトリマゾール、１０μＭ ＴＰＰ、２５０μＭ ＣＩＴＣＯ、もしくは５０μＭアルテミシニンを加えた培地中、トランスフェクトした細胞を約４８時間３７℃でインキュベートした後にＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔシステムキットを使用してＳＥＡＰ活性をアッセイした。結果を図１５に示し、全５個の検体がレポーター遺伝子の発現のインデューサーであることが明らかである。
【０１３９】
これらの結果から明らかなように、クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡはヒト肝細胞にトランスフェクトすることができ、検体がＣＡＲ又はＰＸＲを介してＣＹＰ３Ａ４活性を誘導する能力を評価するために使用することができる。本実施例から明らかなように、クローン１０２−ＳＥＡＰ又はクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターと同等以上の強度の複合プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子のみをトランスフェクトした新鮮なヒト肝細胞を使用してＣＡＲ又はＰＸＲを介するＣＹＰ３Ａ４活性をアッセイすると、ＰＸＲ又はＣＡＲをコードする第２のベクターとレポーターをコトランスフェクトする必要がある従来技術のアッセイよりも改善される。
【実施例８】
【０１４０】
本実施例は多重ウェルフォーマットで実施される本発明のアッセイで使用するためにＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトする効率的で迅速な方法について記載する。この方法の利点は液内バッチトランスフェクションであるため、細胞を懸濁状態でトランスフェクトした後に多重ウェルプレートのウェルにプレーティングできるという点である。この方法は、各ウェルで別々にトランスフェクトする方法（非常に煩瑣で１個以上の９６プレートで再現不能）及び大型（例えば１５ｃｍ又はフラスコ）組織培養皿でトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を分割し、適切な寸法の容器（例えば９６ウェル組織培養プレート）に再プレーティングする方法という時間がかかる低効率の２つの代替方法に比較して改善される。
【０１４１】
ＨｅｐＧ２細胞を組織培養皿で約８０％コンフルエントまで増殖させる。培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄する。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液でトリプシン処理する。細胞が分離し始めたら完全ＤＭＥＭを細胞に加えてトリプシンをブロックし、細胞を遠心管に移す。細胞を１２００ｒｐｍで約３〜５分間遠心する。上清フラクションを捨て、回収される細胞の１５ｃｍプレート当たり約１５〜２０ｍＬで細胞を培地に再懸濁する。適切な培地はＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２０４５−０８５）又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５１９８５−０２６）であるが、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭが好ましい。再懸濁した細胞を１２００ｒｐｍで約３〜５分間遠心し、回収される各１５ｃｍプレート当たり約１５〜２０ｍＬで上記培地に再懸濁する。２０ｍＬシリンジ（１．２×４０ゲージ）を使用し、細胞を約２回吸引排出することにより細胞塊を破砕する。細胞懸濁液をＣｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ ７０μｍ（Ｆａｌｃｏｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５−２３５０）に通し、懸濁液を細胞約５００，０００個／ｍＬまで希釈する。
【０１４２】
９６ウェルプレート用のトランスフェクション複合体の作製は以下の通りである。この方法は他の多重ウェルフォーマットにも適応させることができる。（クローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡ又は別の複合プロモーターもしくは天然プロモーターと機能的に連結したレポーター遺伝子）４．５μｇとｈＰＸＲ（ＡＴＧ）／ｐＳＧＳ ０．５μｇをＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ ５００μＬに加えることにより第１の混合物ＭｉｘＡを調製する。次にＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔ．＃ １１５１４−０１５）３０μＬを加え、混合物を１５分間室温でインキュベートする。
【０１４３】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３２４−０２０）２０μＬをＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ ５００μＬに加えることにより第２の混合物ＭｉｘＢを調製する。
【０１４４】
１５ｍＬポリプロピレンＦａｌｃｏｎ試験管でＭｉｘＡとＭｉｘＢを合わせた後、約５００，０００個／ｍＬの細胞４ｍＬを加え、トランスフェクション混合物を調製する。トランスフェクション混合物を穏和に混合した後、１５分間室温でインキュベートする。周期的に試験管を転倒させて細胞を懸濁状態に保つ。
【０１４５】
その後、各ウェルにトランスフェクション混合物の５０μＬアリコートを加える。この結果、細胞約２０，０００／ウェルとなる。細胞を少なくとも３時間３７℃でインキュベートし、細胞を接着させ、トランスフェクションを進行させる。約３時間後にトランスフェクション混合物を取出し、ＤＭＳＯ又は検体を添加するか又は添加しないＤＭＥＭ−ＧＭ培地１００μＬと交換する。３７℃で４８時間後に培地を取出し、ｈＰＸＲ活性の誘導をアッセイする。
【０１４６】
本明細書では図例態様を参照して本発明を記載するが、当然のことながら本発明はこれらの態様に限定されない。当分野に通常の知識をもつ者が本明細書の教示に接するならば、付加変形及び態様も発明の範囲内に含まれることを認識しよう。従って、本発明は特許請求の範囲のみに限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ヒトＰＸＲとＳＥＡＰレポーター遺伝子に機能的に連結した従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターから構成されるプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞を使用する従来技術のＣＹＰ３Ａ４誘導アッセイを示す模式図である。
【図２Ａ】図２ＡはＳＥＡＰレポーター遺伝子と機能的に連結した従来技術のΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの模式図である。ヒトＰＸＲ又はＣＡＲ結合部位ｄＤＲ３、ｄＥＲ６及びｐＥＲ６の位置を示す。
【図２Ｂ】図２ＢはヒトＰＸＲ又はＣＡＲ誘導に対して応答性の複合プロモーターを作製するためのストラテジーの模式図である。
【図３Ａ】図３ＡはｐＥＲ６フォワード鎖（配列番号２）と相補鎖（配列番号３）を含む２本鎖オリゴマーのヌクレオチド配列を示す。塩基番号はヒトＣＹＰ３Ａプロモーター領域を表す。
【図３Ｂ】図３ＢはｄＥＲ６フォワード鎖（配列番号５）と相補鎖（配列番号６）を含む２本鎖オリゴマーのヌクレオチド配列を示す。塩基番号はヒトＣＹＰ３Ａプロモーター領域を表す。
【図３Ｃ】図３ＣはｄＤＲ６フォワード鎖（配列番号８）と相補鎖（配列番号９）を含む２本鎖オリゴマーのヌクレオチド配列を示す。塩基番号はヒトＣＹＰ３Ａプロモーター領域を表す。
【図４Ａ】図４Ａはクローン１０２エンハンサーとＣＭＶ最小プロモーターを含む複合プロモーターに機能的に連結したＳＥＡＰレポーター遺伝子を含むＳＥＡＰレポーター遺伝子発現カセットを含むクローン１０２−ＳＥＡＰ（プラスミドｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶ−＃１０２）の模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂはクローン１０２−ＳＥＡＰレポーター遺伝子カセットの模式図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは図４Ｂに示すレポーター遺伝子カセットのヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。クローン１０２エンハンサーは大文字で表し、ＣＭＶ最小プロモーターは下線で表し、ＳＥＡＰレポーター遺伝子は斜体で表す。
【図５Ａ】図５ＡはプラスミドｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶの模式図である。
【図５Ｂ】図５ＢはｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。ＥｃｏＲＶ制限酵素部位に対応するヌクレオチド配列を下線で示す。
【図５Ｃ】５ＣはｐＶＩｊ−ＳＥＡＰ−ｐｏｌｙＥｃｏＲＶのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。ＥｃｏＲＶ制限酵素部位に対応するヌクレオチド配列を下線で示す。
【図６】本発明の複合プロモーターの数種のものの複合エンハンサーにおけるｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６エンハンサーエレメントの位置と分布を示す模式図である。エレメントの向きは矢印で示す。各クローンを含むエンハンサーエレメントについて、右向きの矢印はエンハンサーエレメントが天然の向きであることを示し、左向きの矢印は天然以外の向きであることを示す。ｄＤＲ３は白い矢印で示し、ｄＥＲ６は黒い矢印で示し、ｐｒＥＲ６は斜線の矢印で示す。
【図７】プラスミドｐＺＤＣＶＳ−ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰの模式図である。
【図８Ａ】図８ＡはプラスミドｐＳＧ５−ｄＡＴＧ−ｈＰＸＲの模式図である。
【図８Ｂ】図８ＢはプラスミドｐＣＲ３．１−ｈＣＡＲの模式図である。
【図９】ヒトＰＸＲをコードする核内受容体（ＮＲ）ドナープラスミドの存在下で複合プロモーターライブラリーに由来するクローン３、２１、２６、３３、５８、６１、７０、７１、及び１０２をＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトし、１０ｍＭリファンピシンの存在下と不在下でＳＥＡＰ転写誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陽性対照としてレポータープラスミドΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰを加えた。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。ＳＥＡＰの発現をＳＥＡＰ任意単位として報告する。棒線の上の数字はリファンピシンの存在下又は不在下におけるプロモーターからの転写誘導倍率を表す。
【図１０】ヒトＰＸＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。ＳＥＡＰの発現を任意ＳＥＡＰ単位として報告する。棒線の上の数字は指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。
【図１１】ヒトＰＸＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるライブラリークローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。リファンピシンによる転写誘導率を１００％とし、その百分率としてＳＥＡＰの発現を報告する。棒線の上の数字はリファンピシンによる誘導率に比較した指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰにおけるΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの誘導能と比較して結果を示す。
【図１２】ヒトＣＡＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。ＳＥＡＰの発現を任意ＳＥＡＰ単位として報告する。棒線の上の数字は指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。陽性対照としてΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰを加えた。
【図１３】ヒトＣＡＲをコードするＮＲドナーＤＮＡの存在下で各種インデューサーの存在下と不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰの複合プロモーターの誘導能について試験したアッセイの結果を示す。陰性対照はＮＲドナープラスミドを省略した。リファンピシンによる転写誘導率を１００％とし、その百分率としてＳＥＡＰの発現を報告する。棒線の上の数字はリファンピシンによる誘導率に比較した指定化合物の存在下又は不在下におけるクローン１０２−ＳＥＡＰ複合プロモーターからの転写誘導倍率を表す。ΔＣＹＰ３Ａ４／ＳＥＡＰにおけるΔＣＹＰ３Ａ４プロモーターの誘導能と比較して結果を示す。
【図１４】初代ラット肝細胞が肝細胞単独にトランスフェクトした場合にクローン１０２−ＳＥＡＰからの転写を活性化した内在ＰＸＲ又はＣＡＲ活性を含まないことを示す。図から明らかなように、ＣＡＲをコードする遺伝子カセットとクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡを肝細胞にコトランスフェクトした場合には、ＣＡＲアクチベーターのみがクローン１０２−ＳＥＡＰから転写を誘導することができた。同様に図から明らかなように、ＰＸＲをコードする遺伝子カセットとクローン１０２−ＳＥＡＰ ＤＮＡを肝細胞にコトランスフェクトした場合には、ＰＸＲアクチベーターのみがクローン１０２−ＳＥＡＰから転写を誘導することができた。ＳＥＡＰ任意単位として結果を表す。
【図１５】クローン１０２−ＳＥＡＰをトランスフェクトした初代ヒト肝細胞がＰＸＲ又はＣＡＲを介するＣＹＰ３Ａ４のインデューサーを検出できることを示す。ＳＥＡＰ任意単位として結果を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２】
ＰＸＲ結合部位がｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄＤＲ３が配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸が少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含む請求項２に記載の方法。
【請求項５】
細胞が内在ＰＸＲを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が内在ＲＸＲを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞がＨｅｐＧ２である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
レポーターが分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む複合プロモーター。
【請求項１１】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項１０に記載の複合プロモーター。
【請求項１２】
レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含むレポーター遺伝子発現カセット。
【請求項１３】
レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む細胞。
【請求項１４】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）好ましくは第１の核酸の非存在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項１５】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項１６】
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸を含む第１の容器と；場合により、
（ｂ）ＰＸＲをコードし、異種プロモーターと機能的に連結した第２の核酸を含む第２の容器を含むキット。
【請求項１７】
更にレポーター遺伝子の発現を測定するための試薬を含む請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
更に核酸を細胞にトランスフェクトするための試薬を含む請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２０】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２１】
検体が構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）の活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、ＣＡＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２２】
検体がプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）又は構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）の活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導するか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸とＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞と、第１の核酸とＣＡＲをコードする第３の核酸を含む第２の初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で各培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、第１の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第２の培養液では増加しないならば、検体はＰＸＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断し、第２の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第１の培養液では増加しないならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２３】
肝細胞がラット、マウス、及びヒト肝細胞から構成される群から選択される請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
肝細胞がラット肝細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＸＲ結合部位がｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
ｄＤＲ３が配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２７】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２８】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２９】
ＰＸＲ結合部位がｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｄＤＲ３が配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ｄＤＲ３が配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号２のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ｄＤＲ３が配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１０のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２】
ＰＸＲ結合部位がｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄＤＲ３が配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸が少なくとも１個のｄＥＲ６結合部位と少なくとも１個のｄＤＲ３結合部位を含む請求項２に記載の方法。
【請求項５】
細胞が内在ＰＸＲを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が内在ＲＸＲを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞がＨｅｐＧ２である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
レポーターが分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む複合プロモーター。
【請求項１１】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項１０に記載の複合プロモーター。
【請求項１２】
レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含むレポーター遺伝子発現カセット。
【請求項１３】
レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む細胞。
【請求項１４】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）好ましくは第１の核酸の非存在下でＰＸＲにより誘導不能であり、レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項１５】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で細胞をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項１６】
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸を含む第１の容器と；場合により、
（ｂ）ＰＸＲをコードし、異種プロモーターと機能的に連結した第２の核酸を含む第２の容器を含むキット。
【請求項１７】
更にレポーター遺伝子の発現を測定するための試薬を含む請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
更に核酸を細胞にトランスフェクトするための試薬を含む請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、ＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２０】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２１】
検体が構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）の活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む第１の核酸と、ＣＡＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２２】
検体がプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）又は構成的アンドロゲン受容体（ＣＡＲ）の活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導するか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位を含む第１の核酸とＰＸＲをコードする第２の核酸を含む初代培養肝細胞と、第１の核酸とＣＡＲをコードする第３の核酸を含む第２の初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で各培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、第１の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第２の培養液では増加しないならば、検体はＰＸＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断し、第２の培養液では検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加するが、第１の培養液では増加しないならば、検体はＣＡＲの活性化によりＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２３】
肝細胞がラット、マウス、及びヒト肝細胞から構成される群から選択される請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
肝細胞がラット肝細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＸＲ結合部位がｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
ｄＤＲ３が配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２７】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の方法。
【請求項２８】
検体がＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導することができるか否かを判定する方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子と機能的に連結した異種プロモーターと機能的に連結した２個以上のタンデムに配置されたプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）結合部位を含む核酸を含む初代培養肝細胞を提供する段階と；
（ｂ）検体を含む培地で培養液をインキュベートする段階と；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定し、検体の存在下でレポーター遺伝子の発現が増加したならば、検体はＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導できると判断する段階を含む前記方法。
【請求項２９】
ＰＸＲ結合部位がｄＤＲ３、ｄＥＲ６、及びｐＥＲ６から構成される群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｄＤＲ３が配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号７のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ｄＤＲ３が配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号８のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号２のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ｄＤＲ３が配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ｄＥＲ６が配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ｐＥＲ６が配列番号１０のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
２個以上のタンデムに配置されたＰＸＲ結合部位が配列番号１８のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００８−５１０４５７（Ｐ２００８−５１０４５７Ａ）
【公表日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６３７６（Ｐ２００７−５２６３７６）
【出願日】平成１７年８月１５日（２００５．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８８６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１８２７０
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１５日（２００５．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８８６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１８２７０
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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