デルタ−８デサチュラーゼ遺伝子、それによってコードされる酵素およびそれらの使用
本発明は、デルタ−８デサチュラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、この単離されたポリヌクレオチドによってコードされるデルタ−８デサチュラーゼ、その単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、この発現ベクターを含む宿主細胞およびデルタ−８デサチュラーゼおよびポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デルタ−８デサチュラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、それらの単離されたポリヌクレオチドによってコードされるデルタ−８デサチュラーゼ、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、発現ベクターを含む宿主細胞ならびにデルタ−８デサチュラーゼおよびポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、あらゆる生活形態の適切な機能化において多くの役割を果たす。例えば、ＰＵＦＡは細胞の原形質膜の重要な成分であり、そこではＰＵＦＡはリン脂質の形態で見出される。ＰＵＦＡは乳児脳の適切な発育に必要であり、成熟した哺乳動物における組織形成および修復にも必要である。
【０００３】
多数の酵素、最も顕著にはデサチュラーゼおよびエロンガーゼは、ＰＵＦＡの生合成に関与している（図１参照）。デサチュラーゼは、基質の脂肪酸アルキル鎖内の炭素原子間に不飽和化（例えば、二重結合）の導入を触媒する。エロンガーゼは、脂肪酸基質に二炭素単位の付加を触媒する。例えば、リノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）はΔ１２−デサチュラーゼによってオレイン酸（ＯＡ、１８：１ｎ−９）から生成される。エイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）はΔ９−エロンガーゼによってＬＡから生成される。ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）はΔ８−デサチュラーゼによってＥＤＡから生成される（図１参照）。アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）はΔ５−デサチュラーゼによってＤＧＬＡから生成される（図１参照）。
【０００４】
多数の重要な長鎖ＰＵＦＡが当該技術分野において知られている。例えば、最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１つはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。ＥＰＡは菌類および海洋油において見出されている。第２の重要な長鎖ＰＵＦＡはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。ＤＨＡは、ほとんどの場合、魚油に見出され、また哺乳動物の脳組織から精製され得る。第３の重要な長鎖ＰＵＦＡはＡＲＡである。ＡＲＡは糸状菌において見出され、また肝臓および副腎を含む哺乳動物組織から精製され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡは、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路または従来のΔ６−デサチュラーゼ経路のいずれかにより生成され得る（図１参照）。長鎖ＰＵＦＡ、特にＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの生成に関する従来のΔ６経路における基質の脂肪酸に活性なエロンガーゼは、従来、同定されている。ＬＡをＤＧＬＡに変換し、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）をω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）に変換するための従来のΔ６−デサチュラーゼ経路は、ＬＡをガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）に変換し、ＡＬＡをステアリドン酸に変換するΔ６−デサチュラーゼ酵素；ならびにＧＬＡをＤＧＬＡに変換し、ＳＤＡをω３−ＥＴＡに変換するＣ１８−エロンガーゼを利用する。しかしながら、ある場合には、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼは、従来のΔ６−デサチュラーゼ経路よりも優先され得る。例えば、特定の残余物であるオメガ−６またはオメガ−３脂肪酸中間体、例えば、ＧＬＡまたはＳＤＡは、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ω３−ＥＴＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）および／またはＤＨＡの生成過程で所望されない場合、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が、ＧＬＡおよびＳＤＡ形成を迂回するための従来のΔ６−デサチュラーゼ経路の代替経路として使用されてもよい。Δ８−デサチュラーゼは、８番目と９番目の炭素原子（この分子のカルボキシル末端から数える）の間で脂肪酸を非飽和化し、例えば、ω６−エイコサジエン酸（ＥＤＡ）からＤＧＬＡおよび／またはω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ）からω３−ＥＴＡへの変換を触媒し得るため、Δ８−デサチュラーゼがこの経路において有用である。したがって、長鎖ＰＵＦＡの生成に使用し得るΔ８−デサチュラーゼの新しい供給源が当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
一態様では、本発明は、デサチュラーゼ活性を有し、そのアミノ酸配列が、配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むまたはそれに相補的な単離されたヌクレオチド酸またはその断片に関する。単離された核酸またはその断片は、ω６−エイコサジエン酸またはω３−エイコサトリエン酸を基質として利用する機能的に活性なΔ８−デサチュラーゼ酵素をコードする。この単離された核酸配列は、エミリアナ・ハックスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎａ ｈｕｘｌｅｙｉ）、好ましくはエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から得ることができる。
【０００７】
別の態様では、本発明は、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的である単離されたヌクレオチド配列またはその断片に関する。単離されたヌクレオチド配列またはその断片は、基質としてω６−エイコサジエン酸またはω３−エイコサトリエン酸を利用する機能的に活性なΔ８−デサチュラーゼ酵素をコードする。単離されたヌクレオチド配列は配列番号２８の配列を有することができる。あるいは、単離されたヌクレオチド配列は配列番号３０の配列を有することができる。この単離されたヌクレオチド配列は、エミリアナ・ハックスレイ、好ましくはエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から得ることができる。
【０００８】
別の態様では、本発明は発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいるまたはその少なくとも５５％に相補的である、調節配列に作動的に連結されたヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
なおさらなる態様では、本発明は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は真核細胞であり得る。具体的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属種、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属種、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種、およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属種からなる群から選択される真菌細胞である。使用可能である植物細胞の例は、ダイズ、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属種、ベニバナ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタおよび亜麻からなる群から選択される。
【００１０】
さらなる別の態様では、本発明は、そのヌクレオチド配列の発現が、植物細胞、植物種子、植物体または植物組織による少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらす、上記の発現ベクターを含む植物細胞、植物種子、植物体または植物組織に関する。上記発現ベクターによって生成されるポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）またはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）からなる群から選択される。
【００１１】
なおさらなる別の態様では、本発明は、上記の植物細胞、植物種子、植物体または植物組織によって生成される１個以上の植物油または脂肪酸に関する。
【００１２】
なおさらなる別の態様では、本発明は、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列によってコードされる精製されたポリペプチドに関する。
【００１３】
なおさらなる別の態様では、本発明は、２０個の炭素長であるポリ不飽和脂肪酸（Ｃ２０−ＰＵＦＡ）基質をその基質の炭素原子８と炭素原子９の間で非飽和化し、配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％のアミノ酸同一性を有する精製されたポリペプチドに関する。
【００１４】
なお別の実施態様では、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチドに関する。
【００１５】
なおさらなる別の実施形態では、本発明は、Δ８−デサチュラーゼ酵素を生成するための方法に関する。この方法は、
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；および
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、上記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ
を含む。
【００１６】
上記の方法では、宿主細胞は真核細胞である。具体的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、トリコデルマ属種およびピチア属種からなる群から選択される真菌細胞である。使用可能である植物細胞の例は、ダイズ、ブラシカ属種、ベニバナ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタおよび亜麻からなる群から選択される。
【００１７】
なおさらなる別の実施態様では、本発明は、
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、上記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；および
ｄ）発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素を、ω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、上記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、ポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【００１８】
上記の方法では、生成物のポリ不飽和脂肪酸は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１９】
さらに、上記の方法は、
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼにまたはエロンガーゼに曝露して、生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたは追加のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
をさらに含むことができる。生成物のポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）もしくはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２０】
なお別の態様では、本発明は、
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）上記ｂ）の発現ベクター、およびデルタ−９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの調節配列に作動的に連結された、単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加の組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ；
ｄ）発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素およびデルタ−９エロンガーゼを、リノール酸（ＬＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、上記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、宿主細胞においてポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【００２１】
上記の方法において、生成物のポリ不飽和脂肪酸は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）もしくはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２２】
さらに、上記の方法は、
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼにまたはエロンガーゼに曝露して、生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたは追加のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
をさらに含むことができる。生成された生成物のポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２３】
上記の方法では、宿主細胞は真核細胞である。具体的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、トリコデルマ属種およびピチア属種からなる群から選択される真菌細胞である。使用可能な植物細胞の例は、ダイズ、ブラシカ属種、ベニバナ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタおよび亜麻からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】脂肪酸の生合成経路およびこの経路におけるΔ８−デサチュラーゼの役割を示す図である。
【図２Ａ】パブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）ＣＣＭＰ ４５９（配列番号２）、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）（配列番号３）、ユーグレナ・グラシアリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）（配列番号１）およびパーキンサス（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ）（配列番号４）由来の既知のΔ８−デサチュラーゼを用いてＥＤ３−８（配列番号２９）によってコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。同一の残基は強調され、保存されたヒスチジン−ボックスは下線を引かれ、シトクロームｂ５ドメインにおける保存領域は下線を引かれる（二重線）。
【図２Ｂ】パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（配列番号２）、パブロバ・サリナ（配列番号３）、ユーグレナ・グラシアリス（配列番号１）およびパーキンサス（配列番号４）由来の既知のΔ８−デサチュラーゼを用いてＥＤ３−８（配列番号２９）によってコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。同一の残基は強調され、保存されたヒスチジン−ボックスは下線を引かれ、シトクロームｂ５ドメインにおける保存領域は下線を引かれる（二重線）。
【図３Ａ】ユーグレナ・グラシアリス（受託番号ＡＦ１３９７２０、配列番号１）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｂ】パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（配列番号２）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ａ】パブロバ・サリナ（受託番号ＤＱ９９５５１８、配列番号３）由来のΔ８−デサチュラーゼアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ｂ】パーキンサス・マリヌス（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）（受託番号ＤＱ５０８７３０、配列番号４）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ｃ】アカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｎｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ）（受託番号＃ＣＳ６０８４８３、配列番号５）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８のＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す図である。
【図６】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８の推定アミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図７Ａ】実施例２に記載されている得られたクローンＰＫ１５のＤＮＡ配列（配列番号１５）を示す図である。
【図７Ｂ】実施例２に記載されている得られたクローンＰＫ１５のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。
【図８Ａ】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８の推定３’末端のＤＮＡ配列（配列番号２４）を示す図である。
【図８Ｂ】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８の推定３’末端のアミノ酸配列（出現の順にそれぞれ配列番号２５および４４−４６）を示す図である。
【図９】エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼの１２５４塩基対の遺伝子配列（配列番号２８）を示す図である。
【図１０】エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼの１２５４塩基対の遺伝子配列（配列番号２８）によってコードされる４１７個のアミノ酸のタンパク質（配列番号２９）を示す図である。
【図１１】エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼのコドン最適化された遺伝子配列（配列番号３０）を示す図であり、「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」と称する。ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣは、もとのＥＤ３−８遺伝子配列（配列番号２８；図９）と６６．９８％の配列同一性を共有する。コドン最適化された遺伝子の修飾は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２９；図１０）を変化させなかった。
【図１２】イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（ＩｓｏＤ９）（受託番号ＣＱ８３１４２２、配列番号３１）由来のΔ９−エロンガーゼの遺伝子配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な記述）
本発明は、エミリアナ（Ｅｍｉｌｉａｎａ）属種、例えば、エミリアナ・ハクスレイ、具体的には、エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド（例えば、遺伝子）配列および翻訳されたアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、上記遺伝子およびこの遺伝子によってコードされる酵素の使用を含む。例えば、ヌクレオチドおよび対応する酵素は、医薬組成物、栄養組成物、および他の有用な製品に添加することができるポリ不飽和脂肪酸、例えば、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ＥＴＡ ＤＰＡおよびＤＨＡまたはそれらの任意の組み合わせの生成に使用されてもよい。
【００２６】
Ａ．定義
本明細書で使用するとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明らかにそれ以外を記述していない限り、複数表記を含む。本明細書における数値範囲の引用に関して、その間に介在する各数値は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲６−９の場合、６および９に加えて数値７および８が想定され、範囲６．０−７．０の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に想定される。
【００２７】
ａ）ブラシカ属種
本明細書で使用するとき、語句「ブラシカ属種」とは、ブラシカ・ユンシア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）およびブラシカ・カンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の任意の植物を意味する。
【００２８】
ｂ）キメラ構築物
本明細書で使用するとき、語句「キメラ構築物」とは、ともに本来は天然に見出されない核酸分子の組み合わせを意味する。したがって、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含んでもよいが、本来は天然に見出されるものとは異なったように並べられてもよい。
【００２９】
ｃ）コード配列
本明細書で使用するとき、用語「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列中またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置されたヌクレオチド配列を意味し、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性または翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列が含まれてもよい。
【００３０】
ｄ）コドン最適化
「コドン最適化」とは、遺伝子または核酸分子と関連して使用するとき、宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度を模倣するように設計されたコドンの使用頻度を有する遺伝子または核酸分子を意味する。
【００３１】
ｅ）相補性
本明細書で使用するとき、用語「相補性」とは、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度を意味する。相補性は、１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が、適切な条件下で他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズし、二重らせんを形成する能力を測定することによって決定される。この二重らせんにはアデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に、グアニンが一方の鎖に現れる場合、シトシンが他方に現れる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が増すと、２つのＤＮＡセグメントの鎖間のハイブリッド二重鎖を形成する能力が増す。
【００３２】
ｆ）によってコードされる、ハイブリダイゼーションおよびストリンジェント条件
本明細書で使用するとき、語句「によってコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ここで、ポリペプチド配列またはその部分は、その核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の少なくとも３個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含む。
【００３３】
また、本発明は、ＰＵＦＡデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードし、ストリンジェントな条件下で、配列番号２８もしくは配列番号３０を含むヌクレオチド配列を含むまたはそれに相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズすることができる単離されたヌクレオチド配列を包含する。核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度およびイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングすることができるとき、別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照））。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とする。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズするための適したストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が増すと、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍ値が増す。長さが１００ヌクレオチドより大きなハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、参照）。
【００３４】
典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０から８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオンであり、典型的には約０．０１から１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃という条件となる。また、ストリンジェント条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成されてもよい。低度のストリンジェント条件の例には、３０から３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣから２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の５０から５５℃での洗浄が含まれる。中程度のストリンジェント条件の例には、４０から４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５×ＳＳＣから１×ＳＳＣ中の５５から６０℃での洗浄が含まれる。高度のストリンジェント条件の例には、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ中の６０から６５℃での洗浄が含まれる。
【００３５】
ｇ）エクソン
本明細書で使用するとき、用語「エクソン」とは、転写される遺伝子であり、その遺伝子から生じる成熟メッセンジャーＲＮＡに見出される遺伝子の配列の一部を意味するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部ではない。
【００３６】
ｈ）発現、アンチセンス阻害および共抑制
本明細書で使用するとき、用語「発現」とは、機能的な最終産物の生成を意味する。遺伝子の発現は、その遺伝子の転写、および前駆体または成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を伴う。
【００３７】
本明細書で使用するとき、語句「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「共抑制」とは、同一もしくは実質的に類似の外来または内因性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号参照）。
【００３９】
ｉ）機能的に同等である断片またはサブ断片
用語「機能的に同等である断片またはサブ断片」および「機能的に同等の断片またはサブ断片」とは、本明細書では交換可能に用いられ、その断片またはサブ断片が活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変更しまたはある種の表現型を生じさせる能力が保持されている単離された核酸分子の部分またはサブ配列を意味する。例えば、その断片またはサブ断片は、形質転換された植物において所望の表現型を生じさせるキメラ構築物の設計に用いることができる。キメラ構築物は、その核酸の断片またはサブ断片が活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物のプロモーター配列に対して適切な方向で核酸の断片またはサブ断片を連結させることによって、共抑制またはアンチセンス阻害において使用するために設計され得る。
【００４０】
ｊ）遺伝子、天然の遺伝子およびトランス遺伝子
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸分子を意味し、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）にある調節配列を含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、語句「天然の遺伝子」とは、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を意味する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「トランス遺伝子」とは、形質転換手法によってゲノムに導入された遺伝子を意味する。
【００４３】
ｋ）ゴッシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）属種
本明細書で使用するとき、語句「ゴッシピウム属種」は、ゴッシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ゴッシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴッシピウム・ヘルバケウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、ゴッシピウム・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ゴッシピウム・ヒルスタム・バル・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｖａｒ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ゴッシピウム・ヒルスタム・バル・マリア−ガランテ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｖａｒ ｍａｒｉｅ−ｇａｌａｎｔｅ）、ゴッシピウム ラピデウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｌａｐｉｄｅｕｍ）、ゴッシピウム・ストゥルティアヌム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｔｕｒｔｉａｎｕｍ）、ゴッシピウム・ツベリ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｂｅｒｉ）、ゴッシピウム・ツルベリ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｒｂｅｒｉ）、ゴッシピウム・トメントスム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）またはゴッシピウム・トルメントスム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｏｒｍｅｎｔｏｓｕｍ）の任意の植物を意味する。
【００４４】
ｌ）相同性
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似した」および「実質的に対応する」とは、本明細書では交換可能に使用され、１種以上のヌクレオチド塩基における変化が遺伝子発現を媒介するまたはある種の表現型を生じさせる核酸分子の能力に影響を及ぼさない核酸分子を意味する。また、これらの用語は、初期の未修飾分子と比較して、得られた核酸分子の機能特性を実質的に変更しない１種以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸分子の修飾を意味する。したがって、当業者が認識するように、本発明は特定の例示的な配列よりも多くの配列を包含することが理解される。
【００４５】
ｍ）宿主細胞
本明細書で使用するとき、語句「宿主細胞」とは、本発明の単離された核酸配列またはその断片を含む細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シアノバクテリアおよびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または真核細胞（例えば、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞もしくは哺乳動物細胞）であってもよい。
【００４６】
使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、トリコデルマ属種およびピチア属種である。特に好ましい真菌細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４７】
植物細胞は、単子葉植物の植物細胞または双子葉植物の植物細胞であり得る。特に好ましい植物細胞は、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（例えば、ダイズ）、ブラシカ属種、カーサマス・ティンクトリアス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）Ｌ．（例えば、ベニバナ）、ヘリアンサス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（例えば、ヒマワリ）、ズィー・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（例えば、トウモロコシ）、ゴッシピウム属種およびリナム・ウシタティシムム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（例えば、亜麻）由来である。
【００４８】
ｎ）同一性、配列同一性および配列同一性の割合（同一性％）
本明細書で使用するとき、用語「同一性」または「配列同一性」とは、本明細書では交換可能に使用され、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連して使用される場合、特定の比較ウィンドウと対比して、一致が最大となるように並べられた場合と同じようである２つの配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を意味する。したがって、同一性は、２つのＤＮＡまたはポリペプチドセグメントの同じ鎖（センスまたはアンチセンス）間の類似、一致または同等の程度として定義される。
【００４９】
「配列同一性の割合」または「同一性％」は、特定の領域に対して最適に並べられた２つの配列を比較し、同一塩基が両方の配列において出現する位置の数を決定して、合致した位置の数を得て、このような位置の数を比較されているセグメント内の位置の総数で除し、およびこの結果に１００を掛けることによって計算される。配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法によって、および関連アルゴリズムを実装するコンピュータプログラム（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（インテリジェネティックス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ））、ＢＬＡＳＴ（全米バイオメディカル情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（ジェネティックスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（ウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージリリース７．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０）、ジェネティックスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））によって実行することができる（米国特許第５，９１２，１２０号参照）。配列同一性パーセントの有用な例は、限定されないが、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が含まれる。これらの同一性は、本明細書に記載されているプログラムのいずれかを用いて決定することができる。
【００５０】
ｏ）間接的または直接的に
本明細書で使用するとき、用語「間接的に」は、ポリ不飽和脂肪酸の生成における遺伝子およびその対応する酵素の使用と関連して使用する場合、第１の酸が第１の酵素によって第２の酸（すなわち、経路中間体）に変換され（例えば、Δ９−エロンガーゼによって、例えば、ＬＡからＥＤＡ）、次に、第２の酸が、第２の酵素の使用によって第３の酸に変換される（例えば、Δ８−デサチュラーゼによって、例えば、ＥＤＡからＤＧＬＡ）状況を包含する。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「直接的に」は、ポリ不飽和脂肪酸の生成における遺伝子およびその対応する酵素の使用と関連して使用する場合、この酵素が直接、第１の酸を第２の酸に変換し、ここで、次に第２の酸は組成物において使用される（例えば、Δ９−エロンガーゼによって、例えば、ＬＡからＥＤＡへの変換または例えば、Δ８−デサチュラーゼによって、例えば、ω３−ＥＴｒａからω３−ＥＴＡへの変換）状況を包含する。
【００５２】
ｐ）イントロン
本明細書で使用するとき、用語「イントロン」とは、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子における介在配列を意味する。したがって、このような配列はＲＮＡに転写されるが、その後、切り出され、翻訳されない。また、この用語は切り出されたＲＮＡ配列についても使用される。
【００５３】
ｑ）単離された
本明細書で使用するとき、用語「単離された」とは、当該技術分野において知られている日常的な技術を用いて、天然に存在する環境または供給源から（例えば、細菌、藻、菌類、植物、脊椎動物、哺乳動物などから）取り出される核酸分子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質もしくは生物学的に活性なその部分を意味する。単離された核酸分子またはタンパク質は、天然に存在する環境において核酸分子またはタンパク質を通常伴うまたは相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない。
【００５４】
ｒ）単離された核酸断片または単離された核酸配列
本明細書で使用するとき、語句「単離された核酸断片」または「単離された核酸配列」とは、一本鎖もしくは二本鎖であり、合成のヌクレオチド塩基、天然に存在しないヌクレオチド塩基もしくは変更されたヌクレオチド塩基を含んでもよい、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１個以上のセグメントで構成されてもよい。（特定されたポリヌクレオチドの「断片」は、特定されたヌクレオチド配列の領域と同一であるまたは相補的である、およそ、少なくとも約１０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチドなどの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。）ヌクレオチド（これらの５’−一リン酸エステルの形態で通常見出される）は、以下のようなそれらの一文字記号で表される：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対する）については「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸については「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸については「Ｇ」、ウリジル酸については「Ｕ」、デオキシチミジル酸については「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）については「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）については「Ｙ」、ＧまたはＴについては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴについては「Ｈ」、イノシンについては「Ｉ」、および任意のヌクレオチドについては「Ｎ」である。
【００５５】
ｓ）成熟および前駆体
本明細書で使用するとき、用語「成熟」とは、用語「タンパク質」と関連して使用される場合、翻訳後に処理されたポリペプチド；すなわち、一次翻訳産物に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除かれたものを意味する。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「前駆体」とは、用語「タンパク質」と関連して使用される場合、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物；すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドがなおも存在する一次産物を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは、限定されないが、細胞内局在化シグナルであってもよい。
【００５７】
ｔ）３’非コード配列
本明細書で使用するとき、語句「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置されたＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことによって通常特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０によって例示されている。
【００５８】
ｕ）天然に存在しない
本明細書で使用するとき、語句「天然に存在しない」とは、人工的であり、本来は天然に見出されるものとは一致しないものを意味する。
【００５９】
ｖ）作動的に連結された
本明細書で使用するとき、語句「作動的に連結された」とは、１つの核酸配列の機能が他方によって制御されるように、単一の核酸分子への核酸配列の関連性を意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を制御することができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合にコード配列と作動的に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動的に連結され得る。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側もしくは標的ｍＲＮＡの３’側もしくは標的ｍＲＮＡ内に、直接的または間接的に作動的に連結させることができ、または第１の相補的領域が標的ｍＲＮＡの５’側にあり、その相補体が標的ｍＲＮＡの３’側にある。
【００６０】
ｗ）植物
本明細書で使用するとき、用語「植物」とは、植物体全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子およびその子孫を意味する。植物は、限定されないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む。
【００６１】
ｘ）ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ
本明細書で使用するとき、語句「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、多量の特定ＤＮＡセグメントを合成するための技術を意味し、一連の繰り返しサイクルからなる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，コネチカット州ノーウォーク）。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーが低温でアニーリングし、次に中間温度で伸長する。これらの３つの連続ステップの１セットは１サイクルと呼ばれる。
【００６２】
ＰＣＲは、短期間の鋳型の反復複製によって、数百万倍にＤＮＡを増幅させるために使用される強力な技術である（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第第８４，７９６号；欧州特許出願第２５８，０１７号、欧州特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ，欧州特許出願第２０１，１８４，Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；およびＳａｉｋｉら，米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法は、ＤＮＡ合成を開始するための特定のインビトロで合成されたオリゴヌクレオチドのセットを利用する。プライマーの設計は、分析されることが望まれるＤＮＡの配列に依存する。この技術は、高温で鋳型を融解する多数のサイクル（通常２０から５０回）を通じて行われ、この鋳型内で相補配列にプライマーがアニーリングできるようにし、次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いてこの鋳型を複製する。ＰＣＲ反応の生成物は、アガロースゲルにおける分離、続くエチジウムブロマイド染色、およびＵＶ透光による視覚化によって分析される。あるいは、放射性ｄＮＴＰがＰＣＲに添加され、この生成物に標識を組み込むことができる。この場合において、ＰＣＲの生成物は、ゲルのｘ線フィルムへの曝露によって視覚化される。放射性標識ＰＣＲ生成物のさらなる利点は、個々の増幅生成物のレベルが定量され得るということである。
【００６３】
ｙ）プロモーターおよびエンハンサー
本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節ことができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は、近位な上流エレメントおよびより遠位な上流エレメントからなり、後者のエレメントは、多くの場合、エンハンサーと呼ばれる。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーター固有のエレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増大させるために挿入された異種エレメントであってもよいＤＮＡ配列を意味する。また、プロモーター配列は、遺伝子の転写された部分の範囲内、および／または転写された配列の下流に位置することができる。プロモーターは、天然の遺伝子から全体で誘導されてもよく、または本来見出される異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントで構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指向してもよいことが当業者に理解される。大部分の細胞型において、大部分の時間、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞に有用な種々のタイプの新規なプロモーターは、常に発見されつつある；多数の例がＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２による編集物において見出すことができる。大分部の場合において、調節配列の正確な境界は完全に画定されていないため、ある変異のＤＮＡ分子は同一のプロモーター活性を有する場合があることがさらに認識されている。
【００６５】
ｚ）組換え
本明細書で使用するとき、用語「組換え」とは、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術を用いた核酸の単離されたセグメントの操作によって、配列の２つの別に分離されたセグメントの人工的な組み合わせを意味する。
【００６６】
ａａ）組換え構築物、発現構築物および組換え発現構築物
語句「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」とは、本明細書において交換可能に使用され、当業者に周知な標準的な方法を用いて細胞のゲノムに挿入され得る遺伝物質の機能的単位を意味する。このような構築物はそれ自体で使用されてもよく、またはベクターと連結して使用されてもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターが使用されてもよい。当業者は、本発明の単離された核酸分子分子のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択しおよび増殖させるために、ベクターに存在しなければならない遺伝要素を十分に認識している。また、当業者は、異なる独立した形質転換事象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたらすことを認識し（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６）、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す菌株を得るために、多数の事象がスクリーニングされなければならないことを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
【００６７】
ｂｂ）ＲＮＡ転写物、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、機能性ＲＮＡおよび内因性ＲＮＡ
本明細書で使用するとき、語句「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒されたＤＮＡ配列の転写から得られた生成物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と呼ばれ、またはそれは一次転写物の転写後のプロセッシングから誘導されたＲＮＡ配列であってもよく、これは成熟ＲＮＡと呼ばれる。
【００６８】
本明細書で使用するとき、語句「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを含まないＲＮＡであり、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、酵素の逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは、一本鎖形態であり、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）分子を用いて二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を意味し、細胞内またはインビトロにおいてタンパク質に翻訳することができる。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部もしくは一部に相補的であるＲＮＡ転写物、または標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列と一緒であってもよい。
【００７０】
本明細書で使用するとき、語句「機能性ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが、なおも細胞プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを意味する。
【００７１】
用語「相補体」および「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物に関して、本明細書において交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを画定することが意図される。
【００７２】
本明細書で使用するとき、語句「内因性ＲＮＡ」とは、天然に存在するまたは天然に存在しない、すなわち、組換え手段、突然変異などによって導入されたかどうかに関係なく、本発明の組換え構築物を用いた形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によってコードされる任意のＲＮＡを意味する。
【００７３】
ｃｃ）類似性
本明細書で使用するとき、用語「類似性」とは、２つのアミノ酸配列、タンパク質またはポリペプチド間の「類似性」に言及するときに使用する場合、両方の配列において一連の同一であり、保存されたアミノ酸残基が存在することを意味する。２つのアミノ酸配列間の類似性の度合いが高くなると、２つの配列の一致性、統一性（ｓａｍｅｎｅｓｓ）または同等性が高くなる。
【００７４】
ｄｄ）安定な形質転換、一過性形質転換および形質転換
本明細書で使用するとき、語句「安定な形質転換」とは、核ゲノムおよびオルガネラゲノムの両方を含む宿主生物のゲノムに核酸分子を導入し、遺伝的に安定な遺伝をもたらすことを意味する。
【００７５】
これに対して、「一過性形質転換」とは、核酸分子を宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラに導入し、組み込みまたは安定な遺伝なしに遺伝子発現をもたらすことを意味する。形質転換された核酸分子を含む宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。コメ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換法は、粒子加速または「遺伝子銃」による形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、またはトランス遺伝子を含む適切なＴｉプラスミドを用いるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒介した方法（Ｉｓｈｉｄａ
Ｙ．ら，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「形質転換」とは、安定な形質転換および一過性形質転換の両方を意味する。
【００７７】
ｅｅ）翻訳リーダー配列
本明細書で使用するとき、語句「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列およびコーディング配列間に位置されたＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全に処理されたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼす場合がある。翻訳リーダー配列の例は文献に報告されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３：２２５）。
【００７８】
本明細書において引用された全ての特許、特許公報および優先権書類は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
Ｂ．Δ８−デサチュラーゼ遺伝子およびそれによってコードされる酵素
本発明のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子によってコードされる酵素は、少なくとも２つの不飽和化（二重結合）を有し、および全長２０個の炭素原子またはそれよりも長いポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成において本質的である。具体的には、本発明の酵素は、機能的に活性であり（例えば、Δ８−デサチュラーゼ活性を有する）、それは、この酵素が、長さにして少なくとも２０個の炭素原子を有し、位置Δ９、Δ１２および／またはΔ１５の従前より存在する二重結合である炭素原子番号８（Ｃ８）と炭素原子９（Ｃ９）の間に二重結合を付加することを意味する。図１に示されるように、本発明のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子によってコードされる酵素は、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を介して、２０個またはそれを超える炭素原子の長さを有するＰＵＦＡを生成する。基質、ω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸またはω６−エイコサジエン酸およびω３−エイコサトリエン酸の両方は、この経路において本発明のΔ８−デサチュラーゼによって利用される。
【００８０】
本発明のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子は、エミリアナ属種、すなわち、エミリアナ・ハックスレイ、具体的にはエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から単離された。エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から単離されたΔ８−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、図９および配列番号２８に示されている。推定ヌクレオチド配列の単離されたコドン最適化されたヌクレオチド配列は、図１１および配列番号３０に示されている。単離されたまたは精製されたアミノ酸配列は配列番号２８および配列番号３０の両方によってコードされ、図１０および配列番号２９に示されている。
【００８１】
Δ９−エロンガーゼ酵素およびΔ８−デサチュラーゼ酵素を用いたＬＡのＤＧＬＡへの変換およびＡＬＡのω３−ＥＴＡへの変換は、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路と呼ばれる。ＬＡをＤＧＬＡに変換し、ＡＬＡをω３−ＥＴＡに変換するための従来のΔ６経路は、それぞれＬＡをＧＬＡに変換し、ＡＬＡをＳＤＡに変換するためのΔ６−デサチュラーゼ酵素、ＧＬＡをＤＧＬＡに変換し、ＳＤＡをω３−ＥＴＡに変換するためのΔ６−エロンガーゼ遺伝子を利用する。いずれかの経路において、次に、ＡＲＡまたはＥＰＡの生成は、例えば、Δ５−デサチュラーゼ酵素によって触媒される。例えば、ＤＨＡは、例えば、Ｃ２０−エロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼを用いて、それぞれＥＰＡのω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）への変換、およびω３−ドコサペンタエン酸のＤＨＡへの変換に基づいて生成され得る。
【００８２】
例えば、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ω３−ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡは、ある種の場合において、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路または従来のΔ６経路を介して生成され得るが、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が従来のΔ６経路よりも好ましい場合がある。例えば、特定の残基であるオメガ−６またはオメガ−３脂肪酸中間体、例えば、ＧＬＡまたはＳＤＡがＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ω３−ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡの生成中に所望されない場合、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が、ＧＬＡおよびＳＤＡ形成を迂回するための従来のΔ６経路の代替として使用されてもよい。
【００８３】
上記で検討したように、Δ８−デサチュラーゼは、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路において必要な酵素である。例えば、ＥＰＡは、Δ８−デサチュラーゼ遺伝子およびそれによってコードされる酵素なしに、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を介して合成することはできない。図１に示されるように、本発明の単離されたΔ８−デサチュラーゼ酵素は、例えば、ＥＤＡをＤＧＬＡに変換し、ω３−ＥＴｒＡをω３−ＥＴＡに変換する。次に、ω３−ＥＴｒＡからω３−ＥＴＡの生成、およびω３−ＥＴＡからＥＰＡの生成は、例えば、それぞれΔ８−デサチュラーゼおよびΔ５−デサチュラーゼによって触媒される。代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路の使用の結果として、中間体ＧＬＡおよびＳＤＡ脂肪酸が迂回される。
【００８４】
また、本発明は、配列番号２８（エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来の単離されたΔ８−デサチュラーゼヌクレオチド配列）または配列番号３０（エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来の単離されたコドン最適化されたヌクレオチド配列）を含む、からなる、またはその配列において、少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドに相補的である配列（すなわち、配列番号２８または配列番号３０に配列同一性を有する配列）を有する単離されたまたは精製されたヌクレオチド配列を含む。このような配列は、ヒト供給源、および他のヒト以外の供給源（例えば、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）またはマウス）由来であってもよい。
【００８５】
さらに、本発明はまた、配列番号２８または配列番号３０のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる断片および誘導体を包含する。配列番号２８または配列番号３０由来の断片は、１０から１２５０ヌクレオチド、１０から１０００ヌクレオチド、１０から７５０ヌクレオチド、１０から５００ヌクレオチド、１０から２５０ヌクレオチド、１０から約１００ヌクレオチドまたは１０から約５０ヌクレオチドまたは１５から４０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる長さを有することができる。一態様では、配列番号２８および配列番号３０の断片は、Δ８−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の態様では、配列番号２８および配列番号３０の断片は、プライマーおよびプローブとして用いることができる。プライマーおよびプローブを作製する方法は当業者に周知である。このようなプライマーおよびプローブは、１０から５０ヌクレオチド、好ましくは１５から４０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００８６】
また、配列番号２８および配列番号３０のヌクレオチド配列の改変体が本明細書において意図される。このような改変体は、１種以上の塩基対の付加、置換または欠失を含んでもよいが、ただし、このような付加、置換または欠失は、３つの高度に保存された「ヒツチジン−ボックス」領域のいずれかにおいて、または配列番号２９の５’端に見られるシトクロームｂ５様ドメインにおいて生じない。「ヒスチジン−ボックス」領域およびシトクロームｂ５様ドメインは、配列番号２９のアミノ酸の改変体と関連して、本明細書においてより詳細に検討されている。本発明によって包含されるヌクレオチド改変体の例は、以下の表Ａに示されている。
【００８７】
【表１】
【００８８】
また、本発明は他の供給源由来のヌクレオチド配列を包含し、配列番号２８または配列番号３０に対して上述した相補性または一致性を有する。また、配列番号２８または配列番号３０の機能性同等物（すなわち、Δ８−デサチュラーゼを有する配列）は、本発明によって包含される。
【００８９】
また、本発明は、Δ８−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその断片を包含し、ここで、上記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２９を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。このような配列は、ヒト供給源、および他のヒト以外の供給源（例えば、Ｃ．エレガンスまたはマウス）由来であってもよい。
【００９０】
また、本発明は、長さが少なくとも２０個の炭素原子であり、９位の炭素に不飽和を含み、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性または同一性を有する脂肪酸の炭素原子番号８と炭素原子９の間に二重結合を付加することを介してポリ不飽和脂肪酸を脱飽和する（これはΔ８−脱飽和活性を有することを意味する）単離されたおよび／または精製されたポリペプチドを含む（図１０参照）。具体的には、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチドを含む。
【００９１】
また、配列番号２９の配列を有するポリペプチドの断片が本明細書において意図される。このような断片は、１０から４００個の連続したアミノ酸、１０から３００個の連続したアミノ酸、１０から２００個の連続したアミノ酸ｊ、１０から１００個の連続したアミノ酸、１０から５０個の連続したアミノ酸、１０から４０個の連続したアミノ酸または１０から３０個の連続したアミノ酸、１０から２０個のアミノ酸の長さを有することができる。このような断片は、例えば、抗体の調製における免疫原として使用することができる。あるいは、このような断片は、１種以上のイムノアッセイにおける特定の結合パートナーとして使用することができる。
【００９２】
また、配列番号２９の配列を有するポリペプチドの改変体が本明細書において意図される。このような改変体は、１個以上のアミノ酸の付加、置換または欠失を含んでもよいが、ただし、このような付加、置換または欠失は、３つの高度に保存された「ヒスチジン−ボックス」領域のいずれかにおいて、または配列番号２９の５’端で見られるシトクロームｂ５様ドメインにおいて生じない（図２参照）。ヒスチジン−ボックスは、配列番号２９のアミノ酸の位置１５５から１６０（ＨＤＹＬＨ（配列番号３２））、１９７から２０１（ＨＮＴＨＨ（配列番号３３））および３５５から３５９（ＱＴＥＨＨ（配列番号３４））で見出される。５’端のシトクロームｂ５様ドメインは、保存されたヘム結合ＨＰＧＧモチーフ（配列番号２９のアミノ酸位置３８から４１）を有する（図２参照）。このシトクロームｂ５様ドメインは、長鎖ＰＵＦＡ生成に関与するΔ６−、Δ５−およびΔ４−デサチュラーゼなどの多数の「フロントエンド」メンブレン結合したデサチュラーゼ酵素に見出される（Ｎａｐｉｅｒ ＪＡら，（２００３）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ．６８：１３５−４３参照）。シトクロームｂ５は、デサチュラーゼ反応のプロセス中にこれらの酵素における電子供与体として機能すると考えられ、この領域の破壊は酵素活性の喪失または変化をもたらし得る（Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏら，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：６４１−６４６；Ｇｕｉｌｌｏｕ Ｈ．ら，（２００４）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：３２−４０参照）。本発明によって包含されるアミノ酸改変体の例は、以下の表Ｂに示されている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
Ｃ．Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成
一度、Δ８−デサチュラーゼ酵素をコードする核酸配列（例えば、遺伝子）が単離されおよび／または精製されると、それは、ベクターまたは構築物の使用を介して原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれかに導入することができる。ベクター、例えば、バクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドは、Δ８−デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、および宿主細胞内で機能的であり、上記ヌクレオチド配列によってコードされるΔ８−デサチュラーゼの発現を引き出すことができる任意の調節配列（例えば、プロモーター）を含んでもよい。調節配列は、ヌクレオチド配列と作動的に関連しまたは作動的に連結されている。（調節配列がコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、調節配列はコード配列と「作動的に連結されている」と言われる。）適切なプロモーターの例には、限定されないが、アルコール脱水素酵素、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス極初期、ホエイ酸タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、およびガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター、例えば、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０が挙げられる。さらに、他のタンパク質、酵素（例えば、Δ９−エロンガーゼ）、オリゴ糖、脂質などをコードするヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）などの他の調節配列とともにベクターに含めてもよい。構築物に存在する配列の選択は、所望の発現生成物および宿主細胞の性質に依存する。
【００９５】
上述されるように、一度、ベクターが構築されると、次に、例えばトランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーションを含む、当業者に知られている方法によって選択した宿主細胞に導入され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。その後、宿主細胞は、遺伝子の発現を可能にする適切な条件下で培養され、所望のＰＵＦＡを生成した後、当該技術分野において知られている日常的な技術を用いて回収し、精製される。
【００９６】
適切な原核宿主細胞の例には、限定されないが、エシェリキア・コリ、バチルス・サブチリスなどの細菌、スピルリナ属種（すなわち、藍藻）などのシアノバクテリアが挙げられる。真核細胞は、限定されないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞を含む。真菌細胞は、限定されないが、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、トリコデルマ属種またはピチア属種を含む。特に、真菌細胞は、酵母細胞であってもよく、限定されないが、サッカロミセス属種、カンジダ属種、ハンゼヌラ属種、およびピチア属種が挙げられる。また、酵母は、サッカロミセス・セレビシエであってもよい。植物細胞は、限定されないが、グリシン・マックス（例えば、ダイズ）、ブラシカ属種、カーサマス・ティンクトリアスＬ．（例えば、ベニバナ）、ヘリアンサス・アナス（例えば、ヒマワリ）、ズィー・メイス（例えば、トウモロコシ）、ゴッシピウム属種およびリナム・ウシタティシムム（例えば、亜麻）を含む。
【００９７】
宿主細胞における発現は、一過性または安定的に達成させることができる。一過性発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含むが、複製せず、宿主細胞にほとんど組み込まれない、導入された構築物から生じ得て、または宿主細胞が増殖していない場合に生じ得る。また、一過性発現は、対象遺伝子に作動的に連結された調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって達成され得るが、このような誘導システムは、発現の低い基底レベルをしばしば示す。安定な発現は、宿主ゲノムに組み込むことができるまたは宿主細胞において自律複製する構築物の導入によって達成することができる。対象遺伝子の安定な発現は、発現構築物に配置されたまたは発現構築物を用いてトランスフェクトされた選択マーカーの使用を介して選択された後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。安定的な発現が組み込みに起因する場合、構築物の組み込みの部位は、宿主ゲノム内でランダムに生じ得て、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性の領域を含む構築物の使用を介して標的とすることができる。構築物が内因性遺伝子座に標的とされる場合、転写および翻訳の調節領域の全部または一部は、内因性遺伝子座によって提供することができる。
【００９８】
また、トランスジェニック哺乳動物は、Δ８−デサチュラーゼ酵素を発現させ、最終的に対象とするＰＵＦＡ（単数以上）を発現させるために使用されてもよい。より具体的には、一度、上述した構築物が作製されると、それは胚の前核に挿入されてもよい。次に、胚は、レシピエントの雌に移植されてもよい。あるいは、核導入法もまた利用することができる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７８：２１３０−２１３３（１９７７））。その後、妊娠および出産が可能となる（例えば米国特許第５，７５０，１７６号および米国特許第５，７００，６７１号参照）。続いて、子孫からの乳汁、組織または他の流体物試料は、非トランスジェニック動物に通常見出されるレベルと比較して、変化したレベルのＰＵＦＡを含まなければならない。後続世代は、変化したまたは増加したレベルのＰＵＦＡの生成についてモニターされ、従って、所望のデサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のそれらのゲノムへの組み込みについてモニターされてもよい。宿主として利用される哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびウシであってもよい。しかしながら、任意の哺乳動物は、対象とする酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組み込む能力を有する限り使用され得る。
【００９９】
Δ８−デサチュラーゼポリペプチドの発現に関して、機能的転写および翻訳開始および終端領域は、このデサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に連結される。転写および翻訳開始および終端領域は、種々の非排他的な起源、例えば、発現させようとするＤＮＡ、所望のシステムにおいて発現可能であることが知られているもしくは疑われる遺伝子、発現ベクター、化学合成、または宿主細胞における内因性遺伝子座に由来する。植物組織および／または植物部分における発現は、特に、組織または部分が種子、葉、果実、花、根などの早期回収されるものである場合にある種の効率を示す。発現は、米国特許第５，４６３，１７４号、同第４，９４３，６７４号、同第５，１０６，７３９号、同第５，１７５，０９５号、同第５，４２０，０３４号、同第５，１８８，９５８号、および同第５，５８９，３７９号に記載されている調節配列などの特定の調節配列を利用することによって植物を用いてその位置に標的化され得る。あるいは、発現されるタンパク質は、直接にまたはさらに修飾に応じてのいずれかで、宿主植物から流体物画分に組み込まれ得る生成物を生成する酵素であってもよい。Δ８−デサチュラーゼ遺伝子またはアンチセンスΔ８−デサチュラーゼ転写産物の発現は、植物部分および／または植物組織に見出される特定のＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルを変化させることができる。Δ８−デサチュラーゼポリペプチドのコーディング領域は、それ自体でまたは他の遺伝子（例えば、Δ９−エロンガーゼをコードする遺伝子、Δ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ１７−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ５−エロンガーゼをコードする遺伝子および／またはΔ４−デサチュラーゼをコードする遺伝子）と共に発現させ、より高い比率の所望のＰＵＦＡを含むまたはＰＵＦＡ組成が人乳により酷似している組織および／または植物部分を生成することができる（ＷＯ９５／２４４９４参照）。終端領域は、開始領域が得られた遺伝子の３’領域または異なる遺伝子に由来してもよい。多数の終端領域は、同一および異なる属および種由来の種々の宿主で満足できるものとして知られ、見出されている。終端領域は、任意の特性のためというよりもむしろ便宜上の事項として通常は選択される。
【０１００】
上述のように、植物（例えば、グリシン・マックスまたはブラシカ・ナプス（キャノーラ））または植物組織はまた、Δ８−デサチュラーゼ酵素の発現のためにそれぞれ宿主または宿主細胞として利用し、続いて、ポリ不飽和脂肪酸の生成に利用されてもよい。より具体的には、所望のＰＵＦＡは種子で発現され得る。種子油の分離方法は当該技術分野において知られている。したがって、ＰＵＦＡのための供給源の提供に加えて、Δ８−デサチュラーゼ遺伝子、エロンガーゼ遺伝子（例えば、Δ９−エロンガーゼ、Δ５−エロンガーゼなど）、および他のデサチュラーゼ遺伝子（例えば、Δ５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ４−デサチュラーゼなど）の発現を通じて操作され、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料および化粧品に添加し得る種子油を提供することができる。また、プロモーターに作動的に連結されたΔ８−デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターは、Δ８−デサチュラーゼ遺伝子の発現に十分な時間および条件下で植物組織または植物に導入される。また、このベクターは、他の酵素、例えばΔ４−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ１０−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ１９−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、Δ６−エロンガーゼおよび／もしくはΔ５−エロンガーゼをコードする１種以上の遺伝子を含んでもよい。植物組織または植物は、酵素が作用する関連基質を生成してもよく、またはこのような基質を生成する酵素をコードするベクターが植物組織、植物細胞または植物に導入されてもよい。さらに、基質は、適切な酵素を発現する植物組織に噴霧されてもよい。これらの様々な技術を用いて、当業者は、植物細胞、植物組織または植物の使用によってＰＵＦＡを生成してもよい。本発明はまた、上述したベクターを含むトランスジェニック植物を包含し、ここで、このベクターのヌクレオチド配列の発現は、例えば、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことも留意すべきである。
【０１０１】
単一の植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換された外植片からの植物の再生、発生および培養は当該技術分野において周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（１９８８））。この再生および増殖方法は、典型的には、形質転換された細胞を選択するステップ、通常の胚発生から挿し木苗段階を通じて個別化された細胞を培養するステップを含む。トランスジェニック胚および種子は同様に再生させる。得られたトランスジェニック挿し木苗は、その後、土壌等の適切な植物成長培地において植え付けられる。
【０１０２】
対象とするタンパク質をコードする外来の外因性遺伝子を含む植物の発生または再生は当該技術分野において周知である。好ましくは、再生された植物は、自家受粉させ、同型のトランスジェニック植物を提供する。さもなければ、再生された植物から得られた花粉が、栽培学的に重要な系列の種子成長植物に交配される。逆に言うと、これらの重要系列の植物由来の花粉は、再生された植物に受粉させるために使用される。所望のポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知な方法を用いて栽培される。
【０１０３】
植物組織から植物を再生させるための様々な方法がある。再生の特定の方法は、出発植物組織および再生させようとする特定の植物種に依存する。
【０１０４】
主にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用して双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法は、ワタ（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）；ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、ＭｃＣａｂｅら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３（１９８８），Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））；アブラナ属（米国特許第５，４６３，１７４号）；ピーナッツ（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６），ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））；パパイヤ；およびエンドウ（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について公表されている。
【０１０５】
また、エレクトロポレーション、粒子衝撃およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる単子葉植物の形質転換が報告されている。形質転換および植物再生は、アスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４，（１９８７））；オオムギ（ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７（１９９４））；ズィー・メイス（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４（１９８８），Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８（１９９０），Ｆｒｏｍｍら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３（１９９０），Ｋｏｚｉｅｌら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１；１９４，（１９９３），Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５：５５０−５５７（１９９５））；オート麦（Ｓｏｍｅｒｓら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９（１９９２））；オーチャードグラス（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８８））；コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：３７９，（１９８８）；ＢａｔｔｒａｗおよびＨａｌｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７（１９９１））；ライ麦（Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：２７４（１９８７））；サトウキビ（ＢｏｗｅｒおよびＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２））；ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６９１（１９９２））、および小麦（Ｖａｓｉｌら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号）において達成されている。
【０１０６】
クローニングされた核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のアッセイは、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃により核酸分子を植物細胞に導入することによって開発されつつある（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ ６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【０１０７】
一過性発現システムは、遺伝子構築物を機能的に分析するために用いられてもよい（一般にはＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。本発明の核酸分子のいずれかは、ベクター、プロモーター、エンハンサーなどの他の遺伝子エレメントと共に永久的にまたは一過性に植物細胞に導入可能であることが理解される。
【０１０８】
上記で検討された方法に加えて、実施者は、巨大分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離、組換え生物の作成ならびにクローンのスクリーニングおよび単離のための特定の条件および手法を記載している標準的な資料に精通している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。
【０１０９】
上記を考慮すると、本発明はまた、Δ８−デサチュラーゼ酵素を生成するための方法を包含する。このような方法は、１）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；２）上記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップ；および３）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で上記ベクターを宿主細胞に導入するステップを含む。
【０１１０】
また、本発明は、ポリ不飽和脂肪酸を生成する方法を包含する。一態様において、この方法は、１）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；２）調節配列に作動的に連結された、ステップ１）の単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；３）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下でこの発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；および４）発現したΔ８−デサチュラーゼ酵素をω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸またはω６−エイコサジエン酸およびω３−エイコサトリエン酸の両方からなる群から選択される基質に曝露し、この基質を第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換することを伴う。この方法によって生成され得る第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸の例は、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡまたはＤＬＧＡおよびω３−ＥＴＡの両方である。さらに、この方法は、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼまたは少なくとも１つのエロンガーゼに曝露するステップ、必要に応じて、このステップ（すなわち、第２または続く生成物のポリ不飽和脂肪酸を（以前に使用された任意のデサチュラーゼまたはエロンガーゼと同一であるまたは異なっていてもよい）デサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露するステップ）を繰り返して、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ＤＧＬＡおよび／またはω３−ＥＴＡ）を第２または続く（例えば、第３、第４、第５、第６など）生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップをさらに伴うことができる。このステップは、所望の生成物のポリ不飽和脂肪酸が得られるまで必要に応じて何度でも繰り返すことができる。例えば、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸がＤＧＬＡである場合、この方法はＡＲＡ（第２の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに曝露することをさらに含んでもよい。場合により、次に、ＡＲＡはＥＰＡ（第３の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにΔ１７−デサチュラーゼに曝露されてもよい。なおさらに場合により、ＥＰＡはＤＰＡ（第４の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにΔ５−エロンガーゼに曝露されてもよい。なおさらに場合により、ＤＰＡはＤＨＡ（第５の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにΔ４−デサチュラーゼに曝露されてもよい。
【０１１１】
別の態様において、この方法は、１）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；２）調節配列に作動的に連結された、単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；３）２）の発現ベクター、およびΔ９−エロンガーゼ（例えば、Δ９−エロンガーゼをコードする単離されたヌクレオチド配列について報告する米国特許出願公開第２００８／０２１４６６７参照）をコードする少なくとも１つの調節配列に作動的に連結された、単離された塩基配列を含む少なくとも１つの追加の組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ；および４）曝露されたΔ８−デサチュラーゼ酵素およびΔ９−エロンガーゼをＬＡ、ＡＬＡまたはＬＡおよびＡＬＡからなる群から選択される基質に曝露し、この基質を第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換することを伴う。この方法によって生成され得る第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸の例は、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡまたはＤＧＬＡおよびω３−ＥＴＡの両方である。さらに、この方法は、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼまたは少なくとも１つのエロンガーゼに曝露し、このステップ（すなわち、第２または続く生成物のポリ不飽和脂肪酸を（以前に使用された任意のデサチュラーゼまたはエロンガーゼと同一であるまたは異なっていてもよい）デサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露すること）を繰り返して、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ＤＧＬＡおよび／またはω３−ＥＴＡ）を第２または続く（例えば、第３、第４、第５、第６など）生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップを伴ってもよい。このステップは、所望の生成物のポリ不飽和脂肪酸が得られるまで必要に応じて何度でも繰り返すことができる。例えば、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸がＤＧＬＡである場合、この方法はＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに曝露し、ＡＲＡ（第２の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することをさらに含むことができる。必要に応じて、次に、ＡＲＡはΔ１７−デサチュラーゼに曝露され、ＥＰＡ（第３の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することができる。なおさらに必要に応じて、ＥＰＡはΔ５−エロンガーゼに曝露されて、ＤＰＡ（第４の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することができる。なおさらに必要に応じて、ＤＰＡはΔ４−デサチュラーゼに曝露され、ＤＨＡ（第５の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することができる。
【０１１２】
したがって、上記によって例示されるように、本発明のΔ８−デサチュラーゼは、ポリ不飽和脂肪酸の生成に使用され、続いて、特定の有益な目的のために使用されてもよく、または他のポリ不飽和脂肪酸の生成に使用されてもよい。
【０１１３】
Ｄ．Δ８−デサチュラーゼ遺伝子の使用
上述のように、単離されたΔ８−デサチュラーゼ遺伝子およびそれによってコードされるΔ８−デサチュラーゼ酵素は多数の用途を有する。例えば、この遺伝子および対応する酵素は、ポリ不飽和脂肪酸の生成に間接的にまたは直接的に使用されてもよく、例えば、Δ８−デサチュラーゼはＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ω３−ＥＴＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡの生成に使用されてもよい。これらのポリ不飽和脂肪酸（すなわち、Δ８−デサチュラーゼ酵素の活性によって直接的または間接的に生成されるもの）は、例えば、栄養組成物、医薬組成物、化粧品および動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に包含される。これらの用途は以下に詳細に記載されている。
【０１１４】
Ｅ．栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。このような組成物は、本発明の目的では、生体内に取込まれると、（ａ）組織に栄養分を与えもしくは強化しまたはエネルギーを供給するように役割を果たし、および／または（ｂ）十分な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持する、腸内または非経口的な消費を含むヒト消費用の任意の食物または調製物を含む。
【０１１５】
本発明の栄養組成物は、本発明に従って、本明細書に記載されているΔ８−デサチュラーゼ遺伝子の使用によって直接的にまたは間接的に生成された少なくとも１つの油または酸を含み、固体形態または液体形態であってもよい。さらに、この組成物は特定用途に望まれる量の食用多量養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。このような成分の量は、組成物がある種の代謝状態（例えば、代謝異常）を伴うものなどの特殊な必要性を有する、正常な健常の乳児、幼児または成人に使用することが意図されるのかどうかに依存して変化する。
【０１１６】
組成物に添加されてもよい主要栄養素の例には、限定されないが、食用脂、糖質およびタンパク質が挙げられる。このような食用脂の例には、限定されないが、ココナッツオイル、ダイズ油、モノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。このような糖質の例には、限定されないが、グルコース、食用ラクトースおよび加水分解されたデンプンが挙げられる。さらに、本発明の栄養組成物に利用可能なタンパク質の例には、限定されないが、ダイズタンパク質、電気透析されたホエイ、電気透析されたスキムミルク、乳清またはこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられる。
【０１１７】
ビタミンおよびミネラルに関して、下記：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、ビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ複合体が、本発明の栄養組成物に添加されてもよい。他のこのようなビタミンおよびミネラルもまた添加されてもよい。
【０１１８】
本発明の栄養組成物に利用される成分は半精製されたまたは精製されたものである。半精製または精製とは、天然材料の精製によってまたは合成によって調製された材料を意味する。
【０１１９】
本発明の栄養組成物の例は、限定されないが、乳児用調製物、栄養補助食品、栄養代用食品および再水和組成物が挙げられる。特に対象とする栄養組成物は、限定されないが、乳児用の腸内および非経口補給剤、特殊乳児用調製物、高齢者用補給剤、および胃腸障害および／または吸収不良のある者のための補給剤が挙げられる。
【０１２０】
また、本発明の栄養組成物は、食事の補給が必要とされない場合でさえも食品に添加することができる。例えば、この組成物は、任意の種類の食品に添加されてもよく、例えば、限定されないが、マーガリン、調製バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、菓子、サラダ油、調理用油、調理用油、肉類、魚および飲料が挙げられる。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態では、栄養組成物は経腸栄養製品であり、成人または小児の経腸栄養製品がより好ましい。この組成物は、慢性または急性の疾患状態によりストレスを受けたまたは特殊処置を必要とする成人または小児に投与されてもよい。組成物は、本発明に従って製造されるポリ不飽和脂肪酸に加えて、上記のような主要栄養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。主要栄養素は、人乳に含まれるものと同等な量またはエネルギー基準、すなわちカロリー当たりの基準で存在されてもよい。
【０１２２】
液体または固体の経腸および非経口栄養製剤を処方する方法は当該技術分野において周知である。
【０１２３】
経腸製剤は、例えば、滅菌され、その後、即時使用（ＲＴＦ）ベースで利用されてもよく、または濃縮液体もしくは粉末で保存されてもよい。粉末は、前述の通りに調製された製剤を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和により再構成することによって調製することができる。成人および小児栄養製剤は当該技術分野において周知であり、市販されている（例えば、Ｒｏｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，オハイオ州コロンバスのＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明に従って生成された油または酸は、これらの製剤のいずれかに添加されてもよい。
【０１２４】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態である場合、約０．６Ｋｃａｌ／ｍｌから約３Ｋｃａｌ／ｍｌの範囲であってもよい。固体または粉末の形態の場合、栄養補給剤は、約１．２から９Ｋｃａｌ／ｇを超え、好ましくは約３から７Ｋｃａｌ／ｇを含むことができる。一般に、液体製品の浸透圧は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満でなければならない。
【０１２５】
栄養製剤は、本発明に従って製造されたＰＵＦＡに加えて、上述される主要栄養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。これらの追加成分の存在は、個体がこれらの要素を毎日最小必要量を摂取することを助ける。ＰＵＦＡ供給に加えて、亜鉛、銅、葉酸および酸化防止剤をこの組成物に添加することが望まれる場合もある。これらの物質は、ストレス下にある免疫システムを強化し、したがって、組成物を受ける個体にさらなる利益を与えると考えられる。また、医薬組成物がこれらの成分で補足されてもよい。
【０１２６】
より好ましい実施形態では、栄養組成物は、酸化防止剤および少なくとも１つのＰＵＦＡに加えて、糖質供給源を含み、ここで、糖質の少なくとも５重量％は消化しにくいオリゴ糖である。より好ましい実施形態では、栄養組成物はタンパク質、タウリンおよびカルニチンをさらに含む。
【０１２７】
上述のように、本発明に従って製造されたＰＵＦＡまたはその誘導体は、静脈内栄養補給を受けている患者に対して、または栄養不良もしくは他の状態もしくは疾患状態の予防または治療のために栄養代用食品または栄養補助食品、特に乳児用調製剤に添加され得る。背景として、人乳は、ＤＨＡとして約０．１５％から約０．３６％、ＥＰＡとして約０．０３％から約０．１３％、ＡＲＡとして約０．３０％から約０．８８％、ＤＧＬＡとして約０．２２％から約０．６７％、およびＧＬＡとして約０．２７％から約１．０４％を含む脂肪酸プロファイルを有することに留意すべきである。したがって、本発明に従って製造されるＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡなどの脂肪酸は、例えば、人乳のＰＵＦＡ含有量を良好に再現し、ヒト以外の哺乳動物の母乳に通常見出されるＰＵＦＡの存在を変えるために使用することができる。特に、薬理学的補給剤または食品補給剤、特に母乳代用剤または補給剤において使用するための組成は、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡおよびＤＨＡの１種以上を含むことが好ましい。より好ましくは、この油は、約０．３から３０％のＡＲＡ、および約０．２から３０％のＤＧＬＡを含む。
【０１２８】
トリグリセリドとして計算された約２から約３０重量％の脂肪酸を含む非経口医薬組成物は本発明によって包含される。他のビタミン、特に脂溶性ビタミン、例えば、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＬ−カルニチンが必要に応じて含まれてもよい。所望により、アルファ−トコフェロールなどの防腐剤は約０．１重量％で添加されてもよい。
【０１２９】
さらに、ＡＲＡとＤＧＬＡの比は、特別な所定の最終用途に適合させることができる。母乳補給剤または代用剤として処方される場合、ＡＲＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの１種以上を含む組成物は、それぞれ約１：１９：３０から約６：１：０．２の比で提供される。例えば、動物の母乳は、１：１９：３０から６：１：０．２の範囲のＡＲＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡの比で変化することができ、約１：１：１、１：２：１、１：１：４である中間比を含むことが好ましい。宿主細胞においてともに製造される場合、ＥＤＡおよびＤＧＬＡなどの前駆体基質からＡＲＡへの変換率は、ＰＵＦＡ比を厳密に制御するために使用され得る。例えば、ＤＧＬＡからＡＲＡへの５％から１０％の変換率は、約１：１９のＡＲＡ：ＤＧＬＡ比を生成するために用いることができ、一方、約７５％から８０％の変換率は、約６：１のＡＲＡ：ＤＧＬＡ比を生じさせるために用いることができる。したがって、細胞培養システムにおいてまたは宿主動物においてであるかに関係なく、デサチュラーゼ発現の時期、程度および特異性の制御、ならびにエロンガーゼ（例えば、限定されないがΔ９エロンガーゼなど）および他のデサチュラーゼの発現を制御することは、ＰＵＦＡレベルおよび比を調節するために用いることができる。次に、本発明に従って生成されるＰＵＦＡ／酸（例えばＡＲＡおよびＥＰＡ）は、所望濃度および比で他のＰＵＦＡ／酸（例えばＧＬＡ）と組み合わせてもよい。
【０１３０】
さらに、本発明に従って製造されたＰＵＦＡまたはこれらを含む宿主細胞はまた、動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物消費のために望まれるもう１つのものに変えるために動物の飼料補給剤として使用されてもよい。
【０１３１】
本発明に従って生成されたポリ不飽和脂肪酸を使用する栄養補給剤、乳児用調製剤、栄養代用剤および他の栄養溶液の例は、以下に記載されている。
【０１３２】
Ｉ．乳児用調製剤
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄分配合ダイズフォーミュラ：
用途：牛乳に対するアレルギーまたは感受性を有する乳児、幼児および成人用飲料として。ラクトースが避けなければならない障害：ラクターゼ欠乏症、ラクトース不耐症およびガラクトース血症の患者のための食事。
【０１３３】
特徴：
−牛乳タンパク質のアレルギーまたは感受性の症状を避けるためのダイズタンパク質単離体。
−ラクトースに関連した下痢を避けるためのラクトース不含製剤。
−低浸透圧（２００ｍＯｓ／ｋｇ水）。
−吸収を最大にし、吸収不良の危険を最小にするように設計された二重糖質（コーンシロップとショ糖）。
【０１３４】
成分：４３．２％コーンシロップ固体、１４．６％ダイズタンパク質単離体、１１．５％高オレイン酸ベニバナ油、１０．３％糖（ショ糖）、８．４％ダイズ油、８．１％ココナッツ油：２％未満のリン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、アスコルビン酸、塩化コリン、Ｌ−メチオニン、タウリン、パルミチン酸アスコルビル、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、混合トコフェロール、硫酸亜鉛、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、ヨウ化カリウム、水酸化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ベータ−カロチン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３５】
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ下痢用ダイズフォーミュラ：
用途：乳幼児の下痢の食事管理用
特徴：
−特に下痢管理用としてダイズ繊維からの添加された食物繊維を含む最初の乳児用調製剤。
−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に示された。
−ラクトースに関連した下痢を避けるためのラクトース不含処方。
−浸透圧性下痢の危険性を減らすための低浸透圧（２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）
成分：８５．７％水、４．８％コーンシロップ、２．６％糖（ショ糖）、２．１％ダイズ油、２．０％ダイズタンパク質単離物、１．４％ココナッツ油、０．７７％ダイズ繊維、クエン酸カルシウム、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、モノグリセリドおよびジグリセリド、ダイズレシチン、塩化マグネシウム、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３６】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）鉄分配合ショ糖フォーミュラ
用途：牛乳に対するアレルギーもしくは感受性を有する乳児、幼児および成人用飲料として。ラクトースが避けなければならない障害：ラクターゼ欠乏症、ラクトース不耐症およびガラクトース血症の患者のための食事。
【０１３７】
特徴：
−精神的および視覚的発育に重要である母乳に見られるＤＨＡおよびＡＲＡの２つの栄養素を含む。
−牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を避けるためのダイズタンパク質単離物。
−ラクトースに関連した下痢を避けるためのラクトース不含処方。
−低浸透圧（２００ｍＯｓ／ｋｇ水）。
−吸収を最大にし、吸収不良の危険性を最小にするように設計された二重糖質（コーンシロップおよびショ糖）。
成分：４３．２％コーンシロップ固体、１４．６％ダイズタンパク質単離物、１１．５％高オレイン酸ベニバナ油、１０．３％糖（ショ糖）、８．４％ダイズ油、７．７％ココナッツ油、Ｃ．コーニイ（ｃｏｈｎｉｉ）油、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）油、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、アスコルビン酸、塩化コリン、Ｌ−メチオニン、タウリン、パルミチン酸アスコルビル、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、混合トコフェロール、硫酸亜鉛、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、ヨウ化カリウム、水酸化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ベータ−カロチン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３８】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）２０即時使用の鉄分配合ダイズフォーミュラ、２０Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ．：
用途：ダイズ摂取が望まれる場合。
【０１３９】
成分：８５．９％水、６．７％コーンシロップ、１．９％ ダイズタンパク質単離体、１．４％高オレイン酸ベニバナ油、１．３％糖（ショ糖）、１．１％ダイズ油、１．０％ココナッツ油、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、モノグリセリドおよびジグリセリド ジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、アルコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１４０】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用フォーミュラ：
用途：乳児用フォーミュラが必要とされる場合：１歳未満で授乳の中断を決定した場合、授乳の補完が必要な場合、または授乳を採用しない際の日常食。粉末、濃縮液および即時使用の形態。
【０１４１】
成分：水、脱脂乳、ラクトース、高オレイン酸ベニバナ油、ダイズ油、ココナッツ油、ホエイタンパク質濃縮物、クエン酸カリウム、炭酸カルシウム、アルコルビン酸、ダイズレシチン、モノグリセリド、カラゲナン、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化コリン、酒石酸水素コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、パントテン酸カルシウム、ｌ-カルニチン、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、ベータ−カロチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、シアノコバラミン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、水酸化カリウムおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４２】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）鉄分配合乳児用フォーミュラ
用途：授乳の補給または代替としての使用。粉末、濃縮液および即時使用の形態。
【０１４３】
成分：水、脱脂乳、ラクトース、高オレイン酸ベニバナ油、ダイズ油、ココナッツ油、ホエイタンパク質濃縮物、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、クエン酸カリウム、炭酸カルシウム、アルコルビン酸、ダイズレシチン、モノグリセリド、カラゲナン、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化コリン、酒石酸水素コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、パントテン酸カルシウム、ｌ−カルニチン、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、ベータ−カロチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、シアノコバラミン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、水酸化カリウムおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−
モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４４】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＳｕｒｅ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）鉄分配合乳児用フォーミュラ
用途：早熟などの状態のための特殊フォーミュラ
特徴：
−２５％添加された中位鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）を含む十分に吸収される脂肪混和物。
−標準項式よりも高いレベルの１００Ｃａｌあたりのタンパク質、ビタミンおよびミネラル。
−標準項式よりも多くのカルシウムおよびリン。
成分：脱脂乳、コーンシロップ固体、ラクトース、ダイズ油、高オレイン酸ベニバナ油、ホエイタンパク質濃縮物、中位鎖トリグリセリド、ココナッツ油、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム、ｍ−イノシトール、アルコルビン酸、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、タウリン、硫酸第一鉄、酒石酸水素コリン、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、混合トコフェロール、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、クエン酸ナトリウム、ナイアシンアミド、リン酸カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、ベータカロチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、シアノコバラミンおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４５】
Ｈ．Ｓｉｍｉｌａｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃａｒｅ Ａｄｖａｎｃｅ即時使用の低鉄分人乳強化剤、２４Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ．：
用途：低出生体重の乳児に対して、人乳と混合されるようにまたは人乳の代替として与えられるように設計される。
【０１４６】
成分：水、脱脂乳、コーンシロップ固体、ラクトース、中位鎖トリグリセリド、ホエイタンパク質濃縮物、ダイズ油、ココナッツ油、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、アルコルビン酸、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、ダイズレシチン、モノグリセリドおよびジグリセリド、ｍ−イノシトール、クエン酸ナトリウム、カラゲナン、酒石酸水素コリン、タウリン、塩化コリン、ナイアシンアミド、酢酸ｄ−アルファトコフェリル、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、塩化カリウム、二塩基性リン酸カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、ベータカロチン、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム、シアノコバラミンおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−
モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４７】
本発明の様々なＰＵＦＡは、上記の乳児用フォーミュラおよび当該技術分野において知られている他の乳児用フォーミュラに代えておよび／またはそれに添加することができる。
【０１４８】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：濃厚でクリーミーな味のＥＮＳＵＲＥは、食間または食事とともに補助的に使用するため、および一時的な唯一の供給源を提供するための完全なバランスのとれた栄養素の供給源を提供する。ＥＮＳＵＲＥは、栄養の危険にある、意図的でない体重減少を経験した、病気もしくは外科的処置から回復した、または変更されたもしくは低残渣の食事を取っている者に恩恵を与えることができる。経口的食事を目的とする。一時的な単独供給源の提供を目的とする。補助的経口栄養素成分のための小売用製品。
【０１４９】
成分：水、糖（ショ糖）、コーンマルトデキストリン、ミルクタンパク質単離物、ダイズ油、コーン油、菜種油、ダイズタンパク質濃縮物、クエン酸カリウム、天然および人工的なフレーバー、リン酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、ダイズレシチン、リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化コリン、カラギナン、アルコルビン酸、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ヨウ化カリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５０】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、食事に特別なタンパク質および栄養素を必要とする者に有用である。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、一般の外科的処置または股関節もしくは他の骨の骨折から回復中の者による使用に適し、床擦れであるまたは床擦れの危険にある者のための栄養素の良好な供給源である。補助的経口栄養素を目的とする。
【０１５１】
成分：水、糖（ショ糖）、コーンマルトデキストリン、カゼインカルシウムおよびカゼインナトリウム、ダイズ油、ダイズタンパク質単離物、コーン油、クエン酸カリウム、菜種油、リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、人工香味料（塩化ナトリウム）、ダイズレシチン、塩化コリン、アルコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸第一鉄、ジェランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５２】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、患者に健康体重を増加させるまたは維持させるのを助けるために、高カロリーおよびタンパク質を提供する完全なバランスのとれた栄養素の供給源である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、食事とともにもしくは食間または食事の代用として使用することができる。経口的食事を目的とする。一時的な単独供給源の提供を目的とする。水分制限された患者または容量が制限された食事を必要とする患者を対象とする。
【０１５３】
特徴：
−心臓の健康を支持するための６５０ｍｇのオメガ−３脂肪酸ＡＬＡ（１．６ｇ ＲＤＩの４０％）。
−２４種のビタミンおよびミネラルの優れた供給源。
−免疫システムを強化するための抗酸化剤のセレンならびにビタミンＣおよびＥの供給源。
−コレステロールの低下。
−コーシャー。
−グルテン不含。
−ラクトース不含。
【０１５４】
成分：バニラ：水、コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、コーン油、カゼインナトリウおよびカゼインムカルシウム、糖（ショ糖）、ダイズタンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、ダイズレシチン、天然および人工的なフレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アルコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸アルファ−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０１５５】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成される）は、食事とともにまたは食間での補助的使用のための完全にバランスのとれた栄養素である。ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲは、変更された食事である、栄養素が危険である、意図的でない体重減少を経験した、病気もしくは外科的処置から回復した、または低残渣の食事を取っている者に恩恵を与え得る。
【０１５６】
特徴：
−便利であり、混合が容易である。
−低残渣。
−ラクトースおよびグルテン不含。
成分：コーンシロップ、コーンマルトデキストリン、糖（ショ糖）、コーン油、カゼインナトリウムおよびカルシウム、ダイズタンパク質単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、塩化カリウム、ダイズレシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０１５７】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、他の菓子またはデザートの栄養素代替物である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、美味しく食べやすい形態の完全にバランスのとれた栄養素を提供する。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、体重不足もしくは栄養不良である者または水分制限されたもしくは容量がされた食事を取っている者に適している。固さが調節された食事（例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体）を取っている者を対象とする。嚥下障害のある者を対象とする。補助的な経口的栄養素を目的とする。
【０１５８】
特徴：
−２４種の必須ビタミンおよびミネラルの良好な供給源。
−冷凍不要の便利なもの。
−グルテン不含。
−給仕あたり１ｇまたはＦＯＳを含む（ＦＯＳは結腸中の有益細菌の増殖を刺激するプレバイオティックである）。
成分：
バニラ：水、糖（ショ糖）、加工コーンスターチ、部分的に水素化されたダイズ油、ミルクタンパク質濃縮物、脱脂乳、フラクトオリゴ糖、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸第一鉄、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５および＃６、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５９】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＦＩＢＥＲは、食物繊維および栄養素の増加から恩恵を受けることができる者のための完全にバランスのとれた栄養素の供給源である。ＦＯＳ、プレバイオティックとのファイバーブレンドは、消化管の健康の維持を助ける。ＥＮＳＵＲＥ
ＦＩＢＥＲは、低残渣を必要としない者に適している。ＥＮＳＵＲＥ ＦＩＢＥＲは、経口的にまたは管によって与えることができる。ＥＮＳＵＲＥ ＦＩＢＥＲは、変更された食事である、栄養素が危険である、意図的でない体重減少を経験した、病気もしくは外科的処置から回復した者に恩恵を与え得る。経口的な提供を目的とする。一時的な単独供給源の提供を目的とする。
【０１６０】
特徴：
−１ｇのＦＯＳ／８ｆｌ ｏｚ．を含む。ＦＯＳファイバー（消化されない糖質）は結腸中の自然防御の促進を助ける。
−２４種の必須ビタミンおよびミネラルの優れた供給源。
−８−ｆｌ−ｏｚ給仕あたり２．８ｇの全食物繊維を提供する。
−ラクトースおよびグルテン不含。
【０１６１】
成分：
バニラ：水；コーンマルトデキストリン、糖（ショ糖）、カゼインナトリウムおよびカルシウム、ダイズ油、ダイズタンパク質単離物、コーン油、オート麦繊維、フラクトオリゴ糖、菜種油、ダイズ繊維、リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、ダイズレシチン、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然および人工的なフレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アルコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラギナン、硫酸第一鉄、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１６２】
上記されたおよび当業者に知られている種々の栄養補給剤は、本発明に従って生成されるＰＵＦＡで置換されるおよび／またはＰＵＦＡで補足され得る。
【０１６３】
Ｇ．Ｏｘｅｐａ（商標）栄養製品
Ｏｘｅｐａ（商標）は、重病患者、人工呼吸器を装着した患者における炎症反応を調節することが臨床的に示されている。Ｏｘｅｐａは、敗血症、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）、ＡＬＩ（急性肺障害）またはＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群）を有する患者に適している。管による提供を目的とする。単独供給の栄養素を対象とする。
熱量分布：Ｏｘｅｐａにおける熱量分布は表Ｃに示されている。
【０１６４】
【表３】
【０１６５】
成分：水、カゼインカルシウムおよびカゼインナトリウム、糖（ショ糖）、菜種油、中位鎖トリグリセリド、イワシ油、ルリヂサ油、塩化マグネシウム、リン酸カルシウム、ダイズレシチン、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、アルコルビン酸、リン酸カリウム、天然および人工的なフレーバー、塩化コリン、タウリン、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、Ｌ−カルニチン、塩（塩化ナトリウム）、ジェランガム、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ベータ−カロチン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１６６】
Ｏｘｅｐａ（商標）栄養製品の様々な脂肪酸成分は、本発明に従って生成されるＰＵＦＡで置換されるおよび／またはＰＵＦＡで補足され得る。
【０１６７】
Ｆ．医薬組成物
また、本発明は、本明細書に記載されている方法に従って、１種以上の酸、および本明細書に記載されているΔ８−デサチュラーゼ遺伝子を用いて生成された得られた油を含む医薬組成物を包含する。より具体的には、このような医薬組成物は、１個以上の酸および／または油、ならびに標準的な周知の非毒性の医薬として許容される担体、アジュバントまたはビヒクル、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤または乳化剤、例えば、水／油乳化剤を含んでもよい。この組成物は液体または固体の形態であってもよい。例えば、組成物は、錠剤、カプセル、摂取可能な液体もしくは粉末、注射可能なもしくは局所的軟膏またはクリームの形態であってもよい。適切な流動性は、例えば、分散の場合に必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合がある。このような不活性希釈剤に加えて、組成物はまた、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤および香味剤を含むことができる。
【０１６８】
懸濁液は、活性な化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントまたはこれらの物質の混合物を含んでもよい。
【０１６９】
錠剤およびカプセルなどの固体投薬形態は、当該技術分野において周知である技術を用いて調製され得る。例えば、本発明に従って生成されるＰＵＦＡは、従来の錠剤基剤、例えば、ラクトース、ショ糖、およびコーンスターチを用いて、結合剤、例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン、崩壊剤、例えば、ポテトスターチまたはアルギン酸、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムと組み合わせて錠剤化することができる。カプセルは、これらの賦形剤をゼラチンカプセルに、抗酸化剤および関連ＰＵＦＡ（単数以上）とともに組み込むことによって調製することができる。抗酸化剤およびＰＵＦＡ成分は、上記で示されたガイドラインに適合しなければならない。
【０１７０】
静脈内投与について、本発明に従って生成されたＰＵＦＡまたはその誘導体は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（商標）などの市販製剤に組み込んでもよい。典型的な健常成人の血漿脂肪酸プロファイルは、６．６４から９．４６％のＡＲＡ、１．４５から３．１１％のＤＧＬＡ、および０．０２から０．０８％のＧＬＡである。これらのＰＵＦＡまたはその代謝前駆体は、患者において正常な脂肪酸プロファイルを達成ために単独でまたは他のＰＵＦＡと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分は、単一または多重使用のためのキットの形態で個々に提供されてもよい。特定の脂肪酸の典型的な用量は、０．１ｍｇから２０ｇ（最大１００ｇ）／日であり、１０ｍｇから１、２、５または１０ｇ／日が好ましい。
【０１７１】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路は、例えば、腸内（例えば、経口および直腸）および非経口を含む。例えば、液体製剤は、例えば、経口的にまたは直腸に投与されてもよい。さらに、均一な混合物は水に完全に分散され、滅菌条件下で生理学的に許容される希釈剤、防腐剤、緩衝剤または推進剤と混合し、噴霧または吸入剤を形成することができる。
【０１７２】
投与経路は、当然に所望の効果に依存する。例えば、組成物が、荒れた、乾燥したまたは老化した皮膚の治療、損傷もしくは火傷した皮膚の治療、または疾患もしくは疾病によって影響を受けた皮膚もしくは毛髪の治療に利用される場合、おそらくは局所的に塗布されてもよい。
【０１７３】
患者に投与される組成物の用量は当業者によって決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態などの種々の因子に依存する。
【０１７４】
形態に関して、組成物は、例えば、溶液、分散液、懸濁液、乳化剤または後に再構成される滅菌粉末であってもよい。
【０１７５】
また、本発明は、本明細書に記載される医薬組成物および／または栄養組成物の使用による様々な障害の治療を含む。特に、本発明の組成物は、血管形成後の再狭窄の治療に使用することができる。さらに、炎症、関節リウマチ、喘息および乾癬の症状は、本発明の組成物を用いて治療することができる。また、証拠は、ＰＵＦＡがカルシウム代謝に関与していることを示している；したがって、本発明の組成物は、おそらくは骨粗鬆症および腎臓または尿管結石の治療または予防に利用できる。
【０１７６】
さらに、本発明の組成物は、癌の治療に用いることができる。悪性細胞は、脂肪酸の組成が変化していることが示されている。脂肪酸の添加は、悪性細胞の増殖を遅くし、細胞死を生じさせ、および化学治療剤に対する感受性を増加させることが示されている。さらに、本発明の組成物は、癌を伴う悪液質の治療に有用である場合がある。
【０１７７】
また、本発明の組成物は、糖尿病の治療に使用することができる（例えば、米国特許第４，８２６，８７７号およびＨｏｒｒｏｂｉｎ ＤＦら，（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。脂肪酸代謝および組成の変化が糖尿病動物において示されている。
【０１７８】
さらに、Δ８−デサチュラーゼ酵素の使用により直接的にまたは間接的に生成されたＰＵＦＡを含む本発明の組成物はまた、湿疹の治療、血圧降下、および数学的な試験スコアの改善に使用できる。さらに、本発明の組成物は、血小板凝集、血管拡張の誘導、コレステロールレベルの低下、血管壁平滑筋および線維組織の増殖阻害（Ｂｒｅｎｎｅｒら，（１９７６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、胃腸出血および非ステロイド抗炎症薬の他の副作用（米国特許第４，６６６，７０１号参照）の低減または予防、子宮内膜症および月経前症候群（米国特許第４，７５８，５９２号参照）の予防または治療、ならびにウイルス感染後の筋痛性脳脊髄炎および慢性疲労（米国特許第５，１１６，８７１号参照）の治療に使用することができる。
【０１７９】
本発明の組成物のさらなる使用は、ＡＩＤＳ、多発性硬化症および炎症性皮膚疾患の治療、ならびに健康維持における使用を含む。
【０１８０】
さらに、本発明の組成物は、化粧目的に利用されてもよい。本発明の組成物は、混合物が形成されるように既存の化粧品組成物に添加されてもよく、または単独組成物として使用されてもよい。
【０１８１】
Ｇ．獣医用途
動物はヒトと同じ必要なものおよび状態の多くを経験するため、上記した医薬組成物および栄養組成物は、動物（すなわち、家畜または非家畜）と関連してヒトと同じく利用することができる。例えば、本発明の油または酸は、動物または水産養殖飼料補給物、動物飼料代用物、動物ビタミンまたは動物局所軟膏に利用することができる。
【０１８２】
本発明は、以下の非限定的な実施例の使用によって説明することができる。
【実施例１】
【０１８３】
エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来のΔ８−デサチュラーゼの単離およびｃＤＮＡライブラリー構築のための縮退オリゴヌクレオチドの設計
ある種の海草の脂肪酸組成の分析は、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８において相当量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）（全脂質の４０重量％）を示した（表１参照）。さらに、この生物は、代替の「Δ８−デサチュラーゼ−Δ９−エロンガーゼ」経路の中間物を示し（図１参照）、この経路がこの生物において活性であることを示す。したがって、この生物は、リノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）をエイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）に変換し、またはアルファ−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）をエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３ｎ−３）に変換することができる活性Δ９−エロンガーゼを含み、さらにエイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）をジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）に変換し、またはω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥｔｒＡ、２０：３ｎ−３）をω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）に変換する活性なΔ８−デサチュラーゼを含むことが予測される（図１参照）。
【０１８４】
【表４】
【０１８５】
本研究の目的は、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から予測された全長Δ８−デサチュラーゼ遺伝子を単離し、サッカロミセス・セレビシエにおける発現によってその機能性を変化させることであった。そうするために、標準化されたｃＤＮＡライブラリーがエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８について構築された。エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８の細胞ペレットは、海洋性植物プランクトンのＰｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＭＰ−Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州ウェストブーストベイ）から得た。総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて製造業者の使用説明書により細胞ペレットから精製された。要約すると、凍結された細胞ペレットは、乳鉢および乳棒を用いて液体窒素中で潰され、ＲＬＴ緩衝液（Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ）中に懸濁させ、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒを通過させた。ＲＮＡは、製造業者の使用説明書によりＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムを用いて精製された。
【０１８６】
エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８からの一次ライブラリーおよび標準化されたｃＤＮＡライブラリーは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ウォルサム）によって、彼らの独自の技術を用いて構成された。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔは、第１鎖中のいくつかの独特であり独自のステップを用い、最終的には通常使用される技術と比較して２５から３０％の効率増加となる。その独自の工程中、ＲＮＡは、内部の開始（ｐｒｉｍｉｎｇ）事象を減少または排除するように設計された条件を用いてｓｓＤＮＡに逆転写される。これと特殊化されたサイクルプログラムの組み合わせは、全長クローンの数を増加させる。第２鎖の合成後、次にｃＤＮＡクローンは、１．２ｋｂを超えるサイズで選択され、小さく切断されたｃＤＮＡの選択的なクローニングを減少させる。大きなインサートライブラリーについて、より大きなインサートクローンを増やすために、選択されたインサートサイズは４ｋｂを超える。サイズ選択後、ｃＤＮＡ端が磨かれ、このｃＤＮＡは、レアーカッティング（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｉｎｇ）酵素を用いて消化される。次に、「レアカッター」制限酵素は、この酵素のための部位がｃＤＮＡ開始工程中にクローンに導入され、ｐＡＧＥＮベクターに方向性クローニング用のクローンを調製するために使用される。「レアカッター」は、ｃＤＮＡクローン内で切断するのはおそらく２０回未満であり、したがって、クローンに沿ってランダムな間隔で切断するより一般的な制限酵素を利用する他のｃＤＮＡライブラリー構築プロセスに対して、より多くの全長クローンが得られる。結果物は、レアーカッティング制限酵素から作製された５’平滑部および３’突出部を有するインサートである。このプロセスのため、追加のアダプター連結は、方向性クローニングを確実にするために必要とされない。これは、クローニングプロセスの全体的な効率を改善する。５’アダプターを使用しない方向性クローニングのため、さらに、クローニング中のｃＤＮＡの操作数の減少に起因した形質転換効率を増加させる。一次ｃＤＮＡライブラリーが完成した後、独立したクローンの数、組換えクローンの割合および平均インサートサイズの数について試験される。
【０１８７】
標準化プロセスは、標準ライブラリーを２つの集団に分けることによって開始される。第１の集団は直線化され、ｃＤＮＡかＲＮＡに転写され、ビオチン化されたヌクレオチドを組み込んでいる。第２の集団は、ファージミド生成を介して一本鎖ＤＮＡプラスミドにされる。細胞溶解物中の二本鎖ＤＮＡはＤＮＡｓｅＩを用いて消化される。これは、一本鎖ＤＮＡプレップからの二本鎖ＤＮＡプラスミド汚染を排除する。
【０１８８】
次に、２つの集団が混合され、ｓｓＤＮＡプラスミドからの任意の過剰発現されたクローンは、ビオチン化されたＲＮＡ集団由来のそれらの片方とハイブリダイズする。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔは、ハイブリダイゼーション前にポリ−Ａ領域をプレブロックするためにオリゴｄＴおよびプライマー伸長を用いる。これは、ポリ−ＡクローンとＲＮＡのポリ−Ｕのハイブリダイゼーションを妨げる。ストレプトアビジン／フェノール抽出法を用いて、全てのビオチン化されたハイブリダイズされた対および直線化されたビオチン化されたＲＮＡを取り除き、このようにして、一本鎖の反応性が低い（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）ＤＮＡプラスミドを残す。インサートを含むクローンだけにハイブリダイズするオリゴを用いて、ＤＮＡ合成は二本鎖ｃＤＮＡクローンを再生するために開始される。次に、これらのクローンは細菌に形質転換され、最終的な標準化されたｃＤＮＡライブラリーを作製する。このプロトコールを用いて、力価が２．６×１０７ｃｆｕ／ｍｌである標準化されたｃＤＮＡライブラリーが作製され、得られたコロニーの総数は１．８×１０８であり、平均インサートサイズは１．０５ｋｂであった。
【０１８９】
このライブラリーからΔ８−デサチュラーゼ様の候補物を単離するために、既知のΔ８−デサチュラーゼに存在する保存されたアミノ酸モチーフをコードする縮退オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）が設計された。その後、これらのプライマーは、推定のΔ８−デサチュラーゼにおいてこれらの保存された領域を含むＤＮＡ断片を同定するために、ＰＣＲ反応に用いられた。
【０１９０】
以下の生物由来の既知のΔ８−デサチュラーゼアミノ酸配列がアラインメントおよびプライマーの設計のために使用された：ユーグレナ・グラシアリス（受託番号ＡＦ１３９７２０、配列番号１；図３Ａ）、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（ＷＯ２００７／１２７３８１Ａ２、配列番号２；図３Ｂ）、パブロバ・サリナ（受託番号ＤＱ９９５５１８、配列番号３；図４Ａ）、パーキンサス・マリヌス（受託番号ＤＱ５０８７３０、配列番号４；図４Ｂ）およびアカントアメーバ・カステラーニ（受託番号ＣＳ６０８４８３、配列番号５；図４Ｃ）。
【０１９１】
使用された縮退プライマーは以下の通りであった：
タンパク質モチーフ１：（配列番号３８）：
ＮＨ３−Ｒ Ｄ Ａ Ｔ Ｄ／Ｅ Ａ／Ｑ Ｆ Ｅ／Ｍ Ｓ／Ｖ Ｙ／Ｍ Ｈ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１４（フォワード）（配列番号６）：
５’−ＣＧＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＡＣＧ ＧＡＳ ＳＭＧ ＴＴＣ ＲＷＧ ＫＹＫ ＷＷＳ ＣＡＣ−３‘
このプライマーは、推定シトクロームｂ５ドメインに保存された配列モチーフを含んでいた。
タンパク質モチーフ２：（配列番号３９）：
ＮＨ３−Ｇ Ｗ Ｌ Ａ／Ｓ Ｈ Ｄ Ｙ／Ｉ Ｌ／Ｓ Ｈ Ｈ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１５（フォワード）（配列番号７）：
５’−ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＫＣＫ ＣＡＣ ＧＡＣ ＷＷＣ ＹＹＧ ＣＡＴ ＣＡＣ−３’
このプライマーは「ヒスチジン−ボックス１」を保存した配列モチーフを含んでいた。
タンパク質モチーフ３：（配列番号４０）：
ＮＨ３−Ｗ Ｋ／Ｒ Ａ／Ｌ Ｒ Ｈ Ｎ Ｔ／Ａ Ｈ Ｈ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１６（フォワード）（配列番号８）
５’−ＴＧＧ ＭＲＳ ＳＹＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＡＡＣ ＲＣＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＴＧ ＫＳＣ ＡＧＣ ＡＡＣ−３’
このプライマーは「ヒスチジン−ボックス２」を保存した配列モチーフを含んでいた。
タンパク質モチーフ４：（配列番号４１）：
ＮＨ３−Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ａ／Ｇ Ｉ／Ｖ Ｖ Ｖ Ｆ Ａ Ｔ Ｈ Ｙ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１７（リバース）（配列番号９）
５’−ＡＴＡ ＧＴＧ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＳＡＹ ＳＳＣ ＣＧＴ ＣＳＣ ＧＡＡ −３’
タンパク質モチーフ５：（配列番号４２）：
ＮＨ３−Ｑ Ｉ／Ｔ Ｅ Ｈ Ｈ Ｌ Ｆ Ｐ Ｔ／Ｍ Ｍ Ｐ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１８（リバース）（配列番号１０）
５’−ＧＧＧ ＣＡＴ ＳＲＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＴＣ ＧＲＴ ＣＴＧ−３’
このプライマーは「ヒスチジン−ボックス３」を保存した配列モチーフを含んでいた。
【０１９２】
オリゴヌクレオチド合成のための標準のミックスベース（ＭｉｘＢａｓｅ）はＫ＝Ｇ、Ｔ；Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｓ＝Ｃ、Ｇ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｃ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｂ＝Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔ；Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇ；Ｄ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｘ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔであった。
【実施例２】
【０１９３】
エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼ遺伝子の単離
エミリアナ由来のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、上述した縮退オリゴヌクレオチドの種々の置換体および組み合わせ（実施例１参照）をＰＣＲ反応において使用した。鋳型として標準化されたｃＤＮＡライブラリーから単離された２μｌのプラスミドＤＮＡ、１×ＰＣＲ緩衝液マイナスＭｇＣＬ２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５０ｍＭのＫＣｌ）、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、各々２００μＭのｄＮＴＰ、各々２ｐｍｏｌのプライマーおよびプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０μｌ容積においてＰＣＲ増幅を実施した。９４℃／３分間の初期変性後、（９４℃／３０秒間；５５℃／３０秒間；７２℃／１分間）の３５サイクル、７２℃／５分間の最終伸長のように増幅を実施し、反応を４℃で終了させた。全ＰＣＲ反応生成物を、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、反応生成物を０．８％アガロースゲル上で分離した。適切なサイズのバンド（既知のΔ８−デサチュラーゼに基づく）を、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、これらのＤＮＡ断片を製造業者のプロトコールによりＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンポネント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に入れて形質転換し、クローンの配列を決定した。試験された様々なプライマーセットのうち、既知のΔ８−デサチュラーゼに対して配列類似性を有するＤＮＡ断片を生じさせるための唯一のプライマーの組み合わせは、ＲＯ１７１５およびＲＯ１７１７であった。
【０１９４】
このようにして、以前に単離されたΔ８−デサチュラーゼに配列相同性を示した１つのクローンを単離した。このクローン（ＥＤ３−８）は長さが５３１ｂｐであり、それ由来の推定アミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにおける最高スコアの適合として、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（ＷＯ２００７／１２７３８１Ａ２、配列番号２；図３Ｂ）と６２％のアミノ酸配列同一性を示した。このクローンのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列が示されている（それぞれ配列番号１１および１２；図５および６）。
【０１９５】
ＥＤ３−８断片の５’末端を単離するために、鋳型としてｃＤＮＡライブラリーから精製されたプラスミドＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド（プライマー）：ＲＯ１７２０（配列番号１３）（５’−ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＡＡ Ｇ−３’）およびＲＯ８９９（配列番号１４）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。プライマーＲＯ１７２０は、この推定のΔ８−デサチュラーゼのＥＤ３−８断片に基づいて設計され、プライマーＲＯ８９９はｃＤＮＡライブラリーの調製のために用いられたｐＡＧＥＮベクター由来の配列に対応していた。製造業者の使用説明書により、５０μｌの最終体積に含まれる、各々１０ｐｍｏｌのプライマー、１μｌのＤＮＡ鋳型、１．５μｌの５０ｍＭのＭｇＳＯ４、１×ＰＣＲｘ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５×エンハンサー溶液（最終濃度）、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、および０．５μｌプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅を実施した。試料を９４℃で２分間初期変性させた後、９４℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の３５サイクルを行った。６８℃で７分間による最終伸長サイクルを実施し、その後、反応を４０℃で終了させた。ＰＣＲ断片を０．８％アガロースゲル上で分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。ＤＮＡ断片をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンポネント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れて形質転換し、クローンの配列を決定した。
【０１９６】
クローンＰＫ１５は、既知のΔ８−デサチュラーゼとのアミノ酸配列相同性および「ＡＴＧ」、「Ｍｅｔ」開始コドンに基づく推定Δ８−デサチュラーゼの５’末端を含むことが同定された６９２ｂｐインサート（配列番号１５；図７Ａ）を含んでいた。推定Δ８−デサチュラーゼの５’端を含むこのＰＫ１５クローンのコードされるアミノ酸配列が示されている（配列番号１６；図７Ｂ）。
【０１９７】
エミリアナ・ハックスレイ由来のこのΔ８−デサチュラーゼの３’末端を単離するために、以下のプライマーを使用した：
フォワードプライマーＲＯ１７１９（配列番号１７）：５’−ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＧＡＴ Ｇ−３’）
または
フォワードプライマーＲＯ１７２４（配列番号１８）：５’−ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＴＴ ＣＧＡ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＣＣＴ−３’
または
フォワードプライマーＲＯ１７２７（配列番号１９）：５’−ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＣＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＣ ＧＧＴ ＧＡＴ Ｃ−３’
および
リバースプライマーＲＯ８９８（配列番号２０）：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’。
【０１９８】
ＲＯ１７１９、ＲＯ１７２４およびＲＯ１７２７は、先に同定されたＥＤ３−８断片の反応に基づいて設計された。ＲＯ８９８は、ｃＤＮＡライブラリー構築物用に使用されたｐＡＧＥＮベクターの配列に基づいて設計し、ｃＤＮＡライブラリーからのΔ８−デサチュラーゼの３’末端をＰＣＲ増幅することが指示された。ＥＤ３−８の５’末端を単離するために記載された条件と同じＰＣＲ条件を使用した。しかしながら、このようにして生じたＰＣＲ産物は、ＥＤ３−８の推定Δ８−デサチュラーゼの３’末端を含んでいなかった。
【０１９９】
また、製造業者の仕様書によりプラチナＴａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ＨＦ）酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを実施し、提供された１×ＨＦ ＰＣＲ緩衝液（最終濃度）、各々１０ｐｍｏｌのプライマー、１μｌのＤＮＡ鋳型、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１μｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ、および０．５μｌのプラチナＴａｑ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を最終体積５０μｌ中で使用した。試料を９４℃で２分間初期変性させた後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で２分間の３０サイクルを行った。６８℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後、反応を４℃にて終了させた。しかしながら、このようにして生じたＰＣＲ産物は、ＥＤ３−８の推定Δ８−デサチュラーゼの３’末端を含んでいなかった。
【０２００】
プライマーＲＯ１７２７およびＲＯ８９８、ならびにＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた最終ＰＣＲ増幅は、製造業者のプロトコールにより実施した。ＰＣＲ反応は、５０μｌの全反応中に２μｌのｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ鋳型、１×最終濃度のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ緩衝液、各々２０ｐｍｏｌのプライマーおよび１μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。試料を９５℃で２分間初期変性させた後、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の３０サイクルを行った。反応を４℃で終了させた。しかしながら、このようにして生じたＰＣＲ産物は、ＥＤ３−８の推定Δ８−デサチュラーゼの３’末端を含んでいなかった。
【０２０１】
次に、推定のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子、ＥＤ３−８の３’末端を単離するために新しい戦略を開始した。ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）を、その３’末端を単離するためにＧｅｎｅＲａｃｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。エミリアナから単離された全ＲＮＡの５μｇを、製造業者の仕様書により第１鎖のｃＤＮＡを生じさせるためにＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＧ（Ｔ）２４−３’（配列番号４３））とともに使用した。
【０２０２】
上記で生じさせたＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、製造業者の仕様書により、３０ｐｍｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ３’プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’（配列番号２２）および推定Δ８−デサチュラーゼ（ＥＤ３−８）に特異的である１０ｐｍｏｌのＲＯ１７２４フォワードプライマー（配列番号１８）を用いて実施した。ＰＣＲ反応は、５０μｌの全反応中に、２μｌのｃＤＮＡ鋳型、１×ＨＦ ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５μｌプラチナＴａｑ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ、および上述されたプライマーを含んでいた。ＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９４℃／２分間の初期変性；９４℃／３０秒間の変性を５サイクル；７２℃／１分間の伸長；９４℃／３０秒間の変性を５サイクル；７０℃／１分間の伸長；９４℃／３０秒の変性を２０サイクル；６５℃／３０秒間の伸長；６５℃／１０分間の最終伸長；４℃で反応終了。ＰＣＲ産物の分析は、非常に微かなバンドを表し、おそらくはｃＤＮＡプールにおける遺伝子の低比率のためである。よって、入れ子ＰＣＲは、鋳型として１μｌの上記で生じさせたＰＣＲ反応、ならびに１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマーＲＯ１７１９（配列番号１７）および１０ｐｍｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ３’入れ子プライマー（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’（配列番号２３））を用いて実施された。ＰＣＲ反応は、ＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ鋳型（上述）を用いて一次反応について記載されたＰＣＲ反応と同一であった。増幅条件は、以下の通りであった：９４℃／２分間の変性；９４℃／３０秒間の変性、６５℃／３０秒間のアニーリング、６８℃／１分間の伸長を２５サイクル；６８℃／１０分間の最終伸長、４℃で反応の終了。０．８％アガロースゲル上のＰＣＲ断片の解析は、明確なバンドの存在を表した。これらを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。ＤＮＡ断片の末端を、Ｔ４ポリメラーゼを用いて補充し、得られた平滑末端の断片をＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンポネント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れて形質転換し、クローンの配列を決定した。配列決定は、既知のΔ８−デサチュラーゼとのアミノ酸配列の相同性、「ＴＡＧ」終止コドンおよびポリＡテールの存在に基づいて、ＥＤ３−８の推定３’末端を含むアミノ酸配列（配列番号２５および４４から４６；図８Ｂ）をコードする５８９ｂｐのインサート（配列番号２４；図８Ａ）を示した。
【０２０３】
推定のΔ８−デサチュラーゼであるＥＤ３−８の全長遺伝子は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって単離された：
ＲＯ１７３６（配列番号２６）：
（フォワード、ＡＴＧ開始コドン（ボールド）およびＥｃｏＲＩクローニング部位（下線）を含む
【０２０４】
【化１】
ＲＯ１７３７（配列番号２７）：
（リバース、ＴＧＡ終止コドン（ボールド）およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（下線）を含む
【０２０５】
【化２】
ＰＣＲ反応に使用された鋳型は、以下の通り、ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、またはエミリアナの標準化されたｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡを含んでいた：
【０２０６】
【表５】
【０２０７】
増幅は以下のように実施された：９５℃／２分間の初期変性；（９５℃／１５秒間の変性；５５℃／３０秒間のアニーリング；６８℃／１．５分間の伸長）を３０サイクル；６８℃／４分間の最終伸長；４℃で反応の終了。ＰＣＲは約１２５４ｂｐの単一なバンドを生じさせ、これは、製造業者のプロトコールによりＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。両方の鋳型は同じサイズのＤＮＡバンドを生じさせた。鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを用いることによって得られたＰＣＲ産物（ＥＤ３−８−ＥＰ２−５）の配列決定は、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ ３７８由来の推定のΔ８−デサチュラーゼの全長１２５４ｂｐの遺伝子配列（配列番号２８；図９）を示し、この遺伝子配列は４１７アミノ酸を含むタンパク質をコードしている（配列番号２９；図１０）。この遺伝子はＥＤ３−８と称され、発現試験のために使用された。
【０２０８】
ＥＤ３−８に加えて、全長遺伝子のある種の領域においていくつかの配列変異を示した追加の改変体クローンは、配列決定中に特定された（表２参照）。これらの改変は、おそらくＰＣＲ増幅の過程中に一般に生じる突然変異によって引き起こされ、使用されるＤＮＡポリメラーゼの低い特異性に起因している。また、これらのクローンは、ｃＤＮＡライブラリーが鋳型として使用される場合（ＥＤ３−８−ＥＰ−Ｘと称される）またはＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡが鋳型として使用される場合（ＥＤ３−８−ＥＲ−Ｘと称される）に得られた。また、これらの遺伝子は、もとのＥＤ３−８クローンについて記載されているように、Δ８−デサチュラーゼ活性について評価された。
【０２０９】
Δ８−デサチュラーゼＥＤ３−８をコードするヌクレオチド配列を、ｐＵＣ５７クローニングベクターにクローニングし、ｐＲＳＰ６１と称した。このベクターは、ブタペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州マナッサス ２０１１０に寄託し、ＡＴＣＣ特許指定番号ＰＴ Ａ−９４７７が付与された。
【０２１０】
【表６】
【０２１１】
Ｂｌａｓｔ解析は、全長遺伝子ＥＤ３−８（配列番号２９）によってコードされるアミノ酸配列が既知のΔ８−デサチュラーゼに最も高いアミノ酸配列相同性を示したことを明らかにした。これれは、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（（配列番号２；図３Ｂ）、パブロバ・サリナ（配列番号３；図４Ａ）、パーキンサス・マリヌス（配列番号４；図４Ｂ）およびユーグレナ・グラシアリス（配列番号１；図３Ａ）由来のΔ８−デサチュラーゼを含んでいた。これは、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９のΔ８−デサチュラーゼに対して最も高い（５２．３％）のアミノ酸配列同一性を示した。また、それは、酵素活性に本質的であることが知られている（Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏら，（２００１）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．５２：１５８１−１５８５；Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏら，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２８：６３６−６３８）、全ての既知の膜結合性デサチュラーゼにおいて見出された３つの保存「ヒスチジンボックス」（Ｏｋｕｌｅｙら，（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１４７−１５８；Ｐｅｒｅｉｒａ ＳＬら，（２００３）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ．６８：９７−１０６）を含んでいた。ＥＤ３−８によってコードされるタンパク質における保存されたヒスチジンボックスは、アミノ酸位置１５５から１６０（ＨＤＹＬＨ（配列番号３２））、１９７から２０１（ＨＮＴＨＨ（配列番号３３））、および３５５から３５９（ＱＴＥＨＨ（配列番号３４））に存在していた（図２参照）。また、この配列は、５’末端にシトクロームｂ５様ドメインを含み、これは保存されたヘム結合ＨＰＧＧモチーフ（アミノ酸位置３８から４１）を有していた（図２参照）。この遺伝子の全Ｇ＋Ｃ含量は約６５％である。
【実施例３】
【０２１２】
遺伝子ＥＤ３−８によってコードされる推定のΔ８−デサチュラーゼの酵素活性の特徴付け
ＥＤ３−８遺伝子をコードする推定のΔ８−デサチュラーゼを、酵母発現ベクターであるｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、クローンｐＲＳＰ６０を生じさせ、次にコンピテントサッカロミセス・セレビシエ菌株ＳＣ３３４に入れて形質転換した。製造業者によって特定された条件に従って、Ａｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＢｉｏＧｅｎｅ）を用いて酵母形質転換を実施した。ロイシン欠損培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）上でロイシン栄養要求性について形質転換体を選択した。
【０２１３】
ＥＤ３−８によってコードされる酵素の特異的デサチュラーゼ活性を決定するために、形質転換体を５０μＭの特定の脂肪酸基質（以下に列挙される）の存在下で増殖し、特定の生成物への変換を用いて、基質特異性を決定した：
Δ８−デサチュラーゼ活性について：
エイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）→ジホモガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）
エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３ｎ−３）→ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）
Δ６−デサチュラーゼ活性について：
リノール酸（１８：２ｎ−６）→ガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ｎ−６）
アルファ−リノレン酸（１８：３ｎ−３）→ステアリドン酸（ＳＤＡ、１８：４ｎ−３）
Δ５−デサチュラーゼ活性について：
ジホモ−ガンマ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）→アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ｎ−６）
ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）→エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）
Δ４−デサチュラーゼ活性：
ω６−アドレン酸（ＡＤＡ、２２：４ｎ−６）→ω６−ドコサペンタエン酸（ω６−ＤＰＡ、２２：５ｎ−６）
ω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）→ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）
陰性対照の菌株は、Ｓ．セレビシエ３３４において発現されたｐＹＸ２４２ベクターからなっていた。
【０２１４】
選択的ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］培地から単離された形質転換されたコロニーを、激しく振とうしながら３０℃にて１０ｍｌのＹＰＤ液体ブロス中で一晩増殖させた。次に、一晩培養したものの５ｍｌを、５０または２５μＭ（最終濃度）の様々な脂肪酸基質（特定されている）を含む選択培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）の４５ｍｌに添加し、これらを４８から７２時間（指示されている）２４℃にて激しく振とう（２５０ｒｐｍ）した。
【０２１５】
全脂質抽出について、酵母細胞を２０００ｒｐｍ／１５分間にて遠沈し、０．５ｍｌの水を添加し、試料をボルテックスし、次に１０ｍｌのメタノールを穏やかに旋回させながら添加した。その後、２０ｍｌのクロロホルムを添加し、試料を１分間、高速にてボルテックスし、２時間室温に放置した。次に、６ｍｌの生理食塩水を試料に添加し、その後、２２００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上部のクロロホルム層を、きれいな／乾燥した３０ｍｌのバイアルに取り出し、クロロホルムを４０℃にて窒素気流下で乾燥するまで蒸発させた。一度、溶媒が完全に蒸発されると、２ｍｌのクロロホルムを各々のバイアルに添加し、試料を誘導体化した。
【０２１６】
脂質の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への誘導体化について、各々の管を、１００μｌの内部標準（１７．２１６μｇ／１００μｌ）のＴｒｉｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｎを用いてスパイクした。クロロホルムを窒素下で４０℃にて乾燥するまで蒸発させ、２ｍｌの三フッ化ホウ素の１４％メタノール溶液が添加され、その後、２滴（約５０μｌ）のトルエンを添加した。各々のバイアルは窒素が注ぎ、１５分間９５℃にて加熱した。バイアルを冷却した後、２ｍｌの生理食塩水を添加し、脂質を１分間激しくボルテックスすることによって４ｍｌのヘキサンにより抽出した。次に、ヘキサン抽出物を、２０ｍｌのきれいな／乾燥したスクリューキャップ管に移し、５ｍｌのｄｉ−Ｈ２Ｏを添加し、試料をボルテックスし、１５００ｒｐｍにて４分間遠心分離した。その後、洗浄されたヘキサンを２０ｍｌの試薬管に移した。ヘキサンを乾燥するまで蒸発させ、各々の試料を０．５ｍｌの新鮮なヘキサンを用いて再構成した。再構成された最終ヘキサンをボルテックスし、脂質を分散した。次に、全試料をＧＣオートサンプラーバイアルに導入し、４μｌを分析のために注入した。ＧＣをＮｕＣｈｅｋ Ｓｔｄ．４６１を用いて較正した。
【０２１７】
基質の生成物への変換率を、下式を用いて計算した：
【０２１８】
【数１】
表３は、添加された基質の変換率に基づいたＥＤ３−８をコードしたタンパク質の酵素活性を示す。エミリアナ由来のＥＤ３−８遺伝子を変換したｐＲＳＰ６０クローンは、１．６８％のＥＤＡ（２０：２ｎ−６）基質をＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換し、０．５８％のＥＴｒＡ（２０：３ｎ−６）基質をＥＴＡ（２０：４ｎ−３）に変換した。これは、ＥＤ３−８遺伝子が、ｎ−６およびｎ−３脂肪酸基質を認識し得るΔ８−デサチュラーゼをコードし、ｎ−６基質、ＥＤＡを優先することを示した。ベクターだけの対照を用いた場合、バックグラウンド（基質の非特異的変換）活性は検出されなかった（表２参照）。ＥＤ３−８をコードした酵素は、試験された他の基質のいずれに対しても活性がなく（データを示さない）、それはΔ６−、Δ５−またはΔ４−デサチュラーゼ活性を有しないことを示した。
【０２１９】
【表７】
さらに、ＥＤ３−８をコードするタンパク質の他の改変体（表２参照）は、同じ増殖条件下でＳ．セレビシエにおいて発現された。結果は、これらの改変体は、もとのＥＤ３−８をコードしたタンパク質と比較して、より低いΔ８−デサチュラーゼ活性を有するまたは活性がないことを示した（表４参照）。このようにして、ＥＤ３−８のアミノ酸配列における小さな変化は、その位置に依存して、酵素活性に影響を及ぼし得る。これらの変化は、酵素の触媒中心または低い活性をもたす酵素の安定性に影響を及ぼす可能性がある。これらの膜結合性デサチュラーゼの結晶構造は現在のところ解明されていないため、酵素活性に本質的である酵素における全ての領域を予測することは不可能である。「ヒスチジン−ボックス」領域およびシトクロームｂ５領域が活性に本質的であることは周知である。しかしながら、これらのＥＤ３−８改変体は、「ヒスチジン−ボックス」およびシトクロームｂ５領域における変化はない（表２参照）。したがって、酵素活性に重要である、ＥＤ３−８によってコードされるこのΔ８−デサチュラーゼにおける追加の領域を同定した。
【０２２０】
【表８】
ＥＤ３−８のΔ８−デサチュラーゼ活性は試験された培養条件下において低いため、培養条件を修正して、活性がいずれかの方法において、添加された基質の量を変化させることによってまたは発現中の温度および時間を変化させることによって改善され得るかどうかを決定した。このようにして、ｐＲＳＰ６０で形質転換された酵母培養物を、２５μＭ基質の存在下、２４℃で４８時間、または５０μＭもしくは２５μＭ基質、２０℃で７２時間において増殖させた。表５は、培養条件を変化させることが酵母における発現を改善し得ることを示す。基質の生成物への変換率は約１．７％から約４．５％に増加した。
【０２２１】
【表９】
【実施例４】
【０２２２】
ＥＤ３−８のコドン最適化およびサッカロミセス・セレビシエにおけるそのコードされるタンパク質の発現
ＥＤ３−８のＧ＋Ｃ含量が高い（約６５％）ため、これは、酵母における発現に応じて示された相対的に低いΔ８−デサチュラーゼ活性の主な原因である可能性があった。したがって、ＥＤ３−８、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８（配列番号２８；図９）のコドン使用頻度を、サッカロミセス・セレビシエにおける発現について最適した。サッカロミセス・セレビシエのコドン使用頻度パターンを、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｇｏｊｏｂｏｒｉ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２９２）から決定し、これをベクターＮＴＩプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＤ３−８遺伝子配列に適用した。１２５４ｂｐのコード配列の全４１２ｂｐ（約３３％）を、そのコドン使用頻度とサッカロミセス・セレビシエのコドン使用頻度を並べるために修飾した。さらに、内部のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、様々な発現ベクターのマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ部位に遺伝子のクローニングを促進するために排除した。このようにして、１２５４ｂｐのコード領域の全４１４ｂｐを修飾した。この新規なコドン最適化された配列は、もとのＥＤ３−８遺伝子配列と６６．９８％の配列同一性を共有していた。コドン最適化された遺伝子における修飾は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものではなかった（配列番号２９；図１０）。さらに、「ＡＡＡ」がＡＴＧ翻訳開始コドンに対して５’に付加され、それは酵母における発現を促進すると考えられている。この配列は、「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」（配列番号３０；図１１）と称された。また、隣接している制限部位を、様々な発現ベクターへのクローニングを促進するために付加した。所望の「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔコーポレーション（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって合成し、ｐＵＣ５７クローニングの「ＴＡ」クローニング領域にクローニングした。次に、この遺伝子を、構築物を生じさせるためにｐＥＳＣ−Ｕｒａ酵母発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ部位にサブクローニングし、ｐＲＳＰ６２と称した。
【０２２３】
ｐＥＳＣ−ＵｒａベクターにクローニングされたＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ遺伝子（配列番号３０）を含むクローンは、ｐＲＳＰ６２と称し、ブタペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州マナッサス ２０１１０に２００８年９月２６日付けで寄託し、ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−９５３２が付与された。
【０２２４】
ｐＲＳＰ６２を、実施例３に記載されたのと同じプロトコールを用いて、サッカロミセス・セレビシエに形質転換し、この形質転換体を、ウラシルを欠損している培地（ＤＯＢ［−Ｕｒａ］）（ＱＢｉｏＧｅｎｅ）を用いてウラシル栄養供給性について選択した。選択的ＤＯＢ［−Ｕｒａ］培地から単離された形質転換されたコロニーを、１０ｍｌのＹＰＤ液体ブロス中、３００℃にて一晩、激しく振とうしながら増殖した。次に、この一晩の培養物の５ｍｌを、ｐＲＳＰ６２の発現を誘導するために添加された２％ガラクトース（最終濃度）および様々な脂肪酸基質（特定されている）の５０μＭ（最終濃度）を含む選択培地（デキストロース不含ＤＯＢ［−Ｕｒａ］）の４５ｍｌに添加した。培養物を、４８時間（指定されている）２４℃にて激しく振とう（２５０ｒｐｍ）した。また、全脂肪酸の単離および分析を、実施例３に記載されたように実施した。
【０２２５】
表６は、添加された基質の変換率に基づく「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」をコードするタンパク質の酵素活性を示す。コドン最適化されたＥＤ３−８遺伝子のΔ８−デサチュラーゼ活性は、もとのＥＤ３−８をコードしたタンパク質の活性よりも非常に高かった。結果は、ＥＤＡ（２０：２ｎ−６）基質のＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）への変換は１２．５１％であり、ＥＴｒＡ（２０：３ｎ−６）基質のＥＴＡ（２０：４ｎ−３）への変換は８．４５％であることを示している。バックグラウンド（基質の非特異的な変換）活性は、ｐＥＳＣ−Ｕｒａベクターのみの対照を用いた場合には検出されなかった（表６参照）。コドン最適化されたＥＤ３−８をコードした酵素は、試験された他の基質のいずれに対してもΔ６−、Δ５−およびΔ４−デサチュラーゼ活性を示さなかった（データを示していない）。
【０２２６】
【表１０】
【実施例５】
【０２２７】
酵母におけるコドン最適化されたΔ８−デサチュラーゼ「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」およびイソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）Δ９−エロンガーゼの同時発現
コドン最適化されたΔ８−デサチュラーゼ「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」を、イソクリシス・ガルバナ（ＩｓｏＤ９）（受託番号ＣＱ８３１４２２、配列番号３１；図１２）とともに同時発現させた。ＩｓｏＤ９遺伝子の合成遺伝子構築物を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって作製し、ｐＵＣ５７クローニングベクターにクローニングした。この遺伝子を、ｐＹＸ２４２酵母発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにサブクローニングし、この構築物をｐＩｓｏＤ９と称した。
【０２２８】
構築物ｐＲＳＰ６２（ｐＥＳＣ−ＵｒａにおけるＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ）およびｐＩｓｏＤ９を、実施例３に記載されているプロトコールにより、サッカロミセス・セレビシエ菌株ＳＣ３３４に同時形質転換した。ロイシンおよびウラシル栄養供給性（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］培地）を用いて同時形質転換体の選択を行った。形質転換されたコロニーを、３０℃にて１０ｍｌのＹＰＤ液体ブロス中で一晩、激しく振とうしながら増殖させた。次に、この一晩の培養物の５ｍｌを、５０μＭ（最終濃度）のＬＡ（１８：２ｎ−６）またはＡＬＡ（１８：３ｎ−３）（特定されている）を含む選択培地（デキストロース不含ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］＋２％ガラクトース）の４５ｍｌに添加し、これらを、４８から７２時間（指示されている）２４℃または２０℃にて激しく振とうした。また、全脂肪酸の単離および分析を実施例３に記載されるように実施した。
【０２２９】
【表１１】
Δ８−デサチュラーゼおよびΔ９−エロンガーゼは協調して機能することができ、ＬＡ（１８：２ｎ−６）のＤＬＧＡ（２０：３ｎ−３）への変換をもたらす。Δ９−エロンガーゼ（ＩｓｏＤ９）はＬＡをＥＤＡ（２０：２ｎ−６）に変換し、Δ８−デサチュラーゼ（ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣをコードした酵素）はＥＤＡをＤＧＬＡに変換する。これは、エミリアナ・ハックスレイから単離されたＥＤ３−８によってコードされるΔ８−デサチュラーゼがアラキドン酸（ＡＲＡ）またはＥＰＡ／ＤＨＡ生合成をもたらす、代替の（Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ）経路において機能し得ることを示す。したがって、これらの酵素は、様々な宿主においてＬＡからＡＲＡを生じさせ、またはＡＬＡからＥＰＡ／ＤＨＡを生じさせるために追加のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ（すなわち、Δ５−デサチュラーゼ、Ｃ２０−エロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼ）と組み合わせて使用することができる。
【実施例６】
【０２３０】
植物における発現
コドン最適化されたΔ８−デサチュラーゼ遺伝子である「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」は、モデル脂肪種子植物であるアラビドーシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、イソクリシス・ガルバナ（ＩｓｏＤ９）（受託番号ＣＱ８３１４２２、配列番号３１；図１２）由来のΔ９−エロンガーゼ遺伝子、およびユーグレノイド・デセス（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ２９１６（ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ、配列番号３５）（より完全には２００９年７月１７日に出願された米国特許出願シリアル第１２／５０５，２９３号に記載され、これは本明細書と一致する範囲を参照することにより本明細書に援用される）を用いて同時発現させた。
【０２３１】
ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯのコード配列（配列番号３５）を、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド：５’−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＧＴＣＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧ−３’（配列番号３６）および５’−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号３７）（付加された制限酵素認識配列は下線が引かれている）を用いて、対応する遺伝子を含むプラスミドからＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応を、非常に忠誠なＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行った。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによる制限酵素消化後、産物は、バイナリーベクターにおいて、産物の５’末端でダイズ由来の種子特異的なグリシニン−１プロモーターに連結され、産物の３’末端でグリシニン−１の３’非翻訳領域に連結され、プラスミドｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯを生じさせた。グリシニン−１調節エレメントは、以前に報告されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら，（１９８９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｉｎｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１，３１３−３２８）。また、このベクターは、蛍光および細菌選択用のカナマイシン耐性マーカーによって、形質転換された種子を選択するためのカッサバモザイクウイルスプロモーターの調節下にＤｓ−Ｒｅｄトランス遺伝子を含んでいる。また、このベクターは、宿主植物において多重遺伝子の遺伝子発現のための他のトランス遺伝子のクローニングを可能にするいくつかの固有の制限酵素部位（例えば、ＭｌｕＩ）を含んでいる。これらの実験の対照として、イソクリシス・ガルバナのΔ９−ＥＬＯ（配列番号３１）を、ｐＢｉｎＧｌｙＲｅｄ２におけるグリシニン−１プロモーターの調節下でＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩｓｏＤ９を生じさせた。
【０２３２】
ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣコード配列（配列番号３０）を、オープンリーディングフレームの両端に位置するＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて合成した。ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣコード配列を、β−コングリシニン遺伝子のダイズα’−サブニットのための種子特異的なプロモーター、およびファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のファセオリン遺伝子のための３’ミス翻訳された領域を含むｐＢＣｏｎベクターの対応する部位にＮｏｔＩ断片としてクローニングした。ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣを、その５’末端にβ−コングリシニンプロモーターの配列によって、およびその３’末端に３’ファセオリン非翻訳領域によって挟んだ。プロモーター、ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣコード配列および３’非翻訳領域を含む得られたカセットを、カセットの両端に位置するＡｓｃＩ制限酵素部位を用いてｐＢＣｏｎベクターから取り出した。その後、ＡｓｃＩカセットは、ｐＥｕｇＥＬＯの相性のよいＭＭ部位に、ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯおよびＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣデサチュラーゼの種子特異的な同時発現のためのトランス遺伝子を含むプラスミドｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を生じさせた。また、ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣデサチュラーゼのための種子特異的なトランス遺伝子を含むＡｓｃＩカセットをｐＩｓｏＤ９のＭｌｕＩ部位にクローニングし、ｐＩｓｏＤ９−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を生じさせた。
【０２３３】
ｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’およびｐＩｓｏＤ９−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株のＣ５８ ＭＰ９０にエレクトロポレーションによって導入した。次に、カナマイシン耐性のアグロバクテリウムを、フローラルディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ．ａｎｄ Ｂｅｎｔ，Ａ．Ｆ．（１９９８）Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍＱｄｉａｔＱｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ，１６，７３５−７４３））によって、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態型Ｃｏｌ−０の形質転換のために使用した。アグロバクテリウムのフローラルディップ後、植物を、成熟およびドライダウンに到達するまで１日当たり１６時間の長さで２２℃にて維持した。これらの実験について、低レベルのα−リノレン酸および非常に長い鎖の脂肪酸（≧Ｃ２０）を含むが、しかし、その種油においてリノレン酸レベルが上昇しているアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のｆａｄ３／ｆｅａｌ変異体が使用された（Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．ら，（２００６）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７，１１６６−１１７６）。この遺伝的背景は、ベニバナおよび低リノレン酸ダイズなどの穀物由来の種油の脂肪酸プロファイルに近い。アグロバクテリウムに浸されたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物由来のトランスジェニック種子は、既知の方法を用いてＤｓＲｅｄマーカータンパク質の蛍光によって特定された（Ｐｉｄｋｏｗｉｃｈ，Ｍ．Ｓ．ら，（２００７）Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｅｄ ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ａｃｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ ｌｅｖｅｌ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ａ ｐａｌｍ−ｌｉｋｅ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｏｉｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０４，４７４２−４７４７）。単独トランスジェニック種子および非トランスジェニック対照種子を、トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＨ）試薬を使用することによって、トリアシルグリセロールを含む構成脂質の直接的なエステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｃａｔｉｏｎ）に供した（Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．（２０００）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓｓａｔｕｒａｓｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｅｅｄ ｏｉｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７，１２３５０−１２３５５）。単一の種子から得られた脂肪酸メチルエステルを、ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ長×０．２５ｍｍ内径）が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０ガスクロマトグラフの使用、および７℃／分で１８５℃（１分保持）から２３０℃（２分保持）にプログラムしたオーブン温度によってフレームイオン化検出を用いたガスクロマトグラフィーにより分析した。構成脂肪酸メチルエステルを、野生型アラビドプシス・タリアナＣｏｌ−０の種子由来の既知の同一性の脂肪酸メチルエステルと比較した保持時間に基づいて、および標準の脂肪酸メチルエステルの保持時間と比較して、同定した。
【０２３４】
ｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を用いて形質転換された植物から５個の独立した形質転換事象由来の単一のＴ１種子の脂肪酸組成が表８に示されている。また、ｐｌｓｏＤ９−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を用いて形質転換された植物から独立した事象を示す単一のＴ１種子の脂肪酸組成が示されている（表９）。ユーグレナ−ＭＯ７−エロンガーゼおよびＥＤ３−８Δ８−デサチュラーゼを同時発現するｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’形質転換体由来の種子は、主にΔ８，１１，１４−エイコサトリエン酸（２０：３Δ８，１１，１４）およびより少量のΔ１１，１４−エイコサジエン酸を蓄積していた。これらの種子において、２０：３Δ８，１１，１４は、多量の脂肪酸であり、その相対量は全脂肪酸の２８％から３７％の範囲であった。これらの種子における２０：２Δ１１，１４の相対量は、全脂肪酸の１０．８から１４．５％の範囲であった。比較すると、２０：３Δ８，１１，１４および２０：２Δ１１，１４は、非形質転換のアラビドプシスｆａｄ３／ｆａｅｌ植物の種子において検出されないまたはごく微量見出された（表１０）。イソクリシス・ガルバナΔ９ＥＬＯおよびＥＤ３−８Δデサチュラーゼを同時発現する種子において、２０：３Δ８，１１，１４は全脂肪酸の最大３７％を占め、２０：２Δ１１，１４は全脂肪酸の最大６％を構成していた（表９）。全体的に、これらの所見は、ユーグレナ−ＭＯ７−エロンガーゼおよびＥＤ３−８Δ８デサチュラーゼまたはイソクリシス・ガルバナΔ９ＥＬＯおよびＥＤ３−８Δ８デサチュラーゼを同時発現する、１８：２で富んでいる種子は、相当量の２０：３Δ８，１１，１４、アラキドン酸の即時の生合成前駆体（２０：４Δ５，８，１１，１４）を生成することができる。また、これらの所見は、脂肪種子におけるＡＲＡまたはＥＰＡ／ＤＨＡ生成において本質的な段階を操作するために、ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯなどの１８：２特異的なエロンガーゼ、およびＥＤ３−８Δ８デサチュラーゼなどの２０：２Δ８デサチュラーゼの同時発現の実施可能性を示す。トランスジェニック脂肪種子におけるＡＲＡまたはＥＰＡの生成の最終目的を達成させるために、これらの遺伝子とｄ５−デサチュラーゼを同時発現させることが可能である。
【０２３５】
【表１２】
【０２３６】
【表１３】
【０２３７】
【表１４】
説明として本明細書に適切に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数以上）、制限（単数以上）がない状態で実施することができる。使用されている用語および表現は、説明であって制限ではない用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示されおよび記載されている特徴の任意の同等物またはそれらの一部を除外する意図はない。主張される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態により具体的に開示されるが、本明細書に開示されている概念の任意の特性、変更および変化が、添付の特許請求項の範囲により定義されるように本発明の範囲内にあると見なされることが理解されなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デルタ−８デサチュラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、それらの単離されたポリヌクレオチドによってコードされるデルタ−８デサチュラーゼ、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、発現ベクターを含む宿主細胞ならびにデルタ−８デサチュラーゼおよびポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、あらゆる生活形態の適切な機能化において多くの役割を果たす。例えば、ＰＵＦＡは細胞の原形質膜の重要な成分であり、そこではＰＵＦＡはリン脂質の形態で見出される。ＰＵＦＡは乳児脳の適切な発育に必要であり、成熟した哺乳動物における組織形成および修復にも必要である。
【０００３】
多数の酵素、最も顕著にはデサチュラーゼおよびエロンガーゼは、ＰＵＦＡの生合成に関与している（図１参照）。デサチュラーゼは、基質の脂肪酸アルキル鎖内の炭素原子間に不飽和化（例えば、二重結合）の導入を触媒する。エロンガーゼは、脂肪酸基質に二炭素単位の付加を触媒する。例えば、リノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）はΔ１２−デサチュラーゼによってオレイン酸（ＯＡ、１８：１ｎ−９）から生成される。エイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）はΔ９−エロンガーゼによってＬＡから生成される。ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）はΔ８−デサチュラーゼによってＥＤＡから生成される（図１参照）。アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）はΔ５−デサチュラーゼによってＤＧＬＡから生成される（図１参照）。
【０００４】
多数の重要な長鎖ＰＵＦＡが当該技術分野において知られている。例えば、最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１つはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。ＥＰＡは菌類および海洋油において見出されている。第２の重要な長鎖ＰＵＦＡはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。ＤＨＡは、ほとんどの場合、魚油に見出され、また哺乳動物の脳組織から精製され得る。第３の重要な長鎖ＰＵＦＡはＡＲＡである。ＡＲＡは糸状菌において見出され、また肝臓および副腎を含む哺乳動物組織から精製され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡは、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路または従来のΔ６−デサチュラーゼ経路のいずれかにより生成され得る（図１参照）。長鎖ＰＵＦＡ、特にＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの生成に関する従来のΔ６経路における基質の脂肪酸に活性なエロンガーゼは、従来、同定されている。ＬＡをＤＧＬＡに変換し、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）をω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）に変換するための従来のΔ６−デサチュラーゼ経路は、ＬＡをガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）に変換し、ＡＬＡをステアリドン酸に変換するΔ６−デサチュラーゼ酵素；ならびにＧＬＡをＤＧＬＡに変換し、ＳＤＡをω３−ＥＴＡに変換するＣ１８−エロンガーゼを利用する。しかしながら、ある場合には、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼは、従来のΔ６−デサチュラーゼ経路よりも優先され得る。例えば、特定の残余物であるオメガ−６またはオメガ−３脂肪酸中間体、例えば、ＧＬＡまたはＳＤＡは、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ω３−ＥＴＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）および／またはＤＨＡの生成過程で所望されない場合、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が、ＧＬＡおよびＳＤＡ形成を迂回するための従来のΔ６−デサチュラーゼ経路の代替経路として使用されてもよい。Δ８−デサチュラーゼは、８番目と９番目の炭素原子（この分子のカルボキシル末端から数える）の間で脂肪酸を非飽和化し、例えば、ω６−エイコサジエン酸（ＥＤＡ）からＤＧＬＡおよび／またはω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ）からω３−ＥＴＡへの変換を触媒し得るため、Δ８−デサチュラーゼがこの経路において有用である。したがって、長鎖ＰＵＦＡの生成に使用し得るΔ８−デサチュラーゼの新しい供給源が当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
一態様では、本発明は、デサチュラーゼ活性を有し、そのアミノ酸配列が、配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むまたはそれに相補的な単離されたヌクレオチド酸またはその断片に関する。単離された核酸またはその断片は、ω６−エイコサジエン酸またはω３−エイコサトリエン酸を基質として利用する機能的に活性なΔ８−デサチュラーゼ酵素をコードする。この単離された核酸配列は、エミリアナ・ハックスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎａ ｈｕｘｌｅｙｉ）、好ましくはエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から得ることができる。
【０００７】
別の態様では、本発明は、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的である単離されたヌクレオチド配列またはその断片に関する。単離されたヌクレオチド配列またはその断片は、基質としてω６−エイコサジエン酸またはω３−エイコサトリエン酸を利用する機能的に活性なΔ８−デサチュラーゼ酵素をコードする。単離されたヌクレオチド配列は配列番号２８の配列を有することができる。あるいは、単離されたヌクレオチド配列は配列番号３０の配列を有することができる。この単離されたヌクレオチド配列は、エミリアナ・ハックスレイ、好ましくはエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から得ることができる。
【０００８】
別の態様では、本発明は発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいるまたはその少なくとも５５％に相補的である、調節配列に作動的に連結されたヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
なおさらなる態様では、本発明は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は真核細胞であり得る。具体的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属種、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属種、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種、およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属種からなる群から選択される真菌細胞である。使用可能である植物細胞の例は、ダイズ、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属種、ベニバナ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタおよび亜麻からなる群から選択される。
【００１０】
さらなる別の態様では、本発明は、そのヌクレオチド配列の発現が、植物細胞、植物種子、植物体または植物組織による少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらす、上記の発現ベクターを含む植物細胞、植物種子、植物体または植物組織に関する。上記発現ベクターによって生成されるポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）またはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）からなる群から選択される。
【００１１】
なおさらなる別の態様では、本発明は、上記の植物細胞、植物種子、植物体または植物組織によって生成される１個以上の植物油または脂肪酸に関する。
【００１２】
なおさらなる別の態様では、本発明は、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列によってコードされる精製されたポリペプチドに関する。
【００１３】
なおさらなる別の態様では、本発明は、２０個の炭素長であるポリ不飽和脂肪酸（Ｃ２０−ＰＵＦＡ）基質をその基質の炭素原子８と炭素原子９の間で非飽和化し、配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％のアミノ酸同一性を有する精製されたポリペプチドに関する。
【００１４】
なお別の実施態様では、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチドに関する。
【００１５】
なおさらなる別の実施形態では、本発明は、Δ８−デサチュラーゼ酵素を生成するための方法に関する。この方法は、
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；および
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、上記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ
を含む。
【００１６】
上記の方法では、宿主細胞は真核細胞である。具体的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、トリコデルマ属種およびピチア属種からなる群から選択される真菌細胞である。使用可能である植物細胞の例は、ダイズ、ブラシカ属種、ベニバナ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタおよび亜麻からなる群から選択される。
【００１７】
なおさらなる別の実施態様では、本発明は、
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、上記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；および
ｄ）発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素を、ω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、上記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、ポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【００１８】
上記の方法では、生成物のポリ不飽和脂肪酸は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１９】
さらに、上記の方法は、
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼにまたはエロンガーゼに曝露して、生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたは追加のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
をさらに含むことができる。生成物のポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）もしくはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２０】
なお別の態様では、本発明は、
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）上記ｂ）の発現ベクター、およびデルタ−９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの調節配列に作動的に連結された、単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加の組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ；
ｄ）発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素およびデルタ−９エロンガーゼを、リノール酸（ＬＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、上記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、宿主細胞においてポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法に関する。
【００２１】
上記の方法において、生成物のポリ不飽和脂肪酸は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）もしくはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２２】
さらに、上記の方法は、
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼにまたはエロンガーゼに曝露して、生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたは追加のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
をさらに含むことができる。生成された生成物のポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２３】
上記の方法では、宿主細胞は真核細胞である。具体的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、トリコデルマ属種およびピチア属種からなる群から選択される真菌細胞である。使用可能な植物細胞の例は、ダイズ、ブラシカ属種、ベニバナ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタおよび亜麻からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】脂肪酸の生合成経路およびこの経路におけるΔ８−デサチュラーゼの役割を示す図である。
【図２Ａ】パブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）ＣＣＭＰ ４５９（配列番号２）、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）（配列番号３）、ユーグレナ・グラシアリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）（配列番号１）およびパーキンサス（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ）（配列番号４）由来の既知のΔ８−デサチュラーゼを用いてＥＤ３−８（配列番号２９）によってコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。同一の残基は強調され、保存されたヒスチジン−ボックスは下線を引かれ、シトクロームｂ５ドメインにおける保存領域は下線を引かれる（二重線）。
【図２Ｂ】パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（配列番号２）、パブロバ・サリナ（配列番号３）、ユーグレナ・グラシアリス（配列番号１）およびパーキンサス（配列番号４）由来の既知のΔ８−デサチュラーゼを用いてＥＤ３−８（配列番号２９）によってコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。同一の残基は強調され、保存されたヒスチジン−ボックスは下線を引かれ、シトクロームｂ５ドメインにおける保存領域は下線を引かれる（二重線）。
【図３Ａ】ユーグレナ・グラシアリス（受託番号ＡＦ１３９７２０、配列番号１）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｂ】パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（配列番号２）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ａ】パブロバ・サリナ（受託番号ＤＱ９９５５１８、配列番号３）由来のΔ８−デサチュラーゼアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ｂ】パーキンサス・マリヌス（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）（受託番号ＤＱ５０８７３０、配列番号４）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ｃ】アカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｎｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ）（受託番号＃ＣＳ６０８４８３、配列番号５）由来のΔ８−デサチュラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８のＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す図である。
【図６】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８の推定アミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図７Ａ】実施例２に記載されている得られたクローンＰＫ１５のＤＮＡ配列（配列番号１５）を示す図である。
【図７Ｂ】実施例２に記載されている得られたクローンＰＫ１５のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。
【図８Ａ】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８の推定３’末端のＤＮＡ配列（配列番号２４）を示す図である。
【図８Ｂ】実施例２に記載されている得られたクローンＥＤ３−８の推定３’末端のアミノ酸配列（出現の順にそれぞれ配列番号２５および４４−４６）を示す図である。
【図９】エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼの１２５４塩基対の遺伝子配列（配列番号２８）を示す図である。
【図１０】エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼの１２５４塩基対の遺伝子配列（配列番号２８）によってコードされる４１７個のアミノ酸のタンパク質（配列番号２９）を示す図である。
【図１１】エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼのコドン最適化された遺伝子配列（配列番号３０）を示す図であり、「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」と称する。ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣは、もとのＥＤ３−８遺伝子配列（配列番号２８；図９）と６６．９８％の配列同一性を共有する。コドン最適化された遺伝子の修飾は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２９；図１０）を変化させなかった。
【図１２】イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（ＩｓｏＤ９）（受託番号ＣＱ８３１４２２、配列番号３１）由来のΔ９−エロンガーゼの遺伝子配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な記述）
本発明は、エミリアナ（Ｅｍｉｌｉａｎａ）属種、例えば、エミリアナ・ハクスレイ、具体的には、エミリアナ・ハクスレイＣＣＭＰ３７８由来のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド（例えば、遺伝子）配列および翻訳されたアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、上記遺伝子およびこの遺伝子によってコードされる酵素の使用を含む。例えば、ヌクレオチドおよび対応する酵素は、医薬組成物、栄養組成物、および他の有用な製品に添加することができるポリ不飽和脂肪酸、例えば、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ＥＴＡ ＤＰＡおよびＤＨＡまたはそれらの任意の組み合わせの生成に使用されてもよい。
【００２６】
Ａ．定義
本明細書で使用するとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明らかにそれ以外を記述していない限り、複数表記を含む。本明細書における数値範囲の引用に関して、その間に介在する各数値は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲６−９の場合、６および９に加えて数値７および８が想定され、範囲６．０−７．０の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に想定される。
【００２７】
ａ）ブラシカ属種
本明細書で使用するとき、語句「ブラシカ属種」とは、ブラシカ・ユンシア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）およびブラシカ・カンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の任意の植物を意味する。
【００２８】
ｂ）キメラ構築物
本明細書で使用するとき、語句「キメラ構築物」とは、ともに本来は天然に見出されない核酸分子の組み合わせを意味する。したがって、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含んでもよいが、本来は天然に見出されるものとは異なったように並べられてもよい。
【００２９】
ｃ）コード配列
本明細書で使用するとき、用語「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列中またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置されたヌクレオチド配列を意味し、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性または翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列が含まれてもよい。
【００３０】
ｄ）コドン最適化
「コドン最適化」とは、遺伝子または核酸分子と関連して使用するとき、宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度を模倣するように設計されたコドンの使用頻度を有する遺伝子または核酸分子を意味する。
【００３１】
ｅ）相補性
本明細書で使用するとき、用語「相補性」とは、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度を意味する。相補性は、１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が、適切な条件下で他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズし、二重らせんを形成する能力を測定することによって決定される。この二重らせんにはアデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に、グアニンが一方の鎖に現れる場合、シトシンが他方に現れる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が増すと、２つのＤＮＡセグメントの鎖間のハイブリッド二重鎖を形成する能力が増す。
【００３２】
ｆ）によってコードされる、ハイブリダイゼーションおよびストリンジェント条件
本明細書で使用するとき、語句「によってコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ここで、ポリペプチド配列またはその部分は、その核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の少なくとも３個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含む。
【００３３】
また、本発明は、ＰＵＦＡデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードし、ストリンジェントな条件下で、配列番号２８もしくは配列番号３０を含むヌクレオチド配列を含むまたはそれに相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズすることができる単離されたヌクレオチド配列を包含する。核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度およびイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングすることができるとき、別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照））。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とする。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズするための適したストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が増すと、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍ値が増す。長さが１００ヌクレオチドより大きなハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、参照）。
【００３４】
典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０から８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオンであり、典型的には約０．０１から１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃という条件となる。また、ストリンジェント条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成されてもよい。低度のストリンジェント条件の例には、３０から３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣから２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の５０から５５℃での洗浄が含まれる。中程度のストリンジェント条件の例には、４０から４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５×ＳＳＣから１×ＳＳＣ中の５５から６０℃での洗浄が含まれる。高度のストリンジェント条件の例には、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ中の６０から６５℃での洗浄が含まれる。
【００３５】
ｇ）エクソン
本明細書で使用するとき、用語「エクソン」とは、転写される遺伝子であり、その遺伝子から生じる成熟メッセンジャーＲＮＡに見出される遺伝子の配列の一部を意味するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部ではない。
【００３６】
ｈ）発現、アンチセンス阻害および共抑制
本明細書で使用するとき、用語「発現」とは、機能的な最終産物の生成を意味する。遺伝子の発現は、その遺伝子の転写、および前駆体または成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を伴う。
【００３７】
本明細書で使用するとき、語句「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「共抑制」とは、同一もしくは実質的に類似の外来または内因性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号参照）。
【００３９】
ｉ）機能的に同等である断片またはサブ断片
用語「機能的に同等である断片またはサブ断片」および「機能的に同等の断片またはサブ断片」とは、本明細書では交換可能に用いられ、その断片またはサブ断片が活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変更しまたはある種の表現型を生じさせる能力が保持されている単離された核酸分子の部分またはサブ配列を意味する。例えば、その断片またはサブ断片は、形質転換された植物において所望の表現型を生じさせるキメラ構築物の設計に用いることができる。キメラ構築物は、その核酸の断片またはサブ断片が活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物のプロモーター配列に対して適切な方向で核酸の断片またはサブ断片を連結させることによって、共抑制またはアンチセンス阻害において使用するために設計され得る。
【００４０】
ｊ）遺伝子、天然の遺伝子およびトランス遺伝子
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸分子を意味し、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）にある調節配列を含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、語句「天然の遺伝子」とは、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を意味する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「トランス遺伝子」とは、形質転換手法によってゲノムに導入された遺伝子を意味する。
【００４３】
ｋ）ゴッシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）属種
本明細書で使用するとき、語句「ゴッシピウム属種」は、ゴッシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ゴッシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴッシピウム・ヘルバケウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、ゴッシピウム・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ゴッシピウム・ヒルスタム・バル・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｖａｒ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ゴッシピウム・ヒルスタム・バル・マリア−ガランテ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｖａｒ ｍａｒｉｅ−ｇａｌａｎｔｅ）、ゴッシピウム ラピデウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｌａｐｉｄｅｕｍ）、ゴッシピウム・ストゥルティアヌム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｔｕｒｔｉａｎｕｍ）、ゴッシピウム・ツベリ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｂｅｒｉ）、ゴッシピウム・ツルベリ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｒｂｅｒｉ）、ゴッシピウム・トメントスム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）またはゴッシピウム・トルメントスム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｏｒｍｅｎｔｏｓｕｍ）の任意の植物を意味する。
【００４４】
ｌ）相同性
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似した」および「実質的に対応する」とは、本明細書では交換可能に使用され、１種以上のヌクレオチド塩基における変化が遺伝子発現を媒介するまたはある種の表現型を生じさせる核酸分子の能力に影響を及ぼさない核酸分子を意味する。また、これらの用語は、初期の未修飾分子と比較して、得られた核酸分子の機能特性を実質的に変更しない１種以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸分子の修飾を意味する。したがって、当業者が認識するように、本発明は特定の例示的な配列よりも多くの配列を包含することが理解される。
【００４５】
ｍ）宿主細胞
本明細書で使用するとき、語句「宿主細胞」とは、本発明の単離された核酸配列またはその断片を含む細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シアノバクテリアおよびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または真核細胞（例えば、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞もしくは哺乳動物細胞）であってもよい。
【００４６】
使用可能である真菌細胞の例は、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、トリコデルマ属種およびピチア属種である。特に好ましい真菌細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４７】
植物細胞は、単子葉植物の植物細胞または双子葉植物の植物細胞であり得る。特に好ましい植物細胞は、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（例えば、ダイズ）、ブラシカ属種、カーサマス・ティンクトリアス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）Ｌ．（例えば、ベニバナ）、ヘリアンサス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（例えば、ヒマワリ）、ズィー・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（例えば、トウモロコシ）、ゴッシピウム属種およびリナム・ウシタティシムム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（例えば、亜麻）由来である。
【００４８】
ｎ）同一性、配列同一性および配列同一性の割合（同一性％）
本明細書で使用するとき、用語「同一性」または「配列同一性」とは、本明細書では交換可能に使用され、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連して使用される場合、特定の比較ウィンドウと対比して、一致が最大となるように並べられた場合と同じようである２つの配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を意味する。したがって、同一性は、２つのＤＮＡまたはポリペプチドセグメントの同じ鎖（センスまたはアンチセンス）間の類似、一致または同等の程度として定義される。
【００４９】
「配列同一性の割合」または「同一性％」は、特定の領域に対して最適に並べられた２つの配列を比較し、同一塩基が両方の配列において出現する位置の数を決定して、合致した位置の数を得て、このような位置の数を比較されているセグメント内の位置の総数で除し、およびこの結果に１００を掛けることによって計算される。配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法によって、および関連アルゴリズムを実装するコンピュータプログラム（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（インテリジェネティックス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ））、ＢＬＡＳＴ（全米バイオメディカル情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（ジェネティックスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（ウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージリリース７．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０）、ジェネティックスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））によって実行することができる（米国特許第５，９１２，１２０号参照）。配列同一性パーセントの有用な例は、限定されないが、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が含まれる。これらの同一性は、本明細書に記載されているプログラムのいずれかを用いて決定することができる。
【００５０】
ｏ）間接的または直接的に
本明細書で使用するとき、用語「間接的に」は、ポリ不飽和脂肪酸の生成における遺伝子およびその対応する酵素の使用と関連して使用する場合、第１の酸が第１の酵素によって第２の酸（すなわち、経路中間体）に変換され（例えば、Δ９−エロンガーゼによって、例えば、ＬＡからＥＤＡ）、次に、第２の酸が、第２の酵素の使用によって第３の酸に変換される（例えば、Δ８−デサチュラーゼによって、例えば、ＥＤＡからＤＧＬＡ）状況を包含する。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「直接的に」は、ポリ不飽和脂肪酸の生成における遺伝子およびその対応する酵素の使用と関連して使用する場合、この酵素が直接、第１の酸を第２の酸に変換し、ここで、次に第２の酸は組成物において使用される（例えば、Δ９−エロンガーゼによって、例えば、ＬＡからＥＤＡへの変換または例えば、Δ８−デサチュラーゼによって、例えば、ω３−ＥＴｒａからω３−ＥＴＡへの変換）状況を包含する。
【００５２】
ｐ）イントロン
本明細書で使用するとき、用語「イントロン」とは、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子における介在配列を意味する。したがって、このような配列はＲＮＡに転写されるが、その後、切り出され、翻訳されない。また、この用語は切り出されたＲＮＡ配列についても使用される。
【００５３】
ｑ）単離された
本明細書で使用するとき、用語「単離された」とは、当該技術分野において知られている日常的な技術を用いて、天然に存在する環境または供給源から（例えば、細菌、藻、菌類、植物、脊椎動物、哺乳動物などから）取り出される核酸分子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質もしくは生物学的に活性なその部分を意味する。単離された核酸分子またはタンパク質は、天然に存在する環境において核酸分子またはタンパク質を通常伴うまたは相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない。
【００５４】
ｒ）単離された核酸断片または単離された核酸配列
本明細書で使用するとき、語句「単離された核酸断片」または「単離された核酸配列」とは、一本鎖もしくは二本鎖であり、合成のヌクレオチド塩基、天然に存在しないヌクレオチド塩基もしくは変更されたヌクレオチド塩基を含んでもよい、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１個以上のセグメントで構成されてもよい。（特定されたポリヌクレオチドの「断片」は、特定されたヌクレオチド配列の領域と同一であるまたは相補的である、およそ、少なくとも約１０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチドなどの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。）ヌクレオチド（これらの５’−一リン酸エステルの形態で通常見出される）は、以下のようなそれらの一文字記号で表される：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対する）については「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸については「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸については「Ｇ」、ウリジル酸については「Ｕ」、デオキシチミジル酸については「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）については「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）については「Ｙ」、ＧまたはＴについては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴについては「Ｈ」、イノシンについては「Ｉ」、および任意のヌクレオチドについては「Ｎ」である。
【００５５】
ｓ）成熟および前駆体
本明細書で使用するとき、用語「成熟」とは、用語「タンパク質」と関連して使用される場合、翻訳後に処理されたポリペプチド；すなわち、一次翻訳産物に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除かれたものを意味する。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「前駆体」とは、用語「タンパク質」と関連して使用される場合、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物；すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドがなおも存在する一次産物を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは、限定されないが、細胞内局在化シグナルであってもよい。
【００５７】
ｔ）３’非コード配列
本明細書で使用するとき、語句「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置されたＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことによって通常特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０によって例示されている。
【００５８】
ｕ）天然に存在しない
本明細書で使用するとき、語句「天然に存在しない」とは、人工的であり、本来は天然に見出されるものとは一致しないものを意味する。
【００５９】
ｖ）作動的に連結された
本明細書で使用するとき、語句「作動的に連結された」とは、１つの核酸配列の機能が他方によって制御されるように、単一の核酸分子への核酸配列の関連性を意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を制御することができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合にコード配列と作動的に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動的に連結され得る。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側もしくは標的ｍＲＮＡの３’側もしくは標的ｍＲＮＡ内に、直接的または間接的に作動的に連結させることができ、または第１の相補的領域が標的ｍＲＮＡの５’側にあり、その相補体が標的ｍＲＮＡの３’側にある。
【００６０】
ｗ）植物
本明細書で使用するとき、用語「植物」とは、植物体全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子およびその子孫を意味する。植物は、限定されないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む。
【００６１】
ｘ）ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ
本明細書で使用するとき、語句「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、多量の特定ＤＮＡセグメントを合成するための技術を意味し、一連の繰り返しサイクルからなる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，コネチカット州ノーウォーク）。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーが低温でアニーリングし、次に中間温度で伸長する。これらの３つの連続ステップの１セットは１サイクルと呼ばれる。
【００６２】
ＰＣＲは、短期間の鋳型の反復複製によって、数百万倍にＤＮＡを増幅させるために使用される強力な技術である（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第第８４，７９６号；欧州特許出願第２５８，０１７号、欧州特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ，欧州特許出願第２０１，１８４，Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；およびＳａｉｋｉら，米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法は、ＤＮＡ合成を開始するための特定のインビトロで合成されたオリゴヌクレオチドのセットを利用する。プライマーの設計は、分析されることが望まれるＤＮＡの配列に依存する。この技術は、高温で鋳型を融解する多数のサイクル（通常２０から５０回）を通じて行われ、この鋳型内で相補配列にプライマーがアニーリングできるようにし、次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いてこの鋳型を複製する。ＰＣＲ反応の生成物は、アガロースゲルにおける分離、続くエチジウムブロマイド染色、およびＵＶ透光による視覚化によって分析される。あるいは、放射性ｄＮＴＰがＰＣＲに添加され、この生成物に標識を組み込むことができる。この場合において、ＰＣＲの生成物は、ゲルのｘ線フィルムへの曝露によって視覚化される。放射性標識ＰＣＲ生成物のさらなる利点は、個々の増幅生成物のレベルが定量され得るということである。
【００６３】
ｙ）プロモーターおよびエンハンサー
本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節ことができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は、近位な上流エレメントおよびより遠位な上流エレメントからなり、後者のエレメントは、多くの場合、エンハンサーと呼ばれる。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーター固有のエレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増大させるために挿入された異種エレメントであってもよいＤＮＡ配列を意味する。また、プロモーター配列は、遺伝子の転写された部分の範囲内、および／または転写された配列の下流に位置することができる。プロモーターは、天然の遺伝子から全体で誘導されてもよく、または本来見出される異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントで構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指向してもよいことが当業者に理解される。大部分の細胞型において、大部分の時間、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞に有用な種々のタイプの新規なプロモーターは、常に発見されつつある；多数の例がＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２による編集物において見出すことができる。大分部の場合において、調節配列の正確な境界は完全に画定されていないため、ある変異のＤＮＡ分子は同一のプロモーター活性を有する場合があることがさらに認識されている。
【００６５】
ｚ）組換え
本明細書で使用するとき、用語「組換え」とは、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術を用いた核酸の単離されたセグメントの操作によって、配列の２つの別に分離されたセグメントの人工的な組み合わせを意味する。
【００６６】
ａａ）組換え構築物、発現構築物および組換え発現構築物
語句「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」とは、本明細書において交換可能に使用され、当業者に周知な標準的な方法を用いて細胞のゲノムに挿入され得る遺伝物質の機能的単位を意味する。このような構築物はそれ自体で使用されてもよく、またはベクターと連結して使用されてもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターが使用されてもよい。当業者は、本発明の単離された核酸分子分子のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択しおよび増殖させるために、ベクターに存在しなければならない遺伝要素を十分に認識している。また、当業者は、異なる独立した形質転換事象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたらすことを認識し（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６）、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す菌株を得るために、多数の事象がスクリーニングされなければならないことを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
【００６７】
ｂｂ）ＲＮＡ転写物、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、機能性ＲＮＡおよび内因性ＲＮＡ
本明細書で使用するとき、語句「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒されたＤＮＡ配列の転写から得られた生成物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と呼ばれ、またはそれは一次転写物の転写後のプロセッシングから誘導されたＲＮＡ配列であってもよく、これは成熟ＲＮＡと呼ばれる。
【００６８】
本明細書で使用するとき、語句「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを含まないＲＮＡであり、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、酵素の逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは、一本鎖形態であり、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）分子を用いて二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を意味し、細胞内またはインビトロにおいてタンパク質に翻訳することができる。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部もしくは一部に相補的であるＲＮＡ転写物、または標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列と一緒であってもよい。
【００７０】
本明細書で使用するとき、語句「機能性ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが、なおも細胞プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを意味する。
【００７１】
用語「相補体」および「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物に関して、本明細書において交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを画定することが意図される。
【００７２】
本明細書で使用するとき、語句「内因性ＲＮＡ」とは、天然に存在するまたは天然に存在しない、すなわち、組換え手段、突然変異などによって導入されたかどうかに関係なく、本発明の組換え構築物を用いた形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によってコードされる任意のＲＮＡを意味する。
【００７３】
ｃｃ）類似性
本明細書で使用するとき、用語「類似性」とは、２つのアミノ酸配列、タンパク質またはポリペプチド間の「類似性」に言及するときに使用する場合、両方の配列において一連の同一であり、保存されたアミノ酸残基が存在することを意味する。２つのアミノ酸配列間の類似性の度合いが高くなると、２つの配列の一致性、統一性（ｓａｍｅｎｅｓｓ）または同等性が高くなる。
【００７４】
ｄｄ）安定な形質転換、一過性形質転換および形質転換
本明細書で使用するとき、語句「安定な形質転換」とは、核ゲノムおよびオルガネラゲノムの両方を含む宿主生物のゲノムに核酸分子を導入し、遺伝的に安定な遺伝をもたらすことを意味する。
【００７５】
これに対して、「一過性形質転換」とは、核酸分子を宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラに導入し、組み込みまたは安定な遺伝なしに遺伝子発現をもたらすことを意味する。形質転換された核酸分子を含む宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。コメ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換法は、粒子加速または「遺伝子銃」による形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、またはトランス遺伝子を含む適切なＴｉプラスミドを用いるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒介した方法（Ｉｓｈｉｄａ
Ｙ．ら，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「形質転換」とは、安定な形質転換および一過性形質転換の両方を意味する。
【００７７】
ｅｅ）翻訳リーダー配列
本明細書で使用するとき、語句「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列およびコーディング配列間に位置されたＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全に処理されたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼす場合がある。翻訳リーダー配列の例は文献に報告されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３：２２５）。
【００７８】
本明細書において引用された全ての特許、特許公報および優先権書類は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
Ｂ．Δ８−デサチュラーゼ遺伝子およびそれによってコードされる酵素
本発明のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子によってコードされる酵素は、少なくとも２つの不飽和化（二重結合）を有し、および全長２０個の炭素原子またはそれよりも長いポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成において本質的である。具体的には、本発明の酵素は、機能的に活性であり（例えば、Δ８−デサチュラーゼ活性を有する）、それは、この酵素が、長さにして少なくとも２０個の炭素原子を有し、位置Δ９、Δ１２および／またはΔ１５の従前より存在する二重結合である炭素原子番号８（Ｃ８）と炭素原子９（Ｃ９）の間に二重結合を付加することを意味する。図１に示されるように、本発明のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子によってコードされる酵素は、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を介して、２０個またはそれを超える炭素原子の長さを有するＰＵＦＡを生成する。基質、ω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸またはω６−エイコサジエン酸およびω３−エイコサトリエン酸の両方は、この経路において本発明のΔ８−デサチュラーゼによって利用される。
【００８０】
本発明のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子は、エミリアナ属種、すなわち、エミリアナ・ハックスレイ、具体的にはエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から単離された。エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から単離されたΔ８−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、図９および配列番号２８に示されている。推定ヌクレオチド配列の単離されたコドン最適化されたヌクレオチド配列は、図１１および配列番号３０に示されている。単離されたまたは精製されたアミノ酸配列は配列番号２８および配列番号３０の両方によってコードされ、図１０および配列番号２９に示されている。
【００８１】
Δ９−エロンガーゼ酵素およびΔ８−デサチュラーゼ酵素を用いたＬＡのＤＧＬＡへの変換およびＡＬＡのω３−ＥＴＡへの変換は、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路と呼ばれる。ＬＡをＤＧＬＡに変換し、ＡＬＡをω３−ＥＴＡに変換するための従来のΔ６経路は、それぞれＬＡをＧＬＡに変換し、ＡＬＡをＳＤＡに変換するためのΔ６−デサチュラーゼ酵素、ＧＬＡをＤＧＬＡに変換し、ＳＤＡをω３−ＥＴＡに変換するためのΔ６−エロンガーゼ遺伝子を利用する。いずれかの経路において、次に、ＡＲＡまたはＥＰＡの生成は、例えば、Δ５−デサチュラーゼ酵素によって触媒される。例えば、ＤＨＡは、例えば、Ｃ２０−エロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼを用いて、それぞれＥＰＡのω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）への変換、およびω３−ドコサペンタエン酸のＤＨＡへの変換に基づいて生成され得る。
【００８２】
例えば、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ω３−ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡは、ある種の場合において、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路または従来のΔ６経路を介して生成され得るが、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が従来のΔ６経路よりも好ましい場合がある。例えば、特定の残基であるオメガ−６またはオメガ−３脂肪酸中間体、例えば、ＧＬＡまたはＳＤＡがＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ω３−ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡの生成中に所望されない場合、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が、ＧＬＡおよびＳＤＡ形成を迂回するための従来のΔ６経路の代替として使用されてもよい。
【００８３】
上記で検討したように、Δ８−デサチュラーゼは、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路において必要な酵素である。例えば、ＥＰＡは、Δ８−デサチュラーゼ遺伝子およびそれによってコードされる酵素なしに、代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を介して合成することはできない。図１に示されるように、本発明の単離されたΔ８−デサチュラーゼ酵素は、例えば、ＥＤＡをＤＧＬＡに変換し、ω３−ＥＴｒＡをω３−ＥＴＡに変換する。次に、ω３−ＥＴｒＡからω３−ＥＴＡの生成、およびω３−ＥＴＡからＥＰＡの生成は、例えば、それぞれΔ８−デサチュラーゼおよびΔ５−デサチュラーゼによって触媒される。代替のΔ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路の使用の結果として、中間体ＧＬＡおよびＳＤＡ脂肪酸が迂回される。
【００８４】
また、本発明は、配列番号２８（エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来の単離されたΔ８−デサチュラーゼヌクレオチド配列）または配列番号３０（エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来の単離されたコドン最適化されたヌクレオチド配列）を含む、からなる、またはその配列において、少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドに相補的である配列（すなわち、配列番号２８または配列番号３０に配列同一性を有する配列）を有する単離されたまたは精製されたヌクレオチド配列を含む。このような配列は、ヒト供給源、および他のヒト以外の供給源（例えば、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）またはマウス）由来であってもよい。
【００８５】
さらに、本発明はまた、配列番号２８または配列番号３０のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる断片および誘導体を包含する。配列番号２８または配列番号３０由来の断片は、１０から１２５０ヌクレオチド、１０から１０００ヌクレオチド、１０から７５０ヌクレオチド、１０から５００ヌクレオチド、１０から２５０ヌクレオチド、１０から約１００ヌクレオチドまたは１０から約５０ヌクレオチドまたは１５から４０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる長さを有することができる。一態様では、配列番号２８および配列番号３０の断片は、Δ８−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の態様では、配列番号２８および配列番号３０の断片は、プライマーおよびプローブとして用いることができる。プライマーおよびプローブを作製する方法は当業者に周知である。このようなプライマーおよびプローブは、１０から５０ヌクレオチド、好ましくは１５から４０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００８６】
また、配列番号２８および配列番号３０のヌクレオチド配列の改変体が本明細書において意図される。このような改変体は、１種以上の塩基対の付加、置換または欠失を含んでもよいが、ただし、このような付加、置換または欠失は、３つの高度に保存された「ヒツチジン−ボックス」領域のいずれかにおいて、または配列番号２９の５’端に見られるシトクロームｂ５様ドメインにおいて生じない。「ヒスチジン−ボックス」領域およびシトクロームｂ５様ドメインは、配列番号２９のアミノ酸の改変体と関連して、本明細書においてより詳細に検討されている。本発明によって包含されるヌクレオチド改変体の例は、以下の表Ａに示されている。
【００８７】
【表１】
【００８８】
また、本発明は他の供給源由来のヌクレオチド配列を包含し、配列番号２８または配列番号３０に対して上述した相補性または一致性を有する。また、配列番号２８または配列番号３０の機能性同等物（すなわち、Δ８−デサチュラーゼを有する配列）は、本発明によって包含される。
【００８９】
また、本発明は、Δ８−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその断片を包含し、ここで、上記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２９を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。このような配列は、ヒト供給源、および他のヒト以外の供給源（例えば、Ｃ．エレガンスまたはマウス）由来であってもよい。
【００９０】
また、本発明は、長さが少なくとも２０個の炭素原子であり、９位の炭素に不飽和を含み、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性または同一性を有する脂肪酸の炭素原子番号８と炭素原子９の間に二重結合を付加することを介してポリ不飽和脂肪酸を脱飽和する（これはΔ８−脱飽和活性を有することを意味する）単離されたおよび／または精製されたポリペプチドを含む（図１０参照）。具体的には、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチドを含む。
【００９１】
また、配列番号２９の配列を有するポリペプチドの断片が本明細書において意図される。このような断片は、１０から４００個の連続したアミノ酸、１０から３００個の連続したアミノ酸、１０から２００個の連続したアミノ酸ｊ、１０から１００個の連続したアミノ酸、１０から５０個の連続したアミノ酸、１０から４０個の連続したアミノ酸または１０から３０個の連続したアミノ酸、１０から２０個のアミノ酸の長さを有することができる。このような断片は、例えば、抗体の調製における免疫原として使用することができる。あるいは、このような断片は、１種以上のイムノアッセイにおける特定の結合パートナーとして使用することができる。
【００９２】
また、配列番号２９の配列を有するポリペプチドの改変体が本明細書において意図される。このような改変体は、１個以上のアミノ酸の付加、置換または欠失を含んでもよいが、ただし、このような付加、置換または欠失は、３つの高度に保存された「ヒスチジン−ボックス」領域のいずれかにおいて、または配列番号２９の５’端で見られるシトクロームｂ５様ドメインにおいて生じない（図２参照）。ヒスチジン−ボックスは、配列番号２９のアミノ酸の位置１５５から１６０（ＨＤＹＬＨ（配列番号３２））、１９７から２０１（ＨＮＴＨＨ（配列番号３３））および３５５から３５９（ＱＴＥＨＨ（配列番号３４））で見出される。５’端のシトクロームｂ５様ドメインは、保存されたヘム結合ＨＰＧＧモチーフ（配列番号２９のアミノ酸位置３８から４１）を有する（図２参照）。このシトクロームｂ５様ドメインは、長鎖ＰＵＦＡ生成に関与するΔ６−、Δ５−およびΔ４−デサチュラーゼなどの多数の「フロントエンド」メンブレン結合したデサチュラーゼ酵素に見出される（Ｎａｐｉｅｒ ＪＡら，（２００３）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ．６８：１３５−４３参照）。シトクロームｂ５は、デサチュラーゼ反応のプロセス中にこれらの酵素における電子供与体として機能すると考えられ、この領域の破壊は酵素活性の喪失または変化をもたらし得る（Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏら，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：６４１−６４６；Ｇｕｉｌｌｏｕ Ｈ．ら，（２００４）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５：３２−４０参照）。本発明によって包含されるアミノ酸改変体の例は、以下の表Ｂに示されている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
Ｃ．Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成
一度、Δ８−デサチュラーゼ酵素をコードする核酸配列（例えば、遺伝子）が単離されおよび／または精製されると、それは、ベクターまたは構築物の使用を介して原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれかに導入することができる。ベクター、例えば、バクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドは、Δ８−デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、および宿主細胞内で機能的であり、上記ヌクレオチド配列によってコードされるΔ８−デサチュラーゼの発現を引き出すことができる任意の調節配列（例えば、プロモーター）を含んでもよい。調節配列は、ヌクレオチド配列と作動的に関連しまたは作動的に連結されている。（調節配列がコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、調節配列はコード配列と「作動的に連結されている」と言われる。）適切なプロモーターの例には、限定されないが、アルコール脱水素酵素、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス極初期、ホエイ酸タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、およびガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター、例えば、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０が挙げられる。さらに、他のタンパク質、酵素（例えば、Δ９−エロンガーゼ）、オリゴ糖、脂質などをコードするヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）などの他の調節配列とともにベクターに含めてもよい。構築物に存在する配列の選択は、所望の発現生成物および宿主細胞の性質に依存する。
【００９５】
上述されるように、一度、ベクターが構築されると、次に、例えばトランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーションを含む、当業者に知られている方法によって選択した宿主細胞に導入され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。その後、宿主細胞は、遺伝子の発現を可能にする適切な条件下で培養され、所望のＰＵＦＡを生成した後、当該技術分野において知られている日常的な技術を用いて回収し、精製される。
【００９６】
適切な原核宿主細胞の例には、限定されないが、エシェリキア・コリ、バチルス・サブチリスなどの細菌、スピルリナ属種（すなわち、藍藻）などのシアノバクテリアが挙げられる。真核細胞は、限定されないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞を含む。真菌細胞は、限定されないが、サッカロミセス属種、カンジダ属種、リポミセス属種、ヤロウイア属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種、ノイロスポラ属種、クリベロマイセス属種、ハンゼヌラ属種、トリコデルマ属種またはピチア属種を含む。特に、真菌細胞は、酵母細胞であってもよく、限定されないが、サッカロミセス属種、カンジダ属種、ハンゼヌラ属種、およびピチア属種が挙げられる。また、酵母は、サッカロミセス・セレビシエであってもよい。植物細胞は、限定されないが、グリシン・マックス（例えば、ダイズ）、ブラシカ属種、カーサマス・ティンクトリアスＬ．（例えば、ベニバナ）、ヘリアンサス・アナス（例えば、ヒマワリ）、ズィー・メイス（例えば、トウモロコシ）、ゴッシピウム属種およびリナム・ウシタティシムム（例えば、亜麻）を含む。
【００９７】
宿主細胞における発現は、一過性または安定的に達成させることができる。一過性発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含むが、複製せず、宿主細胞にほとんど組み込まれない、導入された構築物から生じ得て、または宿主細胞が増殖していない場合に生じ得る。また、一過性発現は、対象遺伝子に作動的に連結された調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって達成され得るが、このような誘導システムは、発現の低い基底レベルをしばしば示す。安定な発現は、宿主ゲノムに組み込むことができるまたは宿主細胞において自律複製する構築物の導入によって達成することができる。対象遺伝子の安定な発現は、発現構築物に配置されたまたは発現構築物を用いてトランスフェクトされた選択マーカーの使用を介して選択された後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。安定的な発現が組み込みに起因する場合、構築物の組み込みの部位は、宿主ゲノム内でランダムに生じ得て、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性の領域を含む構築物の使用を介して標的とすることができる。構築物が内因性遺伝子座に標的とされる場合、転写および翻訳の調節領域の全部または一部は、内因性遺伝子座によって提供することができる。
【００９８】
また、トランスジェニック哺乳動物は、Δ８−デサチュラーゼ酵素を発現させ、最終的に対象とするＰＵＦＡ（単数以上）を発現させるために使用されてもよい。より具体的には、一度、上述した構築物が作製されると、それは胚の前核に挿入されてもよい。次に、胚は、レシピエントの雌に移植されてもよい。あるいは、核導入法もまた利用することができる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７８：２１３０−２１３３（１９７７））。その後、妊娠および出産が可能となる（例えば米国特許第５，７５０，１７６号および米国特許第５，７００，６７１号参照）。続いて、子孫からの乳汁、組織または他の流体物試料は、非トランスジェニック動物に通常見出されるレベルと比較して、変化したレベルのＰＵＦＡを含まなければならない。後続世代は、変化したまたは増加したレベルのＰＵＦＡの生成についてモニターされ、従って、所望のデサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のそれらのゲノムへの組み込みについてモニターされてもよい。宿主として利用される哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびウシであってもよい。しかしながら、任意の哺乳動物は、対象とする酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組み込む能力を有する限り使用され得る。
【００９９】
Δ８−デサチュラーゼポリペプチドの発現に関して、機能的転写および翻訳開始および終端領域は、このデサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に連結される。転写および翻訳開始および終端領域は、種々の非排他的な起源、例えば、発現させようとするＤＮＡ、所望のシステムにおいて発現可能であることが知られているもしくは疑われる遺伝子、発現ベクター、化学合成、または宿主細胞における内因性遺伝子座に由来する。植物組織および／または植物部分における発現は、特に、組織または部分が種子、葉、果実、花、根などの早期回収されるものである場合にある種の効率を示す。発現は、米国特許第５，４６３，１７４号、同第４，９４３，６７４号、同第５，１０６，７３９号、同第５，１７５，０９５号、同第５，４２０，０３４号、同第５，１８８，９５８号、および同第５，５８９，３７９号に記載されている調節配列などの特定の調節配列を利用することによって植物を用いてその位置に標的化され得る。あるいは、発現されるタンパク質は、直接にまたはさらに修飾に応じてのいずれかで、宿主植物から流体物画分に組み込まれ得る生成物を生成する酵素であってもよい。Δ８−デサチュラーゼ遺伝子またはアンチセンスΔ８−デサチュラーゼ転写産物の発現は、植物部分および／または植物組織に見出される特定のＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルを変化させることができる。Δ８−デサチュラーゼポリペプチドのコーディング領域は、それ自体でまたは他の遺伝子（例えば、Δ９−エロンガーゼをコードする遺伝子、Δ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ１７−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ５−エロンガーゼをコードする遺伝子および／またはΔ４−デサチュラーゼをコードする遺伝子）と共に発現させ、より高い比率の所望のＰＵＦＡを含むまたはＰＵＦＡ組成が人乳により酷似している組織および／または植物部分を生成することができる（ＷＯ９５／２４４９４参照）。終端領域は、開始領域が得られた遺伝子の３’領域または異なる遺伝子に由来してもよい。多数の終端領域は、同一および異なる属および種由来の種々の宿主で満足できるものとして知られ、見出されている。終端領域は、任意の特性のためというよりもむしろ便宜上の事項として通常は選択される。
【０１００】
上述のように、植物（例えば、グリシン・マックスまたはブラシカ・ナプス（キャノーラ））または植物組織はまた、Δ８−デサチュラーゼ酵素の発現のためにそれぞれ宿主または宿主細胞として利用し、続いて、ポリ不飽和脂肪酸の生成に利用されてもよい。より具体的には、所望のＰＵＦＡは種子で発現され得る。種子油の分離方法は当該技術分野において知られている。したがって、ＰＵＦＡのための供給源の提供に加えて、Δ８−デサチュラーゼ遺伝子、エロンガーゼ遺伝子（例えば、Δ９−エロンガーゼ、Δ５−エロンガーゼなど）、および他のデサチュラーゼ遺伝子（例えば、Δ５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ４−デサチュラーゼなど）の発現を通じて操作され、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料および化粧品に添加し得る種子油を提供することができる。また、プロモーターに作動的に連結されたΔ８−デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターは、Δ８−デサチュラーゼ遺伝子の発現に十分な時間および条件下で植物組織または植物に導入される。また、このベクターは、他の酵素、例えばΔ４−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ１０−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ１９−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、Δ６−エロンガーゼおよび／もしくはΔ５−エロンガーゼをコードする１種以上の遺伝子を含んでもよい。植物組織または植物は、酵素が作用する関連基質を生成してもよく、またはこのような基質を生成する酵素をコードするベクターが植物組織、植物細胞または植物に導入されてもよい。さらに、基質は、適切な酵素を発現する植物組織に噴霧されてもよい。これらの様々な技術を用いて、当業者は、植物細胞、植物組織または植物の使用によってＰＵＦＡを生成してもよい。本発明はまた、上述したベクターを含むトランスジェニック植物を包含し、ここで、このベクターのヌクレオチド配列の発現は、例えば、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらすことも留意すべきである。
【０１０１】
単一の植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換された外植片からの植物の再生、発生および培養は当該技術分野において周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（１９８８））。この再生および増殖方法は、典型的には、形質転換された細胞を選択するステップ、通常の胚発生から挿し木苗段階を通じて個別化された細胞を培養するステップを含む。トランスジェニック胚および種子は同様に再生させる。得られたトランスジェニック挿し木苗は、その後、土壌等の適切な植物成長培地において植え付けられる。
【０１０２】
対象とするタンパク質をコードする外来の外因性遺伝子を含む植物の発生または再生は当該技術分野において周知である。好ましくは、再生された植物は、自家受粉させ、同型のトランスジェニック植物を提供する。さもなければ、再生された植物から得られた花粉が、栽培学的に重要な系列の種子成長植物に交配される。逆に言うと、これらの重要系列の植物由来の花粉は、再生された植物に受粉させるために使用される。所望のポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知な方法を用いて栽培される。
【０１０３】
植物組織から植物を再生させるための様々な方法がある。再生の特定の方法は、出発植物組織および再生させようとする特定の植物種に依存する。
【０１０４】
主にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用して双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法は、ワタ（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）；ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、ＭｃＣａｂｅら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３（１９８８），Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））；アブラナ属（米国特許第５，４６３，１７４号）；ピーナッツ（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６），ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））；パパイヤ；およびエンドウ（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について公表されている。
【０１０５】
また、エレクトロポレーション、粒子衝撃およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる単子葉植物の形質転換が報告されている。形質転換および植物再生は、アスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４，（１９８７））；オオムギ（ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７（１９９４））；ズィー・メイス（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４（１９８８），Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８（１９９０），Ｆｒｏｍｍら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３（１９９０），Ｋｏｚｉｅｌら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１；１９４，（１９９３），Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５：５５０−５５７（１９９５））；オート麦（Ｓｏｍｅｒｓら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９（１９９２））；オーチャードグラス（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８８））；コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：３７９，（１９８８）；ＢａｔｔｒａｗおよびＨａｌｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７（１９９１））；ライ麦（Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：２７４（１９８７））；サトウキビ（ＢｏｗｅｒおよびＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２））；ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６９１（１９９２））、および小麦（Ｖａｓｉｌら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号）において達成されている。
【０１０６】
クローニングされた核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のアッセイは、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃により核酸分子を植物細胞に導入することによって開発されつつある（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ ６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【０１０７】
一過性発現システムは、遺伝子構築物を機能的に分析するために用いられてもよい（一般にはＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。本発明の核酸分子のいずれかは、ベクター、プロモーター、エンハンサーなどの他の遺伝子エレメントと共に永久的にまたは一過性に植物細胞に導入可能であることが理解される。
【０１０８】
上記で検討された方法に加えて、実施者は、巨大分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離、組換え生物の作成ならびにクローンのスクリーニングおよび単離のための特定の条件および手法を記載している標準的な資料に精通している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。
【０１０９】
上記を考慮すると、本発明はまた、Δ８−デサチュラーゼ酵素を生成するための方法を包含する。このような方法は、１）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；２）上記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップ；および３）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で上記ベクターを宿主細胞に導入するステップを含む。
【０１１０】
また、本発明は、ポリ不飽和脂肪酸を生成する方法を包含する。一態様において、この方法は、１）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；２）調節配列に作動的に連結された、ステップ１）の単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；３）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下でこの発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；および４）発現したΔ８−デサチュラーゼ酵素をω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸またはω６−エイコサジエン酸およびω３−エイコサトリエン酸の両方からなる群から選択される基質に曝露し、この基質を第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換することを伴う。この方法によって生成され得る第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸の例は、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡまたはＤＬＧＡおよびω３−ＥＴＡの両方である。さらに、この方法は、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼまたは少なくとも１つのエロンガーゼに曝露するステップ、必要に応じて、このステップ（すなわち、第２または続く生成物のポリ不飽和脂肪酸を（以前に使用された任意のデサチュラーゼまたはエロンガーゼと同一であるまたは異なっていてもよい）デサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露するステップ）を繰り返して、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ＤＧＬＡおよび／またはω３−ＥＴＡ）を第２または続く（例えば、第３、第４、第５、第６など）生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップをさらに伴うことができる。このステップは、所望の生成物のポリ不飽和脂肪酸が得られるまで必要に応じて何度でも繰り返すことができる。例えば、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸がＤＧＬＡである場合、この方法はＡＲＡ（第２の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに曝露することをさらに含んでもよい。場合により、次に、ＡＲＡはＥＰＡ（第３の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにΔ１７−デサチュラーゼに曝露されてもよい。なおさらに場合により、ＥＰＡはＤＰＡ（第４の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにΔ５−エロンガーゼに曝露されてもよい。なおさらに場合により、ＤＰＡはＤＨＡ（第５の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成するためにΔ４−デサチュラーゼに曝露されてもよい。
【０１１１】
別の態様において、この方法は、１）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；２）調節配列に作動的に連結された、単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；３）２）の発現ベクター、およびΔ９−エロンガーゼ（例えば、Δ９−エロンガーゼをコードする単離されたヌクレオチド配列について報告する米国特許出願公開第２００８／０２１４６６７参照）をコードする少なくとも１つの調節配列に作動的に連結された、単離された塩基配列を含む少なくとも１つの追加の組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ；および４）曝露されたΔ８−デサチュラーゼ酵素およびΔ９−エロンガーゼをＬＡ、ＡＬＡまたはＬＡおよびＡＬＡからなる群から選択される基質に曝露し、この基質を第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換することを伴う。この方法によって生成され得る第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸の例は、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡまたはＤＧＬＡおよびω３−ＥＴＡの両方である。さらに、この方法は、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼまたは少なくとも１つのエロンガーゼに曝露し、このステップ（すなわち、第２または続く生成物のポリ不飽和脂肪酸を（以前に使用された任意のデサチュラーゼまたはエロンガーゼと同一であるまたは異なっていてもよい）デサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露すること）を繰り返して、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ＤＧＬＡおよび／またはω３−ＥＴＡ）を第２または続く（例えば、第３、第４、第５、第６など）生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップを伴ってもよい。このステップは、所望の生成物のポリ不飽和脂肪酸が得られるまで必要に応じて何度でも繰り返すことができる。例えば、第１の生成物のポリ不飽和脂肪酸がＤＧＬＡである場合、この方法はＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに曝露し、ＡＲＡ（第２の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することをさらに含むことができる。必要に応じて、次に、ＡＲＡはΔ１７−デサチュラーゼに曝露され、ＥＰＡ（第３の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することができる。なおさらに必要に応じて、ＥＰＡはΔ５−エロンガーゼに曝露されて、ＤＰＡ（第４の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することができる。なおさらに必要に応じて、ＤＰＡはΔ４−デサチュラーゼに曝露され、ＤＨＡ（第５の生成物のポリ不飽和脂肪酸）を生成することができる。
【０１１２】
したがって、上記によって例示されるように、本発明のΔ８−デサチュラーゼは、ポリ不飽和脂肪酸の生成に使用され、続いて、特定の有益な目的のために使用されてもよく、または他のポリ不飽和脂肪酸の生成に使用されてもよい。
【０１１３】
Ｄ．Δ８−デサチュラーゼ遺伝子の使用
上述のように、単離されたΔ８−デサチュラーゼ遺伝子およびそれによってコードされるΔ８−デサチュラーゼ酵素は多数の用途を有する。例えば、この遺伝子および対応する酵素は、ポリ不飽和脂肪酸の生成に間接的にまたは直接的に使用されてもよく、例えば、Δ８−デサチュラーゼはＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ω３−ＥＴＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡの生成に使用されてもよい。これらのポリ不飽和脂肪酸（すなわち、Δ８−デサチュラーゼ酵素の活性によって直接的または間接的に生成されるもの）は、例えば、栄養組成物、医薬組成物、化粧品および動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に包含される。これらの用途は以下に詳細に記載されている。
【０１１４】
Ｅ．栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。このような組成物は、本発明の目的では、生体内に取込まれると、（ａ）組織に栄養分を与えもしくは強化しまたはエネルギーを供給するように役割を果たし、および／または（ｂ）十分な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持する、腸内または非経口的な消費を含むヒト消費用の任意の食物または調製物を含む。
【０１１５】
本発明の栄養組成物は、本発明に従って、本明細書に記載されているΔ８−デサチュラーゼ遺伝子の使用によって直接的にまたは間接的に生成された少なくとも１つの油または酸を含み、固体形態または液体形態であってもよい。さらに、この組成物は特定用途に望まれる量の食用多量養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。このような成分の量は、組成物がある種の代謝状態（例えば、代謝異常）を伴うものなどの特殊な必要性を有する、正常な健常の乳児、幼児または成人に使用することが意図されるのかどうかに依存して変化する。
【０１１６】
組成物に添加されてもよい主要栄養素の例には、限定されないが、食用脂、糖質およびタンパク質が挙げられる。このような食用脂の例には、限定されないが、ココナッツオイル、ダイズ油、モノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。このような糖質の例には、限定されないが、グルコース、食用ラクトースおよび加水分解されたデンプンが挙げられる。さらに、本発明の栄養組成物に利用可能なタンパク質の例には、限定されないが、ダイズタンパク質、電気透析されたホエイ、電気透析されたスキムミルク、乳清またはこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられる。
【０１１７】
ビタミンおよびミネラルに関して、下記：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、ビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ複合体が、本発明の栄養組成物に添加されてもよい。他のこのようなビタミンおよびミネラルもまた添加されてもよい。
【０１１８】
本発明の栄養組成物に利用される成分は半精製されたまたは精製されたものである。半精製または精製とは、天然材料の精製によってまたは合成によって調製された材料を意味する。
【０１１９】
本発明の栄養組成物の例は、限定されないが、乳児用調製物、栄養補助食品、栄養代用食品および再水和組成物が挙げられる。特に対象とする栄養組成物は、限定されないが、乳児用の腸内および非経口補給剤、特殊乳児用調製物、高齢者用補給剤、および胃腸障害および／または吸収不良のある者のための補給剤が挙げられる。
【０１２０】
また、本発明の栄養組成物は、食事の補給が必要とされない場合でさえも食品に添加することができる。例えば、この組成物は、任意の種類の食品に添加されてもよく、例えば、限定されないが、マーガリン、調製バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、菓子、サラダ油、調理用油、調理用油、肉類、魚および飲料が挙げられる。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態では、栄養組成物は経腸栄養製品であり、成人または小児の経腸栄養製品がより好ましい。この組成物は、慢性または急性の疾患状態によりストレスを受けたまたは特殊処置を必要とする成人または小児に投与されてもよい。組成物は、本発明に従って製造されるポリ不飽和脂肪酸に加えて、上記のような主要栄養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。主要栄養素は、人乳に含まれるものと同等な量またはエネルギー基準、すなわちカロリー当たりの基準で存在されてもよい。
【０１２２】
液体または固体の経腸および非経口栄養製剤を処方する方法は当該技術分野において周知である。
【０１２３】
経腸製剤は、例えば、滅菌され、その後、即時使用（ＲＴＦ）ベースで利用されてもよく、または濃縮液体もしくは粉末で保存されてもよい。粉末は、前述の通りに調製された製剤を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和により再構成することによって調製することができる。成人および小児栄養製剤は当該技術分野において周知であり、市販されている（例えば、Ｒｏｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，オハイオ州コロンバスのＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明に従って生成された油または酸は、これらの製剤のいずれかに添加されてもよい。
【０１２４】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態である場合、約０．６Ｋｃａｌ／ｍｌから約３Ｋｃａｌ／ｍｌの範囲であってもよい。固体または粉末の形態の場合、栄養補給剤は、約１．２から９Ｋｃａｌ／ｇを超え、好ましくは約３から７Ｋｃａｌ／ｇを含むことができる。一般に、液体製品の浸透圧は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満でなければならない。
【０１２５】
栄養製剤は、本発明に従って製造されたＰＵＦＡに加えて、上述される主要栄養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。これらの追加成分の存在は、個体がこれらの要素を毎日最小必要量を摂取することを助ける。ＰＵＦＡ供給に加えて、亜鉛、銅、葉酸および酸化防止剤をこの組成物に添加することが望まれる場合もある。これらの物質は、ストレス下にある免疫システムを強化し、したがって、組成物を受ける個体にさらなる利益を与えると考えられる。また、医薬組成物がこれらの成分で補足されてもよい。
【０１２６】
より好ましい実施形態では、栄養組成物は、酸化防止剤および少なくとも１つのＰＵＦＡに加えて、糖質供給源を含み、ここで、糖質の少なくとも５重量％は消化しにくいオリゴ糖である。より好ましい実施形態では、栄養組成物はタンパク質、タウリンおよびカルニチンをさらに含む。
【０１２７】
上述のように、本発明に従って製造されたＰＵＦＡまたはその誘導体は、静脈内栄養補給を受けている患者に対して、または栄養不良もしくは他の状態もしくは疾患状態の予防または治療のために栄養代用食品または栄養補助食品、特に乳児用調製剤に添加され得る。背景として、人乳は、ＤＨＡとして約０．１５％から約０．３６％、ＥＰＡとして約０．０３％から約０．１３％、ＡＲＡとして約０．３０％から約０．８８％、ＤＧＬＡとして約０．２２％から約０．６７％、およびＧＬＡとして約０．２７％から約１．０４％を含む脂肪酸プロファイルを有することに留意すべきである。したがって、本発明に従って製造されるＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡなどの脂肪酸は、例えば、人乳のＰＵＦＡ含有量を良好に再現し、ヒト以外の哺乳動物の母乳に通常見出されるＰＵＦＡの存在を変えるために使用することができる。特に、薬理学的補給剤または食品補給剤、特に母乳代用剤または補給剤において使用するための組成は、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡおよびＤＨＡの１種以上を含むことが好ましい。より好ましくは、この油は、約０．３から３０％のＡＲＡ、および約０．２から３０％のＤＧＬＡを含む。
【０１２８】
トリグリセリドとして計算された約２から約３０重量％の脂肪酸を含む非経口医薬組成物は本発明によって包含される。他のビタミン、特に脂溶性ビタミン、例えば、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＬ−カルニチンが必要に応じて含まれてもよい。所望により、アルファ−トコフェロールなどの防腐剤は約０．１重量％で添加されてもよい。
【０１２９】
さらに、ＡＲＡとＤＧＬＡの比は、特別な所定の最終用途に適合させることができる。母乳補給剤または代用剤として処方される場合、ＡＲＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの１種以上を含む組成物は、それぞれ約１：１９：３０から約６：１：０．２の比で提供される。例えば、動物の母乳は、１：１９：３０から６：１：０．２の範囲のＡＲＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡの比で変化することができ、約１：１：１、１：２：１、１：１：４である中間比を含むことが好ましい。宿主細胞においてともに製造される場合、ＥＤＡおよびＤＧＬＡなどの前駆体基質からＡＲＡへの変換率は、ＰＵＦＡ比を厳密に制御するために使用され得る。例えば、ＤＧＬＡからＡＲＡへの５％から１０％の変換率は、約１：１９のＡＲＡ：ＤＧＬＡ比を生成するために用いることができ、一方、約７５％から８０％の変換率は、約６：１のＡＲＡ：ＤＧＬＡ比を生じさせるために用いることができる。したがって、細胞培養システムにおいてまたは宿主動物においてであるかに関係なく、デサチュラーゼ発現の時期、程度および特異性の制御、ならびにエロンガーゼ（例えば、限定されないがΔ９エロンガーゼなど）および他のデサチュラーゼの発現を制御することは、ＰＵＦＡレベルおよび比を調節するために用いることができる。次に、本発明に従って生成されるＰＵＦＡ／酸（例えばＡＲＡおよびＥＰＡ）は、所望濃度および比で他のＰＵＦＡ／酸（例えばＧＬＡ）と組み合わせてもよい。
【０１３０】
さらに、本発明に従って製造されたＰＵＦＡまたはこれらを含む宿主細胞はまた、動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物消費のために望まれるもう１つのものに変えるために動物の飼料補給剤として使用されてもよい。
【０１３１】
本発明に従って生成されたポリ不飽和脂肪酸を使用する栄養補給剤、乳児用調製剤、栄養代用剤および他の栄養溶液の例は、以下に記載されている。
【０１３２】
Ｉ．乳児用調製剤
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄分配合ダイズフォーミュラ：
用途：牛乳に対するアレルギーまたは感受性を有する乳児、幼児および成人用飲料として。ラクトースが避けなければならない障害：ラクターゼ欠乏症、ラクトース不耐症およびガラクトース血症の患者のための食事。
【０１３３】
特徴：
−牛乳タンパク質のアレルギーまたは感受性の症状を避けるためのダイズタンパク質単離体。
−ラクトースに関連した下痢を避けるためのラクトース不含製剤。
−低浸透圧（２００ｍＯｓ／ｋｇ水）。
−吸収を最大にし、吸収不良の危険を最小にするように設計された二重糖質（コーンシロップとショ糖）。
【０１３４】
成分：４３．２％コーンシロップ固体、１４．６％ダイズタンパク質単離体、１１．５％高オレイン酸ベニバナ油、１０．３％糖（ショ糖）、８．４％ダイズ油、８．１％ココナッツ油：２％未満のリン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、アスコルビン酸、塩化コリン、Ｌ−メチオニン、タウリン、パルミチン酸アスコルビル、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、混合トコフェロール、硫酸亜鉛、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、ヨウ化カリウム、水酸化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ベータ−カロチン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３５】
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ下痢用ダイズフォーミュラ：
用途：乳幼児の下痢の食事管理用
特徴：
−特に下痢管理用としてダイズ繊維からの添加された食物繊維を含む最初の乳児用調製剤。
−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に示された。
−ラクトースに関連した下痢を避けるためのラクトース不含処方。
−浸透圧性下痢の危険性を減らすための低浸透圧（２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）
成分：８５．７％水、４．８％コーンシロップ、２．６％糖（ショ糖）、２．１％ダイズ油、２．０％ダイズタンパク質単離物、１．４％ココナッツ油、０．７７％ダイズ繊維、クエン酸カルシウム、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、モノグリセリドおよびジグリセリド、ダイズレシチン、塩化マグネシウム、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３６】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）鉄分配合ショ糖フォーミュラ
用途：牛乳に対するアレルギーもしくは感受性を有する乳児、幼児および成人用飲料として。ラクトースが避けなければならない障害：ラクターゼ欠乏症、ラクトース不耐症およびガラクトース血症の患者のための食事。
【０１３７】
特徴：
−精神的および視覚的発育に重要である母乳に見られるＤＨＡおよびＡＲＡの２つの栄養素を含む。
−牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を避けるためのダイズタンパク質単離物。
−ラクトースに関連した下痢を避けるためのラクトース不含処方。
−低浸透圧（２００ｍＯｓ／ｋｇ水）。
−吸収を最大にし、吸収不良の危険性を最小にするように設計された二重糖質（コーンシロップおよびショ糖）。
成分：４３．２％コーンシロップ固体、１４．６％ダイズタンパク質単離物、１１．５％高オレイン酸ベニバナ油、１０．３％糖（ショ糖）、８．４％ダイズ油、７．７％ココナッツ油、Ｃ．コーニイ（ｃｏｈｎｉｉ）油、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）油、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、アスコルビン酸、塩化コリン、Ｌ−メチオニン、タウリン、パルミチン酸アスコルビル、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、混合トコフェロール、硫酸亜鉛、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、ヨウ化カリウム、水酸化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ベータ−カロチン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３８】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）２０即時使用の鉄分配合ダイズフォーミュラ、２０Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ．：
用途：ダイズ摂取が望まれる場合。
【０１３９】
成分：８５．９％水、６．７％コーンシロップ、１．９％ ダイズタンパク質単離体、１．４％高オレイン酸ベニバナ油、１．３％糖（ショ糖）、１．１％ダイズ油、１．０％ココナッツ油、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、モノグリセリドおよびジグリセリド ジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、アルコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１４０】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用フォーミュラ：
用途：乳児用フォーミュラが必要とされる場合：１歳未満で授乳の中断を決定した場合、授乳の補完が必要な場合、または授乳を採用しない際の日常食。粉末、濃縮液および即時使用の形態。
【０１４１】
成分：水、脱脂乳、ラクトース、高オレイン酸ベニバナ油、ダイズ油、ココナッツ油、ホエイタンパク質濃縮物、クエン酸カリウム、炭酸カルシウム、アルコルビン酸、ダイズレシチン、モノグリセリド、カラゲナン、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化コリン、酒石酸水素コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、パントテン酸カルシウム、ｌ-カルニチン、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、ベータ−カロチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、シアノコバラミン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、水酸化カリウムおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４２】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）鉄分配合乳児用フォーミュラ
用途：授乳の補給または代替としての使用。粉末、濃縮液および即時使用の形態。
【０１４３】
成分：水、脱脂乳、ラクトース、高オレイン酸ベニバナ油、ダイズ油、ココナッツ油、ホエイタンパク質濃縮物、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、クエン酸カリウム、炭酸カルシウム、アルコルビン酸、ダイズレシチン、モノグリセリド、カラゲナン、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化コリン、酒石酸水素コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、パントテン酸カルシウム、ｌ−カルニチン、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、ベータ−カロチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、シアノコバラミン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、水酸化カリウムおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−
モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４４】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＳｕｒｅ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）鉄分配合乳児用フォーミュラ
用途：早熟などの状態のための特殊フォーミュラ
特徴：
−２５％添加された中位鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）を含む十分に吸収される脂肪混和物。
−標準項式よりも高いレベルの１００Ｃａｌあたりのタンパク質、ビタミンおよびミネラル。
−標準項式よりも多くのカルシウムおよびリン。
成分：脱脂乳、コーンシロップ固体、ラクトース、ダイズ油、高オレイン酸ベニバナ油、ホエイタンパク質濃縮物、中位鎖トリグリセリド、ココナッツ油、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム、ｍ−イノシトール、アルコルビン酸、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、タウリン、硫酸第一鉄、酒石酸水素コリン、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、混合トコフェロール、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、クエン酸ナトリウム、ナイアシンアミド、リン酸カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、ベータカロチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、シアノコバラミンおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４５】
Ｈ．Ｓｉｍｉｌａｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃａｒｅ Ａｄｖａｎｃｅ即時使用の低鉄分人乳強化剤、２４Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ．：
用途：低出生体重の乳児に対して、人乳と混合されるようにまたは人乳の代替として与えられるように設計される。
【０１４６】
成分：水、脱脂乳、コーンシロップ固体、ラクトース、中位鎖トリグリセリド、ホエイタンパク質濃縮物、ダイズ油、ココナッツ油、Ｃ．コーニイ油、Ｍ．アルピナ油、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、アルコルビン酸、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、ダイズレシチン、モノグリセリドおよびジグリセリド、ｍ−イノシトール、クエン酸ナトリウム、カラゲナン、酒石酸水素コリン、タウリン、塩化コリン、ナイアシンアミド、酢酸ｄ−アルファトコフェリル、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、塩化カリウム、二塩基性リン酸カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、ベータカロチン、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム、シアノコバラミンおよびヌクレオチド（アデノシン５’−モノリン酸、シチジン５’−
モノリン酸、グアノシン２ナトリウム５’−モノリン酸、ウリジン２ナトリウム５’−モノリン酸）。
【０１４７】
本発明の様々なＰＵＦＡは、上記の乳児用フォーミュラおよび当該技術分野において知られている他の乳児用フォーミュラに代えておよび／またはそれに添加することができる。
【０１４８】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：濃厚でクリーミーな味のＥＮＳＵＲＥは、食間または食事とともに補助的に使用するため、および一時的な唯一の供給源を提供するための完全なバランスのとれた栄養素の供給源を提供する。ＥＮＳＵＲＥは、栄養の危険にある、意図的でない体重減少を経験した、病気もしくは外科的処置から回復した、または変更されたもしくは低残渣の食事を取っている者に恩恵を与えることができる。経口的食事を目的とする。一時的な単独供給源の提供を目的とする。補助的経口栄養素成分のための小売用製品。
【０１４９】
成分：水、糖（ショ糖）、コーンマルトデキストリン、ミルクタンパク質単離物、ダイズ油、コーン油、菜種油、ダイズタンパク質濃縮物、クエン酸カリウム、天然および人工的なフレーバー、リン酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、ダイズレシチン、リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化コリン、カラギナン、アルコルビン酸、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ヨウ化カリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５０】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、食事に特別なタンパク質および栄養素を必要とする者に有用である。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、一般の外科的処置または股関節もしくは他の骨の骨折から回復中の者による使用に適し、床擦れであるまたは床擦れの危険にある者のための栄養素の良好な供給源である。補助的経口栄養素を目的とする。
【０１５１】
成分：水、糖（ショ糖）、コーンマルトデキストリン、カゼインカルシウムおよびカゼインナトリウム、ダイズ油、ダイズタンパク質単離物、コーン油、クエン酸カリウム、菜種油、リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、人工香味料（塩化ナトリウム）、ダイズレシチン、塩化コリン、アルコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸第一鉄、ジェランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５２】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、患者に健康体重を増加させるまたは維持させるのを助けるために、高カロリーおよびタンパク質を提供する完全なバランスのとれた栄養素の供給源である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、食事とともにもしくは食間または食事の代用として使用することができる。経口的食事を目的とする。一時的な単独供給源の提供を目的とする。水分制限された患者または容量が制限された食事を必要とする患者を対象とする。
【０１５３】
特徴：
−心臓の健康を支持するための６５０ｍｇのオメガ−３脂肪酸ＡＬＡ（１．６ｇ ＲＤＩの４０％）。
−２４種のビタミンおよびミネラルの優れた供給源。
−免疫システムを強化するための抗酸化剤のセレンならびにビタミンＣおよびＥの供給源。
−コレステロールの低下。
−コーシャー。
−グルテン不含。
−ラクトース不含。
【０１５４】
成分：バニラ：水、コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、コーン油、カゼインナトリウおよびカゼインムカルシウム、糖（ショ糖）、ダイズタンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、ダイズレシチン、天然および人工的なフレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アルコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸アルファ−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０１５５】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成される）は、食事とともにまたは食間での補助的使用のための完全にバランスのとれた栄養素である。ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲは、変更された食事である、栄養素が危険である、意図的でない体重減少を経験した、病気もしくは外科的処置から回復した、または低残渣の食事を取っている者に恩恵を与え得る。
【０１５６】
特徴：
−便利であり、混合が容易である。
−低残渣。
−ラクトースおよびグルテン不含。
成分：コーンシロップ、コーンマルトデキストリン、糖（ショ糖）、コーン油、カゼインナトリウムおよびカルシウム、ダイズタンパク質単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、塩化カリウム、ダイズレシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０１５７】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、他の菓子またはデザートの栄養素代替物である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、美味しく食べやすい形態の完全にバランスのとれた栄養素を提供する。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、体重不足もしくは栄養不良である者または水分制限されたもしくは容量がされた食事を取っている者に適している。固さが調節された食事（例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体）を取っている者を対象とする。嚥下障害のある者を対象とする。補助的な経口的栄養素を目的とする。
【０１５８】
特徴：
−２４種の必須ビタミンおよびミネラルの良好な供給源。
−冷凍不要の便利なもの。
−グルテン不含。
−給仕あたり１ｇまたはＦＯＳを含む（ＦＯＳは結腸中の有益細菌の増殖を刺激するプレバイオティックである）。
成分：
バニラ：水、糖（ショ糖）、加工コーンスターチ、部分的に水素化されたダイズ油、ミルクタンパク質濃縮物、脱脂乳、フラクトオリゴ糖、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸第一鉄、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５および＃６、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、パルミチン酸ビタミンＡ、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５９】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＦＩＢＥＲは、食物繊維および栄養素の増加から恩恵を受けることができる者のための完全にバランスのとれた栄養素の供給源である。ＦＯＳ、プレバイオティックとのファイバーブレンドは、消化管の健康の維持を助ける。ＥＮＳＵＲＥ
ＦＩＢＥＲは、低残渣を必要としない者に適している。ＥＮＳＵＲＥ ＦＩＢＥＲは、経口的にまたは管によって与えることができる。ＥＮＳＵＲＥ ＦＩＢＥＲは、変更された食事である、栄養素が危険である、意図的でない体重減少を経験した、病気もしくは外科的処置から回復した者に恩恵を与え得る。経口的な提供を目的とする。一時的な単独供給源の提供を目的とする。
【０１６０】
特徴：
−１ｇのＦＯＳ／８ｆｌ ｏｚ．を含む。ＦＯＳファイバー（消化されない糖質）は結腸中の自然防御の促進を助ける。
−２４種の必須ビタミンおよびミネラルの優れた供給源。
−８−ｆｌ−ｏｚ給仕あたり２．８ｇの全食物繊維を提供する。
−ラクトースおよびグルテン不含。
【０１６１】
成分：
バニラ：水；コーンマルトデキストリン、糖（ショ糖）、カゼインナトリウムおよびカルシウム、ダイズ油、ダイズタンパク質単離物、コーン油、オート麦繊維、フラクトオリゴ糖、菜種油、ダイズ繊維、リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、ダイズレシチン、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然および人工的なフレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アルコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラギナン、硫酸第一鉄、酢酸ｄ１−アルファ−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１６２】
上記されたおよび当業者に知られている種々の栄養補給剤は、本発明に従って生成されるＰＵＦＡで置換されるおよび／またはＰＵＦＡで補足され得る。
【０１６３】
Ｇ．Ｏｘｅｐａ（商標）栄養製品
Ｏｘｅｐａ（商標）は、重病患者、人工呼吸器を装着した患者における炎症反応を調節することが臨床的に示されている。Ｏｘｅｐａは、敗血症、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）、ＡＬＩ（急性肺障害）またはＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群）を有する患者に適している。管による提供を目的とする。単独供給の栄養素を対象とする。
熱量分布：Ｏｘｅｐａにおける熱量分布は表Ｃに示されている。
【０１６４】
【表３】
【０１６５】
成分：水、カゼインカルシウムおよびカゼインナトリウム、糖（ショ糖）、菜種油、中位鎖トリグリセリド、イワシ油、ルリヂサ油、塩化マグネシウム、リン酸カルシウム、ダイズレシチン、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、アルコルビン酸、リン酸カリウム、天然および人工的なフレーバー、塩化コリン、タウリン、酢酸ｄ−アルファ−トコフェリル、Ｌ−カルニチン、塩（塩化ナトリウム）、ジェランガム、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ベータ−カロチン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１６６】
Ｏｘｅｐａ（商標）栄養製品の様々な脂肪酸成分は、本発明に従って生成されるＰＵＦＡで置換されるおよび／またはＰＵＦＡで補足され得る。
【０１６７】
Ｆ．医薬組成物
また、本発明は、本明細書に記載されている方法に従って、１種以上の酸、および本明細書に記載されているΔ８−デサチュラーゼ遺伝子を用いて生成された得られた油を含む医薬組成物を包含する。より具体的には、このような医薬組成物は、１個以上の酸および／または油、ならびに標準的な周知の非毒性の医薬として許容される担体、アジュバントまたはビヒクル、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤または乳化剤、例えば、水／油乳化剤を含んでもよい。この組成物は液体または固体の形態であってもよい。例えば、組成物は、錠剤、カプセル、摂取可能な液体もしくは粉末、注射可能なもしくは局所的軟膏またはクリームの形態であってもよい。適切な流動性は、例えば、分散の場合に必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合がある。このような不活性希釈剤に加えて、組成物はまた、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤および香味剤を含むことができる。
【０１６８】
懸濁液は、活性な化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントまたはこれらの物質の混合物を含んでもよい。
【０１６９】
錠剤およびカプセルなどの固体投薬形態は、当該技術分野において周知である技術を用いて調製され得る。例えば、本発明に従って生成されるＰＵＦＡは、従来の錠剤基剤、例えば、ラクトース、ショ糖、およびコーンスターチを用いて、結合剤、例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン、崩壊剤、例えば、ポテトスターチまたはアルギン酸、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムと組み合わせて錠剤化することができる。カプセルは、これらの賦形剤をゼラチンカプセルに、抗酸化剤および関連ＰＵＦＡ（単数以上）とともに組み込むことによって調製することができる。抗酸化剤およびＰＵＦＡ成分は、上記で示されたガイドラインに適合しなければならない。
【０１７０】
静脈内投与について、本発明に従って生成されたＰＵＦＡまたはその誘導体は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（商標）などの市販製剤に組み込んでもよい。典型的な健常成人の血漿脂肪酸プロファイルは、６．６４から９．４６％のＡＲＡ、１．４５から３．１１％のＤＧＬＡ、および０．０２から０．０８％のＧＬＡである。これらのＰＵＦＡまたはその代謝前駆体は、患者において正常な脂肪酸プロファイルを達成ために単独でまたは他のＰＵＦＡと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分は、単一または多重使用のためのキットの形態で個々に提供されてもよい。特定の脂肪酸の典型的な用量は、０．１ｍｇから２０ｇ（最大１００ｇ）／日であり、１０ｍｇから１、２、５または１０ｇ／日が好ましい。
【０１７１】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路は、例えば、腸内（例えば、経口および直腸）および非経口を含む。例えば、液体製剤は、例えば、経口的にまたは直腸に投与されてもよい。さらに、均一な混合物は水に完全に分散され、滅菌条件下で生理学的に許容される希釈剤、防腐剤、緩衝剤または推進剤と混合し、噴霧または吸入剤を形成することができる。
【０１７２】
投与経路は、当然に所望の効果に依存する。例えば、組成物が、荒れた、乾燥したまたは老化した皮膚の治療、損傷もしくは火傷した皮膚の治療、または疾患もしくは疾病によって影響を受けた皮膚もしくは毛髪の治療に利用される場合、おそらくは局所的に塗布されてもよい。
【０１７３】
患者に投与される組成物の用量は当業者によって決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態などの種々の因子に依存する。
【０１７４】
形態に関して、組成物は、例えば、溶液、分散液、懸濁液、乳化剤または後に再構成される滅菌粉末であってもよい。
【０１７５】
また、本発明は、本明細書に記載される医薬組成物および／または栄養組成物の使用による様々な障害の治療を含む。特に、本発明の組成物は、血管形成後の再狭窄の治療に使用することができる。さらに、炎症、関節リウマチ、喘息および乾癬の症状は、本発明の組成物を用いて治療することができる。また、証拠は、ＰＵＦＡがカルシウム代謝に関与していることを示している；したがって、本発明の組成物は、おそらくは骨粗鬆症および腎臓または尿管結石の治療または予防に利用できる。
【０１７６】
さらに、本発明の組成物は、癌の治療に用いることができる。悪性細胞は、脂肪酸の組成が変化していることが示されている。脂肪酸の添加は、悪性細胞の増殖を遅くし、細胞死を生じさせ、および化学治療剤に対する感受性を増加させることが示されている。さらに、本発明の組成物は、癌を伴う悪液質の治療に有用である場合がある。
【０１７７】
また、本発明の組成物は、糖尿病の治療に使用することができる（例えば、米国特許第４，８２６，８７７号およびＨｏｒｒｏｂｉｎ ＤＦら，（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。脂肪酸代謝および組成の変化が糖尿病動物において示されている。
【０１７８】
さらに、Δ８−デサチュラーゼ酵素の使用により直接的にまたは間接的に生成されたＰＵＦＡを含む本発明の組成物はまた、湿疹の治療、血圧降下、および数学的な試験スコアの改善に使用できる。さらに、本発明の組成物は、血小板凝集、血管拡張の誘導、コレステロールレベルの低下、血管壁平滑筋および線維組織の増殖阻害（Ｂｒｅｎｎｅｒら，（１９７６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、胃腸出血および非ステロイド抗炎症薬の他の副作用（米国特許第４，６６６，７０１号参照）の低減または予防、子宮内膜症および月経前症候群（米国特許第４，７５８，５９２号参照）の予防または治療、ならびにウイルス感染後の筋痛性脳脊髄炎および慢性疲労（米国特許第５，１１６，８７１号参照）の治療に使用することができる。
【０１７９】
本発明の組成物のさらなる使用は、ＡＩＤＳ、多発性硬化症および炎症性皮膚疾患の治療、ならびに健康維持における使用を含む。
【０１８０】
さらに、本発明の組成物は、化粧目的に利用されてもよい。本発明の組成物は、混合物が形成されるように既存の化粧品組成物に添加されてもよく、または単独組成物として使用されてもよい。
【０１８１】
Ｇ．獣医用途
動物はヒトと同じ必要なものおよび状態の多くを経験するため、上記した医薬組成物および栄養組成物は、動物（すなわち、家畜または非家畜）と関連してヒトと同じく利用することができる。例えば、本発明の油または酸は、動物または水産養殖飼料補給物、動物飼料代用物、動物ビタミンまたは動物局所軟膏に利用することができる。
【０１８２】
本発明は、以下の非限定的な実施例の使用によって説明することができる。
【実施例１】
【０１８３】
エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来のΔ８−デサチュラーゼの単離およびｃＤＮＡライブラリー構築のための縮退オリゴヌクレオチドの設計
ある種の海草の脂肪酸組成の分析は、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８において相当量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）（全脂質の４０重量％）を示した（表１参照）。さらに、この生物は、代替の「Δ８−デサチュラーゼ−Δ９−エロンガーゼ」経路の中間物を示し（図１参照）、この経路がこの生物において活性であることを示す。したがって、この生物は、リノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）をエイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）に変換し、またはアルファ−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）をエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３ｎ−３）に変換することができる活性Δ９−エロンガーゼを含み、さらにエイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）をジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）に変換し、またはω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥｔｒＡ、２０：３ｎ−３）をω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）に変換する活性なΔ８−デサチュラーゼを含むことが予測される（図１参照）。
【０１８４】
【表４】
【０１８５】
本研究の目的は、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８から予測された全長Δ８−デサチュラーゼ遺伝子を単離し、サッカロミセス・セレビシエにおける発現によってその機能性を変化させることであった。そうするために、標準化されたｃＤＮＡライブラリーがエミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８について構築された。エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８の細胞ペレットは、海洋性植物プランクトンのＰｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＭＰ−Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州ウェストブーストベイ）から得た。総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて製造業者の使用説明書により細胞ペレットから精製された。要約すると、凍結された細胞ペレットは、乳鉢および乳棒を用いて液体窒素中で潰され、ＲＬＴ緩衝液（Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ）中に懸濁させ、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒを通過させた。ＲＮＡは、製造業者の使用説明書によりＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムを用いて精製された。
【０１８６】
エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８からの一次ライブラリーおよび標準化されたｃＤＮＡライブラリーは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ウォルサム）によって、彼らの独自の技術を用いて構成された。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔは、第１鎖中のいくつかの独特であり独自のステップを用い、最終的には通常使用される技術と比較して２５から３０％の効率増加となる。その独自の工程中、ＲＮＡは、内部の開始（ｐｒｉｍｉｎｇ）事象を減少または排除するように設計された条件を用いてｓｓＤＮＡに逆転写される。これと特殊化されたサイクルプログラムの組み合わせは、全長クローンの数を増加させる。第２鎖の合成後、次にｃＤＮＡクローンは、１．２ｋｂを超えるサイズで選択され、小さく切断されたｃＤＮＡの選択的なクローニングを減少させる。大きなインサートライブラリーについて、より大きなインサートクローンを増やすために、選択されたインサートサイズは４ｋｂを超える。サイズ選択後、ｃＤＮＡ端が磨かれ、このｃＤＮＡは、レアーカッティング（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｉｎｇ）酵素を用いて消化される。次に、「レアカッター」制限酵素は、この酵素のための部位がｃＤＮＡ開始工程中にクローンに導入され、ｐＡＧＥＮベクターに方向性クローニング用のクローンを調製するために使用される。「レアカッター」は、ｃＤＮＡクローン内で切断するのはおそらく２０回未満であり、したがって、クローンに沿ってランダムな間隔で切断するより一般的な制限酵素を利用する他のｃＤＮＡライブラリー構築プロセスに対して、より多くの全長クローンが得られる。結果物は、レアーカッティング制限酵素から作製された５’平滑部および３’突出部を有するインサートである。このプロセスのため、追加のアダプター連結は、方向性クローニングを確実にするために必要とされない。これは、クローニングプロセスの全体的な効率を改善する。５’アダプターを使用しない方向性クローニングのため、さらに、クローニング中のｃＤＮＡの操作数の減少に起因した形質転換効率を増加させる。一次ｃＤＮＡライブラリーが完成した後、独立したクローンの数、組換えクローンの割合および平均インサートサイズの数について試験される。
【０１８７】
標準化プロセスは、標準ライブラリーを２つの集団に分けることによって開始される。第１の集団は直線化され、ｃＤＮＡかＲＮＡに転写され、ビオチン化されたヌクレオチドを組み込んでいる。第２の集団は、ファージミド生成を介して一本鎖ＤＮＡプラスミドにされる。細胞溶解物中の二本鎖ＤＮＡはＤＮＡｓｅＩを用いて消化される。これは、一本鎖ＤＮＡプレップからの二本鎖ＤＮＡプラスミド汚染を排除する。
【０１８８】
次に、２つの集団が混合され、ｓｓＤＮＡプラスミドからの任意の過剰発現されたクローンは、ビオチン化されたＲＮＡ集団由来のそれらの片方とハイブリダイズする。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔは、ハイブリダイゼーション前にポリ−Ａ領域をプレブロックするためにオリゴｄＴおよびプライマー伸長を用いる。これは、ポリ−ＡクローンとＲＮＡのポリ−Ｕのハイブリダイゼーションを妨げる。ストレプトアビジン／フェノール抽出法を用いて、全てのビオチン化されたハイブリダイズされた対および直線化されたビオチン化されたＲＮＡを取り除き、このようにして、一本鎖の反応性が低い（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）ＤＮＡプラスミドを残す。インサートを含むクローンだけにハイブリダイズするオリゴを用いて、ＤＮＡ合成は二本鎖ｃＤＮＡクローンを再生するために開始される。次に、これらのクローンは細菌に形質転換され、最終的な標準化されたｃＤＮＡライブラリーを作製する。このプロトコールを用いて、力価が２．６×１０７ｃｆｕ／ｍｌである標準化されたｃＤＮＡライブラリーが作製され、得られたコロニーの総数は１．８×１０８であり、平均インサートサイズは１．０５ｋｂであった。
【０１８９】
このライブラリーからΔ８−デサチュラーゼ様の候補物を単離するために、既知のΔ８−デサチュラーゼに存在する保存されたアミノ酸モチーフをコードする縮退オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）が設計された。その後、これらのプライマーは、推定のΔ８−デサチュラーゼにおいてこれらの保存された領域を含むＤＮＡ断片を同定するために、ＰＣＲ反応に用いられた。
【０１９０】
以下の生物由来の既知のΔ８−デサチュラーゼアミノ酸配列がアラインメントおよびプライマーの設計のために使用された：ユーグレナ・グラシアリス（受託番号ＡＦ１３９７２０、配列番号１；図３Ａ）、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（ＷＯ２００７／１２７３８１Ａ２、配列番号２；図３Ｂ）、パブロバ・サリナ（受託番号ＤＱ９９５５１８、配列番号３；図４Ａ）、パーキンサス・マリヌス（受託番号ＤＱ５０８７３０、配列番号４；図４Ｂ）およびアカントアメーバ・カステラーニ（受託番号ＣＳ６０８４８３、配列番号５；図４Ｃ）。
【０１９１】
使用された縮退プライマーは以下の通りであった：
タンパク質モチーフ１：（配列番号３８）：
ＮＨ３−Ｒ Ｄ Ａ Ｔ Ｄ／Ｅ Ａ／Ｑ Ｆ Ｅ／Ｍ Ｓ／Ｖ Ｙ／Ｍ Ｈ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１４（フォワード）（配列番号６）：
５’−ＣＧＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＡＣＧ ＧＡＳ ＳＭＧ ＴＴＣ ＲＷＧ ＫＹＫ ＷＷＳ ＣＡＣ−３‘
このプライマーは、推定シトクロームｂ５ドメインに保存された配列モチーフを含んでいた。
タンパク質モチーフ２：（配列番号３９）：
ＮＨ３−Ｇ Ｗ Ｌ Ａ／Ｓ Ｈ Ｄ Ｙ／Ｉ Ｌ／Ｓ Ｈ Ｈ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１５（フォワード）（配列番号７）：
５’−ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＫＣＫ ＣＡＣ ＧＡＣ ＷＷＣ ＹＹＧ ＣＡＴ ＣＡＣ−３’
このプライマーは「ヒスチジン−ボックス１」を保存した配列モチーフを含んでいた。
タンパク質モチーフ３：（配列番号４０）：
ＮＨ３−Ｗ Ｋ／Ｒ Ａ／Ｌ Ｒ Ｈ Ｎ Ｔ／Ａ Ｈ Ｈ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１６（フォワード）（配列番号８）
５’−ＴＧＧ ＭＲＳ ＳＹＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＡＡＣ ＲＣＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＴＧ ＫＳＣ ＡＧＣ ＡＡＣ−３’
このプライマーは「ヒスチジン−ボックス２」を保存した配列モチーフを含んでいた。
タンパク質モチーフ４：（配列番号４１）：
ＮＨ３−Ｆ Ａ／Ｇ Ｔ Ａ／Ｇ Ｉ／Ｖ Ｖ Ｖ Ｆ Ａ Ｔ Ｈ Ｙ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１７（リバース）（配列番号９）
５’−ＡＴＡ ＧＴＧ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＳＡＹ ＳＳＣ ＣＧＴ ＣＳＣ ＧＡＡ −３’
タンパク質モチーフ５：（配列番号４２）：
ＮＨ３−Ｑ Ｉ／Ｔ Ｅ Ｈ Ｈ Ｌ Ｆ Ｐ Ｔ／Ｍ Ｍ Ｐ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１７１８（リバース）（配列番号１０）
５’−ＧＧＧ ＣＡＴ ＳＲＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＴＣ ＧＲＴ ＣＴＧ−３’
このプライマーは「ヒスチジン−ボックス３」を保存した配列モチーフを含んでいた。
【０１９２】
オリゴヌクレオチド合成のための標準のミックスベース（ＭｉｘＢａｓｅ）はＫ＝Ｇ、Ｔ；Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｓ＝Ｃ、Ｇ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｃ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｂ＝Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔ；Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇ；Ｄ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｘ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔであった。
【実施例２】
【０１９３】
エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８由来の推定Δ８−デサチュラーゼ遺伝子の単離
エミリアナ由来のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、上述した縮退オリゴヌクレオチドの種々の置換体および組み合わせ（実施例１参照）をＰＣＲ反応において使用した。鋳型として標準化されたｃＤＮＡライブラリーから単離された２μｌのプラスミドＤＮＡ、１×ＰＣＲ緩衝液マイナスＭｇＣＬ２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５０ｍＭのＫＣｌ）、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、各々２００μＭのｄＮＴＰ、各々２ｐｍｏｌのプライマーおよびプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０μｌ容積においてＰＣＲ増幅を実施した。９４℃／３分間の初期変性後、（９４℃／３０秒間；５５℃／３０秒間；７２℃／１分間）の３５サイクル、７２℃／５分間の最終伸長のように増幅を実施し、反応を４℃で終了させた。全ＰＣＲ反応生成物を、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、反応生成物を０．８％アガロースゲル上で分離した。適切なサイズのバンド（既知のΔ８−デサチュラーゼに基づく）を、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、これらのＤＮＡ断片を製造業者のプロトコールによりＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンポネント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に入れて形質転換し、クローンの配列を決定した。試験された様々なプライマーセットのうち、既知のΔ８−デサチュラーゼに対して配列類似性を有するＤＮＡ断片を生じさせるための唯一のプライマーの組み合わせは、ＲＯ１７１５およびＲＯ１７１７であった。
【０１９４】
このようにして、以前に単離されたΔ８−デサチュラーゼに配列相同性を示した１つのクローンを単離した。このクローン（ＥＤ３−８）は長さが５３１ｂｐであり、それ由来の推定アミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにおける最高スコアの適合として、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（ＷＯ２００７／１２７３８１Ａ２、配列番号２；図３Ｂ）と６２％のアミノ酸配列同一性を示した。このクローンのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列が示されている（それぞれ配列番号１１および１２；図５および６）。
【０１９５】
ＥＤ３−８断片の５’末端を単離するために、鋳型としてｃＤＮＡライブラリーから精製されたプラスミドＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド（プライマー）：ＲＯ１７２０（配列番号１３）（５’−ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＡＡ Ｇ−３’）およびＲＯ８９９（配列番号１４）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。プライマーＲＯ１７２０は、この推定のΔ８−デサチュラーゼのＥＤ３−８断片に基づいて設計され、プライマーＲＯ８９９はｃＤＮＡライブラリーの調製のために用いられたｐＡＧＥＮベクター由来の配列に対応していた。製造業者の使用説明書により、５０μｌの最終体積に含まれる、各々１０ｐｍｏｌのプライマー、１μｌのＤＮＡ鋳型、１．５μｌの５０ｍＭのＭｇＳＯ４、１×ＰＣＲｘ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５×エンハンサー溶液（最終濃度）、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、および０．５μｌプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅を実施した。試料を９４℃で２分間初期変性させた後、９４℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の３５サイクルを行った。６８℃で７分間による最終伸長サイクルを実施し、その後、反応を４０℃で終了させた。ＰＣＲ断片を０．８％アガロースゲル上で分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。ＤＮＡ断片をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンポネント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れて形質転換し、クローンの配列を決定した。
【０１９６】
クローンＰＫ１５は、既知のΔ８−デサチュラーゼとのアミノ酸配列相同性および「ＡＴＧ」、「Ｍｅｔ」開始コドンに基づく推定Δ８−デサチュラーゼの５’末端を含むことが同定された６９２ｂｐインサート（配列番号１５；図７Ａ）を含んでいた。推定Δ８−デサチュラーゼの５’端を含むこのＰＫ１５クローンのコードされるアミノ酸配列が示されている（配列番号１６；図７Ｂ）。
【０１９７】
エミリアナ・ハックスレイ由来のこのΔ８−デサチュラーゼの３’末端を単離するために、以下のプライマーを使用した：
フォワードプライマーＲＯ１７１９（配列番号１７）：５’−ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＧＡＴ Ｇ−３’）
または
フォワードプライマーＲＯ１７２４（配列番号１８）：５’−ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＴＴ ＣＧＡ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＣＣＴ−３’
または
フォワードプライマーＲＯ１７２７（配列番号１９）：５’−ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＣＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＣ ＧＧＴ ＧＡＴ Ｃ−３’
および
リバースプライマーＲＯ８９８（配列番号２０）：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’。
【０１９８】
ＲＯ１７１９、ＲＯ１７２４およびＲＯ１７２７は、先に同定されたＥＤ３−８断片の反応に基づいて設計された。ＲＯ８９８は、ｃＤＮＡライブラリー構築物用に使用されたｐＡＧＥＮベクターの配列に基づいて設計し、ｃＤＮＡライブラリーからのΔ８−デサチュラーゼの３’末端をＰＣＲ増幅することが指示された。ＥＤ３−８の５’末端を単離するために記載された条件と同じＰＣＲ条件を使用した。しかしながら、このようにして生じたＰＣＲ産物は、ＥＤ３−８の推定Δ８−デサチュラーゼの３’末端を含んでいなかった。
【０１９９】
また、製造業者の仕様書によりプラチナＴａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ＨＦ）酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを実施し、提供された１×ＨＦ ＰＣＲ緩衝液（最終濃度）、各々１０ｐｍｏｌのプライマー、１μｌのＤＮＡ鋳型、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１μｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ、および０．５μｌのプラチナＴａｑ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を最終体積５０μｌ中で使用した。試料を９４℃で２分間初期変性させた後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で２分間の３０サイクルを行った。６８℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後、反応を４℃にて終了させた。しかしながら、このようにして生じたＰＣＲ産物は、ＥＤ３−８の推定Δ８−デサチュラーゼの３’末端を含んでいなかった。
【０２００】
プライマーＲＯ１７２７およびＲＯ８９８、ならびにＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた最終ＰＣＲ増幅は、製造業者のプロトコールにより実施した。ＰＣＲ反応は、５０μｌの全反応中に２μｌのｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ鋳型、１×最終濃度のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ緩衝液、各々２０ｐｍｏｌのプライマーおよび１μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。試料を９５℃で２分間初期変性させた後、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の３０サイクルを行った。反応を４℃で終了させた。しかしながら、このようにして生じたＰＣＲ産物は、ＥＤ３−８の推定Δ８−デサチュラーゼの３’末端を含んでいなかった。
【０２０１】
次に、推定のΔ８−デサチュラーゼ遺伝子、ＥＤ３−８の３’末端を単離するために新しい戦略を開始した。ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）を、その３’末端を単離するためにＧｅｎｅＲａｃｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。エミリアナから単離された全ＲＮＡの５μｇを、製造業者の仕様書により第１鎖のｃＤＮＡを生じさせるためにＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＧ（Ｔ）２４−３’（配列番号４３））とともに使用した。
【０２０２】
上記で生じさせたＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、製造業者の仕様書により、３０ｐｍｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ３’プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’（配列番号２２）および推定Δ８−デサチュラーゼ（ＥＤ３−８）に特異的である１０ｐｍｏｌのＲＯ１７２４フォワードプライマー（配列番号１８）を用いて実施した。ＰＣＲ反応は、５０μｌの全反応中に、２μｌのｃＤＮＡ鋳型、１×ＨＦ ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５μｌプラチナＴａｑ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ、および上述されたプライマーを含んでいた。ＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９４℃／２分間の初期変性；９４℃／３０秒間の変性を５サイクル；７２℃／１分間の伸長；９４℃／３０秒間の変性を５サイクル；７０℃／１分間の伸長；９４℃／３０秒の変性を２０サイクル；６５℃／３０秒間の伸長；６５℃／１０分間の最終伸長；４℃で反応終了。ＰＣＲ産物の分析は、非常に微かなバンドを表し、おそらくはｃＤＮＡプールにおける遺伝子の低比率のためである。よって、入れ子ＰＣＲは、鋳型として１μｌの上記で生じさせたＰＣＲ反応、ならびに１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマーＲＯ１７１９（配列番号１７）および１０ｐｍｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ３’入れ子プライマー（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’（配列番号２３））を用いて実施された。ＰＣＲ反応は、ＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ鋳型（上述）を用いて一次反応について記載されたＰＣＲ反応と同一であった。増幅条件は、以下の通りであった：９４℃／２分間の変性；９４℃／３０秒間の変性、６５℃／３０秒間のアニーリング、６８℃／１分間の伸長を２５サイクル；６８℃／１０分間の最終伸長、４℃で反応の終了。０．８％アガロースゲル上のＰＣＲ断片の解析は、明確なバンドの存在を表した。これらを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。ＤＮＡ断片の末端を、Ｔ４ポリメラーゼを用いて補充し、得られた平滑末端の断片をＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンポネント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れて形質転換し、クローンの配列を決定した。配列決定は、既知のΔ８−デサチュラーゼとのアミノ酸配列の相同性、「ＴＡＧ」終止コドンおよびポリＡテールの存在に基づいて、ＥＤ３−８の推定３’末端を含むアミノ酸配列（配列番号２５および４４から４６；図８Ｂ）をコードする５８９ｂｐのインサート（配列番号２４；図８Ａ）を示した。
【０２０３】
推定のΔ８−デサチュラーゼであるＥＤ３−８の全長遺伝子は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって単離された：
ＲＯ１７３６（配列番号２６）：
（フォワード、ＡＴＧ開始コドン（ボールド）およびＥｃｏＲＩクローニング部位（下線）を含む
【０２０４】
【化１】
ＲＯ１７３７（配列番号２７）：
（リバース、ＴＧＡ終止コドン（ボールド）およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（下線）を含む
【０２０５】
【化２】
ＰＣＲ反応に使用された鋳型は、以下の通り、ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、またはエミリアナの標準化されたｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡを含んでいた：
【０２０６】
【表５】
【０２０７】
増幅は以下のように実施された：９５℃／２分間の初期変性；（９５℃／１５秒間の変性；５５℃／３０秒間のアニーリング；６８℃／１．５分間の伸長）を３０サイクル；６８℃／４分間の最終伸長；４℃で反応の終了。ＰＣＲは約１２５４ｂｐの単一なバンドを生じさせ、これは、製造業者のプロトコールによりＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。両方の鋳型は同じサイズのＤＮＡバンドを生じさせた。鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを用いることによって得られたＰＣＲ産物（ＥＤ３−８−ＥＰ２−５）の配列決定は、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ ３７８由来の推定のΔ８−デサチュラーゼの全長１２５４ｂｐの遺伝子配列（配列番号２８；図９）を示し、この遺伝子配列は４１７アミノ酸を含むタンパク質をコードしている（配列番号２９；図１０）。この遺伝子はＥＤ３−８と称され、発現試験のために使用された。
【０２０８】
ＥＤ３−８に加えて、全長遺伝子のある種の領域においていくつかの配列変異を示した追加の改変体クローンは、配列決定中に特定された（表２参照）。これらの改変は、おそらくＰＣＲ増幅の過程中に一般に生じる突然変異によって引き起こされ、使用されるＤＮＡポリメラーゼの低い特異性に起因している。また、これらのクローンは、ｃＤＮＡライブラリーが鋳型として使用される場合（ＥＤ３−８−ＥＰ−Ｘと称される）またはＲＡＣＥ ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡが鋳型として使用される場合（ＥＤ３−８−ＥＲ−Ｘと称される）に得られた。また、これらの遺伝子は、もとのＥＤ３−８クローンについて記載されているように、Δ８−デサチュラーゼ活性について評価された。
【０２０９】
Δ８−デサチュラーゼＥＤ３−８をコードするヌクレオチド配列を、ｐＵＣ５７クローニングベクターにクローニングし、ｐＲＳＰ６１と称した。このベクターは、ブタペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州マナッサス ２０１１０に寄託し、ＡＴＣＣ特許指定番号ＰＴ Ａ−９４７７が付与された。
【０２１０】
【表６】
【０２１１】
Ｂｌａｓｔ解析は、全長遺伝子ＥＤ３−８（配列番号２９）によってコードされるアミノ酸配列が既知のΔ８−デサチュラーゼに最も高いアミノ酸配列相同性を示したことを明らかにした。これれは、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９（（配列番号２；図３Ｂ）、パブロバ・サリナ（配列番号３；図４Ａ）、パーキンサス・マリヌス（配列番号４；図４Ｂ）およびユーグレナ・グラシアリス（配列番号１；図３Ａ）由来のΔ８−デサチュラーゼを含んでいた。これは、パブロバ・ルセリＣＣＭＰ ４５９のΔ８−デサチュラーゼに対して最も高い（５２．３％）のアミノ酸配列同一性を示した。また、それは、酵素活性に本質的であることが知られている（Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏら，（２００１）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．５２：１５８１−１５８５；Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏら，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２８：６３６−６３８）、全ての既知の膜結合性デサチュラーゼにおいて見出された３つの保存「ヒスチジンボックス」（Ｏｋｕｌｅｙら，（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１４７−１５８；Ｐｅｒｅｉｒａ ＳＬら，（２００３）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ．６８：９７−１０６）を含んでいた。ＥＤ３−８によってコードされるタンパク質における保存されたヒスチジンボックスは、アミノ酸位置１５５から１６０（ＨＤＹＬＨ（配列番号３２））、１９７から２０１（ＨＮＴＨＨ（配列番号３３））、および３５５から３５９（ＱＴＥＨＨ（配列番号３４））に存在していた（図２参照）。また、この配列は、５’末端にシトクロームｂ５様ドメインを含み、これは保存されたヘム結合ＨＰＧＧモチーフ（アミノ酸位置３８から４１）を有していた（図２参照）。この遺伝子の全Ｇ＋Ｃ含量は約６５％である。
【実施例３】
【０２１２】
遺伝子ＥＤ３−８によってコードされる推定のΔ８−デサチュラーゼの酵素活性の特徴付け
ＥＤ３−８遺伝子をコードする推定のΔ８−デサチュラーゼを、酵母発現ベクターであるｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、クローンｐＲＳＰ６０を生じさせ、次にコンピテントサッカロミセス・セレビシエ菌株ＳＣ３３４に入れて形質転換した。製造業者によって特定された条件に従って、Ａｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＢｉｏＧｅｎｅ）を用いて酵母形質転換を実施した。ロイシン欠損培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）上でロイシン栄養要求性について形質転換体を選択した。
【０２１３】
ＥＤ３−８によってコードされる酵素の特異的デサチュラーゼ活性を決定するために、形質転換体を５０μＭの特定の脂肪酸基質（以下に列挙される）の存在下で増殖し、特定の生成物への変換を用いて、基質特異性を決定した：
Δ８−デサチュラーゼ活性について：
エイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ−６）→ジホモガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）
エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３ｎ−３）→ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）
Δ６−デサチュラーゼ活性について：
リノール酸（１８：２ｎ−６）→ガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ｎ−６）
アルファ−リノレン酸（１８：３ｎ−３）→ステアリドン酸（ＳＤＡ、１８：４ｎ−３）
Δ５−デサチュラーゼ活性について：
ジホモ−ガンマ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）→アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ｎ−６）
ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）→エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）
Δ４−デサチュラーゼ活性：
ω６−アドレン酸（ＡＤＡ、２２：４ｎ−６）→ω６−ドコサペンタエン酸（ω６−ＤＰＡ、２２：５ｎ−６）
ω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）→ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）
陰性対照の菌株は、Ｓ．セレビシエ３３４において発現されたｐＹＸ２４２ベクターからなっていた。
【０２１４】
選択的ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］培地から単離された形質転換されたコロニーを、激しく振とうしながら３０℃にて１０ｍｌのＹＰＤ液体ブロス中で一晩増殖させた。次に、一晩培養したものの５ｍｌを、５０または２５μＭ（最終濃度）の様々な脂肪酸基質（特定されている）を含む選択培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）の４５ｍｌに添加し、これらを４８から７２時間（指示されている）２４℃にて激しく振とう（２５０ｒｐｍ）した。
【０２１５】
全脂質抽出について、酵母細胞を２０００ｒｐｍ／１５分間にて遠沈し、０．５ｍｌの水を添加し、試料をボルテックスし、次に１０ｍｌのメタノールを穏やかに旋回させながら添加した。その後、２０ｍｌのクロロホルムを添加し、試料を１分間、高速にてボルテックスし、２時間室温に放置した。次に、６ｍｌの生理食塩水を試料に添加し、その後、２２００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上部のクロロホルム層を、きれいな／乾燥した３０ｍｌのバイアルに取り出し、クロロホルムを４０℃にて窒素気流下で乾燥するまで蒸発させた。一度、溶媒が完全に蒸発されると、２ｍｌのクロロホルムを各々のバイアルに添加し、試料を誘導体化した。
【０２１６】
脂質の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への誘導体化について、各々の管を、１００μｌの内部標準（１７．２１６μｇ／１００μｌ）のＴｒｉｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｎを用いてスパイクした。クロロホルムを窒素下で４０℃にて乾燥するまで蒸発させ、２ｍｌの三フッ化ホウ素の１４％メタノール溶液が添加され、その後、２滴（約５０μｌ）のトルエンを添加した。各々のバイアルは窒素が注ぎ、１５分間９５℃にて加熱した。バイアルを冷却した後、２ｍｌの生理食塩水を添加し、脂質を１分間激しくボルテックスすることによって４ｍｌのヘキサンにより抽出した。次に、ヘキサン抽出物を、２０ｍｌのきれいな／乾燥したスクリューキャップ管に移し、５ｍｌのｄｉ−Ｈ２Ｏを添加し、試料をボルテックスし、１５００ｒｐｍにて４分間遠心分離した。その後、洗浄されたヘキサンを２０ｍｌの試薬管に移した。ヘキサンを乾燥するまで蒸発させ、各々の試料を０．５ｍｌの新鮮なヘキサンを用いて再構成した。再構成された最終ヘキサンをボルテックスし、脂質を分散した。次に、全試料をＧＣオートサンプラーバイアルに導入し、４μｌを分析のために注入した。ＧＣをＮｕＣｈｅｋ Ｓｔｄ．４６１を用いて較正した。
【０２１７】
基質の生成物への変換率を、下式を用いて計算した：
【０２１８】
【数１】
表３は、添加された基質の変換率に基づいたＥＤ３−８をコードしたタンパク質の酵素活性を示す。エミリアナ由来のＥＤ３−８遺伝子を変換したｐＲＳＰ６０クローンは、１．６８％のＥＤＡ（２０：２ｎ−６）基質をＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換し、０．５８％のＥＴｒＡ（２０：３ｎ−６）基質をＥＴＡ（２０：４ｎ−３）に変換した。これは、ＥＤ３−８遺伝子が、ｎ−６およびｎ−３脂肪酸基質を認識し得るΔ８−デサチュラーゼをコードし、ｎ−６基質、ＥＤＡを優先することを示した。ベクターだけの対照を用いた場合、バックグラウンド（基質の非特異的変換）活性は検出されなかった（表２参照）。ＥＤ３−８をコードした酵素は、試験された他の基質のいずれに対しても活性がなく（データを示さない）、それはΔ６−、Δ５−またはΔ４−デサチュラーゼ活性を有しないことを示した。
【０２１９】
【表７】
さらに、ＥＤ３−８をコードするタンパク質の他の改変体（表２参照）は、同じ増殖条件下でＳ．セレビシエにおいて発現された。結果は、これらの改変体は、もとのＥＤ３−８をコードしたタンパク質と比較して、より低いΔ８−デサチュラーゼ活性を有するまたは活性がないことを示した（表４参照）。このようにして、ＥＤ３−８のアミノ酸配列における小さな変化は、その位置に依存して、酵素活性に影響を及ぼし得る。これらの変化は、酵素の触媒中心または低い活性をもたす酵素の安定性に影響を及ぼす可能性がある。これらの膜結合性デサチュラーゼの結晶構造は現在のところ解明されていないため、酵素活性に本質的である酵素における全ての領域を予測することは不可能である。「ヒスチジン−ボックス」領域およびシトクロームｂ５領域が活性に本質的であることは周知である。しかしながら、これらのＥＤ３−８改変体は、「ヒスチジン−ボックス」およびシトクロームｂ５領域における変化はない（表２参照）。したがって、酵素活性に重要である、ＥＤ３−８によってコードされるこのΔ８−デサチュラーゼにおける追加の領域を同定した。
【０２２０】
【表８】
ＥＤ３−８のΔ８−デサチュラーゼ活性は試験された培養条件下において低いため、培養条件を修正して、活性がいずれかの方法において、添加された基質の量を変化させることによってまたは発現中の温度および時間を変化させることによって改善され得るかどうかを決定した。このようにして、ｐＲＳＰ６０で形質転換された酵母培養物を、２５μＭ基質の存在下、２４℃で４８時間、または５０μＭもしくは２５μＭ基質、２０℃で７２時間において増殖させた。表５は、培養条件を変化させることが酵母における発現を改善し得ることを示す。基質の生成物への変換率は約１．７％から約４．５％に増加した。
【０２２１】
【表９】
【実施例４】
【０２２２】
ＥＤ３−８のコドン最適化およびサッカロミセス・セレビシエにおけるそのコードされるタンパク質の発現
ＥＤ３−８のＧ＋Ｃ含量が高い（約６５％）ため、これは、酵母における発現に応じて示された相対的に低いΔ８−デサチュラーゼ活性の主な原因である可能性があった。したがって、ＥＤ３−８、エミリアナ・ハックスレイＣＣＭＰ３７８（配列番号２８；図９）のコドン使用頻度を、サッカロミセス・セレビシエにおける発現について最適した。サッカロミセス・セレビシエのコドン使用頻度パターンを、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｇｏｊｏｂｏｒｉ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２９２）から決定し、これをベクターＮＴＩプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＤ３−８遺伝子配列に適用した。１２５４ｂｐのコード配列の全４１２ｂｐ（約３３％）を、そのコドン使用頻度とサッカロミセス・セレビシエのコドン使用頻度を並べるために修飾した。さらに、内部のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、様々な発現ベクターのマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ部位に遺伝子のクローニングを促進するために排除した。このようにして、１２５４ｂｐのコード領域の全４１４ｂｐを修飾した。この新規なコドン最適化された配列は、もとのＥＤ３−８遺伝子配列と６６．９８％の配列同一性を共有していた。コドン最適化された遺伝子における修飾は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものではなかった（配列番号２９；図１０）。さらに、「ＡＡＡ」がＡＴＧ翻訳開始コドンに対して５’に付加され、それは酵母における発現を促進すると考えられている。この配列は、「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」（配列番号３０；図１１）と称された。また、隣接している制限部位を、様々な発現ベクターへのクローニングを促進するために付加した。所望の「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔコーポレーション（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって合成し、ｐＵＣ５７クローニングの「ＴＡ」クローニング領域にクローニングした。次に、この遺伝子を、構築物を生じさせるためにｐＥＳＣ−Ｕｒａ酵母発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ部位にサブクローニングし、ｐＲＳＰ６２と称した。
【０２２３】
ｐＥＳＣ−ＵｒａベクターにクローニングされたＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ遺伝子（配列番号３０）を含むクローンは、ｐＲＳＰ６２と称し、ブタペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州マナッサス ２０１１０に２００８年９月２６日付けで寄託し、ＡＴＣＣ特許受託番号ＰＴＡ−９５３２が付与された。
【０２２４】
ｐＲＳＰ６２を、実施例３に記載されたのと同じプロトコールを用いて、サッカロミセス・セレビシエに形質転換し、この形質転換体を、ウラシルを欠損している培地（ＤＯＢ［−Ｕｒａ］）（ＱＢｉｏＧｅｎｅ）を用いてウラシル栄養供給性について選択した。選択的ＤＯＢ［−Ｕｒａ］培地から単離された形質転換されたコロニーを、１０ｍｌのＹＰＤ液体ブロス中、３００℃にて一晩、激しく振とうしながら増殖した。次に、この一晩の培養物の５ｍｌを、ｐＲＳＰ６２の発現を誘導するために添加された２％ガラクトース（最終濃度）および様々な脂肪酸基質（特定されている）の５０μＭ（最終濃度）を含む選択培地（デキストロース不含ＤＯＢ［−Ｕｒａ］）の４５ｍｌに添加した。培養物を、４８時間（指定されている）２４℃にて激しく振とう（２５０ｒｐｍ）した。また、全脂肪酸の単離および分析を、実施例３に記載されたように実施した。
【０２２５】
表６は、添加された基質の変換率に基づく「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」をコードするタンパク質の酵素活性を示す。コドン最適化されたＥＤ３−８遺伝子のΔ８−デサチュラーゼ活性は、もとのＥＤ３−８をコードしたタンパク質の活性よりも非常に高かった。結果は、ＥＤＡ（２０：２ｎ−６）基質のＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）への変換は１２．５１％であり、ＥＴｒＡ（２０：３ｎ−６）基質のＥＴＡ（２０：４ｎ−３）への変換は８．４５％であることを示している。バックグラウンド（基質の非特異的な変換）活性は、ｐＥＳＣ−Ｕｒａベクターのみの対照を用いた場合には検出されなかった（表６参照）。コドン最適化されたＥＤ３−８をコードした酵素は、試験された他の基質のいずれに対してもΔ６−、Δ５−およびΔ４−デサチュラーゼ活性を示さなかった（データを示していない）。
【０２２６】
【表１０】
【実施例５】
【０２２７】
酵母におけるコドン最適化されたΔ８−デサチュラーゼ「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」およびイソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）Δ９−エロンガーゼの同時発現
コドン最適化されたΔ８−デサチュラーゼ「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」を、イソクリシス・ガルバナ（ＩｓｏＤ９）（受託番号ＣＱ８３１４２２、配列番号３１；図１２）とともに同時発現させた。ＩｓｏＤ９遺伝子の合成遺伝子構築物を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって作製し、ｐＵＣ５７クローニングベクターにクローニングした。この遺伝子を、ｐＹＸ２４２酵母発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにサブクローニングし、この構築物をｐＩｓｏＤ９と称した。
【０２２８】
構築物ｐＲＳＰ６２（ｐＥＳＣ−ＵｒａにおけるＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ）およびｐＩｓｏＤ９を、実施例３に記載されているプロトコールにより、サッカロミセス・セレビシエ菌株ＳＣ３３４に同時形質転換した。ロイシンおよびウラシル栄養供給性（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］培地）を用いて同時形質転換体の選択を行った。形質転換されたコロニーを、３０℃にて１０ｍｌのＹＰＤ液体ブロス中で一晩、激しく振とうしながら増殖させた。次に、この一晩の培養物の５ｍｌを、５０μＭ（最終濃度）のＬＡ（１８：２ｎ−６）またはＡＬＡ（１８：３ｎ−３）（特定されている）を含む選択培地（デキストロース不含ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］＋２％ガラクトース）の４５ｍｌに添加し、これらを、４８から７２時間（指示されている）２４℃または２０℃にて激しく振とうした。また、全脂肪酸の単離および分析を実施例３に記載されるように実施した。
【０２２９】
【表１１】
Δ８−デサチュラーゼおよびΔ９−エロンガーゼは協調して機能することができ、ＬＡ（１８：２ｎ−６）のＤＬＧＡ（２０：３ｎ−３）への変換をもたらす。Δ９−エロンガーゼ（ＩｓｏＤ９）はＬＡをＥＤＡ（２０：２ｎ−６）に変換し、Δ８−デサチュラーゼ（ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣをコードした酵素）はＥＤＡをＤＧＬＡに変換する。これは、エミリアナ・ハックスレイから単離されたＥＤ３−８によってコードされるΔ８−デサチュラーゼがアラキドン酸（ＡＲＡ）またはＥＰＡ／ＤＨＡ生合成をもたらす、代替の（Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ）経路において機能し得ることを示す。したがって、これらの酵素は、様々な宿主においてＬＡからＡＲＡを生じさせ、またはＡＬＡからＥＰＡ／ＤＨＡを生じさせるために追加のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ（すなわち、Δ５−デサチュラーゼ、Ｃ２０−エロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼ）と組み合わせて使用することができる。
【実施例６】
【０２３０】
植物における発現
コドン最適化されたΔ８−デサチュラーゼ遺伝子である「ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ」は、モデル脂肪種子植物であるアラビドーシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、イソクリシス・ガルバナ（ＩｓｏＤ９）（受託番号ＣＱ８３１４２２、配列番号３１；図１２）由来のΔ９−エロンガーゼ遺伝子、およびユーグレノイド・デセス（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ２９１６（ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ、配列番号３５）（より完全には２００９年７月１７日に出願された米国特許出願シリアル第１２／５０５，２９３号に記載され、これは本明細書と一致する範囲を参照することにより本明細書に援用される）を用いて同時発現させた。
【０２３１】
ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯのコード配列（配列番号３５）を、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド：５’−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＧＴＣＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧ−３’（配列番号３６）および５’−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号３７）（付加された制限酵素認識配列は下線が引かれている）を用いて、対応する遺伝子を含むプラスミドからＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応を、非常に忠誠なＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行った。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによる制限酵素消化後、産物は、バイナリーベクターにおいて、産物の５’末端でダイズ由来の種子特異的なグリシニン−１プロモーターに連結され、産物の３’末端でグリシニン−１の３’非翻訳領域に連結され、プラスミドｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯを生じさせた。グリシニン−１調節エレメントは、以前に報告されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら，（１９８９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｉｎｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１，３１３−３２８）。また、このベクターは、蛍光および細菌選択用のカナマイシン耐性マーカーによって、形質転換された種子を選択するためのカッサバモザイクウイルスプロモーターの調節下にＤｓ−Ｒｅｄトランス遺伝子を含んでいる。また、このベクターは、宿主植物において多重遺伝子の遺伝子発現のための他のトランス遺伝子のクローニングを可能にするいくつかの固有の制限酵素部位（例えば、ＭｌｕＩ）を含んでいる。これらの実験の対照として、イソクリシス・ガルバナのΔ９−ＥＬＯ（配列番号３１）を、ｐＢｉｎＧｌｙＲｅｄ２におけるグリシニン−１プロモーターの調節下でＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩｓｏＤ９を生じさせた。
【０２３２】
ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣコード配列（配列番号３０）を、オープンリーディングフレームの両端に位置するＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて合成した。ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣコード配列を、β−コングリシニン遺伝子のダイズα’−サブニットのための種子特異的なプロモーター、およびファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のファセオリン遺伝子のための３’ミス翻訳された領域を含むｐＢＣｏｎベクターの対応する部位にＮｏｔＩ断片としてクローニングした。ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣを、その５’末端にβ−コングリシニンプロモーターの配列によって、およびその３’末端に３’ファセオリン非翻訳領域によって挟んだ。プロモーター、ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣコード配列および３’非翻訳領域を含む得られたカセットを、カセットの両端に位置するＡｓｃＩ制限酵素部位を用いてｐＢＣｏｎベクターから取り出した。その後、ＡｓｃＩカセットは、ｐＥｕｇＥＬＯの相性のよいＭＭ部位に、ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯおよびＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣデサチュラーゼの種子特異的な同時発現のためのトランス遺伝子を含むプラスミドｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を生じさせた。また、ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣデサチュラーゼのための種子特異的なトランス遺伝子を含むＡｓｃＩカセットをｐＩｓｏＤ９のＭｌｕＩ部位にクローニングし、ｐＩｓｏＤ９−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を生じさせた。
【０２３３】
ｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’およびｐＩｓｏＤ９−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株のＣ５８ ＭＰ９０にエレクトロポレーションによって導入した。次に、カナマイシン耐性のアグロバクテリウムを、フローラルディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ．ａｎｄ Ｂｅｎｔ，Ａ．Ｆ．（１９９８）Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍＱｄｉａｔＱｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ，１６，７３５−７４３））によって、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態型Ｃｏｌ−０の形質転換のために使用した。アグロバクテリウムのフローラルディップ後、植物を、成熟およびドライダウンに到達するまで１日当たり１６時間の長さで２２℃にて維持した。これらの実験について、低レベルのα−リノレン酸および非常に長い鎖の脂肪酸（≧Ｃ２０）を含むが、しかし、その種油においてリノレン酸レベルが上昇しているアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のｆａｄ３／ｆｅａｌ変異体が使用された（Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．ら，（２００６）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７，１１６６−１１７６）。この遺伝的背景は、ベニバナおよび低リノレン酸ダイズなどの穀物由来の種油の脂肪酸プロファイルに近い。アグロバクテリウムに浸されたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物由来のトランスジェニック種子は、既知の方法を用いてＤｓＲｅｄマーカータンパク質の蛍光によって特定された（Ｐｉｄｋｏｗｉｃｈ，Ｍ．Ｓ．ら，（２００７）Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｅｄ ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ａｃｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ ｌｅｖｅｌ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ａ ｐａｌｍ−ｌｉｋｅ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｏｉｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０４，４７４２−４７４７）。単独トランスジェニック種子および非トランスジェニック対照種子を、トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＨ）試薬を使用することによって、トリアシルグリセロールを含む構成脂質の直接的なエステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｃａｔｉｏｎ）に供した（Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．（２０００）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓｓａｔｕｒａｓｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｅｅｄ ｏｉｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７，１２３５０−１２３５５）。単一の種子から得られた脂肪酸メチルエステルを、ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ長×０．２５ｍｍ内径）が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０ガスクロマトグラフの使用、および７℃／分で１８５℃（１分保持）から２３０℃（２分保持）にプログラムしたオーブン温度によってフレームイオン化検出を用いたガスクロマトグラフィーにより分析した。構成脂肪酸メチルエステルを、野生型アラビドプシス・タリアナＣｏｌ−０の種子由来の既知の同一性の脂肪酸メチルエステルと比較した保持時間に基づいて、および標準の脂肪酸メチルエステルの保持時間と比較して、同定した。
【０２３４】
ｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を用いて形質転換された植物から５個の独立した形質転換事象由来の単一のＴ１種子の脂肪酸組成が表８に示されている。また、ｐｌｓｏＤ９−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’を用いて形質転換された植物から独立した事象を示す単一のＴ１種子の脂肪酸組成が示されている（表９）。ユーグレナ−ＭＯ７−エロンガーゼおよびＥＤ３−８Δ８−デサチュラーゼを同時発現するｐＥｕｇＭＯ７ＥＬＯ−‘ＥＤ３−８−ＥＰ２−５−ＳＣ’形質転換体由来の種子は、主にΔ８，１１，１４−エイコサトリエン酸（２０：３Δ８，１１，１４）およびより少量のΔ１１，１４−エイコサジエン酸を蓄積していた。これらの種子において、２０：３Δ８，１１，１４は、多量の脂肪酸であり、その相対量は全脂肪酸の２８％から３７％の範囲であった。これらの種子における２０：２Δ１１，１４の相対量は、全脂肪酸の１０．８から１４．５％の範囲であった。比較すると、２０：３Δ８，１１，１４および２０：２Δ１１，１４は、非形質転換のアラビドプシスｆａｄ３／ｆａｅｌ植物の種子において検出されないまたはごく微量見出された（表１０）。イソクリシス・ガルバナΔ９ＥＬＯおよびＥＤ３−８Δデサチュラーゼを同時発現する種子において、２０：３Δ８，１１，１４は全脂肪酸の最大３７％を占め、２０：２Δ１１，１４は全脂肪酸の最大６％を構成していた（表９）。全体的に、これらの所見は、ユーグレナ−ＭＯ７−エロンガーゼおよびＥＤ３−８Δ８デサチュラーゼまたはイソクリシス・ガルバナΔ９ＥＬＯおよびＥＤ３−８Δ８デサチュラーゼを同時発現する、１８：２で富んでいる種子は、相当量の２０：３Δ８，１１，１４、アラキドン酸の即時の生合成前駆体（２０：４Δ５，８，１１，１４）を生成することができる。また、これらの所見は、脂肪種子におけるＡＲＡまたはＥＰＡ／ＤＨＡ生成において本質的な段階を操作するために、ＥｕｇＭＯ７ＥＬＯなどの１８：２特異的なエロンガーゼ、およびＥＤ３−８Δ８デサチュラーゼなどの２０：２Δ８デサチュラーゼの同時発現の実施可能性を示す。トランスジェニック脂肪種子におけるＡＲＡまたはＥＰＡの生成の最終目的を達成させるために、これらの遺伝子とｄ５−デサチュラーゼを同時発現させることが可能である。
【０２３５】
【表１２】
【０２３６】
【表１３】
【０２３７】
【表１４】
説明として本明細書に適切に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数以上）、制限（単数以上）がない状態で実施することができる。使用されている用語および表現は、説明であって制限ではない用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示されおよび記載されている特徴の任意の同等物またはそれらの一部を除外する意図はない。主張される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態により具体的に開示されるが、本明細書に開示されている概念の任意の特性、変更および変化が、添付の特許請求項の範囲により定義されるように本発明の範囲内にあると見なされることが理解されなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デサチュラーゼ活性を有し、そのアミノ酸配列が配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むまたはそれに相補的である単離されたヌクレオチド酸またはその断片。
【請求項２】
配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的である単離されたヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３】
配列が、ω６−エイコサジエン酸またはω３−エイコサトリエン酸を基質として利用する機能的に活性なΔ８−デサチュラーゼ酵素をコードする、請求項２の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいるまたはその少なくとも５５％に相補的である、調節配列に作動的に連結されたヌクレオチド配列
を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される真核細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項７】
そのヌクレオチド配列の発現が植物細胞、植物種子、植物体または植物組織による少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらす、請求項４のベクターを含む植物細胞、植物種子、植物体または植物組織。
【請求項８】
ポリ不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）またはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７の植物細胞、植物種子、植物体または植物組織。
【請求項９】
請求項８の植物細胞、植物種子、植物体または植物組織によって生成される１種以上の植物油または脂肪酸。
【請求項１０】
配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列によってコードされる精製ポリペプチド。
【請求項１１】
２０個の炭素長のポリ不飽和脂肪酸（Ｃ２０−ＰＵＦＡ）基質を該基質の炭素原子８と炭素原子９との間で不飽和化し、配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％のアミノ酸同一性を有する精製されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２９のアミノ酸配列を有する、請求項１１の精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；および
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ
を含む、Δ８−デサチュラーゼ酵素を生成するための方法。
【請求項１４】
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；および
ｄ）前記発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素をω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、ポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法。
【請求項１５】
生成物のポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露して、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたはさらなるポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）ｂ）の発現ベクター、およびデルタ−９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの調節配列に作動的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加の組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ；
ｄ）前記発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素およびデルタ−９エロンガーゼを、リノール酸（ＬＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、宿主細胞においてポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法。
【請求項１８】
ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）もしくはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露して、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたは追加のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
生成物のポリ不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１９の方法。
【請求項１】
デサチュラーゼ活性を有し、そのアミノ酸配列が配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むまたはそれに相補的である単離されたヌクレオチド酸またはその断片。
【請求項２】
配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的である単離されたヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３】
配列が、ω６−エイコサジエン酸またはω３−エイコサトリエン酸を基質として利用する機能的に活性なΔ８−デサチュラーゼ酵素をコードする、請求項２の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいるまたはその少なくとも５５％に相補的である、調節配列に作動的に連結されたヌクレオチド配列
を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される真核細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項７】
そのヌクレオチド配列の発現が植物細胞、植物種子、植物体または植物組織による少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸の生成をもたらす、請求項４のベクターを含む植物細胞、植物種子、植物体または植物組織。
【請求項８】
ポリ不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）またはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７の植物細胞、植物種子、植物体または植物組織。
【請求項９】
請求項８の植物細胞、植物種子、植物体または植物組織によって生成される１種以上の植物油または脂肪酸。
【請求項１０】
配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列によってコードされる精製ポリペプチド。
【請求項１１】
２０個の炭素長のポリ不飽和脂肪酸（Ｃ２０−ＰＵＦＡ）基質を該基質の炭素原子８と炭素原子９との間で不飽和化し、配列番号２９を含むアミノ酸配列と少なくとも５５％のアミノ酸同一性を有する精製されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２９のアミノ酸配列を有する、請求項１１の精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；および
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ
を含む、Δ８−デサチュラーゼ酵素を生成するための方法。
【請求項１４】
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）Δ８−デサチュラーゼ酵素の生成に十分な時間および条件下で、前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；および
ｄ）前記発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素をω６−エイコサジエン酸、ω３−エイコサトリエン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、ポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法。
【請求項１５】
生成物のポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露して、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたはさらなるポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
ａ）配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むまたはその少なくとも５５％に相補的であるヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）調節配列に作動的に連結された、ステップａ）により単離されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）ｂ）の発現ベクター、およびデルタ−９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの調節配列に作動的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加の組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ；
ｄ）前記発現されたΔ８−デサチュラーゼ酵素およびデルタ−９エロンガーゼを、リノール酸（ＬＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基質に曝露して、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ
を含む、宿主細胞においてポリ不飽和脂肪酸を生成するための方法。
【請求項１８】
ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）もしくはω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
生成物のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加のデサチュラーゼまたはエロンガーゼに曝露して、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のまたは追加のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
生成物のポリ不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１９の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５０４９６０（Ｐ２０１２−５０４９６０Ａ）
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３１１１４（Ｐ２０１１−５３１１１４）
【出願日】平成２１年１０月６日（２００９．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５９６８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４２５１０
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月６日（２００９．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５９６８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４２５１０
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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