デングキメラウイルス
本発明は、点突然変異及び遺伝学的変化を蓄積する傾向が小さいデングキメラウイルスに関する。これらのデングキメラウイルスにおいて、ポリメラーゼをコードするＮＳ５遺伝子が、黄熱ウイルスの対応するＮＳ５配列によって置換されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝的安定性が高いゆえに非弱毒化表現系に復帰しにくいデングキメラウイルスに関する。これらのデングキメラウイルスにおいて、ポリメラーゼをコードしているＮＳ５配列は、黄熱病ウイルスの対応するＮＳ５配列と置き換えられている。
【背景技術】
【０００２】
デング熱はマラリアに次ぐ、二番目に重要な熱帯感染症であり、世界人口（２０億５千万人）の半分以上の人々が伝染のリスクがある場所に生活している。デング病の推定５０００万から１億人のうち、年間５０万人がＤＨＦ患者として入院し、２万５千人が死亡している。デング病はアジア、太平洋、アフリカ、アメリカ、カリブ海などの風土性がある。
【０００３】
デング出血性熱（ＤＨＦ）は、深刻な内出血によって悪化する血液量減少症及び低血圧症（Ｄｅｎｇｕｅ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ, ＤＳＳ）を引き起こす恒常性の異常と高い血管浸透性とによって特徴付けられる深刻な熱性の疾患である。ＤＨＦの致死率は治療を施さないと１０％と高いが、処置を行えば１％以下となる(WHO Technical Guide, 1986)。
【０００４】
デング熱感染症はフラビウイルス属(Gubler, 1988)のうち、密接に関連しているが、抗原性の異なる４つのウイルス血清型(Gubler, 1988；Kautner ら、1997；Rigau-Perez ら、1998；Vaughn ら、1997)によって引き起こされる。デングウイルス血清型に感染すると非特異的なウイルス性症候群から深刻で致命的な出血性疾患までの範囲に及ぶ臨床疾患を引き起こす。デング熱（ＤＦ）の潜伏期間は蚊に刺されてから平均４日（３から１４日の範囲）である。ＤＦは二峰性の熱、頭痛、体中の痛み、衰弱、発疹、リンパ節腫そして白血球減少症によって特徴付けられる(Kautnerら、1997; Rigau-Perezら、1998)。ウイルス血症の期間は熱性の疾患と同じである(Vaughnら、1997)。ＤＦは通常７〜１０日間で回復するが、遷延性の無力症となるのが一般的である。白血球及び血小板の数がしばしば減少する。
【０００５】
ウイルスは、ヒトやヒトを標的として好む、国内で日中に咬刺するネッタイシマカの中に周期的に保有される。ヒトへの感染は、感染したネッタイシマカが血液摂食している間、ウイルスが注入されることによって引き起こされる。ネッタイシマカの唾液ウイルスは主に血管外組織に蓄積される。接種後に感染した原発細胞の小集合は樹状細胞であり、その後、流出するリンパ節に向かって遊走する(Wuら、2000)。皮膚での最初の複製とリンパ節からの流出の後、高熱期の間、一般的に３〜５日間のうちにウイルスが血管内に出現する。
【０００６】
単球及びマクロファージは樹状細胞とともにデングウイルスの主な標的である。ホモタイプの再感染に対する防御は完全であり恐らく生涯維持されると思われるが、デング型どうしの交差防御は１２週間以下である(Sabin, 1952)。したがって、対象患者は異なる血清型に再び感染する可能性がある。二回目のデング感染は深刻なデング熱感染症に発展するという理論的に危険な因子である。しかしながら、ＤＨＦは多因性である：患者の年齢、免疫状態、患者の遺伝的体質のみならずウイルス株も含まれる。二つの因子がＤＨＦの発症に大きな役割を担っている：高ウイルス血症（ウイルス血症のレベルに係わる疾患の重症度）に伴うウイルスの急速な複製(Vaughnら、2000)及び炎症メディエーターの高レベル放出に伴う重要な炎症反応(Rothman及びEnnis, 1999)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
デング熱感染症に対する特別な治療はない。ＤＦの管理は、ベッド療養、解熱剤と鎮痛剤による熱と苦痛の制御、そして適切な水分摂取によって支持される。ＤＨＦの治療は、体液喪失の調整、凝固因子の交替、そしてヘパリンの注入が必要である。
【０００８】
現在の予防対策は媒介生物の駆除と個人的な保護措置に依存しており、これは強要することは難しく、高価である。現在デングに対するワクチンの登録はない。デングの４つの血清型が世界中に広がり、それらはＤＨＦの場合に含まれることが報告されているため、４つすべてのデングウイルス血清型に対してワクチン接種により予防することが理想的である。
【０００９】
弱毒生ワクチン、これは自然免疫を再生させるものであるが、多くの疾患に対するワクチンの開発に使用されている。弱毒生ウイルスワクチンの優位性は複製能力と体液性かつ細胞性の両者の免疫応答の誘導にある。さらに、ウイルス（構造及び非構造タンパク質）の異なる組成に対して全体のビリオンワクチンによって誘導された免疫応答は自然感染によって誘導された応答を再度生じた。
【００１０】
デングワクチンのプロジェクトがタイのマヒドール大学化学技術研究所、ワクチン開発センターで立ち上げられた。デング血清型１から４に対する弱毒生ワクチンの候補の実験規模での開発に成功した。これらのワクチンはタイのボランティアによって、一価（一つの血清型）、二価（二つの血清型）、三価（三つの血清型）、四価（四つすべての血清型）として試験されている。これらのワクチンは大人及び小児に対して安全で、かつ免疫応答し得るように構築された(Gubler, 1997)。しかしながら、これらのＬＡＶ株は異種性の集団に対応し、組成物に存在する株の一つのインビトロまたはインビボの選択の可能性によるリスクを示す。実際に、デングウイルスは複製過程において、一般的突然変異や遺伝的変化を起こしやすい。
【００１１】
Pugachevら（2004）は、黄熱ウイルスのＮＳ５によってコードされたポリメラーゼは他のフラビウイルスと比較して、忠実度が高いという特徴を有することを最近公表した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明者らは、黄熱ポリメラーゼのユニークな特徴を活かしてデングウイルスのキメラ組み換え体を構築することを提案する。該組み換え体において、デングウイルスの元のポリメラーゼをコードする配列が黄熱株の対応する配列で置換されており、かくして有用なワクチン候補となるであろう高い遺伝的安定性を有する弱毒生デングウイルスが得られる。
【００１３】
定義
「黄熱株」と表現することによって、多様な黄熱株を意味している。一例として、ＹＦＤ１７株が使用され得る。この株はSmithburnら（１９５６）及びFreestone （１９９５）が開示している。ＹＦ１７Ｄは遺伝子レベルで研究され(Rice ら、1985)、そのゲノム配列は配列番号７に示される(Genbank accession number NC 002031)。確かに本発明に関する記載の文脈上、デングウイルスに挿入されるＮＳ５配列はいずれの黄熱株にも由来し得る。本発明における一つの実施態様において、デングウイルスのＮＳ５をコードしている配列はＹＦＤ１７株のＮＳ５をコードしている配列に対応するため置換される。好都合なことに、同じデングウイルスの３’ＮＣＲ配列もまた同じ黄熱株の３’ＮＣＲ配列に対応するため置換される。
【００１４】
本明細書に記載のとおり、デング（ＤＥＮ）ウイルスは血清型１、２、３、４の野生型デングウイルス、または血清型１、２、３、４の弱毒生デングウイルス株を示す。デングウイルスは下記の遺伝子構成を示すＲＮＡウイルスである：５’−非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、外被（Ｅ））及び非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）及び３’ＮＣＲ。ＲＮＡゲノムはヌクレオチド（正二十面体の対称性）を形成するＣタンパク質に関連する。他のフラビウイルスのように、ＤＥＮウイルス性ゲノムは、中断されていない翻訳領域（ＯＲＦ）をコードしており、この翻訳領域は一つのポリタンパク質に翻訳される。
【００１５】
特に、デング血清型１（ＤＥＮ−１）ウイルスは野生型株の１６００７であろう。デング血清型２（ＤＥＮ−２）ウイルスは野生型株の１６６８１であろう。デング血清型３（ＤＥＮ−３）ウイルスは野生型株の１６５６２またはマルティニクで新たに再導入されたデングウイルス型３（Peyrefitte ら、2003、配列番号８）であろう。デング血清型４（ＤＥＮ−４）は野生型株の１０３６であろう。
【００１６】
「弱毒生」ウイルスまたは株と記載することによって、本明細書では、試験されたヒトの大半において軽症（例えば、明確な利益／リスクの比率が現れるほどに調節された目的から受け入れられる程度）または副次的作用（例えば、全身性の発症かつ／または生物学的異常かつ／または局所反応）がないが、しかし感染して免疫応答を引き起こす株またはウイルスを意味する。これらの弱毒生株は初めはデング野生型株に由来してもよい。
【００１７】
「免疫反応」と記載することによって、本明細書では霊長類において、特にヒトにおいて、中和抗体を含む特異な体液性免疫応答を含む応答を意味する。特異な体液性免疫応答の導入はＥＬＩＳＡアッセイによって容易に確定され得る。ワクチンの血清中における中和抗体の存在はHuang ら (2000)が開示したような血小板の減少によって評価される。確定された中和抗体の滴定量が少なくとも１：１０と同じかそれ以上であるとき、血清は中和抗体の存在に関して陽性であると考えられる。
【００１８】
本発明のキメラデングウイルスの構築のために最初の産生物として用いられ得るデング株は、例えば、：
「ＬＡＶ１」株、これはプライマリードッグの腎臓（ＰＤＫ）におけるデング血清型１（ＤＥＮ−１）株１６００７の１３継代の後確立された弱毒化株である。ＬＡＶ１配列は配列番号９に示される。ＤＥＮ−１ １６００７と比較して、ＬＡＶ１は１４個のヌクレオチド置換を有する：１３２３ Ｔ＞Ｃ、１５４１ Ｇ＞Ａ、１５４３ Ａ＞Ｇ、１５４５ Ｇ＞Ａ、１５６７ Ａ＞Ｇ、１６０８ Ｃ＞Ｔ、２３６３ Ａ＞Ｇ、２６９５ Ｔ＞Ｃ、２７８２ Ｃ＞Ｔ、５０６３ Ｇ＞Ａ、６０４８ Ａ＞Ｔ、６８０６ Ａ＞Ｇ、７３３０ Ａ＞Ｇ、そして、９４４５ Ｃ＞Ｔである。上記ＬＡＶ１株は、マヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前に、the Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM)に、番号１−２４８０として、寄託されている。
「ＬＡＶ２」株、これは弱毒化株であるが、ＰＤＫ細胞におけるデング血清型２（ＤＥＮ−２）株１６６８１の５３継代の後に構築された。ＬＡＶ２ヌクレオチド配列は配列番号１０に示される。株１６６８１のゲノム配列と比較して、ＬＡＶ２は９つのヌクレオチド置換を有する：５７ Ｃ＞Ｔ、５２４ Ａ＞Ｔ、２０５５ Ｃ＞Ｔ、２５７９ Ｇ＞Ａ、４０１８ Ｃ＞Ｔ、５２７０ Ａ＞（Ａ／Ｔ）、５５４７ Ｔ＞Ｃ、６５９９ Ｇ＞Ｃ、そして８５７１ Ｃ＞Ｔである。上記ＬＡＶ２株はマヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前に、ＣＮＣＭに、番号１−２４８１として寄託されている。
「ＬＡＶ３」株、これは一次ミドリザル腎臓（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ Ｋｉｄｎｅｙ、ＰＧＭＫ）細胞におけるデング血清型３（ＤＥＮ−３）株１６５６２の３０継代後及び胎仔アカゲザル肺（Ｆｅｔａｌ Ｒｈｅｓｕｓ Ｌｕｎｇ、ＦＲｈＬ）細胞における３継代後に構築された株に対応するものである。ＬＡＶ３ヌクレオチド配列は配列番号１１に示されている。上記ＬＡＶ３株はマヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前にＣＮＣＭに、番号１−２４８２として寄託されている。
「ＬＡＶ４」株、これは一次犬腎臓（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｄｏｇ Ｋｄｎｅｙ、ＰＤＫ）細胞におけるデング血清型４（ＤＥＮ−４）株１０３６の１８継代後に構築された株に対応する。ＬＡＶ４ヌクレオチド配列は配列番号１２に示されている。上記ＬＡＶ４株はマヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前にＣＮＣＭに、番号１−２４８３として寄託されている。
【００１９】
弱毒生ベロ由来血清型１及び２ウイルス（ＶＤＶ１及びＶＤＶ２）は本発明のキメラデングウイルスを構築する上で出発デング株として使用するには好都合である。ＶＤＶ１及びＶＤＶ２は、出願人による、複合体の単離及びＬＡＶ１及びＬＡＶ２及びプラーク精製物のそれぞれの精製ゲノムＲＮＡとともにベロ細胞の特異的な形質移入を含む多様なステップからなる形質移入の過程を通して開発された。ＬＡＶ１株のゲノム配列と比較して、ＶＤＶ１（配列番号１３）は３つのヌクレオチド置換を有する：５９６２ Ｃ＞Ａ、及び７９４７ Ａ＞Ｇ、及び任意に２７１９ Ｇ＞Ａであってもよい。ＬＡＶ２株のゲノム配列と比較してＶＤＶ２（配列番号１４）は下記のヌクレオチド置換を有する：７３６ Ｇ＞Ｃ、１６１９ Ｇ＞Ａ、４７２３ Ｔ＞Ａ、５０６２ Ｇ＞Ｃ、９１９１ Ｇ＞Ａ、１００６３ Ｔ＞Ａ、及び１０５０７ Ａ＞Ｇ、及び任意に１６３８ Ａ＞Ｇ、２５２０ Ｇ＞Ａ、及び９２２２ Ａ＞Ｇであってもよい。
【００２０】
デングウイルスゲノミック配列またはポリタンパク質と同一視される置換はＤｕｎｎｅｎ及びＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ（２０００）の命名法に準じて命名された。核酸レベルでＤｕｎｎｅｎ及びＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓによって定義されたように、置換は「＞」を用いて表される、例えば、「３１Ａ＞Ｇ」は該当配列のヌクレオチド３１においてＡがＧに変えられることを示している。
【００２１】
キメラデング／黄熱ウイルス
以上のように本発明は単離された生キメラデングウイルス、つまり有利に単離された弱毒生キメラデングウイルスを提供するもので、弱毒生キメラデングウイルスにおいて、デングウイルスの非構造配列ＮＳ５は黄熱ウイルスの対応するＮＳ５配列によって置換される。有利なことに、デングウイルスの３’ＮＣＲ配列もまた同じ黄熱ウイルスの対応する３’ＮＣＲ配列により置換される。
【００２２】
このキメラデング株は、例えば、実施例に記載されたプロトコルを用いて構築及び単離され得る。
【００２３】
これらの生キメラデング株は弱毒デング株または野生型デング株から構築され得る。この後者の場合において、キメラウイルスは、例えば、ベロ細胞のような細胞培養上での連続継代によって弱毒化され得る。
【００２４】
したがって、一つの実施態様において、本発明のキメラデングウイルスは弱毒生デング株から構築される。特定の実施態様において、前記一つのデング株はＬＡＶ１（配列番号９）、ＬＡＶ２（配列番号１０）、ＬＡＶ３（配列番号１１）、ＬＡＶ４（配列番号１２）、ベロ−由来血清型１（配列番号１３）及びベロ−由来血清型２（配列番号１４）からなる群から選択される。
【００２５】
特定の実施態様において、上に挙げられた弱毒株に含まれるＮＳ５配列及び任意に３’−ＮＣＲ配列は黄熱ワクチン株ＹＦ１７Ｄ（配列番号７）に由来する。
【００２６】
上記に従って産生されたキメラデングウイルスは凍結組成物の形態として備蓄されるか凍結乾燥された生成物として備蓄され得る。この目的のためにキメラデングウイルスは糖アルコール及び安定剤などのような凍結保護組成物を含む水溶性の緩衝溶液のような希釈剤とともに混合される。凍結または凍結乾燥前のｐＨは有利には６から９の範囲、例えば、室温のｐＨメーターによって決定されるように７を示す。使用前、凍結乾燥された産生物は、液状の免疫原性組成物またはワクチンを再構成するために、滅菌されたＮａＣｌ ４‰溶液のような医薬上許容される希釈剤または賦形剤とともに混合される。
【００２７】
ウイルスの弱毒−特異性遺伝子座における配列は、キメラ構成物の高い遺伝的安定性を確認するため形質移入後または細胞培養上での連続継代（例えば、１０継代）の後に回復した。
【００２８】
核酸
本発明は、上記に示すように、本発明のキメラデングウイルスをコードしている単離された核酸に関する。前記核酸は５’−非コード領域（ＮＣＲ）、構造配列（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、そして外皮（Ｅ））及びあるデング株の非構造配列ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、及びＮＳ４Ｂ、及び黄熱ウイルスの非構造配列ＮＳ５及び前記デング株の３’−ＮＣＲ配列または有利には前記黄熱ウイルスの３’ＮＣＲ配列のいずれかで構成されている、またはから成っている。
【００２９】
「核酸分子」はリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン）のリン酸エステル重合体の形態またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）、またはホスホロチオエート及びチオエステルのようなそれらのリン酸エステル類似体のいずれかで、一本鎖形態または二重らせん構造となっている。
【００３０】
したがって、本発明は、本発明のキメラデングウイルスをコードしているｃＤＮＡ配列並びに等価のＲＮＡ配列を提供する。
【００３１】
「等価のＲＮＡ配列」はデオキシチミジンがウリジンによって置換された前記ＤＮＡ配列を意味する。
【００３２】
本発明はまた、本発明のキメラデングウイルスのプラス鎖ＲＮＡを提供する。
【００３３】
さらに発明は本発明の核酸によってコードされたポリタンパク質に関する。
【００３４】
免疫原性及びワクチンの組成物
本発明はまた、ワクチンとして使用されるのに適した免疫原性組成物に関し、この組成物は医薬上許容される担体中の、本発明の少なくとも一つのキメラデングウイルスを含んでいる。
【００３５】
本発明による免疫原性組成物は、中和抗体などの、デングウイルスに対する体液性の免疫応答を誘発する。
【００３６】
一つの実施態様によれば、免疫原性組成物はワクチンである。
【００３７】
一つの実施態様によれば、免疫原性組成物は一価の組成物である、すなわち、特異的な免疫応答を誘発し、かつ／または唯一のデング血清型の血清型に対して防御する組成物である。
【００３８】
他の実施態様によると、本発明は多価デング免疫原性組成物、すなわち、少なくとも２、例えば３または４種のデング血清型に対して特異的な免疫応答を誘発する組成物に関する。多価の免疫原性組成物またはワクチンはそれぞれの一価のデングワクチンを組み合わせることによって得られるだろう。第２の血清型に対して特異的な免疫応答を誘発する本発明の多価組成物の有効成分は、他の血清型の第二のキメラデングウイルスであるか、または他の血清型の弱毒生デングウイルスである。例えば、本発明の免疫原性またはワクチン多価組成物は、少なくともキメラデングウイルスまたは血清型２、血清型３、及び血清型４から成る群から選択された弱毒生デングウイルスと組み合わされた、本発明のキメラデング血清型１ウイルスを含んでいてもよい。
【００３９】
有利には、免疫原性またはワクチン組成物は四価のデングワクチン組成物である。
【００４０】
本発明によれば、免疫原性またはワクチンは当該分野の技術者に知られた従来の方法を用いて準備される。慣例的には、本発明による抗原は、水またはリン酸緩衝食塩水、湿潤剤、注入剤、乳化剤、及び安定剤のような医薬上許容される希釈剤または賦形剤とともに混合される。この賦形剤または希釈液は医薬剤形の選択の機能、投与管理の方法及び経路、及び薬務の関数として選択される。医薬上の処方剤形の点から適当な賦形剤または希釈剤及び必要成分はＲｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬化学に記載されており、これは当該分野の参考文献を代表するものである。
【００４１】
有利には、免疫原性の組成物またはワクチンは、ｐＨ（ｐＨメーターを用いてＲＴにおいて決定されるように）を例えば６から９に維持するため水溶性の緩衝液を含む注入可能な組成物に相当する。
【００４２】
本発明の組成物はアジュバント、例えば、キメラデングウイルスによって誘発される免疫応答を向上または増強する物質をさらに含む。ヒトのワクチンの分野において慣例的に使用される医薬上許容されるアジュバントまたはアジュバントの混合物をこの目的のために使用してもよい。
【００４３】
本発明によれば、免疫原性組成物またはワクチンは、非経口的な（例えば、皮内、皮下、筋肉内）方法のように、ヒトのワクチンの分野でよく使用されている従来の方法に従って投与される。本発明の状況において免疫原性組成物またはワクチンは、三角筋領域の皮下に投与されるような注射可能な組成物であることが好ましい。
【００４４】
免疫化のための方法
さらに本発明は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの免疫効果量を用いてホストに投与することを含む、デング感染に対して免疫が必要な宿主の免疫化方法を提供する。
【００４５】
「免疫が必要な宿主」とは、デング感染の危機にあるヒトを示す。例えば、個人旅行でデングウイルスが存在する地域を訪れたヒト、その地域の居住者が挙げられる。
【００４６】
投与方法はワクチンの分野で使用される従来のいずれの方法でもよい。投与方法の選択は、選択された処方剤形に依る。好ましくは、免疫原性組成物またはワクチンは、皮下経路、有利には三角筋領域に投与する注入可能な組成物に対応する。
【００４７】
免疫原性組成物またはワクチンにおける弱毒生キメラデングウイルスの量は、剤形中のウイルスのプラーク形成ユニット（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ、ＰＦＵ）または細胞培養感染量（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ ５０％、ＣＣＩＤ５０）で表され、そして従来の医薬技術を用いることによって調製される。例えば、本発明による組成物は、一価の組成物に対して、弱毒生キメラデングウイルスの４±０．５ ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０で、ウイルスの１０〜１０６ＣＣＩＤ５０または１０３〜１０５ＣＣＩＤ５０を含む剤形で調製される。ウイルス性干渉及び免疫応答（すなわち、組成物中に含まれるすべての血清型に対する免疫応答は）のバランスを達成するために、組成物は多価であり、投与されるワクチンに存在する異なるデング血清型のそれぞれの量は等量でなくてもよい。
【００４８】
「免疫有効量」はワクチンの血清において中和抗体を含む特異的な体液性免疫応答を誘発し得る量である。中和抗体の存在の評価方法は当該分野の技術者によく知られている。
【００４９】
投与量は投与方法によってさまざまである。皮下注射は０．１ｍｌから１０ｍｌの範囲に及び、好ましくは０．５ｍｌである。
【００５０】
組成物の投与に係る最適時期は、デングウイルスに最初に曝される前１〜３ヶ月である。本発明のワクチンは予防剤としてデング感染のリスクにある大人または子どもに投与される。よって、標的にされる集団は、デングウイルスに対して治療経験者、未感染者、並びにすでに感染している者を包含する。本発明のワクチンは一回量で投与されるか、または所望により投与は初回量を用いた後、当業者が適宜決定して、例えば２〜６ヶ月後に追加量を用いることができる。
【００５１】
本発明はさらに下記の図及び実施例として記載される。下記の記載を明らかにする目的でＬＡＶ３からの本発明のキメラデングウイルスの構築を詳述する。
【００５２】
図
図１は、黄熱ＮＳ５配列を含むキメラデング３ウイルスを構築するために使用され得る３工程のＰＣＲストラテジーの図表である。
図２は、デングウイルス及び黄熱ウイルスの、並びにキメラデング３／黄熱ウイルスのゲノム構成の図表である。
図３は、デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ１上のＳｃａｌ制限酵素部位の位置を示す。
図４は、デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ２上のＮｏｔｌ及びＳｐｅｌ制限酵素部位の位置を示す。
図５は、単位複製配列ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の間の重複を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
実施例
実施例１：黄熱ＮＳ５配列を含むキメラデング３ウイルスの構築
【００５４】
本発明のキメラデング３ウイルスを構築するために、完全なデング３ゲノムｃＤＮＡ（配列番号１１）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターｐＶＡＸ（インビトロゲン）内にクローン化し、Ｎｏｔｌ制限酵素部位がウイルス性配列の３’末端に隣接しているように設計することができる。
【００５５】
デング３のＮＳ４ｂと黄熱のＮＳ５とを連結するために、重複伸長の技術に基づいて下記のストラテジーを使用することができる。この技術は、連結部位で新たな制限酵素部位をつくる必要性を回避して２つのゲノム配列を完全に連結する能力があるため有利に選択される。
【００５６】
図１及び下記に示されるように連続ＰＣＲステップを用いて、デング−黄熱キメラ構築物を得ることができる。
【００５７】
最初のＰＣＲステップにおいて、２つの部分的重複ＤＮＡセグメントは下記のように産生される：すなわち、図３に示す方法に従って、ＰＣＲセグメントを産生する。
【００５８】
プライマー１はデング３のＮＳ４中に位置し（配列番号９のデング３配列のヌクレオチド７１４６〜７１７５）、ユニークなＳｃａｌ制限酵素部位（下線部）を含んでいる。プライマー２はデング３のＮＳ４ｂ（太字）と黄熱のＮＳ５配列とに重複している。
【００５９】
プログラム:
【００６０】
デングＮＳ４ｂ配列のおよそ４３０ヌクレオチドを含む０．４５Ｋｂフラグメントと黄熱ＮＳ５配列の５’末端に対応する小さな伸長物とが得られる（ＰＣＲ１、配列番号３）。
【００６１】
図４に示されるストラテジーに従って、ＰＣＲ２フラグメントを得る。
【００６２】
プライマー３はデング３のＮＳ４ｂと黄熱のＮＳ５（太字）とに重複しており、プライマー２の逆相補鎖である。プライマー４は黄熱の３’ＵＴＲ中に位置しており、制限酵素部位Ｎｏｔ ｌ及びＳｐｅ ｌ（下線部）を含んでいる。
【００６３】
プログラム：
【００６４】
デングＮＳ４ｂ配列の５’末端の１５ヌクレオチド及び黄熱ＮＳ５をコードしている相補配列及び黄熱ゲノムの非コード化された３’領域を含む３．２Ｋｂフラグメントが得られる（ＰＣＲ２、配列番号６）。
【００６５】
第２のＰＣＲステップ（ＰＣＲ３、図５）において、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の両者の部分的重複フラグメントの化学量論的混合物を１０回のＰＣＲサイクルに供される。
【００６６】
PCR 3
Product of PCR 1 0.5μl
Product of PCR 2 0.5μl
10× Buffer 5μl
dNTP 1.25 mM 8μl
Nuclease-free water 36μl
Final volume 50μl
+ Platinum Hi Fi Taq polymerase 1μl
【００６７】
プログラム：
【００６８】
Ｓｃａｌ及びＮｏｔ／Ｓｐｅのそれぞれの制限酵素部位を含むプライマー１及び４の存在下で、第３のＰＣＲステップ（ＰＣＲ４）は第２反応で得られた産物を用いて実行される。その目的のために、プライマー１及びプライマー４（１２５ｎｇ／μｌ）のそれぞれ１μｌがＰＣＲ３の反応性生物に加えられ、ＰＣＲ反応は追加的に２５サイクル続けられる。
【００６９】
その結果得られるＤＮＡの長フラグメントをアガロースゲル上で精製し、次にＳｃａｌ及びＮｏｔｌまたはＳｐｅｌ制限酵素エンドヌクレアーゼを用いて消化し、全デング３配列を含むオリジナルベクターに連結する。
【００７０】
実施例２：キメラデングウイルスの回収
キメラデングウイルスを回収するために、下記のストラテジーを用いることができる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞ですべての組み換え体プラスミドを増幅することができる。次いで、プラスミド５００ｎｇをＮｏｔｌ制限酵素エンドヌクレアーゼによって線状化する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写の後、ウイルス性のＲＮＡが得られ、ｍ７ＧｐｐｐＡキャップ類似体を用いてキャップされる。さらに、その後エレクトロポレーションにより、３×１０６個〜４×１０６個のＬＬＣ−ＭＫ２細胞またはＢＨＫ−２１細胞中にトランスフェクションする。形質移入された細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭが入った７５ｃｍ２フラスコに移す。そして、得られたキメラウイルスを増幅させ、細胞から単離する。
【００７１】
参考文献
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- Rothman AL, Ennis FA. (1999) Immunopathogenesis of dengue haemorrhagic fever. Virology; 257: 1-6
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- Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, Innis BL, Nimmannitya S, Suntayakorn S, Rothman AL, Ennis FA, Nisalak A. (1997) Dengue in the early febrile phase: viremia and antibody response. J Infect Dis; 176: 322-30
- Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, Innis BL, Nimmannitya S, Suntayakorn S, Endy TP, Raengsakulrach B, Rothman AL, Ennis FA, Nisalak A. (2000) Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. J Inf Dis; 181: 2-9
- WHO Technical Guide, (1986) Dengue haemorrhagic fever : diagnosis, treatment and control, p1-2. World Health Organization, Geneva, Switzerland
- Wu S, Grouard-Vogel G, Sun W, Mascola J, Brachtel E, Putvatana R. (2000) Human skin Langerhans cells are targets of dengue virus infection. Nature Med; 7:816-820
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】黄熱ＮＳ５配列を含むキメラデング３ウイルスを構築するために使用され得る３工程のＰＣＲストラテジーの図表である。
【図２】デングウイルス及び黄熱ウイルスの、並びにキメラデング３／黄熱ウイルスのゲノム構成の図表である。
【図３】デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ１上のＳｃａｌ制限酵素部位の位置を示す。
【図４】デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ２上のＮｏｔｌ及びＳｐｅｌ制限酵素部位の位置を示す。
【図５】単位複製配列ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の間の重複を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝的安定性が高いゆえに非弱毒化表現系に復帰しにくいデングキメラウイルスに関する。これらのデングキメラウイルスにおいて、ポリメラーゼをコードしているＮＳ５配列は、黄熱病ウイルスの対応するＮＳ５配列と置き換えられている。
【背景技術】
【０００２】
デング熱はマラリアに次ぐ、二番目に重要な熱帯感染症であり、世界人口（２０億５千万人）の半分以上の人々が伝染のリスクがある場所に生活している。デング病の推定５０００万から１億人のうち、年間５０万人がＤＨＦ患者として入院し、２万５千人が死亡している。デング病はアジア、太平洋、アフリカ、アメリカ、カリブ海などの風土性がある。
【０００３】
デング出血性熱（ＤＨＦ）は、深刻な内出血によって悪化する血液量減少症及び低血圧症（Ｄｅｎｇｕｅ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ, ＤＳＳ）を引き起こす恒常性の異常と高い血管浸透性とによって特徴付けられる深刻な熱性の疾患である。ＤＨＦの致死率は治療を施さないと１０％と高いが、処置を行えば１％以下となる(WHO Technical Guide, 1986)。
【０００４】
デング熱感染症はフラビウイルス属(Gubler, 1988)のうち、密接に関連しているが、抗原性の異なる４つのウイルス血清型(Gubler, 1988；Kautner ら、1997；Rigau-Perez ら、1998；Vaughn ら、1997)によって引き起こされる。デングウイルス血清型に感染すると非特異的なウイルス性症候群から深刻で致命的な出血性疾患までの範囲に及ぶ臨床疾患を引き起こす。デング熱（ＤＦ）の潜伏期間は蚊に刺されてから平均４日（３から１４日の範囲）である。ＤＦは二峰性の熱、頭痛、体中の痛み、衰弱、発疹、リンパ節腫そして白血球減少症によって特徴付けられる(Kautnerら、1997; Rigau-Perezら、1998)。ウイルス血症の期間は熱性の疾患と同じである(Vaughnら、1997)。ＤＦは通常７〜１０日間で回復するが、遷延性の無力症となるのが一般的である。白血球及び血小板の数がしばしば減少する。
【０００５】
ウイルスは、ヒトやヒトを標的として好む、国内で日中に咬刺するネッタイシマカの中に周期的に保有される。ヒトへの感染は、感染したネッタイシマカが血液摂食している間、ウイルスが注入されることによって引き起こされる。ネッタイシマカの唾液ウイルスは主に血管外組織に蓄積される。接種後に感染した原発細胞の小集合は樹状細胞であり、その後、流出するリンパ節に向かって遊走する(Wuら、2000)。皮膚での最初の複製とリンパ節からの流出の後、高熱期の間、一般的に３〜５日間のうちにウイルスが血管内に出現する。
【０００６】
単球及びマクロファージは樹状細胞とともにデングウイルスの主な標的である。ホモタイプの再感染に対する防御は完全であり恐らく生涯維持されると思われるが、デング型どうしの交差防御は１２週間以下である(Sabin, 1952)。したがって、対象患者は異なる血清型に再び感染する可能性がある。二回目のデング感染は深刻なデング熱感染症に発展するという理論的に危険な因子である。しかしながら、ＤＨＦは多因性である：患者の年齢、免疫状態、患者の遺伝的体質のみならずウイルス株も含まれる。二つの因子がＤＨＦの発症に大きな役割を担っている：高ウイルス血症（ウイルス血症のレベルに係わる疾患の重症度）に伴うウイルスの急速な複製(Vaughnら、2000)及び炎症メディエーターの高レベル放出に伴う重要な炎症反応(Rothman及びEnnis, 1999)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
デング熱感染症に対する特別な治療はない。ＤＦの管理は、ベッド療養、解熱剤と鎮痛剤による熱と苦痛の制御、そして適切な水分摂取によって支持される。ＤＨＦの治療は、体液喪失の調整、凝固因子の交替、そしてヘパリンの注入が必要である。
【０００８】
現在の予防対策は媒介生物の駆除と個人的な保護措置に依存しており、これは強要することは難しく、高価である。現在デングに対するワクチンの登録はない。デングの４つの血清型が世界中に広がり、それらはＤＨＦの場合に含まれることが報告されているため、４つすべてのデングウイルス血清型に対してワクチン接種により予防することが理想的である。
【０００９】
弱毒生ワクチン、これは自然免疫を再生させるものであるが、多くの疾患に対するワクチンの開発に使用されている。弱毒生ウイルスワクチンの優位性は複製能力と体液性かつ細胞性の両者の免疫応答の誘導にある。さらに、ウイルス（構造及び非構造タンパク質）の異なる組成に対して全体のビリオンワクチンによって誘導された免疫応答は自然感染によって誘導された応答を再度生じた。
【００１０】
デングワクチンのプロジェクトがタイのマヒドール大学化学技術研究所、ワクチン開発センターで立ち上げられた。デング血清型１から４に対する弱毒生ワクチンの候補の実験規模での開発に成功した。これらのワクチンはタイのボランティアによって、一価（一つの血清型）、二価（二つの血清型）、三価（三つの血清型）、四価（四つすべての血清型）として試験されている。これらのワクチンは大人及び小児に対して安全で、かつ免疫応答し得るように構築された(Gubler, 1997)。しかしながら、これらのＬＡＶ株は異種性の集団に対応し、組成物に存在する株の一つのインビトロまたはインビボの選択の可能性によるリスクを示す。実際に、デングウイルスは複製過程において、一般的突然変異や遺伝的変化を起こしやすい。
【００１１】
Pugachevら（2004）は、黄熱ウイルスのＮＳ５によってコードされたポリメラーゼは他のフラビウイルスと比較して、忠実度が高いという特徴を有することを最近公表した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明者らは、黄熱ポリメラーゼのユニークな特徴を活かしてデングウイルスのキメラ組み換え体を構築することを提案する。該組み換え体において、デングウイルスの元のポリメラーゼをコードする配列が黄熱株の対応する配列で置換されており、かくして有用なワクチン候補となるであろう高い遺伝的安定性を有する弱毒生デングウイルスが得られる。
【００１３】
定義
「黄熱株」と表現することによって、多様な黄熱株を意味している。一例として、ＹＦＤ１７株が使用され得る。この株はSmithburnら（１９５６）及びFreestone （１９９５）が開示している。ＹＦ１７Ｄは遺伝子レベルで研究され(Rice ら、1985)、そのゲノム配列は配列番号７に示される(Genbank accession number NC 002031)。確かに本発明に関する記載の文脈上、デングウイルスに挿入されるＮＳ５配列はいずれの黄熱株にも由来し得る。本発明における一つの実施態様において、デングウイルスのＮＳ５をコードしている配列はＹＦＤ１７株のＮＳ５をコードしている配列に対応するため置換される。好都合なことに、同じデングウイルスの３’ＮＣＲ配列もまた同じ黄熱株の３’ＮＣＲ配列に対応するため置換される。
【００１４】
本明細書に記載のとおり、デング（ＤＥＮ）ウイルスは血清型１、２、３、４の野生型デングウイルス、または血清型１、２、３、４の弱毒生デングウイルス株を示す。デングウイルスは下記の遺伝子構成を示すＲＮＡウイルスである：５’−非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、外被（Ｅ））及び非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）及び３’ＮＣＲ。ＲＮＡゲノムはヌクレオチド（正二十面体の対称性）を形成するＣタンパク質に関連する。他のフラビウイルスのように、ＤＥＮウイルス性ゲノムは、中断されていない翻訳領域（ＯＲＦ）をコードしており、この翻訳領域は一つのポリタンパク質に翻訳される。
【００１５】
特に、デング血清型１（ＤＥＮ−１）ウイルスは野生型株の１６００７であろう。デング血清型２（ＤＥＮ−２）ウイルスは野生型株の１６６８１であろう。デング血清型３（ＤＥＮ−３）ウイルスは野生型株の１６５６２またはマルティニクで新たに再導入されたデングウイルス型３（Peyrefitte ら、2003、配列番号８）であろう。デング血清型４（ＤＥＮ−４）は野生型株の１０３６であろう。
【００１６】
「弱毒生」ウイルスまたは株と記載することによって、本明細書では、試験されたヒトの大半において軽症（例えば、明確な利益／リスクの比率が現れるほどに調節された目的から受け入れられる程度）または副次的作用（例えば、全身性の発症かつ／または生物学的異常かつ／または局所反応）がないが、しかし感染して免疫応答を引き起こす株またはウイルスを意味する。これらの弱毒生株は初めはデング野生型株に由来してもよい。
【００１７】
「免疫反応」と記載することによって、本明細書では霊長類において、特にヒトにおいて、中和抗体を含む特異な体液性免疫応答を含む応答を意味する。特異な体液性免疫応答の導入はＥＬＩＳＡアッセイによって容易に確定され得る。ワクチンの血清中における中和抗体の存在はHuang ら (2000)が開示したような血小板の減少によって評価される。確定された中和抗体の滴定量が少なくとも１：１０と同じかそれ以上であるとき、血清は中和抗体の存在に関して陽性であると考えられる。
【００１８】
本発明のキメラデングウイルスの構築のために最初の産生物として用いられ得るデング株は、例えば、：
「ＬＡＶ１」株、これはプライマリードッグの腎臓（ＰＤＫ）におけるデング血清型１（ＤＥＮ−１）株１６００７の１３継代の後確立された弱毒化株である。ＬＡＶ１配列は配列番号９に示される。ＤＥＮ−１ １６００７と比較して、ＬＡＶ１は１４個のヌクレオチド置換を有する：１３２３ Ｔ＞Ｃ、１５４１ Ｇ＞Ａ、１５４３ Ａ＞Ｇ、１５４５ Ｇ＞Ａ、１５６７ Ａ＞Ｇ、１６０８ Ｃ＞Ｔ、２３６３ Ａ＞Ｇ、２６９５ Ｔ＞Ｃ、２７８２ Ｃ＞Ｔ、５０６３ Ｇ＞Ａ、６０４８ Ａ＞Ｔ、６８０６ Ａ＞Ｇ、７３３０ Ａ＞Ｇ、そして、９４４５ Ｃ＞Ｔである。上記ＬＡＶ１株は、マヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前に、the Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM)に、番号１−２４８０として、寄託されている。
「ＬＡＶ２」株、これは弱毒化株であるが、ＰＤＫ細胞におけるデング血清型２（ＤＥＮ−２）株１６６８１の５３継代の後に構築された。ＬＡＶ２ヌクレオチド配列は配列番号１０に示される。株１６６８１のゲノム配列と比較して、ＬＡＶ２は９つのヌクレオチド置換を有する：５７ Ｃ＞Ｔ、５２４ Ａ＞Ｔ、２０５５ Ｃ＞Ｔ、２５７９ Ｇ＞Ａ、４０１８ Ｃ＞Ｔ、５２７０ Ａ＞（Ａ／Ｔ）、５５４７ Ｔ＞Ｃ、６５９９ Ｇ＞Ｃ、そして８５７１ Ｃ＞Ｔである。上記ＬＡＶ２株はマヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前に、ＣＮＣＭに、番号１−２４８１として寄託されている。
「ＬＡＶ３」株、これは一次ミドリザル腎臓（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ Ｋｉｄｎｅｙ、ＰＧＭＫ）細胞におけるデング血清型３（ＤＥＮ−３）株１６５６２の３０継代後及び胎仔アカゲザル肺（Ｆｅｔａｌ Ｒｈｅｓｕｓ Ｌｕｎｇ、ＦＲｈＬ）細胞における３継代後に構築された株に対応するものである。ＬＡＶ３ヌクレオチド配列は配列番号１１に示されている。上記ＬＡＶ３株はマヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前にＣＮＣＭに、番号１−２４８２として寄託されている。
「ＬＡＶ４」株、これは一次犬腎臓（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｄｏｇ Ｋｄｎｅｙ、ＰＤＫ）細胞におけるデング血清型４（ＤＥＮ−４）株１０３６の１８継代後に構築された株に対応する。ＬＡＶ４ヌクレオチド配列は配列番号１２に示されている。上記ＬＡＶ４株はマヒドール大学の名前でＥＰ１１５９９６８に記載されており、２０００年５月２５日以前にＣＮＣＭに、番号１−２４８３として寄託されている。
【００１９】
弱毒生ベロ由来血清型１及び２ウイルス（ＶＤＶ１及びＶＤＶ２）は本発明のキメラデングウイルスを構築する上で出発デング株として使用するには好都合である。ＶＤＶ１及びＶＤＶ２は、出願人による、複合体の単離及びＬＡＶ１及びＬＡＶ２及びプラーク精製物のそれぞれの精製ゲノムＲＮＡとともにベロ細胞の特異的な形質移入を含む多様なステップからなる形質移入の過程を通して開発された。ＬＡＶ１株のゲノム配列と比較して、ＶＤＶ１（配列番号１３）は３つのヌクレオチド置換を有する：５９６２ Ｃ＞Ａ、及び７９４７ Ａ＞Ｇ、及び任意に２７１９ Ｇ＞Ａであってもよい。ＬＡＶ２株のゲノム配列と比較してＶＤＶ２（配列番号１４）は下記のヌクレオチド置換を有する：７３６ Ｇ＞Ｃ、１６１９ Ｇ＞Ａ、４７２３ Ｔ＞Ａ、５０６２ Ｇ＞Ｃ、９１９１ Ｇ＞Ａ、１００６３ Ｔ＞Ａ、及び１０５０７ Ａ＞Ｇ、及び任意に１６３８ Ａ＞Ｇ、２５２０ Ｇ＞Ａ、及び９２２２ Ａ＞Ｇであってもよい。
【００２０】
デングウイルスゲノミック配列またはポリタンパク質と同一視される置換はＤｕｎｎｅｎ及びＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ（２０００）の命名法に準じて命名された。核酸レベルでＤｕｎｎｅｎ及びＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓによって定義されたように、置換は「＞」を用いて表される、例えば、「３１Ａ＞Ｇ」は該当配列のヌクレオチド３１においてＡがＧに変えられることを示している。
【００２１】
キメラデング／黄熱ウイルス
以上のように本発明は単離された生キメラデングウイルス、つまり有利に単離された弱毒生キメラデングウイルスを提供するもので、弱毒生キメラデングウイルスにおいて、デングウイルスの非構造配列ＮＳ５は黄熱ウイルスの対応するＮＳ５配列によって置換される。有利なことに、デングウイルスの３’ＮＣＲ配列もまた同じ黄熱ウイルスの対応する３’ＮＣＲ配列により置換される。
【００２２】
このキメラデング株は、例えば、実施例に記載されたプロトコルを用いて構築及び単離され得る。
【００２３】
これらの生キメラデング株は弱毒デング株または野生型デング株から構築され得る。この後者の場合において、キメラウイルスは、例えば、ベロ細胞のような細胞培養上での連続継代によって弱毒化され得る。
【００２４】
したがって、一つの実施態様において、本発明のキメラデングウイルスは弱毒生デング株から構築される。特定の実施態様において、前記一つのデング株はＬＡＶ１（配列番号９）、ＬＡＶ２（配列番号１０）、ＬＡＶ３（配列番号１１）、ＬＡＶ４（配列番号１２）、ベロ−由来血清型１（配列番号１３）及びベロ−由来血清型２（配列番号１４）からなる群から選択される。
【００２５】
特定の実施態様において、上に挙げられた弱毒株に含まれるＮＳ５配列及び任意に３’−ＮＣＲ配列は黄熱ワクチン株ＹＦ１７Ｄ（配列番号７）に由来する。
【００２６】
上記に従って産生されたキメラデングウイルスは凍結組成物の形態として備蓄されるか凍結乾燥された生成物として備蓄され得る。この目的のためにキメラデングウイルスは糖アルコール及び安定剤などのような凍結保護組成物を含む水溶性の緩衝溶液のような希釈剤とともに混合される。凍結または凍結乾燥前のｐＨは有利には６から９の範囲、例えば、室温のｐＨメーターによって決定されるように７を示す。使用前、凍結乾燥された産生物は、液状の免疫原性組成物またはワクチンを再構成するために、滅菌されたＮａＣｌ ４‰溶液のような医薬上許容される希釈剤または賦形剤とともに混合される。
【００２７】
ウイルスの弱毒−特異性遺伝子座における配列は、キメラ構成物の高い遺伝的安定性を確認するため形質移入後または細胞培養上での連続継代（例えば、１０継代）の後に回復した。
【００２８】
核酸
本発明は、上記に示すように、本発明のキメラデングウイルスをコードしている単離された核酸に関する。前記核酸は５’−非コード領域（ＮＣＲ）、構造配列（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、そして外皮（Ｅ））及びあるデング株の非構造配列ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、及びＮＳ４Ｂ、及び黄熱ウイルスの非構造配列ＮＳ５及び前記デング株の３’−ＮＣＲ配列または有利には前記黄熱ウイルスの３’ＮＣＲ配列のいずれかで構成されている、またはから成っている。
【００２９】
「核酸分子」はリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン）のリン酸エステル重合体の形態またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）、またはホスホロチオエート及びチオエステルのようなそれらのリン酸エステル類似体のいずれかで、一本鎖形態または二重らせん構造となっている。
【００３０】
したがって、本発明は、本発明のキメラデングウイルスをコードしているｃＤＮＡ配列並びに等価のＲＮＡ配列を提供する。
【００３１】
「等価のＲＮＡ配列」はデオキシチミジンがウリジンによって置換された前記ＤＮＡ配列を意味する。
【００３２】
本発明はまた、本発明のキメラデングウイルスのプラス鎖ＲＮＡを提供する。
【００３３】
さらに発明は本発明の核酸によってコードされたポリタンパク質に関する。
【００３４】
免疫原性及びワクチンの組成物
本発明はまた、ワクチンとして使用されるのに適した免疫原性組成物に関し、この組成物は医薬上許容される担体中の、本発明の少なくとも一つのキメラデングウイルスを含んでいる。
【００３５】
本発明による免疫原性組成物は、中和抗体などの、デングウイルスに対する体液性の免疫応答を誘発する。
【００３６】
一つの実施態様によれば、免疫原性組成物はワクチンである。
【００３７】
一つの実施態様によれば、免疫原性組成物は一価の組成物である、すなわち、特異的な免疫応答を誘発し、かつ／または唯一のデング血清型の血清型に対して防御する組成物である。
【００３８】
他の実施態様によると、本発明は多価デング免疫原性組成物、すなわち、少なくとも２、例えば３または４種のデング血清型に対して特異的な免疫応答を誘発する組成物に関する。多価の免疫原性組成物またはワクチンはそれぞれの一価のデングワクチンを組み合わせることによって得られるだろう。第２の血清型に対して特異的な免疫応答を誘発する本発明の多価組成物の有効成分は、他の血清型の第二のキメラデングウイルスであるか、または他の血清型の弱毒生デングウイルスである。例えば、本発明の免疫原性またはワクチン多価組成物は、少なくともキメラデングウイルスまたは血清型２、血清型３、及び血清型４から成る群から選択された弱毒生デングウイルスと組み合わされた、本発明のキメラデング血清型１ウイルスを含んでいてもよい。
【００３９】
有利には、免疫原性またはワクチン組成物は四価のデングワクチン組成物である。
【００４０】
本発明によれば、免疫原性またはワクチンは当該分野の技術者に知られた従来の方法を用いて準備される。慣例的には、本発明による抗原は、水またはリン酸緩衝食塩水、湿潤剤、注入剤、乳化剤、及び安定剤のような医薬上許容される希釈剤または賦形剤とともに混合される。この賦形剤または希釈液は医薬剤形の選択の機能、投与管理の方法及び経路、及び薬務の関数として選択される。医薬上の処方剤形の点から適当な賦形剤または希釈剤及び必要成分はＲｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬化学に記載されており、これは当該分野の参考文献を代表するものである。
【００４１】
有利には、免疫原性の組成物またはワクチンは、ｐＨ（ｐＨメーターを用いてＲＴにおいて決定されるように）を例えば６から９に維持するため水溶性の緩衝液を含む注入可能な組成物に相当する。
【００４２】
本発明の組成物はアジュバント、例えば、キメラデングウイルスによって誘発される免疫応答を向上または増強する物質をさらに含む。ヒトのワクチンの分野において慣例的に使用される医薬上許容されるアジュバントまたはアジュバントの混合物をこの目的のために使用してもよい。
【００４３】
本発明によれば、免疫原性組成物またはワクチンは、非経口的な（例えば、皮内、皮下、筋肉内）方法のように、ヒトのワクチンの分野でよく使用されている従来の方法に従って投与される。本発明の状況において免疫原性組成物またはワクチンは、三角筋領域の皮下に投与されるような注射可能な組成物であることが好ましい。
【００４４】
免疫化のための方法
さらに本発明は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの免疫効果量を用いてホストに投与することを含む、デング感染に対して免疫が必要な宿主の免疫化方法を提供する。
【００４５】
「免疫が必要な宿主」とは、デング感染の危機にあるヒトを示す。例えば、個人旅行でデングウイルスが存在する地域を訪れたヒト、その地域の居住者が挙げられる。
【００４６】
投与方法はワクチンの分野で使用される従来のいずれの方法でもよい。投与方法の選択は、選択された処方剤形に依る。好ましくは、免疫原性組成物またはワクチンは、皮下経路、有利には三角筋領域に投与する注入可能な組成物に対応する。
【００４７】
免疫原性組成物またはワクチンにおける弱毒生キメラデングウイルスの量は、剤形中のウイルスのプラーク形成ユニット（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ、ＰＦＵ）または細胞培養感染量（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ ５０％、ＣＣＩＤ５０）で表され、そして従来の医薬技術を用いることによって調製される。例えば、本発明による組成物は、一価の組成物に対して、弱毒生キメラデングウイルスの４±０．５ ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０で、ウイルスの１０〜１０６ＣＣＩＤ５０または１０３〜１０５ＣＣＩＤ５０を含む剤形で調製される。ウイルス性干渉及び免疫応答（すなわち、組成物中に含まれるすべての血清型に対する免疫応答は）のバランスを達成するために、組成物は多価であり、投与されるワクチンに存在する異なるデング血清型のそれぞれの量は等量でなくてもよい。
【００４８】
「免疫有効量」はワクチンの血清において中和抗体を含む特異的な体液性免疫応答を誘発し得る量である。中和抗体の存在の評価方法は当該分野の技術者によく知られている。
【００４９】
投与量は投与方法によってさまざまである。皮下注射は０．１ｍｌから１０ｍｌの範囲に及び、好ましくは０．５ｍｌである。
【００５０】
組成物の投与に係る最適時期は、デングウイルスに最初に曝される前１〜３ヶ月である。本発明のワクチンは予防剤としてデング感染のリスクにある大人または子どもに投与される。よって、標的にされる集団は、デングウイルスに対して治療経験者、未感染者、並びにすでに感染している者を包含する。本発明のワクチンは一回量で投与されるか、または所望により投与は初回量を用いた後、当業者が適宜決定して、例えば２〜６ヶ月後に追加量を用いることができる。
【００５１】
本発明はさらに下記の図及び実施例として記載される。下記の記載を明らかにする目的でＬＡＶ３からの本発明のキメラデングウイルスの構築を詳述する。
【００５２】
図
図１は、黄熱ＮＳ５配列を含むキメラデング３ウイルスを構築するために使用され得る３工程のＰＣＲストラテジーの図表である。
図２は、デングウイルス及び黄熱ウイルスの、並びにキメラデング３／黄熱ウイルスのゲノム構成の図表である。
図３は、デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ１上のＳｃａｌ制限酵素部位の位置を示す。
図４は、デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ２上のＮｏｔｌ及びＳｐｅｌ制限酵素部位の位置を示す。
図５は、単位複製配列ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の間の重複を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
実施例
実施例１：黄熱ＮＳ５配列を含むキメラデング３ウイルスの構築
【００５４】
本発明のキメラデング３ウイルスを構築するために、完全なデング３ゲノムｃＤＮＡ（配列番号１１）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターｐＶＡＸ（インビトロゲン）内にクローン化し、Ｎｏｔｌ制限酵素部位がウイルス性配列の３’末端に隣接しているように設計することができる。
【００５５】
デング３のＮＳ４ｂと黄熱のＮＳ５とを連結するために、重複伸長の技術に基づいて下記のストラテジーを使用することができる。この技術は、連結部位で新たな制限酵素部位をつくる必要性を回避して２つのゲノム配列を完全に連結する能力があるため有利に選択される。
【００５６】
図１及び下記に示されるように連続ＰＣＲステップを用いて、デング−黄熱キメラ構築物を得ることができる。
【００５７】
最初のＰＣＲステップにおいて、２つの部分的重複ＤＮＡセグメントは下記のように産生される：すなわち、図３に示す方法に従って、ＰＣＲセグメントを産生する。
【００５８】
プライマー１はデング３のＮＳ４中に位置し（配列番号９のデング３配列のヌクレオチド７１４６〜７１７５）、ユニークなＳｃａｌ制限酵素部位（下線部）を含んでいる。プライマー２はデング３のＮＳ４ｂ（太字）と黄熱のＮＳ５配列とに重複している。
【００５９】
プログラム:
【００６０】
デングＮＳ４ｂ配列のおよそ４３０ヌクレオチドを含む０．４５Ｋｂフラグメントと黄熱ＮＳ５配列の５’末端に対応する小さな伸長物とが得られる（ＰＣＲ１、配列番号３）。
【００６１】
図４に示されるストラテジーに従って、ＰＣＲ２フラグメントを得る。
【００６２】
プライマー３はデング３のＮＳ４ｂと黄熱のＮＳ５（太字）とに重複しており、プライマー２の逆相補鎖である。プライマー４は黄熱の３’ＵＴＲ中に位置しており、制限酵素部位Ｎｏｔ ｌ及びＳｐｅ ｌ（下線部）を含んでいる。
【００６３】
プログラム：
【００６４】
デングＮＳ４ｂ配列の５’末端の１５ヌクレオチド及び黄熱ＮＳ５をコードしている相補配列及び黄熱ゲノムの非コード化された３’領域を含む３．２Ｋｂフラグメントが得られる（ＰＣＲ２、配列番号６）。
【００６５】
第２のＰＣＲステップ（ＰＣＲ３、図５）において、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の両者の部分的重複フラグメントの化学量論的混合物を１０回のＰＣＲサイクルに供される。
【００６６】
PCR 3
Product of PCR 1 0.5μl
Product of PCR 2 0.5μl
10× Buffer 5μl
dNTP 1.25 mM 8μl
Nuclease-free water 36μl
Final volume 50μl
+ Platinum Hi Fi Taq polymerase 1μl
【００６７】
プログラム：
【００６８】
Ｓｃａｌ及びＮｏｔ／Ｓｐｅのそれぞれの制限酵素部位を含むプライマー１及び４の存在下で、第３のＰＣＲステップ（ＰＣＲ４）は第２反応で得られた産物を用いて実行される。その目的のために、プライマー１及びプライマー４（１２５ｎｇ／μｌ）のそれぞれ１μｌがＰＣＲ３の反応性生物に加えられ、ＰＣＲ反応は追加的に２５サイクル続けられる。
【００６９】
その結果得られるＤＮＡの長フラグメントをアガロースゲル上で精製し、次にＳｃａｌ及びＮｏｔｌまたはＳｐｅｌ制限酵素エンドヌクレアーゼを用いて消化し、全デング３配列を含むオリジナルベクターに連結する。
【００７０】
実施例２：キメラデングウイルスの回収
キメラデングウイルスを回収するために、下記のストラテジーを用いることができる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞ですべての組み換え体プラスミドを増幅することができる。次いで、プラスミド５００ｎｇをＮｏｔｌ制限酵素エンドヌクレアーゼによって線状化する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写の後、ウイルス性のＲＮＡが得られ、ｍ７ＧｐｐｐＡキャップ類似体を用いてキャップされる。さらに、その後エレクトロポレーションにより、３×１０６個〜４×１０６個のＬＬＣ−ＭＫ２細胞またはＢＨＫ−２１細胞中にトランスフェクションする。形質移入された細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭが入った７５ｃｍ２フラスコに移す。そして、得られたキメラウイルスを増幅させ、細胞から単離する。
【００７１】
参考文献
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- Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, Innis BL, Nimmannitya S, Suntayakorn S, Endy TP, Raengsakulrach B, Rothman AL, Ennis FA, Nisalak A. (2000) Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. J Inf Dis; 181: 2-9
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】黄熱ＮＳ５配列を含むキメラデング３ウイルスを構築するために使用され得る３工程のＰＣＲストラテジーの図表である。
【図２】デングウイルス及び黄熱ウイルスの、並びにキメラデング３／黄熱ウイルスのゲノム構成の図表である。
【図３】デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ１上のＳｃａｌ制限酵素部位の位置を示す。
【図４】デング−３ゲノム及び単位複製配列ＰＣＲ２上のＮｏｔｌ及びＳｐｅｌ制限酵素部位の位置を示す。
【図５】単位複製配列ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の間の重複を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デング非構造ＮＳ５配列が黄熱ウイルスの非構造ＮＳ５配列に置換されている、単離されたキメラデングウイルス。
【請求項２】
デングウイルスの３’ＮＣＲ配列が同じ黄熱ウイルスの３’ＮＣＲ配列に置換されている、特徴とする請求項１に記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項３】
デングウイルスがデング血清型１、デング血清型２、デング血清型３、及びデング血清型４からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項４】
デングウイルスが弱毒生デングウイルスである、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項５】
デング株がＬＡＶ１（配列番号９）、ＬＡＶ２（配列番号１０）、ベロ−由来血清型１（配列番号１３）、及びベロ−由来血清型２（配列番号１４）からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項６】
黄熱ウイルスがワクチン株ＹＦ１７（配列番号７）である請求項１から５に記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のキメラデングウイルスをコードしている、単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸によってコードされたタンパク質。
【請求項９】
医薬上許容される担体において、請求項１から６のいずれかに記載のキメラデングウイルスを含む、免疫原性組成物。
【請求項１０】
一価の組成物である、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
多価組成物である、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１】
デング非構造ＮＳ５配列が黄熱ウイルスの非構造ＮＳ５配列に置換されている、単離されたキメラデングウイルス。
【請求項２】
デングウイルスの３’ＮＣＲ配列が同じ黄熱ウイルスの３’ＮＣＲ配列に置換されている、特徴とする請求項１に記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項３】
デングウイルスがデング血清型１、デング血清型２、デング血清型３、及びデング血清型４からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項４】
デングウイルスが弱毒生デングウイルスである、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項５】
デング株がＬＡＶ１（配列番号９）、ＬＡＶ２（配列番号１０）、ベロ−由来血清型１（配列番号１３）、及びベロ−由来血清型２（配列番号１４）からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項６】
黄熱ウイルスがワクチン株ＹＦ１７（配列番号７）である請求項１から５に記載の単離されたキメラデングウイルス。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のキメラデングウイルスをコードしている、単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸によってコードされたタンパク質。
【請求項９】
医薬上許容される担体において、請求項１から６のいずれかに記載のキメラデングウイルスを含む、免疫原性組成物。
【請求項１０】
一価の組成物である、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
多価組成物である、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５２３０１９（Ｐ２００９−５２３０１９Ａ）
【公表日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４９８７９（Ｐ２００８−５４９８７９）
【出願日】平成１９年１月１２日（２００７．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５０２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９３４７２
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５９２０５５８２０）サノフィ・パスツール (20)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１２日（２００７．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５０２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９３４７２
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５９２０５５８２０）サノフィ・パスツール (20)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
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