トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット及びその使用
【課題】トウモロコシの雌穂上位葉数増加に関与する遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット、多葉性関連遺伝子座の有無の識別方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法を提供する。
【解決手段】多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセット、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法、及び上記方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法。
【効果】本発明を用いることで、幼苗段階での多葉化系統の選抜が可能となる。
【解決手段】多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセット、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法、及び上記方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法。
【効果】本発明を用いることで、幼苗段階での多葉化系統の選抜が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット、トウモロコシ多葉性自殖系統の育成過程における多葉性個体の幼苗の選抜方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法に関するものであり、更に詳しくは、多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより遺伝子型を判別することにより、幼苗段階での雌穂上位葉数の向上した個体の選抜を可能とする新しい多葉性個体の幼苗選抜方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子実のみならず茎葉部も利用する飼料用トウモロコシにおいては、葉数の増加は、収量増加につながる重要な形質と考えられている。一般に、トウモロコシの最上位の雌穂より上部にある葉の枚数（雌穂上位葉数）は、自殖系統で５〜７枚である。しかしながら、雌穂上位葉数が増加した変異体が見出され、その形質を導入することにより、１０枚前後の雌穂上位葉数をもつ多葉性自殖系統が作出されている。
【０００３】
幾つかの報告から、この形質は、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）と呼ばれる遺伝子座により支配される優性の形質であることが知られていたが、その遺伝子座が、染色体上のどこに座乗するかは明らかにされていない（非特許文献１）。
【０００４】
多葉性の特性は、雄穂出現後で無ければ判別できないが、多葉性関連遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーを活用することが可能となれば、同形質に関し、多葉性個体の幼苗段階での選抜が可能になると考えられ、また、多葉性関連遺伝子のホモ化にも有効と考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈａｖｅｒ，ＤＬ．，３８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｓｏｒｇｈｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：１６１−１８０（１９８３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、トウモロコシ多葉性系統９５７Ｌと非多葉性系統Ｎａ１２を両親とする雑種第２世代（Ｆ２）を解析集団とし、各種ＤＮＡマーカーを用いた連鎖地図の作成及びＱＴＬ解析を行った結果、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）が第３染色体上に座乗することを特定することに成功し、同遺伝子座近傍の増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカーをＳＴＳ化し、Ａ４Ｍ４８を見出した。更に、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）周辺に対して、単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーを追加し、高密度の連鎖地図を作成することにより、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に緊密に連鎖するＳＳＲマーカーを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、トウモロコシの雌穂上位葉数に関連する遺伝子座の解明及び同遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーの検出を可能にするプライマーセットを提供することを目的とするものである。また、本発明は、該プライマーセットを利用して多葉性個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法及び該方法により作出されたトウモロコシ多葉性系統を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できることを特徴とするプライマーセット。
（２）多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できる、前記（１）に記載のプライマーセット。
（３）上記ＤＮＡマーカーが、ＡＦＬＰマーカーのＡ４Ｍ４８である、前記（２）に記載のプライマーセット。
（４）配列表の配列番号１〜６の順方向プライマー及び７〜１２の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成される、前記（１）から（３）のいずれかに記載のプライマーセット。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法。
（６）前記（５）に記載の方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出することを特徴とするトウモロコシ多葉性系統の作出方法。
（７）前記（６）に記載の方法により作出された飼料用トウモロコシであって、雌穂上位葉数を多くしたことで特徴付けられるトウモロコシ多葉性系統。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明では、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できること、上記プライマーセットが、配列表の配列番号１〜６の順方向プライマー及び７〜１２の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成されること、を好ましい実施の態様としている。
【００１１】
また、本発明は、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法の点、及び、上記方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法の点、更に、上記方法により作出されたトウモロコシ多葉性系統の点、に特徴を有するものである。
【００１２】
本発明は、トウモロコシの雌穂上位葉数に関与する遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖し、遺伝子型の判定に利用可能なＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを提供するものである。以下、本発明のプライマーセット及びその新しい利用手法について説明する。
【００１３】
本発明では、多葉性関連遺伝子座に対し、緊密に連鎖するＤＮＡマーカーを複数個見出しているが、本発明が対象とするＤＮＡマーカーは、これらに限定されるものではなく、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に緊密に連鎖するものであれば同様に使用することができる。
【００１４】
本発明では、これらのＤＮＡマーカーを検出できるプライマーペアの構築に成功した。そして、該プライマーペアを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行ったところ、多葉性系統と非多葉性系統では、塩基数の異なったＤＮＡ断片が増幅されることが判明した。このため、増幅断片長を調査することで、同マーカーの座乗する領域が多葉性系統と非多葉性系統のどちらに由来するかが判定され、結果として、調査個体の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無が識別可能となることが分かった。
【００１５】
上記のＤＮＡマーカーの遺伝子型の判定に用いるゲノムＤＮＡの抽出法には、特別な制約は無く、植物の葉片からのＤＮＡ抽出で一般的に用いられるＣＴＡＢ法などを必要に応じて改変し、実施すればよい。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることも適宜可能である。また、ＤＮＡマーカーのＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲの条件は、例えば、後記する実施例に例示されているが、これらに制限されるものではなく、プライマーペアや使用機器に合わせて任意に変更することができる。同様に、電気泳動条件も変更可能であり、また、増幅断片長の差が十分にあれば、アガロースゲルを用いることもできる。
【００１６】
本発明では、ゲノムＤＮＡの抽出手法、ＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲ条件、電気泳動条件等は、任意に設定することができる。本発明によれば、上述のように、本発明の特定のプライマーペアを用いて上記ＤＮＡマーカーを検出し、該ＤＮＡマーカーを指標として多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無を識別し、個体の幼苗を選抜することで、その後代において雌穂上位葉数の多い多葉性系統を作出することが可能となる。
【００１７】
本発明の方法でＰＣＲに供するトウモロコシ系統としては、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）を有する多葉性系統を片親として用いた系統であればいずれの系統でも使用することができる。ＤＮＡマーカーに関しては、好適には、例えば、育種素材として用いる多葉性系統と非多葉性系統間で増幅断片長に明確な差があるものを用いる必要がある。
【００１８】
本発明において、多葉性関連遺伝子座の推定のために用いる解析集団としては、例えば、多葉性系統９５７Ｌと非多葉性系統Ｎａ１２の雑種第２世代（Ｆ２）の集団個体が例示されるが、これらに制限されるものではなく、適宜の多葉性系統と非多葉性系統の雑種第２世代の集団個体が用いられる。各個体の雌穂上位葉数の観測とＤＮＡ抽出を行い、後の解析に用いる。雌穂上位葉数は、最上位の雌穂よりも上位の葉数を計測する。
【００１９】
次に、連鎖地図の作成には、好適には、例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーが用いられる。ＲＦＬＰ解析は、例えば、トウモロコシのゲノム由来及びｃＤＮＡ由来のプローブを用い、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＥＣＬサザンハイブリシステムにより多型分析を行うことで実施することができる。
【００２０】
ＡＦＬＰ解析は、Ｖｏｓらの方法及びＭｙｂｕｒｇらの方法に従って実施することができる。ゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、好適には、例えば、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行い、ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、蛍光色素で標識して使用される。
【００２１】
多型の検出は、例えば、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行うことができる。ＳＳＲ多型解析では、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）に登録、公開されたＳＳＲマーカーを用いることができる。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、フォワードプライマーは、例えば、ＩＲＤ８００蛍光色素で標識することができる。しかし、これらに制限されるものではなく、ＡＦＬＰやＳＳＲでの多型検出には、任意の機器及び蛍光色素を用いることができる。
【００２２】
ＳＳＲ増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通りの条件で実施する。ＰＣＲの条件としては、例えば、１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間、の条件が例示されるが、これに制限されるものではなく、好適な条件を任意に設定することができる。多型の検出は、例えば、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２で実施する。
【００２３】
上記ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ及びＳＳＲの多型解析の結果をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアＭａｐｍａｎａｇｅｒＱＴＸを用いて、連鎖解析及び多葉性に関するＱＴＬ解析を行う。本発明では、第３染色体上に多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）が存在し、更に、ＡＦＬＰマーカーの１つＡ４Ｍ４８がｌｆｙ１に連鎖することが見出された。そこで、Ａ４Ｍ４８マーカーの増幅断片の塩基配列を決定し、同マーカーの多型解析を効率的に行うためのプライマーセットを新たに設計した（ＳＴＳ化）。
【００２４】
このプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、例えば、非多葉性系統Ｎａ１２のゲノムＤＮＡを鋳型とした時、２８２塩基対の断片を増幅するが、多葉性系統９５７ＬのゲノムＤＮＡを鋳型とすると、２８０塩基対の断片を増幅し、増幅断片長の違いから、同マーカーの遺伝子型が判定可能となる。他の非多葉性系統及び多葉性系統の場合についても、増幅断片長の違いから同様に同マーカーの遺伝子型を判定することが可能である。
【００２５】
また、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に、より緊密に連鎖するマーカーを見出すために、例えば、ＭａｉｚｅＧＤＢで公開されたＳＳＲマーカーのうち、Ｂｉｎ番号３．０８〜３．０９に座乗し、本解析集団の親系統であるＮａ１２と９５７Ｌ間で多型に違いが見られるものを選抜する。上述の解析集団に対し、これらのマーカーの多型解析を行い、高密度の連鎖地図を作成する。この連鎖地図を、ＱＴＬ解析ソフトＭａｐＱＴＬで再びＱＴＬ解析を行う。
【００２６】
本発明では、５つのＳＳＲマーカー（ｕｍｃ１５７８、ｕｍｃ１３６１、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１、ｕｍｃ１６４１）が、Ａ４Ｍ４８マーカーと同程度或いはより緊密にｌｆｙ１に連鎖していることが見出された。本発明では、これらのＤＮＡマーカーを検出可能にするためのプライマーペアを構築した。これらのＤＮＡマーカーは、すべて、ＭａｉｚｅＧＤＢにおいて公開されているＳＳＲマーカーであり、同ウェブサイトでこれらのマーカーに関するより詳細な情報や、他のマーカーの情報を得ることができる。
【００２７】
上述のＡ４Ｍ４８マーカー及び５つのＳＳＲマーカーによる選抜効果を検証するために、例えば、３つの集団が用いられる。この場合、例えば、多葉性系統９１４Ｌと３系統の異なる非多葉性自殖系統（例えば、ＴＤ１６、ＫＫ８、ＫＫ１１）とのＦ１を更に各々の非多葉性系統と交配した戻し交配第１世代（ＢＣ１世代）を用いて、各集団９０個体を養成し、雌穂上位葉数の計測とｌｆｙ１近傍マーカーによる遺伝子型調査を行う手法が例示される。
【００２８】
上記手法では、各集団で調査するｌｆｙ１近傍マーカーは、９１４Ｌとそれぞれの非多葉性系統間で増幅断片長に違いがあり、遺伝子型の判定が可能であることを事前に確認したものが用いられる。非多葉性系統を反復親とする戻し交配の場合、遺伝子型としては、多葉性型と非多葉性型のへテロ及び非多葉性型のホモが出現し得る。
【００２９】
Ａ４Ｍ４８マーカーの遺伝子型がヘテロを示したグループと非多葉性のホモを示したグループ間で平均雌穂上位葉数を比較すると、３集団とも、多葉性型と非多葉性型のヘテロの方が、非多葉性型ホモよりも雌穂上位葉数が有意に多いことが示され、Ａ４Ｍ４８マーカーによる選抜効果が見出された。
【００３０】
同様の結果は、調査した４つのＳＳＲマーカーでも見られ、ＤＮＡマーカーによる多葉性個体の選抜が有効であることが分かった。また、調査したマーカーを連鎖解析すると、ｕｍｃ１５７８、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１はｌｆｙ１から１ｃＭ以内に座乗し、Ａ４Ｍ４８は、７ｃＭ、ｕｍｃ１３６１は、７〜８ｃＭの位置に座乗していることが見出された。
【００３１】
本発明は、多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することにより、調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別し、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する手法を確立したことに最大の特徴を有するものである。本発明において、幼苗の選抜、後代の作出に関する方法及び手段については、常法に従って適宜選択、利用することができる。
【００３２】
本発明では、上記ＤＮＡマーカーを検出できる特定のプライマーセットが提供されるが、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できるものであれば同様に使用することができる。本発明では、ＤＮＡマーカーとしては公知のＤＮＡマーカーでも利用可能であるが、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に緊密に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別し、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法は、従来技術からは予期し得ない新規手法である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。
（２）本発明により提供されるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無を識別することができる。
（３）それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代においてトウモロコシ多葉性系統を効率的かつ確実に作出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
次に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
１）解析集団
多葉性関連遺伝子座の推定のため、多葉性系統９５７Ｌと非多葉性系統Ｎａ１２の雑種第２世代（Ｆ２）集団８０個体を養成し、各個体の雌穂上位葉数の観測とＤＮＡ抽出を行い、後の解析に用いた。雌穂上位葉数は、最上位の雌穂よりも上位の葉数を計測した。
【００３６】
２）連鎖地図作成
連鎖地図の作成には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーを用いた。ＲＦＬＰ解析は、米国ミズーリ大学より分譲されたトウモロコシのゲノム由来及びｃＤＮＡ由来のプローブを用い、ＥＣＬサザンハイブリシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により多型分析を行った。
【００３７】
ＡＦＬＰ解析には、Ｖｏｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４（１９９５））及びＭｙｂｕｒｇらの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：３４８−３５７（２００１））に則り行った。ゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行い、ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、ＩＲＤ７００或いはＩＲＤ８００蛍光色素（アロカ社製）で標識されたものを用いた。
【００３８】
多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行った。ＳＳＲ多型解析は、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）に登録、公開されたＳＳＲマーカーを用いた。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、フォワードプライマーは、ＩＲＤ８００蛍光色素で標識した。
【００３９】
ＳＳＲ増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通り、以下の条件で行った。１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間。多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２で行った。
【００４０】
上記ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ及びＳＳＲの計２４７マーカーの多型解析の結果をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアＭａｐｍａｎａｇｅｒＱＴＸ（Ｍａｎｌｙ，ＫＦ，Ｃｕｄｍｏｒｅ，Ｊｒ，ＲＨ，Ｍｅｅｒ，ＪＭ（２００１）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １２： ９３０−９３２）を用いて、連鎖解析及び多葉性に関するＱＴＬ解析を行った。
【００４１】
その結果、第３染色体上に多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）が存在し、更に、ＡＦＬＰマーカーの１つＡ４Ｍ４８がｌｆｙ１に連鎖することが示された。そこで、Ａ４Ｍ４８マーカーの増幅断片の塩基配列を決定し、同マーカーの多型解析を効率的に行うためのプライマーセットを新たに設計した（ＳＴＳ化）。このプライマーセットは、順方向プライマーＬＥＦ：５’−ＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡ−３’（配列番号１）、及び逆方向プライマーＬＥＲ：５’−ＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）からなる。
【００４２】
このプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、非多葉性系統Ｎａ１２のゲノムＤＮＡを鋳型とした時、２８２塩基対の断片を増幅するが、多葉性系統９５７ＬのゲノムＤＮＡを鋳型とすると、２８０塩基対の断片を増幅し、増幅断片長の違いから、同マーカーの遺伝子型が判定可能となる（図１）。
【００４３】
また、ｌｆｙ１に、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、ＭａｉｚｅＧＤＢで公開されたＳＳＲマーカーのうち、Ｂｉｎ番号３．０８〜３．０９に座乗し、本解析集団の親系統であるＮａ１２と９５７Ｌ間で多型に違いが見られるものを選抜した。上述の解析集団に対し、これらのマーカーの多型解析を行い、高密度の連鎖地図を作成した。
【００４４】
この連鎖地図を、ＱＴＬ解析ソフトＭａｐＱＴＬ（Ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｍ．Ｐ． Ｂｏｅｒ，Ｒ．Ｃ． Ｊａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ，２００２．ＭａｐＱＴＬ４．０，Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＱＴＬ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｓ．Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で再びＱＴＬ解析を行った。
【００４５】
その結果、５つのＳＳＲマーカー（ｕｍｃ１５７８、ｕｍｃ１３６１、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１、ｕｍｃ１６４１）が、Ａ４Ｍ４８マーカーと同程度或いはより緊密にｌｆｙ１に連鎖していることが示された（図２）。そこで、本発明では、これらのＤＮＡマーカーを検出可能にするためのプライマーペアを構築した（表１）。これらのＤＮＡマーカーは、すべて、ＭａｉｚｅＧＤＢにおいて公開されているＳＳＲマーカーであり、同ウェブサイトでこれらのマーカーに関するより詳細な情報や、他のマーカーの情報を得ることができる。
【００４６】
【表１】
【００４７】
上述のＡ４Ｍ４８マーカー及び５つのＳＳＲマーカーによる選抜効果を検証するため、３つの集団を用いた。これらは、多葉性系統９１４Ｌと３系統の異なる非多葉性自殖系統（ＴＤ１６、ＫＫ８、ＫＫ１１）とのＦ１を更に各々の非多葉性系統と交配した戻し交配第１世代（ＢＣ１世代）であり、各集団９０個体を養成し、雌穂上位葉数の計測とｌｆｙ１近傍マーカーによる遺伝子型調査を行った。
【００４８】
各集団で調査するｌｆｙ１近傍マーカーは、９１４Ｌとそれぞれの非多葉性系統間で増幅断片長に違いがあり、遺伝子型の判定が可能であることを事前に確認した、Ａ４Ｍ４８、ｕｍｃ１５７８、ｕｍｃ１３６１、ｂｎｌｇ１４９６及びｍｍｃ０００１の５つのマーカーを用いた。非多葉性系統を反復親とする戻し交配の場合、遺伝子型としては、多葉性型と非多葉性型のへテロ及び非多葉性型のホモが出現し得る。
【００４９】
Ａ４Ｍ４８マーカーの遺伝子型がヘテロを示したグループと非多葉性のホモを示したグループ間で平均雌穂上位葉数を比較した。その結果、３集団とも、多葉性型と非多葉性型のヘテロの方が、非多葉性型ホモよりも雌穂上位葉数が有意に多いことが示され、Ａ４Ｍ４８マーカーによる選抜効果が示された（表２）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
同様の結果は、供試した４つのＳＳＲマーカーでも見られ、ＤＮＡマーカーによる多葉性個体の選抜が有効であることが示された。また、調査したマーカーを連鎖解析した結果、ｕｍｃ１５７８、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１は、ｌｆｙ１から１ｃＭ以内に座乗し、Ａ４Ｍ４８は、７ｃＭ、ｕｍｃ１３６１は、７〜８ｃＭの位置に座乗していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上詳述したように、本発明は、トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット及びその使用に係るものであり、本発明により、トウモロコシ第３染色体上の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。本発明により提供されるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無を識別すること、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代においてトウモロコシ多葉性系統を効率的かつ確実に作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、戻し交配第１世代（ＢＣ１）でのＡ４Ｍ４８マーカーによる遺伝子型調査の一例を示すものである。配列番号１及び２をプライマーとするＰＣＲによって増幅された断片の電気泳動図である。図中右、“←多葉性”は多葉性親系統に由来する増幅断片を示し、“←非多葉性”は非多葉性親系統に由来する増幅断片を示す。図上部、“Ｍ”はサイズマーカーを示し、図中左にサイズマーカーの塩基数を示す。両端レーンのサイズマーカー間で、２４個体の遺伝子型調査を行っている。
【図２】図２は、多葉性に関するＱＴＬ解析の結果を示すものである。図中、各マーカーのＬＯＤスコアを“▲”で示しており、本発明で多葉性の選抜に利用可能であることを確認したマーカーを△で示し、図下部にマーカー名を記した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット、トウモロコシ多葉性自殖系統の育成過程における多葉性個体の幼苗の選抜方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法に関するものであり、更に詳しくは、多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより遺伝子型を判別することにより、幼苗段階での雌穂上位葉数の向上した個体の選抜を可能とする新しい多葉性個体の幼苗選抜方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子実のみならず茎葉部も利用する飼料用トウモロコシにおいては、葉数の増加は、収量増加につながる重要な形質と考えられている。一般に、トウモロコシの最上位の雌穂より上部にある葉の枚数（雌穂上位葉数）は、自殖系統で５〜７枚である。しかしながら、雌穂上位葉数が増加した変異体が見出され、その形質を導入することにより、１０枚前後の雌穂上位葉数をもつ多葉性自殖系統が作出されている。
【０００３】
幾つかの報告から、この形質は、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）と呼ばれる遺伝子座により支配される優性の形質であることが知られていたが、その遺伝子座が、染色体上のどこに座乗するかは明らかにされていない（非特許文献１）。
【０００４】
多葉性の特性は、雄穂出現後で無ければ判別できないが、多葉性関連遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーを活用することが可能となれば、同形質に関し、多葉性個体の幼苗段階での選抜が可能になると考えられ、また、多葉性関連遺伝子のホモ化にも有効と考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈａｖｅｒ，ＤＬ．，３８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｓｏｒｇｈｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：１６１−１８０（１９８３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、トウモロコシ多葉性系統９５７Ｌと非多葉性系統Ｎａ１２を両親とする雑種第２世代（Ｆ２）を解析集団とし、各種ＤＮＡマーカーを用いた連鎖地図の作成及びＱＴＬ解析を行った結果、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）が第３染色体上に座乗することを特定することに成功し、同遺伝子座近傍の増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカーをＳＴＳ化し、Ａ４Ｍ４８を見出した。更に、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）周辺に対して、単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーを追加し、高密度の連鎖地図を作成することにより、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に緊密に連鎖するＳＳＲマーカーを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、トウモロコシの雌穂上位葉数に関連する遺伝子座の解明及び同遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーの検出を可能にするプライマーセットを提供することを目的とするものである。また、本発明は、該プライマーセットを利用して多葉性個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法及び該方法により作出されたトウモロコシ多葉性系統を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できることを特徴とするプライマーセット。
（２）多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できる、前記（１）に記載のプライマーセット。
（３）上記ＤＮＡマーカーが、ＡＦＬＰマーカーのＡ４Ｍ４８である、前記（２）に記載のプライマーセット。
（４）配列表の配列番号１〜６の順方向プライマー及び７〜１２の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成される、前記（１）から（３）のいずれかに記載のプライマーセット。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法。
（６）前記（５）に記載の方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出することを特徴とするトウモロコシ多葉性系統の作出方法。
（７）前記（６）に記載の方法により作出された飼料用トウモロコシであって、雌穂上位葉数を多くしたことで特徴付けられるトウモロコシ多葉性系統。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明では、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できること、上記プライマーセットが、配列表の配列番号１〜６の順方向プライマー及び７〜１２の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成されること、を好ましい実施の態様としている。
【００１１】
また、本発明は、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法の点、及び、上記方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法の点、更に、上記方法により作出されたトウモロコシ多葉性系統の点、に特徴を有するものである。
【００１２】
本発明は、トウモロコシの雌穂上位葉数に関与する遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖し、遺伝子型の判定に利用可能なＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを提供するものである。以下、本発明のプライマーセット及びその新しい利用手法について説明する。
【００１３】
本発明では、多葉性関連遺伝子座に対し、緊密に連鎖するＤＮＡマーカーを複数個見出しているが、本発明が対象とするＤＮＡマーカーは、これらに限定されるものではなく、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に緊密に連鎖するものであれば同様に使用することができる。
【００１４】
本発明では、これらのＤＮＡマーカーを検出できるプライマーペアの構築に成功した。そして、該プライマーペアを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行ったところ、多葉性系統と非多葉性系統では、塩基数の異なったＤＮＡ断片が増幅されることが判明した。このため、増幅断片長を調査することで、同マーカーの座乗する領域が多葉性系統と非多葉性系統のどちらに由来するかが判定され、結果として、調査個体の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無が識別可能となることが分かった。
【００１５】
上記のＤＮＡマーカーの遺伝子型の判定に用いるゲノムＤＮＡの抽出法には、特別な制約は無く、植物の葉片からのＤＮＡ抽出で一般的に用いられるＣＴＡＢ法などを必要に応じて改変し、実施すればよい。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることも適宜可能である。また、ＤＮＡマーカーのＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲの条件は、例えば、後記する実施例に例示されているが、これらに制限されるものではなく、プライマーペアや使用機器に合わせて任意に変更することができる。同様に、電気泳動条件も変更可能であり、また、増幅断片長の差が十分にあれば、アガロースゲルを用いることもできる。
【００１６】
本発明では、ゲノムＤＮＡの抽出手法、ＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲ条件、電気泳動条件等は、任意に設定することができる。本発明によれば、上述のように、本発明の特定のプライマーペアを用いて上記ＤＮＡマーカーを検出し、該ＤＮＡマーカーを指標として多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無を識別し、個体の幼苗を選抜することで、その後代において雌穂上位葉数の多い多葉性系統を作出することが可能となる。
【００１７】
本発明の方法でＰＣＲに供するトウモロコシ系統としては、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）を有する多葉性系統を片親として用いた系統であればいずれの系統でも使用することができる。ＤＮＡマーカーに関しては、好適には、例えば、育種素材として用いる多葉性系統と非多葉性系統間で増幅断片長に明確な差があるものを用いる必要がある。
【００１８】
本発明において、多葉性関連遺伝子座の推定のために用いる解析集団としては、例えば、多葉性系統９５７Ｌと非多葉性系統Ｎａ１２の雑種第２世代（Ｆ２）の集団個体が例示されるが、これらに制限されるものではなく、適宜の多葉性系統と非多葉性系統の雑種第２世代の集団個体が用いられる。各個体の雌穂上位葉数の観測とＤＮＡ抽出を行い、後の解析に用いる。雌穂上位葉数は、最上位の雌穂よりも上位の葉数を計測する。
【００１９】
次に、連鎖地図の作成には、好適には、例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーが用いられる。ＲＦＬＰ解析は、例えば、トウモロコシのゲノム由来及びｃＤＮＡ由来のプローブを用い、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＥＣＬサザンハイブリシステムにより多型分析を行うことで実施することができる。
【００２０】
ＡＦＬＰ解析は、Ｖｏｓらの方法及びＭｙｂｕｒｇらの方法に従って実施することができる。ゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、好適には、例えば、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行い、ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、蛍光色素で標識して使用される。
【００２１】
多型の検出は、例えば、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行うことができる。ＳＳＲ多型解析では、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）に登録、公開されたＳＳＲマーカーを用いることができる。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、フォワードプライマーは、例えば、ＩＲＤ８００蛍光色素で標識することができる。しかし、これらに制限されるものではなく、ＡＦＬＰやＳＳＲでの多型検出には、任意の機器及び蛍光色素を用いることができる。
【００２２】
ＳＳＲ増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通りの条件で実施する。ＰＣＲの条件としては、例えば、１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間、の条件が例示されるが、これに制限されるものではなく、好適な条件を任意に設定することができる。多型の検出は、例えば、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２で実施する。
【００２３】
上記ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ及びＳＳＲの多型解析の結果をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアＭａｐｍａｎａｇｅｒＱＴＸを用いて、連鎖解析及び多葉性に関するＱＴＬ解析を行う。本発明では、第３染色体上に多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）が存在し、更に、ＡＦＬＰマーカーの１つＡ４Ｍ４８がｌｆｙ１に連鎖することが見出された。そこで、Ａ４Ｍ４８マーカーの増幅断片の塩基配列を決定し、同マーカーの多型解析を効率的に行うためのプライマーセットを新たに設計した（ＳＴＳ化）。
【００２４】
このプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、例えば、非多葉性系統Ｎａ１２のゲノムＤＮＡを鋳型とした時、２８２塩基対の断片を増幅するが、多葉性系統９５７ＬのゲノムＤＮＡを鋳型とすると、２８０塩基対の断片を増幅し、増幅断片長の違いから、同マーカーの遺伝子型が判定可能となる。他の非多葉性系統及び多葉性系統の場合についても、増幅断片長の違いから同様に同マーカーの遺伝子型を判定することが可能である。
【００２５】
また、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に、より緊密に連鎖するマーカーを見出すために、例えば、ＭａｉｚｅＧＤＢで公開されたＳＳＲマーカーのうち、Ｂｉｎ番号３．０８〜３．０９に座乗し、本解析集団の親系統であるＮａ１２と９５７Ｌ間で多型に違いが見られるものを選抜する。上述の解析集団に対し、これらのマーカーの多型解析を行い、高密度の連鎖地図を作成する。この連鎖地図を、ＱＴＬ解析ソフトＭａｐＱＴＬで再びＱＴＬ解析を行う。
【００２６】
本発明では、５つのＳＳＲマーカー（ｕｍｃ１５７８、ｕｍｃ１３６１、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１、ｕｍｃ１６４１）が、Ａ４Ｍ４８マーカーと同程度或いはより緊密にｌｆｙ１に連鎖していることが見出された。本発明では、これらのＤＮＡマーカーを検出可能にするためのプライマーペアを構築した。これらのＤＮＡマーカーは、すべて、ＭａｉｚｅＧＤＢにおいて公開されているＳＳＲマーカーであり、同ウェブサイトでこれらのマーカーに関するより詳細な情報や、他のマーカーの情報を得ることができる。
【００２７】
上述のＡ４Ｍ４８マーカー及び５つのＳＳＲマーカーによる選抜効果を検証するために、例えば、３つの集団が用いられる。この場合、例えば、多葉性系統９１４Ｌと３系統の異なる非多葉性自殖系統（例えば、ＴＤ１６、ＫＫ８、ＫＫ１１）とのＦ１を更に各々の非多葉性系統と交配した戻し交配第１世代（ＢＣ１世代）を用いて、各集団９０個体を養成し、雌穂上位葉数の計測とｌｆｙ１近傍マーカーによる遺伝子型調査を行う手法が例示される。
【００２８】
上記手法では、各集団で調査するｌｆｙ１近傍マーカーは、９１４Ｌとそれぞれの非多葉性系統間で増幅断片長に違いがあり、遺伝子型の判定が可能であることを事前に確認したものが用いられる。非多葉性系統を反復親とする戻し交配の場合、遺伝子型としては、多葉性型と非多葉性型のへテロ及び非多葉性型のホモが出現し得る。
【００２９】
Ａ４Ｍ４８マーカーの遺伝子型がヘテロを示したグループと非多葉性のホモを示したグループ間で平均雌穂上位葉数を比較すると、３集団とも、多葉性型と非多葉性型のヘテロの方が、非多葉性型ホモよりも雌穂上位葉数が有意に多いことが示され、Ａ４Ｍ４８マーカーによる選抜効果が見出された。
【００３０】
同様の結果は、調査した４つのＳＳＲマーカーでも見られ、ＤＮＡマーカーによる多葉性個体の選抜が有効であることが分かった。また、調査したマーカーを連鎖解析すると、ｕｍｃ１５７８、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１はｌｆｙ１から１ｃＭ以内に座乗し、Ａ４Ｍ４８は、７ｃＭ、ｕｍｃ１３６１は、７〜８ｃＭの位置に座乗していることが見出された。
【００３１】
本発明は、多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することにより、調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別し、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する手法を確立したことに最大の特徴を有するものである。本発明において、幼苗の選抜、後代の作出に関する方法及び手段については、常法に従って適宜選択、利用することができる。
【００３２】
本発明では、上記ＤＮＡマーカーを検出できる特定のプライマーセットが提供されるが、多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できるものであれば同様に使用することができる。本発明では、ＤＮＡマーカーとしては公知のＤＮＡマーカーでも利用可能であるが、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に緊密に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別し、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法は、従来技術からは予期し得ない新規手法である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。
（２）本発明により提供されるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無を識別することができる。
（３）それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代においてトウモロコシ多葉性系統を効率的かつ確実に作出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
次に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
１）解析集団
多葉性関連遺伝子座の推定のため、多葉性系統９５７Ｌと非多葉性系統Ｎａ１２の雑種第２世代（Ｆ２）集団８０個体を養成し、各個体の雌穂上位葉数の観測とＤＮＡ抽出を行い、後の解析に用いた。雌穂上位葉数は、最上位の雌穂よりも上位の葉数を計測した。
【００３６】
２）連鎖地図作成
連鎖地図の作成には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーを用いた。ＲＦＬＰ解析は、米国ミズーリ大学より分譲されたトウモロコシのゲノム由来及びｃＤＮＡ由来のプローブを用い、ＥＣＬサザンハイブリシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により多型分析を行った。
【００３７】
ＡＦＬＰ解析には、Ｖｏｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４（１９９５））及びＭｙｂｕｒｇらの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：３４８−３５７（２００１））に則り行った。ゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行い、ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、ＩＲＤ７００或いはＩＲＤ８００蛍光色素（アロカ社製）で標識されたものを用いた。
【００３８】
多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行った。ＳＳＲ多型解析は、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）に登録、公開されたＳＳＲマーカーを用いた。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、フォワードプライマーは、ＩＲＤ８００蛍光色素で標識した。
【００３９】
ＳＳＲ増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通り、以下の条件で行った。１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間。多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２で行った。
【００４０】
上記ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ及びＳＳＲの計２４７マーカーの多型解析の結果をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアＭａｐｍａｎａｇｅｒＱＴＸ（Ｍａｎｌｙ，ＫＦ，Ｃｕｄｍｏｒｅ，Ｊｒ，ＲＨ，Ｍｅｅｒ，ＪＭ（２００１）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １２： ９３０−９３２）を用いて、連鎖解析及び多葉性に関するＱＴＬ解析を行った。
【００４１】
その結果、第３染色体上に多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）が存在し、更に、ＡＦＬＰマーカーの１つＡ４Ｍ４８がｌｆｙ１に連鎖することが示された。そこで、Ａ４Ｍ４８マーカーの増幅断片の塩基配列を決定し、同マーカーの多型解析を効率的に行うためのプライマーセットを新たに設計した（ＳＴＳ化）。このプライマーセットは、順方向プライマーＬＥＦ：５’−ＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡ−３’（配列番号１）、及び逆方向プライマーＬＥＲ：５’−ＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）からなる。
【００４２】
このプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、非多葉性系統Ｎａ１２のゲノムＤＮＡを鋳型とした時、２８２塩基対の断片を増幅するが、多葉性系統９５７ＬのゲノムＤＮＡを鋳型とすると、２８０塩基対の断片を増幅し、増幅断片長の違いから、同マーカーの遺伝子型が判定可能となる（図１）。
【００４３】
また、ｌｆｙ１に、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、ＭａｉｚｅＧＤＢで公開されたＳＳＲマーカーのうち、Ｂｉｎ番号３．０８〜３．０９に座乗し、本解析集団の親系統であるＮａ１２と９５７Ｌ間で多型に違いが見られるものを選抜した。上述の解析集団に対し、これらのマーカーの多型解析を行い、高密度の連鎖地図を作成した。
【００４４】
この連鎖地図を、ＱＴＬ解析ソフトＭａｐＱＴＬ（Ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｍ．Ｐ． Ｂｏｅｒ，Ｒ．Ｃ． Ｊａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ，２００２．ＭａｐＱＴＬ４．０，Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＱＴＬ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｓ．Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で再びＱＴＬ解析を行った。
【００４５】
その結果、５つのＳＳＲマーカー（ｕｍｃ１５７８、ｕｍｃ１３６１、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１、ｕｍｃ１６４１）が、Ａ４Ｍ４８マーカーと同程度或いはより緊密にｌｆｙ１に連鎖していることが示された（図２）。そこで、本発明では、これらのＤＮＡマーカーを検出可能にするためのプライマーペアを構築した（表１）。これらのＤＮＡマーカーは、すべて、ＭａｉｚｅＧＤＢにおいて公開されているＳＳＲマーカーであり、同ウェブサイトでこれらのマーカーに関するより詳細な情報や、他のマーカーの情報を得ることができる。
【００４６】
【表１】
【００４７】
上述のＡ４Ｍ４８マーカー及び５つのＳＳＲマーカーによる選抜効果を検証するため、３つの集団を用いた。これらは、多葉性系統９１４Ｌと３系統の異なる非多葉性自殖系統（ＴＤ１６、ＫＫ８、ＫＫ１１）とのＦ１を更に各々の非多葉性系統と交配した戻し交配第１世代（ＢＣ１世代）であり、各集団９０個体を養成し、雌穂上位葉数の計測とｌｆｙ１近傍マーカーによる遺伝子型調査を行った。
【００４８】
各集団で調査するｌｆｙ１近傍マーカーは、９１４Ｌとそれぞれの非多葉性系統間で増幅断片長に違いがあり、遺伝子型の判定が可能であることを事前に確認した、Ａ４Ｍ４８、ｕｍｃ１５７８、ｕｍｃ１３６１、ｂｎｌｇ１４９６及びｍｍｃ０００１の５つのマーカーを用いた。非多葉性系統を反復親とする戻し交配の場合、遺伝子型としては、多葉性型と非多葉性型のへテロ及び非多葉性型のホモが出現し得る。
【００４９】
Ａ４Ｍ４８マーカーの遺伝子型がヘテロを示したグループと非多葉性のホモを示したグループ間で平均雌穂上位葉数を比較した。その結果、３集団とも、多葉性型と非多葉性型のヘテロの方が、非多葉性型ホモよりも雌穂上位葉数が有意に多いことが示され、Ａ４Ｍ４８マーカーによる選抜効果が示された（表２）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
同様の結果は、供試した４つのＳＳＲマーカーでも見られ、ＤＮＡマーカーによる多葉性個体の選抜が有効であることが示された。また、調査したマーカーを連鎖解析した結果、ｕｍｃ１５７８、ｂｎｌｇ１４９６、ｍｍｃ０００１は、ｌｆｙ１から１ｃＭ以内に座乗し、Ａ４Ｍ４８は、７ｃＭ、ｕｍｃ１３６１は、７〜８ｃＭの位置に座乗していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上詳述したように、本発明は、トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット及びその使用に係るものであり、本発明により、トウモロコシ第３染色体上の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。本発明により提供されるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）の有無を識別すること、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代においてトウモロコシ多葉性系統を効率的かつ確実に作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、戻し交配第１世代（ＢＣ１）でのＡ４Ｍ４８マーカーによる遺伝子型調査の一例を示すものである。配列番号１及び２をプライマーとするＰＣＲによって増幅された断片の電気泳動図である。図中右、“←多葉性”は多葉性親系統に由来する増幅断片を示し、“←非多葉性”は非多葉性親系統に由来する増幅断片を示す。図上部、“Ｍ”はサイズマーカーを示し、図中左にサイズマーカーの塩基数を示す。両端レーンのサイズマーカー間で、２４個体の遺伝子型調査を行っている。
【図２】図２は、多葉性に関するＱＴＬ解析の結果を示すものである。図中、各マーカーのＬＯＤスコアを“▲”で示しており、本発明で多葉性の選抜に利用可能であることを確認したマーカーを△で示し、図下部にマーカー名を記した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できる、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
上記ＤＮＡマーカーが、ＡＦＬＰマーカーのＡ４Ｍ４８である、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列表の配列番号１〜６の順方向プライマー及び７〜１２の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成される、請求項１から３のいずれかに記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出することを特徴とするトウモロコシ多葉性系統の作出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により作出された飼料用トウモロコシであって、雌穂上位葉数を多くしたことで特徴付けられるトウモロコシ多葉性系統。
【請求項１】
多葉性関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第３染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
多葉性関連遺伝子座（ｌｆｙ１）から１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出できる、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
上記ＤＮＡマーカーが、ＡＦＬＰマーカーのＡ４Ｍ４８である、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列表の配列番号１〜６の順方向プライマー及び７〜１２の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成される、請求項１から３のいずれかに記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出することを特徴とするトウモロコシ多葉性系統の作出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により作出された飼料用トウモロコシであって、雌穂上位葉数を多くしたことで特徴付けられるトウモロコシ多葉性系統。
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２００８−２１２００５（Ｐ２００８−２１２００５Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６７７（Ｐ２００７−５０６７７）
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
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