トランスサイレチンアミロイドーシスのゲニステインによる阻害
ゲニステインは、優れたトランスサイレチンアミロイドーシス阻害剤であり、血漿中で優れた結合選択性を示す。トランスサイレチンアミロイドーシスの患者を、病状の改善のために、ゲニステイン含有治療薬で治療することが、開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスの治療に関する。更に詳細には、本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスの治療として、ゲニステインを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
老人性の全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）は、野生型（ＷＴ）トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドフィブリルの心臓及び末梢神経への沈着に特徴づけられる（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０，８７，２８４３〜２８４５；ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｒ．Ｅ．；３ｒｄ；Ｋａｓｐｅｒ，Ｅ．Ｋ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９８，２１，５４７〜５５２）。１００以上の種々のＴＴＲ変異体のうちの１つの変異体による沈着は、家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）として知られる疾病群に関与している（Ｓａｒａｉｖａ，Ｍ．Ｊ．；Ｃｏｓｔａ，Ｐ．Ｐ．；Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８５，７６，２１７１〜２１７７；Ｐｌａｎｔｅ−Ｂｏｒｄｅｎｅｕｖｅ，Ｖ．；Ｓａｉｄ，Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０００，１３，５６９〜５７３）。Ｖ３０Ｍ突然変異は、最も一般的なＦＡＰ変異体であり、日本、ポルトガル、及びスェーデンの患者にみられる。約１００万人のアフリカ系アメリカ人は、高い浸透度を有する家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）変異体、Ｖ１２２Ｉ ＴＴＲ、によるうっ血性心不全の重大な危険性を有している（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７，３３６，４６６〜４７３）。更に、ＴＴＲ変異体の亜集団は、ＣＮＳ選択性アミロイドーシス（ＣＮＳＡ）を惹き起こすことが、近年になって、判明した。
【０００３】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、ホロ（ｈｏｌｏ）−レチノール結合タンパク質及びチロキシン（Ｔ４）を血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中で輸送する機能を持つ（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．；Ｒａｓｋ，Ｌ．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５，２５０，８５５４〜８５６３；Ｍｏｎａｃｏ，Ｈ．Ｌ．；Ｒｉｚｚｉ，Ｍ．；Ｃｏｄａ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６８，１０３９〜１０４１）。ＴＴＲは、ダイマー−ダイマーインターフェイスに位置する、２つの同一漏斗形状のチロキシン結合部位を有する。これらのチロキシン結合部位は、結晶の２双軸（Ｚ−軸）に垂直に配向した２本のＣ2軸により相互交換され得る（図２）（Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００２，１，２６７〜２７５）。通常は、血漿及びＣＳＦ中のＴＴＲの１％未満が、Ｔ４と結合し、これらの部位を他の小さな疎水性分子の標的とさせ、アミロイド形成を防ぐ（Ｂａｒｔａｌｅｎａ，Ｌ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１９９３，１３，５８３〜５９８）。
【０００４】
チロキシン部位に結合することによりＴＴＲフィブリル形成を阻害できる数種の化合物が報告されている（Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５〜３７４；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９〜１３４７；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９〜１４０１；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，近刊；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２〜３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１〜３３２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８，９５，１２９５６〜１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８〜２１９２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，１５，１０７５〜１０７８；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３，４２，２７５８〜２７６１；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｒ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，近刊）。理想的に言えば、良好な阻害剤は、高い親和性で結合し、ゆっくりと解離し、かつ血液中のＴＴＲに高い結合選択性を示すものである。これらの分子は、解離遷移状態よりも天然状態（ｎａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）への結合を好むので、そのことにより仲介された動的安定化を通して、その影響を及ぼす（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３〜７１６）。天然状態の動的安定化は、化合物ヘテロ接合体中で働くのと同じメカニズムであり、そのメカニズムでは、主にＶ３０Ｍサブユニットから構成されるテトラマーへＴ１１９Ｍトランス−サプレッサーサブユニットを組み込むことで、解離活性化バリアを上昇させ、その結果、疾病を改善する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３〜７１６；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｆ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９３，２４５９〜２４６２）。同様に、小分子によるＴＴＲの動的安定化は、ＴＴＲアミロイドーシスを改善することができる。
【０００５】
ゲニステイン（１）は、種々の大豆食品中に１．９〜２２９μｇ／ｇの濃度でみられるイソフラボンである。さらにゲニステインの７１〜９６８μｇ／ｇは、そのＯ−グルコシド複合体、ゲニスチン（２）として存在し、インビボで腸内バクテリアにより迅速に脱グリコシル化される。毒性研究から、このイソフラボンは、相対的に高い濃度で使用しても、健康に悪影響を引き起こすようには見えないことが示されている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００２，７６，５５３〜５５９；Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ＴＴＲに結合し、ＴＴＲアミロイドーシスの治療に効果的であり、かつヒトに対し安全な統計結果を示す、非常に効能のある天然産物を提供することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一定の割合でのテトラマー解離及び部分モノマー変性を含む、トランスサイレチン（ＴＴＲ）のミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）は、３つのアミロイド疾病である、老人性の全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）に関与する、ＴＴＲのアミロイドへのミスアセンブリー（ｍｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）及び他の異常な四次構造を生じるのに十分である。大豆中の主要なイソフラボン天然産物である、ゲニステインは、非占有のＴＴＲ甲状腺ホルモン結合部位の１つ又は両方に結合することが本明細書中に開示される。この結合は、本明細書中で、天然状態のテトラマーを、解離遷移状態より一層安定化させる効果を有し、その結果、テトラマーの解離のための化学反応バリアを上げることが開示されている。ゲニステインは、トランスサイレチンテトラマーの解離及びアミロイド形成に対する優れた阻害剤であり、酸媒介フィブリル形成を、ＴＴＲのみの場合に示されるものの１０％未満まで減じることが本明細書中に開示されている。ゲニステインは、又、最も一般的なＦＡＰ及びＦＡＣ突然変異であるＶ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉによるアミロイド形成を阻害することが本明細書中に開示されている。ゲニステインは、他の全ての血漿蛋白質ではなく、血漿中ＴＴＲに、高度に選択的に結合することが本明細書中に開示される。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）から、ゲニステインが、負の協同性（Ｋd1＝４０ｎＭ、Ｋd2＝１．４μＭ）でＴＴＲに結合することが示される。ゲニステインは、その公知の経口バイオアベイラビリティ及び安全性データのより、トランスサイレチンアミロイドーシスの奇病を治療する栄養補助食品として特に有用である。
【０００８】
本発明の１態様は、トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者の治療方法を対象とする。この治療法は、患者に、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有する組成物を投与するステップを含む。ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％まで阻害するのに十分な量投与される。ゲニステインは、式：
【化１】
により表わされる構造を有する。好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、老人性の全身性アミロイドーシス又は家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである。更に詳細には、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーは、Ｖ３０Ｍ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、家族性アミロイドーシス心筋症である。更に詳細には、家族性アミロイドーシス心筋症は、Ｖ１２２Ｉ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、３．６μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、７．２μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、投与は、定期的に繰り返される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、患者に経口投与される。
【０００９】
本発明の別の態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者を治療する医薬の製造へゲニステインを使用する。この医薬は、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有する。ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％まで阻害するのに十分な量投与される。ゲニステインは、式：
【化２】
により表わされる構造を有する。好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、老人性の全身性アミロイドーシス又は家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである。更に詳細には、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーは、Ｖ３０Ｍ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、家族性アミロイドーシス心筋症である。更に詳細には、家族性アミロイドーシス心筋症は、Ｖ１２２Ｉ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、３．６μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、７．２μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、投与は、定期的に繰り返される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、患者に経口投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
天然産ゲニステイン及び構造的に関連する数個の天然類似体について、ＴＴＲアミロイドフィブリル形成を阻害するその能力に関しインビトロでテストした。ゲニステインは、ＷＴ ＴＴＲアミロイド形成の優れた阻害剤のように見える。その上、この化合物は、他の可能性あるすべてのタンパク質標的よりも、血漿中のＴＴＲへ高度に選択的に結合する。ゲニステインは、変異体；Ｖ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉ、に関係する最も一般的な疾病のアミロイド形成も阻害する。大豆製品の摂取を増加させるか又は大豆に基づくサプリメントをその食事に付け加えるだけで、一部の患者が利益を得ることができるので、そのような栄養補助食品を使用する利点は多い。ゲニステインの豊富な毒性情報から、高濃度での摂取ですら、ヒトが消費しても安全であることが示唆されている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００２，７６，５５３〜５５９；Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７）。
【００１１】
（考察）
ゲニステインは、優れたトランスサイレチンアミロイド形成阻害剤であることが、本明細書中に開示される。この栄養補助食品は、野生型、Ｖ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉのアミロイド形成を実質的に阻害する（図３Ａ〜Ｃ）。この化合物（３．６μＭ又は７．２μＭ）は、非添加ＴＴＲが示す値の１０％未満（３．６μＭ ＴＴＲ）までフィブリル形成を減じる。更に、ゲニステインは、尿素中のＷＴ及びＶ１２２Ｉ ＴＴＲテトラマーの解離速度を劇的に緩慢にし（図４）、小分子が媒介するテトラマーの動的安定化を示す。これらの実験は、ゲニステインが効果的であるはずの生理的条件をシミュレートしそうもない尿素溶液を使用しているので、Ｖ３０Ｍに対して見られたより小さな効果は、ゲニステインが、Ｖ３０Ｍ疾病の治療において劣るものであるということを必ずしも意味せず、むしろこれらは動的安定性を示している。
【００１２】
ＴＴＲテトラマーの動的安定化は、解離遷移状態よりネィティブ状態を選択する安定化の結果生じる。Ｔ１１９Ｍサブユニットの包含による、Ｖ３０Ｍ含有ＴＴＲテトラマーの動的安定化は、ＴＴＲアミロイドーシスを改善するのに十分であり、このことは、ＴＴＲのゲニステイン媒介動的安定化が、ヒトの疾病を防止するのに有効であることを示唆する。アミロイド形成経路に関わる何れの種が、毒性を誘発するのか不明のままであるので、動的安定化は、最も保守的な戦略である。
【００１３】
等温滴定熱量測定法を使用して、ｐＨ８．０（２５℃）でのＷＴ ＴＴＲについてゲニステインの結合定数を測定した。空所の引算及び得られたサーモグラムの積分から、結合等温線が得られ、これは、負の協同性（Ｋd1＝４０ｎＭ、Ｋd2＝１４００ｎＭ）を備えた２つの連続した相互作用結合部位又は２つの同一の非相互作用部位（Ｋd1＝Ｋd2＝８４５ｎＭ）のモデルに等しくぴったりとフィットする。等濃度のゲニステインとＴＴＲで強い凝集阻害が観察されるので、恐らく、ゲニステインは、負の協同性（Ｋd1＝４０ｎＭ、Ｋd2＝１４００ｎＭ）で結合し、主にＴＴＲ・Ｉを溶解して提供するようである。非リガンド型ＴＴＲが主な種なので、Ｋd1＝Ｋd2＝８４５ｎＭのばあいには、低濃度での効力は期待されないだろう。
【００１４】
ゲニステインの５位と７位にあるヒドロキシル基は、凝集阻害について重要であるように思える。５−ＯＨが欠けるダイゼインは、ＴＴＲ濃度の２倍濃度（７．２μＭ）で投与の場合、凝集阻害能力がほぼ４倍減少する。７位のヒドロキシル基をグルコース部分でマスクすると（ゲニスチン）、活性の劇的な損失をもたらし、非常に高い阻害剤濃度でも４１％のフィブリル形成が残る（ゲニスチン３６μＭ、タンパク質３．６μＭ）。ｐ−ヒドロキシフェニル置換基の位置も重要のようである。この構造をイソフラボン（ゲニステイン）の２位から１位に移動させると（アピゲニン）、ｐＨ４．４でＷＴ ＴＴＲ凝集の阻害は、２倍減少する結果となる。
【００１５】
ジフルニサルは、トランスサイレチンアミロイド形成の阻害において、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として効果があることが、従来報告されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５〜５５２）。この化合物は、正常のヒト被験者経口投与研究（Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｋｅｌｌｙ 未公開結果）で有望であるが、腎臓病及び腎不全の非常に高い発病率に悩まされるアフリカ系アメリカ人では、腎血流障害のために、Ｖ１２２ＩＦＡＣの治療に関しては問題がある（Ｕ．Ｓ．Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。ＮＳＡＩＤによる治療は、腎臓への血流を保持する助けとなるプロスタグランジンの合成を阻害するので、この危険性を悪化させる可能性がある。ゲニステインは、腎機能にいかなる悪影響も有することを示さず、ジフルニサルより活性かつ選択性であるので、より良好なＶ１２２Ｉアミロイドーシス阻害剤であり得る。
【００１６】
重要であり克服不可能な課題ではないが、体重１ｋｇ当たり１６ｍｇの用量で約０．１〜８μＭのゲニステインのインビボ血漿濃度では、ゲニステイン及びゲニスチンの経口バイオアベイラビリティが少ないことである（Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７；Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００１，１３１，１３６２Ｓ〜１３７５Ｓ）。Ｃａｃｏ−２細胞及びラット灌流腸管モデルを使用するＬｉｕ及びＨｕの研究（Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｈｕ，Ｍ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２００２，３０，３７０〜３７７）で、ゲニステインは、腸に効果的に吸収されるが、広範な初回通過代謝は、主な代謝産物として７−ＯＨ−グルクロン酸を形成することが示される。ゲニスチンの浸透性は、その対応するアグリコンよりもほぼ５倍低い。ゲニステインの血漿中半減期は、男性では３．２時間、女性では３．８時間であることが測定された。これらの興味ある薬物動態学から、緩慢な放出処方が有用であることが示唆される（Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７）。
【００１７】
大豆製品、特にゲニステイン、は、抗腫瘍作用を有することが報告されており、これは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む多数のタンパク質の遺伝子発現修飾に至るタンパク質チロシンキナーゼ経路の阻害による。これらの発現変化が、細胞成長及び増殖、血管形成、並びに細胞サイクルをＧ２／Ｍで阻むことが示された（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，Ｍ．Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００４，５４６，１２１〜１６５）。ゲニステインのチロシンキナーゼとの相互作用及びこれらの多数の生物学的経路への影響は、長期治療に対する懸念を引き起こす。しかしこれらの懸念は、大豆の多い食事は多数のプラスの効果を有することを示唆する疫学データ及びゲニステインの毒性を評価する多数の短期高投与量研究の双方により和らげられる。
【実施例】
【００１８】
（材料と方法）
ゲニステイン、ダイゼイン及びアピゲニンは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ゲニスチンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、そのまま使用した。これらの化合物の純度は、ＨＰＬＣ及び高分解能質量分析法により証明した。
【００１９】
（タンパク質発現及び精製）
ＷＴ、Ｖ１２２Ｉ及びＶ３０Ｍ ＴＴＲは、これまでに記されているようにＥ．ｃｏｌｉから発現及び精製した（Ｆｏｓｓ，Ｔ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，近刊）。
【００２０】
（停滞（ｓｔａｇｎａｎｔ）トランスサイレチン凝集アッセイ）
停滞凝集アッセイは、これまでに記されているように行った（Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１３５６０〜１３５７３）。ＴＴＲ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中の７．６μＭ（０．４ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ７．０）のサンプル０．４９５ｍＬを、ＤＭＳＯ中のイソフラボン又はフラボン阻害剤（０．７６ｍＭ又は１．４４ｍＭ）５μＬと共にインキュベートした。３０分後、サンプルを、１００ｍＭのＫＣｌと、１ｍＭのＥＤＴＡとを含有する２００ｍＭ酢酸緩衝液（ＷＴ及びＶ１２２Ｉに関してはｐＨ４．２、最終ｐＨ４．４、Ｖ３０Ｍに関してはｐＨ４．８、最終ｐＨ５．０）０．５ｍＬで希釈した。サンプルを短時間ボルテックスした後、更に３７℃で、７２時間、撹拌せずにインキュベートした。濁度測定を、ＨＰ８４５３ＵＶ−可視分光計により、３５０ｎｍと４００ｎｍで行って、凝集の程度を調べた。測定の直前に、シングルタイムポイントのサンプル（ｓｉｎｇｌｅ−ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ）（７２時間）をボルテックスした。
【００２１】
（円二色性によるＴＴＲ尿素変性カーブ）
ＴＴＲ（４００μＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ；４．５μＭテトラマー）を、４．５又は９．０μＭの濃度のゲニステインと共に２５℃で１８時間プレインキュベートした。１００ｍＭのＫＣｌと、１ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのＤＴＴとを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の尿素（１０Ｍ、６００μＬ）を、最初の測定の直前に、サンプルに添加した（総容積１．０ｍＬ、尿素６．０Ｍ、ＴＴＲ（１．８μＭテトラマー）最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）。０．５ｎｍ毎にサンプリングしながら、２２０〜２１４ｎｍの波長スキャンを使用し、円二色性スペクトルを、１２０時間（２５℃）まで記録した。２１８〜２１５のシグナルを平均し、プロットして、各時点で解離し、アンフォールド（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）されたＴＴＲテトラマーの画分を決定した。
【００２２】
（ＴＴＲ抗体精製及びセファロースへの結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ））
既に記されているようにして作成された抗体（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１，９８，５５６６〜５５７１）を、組換えブドウ球菌タンパク質Ａカラムにわたるラビット血清通路により精製した。カラムをｐＨ７．２の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の５カラム容積で洗浄した。抗体を５カラム容積の１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出画分各５ｍＬを、１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬで中和させた。次いで、画分を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．２）に対して透析した。その後、濃縮タンパク質を臭化シアン活性化セロファロースに結合させた。セファロースゲルは、先ずろ過漏斗中で、１ｍＭ ＨＣｌの１４００ｍＬで１５分間洗浄した。カップリング緩衝液（１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）及び抗体を洗浄済みゲルに添加した（ゲル１ｇ当たり３５ｍｇの抗体及びカップリング緩衝液５ｍＬ）。ゲルを室温で１時間回転させた後、遠心分離（３０００ｒｐｍ）を１分行った。ゲルを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に移し、室温で２時間回転させた。ゲルをＮａＣｌ（５００ｍＭ）含有１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）及びＮａＣｌ（５００ｍＭ）含有１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で、２サイクル洗浄した。ゲルをＴＳＡ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）で２度洗浄し、ＴＳＡ中に１：１のスラリーとして貯蔵した。
【００２３】
（ゲニステイン及びダイゼインのＴＴＲへの血漿選択性結合）
血漿中のＴＴＲへのゲニステイン及びダイゼインの結合化学量は、抗体補足／ＨＰＬＣ法により測定した（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１，９８，５５６６〜５５７１）。潜在的阻害剤の１．４４ｍＭ ＤＭＳＯ貯蔵溶液のサンプル７．５μＬを、ヒト血漿１．０ｍＬを含む１．５ｍＬエッペンドルフ型チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）に添加した。混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。急冷したセファロースのゲル：トリス生理食塩水（１：１）スラリー（１２５μＬ）を添加し、生じたスラリーを４℃で１時間揺動させた。混合物を遠心分離（１６０００×ｇ）し、上澄みを２つの等しいアリコート（４００μＬ）に分配した。各アリコートに抗−ＴＴＲ抗体結合セファロースのゲル：トリス生理食塩水（１：１）スラリー（２００μＬ）を添加した（前記参照）。これらの混合物を、４℃で、２０分間、ゆっくりと揺動した後、遠心分離（１６０００×ｇ）して、上澄みを取り出した。ゲルペレットを、４℃で、０．０５％サポニン含有トリス生理食塩水１ｍＬで洗浄し（３×１０分）、その後、トリス生理食塩水で洗浄した（２×１ｍＬ、各回１０分）。最終洗浄後、サンプルを遠心分離（１６０００×ｇ）し、生じたペレットに１００ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）１５５μＬを添加して、抗体から、ＴＴＲ及び結合小分子を溶出させた。高いｐＨ混合物を４℃で３０分間揺動し、次いで遠心分離（１６０００×ｇ）した。ＴＴＲと阻害剤とを含有する上澄み（１４５μＬ）を取り出し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。生じた溶液（１３５μＬ）は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ３−ｃｍＣ18逆相カラムを１００％溶液Ａで利用するＷａｔｅｒｓ７１７Ｐｌｕｓオートサンプラーに注入した。溶液Ｂの９分に渡る２０〜１００％直線勾配を利用して、ＴＴＲと阻害剤の両方を溶出させた。溶液Ａは、水９４．８％、アセトニトリル５％、トリフルオロ酢酸０．２％からなる。溶液Ｂは、アセトニトリル９４．８％、水５％、トリフルオロ酢酸０．２％を含有する。２８０ｎｍでの検出をＷａｔｅｒｓ４８６Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで実施した。小分子及びＴＴＲの積分ピークを、公知量の小分子及びＴＴＲから制作した較正カーブと比較した。
【００２４】
（等温滴定熱量分析）
ゲニステインとＷＴ ＴＴＲの結合を特徴付ける解離定数を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ等温滴定熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して測定した。小分子溶液（１００ｍＭ ＫＣｌと、１ｍＭ ＥＤＴＡと、１０％ＥｔＯＨとを含有する２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の最終濃度４３２μＭ）を調製し、ＷＴ ＴＴＲ（１００ｍＭ ＫＣｌと、１ｍＭ ＥＤＴＡと、１０％ＥｔＯＨとを含有する２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中１２μＭ）を含むＩＴＣセルへ滴定した。全操作に関して、少量の予備的注入を行った後、リガンド：タンパク質のモル比が少なくとも４：１に至るまで、同一の注入（２．０〜５．０μＬ）を行った。データは、Ｓｏｌｖｅｒプラグインを備えたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を利用して、非線形最小２乗法により、同一の結合部位モデル又は連続相互作用結合部位モデル（Ｆｏｓｓ，Ｔ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，近刊）のどちらかに適合させた。
【００２５】
（結果）
（フィブリル形成アッセイ）
ゲニステイン（１）、ゲニスチン（２）、ダイゼイン（３）及びアピゲニン（５、図１）を、既に記載の濁度アッセイ（Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１３５６０〜１３５７３）を使用して、ＷＴ ＴＴＲアミロイド形成の潜在的阻害剤としてテストした。大豆抽出物が、ＴＴＲアミロイドーシスの天然産阻害剤のためのスクリーンで、活性を示した（Ｎ Ｇｒｅｅｎ、未公開結果）ので、大豆のこれらの主成分が評価された。ゲニステインは、最も一般的なＦＡＰ及びＦＡＣ突然変異、それぞれＶ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉ、によるアミロイド形成の阻害剤として、その効能に関してもテストした。ＷＴ又は突然変異ＴＴＲホモテトラマーに関連して凝集体形成が報告されており、その場合の阻害剤不在時の凝集量を、１００％とする。従って、所定の阻害剤の存在下での５％凝集体形成は、９５％の阻害に相当する。ゲニステインは、基本的には、ＷＴ、Ｖ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉ ＴＴＲ（３．６μＭ）からの酸媒介凝集を、テスト阻害剤の両方の濃度（３．６μＭ又は７．２μＭ）で防止した（フィブリル２〜９％）（図３）。ダイゼイン及びアピゲニンは、ＷＴ凝集体形成のあまり有効でない阻害剤であり、ＴＴＲの２倍の濃度（７．２μＭ）で投与の際に、ほぼ２０％と２８％の凝集をそれぞれ許した。グルコシドゲニスチンは、非常に弱い阻害剤であり、ＴＴＲの濃度より１桁高い濃度（３６μＭ）でＷＴ ＴＴＲ凝集体形成４１％を示した。
【００２６】
（ゲニステイン濃度の関数としてのテトラマーの解離率）
尿素起因性解離に対しテトラマーのＴＴＲを動的に安定化させるその能力に関して、ゲニステインを更にテストした。尿素起因性モノマー変性にはテトラマーの解離が必要なので、遷移を非可逆的にする遷移後尿素濃度（６Ｍ）中で、迅速なモノマーアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）とテトラマー解離を関連付けることで、テトラマー解離の速度をモニターすることが可能となる。種々の小分子濃度でのテトラマー解離の割合及び範囲は、６．０Ｍ尿素中で、遠紫外線ＣＤ分光計によりモニターした。ゲニステインは、ＷＴ ＴＴＲテトラマー解離の幅に最も劇的な効果を及ぼした（図４Ａ）。等モル量のゲニステイン及びＷＴ ＴＴＲ（１．８μＭ）では、１２０時間後、ほんの１０％の蛋白質が解離し、アンフォールドされた。このことは、残りが、小分子結合の結果として、安定化されていることを意味する。これは、同一条件下でのＶ１２２Ｉの３３％解離（図４Ｂ、三角形）及びＶ３０Ｍの８７％解離（図４Ｃ、三角形）と対照的であった。阻害剤濃度（３．６μＭ）が、ＴＴＲ濃度（１．８μＭ）の２倍の場合には、ＷＴ ＴＴＲの１％のみ（図４Ａ、ひし形）、Ｖ１２２Ｉの１８％（図４Ｂ、ひし形）及びＶ３０Ｍの７０％（図４Ｃ、ひし形）が同一期間にわたり解離した。これらの結果は、小分子結合が与えたＴＴＲテトラマーの動的安定化と一致した。
【００２７】
（ゲニステイン及びダイゼインの血漿選択性）
ゲニステイン及びダイゼインのどちらが、血漿中の他の蛋白質ではなく選択的にＴＴＲに結合し得るかテストするために、これら２つの化合物を、血漿と共にインキュベートして、ＴＴＲの結合化学量を測定した。２つのイソフラボンは、ヒト血漿と共に、１０．８μＭの濃度（ヒト血漿中の代表的ＴＴＲ濃度は約５μＭである）で、別々にインキュベートした。トランスサイレチンは、樹脂結合抗ＴＴＲ抗体に捕捉させ、３洗浄ステップを施した。抗体からＴＴＲ及び任意の結合小分子を高いｐＨにより放出後、ＴＴＲに結合した阻害剤の化学量を、逆相ＨＰＬＣにより評価した。ＴＴＲテトラマー当たり最大２．０当量の阻害剤が結合できる。洗浄による損失が、観察された化学量を低下させている可能性があり、このことは、これらの数値が下限であると考えられることを意味する。４つの独立した実験の分析は、テトラマー当たり１．４５当量のゲニステインの血漿選択性を明らかにし、これは洗浄関連損失及びリガンドの解離定数が非常に低いことを意味する。他方、ダイゼインは、０．７５の結合化学量を示し、これは下限を示す。
【００２８】
（ＷＴ ＴＴＲへのゲニステインの結合定数の測定）
等温滴定熱量測定法を使用して、ゲニステインのＷＴ ＴＴＲへの結合の解離定数を、ｐＨ８．０（２５℃）で測定した。ブランク減算後のサーモグラムの集積により、結合等温線が得られ、これは負の協同性を備えた２つの連続した相互作用結合部位又は２つの同一の非相互作用部位のモデルに、等しく適合する。連続結合部位への適合から、Ｋd1＝４０±２５ｎＭ、Ｋd2＝１４００±１７０ｎＭの解離定数が得られた。データを同一結合部位に適合させると、１．９２±０．０７の占有でＫd1＝Ｋd2＝８４５±４５ｎＭが得られた。阻害効果は、負の協同結合（Ｋd1＝４０±２５ｎＭ、Ｋd2＝１４００±１７０ｎＭ）を強く示唆した；下記参照。
【００２９】
（図面の詳細な記述）
図１は、ゲニスチン（２）のアグリコンであるゲニステイン（１）、ダイジン（４）及びその相当するアグリコンであるダイゼイン（３）並びに、最初の２つのアグリコンと比較するために使用されたアピゲニン（５）の構造を示す。ゲニステインの５位にあるヒドロキシル基を欠くイソフラボンダイゼインは、大豆食品中にも見られるが、化学的保護作用はその性質に無い。
【００３０】
図２は、２つのチロキシン結合部位を描写するトランスサイレチンのテトラマー構造の概略図である。２つの結合部位は、結晶学上の２双軸に垂直な２本のＣ2軸により相互交換される。チロキシンで満たされた各結合部位は、内側及び外側ポケットを有する。
【００３１】
図３は、フィブリル形成の防止に関する種々の化合物の効能を比較する、一連の棒グラフ３つを示す。部分酸が仲介して、（Ａ）ＷＴ、（Ｂ）Ｖ３０Ｍ及び（Ｃ）Ｖ１２２Ｉ ＴＴＲの凝集を変性する。青の棒は、ｐＨを４．４まで下げる（７２時間）前に、テトラマーのＴＴＲ（３．６μＭ）が阻害剤（３．６μＭ又は７．２μＭ）と共に、３０分間プレインキュベートされた場合の凝集体形成アッセイからのデータを表す。各棒グラフ（光学濃度３５０ｎｍ）のＹ軸は、１００％とされたＷＴ ＴＴＲ（３．６μＭ）と比較した凝集体の形成を表す。従って、凝集体形成５％は、９５％の阻害とみなされる。
【００３２】
図４は、（Ａ）ＷＴ（黒丸）、（Ｂ）Ｖ１２２Ｉ及び（Ｃ）Ｖ３０Ｍ ＴＴＲに関する、尿素媒介テトラマー解離（６Ｍ）カーブの割合を示す一連のグラフである。ＷＴ及びその変異体をゲニステイン（１．８μＭ、三角形；３．６μＭ、ひし形）と共にプレインキュベートすると、ＴＴＲの解離は、劇的に緩慢となる。２１４〜２１８ｎｍでの遠紫外線ＣＤ楕円率は、ＷＴのそれと比較され、各時点で解離し、迅速にアンフォールドされるＴＴＲの画分を決定した。これらの実験は、ゲニステインが効果的であるはずの生理的条件をシミュレートしそうもない尿素溶液を使用しているので、Ｖ３０Ｍで見られたより小さな効果は、ゲニステインがＶ３０Ｍ疾病の治療において劣ることを必ずしも意味せず、むしろこれらは動的安定性を示している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ゲニスチン（２）のアグリコンであるゲニステイン（１）、ダイジン（４）及びその相当するアグリコンであるダイゼイン（３）並びに、最初の２つのアグリコンと比較するために使用されたアピゲニン（５）の構造を示す。
【図２】２つのチロキシン結合部位を描写するトランスサイレチンのテトラマー構造の概略図である。
【図３】フィブリル形成防止に対する種々の化合物の効能を比較する、一連の棒グラフ３つを示す。
【図４】（Ａ）ＷＴ（緑の円）、（Ｂ）Ｖ１２２Ｉ及び（Ｃ）Ｖ３０Ｍ ＴＴＲに関する、尿素媒介テトラマー解離（６Ｍ）カーブの割合を示す一連のグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスの治療に関する。更に詳細には、本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスの治療として、ゲニステインを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
老人性の全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）は、野生型（ＷＴ）トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドフィブリルの心臓及び末梢神経への沈着に特徴づけられる（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０，８７，２８４３〜２８４５；ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｒ．Ｅ．；３ｒｄ；Ｋａｓｐｅｒ，Ｅ．Ｋ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９８，２１，５４７〜５５２）。１００以上の種々のＴＴＲ変異体のうちの１つの変異体による沈着は、家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）として知られる疾病群に関与している（Ｓａｒａｉｖａ，Ｍ．Ｊ．；Ｃｏｓｔａ，Ｐ．Ｐ．；Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８５，７６，２１７１〜２１７７；Ｐｌａｎｔｅ−Ｂｏｒｄｅｎｅｕｖｅ，Ｖ．；Ｓａｉｄ，Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０００，１３，５６９〜５７３）。Ｖ３０Ｍ突然変異は、最も一般的なＦＡＰ変異体であり、日本、ポルトガル、及びスェーデンの患者にみられる。約１００万人のアフリカ系アメリカ人は、高い浸透度を有する家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）変異体、Ｖ１２２Ｉ ＴＴＲ、によるうっ血性心不全の重大な危険性を有している（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７，３３６，４６６〜４７３）。更に、ＴＴＲ変異体の亜集団は、ＣＮＳ選択性アミロイドーシス（ＣＮＳＡ）を惹き起こすことが、近年になって、判明した。
【０００３】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、ホロ（ｈｏｌｏ）−レチノール結合タンパク質及びチロキシン（Ｔ４）を血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中で輸送する機能を持つ（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．；Ｒａｓｋ，Ｌ．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５，２５０，８５５４〜８５６３；Ｍｏｎａｃｏ，Ｈ．Ｌ．；Ｒｉｚｚｉ，Ｍ．；Ｃｏｄａ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６８，１０３９〜１０４１）。ＴＴＲは、ダイマー−ダイマーインターフェイスに位置する、２つの同一漏斗形状のチロキシン結合部位を有する。これらのチロキシン結合部位は、結晶の２双軸（Ｚ−軸）に垂直に配向した２本のＣ2軸により相互交換され得る（図２）（Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００２，１，２６７〜２７５）。通常は、血漿及びＣＳＦ中のＴＴＲの１％未満が、Ｔ４と結合し、これらの部位を他の小さな疎水性分子の標的とさせ、アミロイド形成を防ぐ（Ｂａｒｔａｌｅｎａ，Ｌ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１９９３，１３，５８３〜５９８）。
【０００４】
チロキシン部位に結合することによりＴＴＲフィブリル形成を阻害できる数種の化合物が報告されている（Ａｄａｍｓｋｉ−Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，３５５〜３７４；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，１３３９〜１３４７；Ｂａｕｒｅｓ，Ｐ．Ｗ．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１３８９〜１４０１；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，近刊；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００，７，３１２〜３２１；Ｏｚａ，Ｖ．Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３２１〜３３２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８，９５，１２９５６〜１２９６０；Ｐｅｔｒａｓｓｉ，Ｈ．Ｍ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，２１７８〜２１９２；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，１５，１０７５〜１０７８；Ｒａｚａｖｉ，Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３，４２，２７５８〜２７６１；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｒ．Ｌ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，近刊）。理想的に言えば、良好な阻害剤は、高い親和性で結合し、ゆっくりと解離し、かつ血液中のＴＴＲに高い結合選択性を示すものである。これらの分子は、解離遷移状態よりも天然状態（ｎａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）への結合を好むので、そのことにより仲介された動的安定化を通して、その影響を及ぼす（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３〜７１６）。天然状態の動的安定化は、化合物ヘテロ接合体中で働くのと同じメカニズムであり、そのメカニズムでは、主にＶ３０Ｍサブユニットから構成されるテトラマーへＴ１１９Ｍトランス−サプレッサーサブユニットを組み込むことで、解離活性化バリアを上昇させ、その結果、疾病を改善する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，２９９，７１３〜７１６；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｆ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９３，２４５９〜２４６２）。同様に、小分子によるＴＴＲの動的安定化は、ＴＴＲアミロイドーシスを改善することができる。
【０００５】
ゲニステイン（１）は、種々の大豆食品中に１．９〜２２９μｇ／ｇの濃度でみられるイソフラボンである。さらにゲニステインの７１〜９６８μｇ／ｇは、そのＯ−グルコシド複合体、ゲニスチン（２）として存在し、インビボで腸内バクテリアにより迅速に脱グリコシル化される。毒性研究から、このイソフラボンは、相対的に高い濃度で使用しても、健康に悪影響を引き起こすようには見えないことが示されている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００２，７６，５５３〜５５９；Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ＴＴＲに結合し、ＴＴＲアミロイドーシスの治療に効果的であり、かつヒトに対し安全な統計結果を示す、非常に効能のある天然産物を提供することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一定の割合でのテトラマー解離及び部分モノマー変性を含む、トランスサイレチン（ＴＴＲ）のミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）は、３つのアミロイド疾病である、老人性の全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）に関与する、ＴＴＲのアミロイドへのミスアセンブリー（ｍｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）及び他の異常な四次構造を生じるのに十分である。大豆中の主要なイソフラボン天然産物である、ゲニステインは、非占有のＴＴＲ甲状腺ホルモン結合部位の１つ又は両方に結合することが本明細書中に開示される。この結合は、本明細書中で、天然状態のテトラマーを、解離遷移状態より一層安定化させる効果を有し、その結果、テトラマーの解離のための化学反応バリアを上げることが開示されている。ゲニステインは、トランスサイレチンテトラマーの解離及びアミロイド形成に対する優れた阻害剤であり、酸媒介フィブリル形成を、ＴＴＲのみの場合に示されるものの１０％未満まで減じることが本明細書中に開示されている。ゲニステインは、又、最も一般的なＦＡＰ及びＦＡＣ突然変異であるＶ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉによるアミロイド形成を阻害することが本明細書中に開示されている。ゲニステインは、他の全ての血漿蛋白質ではなく、血漿中ＴＴＲに、高度に選択的に結合することが本明細書中に開示される。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）から、ゲニステインが、負の協同性（Ｋd1＝４０ｎＭ、Ｋd2＝１．４μＭ）でＴＴＲに結合することが示される。ゲニステインは、その公知の経口バイオアベイラビリティ及び安全性データのより、トランスサイレチンアミロイドーシスの奇病を治療する栄養補助食品として特に有用である。
【０００８】
本発明の１態様は、トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者の治療方法を対象とする。この治療法は、患者に、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有する組成物を投与するステップを含む。ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％まで阻害するのに十分な量投与される。ゲニステインは、式：
【化１】
により表わされる構造を有する。好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、老人性の全身性アミロイドーシス又は家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである。更に詳細には、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーは、Ｖ３０Ｍ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、家族性アミロイドーシス心筋症である。更に詳細には、家族性アミロイドーシス心筋症は、Ｖ１２２Ｉ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、３．６μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、７．２μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、投与は、定期的に繰り返される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、患者に経口投与される。
【０００９】
本発明の別の態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者を治療する医薬の製造へゲニステインを使用する。この医薬は、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有する。ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％まで阻害するのに十分な量投与される。ゲニステインは、式：
【化２】
により表わされる構造を有する。好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、老人性の全身性アミロイドーシス又は家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである。更に詳細には、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーは、Ｖ３０Ｍ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、トランスサイレチンアミロイドーシスは、家族性アミロイドーシス心筋症である。更に詳細には、家族性アミロイドーシス心筋症は、Ｖ１２２Ｉ突然変異に特徴づけられる。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、３．６μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、前記患者に対し、ゲニステインの血漿濃度を、７．２μｍｏｌ以上のレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。別の好ましい態様では、投与は、定期的に繰り返される。別の好ましい態様では、ゲニステインは、患者に経口投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
天然産ゲニステイン及び構造的に関連する数個の天然類似体について、ＴＴＲアミロイドフィブリル形成を阻害するその能力に関しインビトロでテストした。ゲニステインは、ＷＴ ＴＴＲアミロイド形成の優れた阻害剤のように見える。その上、この化合物は、他の可能性あるすべてのタンパク質標的よりも、血漿中のＴＴＲへ高度に選択的に結合する。ゲニステインは、変異体；Ｖ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉ、に関係する最も一般的な疾病のアミロイド形成も阻害する。大豆製品の摂取を増加させるか又は大豆に基づくサプリメントをその食事に付け加えるだけで、一部の患者が利益を得ることができるので、そのような栄養補助食品を使用する利点は多い。ゲニステインの豊富な毒性情報から、高濃度での摂取ですら、ヒトが消費しても安全であることが示唆されている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．；ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００２，７６，５５３〜５５９；Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７）。
【００１１】
（考察）
ゲニステインは、優れたトランスサイレチンアミロイド形成阻害剤であることが、本明細書中に開示される。この栄養補助食品は、野生型、Ｖ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉのアミロイド形成を実質的に阻害する（図３Ａ〜Ｃ）。この化合物（３．６μＭ又は７．２μＭ）は、非添加ＴＴＲが示す値の１０％未満（３．６μＭ ＴＴＲ）までフィブリル形成を減じる。更に、ゲニステインは、尿素中のＷＴ及びＶ１２２Ｉ ＴＴＲテトラマーの解離速度を劇的に緩慢にし（図４）、小分子が媒介するテトラマーの動的安定化を示す。これらの実験は、ゲニステインが効果的であるはずの生理的条件をシミュレートしそうもない尿素溶液を使用しているので、Ｖ３０Ｍに対して見られたより小さな効果は、ゲニステインが、Ｖ３０Ｍ疾病の治療において劣るものであるということを必ずしも意味せず、むしろこれらは動的安定性を示している。
【００１２】
ＴＴＲテトラマーの動的安定化は、解離遷移状態よりネィティブ状態を選択する安定化の結果生じる。Ｔ１１９Ｍサブユニットの包含による、Ｖ３０Ｍ含有ＴＴＲテトラマーの動的安定化は、ＴＴＲアミロイドーシスを改善するのに十分であり、このことは、ＴＴＲのゲニステイン媒介動的安定化が、ヒトの疾病を防止するのに有効であることを示唆する。アミロイド形成経路に関わる何れの種が、毒性を誘発するのか不明のままであるので、動的安定化は、最も保守的な戦略である。
【００１３】
等温滴定熱量測定法を使用して、ｐＨ８．０（２５℃）でのＷＴ ＴＴＲについてゲニステインの結合定数を測定した。空所の引算及び得られたサーモグラムの積分から、結合等温線が得られ、これは、負の協同性（Ｋd1＝４０ｎＭ、Ｋd2＝１４００ｎＭ）を備えた２つの連続した相互作用結合部位又は２つの同一の非相互作用部位（Ｋd1＝Ｋd2＝８４５ｎＭ）のモデルに等しくぴったりとフィットする。等濃度のゲニステインとＴＴＲで強い凝集阻害が観察されるので、恐らく、ゲニステインは、負の協同性（Ｋd1＝４０ｎＭ、Ｋd2＝１４００ｎＭ）で結合し、主にＴＴＲ・Ｉを溶解して提供するようである。非リガンド型ＴＴＲが主な種なので、Ｋd1＝Ｋd2＝８４５ｎＭのばあいには、低濃度での効力は期待されないだろう。
【００１４】
ゲニステインの５位と７位にあるヒドロキシル基は、凝集阻害について重要であるように思える。５−ＯＨが欠けるダイゼインは、ＴＴＲ濃度の２倍濃度（７．２μＭ）で投与の場合、凝集阻害能力がほぼ４倍減少する。７位のヒドロキシル基をグルコース部分でマスクすると（ゲニスチン）、活性の劇的な損失をもたらし、非常に高い阻害剤濃度でも４１％のフィブリル形成が残る（ゲニスチン３６μＭ、タンパク質３．６μＭ）。ｐ−ヒドロキシフェニル置換基の位置も重要のようである。この構造をイソフラボン（ゲニステイン）の２位から１位に移動させると（アピゲニン）、ｐＨ４．４でＷＴ ＴＴＲ凝集の阻害は、２倍減少する結果となる。
【００１５】
ジフルニサルは、トランスサイレチンアミロイド形成の阻害において、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として効果があることが、従来報告されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，８４，５４５〜５５２）。この化合物は、正常のヒト被験者経口投与研究（Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｋｅｌｌｙ 未公開結果）で有望であるが、腎臓病及び腎不全の非常に高い発病率に悩まされるアフリカ系アメリカ人では、腎血流障害のために、Ｖ１２２ＩＦＡＣの治療に関しては問題がある（Ｕ．Ｓ．Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。ＮＳＡＩＤによる治療は、腎臓への血流を保持する助けとなるプロスタグランジンの合成を阻害するので、この危険性を悪化させる可能性がある。ゲニステインは、腎機能にいかなる悪影響も有することを示さず、ジフルニサルより活性かつ選択性であるので、より良好なＶ１２２Ｉアミロイドーシス阻害剤であり得る。
【００１６】
重要であり克服不可能な課題ではないが、体重１ｋｇ当たり１６ｍｇの用量で約０．１〜８μＭのゲニステインのインビボ血漿濃度では、ゲニステイン及びゲニスチンの経口バイオアベイラビリティが少ないことである（Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７；Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００１，１３１，１３６２Ｓ〜１３７５Ｓ）。Ｃａｃｏ−２細胞及びラット灌流腸管モデルを使用するＬｉｕ及びＨｕの研究（Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｈｕ，Ｍ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２００２，３０，３７０〜３７７）で、ゲニステインは、腸に効果的に吸収されるが、広範な初回通過代謝は、主な代謝産物として７−ＯＨ−グルクロン酸を形成することが示される。ゲニスチンの浸透性は、その対応するアグリコンよりもほぼ５倍低い。ゲニステインの血漿中半減期は、男性では３．２時間、女性では３．８時間であることが測定された。これらの興味ある薬物動態学から、緩慢な放出処方が有用であることが示唆される（Ｂｕｓｂｙ，Ｍ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７５，１２６〜１３６；Ｂｌｏｅｄｏｎ，Ｌ．Ｔ．；ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００２，７６，１１２６〜１１３７）。
【００１７】
大豆製品、特にゲニステイン、は、抗腫瘍作用を有することが報告されており、これは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む多数のタンパク質の遺伝子発現修飾に至るタンパク質チロシンキナーゼ経路の阻害による。これらの発現変化が、細胞成長及び増殖、血管形成、並びに細胞サイクルをＧ２／Ｍで阻むことが示された（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，Ｍ．Ｈ．；ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００４，５４６，１２１〜１６５）。ゲニステインのチロシンキナーゼとの相互作用及びこれらの多数の生物学的経路への影響は、長期治療に対する懸念を引き起こす。しかしこれらの懸念は、大豆の多い食事は多数のプラスの効果を有することを示唆する疫学データ及びゲニステインの毒性を評価する多数の短期高投与量研究の双方により和らげられる。
【実施例】
【００１８】
（材料と方法）
ゲニステイン、ダイゼイン及びアピゲニンは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ゲニスチンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、そのまま使用した。これらの化合物の純度は、ＨＰＬＣ及び高分解能質量分析法により証明した。
【００１９】
（タンパク質発現及び精製）
ＷＴ、Ｖ１２２Ｉ及びＶ３０Ｍ ＴＴＲは、これまでに記されているようにＥ．ｃｏｌｉから発現及び精製した（Ｆｏｓｓ，Ｔ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，近刊）。
【００２０】
（停滞（ｓｔａｇｎａｎｔ）トランスサイレチン凝集アッセイ）
停滞凝集アッセイは、これまでに記されているように行った（Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１３５６０〜１３５７３）。ＴＴＲ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中の７．６μＭ（０．４ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ７．０）のサンプル０．４９５ｍＬを、ＤＭＳＯ中のイソフラボン又はフラボン阻害剤（０．７６ｍＭ又は１．４４ｍＭ）５μＬと共にインキュベートした。３０分後、サンプルを、１００ｍＭのＫＣｌと、１ｍＭのＥＤＴＡとを含有する２００ｍＭ酢酸緩衝液（ＷＴ及びＶ１２２Ｉに関してはｐＨ４．２、最終ｐＨ４．４、Ｖ３０Ｍに関してはｐＨ４．８、最終ｐＨ５．０）０．５ｍＬで希釈した。サンプルを短時間ボルテックスした後、更に３７℃で、７２時間、撹拌せずにインキュベートした。濁度測定を、ＨＰ８４５３ＵＶ−可視分光計により、３５０ｎｍと４００ｎｍで行って、凝集の程度を調べた。測定の直前に、シングルタイムポイントのサンプル（ｓｉｎｇｌｅ−ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ）（７２時間）をボルテックスした。
【００２１】
（円二色性によるＴＴＲ尿素変性カーブ）
ＴＴＲ（４００μＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ；４．５μＭテトラマー）を、４．５又は９．０μＭの濃度のゲニステインと共に２５℃で１８時間プレインキュベートした。１００ｍＭのＫＣｌと、１ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのＤＴＴとを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の尿素（１０Ｍ、６００μＬ）を、最初の測定の直前に、サンプルに添加した（総容積１．０ｍＬ、尿素６．０Ｍ、ＴＴＲ（１．８μＭテトラマー）最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）。０．５ｎｍ毎にサンプリングしながら、２２０〜２１４ｎｍの波長スキャンを使用し、円二色性スペクトルを、１２０時間（２５℃）まで記録した。２１８〜２１５のシグナルを平均し、プロットして、各時点で解離し、アンフォールド（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）されたＴＴＲテトラマーの画分を決定した。
【００２２】
（ＴＴＲ抗体精製及びセファロースへの結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ））
既に記されているようにして作成された抗体（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１，９８，５５６６〜５５７１）を、組換えブドウ球菌タンパク質Ａカラムにわたるラビット血清通路により精製した。カラムをｐＨ７．２の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の５カラム容積で洗浄した。抗体を５カラム容積の１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出画分各５ｍＬを、１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬで中和させた。次いで、画分を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．２）に対して透析した。その後、濃縮タンパク質を臭化シアン活性化セロファロースに結合させた。セファロースゲルは、先ずろ過漏斗中で、１ｍＭ ＨＣｌの１４００ｍＬで１５分間洗浄した。カップリング緩衝液（１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）及び抗体を洗浄済みゲルに添加した（ゲル１ｇ当たり３５ｍｇの抗体及びカップリング緩衝液５ｍＬ）。ゲルを室温で１時間回転させた後、遠心分離（３０００ｒｐｍ）を１分行った。ゲルを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に移し、室温で２時間回転させた。ゲルをＮａＣｌ（５００ｍＭ）含有１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）及びＮａＣｌ（５００ｍＭ）含有１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で、２サイクル洗浄した。ゲルをＴＳＡ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）で２度洗浄し、ＴＳＡ中に１：１のスラリーとして貯蔵した。
【００２３】
（ゲニステイン及びダイゼインのＴＴＲへの血漿選択性結合）
血漿中のＴＴＲへのゲニステイン及びダイゼインの結合化学量は、抗体補足／ＨＰＬＣ法により測定した（Ｐｕｒｋｅｙ，Ｈ．Ｅ．；Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１，９８，５５６６〜５５７１）。潜在的阻害剤の１．４４ｍＭ ＤＭＳＯ貯蔵溶液のサンプル７．５μＬを、ヒト血漿１．０ｍＬを含む１．５ｍＬエッペンドルフ型チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）に添加した。混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。急冷したセファロースのゲル：トリス生理食塩水（１：１）スラリー（１２５μＬ）を添加し、生じたスラリーを４℃で１時間揺動させた。混合物を遠心分離（１６０００×ｇ）し、上澄みを２つの等しいアリコート（４００μＬ）に分配した。各アリコートに抗−ＴＴＲ抗体結合セファロースのゲル：トリス生理食塩水（１：１）スラリー（２００μＬ）を添加した（前記参照）。これらの混合物を、４℃で、２０分間、ゆっくりと揺動した後、遠心分離（１６０００×ｇ）して、上澄みを取り出した。ゲルペレットを、４℃で、０．０５％サポニン含有トリス生理食塩水１ｍＬで洗浄し（３×１０分）、その後、トリス生理食塩水で洗浄した（２×１ｍＬ、各回１０分）。最終洗浄後、サンプルを遠心分離（１６０００×ｇ）し、生じたペレットに１００ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）１５５μＬを添加して、抗体から、ＴＴＲ及び結合小分子を溶出させた。高いｐＨ混合物を４℃で３０分間揺動し、次いで遠心分離（１６０００×ｇ）した。ＴＴＲと阻害剤とを含有する上澄み（１４５μＬ）を取り出し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。生じた溶液（１３５μＬ）は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ３−ｃｍＣ18逆相カラムを１００％溶液Ａで利用するＷａｔｅｒｓ７１７Ｐｌｕｓオートサンプラーに注入した。溶液Ｂの９分に渡る２０〜１００％直線勾配を利用して、ＴＴＲと阻害剤の両方を溶出させた。溶液Ａは、水９４．８％、アセトニトリル５％、トリフルオロ酢酸０．２％からなる。溶液Ｂは、アセトニトリル９４．８％、水５％、トリフルオロ酢酸０．２％を含有する。２８０ｎｍでの検出をＷａｔｅｒｓ４８６Ｔｕｎａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで実施した。小分子及びＴＴＲの積分ピークを、公知量の小分子及びＴＴＲから制作した較正カーブと比較した。
【００２４】
（等温滴定熱量分析）
ゲニステインとＷＴ ＴＴＲの結合を特徴付ける解離定数を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ等温滴定熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して測定した。小分子溶液（１００ｍＭ ＫＣｌと、１ｍＭ ＥＤＴＡと、１０％ＥｔＯＨとを含有する２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の最終濃度４３２μＭ）を調製し、ＷＴ ＴＴＲ（１００ｍＭ ＫＣｌと、１ｍＭ ＥＤＴＡと、１０％ＥｔＯＨとを含有する２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中１２μＭ）を含むＩＴＣセルへ滴定した。全操作に関して、少量の予備的注入を行った後、リガンド：タンパク質のモル比が少なくとも４：１に至るまで、同一の注入（２．０〜５．０μＬ）を行った。データは、Ｓｏｌｖｅｒプラグインを備えたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を利用して、非線形最小２乗法により、同一の結合部位モデル又は連続相互作用結合部位モデル（Ｆｏｓｓ，Ｔ．Ｒ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，近刊）のどちらかに適合させた。
【００２５】
（結果）
（フィブリル形成アッセイ）
ゲニステイン（１）、ゲニスチン（２）、ダイゼイン（３）及びアピゲニン（５、図１）を、既に記載の濁度アッセイ（Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，１３５６０〜１３５７３）を使用して、ＷＴ ＴＴＲアミロイド形成の潜在的阻害剤としてテストした。大豆抽出物が、ＴＴＲアミロイドーシスの天然産阻害剤のためのスクリーンで、活性を示した（Ｎ Ｇｒｅｅｎ、未公開結果）ので、大豆のこれらの主成分が評価された。ゲニステインは、最も一般的なＦＡＰ及びＦＡＣ突然変異、それぞれＶ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉ、によるアミロイド形成の阻害剤として、その効能に関してもテストした。ＷＴ又は突然変異ＴＴＲホモテトラマーに関連して凝集体形成が報告されており、その場合の阻害剤不在時の凝集量を、１００％とする。従って、所定の阻害剤の存在下での５％凝集体形成は、９５％の阻害に相当する。ゲニステインは、基本的には、ＷＴ、Ｖ３０Ｍ及びＶ１２２Ｉ ＴＴＲ（３．６μＭ）からの酸媒介凝集を、テスト阻害剤の両方の濃度（３．６μＭ又は７．２μＭ）で防止した（フィブリル２〜９％）（図３）。ダイゼイン及びアピゲニンは、ＷＴ凝集体形成のあまり有効でない阻害剤であり、ＴＴＲの２倍の濃度（７．２μＭ）で投与の際に、ほぼ２０％と２８％の凝集をそれぞれ許した。グルコシドゲニスチンは、非常に弱い阻害剤であり、ＴＴＲの濃度より１桁高い濃度（３６μＭ）でＷＴ ＴＴＲ凝集体形成４１％を示した。
【００２６】
（ゲニステイン濃度の関数としてのテトラマーの解離率）
尿素起因性解離に対しテトラマーのＴＴＲを動的に安定化させるその能力に関して、ゲニステインを更にテストした。尿素起因性モノマー変性にはテトラマーの解離が必要なので、遷移を非可逆的にする遷移後尿素濃度（６Ｍ）中で、迅速なモノマーアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）とテトラマー解離を関連付けることで、テトラマー解離の速度をモニターすることが可能となる。種々の小分子濃度でのテトラマー解離の割合及び範囲は、６．０Ｍ尿素中で、遠紫外線ＣＤ分光計によりモニターした。ゲニステインは、ＷＴ ＴＴＲテトラマー解離の幅に最も劇的な効果を及ぼした（図４Ａ）。等モル量のゲニステイン及びＷＴ ＴＴＲ（１．８μＭ）では、１２０時間後、ほんの１０％の蛋白質が解離し、アンフォールドされた。このことは、残りが、小分子結合の結果として、安定化されていることを意味する。これは、同一条件下でのＶ１２２Ｉの３３％解離（図４Ｂ、三角形）及びＶ３０Ｍの８７％解離（図４Ｃ、三角形）と対照的であった。阻害剤濃度（３．６μＭ）が、ＴＴＲ濃度（１．８μＭ）の２倍の場合には、ＷＴ ＴＴＲの１％のみ（図４Ａ、ひし形）、Ｖ１２２Ｉの１８％（図４Ｂ、ひし形）及びＶ３０Ｍの７０％（図４Ｃ、ひし形）が同一期間にわたり解離した。これらの結果は、小分子結合が与えたＴＴＲテトラマーの動的安定化と一致した。
【００２７】
（ゲニステイン及びダイゼインの血漿選択性）
ゲニステイン及びダイゼインのどちらが、血漿中の他の蛋白質ではなく選択的にＴＴＲに結合し得るかテストするために、これら２つの化合物を、血漿と共にインキュベートして、ＴＴＲの結合化学量を測定した。２つのイソフラボンは、ヒト血漿と共に、１０．８μＭの濃度（ヒト血漿中の代表的ＴＴＲ濃度は約５μＭである）で、別々にインキュベートした。トランスサイレチンは、樹脂結合抗ＴＴＲ抗体に捕捉させ、３洗浄ステップを施した。抗体からＴＴＲ及び任意の結合小分子を高いｐＨにより放出後、ＴＴＲに結合した阻害剤の化学量を、逆相ＨＰＬＣにより評価した。ＴＴＲテトラマー当たり最大２．０当量の阻害剤が結合できる。洗浄による損失が、観察された化学量を低下させている可能性があり、このことは、これらの数値が下限であると考えられることを意味する。４つの独立した実験の分析は、テトラマー当たり１．４５当量のゲニステインの血漿選択性を明らかにし、これは洗浄関連損失及びリガンドの解離定数が非常に低いことを意味する。他方、ダイゼインは、０．７５の結合化学量を示し、これは下限を示す。
【００２８】
（ＷＴ ＴＴＲへのゲニステインの結合定数の測定）
等温滴定熱量測定法を使用して、ゲニステインのＷＴ ＴＴＲへの結合の解離定数を、ｐＨ８．０（２５℃）で測定した。ブランク減算後のサーモグラムの集積により、結合等温線が得られ、これは負の協同性を備えた２つの連続した相互作用結合部位又は２つの同一の非相互作用部位のモデルに、等しく適合する。連続結合部位への適合から、Ｋd1＝４０±２５ｎＭ、Ｋd2＝１４００±１７０ｎＭの解離定数が得られた。データを同一結合部位に適合させると、１．９２±０．０７の占有でＫd1＝Ｋd2＝８４５±４５ｎＭが得られた。阻害効果は、負の協同結合（Ｋd1＝４０±２５ｎＭ、Ｋd2＝１４００±１７０ｎＭ）を強く示唆した；下記参照。
【００２９】
（図面の詳細な記述）
図１は、ゲニスチン（２）のアグリコンであるゲニステイン（１）、ダイジン（４）及びその相当するアグリコンであるダイゼイン（３）並びに、最初の２つのアグリコンと比較するために使用されたアピゲニン（５）の構造を示す。ゲニステインの５位にあるヒドロキシル基を欠くイソフラボンダイゼインは、大豆食品中にも見られるが、化学的保護作用はその性質に無い。
【００３０】
図２は、２つのチロキシン結合部位を描写するトランスサイレチンのテトラマー構造の概略図である。２つの結合部位は、結晶学上の２双軸に垂直な２本のＣ2軸により相互交換される。チロキシンで満たされた各結合部位は、内側及び外側ポケットを有する。
【００３１】
図３は、フィブリル形成の防止に関する種々の化合物の効能を比較する、一連の棒グラフ３つを示す。部分酸が仲介して、（Ａ）ＷＴ、（Ｂ）Ｖ３０Ｍ及び（Ｃ）Ｖ１２２Ｉ ＴＴＲの凝集を変性する。青の棒は、ｐＨを４．４まで下げる（７２時間）前に、テトラマーのＴＴＲ（３．６μＭ）が阻害剤（３．６μＭ又は７．２μＭ）と共に、３０分間プレインキュベートされた場合の凝集体形成アッセイからのデータを表す。各棒グラフ（光学濃度３５０ｎｍ）のＹ軸は、１００％とされたＷＴ ＴＴＲ（３．６μＭ）と比較した凝集体の形成を表す。従って、凝集体形成５％は、９５％の阻害とみなされる。
【００３２】
図４は、（Ａ）ＷＴ（黒丸）、（Ｂ）Ｖ１２２Ｉ及び（Ｃ）Ｖ３０Ｍ ＴＴＲに関する、尿素媒介テトラマー解離（６Ｍ）カーブの割合を示す一連のグラフである。ＷＴ及びその変異体をゲニステイン（１．８μＭ、三角形；３．６μＭ、ひし形）と共にプレインキュベートすると、ＴＴＲの解離は、劇的に緩慢となる。２１４〜２１８ｎｍでの遠紫外線ＣＤ楕円率は、ＷＴのそれと比較され、各時点で解離し、迅速にアンフォールドされるＴＴＲの画分を決定した。これらの実験は、ゲニステインが効果的であるはずの生理的条件をシミュレートしそうもない尿素溶液を使用しているので、Ｖ３０Ｍで見られたより小さな効果は、ゲニステインがＶ３０Ｍ疾病の治療において劣ることを必ずしも意味せず、むしろこれらは動的安定性を示している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ゲニスチン（２）のアグリコンであるゲニステイン（１）、ダイジン（４）及びその相当するアグリコンであるダイゼイン（３）並びに、最初の２つのアグリコンと比較するために使用されたアピゲニン（５）の構造を示す。
【図２】２つのチロキシン結合部位を描写するトランスサイレチンのテトラマー構造の概略図である。
【図３】フィブリル形成防止に対する種々の化合物の効能を比較する、一連の棒グラフ３つを示す。
【図４】（Ａ）ＷＴ（緑の円）、（Ｂ）Ｖ１２２Ｉ及び（Ｃ）Ｖ３０Ｍ ＴＴＲに関する、尿素媒介テトラマー解離（６Ｍ）カーブの割合を示す一連のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者の治療方法であって、
前記治療方法は、前記患者に、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有する組成物を投与するステップを含み、
前記ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％阻害するのに十分な量投与され、
前記ゲニステインは、式：
【化１】
により表わされる構造を有する治療方法。
【請求項２】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、老人性の全身性アミロイドーシスである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーが、Ｖ３０Ｍ突然変異で特徴付けられる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス心筋症である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記家族性アミロイドーシス心筋症が、Ｖ１２２Ｉ突然変異で特徴付けられる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を３．６マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を７．２マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲニステインを含有する組成物の投与が、定期的に繰り返される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲニステインを含有する組成物が、患者に経口投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者を治療するための医薬の製造へのゲニステインの使用であって、この医薬は、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有し、前記ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％まで阻害するのに十分な量投与され、前記ゲニステインは、式：
【化２】
により表わされる構造を有する医薬製造へのゲニステインの使用。
【請求項１２】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、老人性の全身性アミロイドーシスである請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーは、Ｖ３０Ｍ突然変異で特徴付けられる請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス心筋症である請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記家族性アミロイドーシス心筋症が、Ｖ１２２Ｉ突然変異で特徴付けられる請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を３．６マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を７．２マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲニステインを含有する組成物の投与は、定期的に繰り返される請求項１１に記載の使用。
【請求項２０】
前記ゲニステインを含有する組成物が、患者に経口投与される請求項１１に記載の使用。
【請求項１】
トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者の治療方法であって、
前記治療方法は、前記患者に、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有する組成物を投与するステップを含み、
前記ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％阻害するのに十分な量投与され、
前記ゲニステインは、式：
【化１】
により表わされる構造を有する治療方法。
【請求項２】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、老人性の全身性アミロイドーシスである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーが、Ｖ３０Ｍ突然変異で特徴付けられる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス心筋症である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記家族性アミロイドーシス心筋症が、Ｖ１２２Ｉ突然変異で特徴付けられる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を３．６マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を７．２マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲニステインを含有する組成物の投与が、定期的に繰り返される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲニステインを含有する組成物が、患者に経口投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
トランスサイレチンアミロイドーシスを有するか又は潜在的に有する患者を治療するための医薬の製造へのゲニステインの使用であって、この医薬は、有効成分としてゲニステインの治療有効量を含有し、前記ゲニステインは、前記治療過程の間、前記患者の血漿中でトランスサイレチンの酸媒介フィブリル形成を、少なくとも約９０％まで阻害するのに十分な量投与され、前記ゲニステインは、式：
【化２】
により表わされる構造を有する医薬製造へのゲニステインの使用。
【請求項１２】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、老人性の全身性アミロイドーシスである請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーである請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記家族性アミロイドーシス多発ニューロパシーは、Ｖ３０Ｍ突然変異で特徴付けられる請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイドーシス心筋症である請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記家族性アミロイドーシス心筋症が、Ｖ１２２Ｉ突然変異で特徴付けられる請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を３．６マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者に対し投与されるゲニステインの治療有効量が、ゲニステインの血漿濃度を７．２マイクロモル以上の値まで上昇させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲニステインを含有する組成物の投与は、定期的に繰り返される請求項１１に記載の使用。
【請求項２０】
前記ゲニステインを含有する組成物が、患者に経口投与される請求項１１に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５０４６８２（Ｐ２００９−５０４６８２Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２６２９４（Ｐ２００８−５２６２９４）
【出願日】平成１８年８月１１日（２００６．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２２１３８
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１１日（２００６．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２２１３８
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
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