トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキット
【課題】効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法を提供する。
【解決手段】不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【解決手段】不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫は発生様式の違いから、完全変態類と不完全変態類に大別される。ショウジョウバエ等の完全変態類については、その形態形成についてよく研究されているが、不完全変態類についての研究はほとんどされていない。しかし、害虫の中には、バッタ、イナゴ、ゴキブリなどの不完全変態昆虫もおり、これらの対策に遺伝子組換えの技術は必要不可欠になっている。また、不完全変態の昆虫を天敵昆虫として利用する場合にも、遺伝子組換えの技術は必要不可欠になっている。
【０００３】
遺伝子組換えの一つである、外部から特定の遺伝子を導入したトランスジェニックにおいて、外来ＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれる効率が低いため、その効率を高めるためには特別な手段を利用する必要がある。その手段として現在普及しているのが、ＤＮＡ型トランスポゾンである。ＤＮＡ型トランスポゾンは、ＤＮＡからトランスポゼースにより切り出され、別のＤＮＡのターゲット配列に挿入される。ＤＮＡ型トランスポゾンがゲノムＤＮＡに挿入する性質を利用したトランスジェニック生物作製ならびに挿入変異体の作製は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）におけるＰエレメントの系に代表されるように、極めて有効な手法である。実際、トランスポゾンは他のトランスジェニック完全変態昆虫の作製にも用いられている。カイコ、ショウジョウバエ、カなども、トランスポゾンを用いてトランスジェニック個体が作製されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃの転移酵素のコード領域を有するｍＲＮＡ、および任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをカイコ卵に注入し、そのカイコ卵から生じたカイコの中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニックカイコを選択するトランスジェニックカイコの製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２５９７７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、コオロギに代表される不完全変態の昆虫では、トランスジェニック個体の作製が確立されていない。
【０００７】
本発明は、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体の卵を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法である。
【０００９】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法において、前記不完全変態昆虫が、コオロギであることが好ましい。
【００１０】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法において、前記任意のＤＮＡが、ヒト遺伝子であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法である。
【００１２】
また、本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製されるトランスジェニック不完全変態昆虫である。
【００１３】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫において、前記不完全変態昆虫が、コオロギであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であるトランスジェニック不完全変態昆虫である。
【００１５】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫において、前記不完全変態昆虫が、コオロギであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製したトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むキットである。
【００１７】
また、本発明は、任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であるトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むキットである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体の卵を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態におけるインジェクション方法を示す概略図である。
【図２】本発明の実施例における、３ｘＰ３−ＥＧＦＰトランスジェニックコオロギを示す図である。
【図３】本発明の実施例における、採卵後約４２時間のトランスジェニック卵を示す図である。
【図４】本発明の実施例における、ＥＧＦＰが観察できる卵にｃａｄをＲＮＡ干渉し、その発生過程を示す図である。
【図５】本発明の実施例における、ＥＧＦＰが観察できる卵にｏｔｄをＲＮＡ干渉し、その発生過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
＜トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法＞
本発明の実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含む。
【００２２】
トランスジェニック個体作製において外来ＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれる効率が低いため、ＤＮＡ型トランスポゾンが有用である。例えば、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃは、鱗翅目昆虫である蛾の一種イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）から採られ、幅広い生物で転移することが確認されている。ｐｉｇｇｙＢａｃは、ＴＴＡＡ属ともいわれ、ゲノム中のＴＴＡＡ配列中に転移する。中央部にあるトランスポゼース遺伝子と、その両端に存在する１３ｂｐの逆向き反復配列から構成されている。この原理を利用し、トランスポゼースをコードするベクターと、外来遺伝子をコードするベクターとを不完全変態昆虫に共注入すれば、トランスポゼースによって切り出された外来遺伝子が、不完全変態昆虫のゲノム上に挿入され、トランスジェニック不完全変態昆虫が作製されることになる。
【００２３】
これらは、一般的にはＤＮＡ型トランスポゾン（ドナー（ｄｏｎｏｒ））のヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）としてプラスミドを用いた系で作製されているが、本実施形態では、不完全変態昆虫であるコオロギの細胞質よりクローニングされたアクチンプロモーター（ａｃｔｉｎ）等のプロモーターのプラスミドに代わり、ｍＲＮＡを用いる。すなわち、プロモーター下で任意の遺伝子が発現するようにしたトランスポゾンベクター（ドナー）と、トランスポゼース供給源としてのトランスポゾン ｍＲＮＡ（ヘルパー）とを卵にインジェクションする。例えば、コオロギアクチンプロモーター下で任意の遺伝子が発現するようにしたｐｉｇｇｙＢａｃベクター（ドナー）と、トランスポゼース供給源としてのｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ（ヘルパー）とをコオロギ卵に注入（インジェクション）することにより、トランスジェニックコオロギを作製することができる。
【００２４】
トランスジェニック生物の作製において、昆虫で初めてトランスジェニック個体を作製できた完全変態昆虫であるハエの場合、次世代に効率よくトランスポゾンを転移させるため、始原生殖細胞（primordial germ cell）が形成される卵の後極にトランスポゾンのインジェクションを行っている。また、この知見を利用して、同じ完全変態昆虫であるカについてもトランスジェニック個体の作製に成功している。しかし、不完全変態昆虫においては、この始原生殖細胞の形成様式が多様化しており、どの位置に始原生殖細胞が形成されるかさえも分かっていない場合がほとんどである。したがって、効率の良いトランスジェニック作製が確立できていなかった。
【００２５】
そこで、本方法では、まず、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する（部位特定工程）。始原生殖細胞の部位を特定する方法としては、特に制限はないが、例えば、始原生殖細胞の遺伝子マーカーであるｖａｓａのｍＲＮＡとｐｒｏｔｅｉｎの発現部位を調べて、始原生殖細胞の部位を特定する方法等が挙げられる。実施例で示すように、例えばｖａｓａのｍＲＮＡとｐｒｏｔｅｉｎの発現部位を調べる方法により、コオロギでは卵の最後端から２０％上流位置（卵全長を１００％とする）にその発現が認められた。そこで、ｖａｓａの発現位置である、卵の後端より２０％の位置を狙い、ＤＮＡ型トランスポゾンのインジェクションを行うことで効率の良いトランスジェニック個体の作製が可能となった。
【００２６】
次に、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する（注入工程）。
【００２７】
プロモーターの下流に連結した外来ＤＮＡ配列の両末端にトランスポゾンエレメントを有するＤＮＡ型トランスポゾンのプラスミド（ドナー）、および、トランスポゼース供給源としてのトランスポゼースｍＲＮＡ（ヘルパー）を調製する。そして、受精卵における前記特定した部位付近にドナーとヘルパーとをインジェクションする。
【００２８】
ドナーは、プロモーターの下流に任意のＤＮＡを連結したＤＮＡ配列の両末端にトランスポゾンエレメントを有するプラスミドであればよく、特に制限はない。図１は、本実施形態におけるインジェクション方法を示す概略図である。図１には、ドナーの構造の一例を示してある。ドナーは、例えば、コオロギ細胞質アクチンプロモーター（Ｇｂ’ａｃｔ）の下流に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰを連結したＤＮＡ配列（Ｇｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰ）の両末端にｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを持つプラスミドである。または、ドナーは、コオロギの眼に発現する３ｘＰ３プロモーター（３ｘＰ３）の下流に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰを連結したＤＮＡ配列（３ｘＰ３−ＥＧＦＰ）の両末端にｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを持つプラスミドである。ＥＧＦＰの代わりに赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄも用いてもよい。
【００２９】
ドナーは、どのように調製されたものであってもよいが、例えば、プラスミド精製キットであるＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製することができる。
【００３０】
トランスポゾンは、細胞内においてゲノム上の位置を移動することができる塩基配列として知られており、しばしば、遺伝子導入用のベクターとして使用されるものである。トランスポゾンは、遺伝子導入用のベクターとして使用可能なものであれば特に制限されるものではない。また、トランスポゾンには、ＤＮＡ断片が直接転移するＤＮＡ型と、転写と逆転写の過程を経るＲＮＡ型があるが、そのいずれかに限定されるものではない。トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃの他にも、Ｍｉｎｏｓ、Ｍａｒｉｎｅｒ、Ｈｅｒｍｅｓなどが挙げられる。
【００３１】
プロモーターとしては、任意のＤＮＡを発現させたい部位に応じて選択すればよく、特に制限はない。例えば、コオロギの細胞質に特異的に発現するコオロギアクチンプロモーター（Ｇｂ’ａｃｔ）、コオロギの眼に特異的に発現する３ｘＰ３プロモーター、高温処理により遺伝子発現の制御が可能になるｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ プロモーター等が挙げられる。
【００３２】
コオロギアクチンプロモーターは、Extrachromosomal transposition of the transposable element Minos in embryos of the Gryllus bimaculatus Develop. Growth Differ., (2002), 44, 409-417に使用されている配列のものを用いることができる。
【００３３】
組み込む任意のＤＮＡとしては、特に制限はないが、任意の遺伝子や任意のＤＮＡ等である。任意の遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ等の他に、ヒト遺伝子、酵母転写遺伝子Ｇａｌ４等が挙げられる。ヒト遺伝子を組み込んだトランスジェニック不完全変態昆虫を作製することにより、遺伝子診断等に用いるヒト遺伝子を含む細胞または組織等を安価に得ることができる。任意のＤＮＡとしては、酵母転写遺伝子Ｇａｌ４の結合サイトＵＡＳ等が挙げられる。
【００３４】
ベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃ−３ｘＰ３−ＥＧＦＰ（ｐＢ［３ｘＰ３−ＥＧＦＰ］）には、Horn&Wimmer（2000）により用いられている、ｐＢ３ｘＰ３−ＥＧＦＰ ａｆを使用することができる。ｐｉｇｇｙＢａｃ−Ｇｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰ（ｐＢ［Ｇｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰ］）には、上記ベクターから３ｘＰ３−ＥＧＦＰを抜き出し、ｐＢＧｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰからＰＣＲで増幅した配列と入れ替えたものを用いればよい。
【００３５】
トランスポゾンは、自身が転移するために、転移酵素を必要とする。転移酵素は、トランスポゾンの逆位末端反復配列を認識する。それによってトランスポゾンがゲノム配列から切り出されて別の部位に挿入され、転移が引き起こされる。トランスポゼースｍＲＮＡ（ヘルパー）は、トランスポゾンの転移酵素のコード領域を有するものであればよく、特に制限はない。例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃの転移酵素のコード領域を有するｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ等が挙げられる。
【００３６】
トランスポゼースｍＲＮＡは、どのように調製されたものであってよいが、例えば、以下の方法により調製することができる。ｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ合成用プラスミドは、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行う。精製されたプラスミドは、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し直鎖化する。その後、フェノール／クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行う。精製物を鋳型ＤＮＡとして、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ）によりｍＲＮＡの合成をｉｎ ｖｉｔｒｏで行い、精製する。合成したｍＲＮＡは小分けに分注し、−８０℃で保存する。
【００３７】
不完全変態昆虫としては、蛹を経ずに幼虫が直接成虫に変態する昆虫であればよく、特に制限はないが、例えば、コオロギ、バッタ、イナゴ（バッタ目）、カマキリ（カマキリ目）、ゴキブリ、シロアリ（ゴキブリ目）、セミ、サシガメ、トコジラミ（カメムシ目）、トンボ（トンボ目）、アザミウマ（アザミウマ目）等が挙げられる。これらのうち、安価にサンプルが入手可能である、繁殖しやすい等の点からコオロギが好ましい。
【００３８】
コオロギとしては、フタホシコオロギ、ヨーロッパイエコオロギ等が挙げられる。フタホシコオロギは、亜熱帯に生息する不完全変態昆虫であり、日本では沖縄に生息する。成虫翅の付け根に一対の白班を持つことから和名ではこう呼ばれる。卵に休眠性がなく、適当な条件下で１年を通して生殖・発生を繰り返す。比較的飼育が容易で、温度、湿度、日照条件を最適条件にすることで年中繁殖が可能であるため、必要なサンプルが常に手に入ることが出来るので、トランスジェニック個体の作製に適している。
【００３９】
注入工程に先立ち、必要に応じて、不完全変態昆虫の卵の採卵、収集を行う。その後、卵の表面に付着している雑菌を取り除くため、また、インジェクション時のガラスキャピラリ等が折れるのを防止し、インジェクションを行いやすくするため、７０％エタノール等のアルコール等により卵の消毒処理を行うことが好ましい。アルコール等による消毒処理の後、水等でさらに洗浄すればよい。
【００４０】
その後、ドナーおよびヘルパーの溶液を、不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近にインジェクション（注入）する。例えば、キャピラリ等を直接卵に挿し、溶液を注入し、そのままインキュベーター等で保護すればよい。インジェクションを行う際にミネラルオイル等のオイルで卵を覆ってもよい。
【００４１】
なお、インジェクションの前に、卵をわずかに乾燥させ内圧を下げることが好ましい。これにより、インジェクション時の大量の卵黄漏れによるキャピラリの詰まりを防ぐことができる。乾燥を行いすぎると（過乾燥）、発生率が下がる場合がある。季節、作業する部屋の空調、空調等による風の当たり具合等により周囲環境の湿度が変化すると、乾燥度合いも左右される。空気が乾燥している場合は加湿器を使用してもよい。乾燥させた場合は、乾燥後にミネラルオイル等のオイルで卵を覆ってもよい。
【００４２】
例えば、コオロギでは、卵の腹側に初期胚が形成されるために、腹側よりインジェクションを行うと、胚を傷つけてしまい発生率が低下する場合がある。そのため、卵の背側よりインジェクションを行うことが好ましい。
【００４３】
インジェクション濃度は、例えば、超純水やＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）等の溶媒中、ドナー １．０μｇ／μＬ、ヘルパー １．０μｇ／μＬとすればよい。
【００４４】
インジェクションは、例えば、ガラスキャピラリをプラーで作製したもの等を用いて行うことができる。
【００４５】
卵の培養は、例えば、２８℃のインキュベーターまたは定温の部屋に入れることによって行うことができ、幼虫の飼育は、２８℃〜３０℃の飼育室で飼料等を用いて行うことができる。例えば、インジェクション直後のコオロギの卵は、２８℃のインキュベーターで４８時間〜６０時間飼育し、シャーレ等に卵を移し、さらに２８℃〜３０℃で孵化するまで飼育する。インジェクションを行う際にオイルで卵を覆った場合、卵をオイルから出して移動させることが好ましい。その理由は、オイルの中に居続けると発生が遅れる、孵化率が激減することがあるためである。孵化した幼虫は、２８℃〜３０℃の飼育室で成虫になるまで飼育すればよい。このような飼育方法により、生存率が向上する。
【００４６】
そして、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する（選択工程）。選択方法には、特に制限はないが、例えば、終齢幼虫の段階で個別に飼育し、それぞれの幼虫を野生型と交配させることにより容易にヘテロ個体を維持することができる。または、集団で飼育し交配させることにより、個別飼育の手間が省ける。任意のＤＮＡが挿入されたことは、ＥＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子が挿入されている場合は、交配させて得られた卵からＧＦＰの蛍光を観察すればよい。３ｘＰ３プロモーターにより眼でＧＦＰなどの蛍光タンパク質が発現している場合は、幼虫期に眼でのＧＦＰの蛍光を指標に簡便にスクリーニングできる。
【００４７】
以上のような方法により、形質転換の効率、成長率が高く、トランスジェニック不完全変態昆虫を作製することができる。
【００４８】
コオロギ以外の不完全変態類昆虫に関してもまず、ｖａｓａの発現を調べる等により、卵における始原生殖細胞の部位を特定し、その発現部位付近にインジェクションを行うことにより、形質転換の効率、成長率が高く、トランスジェニック不完全変態昆虫を作製することができる。
【００４９】
例えば、所望のタンパク質等を発現する遺伝子を組み込んだトランスジェニック不完全変態昆虫を作製し、繁殖させることにより、細胞上あるいは組織上で発現した所望のタンパク質等を得ることができる。また、病理学的診断や、抗体医薬の評価等の創薬スクリーニング等に利用可能な、所望のタンパク質等を含む組織等を得ることができる。これらは、培養等の手法に比べると安価に得ることができ、不完全変態昆虫として繁殖性の高いコオロギ等を用いれば、より安価に得ることができる。
【００５０】
また、トランスジェニック不完全変態昆虫を作製することにより、遺伝子の機能や転写調節領域の解析等の幅広い研究が期待される。不完全変態類であるフタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus,Gb）をモデル昆虫として、形態形成に関連する遺伝子の機能解析を行うことにより、形態形成におけるメカニズムを分子レベルで解明することが可能となる。遺伝子の機能解析法として、遺伝子の過剰発現やＲＮＡｉなどがあるが、これらの研究を進めて行く上で、本実施形態に係るトランスジェニック個体の作製方法が有用である。また、害虫等の研究には、トランスジェニック等の遺伝子組換えの技術が必要不可欠であるが、これまでトランスジェニック個体の作製が確立されていなかった不完全変態昆虫でもトランスジェニックによる研究を行うことができるようになる。
【００５１】
＜トランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法＞
本発明の実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、を含む。詳細は、上記トランスジェニック不完全変態昆虫と同様である。
【００５２】
本方法により、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体の卵を作製することが可能となる。
【００５３】
＜トランスジェニック不完全変態昆虫＞
本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫は、任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であり、トランスジェニックコオロギであることが好ましい。
【００５４】
本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫は、どのような方法により作製されたものであってもよい。また、本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製されるものである。
【００５５】
本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫としては、蛹を経ずに幼虫が直接成虫に変態する昆虫のトランスジェニック個体であればよく、特に制限はないが、例えば、トランスジェニックコオロギ、トランスジェニックバッタ、トランスジェニックイナゴ、トランスジェニックゴキブリ、トランスジェニックシロアリ、トランスジェニックセミ、トランスジェニックカマキリ、トランスジェニックトンボ、トランスジェニックサシガメ、トランスジェニックトコジラミ、トランスジェニックアザミウマ等が挙げられる。これらのうち、安価にサンプルが入手可能である、繁殖しやすい等の点からトランスジェニックコオロギが好ましい。
【００５６】
＜キット＞
本実施形態に係るキットは、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含む。
【００５７】
また、本実施形態に係るキットは、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製したトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含む。
【００５８】
キットとしては、トランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を利用するものであればよく、特に制限はないが、分析用キット、診断用キット、検出用キット、検査用キット等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６０】
コオロギ細胞質アクチンプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰまたは赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄを連結したＤＮＡ配列の両末端にｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを持つプラスミド（ｄｏｎｏｒ）と、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写合成したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースｍＲＮＡ（ｈｅｌｐｅｒ）をコオロギの卵に共注入した。ＤＮＡを導入した卵から得られたコオロギと野生型を交配させ、次世代の卵の蛍光を観察したところ、ＤＮＡを導入した卵から得られた成虫の約１０％から蛍光を発する個体が得られた。また、蛍光が観察され飼育し羽化したメスと野生型のオスとを交配させ得られた卵は、蛍光を発した。従って、ｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを介した蛍光タンパク質遺伝子のゲノムへの挿入が起こっていると考えられ、トランスジェニックコオロギの作製に成功した。蛍光を発する卵を用いて、細胞移動を観察したところ胚原基形成過程における細胞のダイナミックな移動の様子が明らかとなった。ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ（ｏｔｄ）またはｃａｕｄａｌ（ｃａｄ）のＲＮＡ干渉を行うと、この過程に異常を生ずることが示された。また、コオロギの眼に特異的に発現するプロモーター（３ｘＰ３）により発現するＥＧＦＰを用いて、ＥＧＦＰが発現するトランスジェニックコオロギの作製に成功した。以下、詳細に述べる。
【００６１】
＜実施例１＞
［材料：フタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus）］
実験動物とした昆虫は、直翅目キリギリス亜目コオロギ科に属するフタホシコオロギである。通常、２８℃、湿度７０％、蛍光１０時間／日照射の下で飼育した。本実施例では、この条件下で飼育されたフタホシコオロギとその卵を用いた。この条件下で、フタホシコオロギ卵は、産卵後約１１日で孵化し、その後、約５週間で８回の脱皮を経て成虫となり、通常１ヶ月間生きる。メス成虫は最終脱皮後、およそ３日目から交尾活動を開始し、およそ５日目から通常１日１００個前後の卵を産む。産卵は約３週間行われ、生涯で１５００個以上の卵を産む。卵は直径２．５ｍｍ〜３．０ｍｍ、短径約０．８ｍｍ〜１．０ｍｍの米粒状である。昆虫卵としては大型の部類に属し、卵殻が透明なため、卵黄が少なくなり眼の形成される発生後期では内部の様子を観察しやすい。
【００６２】
［始原生殖細胞の部位の特定］
始原生殖細胞の遺伝子マーカーであるｖａｓａのｍＲＮＡとｐｒｏｔｅｉｎの発現部位を調べた。操作は、論文（Dynamic expression patterns of vasa during embryogenesis in the cricket Gryllus bimaculatus (2008) Dev. Genes Evol., 218, 381-387）に記載してある通りに行った。具体的には、まずコオロギ７齢幼虫からｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いて抽出した。その後、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡからｍＲＮＡを精製するため、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ＜ｓｕｐｅｒ＞ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。精製したｍＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒとともに逆転写反応に使用し、ｃＤＮＡを得た。コオロギのｖａｓａ遺伝子ホモログをクローニングするために、縮重ＰＣＲを行った。用いたｐｒｉｍｅｒは、Ｄｅｇ−Ｆ１（5’-CCG GAT CCA TGG CNT GYG CNC ARA CNG-3’（配列番号１））と、Ｄｅｇ−Ｒ１（5’-CCA AGC TTA ANC CCA TRT CAN RCA TNC KRT C-3’（配列番号２））である。これらのｐｒｉｍｅｒは、他の生物と保存性の高い領域である、ＭＡＣＡＱＴＧとＤＲＭＬＤＭＧＦに設計した。Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法を用いて、未知領域の５’と３’末端を決定した。得られたコオロギｖａｓａのｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録した（アクセッション番号：ＡＢ３７８０６５）。得られたコオロギｖａｓａの配列をもとに、ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｗ−ＩＳＨ）法のプローブを作製した。コオロギ卵は、市販のハイター液により卵殻を剥がし、４％ Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＦＡ／ＰＢＳ）に等量のｈｅｐｔａｎｅを重層した固定液を用いて、室温で２０分間固定を行った。その後、２０％メタノール／ＰＢＴ（ＰＢＳに終濃度０．１％となるようｔｗｅｅｎを加える）により固定液を洗浄した。コオロギ卵へのプローブの浸透性を高めるために、先の鋭いタングステン針を用いてコオロギ卵の周囲を８カ所程度突き刺した。この処理を行ったコオロギ卵を用いて、Ｗ−ＩＳＨの処理を行った。コオロギでは卵の最後端から２０％上流位置（卵全長を１００％とする）にその発現が認められた。そこで、ｖａｓａの発現位置である、卵の後端より２０％の位置を狙いインジェクションを行うこととした。
【００６３】
［卵へのインジェクション］
（両面テープ付きスライドガラスの作製）
両面テープをスライドガラスに貼付し、ピンセットでしごいてなだらかにした。ビニールテープで土手を作製し、両面テープ付きスライドガラスの粘着テープに重ねて貼付けた。土手のビニールテープは４枚重ねた。この時、ビニールテープを引っ張り過ぎると、土手の機能を果たさないので注意した。
【００６４】
（ガラスキャピラリ作製）
ガラスキャピラリ １ ｖｉａｌ ３１／２ ｃａｐｉｌｌａｒｙ（Ｄｏｒａｍｍｏｎｄ）をプラーで以下のプログラムで作製した。
HEAT 743, PULL 0, VEL 20, TIME 250
HEAT 743, PULL 0, VEL 20, TIME 250
HEAT 743, PULL 0, VEL 20, TIME 250
HEAT 743, PULL 70, VEL 25, TIME 150
【００６５】
作製後、ガラスキャピラリの先端を折るため、インジェクタにセットした。新しいキャピラリを半分に折り、スライドガラスにセットした。顕微鏡にマウントし、顕微鏡のステージを移動させ、キャピラリ端とインジェクションキャピラリの先端とを近づけて先端同士を接触させ、キャピラリを任意の太さに折った。完成したガラスキャピラリを安全に外した。
【００６６】
（湿箱の作製）
角シャーレに三つ折りにしたコンフォートタオルを敷き、水で濡らした。角シャーレを傾け、余分な水は切っておいた。
【００６７】
（採卵）
シャーレに２枚のキッチンペーパを任意の大きさに切り敷いた。キッチンペーパを脱イオン水で濡らし、余分な水分は除した。そして、キッチンペーパでフタをした。２時間採卵し、２８℃に設定したインキュベーターで１時間インキュベートした。
【００６８】
（卵の収集）
水を張ったプラスチック容器（タッパー（登録商標））に採卵した卵をキッチンペーパから落し、茶こしで集めた。乾燥を防ぐため、再び水の張ったプラスチック容器に茶こしをつけた。
【００６９】
（卵の洗浄）
卵の表面に付着している雑菌を取り除くため、インジェクション時にガラスキャピラリが折れるのを防止し、インジェクションを行いやすくするため、７０％エタノール処理を行った。７０％エタノール→水→水の洗浄系列を入れて準備しておいた。７０％エタノール液には７秒程度、茶こしを揺すりながら浸した。素早く水で洗い流し、再び水の入ったプラスチック容器に茶こしを浸けて乾燥を防いだ。
【００７０】
（粘着テープへの卵の配置）
コンフォートタオルを水で濡らし、手で軽くしぼって水気を切った。作業台にコンフォートタオルを敷いた。茶こしの水分を吸い取った。茶こしを裏返して裏側をはじき、卵を濡れたコンフォートタオルの上に落とした。水で濡らした絵筆で卵を転がすようにして、バラバラに分離させた。２００μＬチップの先に粘着テープを付けた卵並べ器具を使用して、卵を粘着テープ付きスライドガラスに並べた。後で卵の背側にインジェクションできるように配置した。卵はバナナ型“く”の形をしているが、飛び出ている方が腹側であり、腹側にインジェクションを行うと胚発生が悪くなることがある。粘着テープ付きスライドガラスの片側におよそ１５個の卵を並べ、一枚でおよそ３０個の卵をインジェクションに使用した。
【００７１】
（卵の乾燥）
卵をわずかに乾燥させて内圧を下げることで、インジェクション時の大量の卵黄漏れによるキャピラリの詰まりを防ぐことを目的とする。乾燥を行いすぎると（過乾燥）、発生率が下がることがある。湿度が変化すると、乾燥具合も左右され、風が直接当たると過乾燥になるので注意が必要である。空気が乾燥している場合は加湿器を使用してもよい。卵を並べ終わったら、８分程度放置した。この間を乾燥時間とした。規定の時間が過ぎた後、ミネラルオイルで卵を覆った。このとき、ミネラルオイルがビニールテープ土手の下から漏れていないかチェックした。漏れた場合、卵が乾燥して発生率が悪くなることがある。
【００７２】
（ドナープラスミドの作製、ヘルパーｍＲＮＡの作製）
ドナープラスミドの作製ならびにヘルパーｍＲＮＡの作製は、論文（piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus (2004) Develop. Growth Differ., 46, 343-349）に記載されている通りに行った。
【００７３】
ドナープラスミドｐＢＧａｃｔ−ｅＧＦＰは、以下の方法で作製した。まずｐＧａｃｔ−ｅＧＦＰプラスミドよりコオロギアクチンプロモーターとＥＧＦＰ部分作製するために、ＰｓｔＩもしくはＢｇｌＩＩサイトが付加したｐｒｉｍｅｒ（5’-aattctgcagcagttccttcaaatgttcaaaat-3’（配列番号３）と5’-aattagatctgaactggaacaacactcaacccta-3’（配列番号４））を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩ処理し、断片を得た。ドナープラスミドｐＢ３ｘＰ３−ｅＧＦＰａｆは、Ｅ．Ｗｉｍｍｅｒから入手した（Horn, C., Wimmer, E. A. 2000. A versatile vector set for animal transgenesis. Dev. Genes Evol. 210, 630-637）。ｐＢ３ｘＰ３−ｅＧＦＰａｆは、制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩで処理し、このベクターに先ほどのＰＣＲ断片を組み込み、ドナープラスミドｐＢＧａｃｔ−ｅＧＦＰを作製した。
【００７４】
プラスミドｐＢＧａｃｔ−ｅＧＦＰは、文献（piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus (2004) Develop. Growth Differ., 46, 343-349）に記載されている。また、プラスミドｐＢ３ｘＰ３−ｅＧＦＰａｆは、文献（Horn, C., Wimmer, E. A. 2000. A versatile vector set for animal transgenesis. Dev. Genes Evol., 210, 630-637.）に記載されている。
【００７５】
ヘルパーｍＲＮＡ合成の際のプラスミドｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃは、以下のように作製した。ｐｉｇｇｙＢａｃのｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅ（ＯＲＦ）は、ｐｒｉｍｅｒ（5’-ccttctgcagtatgggatgttctttagacga-3’（配列番号５）と5’-ccaaggatcctttagtcagtccagaaacaac-3’（配列番号６））を用いてｐｈｓｐ−ｐＢａｃ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｈａｒｒｅｌｌから入手した。Handler, A. M., Harrell, R. A. 1999. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Mol. Biol., 8, 449-457.）を鋳型ＤＮＡとしＰＣＲにより増幅した。ｐｒｉｍｅｒにはＰｓｔＩもしくはＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅを付加しているので、ＰＣＲ産物は制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩにより処理した。さらに、ｍＲＮＡ合成用プラスミドｐＳＰ６４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）も制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩにより処理し、ＰＣＲ産物を組み込みｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ合成用プラスミドｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃを作製した。ｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡの合成用鋳型ＤＮＡは、ｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（１：１，ｖ／ｖ）抽出、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出、エタノール沈殿により精製した。得られた鋳型ＤＮＡの１μｇをｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標） ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）によりｍＲＮＡの合成をｉｎ ｖｉｔｒｏで行い、精製した。得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製し、終濃度１μｇ／μＬに調製した。保存は小分けに（２μＬ）分注し、−８０℃で保存した。
【００７６】
プラスミドｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃは、文献（piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus (2004) Develop. Growth Differ., 46, 343-349）に記載されている。
【００７７】
（キャピラリへのインジェクション溶液の充填）
ドナー、ヘルパーの終濃度をどちらとも１μｇ／μＬにした（溶媒：水）。マイクロピペット（ピペットマン（登録商標））を用いて、２〜３μＬのインジェクション溶液を、作製したキャピラリへ充填した。詰まりにくくするために、遠心処理を行ってもよい。インジェクション溶液を充填したキャピラリの先端は詰まりやすいため、素早くオイル中に浸し、乾燥を防いだ。
【００７８】
（卵へのインジェクション）
光学顕微鏡で卵の輪郭に焦点を合わせた。焦点が合うと輪郭がはっきりと黒くなる。インジェクション部位が視野に来るようにステージを移動した。インジェクション部位は、卵の後端から２０％付近（卵全長を１００％とする）の背側とした。注射筒をわずかに押し、キャピラリ先からインジェクション溶液が漏れるのを確認した。溶液を少し出しながら卵にキャピラリを刺した。注射筒に力をかけ、卵内部に溶液が入るのを確認した。そして、力をかけながらキャピラリを卵から引き抜いた。潰れた卵、インジェクションを失敗した卵は取り除いた。
【００７９】
（インジェクション後の操作）
湿らせたコンフォートタオルが入っている湿箱の中にインジェクション後のスライドガラスをいれた。湿箱を２８℃に設定したインキュベーターに入れ、飼育した。インジェクション後２、３日経過すると卵割が観察できるので発生率を調べた。２日後にＥＧＦＰ、３日後にＤｓＲｅｄの蛍光を観察した。そして、濡らしたキッチンペーパの上でインジェクションした卵を転がしてミネラルオイルを除去し、濡らしたキッチンペーパを敷いたシャーレで飼育した。
【００８０】
［結果］
ＥＧＦＰがｄｏｎｏｒの場合、スライドガラスに１１４個の卵を並べ、８８個の卵にインジェクションをした。その内、３９個が発生、２３個から蛍光が観察された。羽化したコオロギは１５匹となり、４匹のメスから蛍光を発する卵が得られた。図２に、３ｘＰ３-ＥＧＦＰトランスジェニックコオロギの写真を示す。発生した卵からのトランスジェニックコオロギの作製効率は、（４／３９）×１００＝１０．２％であった。ＤｓＲｅｄがｄｏｎｏｒの場合、スライドガラスに２２２個の卵を並べ、１７９個の卵にインジェクションをした。その内、４６個が発生、１１個から蛍光が観察された。羽化したコオロギは１４匹となり、３匹のメスから蛍光を発する卵が得られた。発生した卵からのトランスジェニックコオロギの作製効率は、（３／４６）×１００＝６．５％であった。
【００８１】
［ＲＮＡｉ法による解析］
（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の作製）
ｄｓＲＮＡ合成のためのｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡから、Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔ７ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）により３７℃、１５時間反応させ、ＲＮＡを合成した。その後、ＤＮａｓｅ処理を行い、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを除去した。次に、フェノール／クロロホルム処理、イソプロパノール沈澱を行い、ＴＥ（１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。そして、１０００ｍＬビーカに水４００ｍＬを入れ、ガスバーナで加熱して沸騰させ、チューブごと５分間浸し、ＲＮＡを変性させた。その後、ビーカごと火元から外し、お湯が室温になるまでアニーリングさせ、ｄｓＲＮＡとした。そして、再びエタノール沈澱を行い、ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｍＱ）に２０μＭになるように溶解し、ｄｓＲＮＡ溶液として保存した。インジェクションを行う際の濃度は２０μＭに希釈した。
【００８２】
（メス成虫へのｄｓＲＮＡの注入）
成虫へのｄｓＲＮＡ注入は、インジェクション装置（Ｎｏｎｏｊｅｃｔ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いた。ミネラルオイルをキャピラリに充填し、インジェクション装置に取り付けた。そして、ミネラルオイルを排出し、ｄｓＲＮＡを吸入した。排出量は６９．０ｎＬ、Ｆａｓｔに設定した。コオロギをシャーレに入れ、３０分程度氷上麻酔を行った。コオロギをインジェクション台に腹ばいにしておき、Ｔ３の脚の付け根の白い柔らかいところにキャピラリを差し込み、ｄｓＲＮＡが６９ｎＬ排出されるように設定したボタンを１１回押し、ｄｓＲＮＡを成虫に注入した。その後、静かにキャピラリを体からはずした。
【００８３】
（共焦点レーザ顕微鏡Ｃ１ｓｉ−Ｒｅａｄｙを用いたｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ｍｏｖｉｅの撮影）
マツナミガラスボトムディッシュに卵を並べ、顕微鏡の台に設置した。機械の設定として、Ａｒレーザ（４８８ｎｍ）、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ５１５／３０、レーザの強さ６．０％、ゲイン１２５で行った。ｓｔｅｐ ｓｉｚｅは、６．０〜７．０μｍにして、ｓｔｅｐ数を５０枚以内にした。３０分毎に撮影した。Ｍｏｖｉｅは、１秒で１時間経過するように設定した。
【００８４】
［結果］
卵のときに蛍光が観察され、羽化したメスと野生型のオスを交配させ得られた卵は蛍光を発した。図３に、採卵後、約４２時間のトランスジェニック卵の写真を示す。ＤＮＡを導入した卵から得られた成虫から、蛍光を発する個体が得られた。図３（Ａ）は、ＥＧＦＰから得られたトランスジェニック個体を示し、図３（Ｂ）は、ＤｓＲｅｄから得られたトランスジェニック個体を示す。卵の後方で光っているのは、コオロギの胚である。
【００８５】
蛍光を発する卵を、共焦点レーザ顕微鏡を用いてｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ｍｏｖｉｅにしたところ、胚原基形成過程における細胞のダイナミックな移動の様子が明らかになった。まず後方から細胞が表面に現れて全体に広がった。分裂をくり返し、後方の細胞が胚原基を形成するために集まった。しかし、前方の細胞は、後方の細胞のようなダイナミックな動きはせず、その場からあまり動かなかった。
【００８６】
ｃａｄをＲＮＡ干渉した場合、胚原基形成の細胞移動がコントロールとは異なっていた。そのうえ、以前にわかっていた胚後方が伸長しないという表現型の様子も確認できた。ｏｔｄをＲＮＡ干渉した場合、全体に細胞が広がるが、その後、細胞移動、細胞分裂は行われなかった。
【００８７】
図４は、ＥＧＦＰが観察できるトランスジェニック卵を使用して、ｃａｄをＲＮＡ干渉により機能阻害し、コオロギ胚の発生過程を示す写真である。ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅによりｃａｄの胚発生初期の様子をＥＧＦＰの蛍光で現している。上の卵がｃａｄをＲＮＡ干渉した卵であり、下の卵はコントロールである。採卵後、（Ａ）１６時間、（Ｂ）１８時間、（Ｃ）２０時間、（Ｄ）２２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）２６時間、（Ｇ）２８時間、（Ｈ）３０時間、（Ｉ）３４時間、（Ｊ）３６時間、（Ｋ）３８時間、（Ｌ）４２時間に撮影された写真である。（Ｈ）〜（Ｋ）の矢印は胚の後方部位を示している。これらの図より、明らかに後方の伸長が少しだけしか起こらないことがわかった。
【００８８】
図５は、ＥＧＦＰが観察できるトランスジェニック卵を使用して、ｏｔｄをＲＮＡ干渉により機能阻害し、コオロギ胚の発生過程を示す写真である。上の卵がコントロールで、下の卵がｏｔｄをＲＮＡ干渉した卵になる。採卵後、６時間から２４時間までを撮影した。撮影は卵の腹側から行い、写真の右が卵の後方を示す。コントロールでは１０時間を過ぎると、エネルギド（ＥＧＦＰの蛍光で示される輝点）が卵表面に移動し、胞胚期を形成する。そしてエネルギドが盛んに分裂し、卵表面を覆う。その後、細胞化が起こり、１８時間を過ぎると、各細胞が後方に集まり胚が形成される。しかし、ｏｔｄのＲＮＡｉ干渉を行うと、卵表面にエネルギドは移動してくるが（１１時間）、それらは細胞移動も細胞分裂も行われず、胚が形成されていない。２４時間ではコントロールでは初期胚原基が形成されているが、ｏｔｄの影響で胚が形成されていない。
【００８９】
以上のように、ｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを介した蛍光タンパク質遺伝子のゲノムへの挿入が起こっており、次世代にも受け継がれているのでトランスジェニックコオロギの作製に成功したと考えられる。
【００９０】
現在まで、長胚型のショウジョウバエでは卵全体に濃度勾配をとり細胞化が起こっている。短胚型のコオロギでも、卵全体に濃度勾配をとり前方の細胞からも胚原基を形成するのに関与するのではないかと考えられてきた。しかし、前方の細胞が胚原基を形成するのには必要ではなかった。
【００９１】
ｃａｄをＲＮＡ干渉することで、胚原基形成の長さ、細胞の接着の様子が異常であることがわかった。これは、ｃａｄが後方領域に重要な遺伝子であり、強い表現型であれば頭部だけになる。胚原基が短くなる、後方の伸長が行われないことは以前にも他の実験でわかっていた。今回、細胞が移動して集まるところから異常があるとわかった。今後、形態異常が起こる他の遺伝子でも有効な解析手段だと示唆される。
【００９２】
ｏｔｄは、全体に斑点状の蛍光になるが胚が形成されなかった。この後に採卵した卵からは初めから全体に斑点状の蛍光が見られた。そのため、卵巣を調べたところ、コオロギ体内からすでに斑点状の蛍光が見られた。コオロギ体内にある卵なので、受精はしていないと思われる。受精をしなくても少しは分裂が起こることは知られているが、全体に広がるほど分裂はしないはずである。受精をせずに分裂するので、ｏｔｄが受精するまでの分裂を抑えているのではないかと考えられる。ｏｔｄの表現型として前後軸を決める、頭部形成に関与する遺伝子だと知られているが、細胞分裂の開始の切り替えの役割、卵巣からはじまる卵形成の異常など卵を産む前から影響を及ぼすものと考えられる。
【００９３】
このように、不完全変態類のフタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus）のトランスジェニック個体の作製法を確立した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫は発生様式の違いから、完全変態類と不完全変態類に大別される。ショウジョウバエ等の完全変態類については、その形態形成についてよく研究されているが、不完全変態類についての研究はほとんどされていない。しかし、害虫の中には、バッタ、イナゴ、ゴキブリなどの不完全変態昆虫もおり、これらの対策に遺伝子組換えの技術は必要不可欠になっている。また、不完全変態の昆虫を天敵昆虫として利用する場合にも、遺伝子組換えの技術は必要不可欠になっている。
【０００３】
遺伝子組換えの一つである、外部から特定の遺伝子を導入したトランスジェニックにおいて、外来ＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれる効率が低いため、その効率を高めるためには特別な手段を利用する必要がある。その手段として現在普及しているのが、ＤＮＡ型トランスポゾンである。ＤＮＡ型トランスポゾンは、ＤＮＡからトランスポゼースにより切り出され、別のＤＮＡのターゲット配列に挿入される。ＤＮＡ型トランスポゾンがゲノムＤＮＡに挿入する性質を利用したトランスジェニック生物作製ならびに挿入変異体の作製は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）におけるＰエレメントの系に代表されるように、極めて有効な手法である。実際、トランスポゾンは他のトランスジェニック完全変態昆虫の作製にも用いられている。カイコ、ショウジョウバエ、カなども、トランスポゾンを用いてトランスジェニック個体が作製されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃの転移酵素のコード領域を有するｍＲＮＡ、および任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをカイコ卵に注入し、そのカイコ卵から生じたカイコの中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニックカイコを選択するトランスジェニックカイコの製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２５９７７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、コオロギに代表される不完全変態の昆虫では、トランスジェニック個体の作製が確立されていない。
【０００７】
本発明は、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体の卵を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法である。
【０００９】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法において、前記不完全変態昆虫が、コオロギであることが好ましい。
【００１０】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法において、前記任意のＤＮＡが、ヒト遺伝子であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法である。
【００１２】
また、本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製されるトランスジェニック不完全変態昆虫である。
【００１３】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫において、前記不完全変態昆虫が、コオロギであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であるトランスジェニック不完全変態昆虫である。
【００１５】
また、前記トランスジェニック不完全変態昆虫において、前記不完全変態昆虫が、コオロギであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製したトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むキットである。
【００１７】
また、本発明は、任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であるトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むキットである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体の卵を作製するトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法、トランスジェニック不完全変態昆虫およびキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態におけるインジェクション方法を示す概略図である。
【図２】本発明の実施例における、３ｘＰ３−ＥＧＦＰトランスジェニックコオロギを示す図である。
【図３】本発明の実施例における、採卵後約４２時間のトランスジェニック卵を示す図である。
【図４】本発明の実施例における、ＥＧＦＰが観察できる卵にｃａｄをＲＮＡ干渉し、その発生過程を示す図である。
【図５】本発明の実施例における、ＥＧＦＰが観察できる卵にｏｔｄをＲＮＡ干渉し、その発生過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
＜トランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法＞
本発明の実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含む。
【００２２】
トランスジェニック個体作製において外来ＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれる効率が低いため、ＤＮＡ型トランスポゾンが有用である。例えば、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃは、鱗翅目昆虫である蛾の一種イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）から採られ、幅広い生物で転移することが確認されている。ｐｉｇｇｙＢａｃは、ＴＴＡＡ属ともいわれ、ゲノム中のＴＴＡＡ配列中に転移する。中央部にあるトランスポゼース遺伝子と、その両端に存在する１３ｂｐの逆向き反復配列から構成されている。この原理を利用し、トランスポゼースをコードするベクターと、外来遺伝子をコードするベクターとを不完全変態昆虫に共注入すれば、トランスポゼースによって切り出された外来遺伝子が、不完全変態昆虫のゲノム上に挿入され、トランスジェニック不完全変態昆虫が作製されることになる。
【００２３】
これらは、一般的にはＤＮＡ型トランスポゾン（ドナー（ｄｏｎｏｒ））のヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）としてプラスミドを用いた系で作製されているが、本実施形態では、不完全変態昆虫であるコオロギの細胞質よりクローニングされたアクチンプロモーター（ａｃｔｉｎ）等のプロモーターのプラスミドに代わり、ｍＲＮＡを用いる。すなわち、プロモーター下で任意の遺伝子が発現するようにしたトランスポゾンベクター（ドナー）と、トランスポゼース供給源としてのトランスポゾン ｍＲＮＡ（ヘルパー）とを卵にインジェクションする。例えば、コオロギアクチンプロモーター下で任意の遺伝子が発現するようにしたｐｉｇｇｙＢａｃベクター（ドナー）と、トランスポゼース供給源としてのｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ（ヘルパー）とをコオロギ卵に注入（インジェクション）することにより、トランスジェニックコオロギを作製することができる。
【００２４】
トランスジェニック生物の作製において、昆虫で初めてトランスジェニック個体を作製できた完全変態昆虫であるハエの場合、次世代に効率よくトランスポゾンを転移させるため、始原生殖細胞（primordial germ cell）が形成される卵の後極にトランスポゾンのインジェクションを行っている。また、この知見を利用して、同じ完全変態昆虫であるカについてもトランスジェニック個体の作製に成功している。しかし、不完全変態昆虫においては、この始原生殖細胞の形成様式が多様化しており、どの位置に始原生殖細胞が形成されるかさえも分かっていない場合がほとんどである。したがって、効率の良いトランスジェニック作製が確立できていなかった。
【００２５】
そこで、本方法では、まず、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する（部位特定工程）。始原生殖細胞の部位を特定する方法としては、特に制限はないが、例えば、始原生殖細胞の遺伝子マーカーであるｖａｓａのｍＲＮＡとｐｒｏｔｅｉｎの発現部位を調べて、始原生殖細胞の部位を特定する方法等が挙げられる。実施例で示すように、例えばｖａｓａのｍＲＮＡとｐｒｏｔｅｉｎの発現部位を調べる方法により、コオロギでは卵の最後端から２０％上流位置（卵全長を１００％とする）にその発現が認められた。そこで、ｖａｓａの発現位置である、卵の後端より２０％の位置を狙い、ＤＮＡ型トランスポゾンのインジェクションを行うことで効率の良いトランスジェニック個体の作製が可能となった。
【００２６】
次に、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する（注入工程）。
【００２７】
プロモーターの下流に連結した外来ＤＮＡ配列の両末端にトランスポゾンエレメントを有するＤＮＡ型トランスポゾンのプラスミド（ドナー）、および、トランスポゼース供給源としてのトランスポゼースｍＲＮＡ（ヘルパー）を調製する。そして、受精卵における前記特定した部位付近にドナーとヘルパーとをインジェクションする。
【００２８】
ドナーは、プロモーターの下流に任意のＤＮＡを連結したＤＮＡ配列の両末端にトランスポゾンエレメントを有するプラスミドであればよく、特に制限はない。図１は、本実施形態におけるインジェクション方法を示す概略図である。図１には、ドナーの構造の一例を示してある。ドナーは、例えば、コオロギ細胞質アクチンプロモーター（Ｇｂ’ａｃｔ）の下流に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰを連結したＤＮＡ配列（Ｇｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰ）の両末端にｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを持つプラスミドである。または、ドナーは、コオロギの眼に発現する３ｘＰ３プロモーター（３ｘＰ３）の下流に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰを連結したＤＮＡ配列（３ｘＰ３−ＥＧＦＰ）の両末端にｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを持つプラスミドである。ＥＧＦＰの代わりに赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄも用いてもよい。
【００２９】
ドナーは、どのように調製されたものであってもよいが、例えば、プラスミド精製キットであるＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製することができる。
【００３０】
トランスポゾンは、細胞内においてゲノム上の位置を移動することができる塩基配列として知られており、しばしば、遺伝子導入用のベクターとして使用されるものである。トランスポゾンは、遺伝子導入用のベクターとして使用可能なものであれば特に制限されるものではない。また、トランスポゾンには、ＤＮＡ断片が直接転移するＤＮＡ型と、転写と逆転写の過程を経るＲＮＡ型があるが、そのいずれかに限定されるものではない。トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃの他にも、Ｍｉｎｏｓ、Ｍａｒｉｎｅｒ、Ｈｅｒｍｅｓなどが挙げられる。
【００３１】
プロモーターとしては、任意のＤＮＡを発現させたい部位に応じて選択すればよく、特に制限はない。例えば、コオロギの細胞質に特異的に発現するコオロギアクチンプロモーター（Ｇｂ’ａｃｔ）、コオロギの眼に特異的に発現する３ｘＰ３プロモーター、高温処理により遺伝子発現の制御が可能になるｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ プロモーター等が挙げられる。
【００３２】
コオロギアクチンプロモーターは、Extrachromosomal transposition of the transposable element Minos in embryos of the Gryllus bimaculatus Develop. Growth Differ., (2002), 44, 409-417に使用されている配列のものを用いることができる。
【００３３】
組み込む任意のＤＮＡとしては、特に制限はないが、任意の遺伝子や任意のＤＮＡ等である。任意の遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ等の他に、ヒト遺伝子、酵母転写遺伝子Ｇａｌ４等が挙げられる。ヒト遺伝子を組み込んだトランスジェニック不完全変態昆虫を作製することにより、遺伝子診断等に用いるヒト遺伝子を含む細胞または組織等を安価に得ることができる。任意のＤＮＡとしては、酵母転写遺伝子Ｇａｌ４の結合サイトＵＡＳ等が挙げられる。
【００３４】
ベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃ−３ｘＰ３−ＥＧＦＰ（ｐＢ［３ｘＰ３−ＥＧＦＰ］）には、Horn&Wimmer（2000）により用いられている、ｐＢ３ｘＰ３−ＥＧＦＰ ａｆを使用することができる。ｐｉｇｇｙＢａｃ−Ｇｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰ（ｐＢ［Ｇｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰ］）には、上記ベクターから３ｘＰ３−ＥＧＦＰを抜き出し、ｐＢＧｂ’ａｃｔ−ＥＧＦＰからＰＣＲで増幅した配列と入れ替えたものを用いればよい。
【００３５】
トランスポゾンは、自身が転移するために、転移酵素を必要とする。転移酵素は、トランスポゾンの逆位末端反復配列を認識する。それによってトランスポゾンがゲノム配列から切り出されて別の部位に挿入され、転移が引き起こされる。トランスポゼースｍＲＮＡ（ヘルパー）は、トランスポゾンの転移酵素のコード領域を有するものであればよく、特に制限はない。例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃの転移酵素のコード領域を有するｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ等が挙げられる。
【００３６】
トランスポゼースｍＲＮＡは、どのように調製されたものであってよいが、例えば、以下の方法により調製することができる。ｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ合成用プラスミドは、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行う。精製されたプラスミドは、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し直鎖化する。その後、フェノール／クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行う。精製物を鋳型ＤＮＡとして、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ）によりｍＲＮＡの合成をｉｎ ｖｉｔｒｏで行い、精製する。合成したｍＲＮＡは小分けに分注し、−８０℃で保存する。
【００３７】
不完全変態昆虫としては、蛹を経ずに幼虫が直接成虫に変態する昆虫であればよく、特に制限はないが、例えば、コオロギ、バッタ、イナゴ（バッタ目）、カマキリ（カマキリ目）、ゴキブリ、シロアリ（ゴキブリ目）、セミ、サシガメ、トコジラミ（カメムシ目）、トンボ（トンボ目）、アザミウマ（アザミウマ目）等が挙げられる。これらのうち、安価にサンプルが入手可能である、繁殖しやすい等の点からコオロギが好ましい。
【００３８】
コオロギとしては、フタホシコオロギ、ヨーロッパイエコオロギ等が挙げられる。フタホシコオロギは、亜熱帯に生息する不完全変態昆虫であり、日本では沖縄に生息する。成虫翅の付け根に一対の白班を持つことから和名ではこう呼ばれる。卵に休眠性がなく、適当な条件下で１年を通して生殖・発生を繰り返す。比較的飼育が容易で、温度、湿度、日照条件を最適条件にすることで年中繁殖が可能であるため、必要なサンプルが常に手に入ることが出来るので、トランスジェニック個体の作製に適している。
【００３９】
注入工程に先立ち、必要に応じて、不完全変態昆虫の卵の採卵、収集を行う。その後、卵の表面に付着している雑菌を取り除くため、また、インジェクション時のガラスキャピラリ等が折れるのを防止し、インジェクションを行いやすくするため、７０％エタノール等のアルコール等により卵の消毒処理を行うことが好ましい。アルコール等による消毒処理の後、水等でさらに洗浄すればよい。
【００４０】
その後、ドナーおよびヘルパーの溶液を、不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近にインジェクション（注入）する。例えば、キャピラリ等を直接卵に挿し、溶液を注入し、そのままインキュベーター等で保護すればよい。インジェクションを行う際にミネラルオイル等のオイルで卵を覆ってもよい。
【００４１】
なお、インジェクションの前に、卵をわずかに乾燥させ内圧を下げることが好ましい。これにより、インジェクション時の大量の卵黄漏れによるキャピラリの詰まりを防ぐことができる。乾燥を行いすぎると（過乾燥）、発生率が下がる場合がある。季節、作業する部屋の空調、空調等による風の当たり具合等により周囲環境の湿度が変化すると、乾燥度合いも左右される。空気が乾燥している場合は加湿器を使用してもよい。乾燥させた場合は、乾燥後にミネラルオイル等のオイルで卵を覆ってもよい。
【００４２】
例えば、コオロギでは、卵の腹側に初期胚が形成されるために、腹側よりインジェクションを行うと、胚を傷つけてしまい発生率が低下する場合がある。そのため、卵の背側よりインジェクションを行うことが好ましい。
【００４３】
インジェクション濃度は、例えば、超純水やＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）等の溶媒中、ドナー １．０μｇ／μＬ、ヘルパー １．０μｇ／μＬとすればよい。
【００４４】
インジェクションは、例えば、ガラスキャピラリをプラーで作製したもの等を用いて行うことができる。
【００４５】
卵の培養は、例えば、２８℃のインキュベーターまたは定温の部屋に入れることによって行うことができ、幼虫の飼育は、２８℃〜３０℃の飼育室で飼料等を用いて行うことができる。例えば、インジェクション直後のコオロギの卵は、２８℃のインキュベーターで４８時間〜６０時間飼育し、シャーレ等に卵を移し、さらに２８℃〜３０℃で孵化するまで飼育する。インジェクションを行う際にオイルで卵を覆った場合、卵をオイルから出して移動させることが好ましい。その理由は、オイルの中に居続けると発生が遅れる、孵化率が激減することがあるためである。孵化した幼虫は、２８℃〜３０℃の飼育室で成虫になるまで飼育すればよい。このような飼育方法により、生存率が向上する。
【００４６】
そして、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する（選択工程）。選択方法には、特に制限はないが、例えば、終齢幼虫の段階で個別に飼育し、それぞれの幼虫を野生型と交配させることにより容易にヘテロ個体を維持することができる。または、集団で飼育し交配させることにより、個別飼育の手間が省ける。任意のＤＮＡが挿入されたことは、ＥＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子が挿入されている場合は、交配させて得られた卵からＧＦＰの蛍光を観察すればよい。３ｘＰ３プロモーターにより眼でＧＦＰなどの蛍光タンパク質が発現している場合は、幼虫期に眼でのＧＦＰの蛍光を指標に簡便にスクリーニングできる。
【００４７】
以上のような方法により、形質転換の効率、成長率が高く、トランスジェニック不完全変態昆虫を作製することができる。
【００４８】
コオロギ以外の不完全変態類昆虫に関してもまず、ｖａｓａの発現を調べる等により、卵における始原生殖細胞の部位を特定し、その発現部位付近にインジェクションを行うことにより、形質転換の効率、成長率が高く、トランスジェニック不完全変態昆虫を作製することができる。
【００４９】
例えば、所望のタンパク質等を発現する遺伝子を組み込んだトランスジェニック不完全変態昆虫を作製し、繁殖させることにより、細胞上あるいは組織上で発現した所望のタンパク質等を得ることができる。また、病理学的診断や、抗体医薬の評価等の創薬スクリーニング等に利用可能な、所望のタンパク質等を含む組織等を得ることができる。これらは、培養等の手法に比べると安価に得ることができ、不完全変態昆虫として繁殖性の高いコオロギ等を用いれば、より安価に得ることができる。
【００５０】
また、トランスジェニック不完全変態昆虫を作製することにより、遺伝子の機能や転写調節領域の解析等の幅広い研究が期待される。不完全変態類であるフタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus,Gb）をモデル昆虫として、形態形成に関連する遺伝子の機能解析を行うことにより、形態形成におけるメカニズムを分子レベルで解明することが可能となる。遺伝子の機能解析法として、遺伝子の過剰発現やＲＮＡｉなどがあるが、これらの研究を進めて行く上で、本実施形態に係るトランスジェニック個体の作製方法が有用である。また、害虫等の研究には、トランスジェニック等の遺伝子組換えの技術が必要不可欠であるが、これまでトランスジェニック個体の作製が確立されていなかった不完全変態昆虫でもトランスジェニックによる研究を行うことができるようになる。
【００５１】
＜トランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法＞
本発明の実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、を含む。詳細は、上記トランスジェニック不完全変態昆虫と同様である。
【００５２】
本方法により、効率よく不完全変態昆虫のトランスジェニック個体の卵を作製することが可能となる。
【００５３】
＜トランスジェニック不完全変態昆虫＞
本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫は、任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であり、トランスジェニックコオロギであることが好ましい。
【００５４】
本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫は、どのような方法により作製されたものであってもよい。また、本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫は、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製されるものである。
【００５５】
本実施形態に係るトランスジェニック不完全変態昆虫としては、蛹を経ずに幼虫が直接成虫に変態する昆虫のトランスジェニック個体であればよく、特に制限はないが、例えば、トランスジェニックコオロギ、トランスジェニックバッタ、トランスジェニックイナゴ、トランスジェニックゴキブリ、トランスジェニックシロアリ、トランスジェニックセミ、トランスジェニックカマキリ、トランスジェニックトンボ、トランスジェニックサシガメ、トランスジェニックトコジラミ、トランスジェニックアザミウマ等が挙げられる。これらのうち、安価にサンプルが入手可能である、繁殖しやすい等の点からトランスジェニックコオロギが好ましい。
【００５６】
＜キット＞
本実施形態に係るキットは、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含む。
【００５７】
また、本実施形態に係るキットは、不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製したトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含む。
【００５８】
キットとしては、トランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を利用するものであればよく、特に制限はないが、分析用キット、診断用キット、検出用キット、検査用キット等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６０】
コオロギ細胞質アクチンプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰまたは赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄを連結したＤＮＡ配列の両末端にｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを持つプラスミド（ｄｏｎｏｒ）と、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写合成したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースｍＲＮＡ（ｈｅｌｐｅｒ）をコオロギの卵に共注入した。ＤＮＡを導入した卵から得られたコオロギと野生型を交配させ、次世代の卵の蛍光を観察したところ、ＤＮＡを導入した卵から得られた成虫の約１０％から蛍光を発する個体が得られた。また、蛍光が観察され飼育し羽化したメスと野生型のオスとを交配させ得られた卵は、蛍光を発した。従って、ｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを介した蛍光タンパク質遺伝子のゲノムへの挿入が起こっていると考えられ、トランスジェニックコオロギの作製に成功した。蛍光を発する卵を用いて、細胞移動を観察したところ胚原基形成過程における細胞のダイナミックな移動の様子が明らかとなった。ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ（ｏｔｄ）またはｃａｕｄａｌ（ｃａｄ）のＲＮＡ干渉を行うと、この過程に異常を生ずることが示された。また、コオロギの眼に特異的に発現するプロモーター（３ｘＰ３）により発現するＥＧＦＰを用いて、ＥＧＦＰが発現するトランスジェニックコオロギの作製に成功した。以下、詳細に述べる。
【００６１】
＜実施例１＞
［材料：フタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus）］
実験動物とした昆虫は、直翅目キリギリス亜目コオロギ科に属するフタホシコオロギである。通常、２８℃、湿度７０％、蛍光１０時間／日照射の下で飼育した。本実施例では、この条件下で飼育されたフタホシコオロギとその卵を用いた。この条件下で、フタホシコオロギ卵は、産卵後約１１日で孵化し、その後、約５週間で８回の脱皮を経て成虫となり、通常１ヶ月間生きる。メス成虫は最終脱皮後、およそ３日目から交尾活動を開始し、およそ５日目から通常１日１００個前後の卵を産む。産卵は約３週間行われ、生涯で１５００個以上の卵を産む。卵は直径２．５ｍｍ〜３．０ｍｍ、短径約０．８ｍｍ〜１．０ｍｍの米粒状である。昆虫卵としては大型の部類に属し、卵殻が透明なため、卵黄が少なくなり眼の形成される発生後期では内部の様子を観察しやすい。
【００６２】
［始原生殖細胞の部位の特定］
始原生殖細胞の遺伝子マーカーであるｖａｓａのｍＲＮＡとｐｒｏｔｅｉｎの発現部位を調べた。操作は、論文（Dynamic expression patterns of vasa during embryogenesis in the cricket Gryllus bimaculatus (2008) Dev. Genes Evol., 218, 381-387）に記載してある通りに行った。具体的には、まずコオロギ７齢幼虫からｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いて抽出した。その後、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡからｍＲＮＡを精製するため、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ＜ｓｕｐｅｒ＞ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。精製したｍＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒとともに逆転写反応に使用し、ｃＤＮＡを得た。コオロギのｖａｓａ遺伝子ホモログをクローニングするために、縮重ＰＣＲを行った。用いたｐｒｉｍｅｒは、Ｄｅｇ−Ｆ１（5’-CCG GAT CCA TGG CNT GYG CNC ARA CNG-3’（配列番号１））と、Ｄｅｇ−Ｒ１（5’-CCA AGC TTA ANC CCA TRT CAN RCA TNC KRT C-3’（配列番号２））である。これらのｐｒｉｍｅｒは、他の生物と保存性の高い領域である、ＭＡＣＡＱＴＧとＤＲＭＬＤＭＧＦに設計した。Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法を用いて、未知領域の５’と３’末端を決定した。得られたコオロギｖａｓａのｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録した（アクセッション番号：ＡＢ３７８０６５）。得られたコオロギｖａｓａの配列をもとに、ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｗ−ＩＳＨ）法のプローブを作製した。コオロギ卵は、市販のハイター液により卵殻を剥がし、４％ Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＦＡ／ＰＢＳ）に等量のｈｅｐｔａｎｅを重層した固定液を用いて、室温で２０分間固定を行った。その後、２０％メタノール／ＰＢＴ（ＰＢＳに終濃度０．１％となるようｔｗｅｅｎを加える）により固定液を洗浄した。コオロギ卵へのプローブの浸透性を高めるために、先の鋭いタングステン針を用いてコオロギ卵の周囲を８カ所程度突き刺した。この処理を行ったコオロギ卵を用いて、Ｗ−ＩＳＨの処理を行った。コオロギでは卵の最後端から２０％上流位置（卵全長を１００％とする）にその発現が認められた。そこで、ｖａｓａの発現位置である、卵の後端より２０％の位置を狙いインジェクションを行うこととした。
【００６３】
［卵へのインジェクション］
（両面テープ付きスライドガラスの作製）
両面テープをスライドガラスに貼付し、ピンセットでしごいてなだらかにした。ビニールテープで土手を作製し、両面テープ付きスライドガラスの粘着テープに重ねて貼付けた。土手のビニールテープは４枚重ねた。この時、ビニールテープを引っ張り過ぎると、土手の機能を果たさないので注意した。
【００６４】
（ガラスキャピラリ作製）
ガラスキャピラリ １ ｖｉａｌ ３１／２ ｃａｐｉｌｌａｒｙ（Ｄｏｒａｍｍｏｎｄ）をプラーで以下のプログラムで作製した。
HEAT 743, PULL 0, VEL 20, TIME 250
HEAT 743, PULL 0, VEL 20, TIME 250
HEAT 743, PULL 0, VEL 20, TIME 250
HEAT 743, PULL 70, VEL 25, TIME 150
【００６５】
作製後、ガラスキャピラリの先端を折るため、インジェクタにセットした。新しいキャピラリを半分に折り、スライドガラスにセットした。顕微鏡にマウントし、顕微鏡のステージを移動させ、キャピラリ端とインジェクションキャピラリの先端とを近づけて先端同士を接触させ、キャピラリを任意の太さに折った。完成したガラスキャピラリを安全に外した。
【００６６】
（湿箱の作製）
角シャーレに三つ折りにしたコンフォートタオルを敷き、水で濡らした。角シャーレを傾け、余分な水は切っておいた。
【００６７】
（採卵）
シャーレに２枚のキッチンペーパを任意の大きさに切り敷いた。キッチンペーパを脱イオン水で濡らし、余分な水分は除した。そして、キッチンペーパでフタをした。２時間採卵し、２８℃に設定したインキュベーターで１時間インキュベートした。
【００６８】
（卵の収集）
水を張ったプラスチック容器（タッパー（登録商標））に採卵した卵をキッチンペーパから落し、茶こしで集めた。乾燥を防ぐため、再び水の張ったプラスチック容器に茶こしをつけた。
【００６９】
（卵の洗浄）
卵の表面に付着している雑菌を取り除くため、インジェクション時にガラスキャピラリが折れるのを防止し、インジェクションを行いやすくするため、７０％エタノール処理を行った。７０％エタノール→水→水の洗浄系列を入れて準備しておいた。７０％エタノール液には７秒程度、茶こしを揺すりながら浸した。素早く水で洗い流し、再び水の入ったプラスチック容器に茶こしを浸けて乾燥を防いだ。
【００７０】
（粘着テープへの卵の配置）
コンフォートタオルを水で濡らし、手で軽くしぼって水気を切った。作業台にコンフォートタオルを敷いた。茶こしの水分を吸い取った。茶こしを裏返して裏側をはじき、卵を濡れたコンフォートタオルの上に落とした。水で濡らした絵筆で卵を転がすようにして、バラバラに分離させた。２００μＬチップの先に粘着テープを付けた卵並べ器具を使用して、卵を粘着テープ付きスライドガラスに並べた。後で卵の背側にインジェクションできるように配置した。卵はバナナ型“く”の形をしているが、飛び出ている方が腹側であり、腹側にインジェクションを行うと胚発生が悪くなることがある。粘着テープ付きスライドガラスの片側におよそ１５個の卵を並べ、一枚でおよそ３０個の卵をインジェクションに使用した。
【００７１】
（卵の乾燥）
卵をわずかに乾燥させて内圧を下げることで、インジェクション時の大量の卵黄漏れによるキャピラリの詰まりを防ぐことを目的とする。乾燥を行いすぎると（過乾燥）、発生率が下がることがある。湿度が変化すると、乾燥具合も左右され、風が直接当たると過乾燥になるので注意が必要である。空気が乾燥している場合は加湿器を使用してもよい。卵を並べ終わったら、８分程度放置した。この間を乾燥時間とした。規定の時間が過ぎた後、ミネラルオイルで卵を覆った。このとき、ミネラルオイルがビニールテープ土手の下から漏れていないかチェックした。漏れた場合、卵が乾燥して発生率が悪くなることがある。
【００７２】
（ドナープラスミドの作製、ヘルパーｍＲＮＡの作製）
ドナープラスミドの作製ならびにヘルパーｍＲＮＡの作製は、論文（piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus (2004) Develop. Growth Differ., 46, 343-349）に記載されている通りに行った。
【００７３】
ドナープラスミドｐＢＧａｃｔ−ｅＧＦＰは、以下の方法で作製した。まずｐＧａｃｔ−ｅＧＦＰプラスミドよりコオロギアクチンプロモーターとＥＧＦＰ部分作製するために、ＰｓｔＩもしくはＢｇｌＩＩサイトが付加したｐｒｉｍｅｒ（5’-aattctgcagcagttccttcaaatgttcaaaat-3’（配列番号３）と5’-aattagatctgaactggaacaacactcaacccta-3’（配列番号４））を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩ処理し、断片を得た。ドナープラスミドｐＢ３ｘＰ３−ｅＧＦＰａｆは、Ｅ．Ｗｉｍｍｅｒから入手した（Horn, C., Wimmer, E. A. 2000. A versatile vector set for animal transgenesis. Dev. Genes Evol. 210, 630-637）。ｐＢ３ｘＰ３−ｅＧＦＰａｆは、制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩで処理し、このベクターに先ほどのＰＣＲ断片を組み込み、ドナープラスミドｐＢＧａｃｔ−ｅＧＦＰを作製した。
【００７４】
プラスミドｐＢＧａｃｔ−ｅＧＦＰは、文献（piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus (2004) Develop. Growth Differ., 46, 343-349）に記載されている。また、プラスミドｐＢ３ｘＰ３−ｅＧＦＰａｆは、文献（Horn, C., Wimmer, E. A. 2000. A versatile vector set for animal transgenesis. Dev. Genes Evol., 210, 630-637.）に記載されている。
【００７５】
ヘルパーｍＲＮＡ合成の際のプラスミドｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃは、以下のように作製した。ｐｉｇｇｙＢａｃのｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅ（ＯＲＦ）は、ｐｒｉｍｅｒ（5’-ccttctgcagtatgggatgttctttagacga-3’（配列番号５）と5’-ccaaggatcctttagtcagtccagaaacaac-3’（配列番号６））を用いてｐｈｓｐ−ｐＢａｃ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｈａｒｒｅｌｌから入手した。Handler, A. M., Harrell, R. A. 1999. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Mol. Biol., 8, 449-457.）を鋳型ＤＮＡとしＰＣＲにより増幅した。ｐｒｉｍｅｒにはＰｓｔＩもしくはＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅを付加しているので、ＰＣＲ産物は制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩにより処理した。さらに、ｍＲＮＡ合成用プラスミドｐＳＰ６４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）も制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩＩにより処理し、ＰＣＲ産物を組み込みｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡ合成用プラスミドｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃを作製した。ｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡの合成用鋳型ＤＮＡは、ｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（１：１，ｖ／ｖ）抽出、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出、エタノール沈殿により精製した。得られた鋳型ＤＮＡの１μｇをｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標） ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）によりｍＲＮＡの合成をｉｎ ｖｉｔｒｏで行い、精製した。得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製し、終濃度１μｇ／μＬに調製した。保存は小分けに（２μＬ）分注し、−８０℃で保存した。
【００７６】
プラスミドｐＳＰ６４−ｐｉｇｇｙＢａｃは、文献（piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus (2004) Develop. Growth Differ., 46, 343-349）に記載されている。
【００７７】
（キャピラリへのインジェクション溶液の充填）
ドナー、ヘルパーの終濃度をどちらとも１μｇ／μＬにした（溶媒：水）。マイクロピペット（ピペットマン（登録商標））を用いて、２〜３μＬのインジェクション溶液を、作製したキャピラリへ充填した。詰まりにくくするために、遠心処理を行ってもよい。インジェクション溶液を充填したキャピラリの先端は詰まりやすいため、素早くオイル中に浸し、乾燥を防いだ。
【００７８】
（卵へのインジェクション）
光学顕微鏡で卵の輪郭に焦点を合わせた。焦点が合うと輪郭がはっきりと黒くなる。インジェクション部位が視野に来るようにステージを移動した。インジェクション部位は、卵の後端から２０％付近（卵全長を１００％とする）の背側とした。注射筒をわずかに押し、キャピラリ先からインジェクション溶液が漏れるのを確認した。溶液を少し出しながら卵にキャピラリを刺した。注射筒に力をかけ、卵内部に溶液が入るのを確認した。そして、力をかけながらキャピラリを卵から引き抜いた。潰れた卵、インジェクションを失敗した卵は取り除いた。
【００７９】
（インジェクション後の操作）
湿らせたコンフォートタオルが入っている湿箱の中にインジェクション後のスライドガラスをいれた。湿箱を２８℃に設定したインキュベーターに入れ、飼育した。インジェクション後２、３日経過すると卵割が観察できるので発生率を調べた。２日後にＥＧＦＰ、３日後にＤｓＲｅｄの蛍光を観察した。そして、濡らしたキッチンペーパの上でインジェクションした卵を転がしてミネラルオイルを除去し、濡らしたキッチンペーパを敷いたシャーレで飼育した。
【００８０】
［結果］
ＥＧＦＰがｄｏｎｏｒの場合、スライドガラスに１１４個の卵を並べ、８８個の卵にインジェクションをした。その内、３９個が発生、２３個から蛍光が観察された。羽化したコオロギは１５匹となり、４匹のメスから蛍光を発する卵が得られた。図２に、３ｘＰ３-ＥＧＦＰトランスジェニックコオロギの写真を示す。発生した卵からのトランスジェニックコオロギの作製効率は、（４／３９）×１００＝１０．２％であった。ＤｓＲｅｄがｄｏｎｏｒの場合、スライドガラスに２２２個の卵を並べ、１７９個の卵にインジェクションをした。その内、４６個が発生、１１個から蛍光が観察された。羽化したコオロギは１４匹となり、３匹のメスから蛍光を発する卵が得られた。発生した卵からのトランスジェニックコオロギの作製効率は、（３／４６）×１００＝６．５％であった。
【００８１】
［ＲＮＡｉ法による解析］
（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の作製）
ｄｓＲＮＡ合成のためのｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡから、Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔ７ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）により３７℃、１５時間反応させ、ＲＮＡを合成した。その後、ＤＮａｓｅ処理を行い、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを除去した。次に、フェノール／クロロホルム処理、イソプロパノール沈澱を行い、ＴＥ（１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。そして、１０００ｍＬビーカに水４００ｍＬを入れ、ガスバーナで加熱して沸騰させ、チューブごと５分間浸し、ＲＮＡを変性させた。その後、ビーカごと火元から外し、お湯が室温になるまでアニーリングさせ、ｄｓＲＮＡとした。そして、再びエタノール沈澱を行い、ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｍＱ）に２０μＭになるように溶解し、ｄｓＲＮＡ溶液として保存した。インジェクションを行う際の濃度は２０μＭに希釈した。
【００８２】
（メス成虫へのｄｓＲＮＡの注入）
成虫へのｄｓＲＮＡ注入は、インジェクション装置（Ｎｏｎｏｊｅｃｔ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いた。ミネラルオイルをキャピラリに充填し、インジェクション装置に取り付けた。そして、ミネラルオイルを排出し、ｄｓＲＮＡを吸入した。排出量は６９．０ｎＬ、Ｆａｓｔに設定した。コオロギをシャーレに入れ、３０分程度氷上麻酔を行った。コオロギをインジェクション台に腹ばいにしておき、Ｔ３の脚の付け根の白い柔らかいところにキャピラリを差し込み、ｄｓＲＮＡが６９ｎＬ排出されるように設定したボタンを１１回押し、ｄｓＲＮＡを成虫に注入した。その後、静かにキャピラリを体からはずした。
【００８３】
（共焦点レーザ顕微鏡Ｃ１ｓｉ−Ｒｅａｄｙを用いたｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ｍｏｖｉｅの撮影）
マツナミガラスボトムディッシュに卵を並べ、顕微鏡の台に設置した。機械の設定として、Ａｒレーザ（４８８ｎｍ）、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ５１５／３０、レーザの強さ６．０％、ゲイン１２５で行った。ｓｔｅｐ ｓｉｚｅは、６．０〜７．０μｍにして、ｓｔｅｐ数を５０枚以内にした。３０分毎に撮影した。Ｍｏｖｉｅは、１秒で１時間経過するように設定した。
【００８４】
［結果］
卵のときに蛍光が観察され、羽化したメスと野生型のオスを交配させ得られた卵は蛍光を発した。図３に、採卵後、約４２時間のトランスジェニック卵の写真を示す。ＤＮＡを導入した卵から得られた成虫から、蛍光を発する個体が得られた。図３（Ａ）は、ＥＧＦＰから得られたトランスジェニック個体を示し、図３（Ｂ）は、ＤｓＲｅｄから得られたトランスジェニック個体を示す。卵の後方で光っているのは、コオロギの胚である。
【００８５】
蛍光を発する卵を、共焦点レーザ顕微鏡を用いてｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ｍｏｖｉｅにしたところ、胚原基形成過程における細胞のダイナミックな移動の様子が明らかになった。まず後方から細胞が表面に現れて全体に広がった。分裂をくり返し、後方の細胞が胚原基を形成するために集まった。しかし、前方の細胞は、後方の細胞のようなダイナミックな動きはせず、その場からあまり動かなかった。
【００８６】
ｃａｄをＲＮＡ干渉した場合、胚原基形成の細胞移動がコントロールとは異なっていた。そのうえ、以前にわかっていた胚後方が伸長しないという表現型の様子も確認できた。ｏｔｄをＲＮＡ干渉した場合、全体に細胞が広がるが、その後、細胞移動、細胞分裂は行われなかった。
【００８７】
図４は、ＥＧＦＰが観察できるトランスジェニック卵を使用して、ｃａｄをＲＮＡ干渉により機能阻害し、コオロギ胚の発生過程を示す写真である。ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅによりｃａｄの胚発生初期の様子をＥＧＦＰの蛍光で現している。上の卵がｃａｄをＲＮＡ干渉した卵であり、下の卵はコントロールである。採卵後、（Ａ）１６時間、（Ｂ）１８時間、（Ｃ）２０時間、（Ｄ）２２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）２６時間、（Ｇ）２８時間、（Ｈ）３０時間、（Ｉ）３４時間、（Ｊ）３６時間、（Ｋ）３８時間、（Ｌ）４２時間に撮影された写真である。（Ｈ）〜（Ｋ）の矢印は胚の後方部位を示している。これらの図より、明らかに後方の伸長が少しだけしか起こらないことがわかった。
【００８８】
図５は、ＥＧＦＰが観察できるトランスジェニック卵を使用して、ｏｔｄをＲＮＡ干渉により機能阻害し、コオロギ胚の発生過程を示す写真である。上の卵がコントロールで、下の卵がｏｔｄをＲＮＡ干渉した卵になる。採卵後、６時間から２４時間までを撮影した。撮影は卵の腹側から行い、写真の右が卵の後方を示す。コントロールでは１０時間を過ぎると、エネルギド（ＥＧＦＰの蛍光で示される輝点）が卵表面に移動し、胞胚期を形成する。そしてエネルギドが盛んに分裂し、卵表面を覆う。その後、細胞化が起こり、１８時間を過ぎると、各細胞が後方に集まり胚が形成される。しかし、ｏｔｄのＲＮＡｉ干渉を行うと、卵表面にエネルギドは移動してくるが（１１時間）、それらは細胞移動も細胞分裂も行われず、胚が形成されていない。２４時間ではコントロールでは初期胚原基が形成されているが、ｏｔｄの影響で胚が形成されていない。
【００８９】
以上のように、ｐｉｇｇｙＢａｃエレメントを介した蛍光タンパク質遺伝子のゲノムへの挿入が起こっており、次世代にも受け継がれているのでトランスジェニックコオロギの作製に成功したと考えられる。
【００９０】
現在まで、長胚型のショウジョウバエでは卵全体に濃度勾配をとり細胞化が起こっている。短胚型のコオロギでも、卵全体に濃度勾配をとり前方の細胞からも胚原基を形成するのに関与するのではないかと考えられてきた。しかし、前方の細胞が胚原基を形成するのには必要ではなかった。
【００９１】
ｃａｄをＲＮＡ干渉することで、胚原基形成の長さ、細胞の接着の様子が異常であることがわかった。これは、ｃａｄが後方領域に重要な遺伝子であり、強い表現型であれば頭部だけになる。胚原基が短くなる、後方の伸長が行われないことは以前にも他の実験でわかっていた。今回、細胞が移動して集まるところから異常があるとわかった。今後、形態異常が起こる他の遺伝子でも有効な解析手段だと示唆される。
【００９２】
ｏｔｄは、全体に斑点状の蛍光になるが胚が形成されなかった。この後に採卵した卵からは初めから全体に斑点状の蛍光が見られた。そのため、卵巣を調べたところ、コオロギ体内からすでに斑点状の蛍光が見られた。コオロギ体内にある卵なので、受精はしていないと思われる。受精をしなくても少しは分裂が起こることは知られているが、全体に広がるほど分裂はしないはずである。受精をせずに分裂するので、ｏｔｄが受精するまでの分裂を抑えているのではないかと考えられる。ｏｔｄの表現型として前後軸を決める、頭部形成に関与する遺伝子だと知られているが、細胞分裂の開始の切り替えの役割、卵巣からはじまる卵形成の異常など卵を産む前から影響を及ぼすものと考えられる。
【００９３】
このように、不完全変態類のフタホシコオロギ（Gryllus bimaculatus）のトランスジェニック個体の作製法を確立した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法であって、
前記不完全変態昆虫が、コオロギであることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法であって、
前記任意のＤＮＡが、ヒト遺伝子であることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【請求項４】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
を含むことを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法。
【請求項５】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、
を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製されることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項６】
請求項５に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫であって、
前記不完全変態昆虫が、コオロギであることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項７】
任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項８】
請求項７に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫であって、
前記不完全変態昆虫が、コオロギであることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項９】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、
を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製したトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であるトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、
を含むことを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法であって、
前記不完全変態昆虫が、コオロギであることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法であって、
前記任意のＤＮＡが、ヒト遺伝子であることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法。
【請求項４】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
を含むことを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫の卵の作製方法。
【請求項５】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、
を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製されることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項６】
請求項５に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫であって、
前記不完全変態昆虫が、コオロギであることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項７】
任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項８】
請求項７に記載のトランスジェニック不完全変態昆虫であって、
前記不完全変態昆虫が、コオロギであることを特徴とするトランスジェニック不完全変態昆虫。
【請求項９】
不完全変態昆虫の卵における始原生殖細胞の部位を特定する部位特定工程と、
トランスポゼースｍＲＮＡと、任意のＤＮＡが挿入されたトランスポゾンとを不完全変態昆虫の卵における前記特定した部位付近に注入する注入工程と、
前記注入した卵から生じた不完全変態昆虫の中から、前記任意のＤＮＡが挿入されたトランスジェニック体を選択する選択工程と、
を含むトランスジェニック不完全変態昆虫の作製方法によって作製したトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
任意のＤＮＡが挿入された不完全変態昆虫であるトランスジェニック不完全変態昆虫から採取した細胞または組織を含むことを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−８３２３２（Ｐ２０１１−８３２３２Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８８４１（Ｐ２００９−２３８８４１）
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）刊行物名 Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｏｏｋ，４２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ（日本発生生物学会第４２回大会講演要旨集） （２）頒布日 平成２１年５月２日 （３）発行元 Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ４２ｎｄ ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＪＳＤＢ（２００９）（日本発生生物学会第４２回大会（２００９）組織委員会） （４）該当頁 第１５４頁 （５）公開者 中村 太郎、三戸 太郎、新明 洋平、吉崎 正人、板東 哲哉、大内 淑代、野地 澄晴 （６）発表内容 （タイトル）トランスジェニックコオロギを用いた胞胚期と初期胚発生過程における細胞動態の解析
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【出願人】（３９００２９７９１）アロカ株式会社 (899)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）刊行物名 Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｏｏｋ，４２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ（日本発生生物学会第４２回大会講演要旨集） （２）頒布日 平成２１年５月２日 （３）発行元 Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ４２ｎｄ ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＪＳＤＢ（２００９）（日本発生生物学会第４２回大会（２００９）組織委員会） （４）該当頁 第１５４頁 （５）公開者 中村 太郎、三戸 太郎、新明 洋平、吉崎 正人、板東 哲哉、大内 淑代、野地 澄晴 （６）発表内容 （タイトル）トランスジェニックコオロギを用いた胞胚期と初期胚発生過程における細胞動態の解析
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【出願人】（３９００２９７９１）アロカ株式会社 (899)
【Ｆターム（参考）】
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