トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および予防方法ならびに新規付随的特徴
本発明の実施形態は全般的には、トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の新規治療および／または予防方法、腸レオウイルス株（ＥＲＳ）ならびに新規付随的特徴に関する。他の実施形態は全般的には、神経学的症状の治療および／または予防のためのＥＲＳを含んでなる免疫原性組成物またはワクチンを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および予防方法ならびに新規付随的特徴に関する。
【背景技術】
【０００２】
レオウイルス感染は世界中で家禽において一般的に見られ、ウイルス性関節炎／腱滑膜炎、吸収不良症候群（ＭＡＳ）、心膜炎、心筋炎および免疫抑制を含む多種多様な臨床徴候を示すニワトリから分離されている［ＭｃＮｕｌｔｙら，“Ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｒｄｓ，”Ｒｅｏｖｉｒｕｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １３，ｐｐｌ８１−１９３（１９９３）］。
【０００３】
特にブロイラー品種におけるウイルス性関節炎／腱滑膜炎は、レオウイルス感染に起因する最も重要な疾患である［Ｎｉｂｅｒｔら， Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８１（２００１）］。それは、ニワトリの飛節および脚腱に主に限局した、慢性炎症性病変を伴う持続的ウイルス感染である。該病変は滑液構造体に限局している［Ｍｅｎｅｎｄｅｚら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１９：１１２−１１７（１９７５）；Ｅｌｌｉｓら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２７：６４４−６５１（１９８３）；Ｋｉｂｅｎｇｅら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１４：８７−９８（１９８５）］；［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８１−１６８２（２００１）］。
【０００４】
レオウイルス感染の臨床徴候／症状は、いくつかのグループにより吸収不良症候群（ＭＡＳ）に関連づけられている［Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．７：１８３−１８７（１９７８）；Ｐａｇｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２６：６１８−６２４（１９８２）；Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２７：２５５−２６０（１９８３）；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３７：４５１−４５８（１９９３）］。該症候群は、不均一な成長、不完全な羽毛および未消化の食物と水様性含有物とを伴う下痢を伴った体重増加の減少により特徴づけられる。病的変化は、ほとんどの場合、前胃腸炎、膵炎および肝炎を含む。ＭＡＳは消化不良もしくは吸収不良のいずれか又はそれらの両方によって引き起こされうる。見出される病変は、不十分な消化液分泌による消化不良、または不十分な吸収能による吸収不良を引き起こしうる。しかし、体重増加の減少にばらつきがあることからも分かるとおり、ＭＡＳから分離されたレオウイルスの病原性は様々である［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８１−１６８２（２００１）；Ｐａｇｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２６：６１８−６２４（１９８２）；ＭｃＮｕｌｔｙら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１３：４２９−４３９（１９８４）；Ｄｅｃａｅｓｓｔｅｃｋｅｒら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１５：７６９−７８２（１９８６）；ＫｉｂｅｎｇｅおよびＤｈｉｌｌｏｎ，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３１：３９−４２（１９８７）；Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１７：８７９−８９２（１９８８）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．４１：８０−９２（１９９７） Ｓｏｎｇｓｅｒｍら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．４６：８７−９４（２００２）］。現在のところ、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスは先行技術においては開示されていない。
【０００５】
先行技術において、公知トリレオウイルスに対する幾つかのワクチンが存在する。生ワクチンの具体例には、株Ｓ１１３３および２１７７が含まれる。米国における生ワクチンは、腱滑膜炎の野外症例からｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅにより分離され特徴づけられた、種々の継代レベルのトリレオウイルス株Ｓ１１３３から開発された。株Ｓ１１３３は漿尿膜（ＣＡＭ）内で３７℃で連続的に２３５回、ついでニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）内で３２℃で６５回培養された。さらに１３５回の継代がＣＥＦ内で３７℃で行われた［ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．，２７：６９８−７０６（１９８３）］。株２１７７はＲｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒによりトリレオウイルスの野外症例から分離され特徴づけられた［米国特許第５，５２５，３４２号］。株２１７７は、組織サンプルを孵化卵内に接種し卵黄流体を集めることにより、レオウイルス疾患を示すニワトリから分離された。ついで、この卵黄流体はＣＥＦ内に接種され、細胞病理が観察されるまで１４回継代され、その時点で該ウイルスがプラーク精製された。ついで、ウイルスのストックを得るために、この卵黄流体は孵化卵内での増殖に付された。該ストックは非病原性であることが判明し、株２１７７と命名された。現在のところ、馴化無しのＶｅｒｏ細胞上で直接、レオウイルスを増殖させる／培養することは不可能である［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐｐ．１６８１−１６８２（２００１）］。最も一般的な方法は孵化鶏卵内での増殖である。先行技術においては、哺乳類細胞内で増殖しうるトリオルトレオウイルス（レオウイルス）のいくつかの特徴を有する哺乳類レオウイルスである、オーストラリアオオコウモリ由来のオルトレオウイルスが開示されている［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８２（２００１）］。しかし、馴化無しで哺乳類細胞内で増殖しうるトリレオウイルスは先行技術においては開示されていない［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８２（２００１）］。また、先行技術は、トリレオウイルスにより引き起こされる家禽における神経学的症状の治療および／または予防方法を開示していない。したがって、当技術分野においては、トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／予防方法が求められている。
【０００６】
最近、ｖａｎ Ｌｏｏｎら［Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］は、腸レオウイルス株（ＥＲＳ）と称される新規クラスのレオウイルスの単離および同定を記載した。ＥＲＳは、高い致死性を示すものとしてブロイラーから単離された。それらのブロイラーは、レオウイルス感染に対して十分にワクチン接種された親集団に由来するものであった。ＥＲＳはレオウイルスの新規血清型であることが明らかとなった。なぜなら、該ウイルスは、プラーク減少試験を用いた場合に公知レオウイルスにより中和され得なかったからである［ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］。さらに、モノクローナル抗体のパネルでのＥＲＳの特徴づけは、これらの株が、文献に既に記載されているレオウイルス株とは異なるパネルパターンを示すことを明らかにした［Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２７：２４６−２５４（１９８３）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１６：１０６７−１０７２（１９７２）；Ｏｌｓｏｎら，Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．１８：７３５−７３９（１９５７）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３３：５３５−５４４（１９８９）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１８：２８９−２９６（１９７４）］。さらに、当技術分野で受け入れられている方法でプラーク減少アッセイを行うことにより、これがレオウイルスの新規抗原クラスであると同定された（米国特許出願第号）。プラーク減少アッセイの説明はＮｅｒｓｅｓｓｉａｎらによる文献（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．Ｎ５０，１９８９，ｐｐ．１４７５−１４８０）に記載されている。この文献は、トリレオウイルスの異種免疫特性を証明しており、レオウイルス分離体間の抗原関係（類似性および相違を含むが、これらに限定されるものではない）を決定し特徴づけるためのプラーク減少アッセイの使用の正当性を立証している。野外のレオウイルスに関するスクリーニングにおいて、オランダ、ベルギー、アイルランド、英国、スペイン、ドイツ、イタリア、米国、アルゼンチン、アラブ首長国連邦、南アフリカ、フィリピンおよびインドネシアにもＥＲＳ型株が存在することが認められた。これらのＥＲＳ型株は、通常、ＭＡＳを有する鳥類から分離された。特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリにおけるＥＲＳの病原性および散在は、ＥＲＳが高い致死性、腱滑膜炎（未公開の観察）およびＭＡＳを誘発しうることを証明した［ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］。レオウイルスに対する母体由来抗体を有する商業的ブロイラーにおいても、ｖａｎ Ｌｏｏｎら［Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］は、１日齢または７日齢に接種されたブロイラーにおいてそれぞれ３５％および２５％の成長遅延を示した。この新規クラスの更なる研究および評価は、他の驚くべき特徴を提供している。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の概要）
全般的には、本発明の実施形態は、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスのクラス、ならびにトリレオウイルスのクラスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／または予防方法に関する。
【０００８】
１つの実施形態において、トリ腸レオウイルス株（Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎ）（ＥＲＳ）と称されるレオウイルスのクラスが神経学的症状を引き起こすことが見出された。そのような神経学的症状には、頚部のねじれ、振戦などが含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。さらに、１つの実施形態においては、トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／または予防方法が、生、弱毒化または不活化形態のＥＲＳトリレオウイルスと担体または希釈剤とを含む免疫原性組成物またはワクチンの有効量を投与することを含むことが見出された。
【０００９】
本発明の方法の１つの実施形態においては、投与する免疫原性組成物またはワクチンは、米国特許出願第０９／４９３，４８４号（以下、‘４８４出願と称する）のウイルスのクラスの実施形態の特徴を有するものとして特徴づけられるレオウイルスの抗原クラスのレオウイルスを含む。‘４８４出願は、公開されている２０００年１月２５日付け出願の欧州特許出願番号００２００２５６．６からの優先権を主張している。該欧州特許出願は公開番号ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａ１として２０００年８月２日付けで公開された。
【００１０】
レオウイルスのそのようなクラスは、ＥＣＡＣＣ（英国ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ））に受託番号９９０１１４７５でサンプルが寄託されている株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも７５％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属するものとして特徴づけられ、そのようなクラスは更に、トリレオウイルス分離体（好ましくは原型レオウイルス株１１３３）に対して産生させたポリクローナル抗血清とのＩＦＴにおける反応性により、ならびにモノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴ（それらのハイブリドーマはそれぞれ受託番号９９０１１４７２、９９０１１４７３および９９０１１４７４でＥＣＡＣＣに寄託されている）とのＩＦＴにおける反応性の非存在により特徴づけられる。
【００１１】
この概要のいかなる点も、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明の範囲を更に詳しく理解するためには、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲に注目すべきである。
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書中で用いる「相対的（に）非病原性」なる語は、ウイルスの病原性が有意に減少していて、該ウイルスの生株で免疫された家禽の約２０％以下が該ウイルスに侵されることを意味する。本明細書中で用いる「ニワトリ」なる語は、ブロイラー、繁殖株、産卵株などを含むすべてのニワトリを意味する。「家禽」なる語はニワトリ、シチメンチョウ、水鳥、ホロホロチョウ（ｇｕｉｎｅａ）、ウズラ、ハト、ダチョウなどを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書中で用いる「天然」なる語は、人的介入が存在しないことを意味する。しかし、「天然に非病原性」な株は、種々の実施形態においては、ウイルスストックなどを調製するために継代されうると意図される。さらに、該ウイルスが、継代の前に、定義されているとおりの「相対的（に）非病原性」である場合には、そのような継代により、ウイルスが「天然に非病原性」でないとみなされるようになることはないと意図される。
【００１３】
本明細書中で用いる「ワクチン株」なる語は、免疫原性組成物またはワクチンにおいて使用するのに適したウイルス株を意味する。「ワクチン株」には、非病原性株または相対的に非病原性の株、不活化株および／または弱毒化株が含まれうるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００１４】
２０００年１月２８日付けの‘４８１出願は、トリレオウイルスの新規抗原クラスを初めて明らかにした。‘４８１出願は、公開されている２０００年１月２５日付け出願の欧州特許出願番号００２００２５６．６からの優先権を主張している。該欧州特許出願は公開番号ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａ１として２０００年８月２日付けで公開された。
【００１５】
本出願における新規クラスはトリレオウイルスＥＲＳ（腸レオウイルス株）として特徴づけられた。該クラスは腸障害、レオウイルス関連疾患（例えば、過度に液状の便および／または消化不良の食物）を引き起こすことが判明したため、該クラスはＥＲＳとして同定された。本発明において、驚くべきことに、トリレオウイルスＥＲＳであるレオウイルスクラスが神経学的症状を引き起こすことが見出された。神経学的症状には、頚部のねじれ（斜頚（ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｏｓｉｓ）とも称される）および振戦が含まれるが、これらに限定されるものではなく、これらのすべてが要求されるわけではない。
【００１６】
したがって、本発明の実施形態は全般的には、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスのクラス、ならびにトリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療方法に関する。１つの実施形態においては、本発明の方法は、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスの生、弱毒化または不活化形態と担体または希釈剤とを含む免疫原性組成物またはワクチンの有効量を投与することを含む。したがって、更なる実施形態は、欧州出願ＥＰ１ ０２４ １８９ Ａ１のウイルスのクラスの特徴を有するレオウイルスの抗原クラスのレオウイルスを含む免疫原性組成物またはワクチンに関する。
【００１７】
レオウイルスのそのようなクラスは、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫに受託番号９９０１１４７５でサンプルが寄託されている株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも７５％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属するものとして特徴づけられ、および／または、そのようなクラスは更に、トリレオウイルス分離体（好ましくは原型レオウイルス株１１３３）に対して産生させたポリクローナル抗血清とのＩＦＴにおける反応性により、ならびにモノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴ（それらのハイブリドーマはそれぞれ受託番号９９０１１４７２、９９０１１４７３および９９０１１４７４でＥＣＡＣＣに寄託されている）とのＩＦＴにおける反応性の非存在により特徴づけられる。
【００１８】
本発明の他のレオウイルス、および本発明のワクチン／方法において使用するための他のレオウイルスは、株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも８０％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属する免疫原性組成物またはワクチンのレオウイルスとして特徴づけられる。本発明の他のレオウイルス、および本発明のワクチン／方法において使用するための他のレオウイルスは、株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも９０％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属する免疫原性組成物またはワクチンのレオウイルスとして特徴づけられる。
【００１９】
本発明の方法における使用に適したレオウイルスを代表する典型的で非限定的な株には、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫに受託番号９９０１１４７５で寄託されている株ＥＲＳ（分離体１）、２００２年１０月１日にＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号ｐｔａ−４７３５で寄託されている株ＥＲＳ １０３７、２００２年１０月３０日にＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号ｐｔａ−４７８２として寄託されている株ＥＲＳ ０６０Ｅ、および２００２年１０月３０日にＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号ＰＴＡ−４７８３で寄託されている株ＥＲＳ ０７４が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の株、および本発明の方法のための免疫原性組成物またはワクチンにおいて使用する株は、当技術分野において一般的な方法に従い家禽から分離することが可能である。ニワトリの場合には、レオウイルスの株は、レオウイルス関連疾患を有するニワトリから分離される。ウイルス分離のための方法は当技術分野において一般的である。分離においては、該ウイルスは、レオウイルス関連疾患の徴候を示すブロイラーから集めた感染腱から分離した。しかし、本発明の方法は、トリのどの部分から該ウイルスが分離されたかによっては限定されない。
【００２１】
実際のところ、驚くべきことに、本発明のトリレオウイルスは、トリレオウイルスにより誘発される神経学的症状に罹患した家禽の神経系、例えば脳および脊髄から分離されうることが見出された。これまでには、トリレオウイルスは、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体からは分離されていない。さらに、神経学的症状を引き起こす株のみが、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体から分離されうると考えられる。実際のところ、神経学的症状を引き起こさない先行技術のレオウイルスは、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体からは分離され得ないことが、実験の部において示されている。
【００２２】
したがって、本発明は、家禽の神経系から分離されうるトリレオウイルスのクラスを開示する。種々の実施形態においては、そのように特徴づけられるトリレオウイルスのクラスは、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体から分離されうる。
【００２３】
種々の実施形態においては、本発明の方法において使用する免疫原性組成物またはワクチンは、単独で又は家禽に対する他のウイルス（例えば、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、ニワトリ貧血ウイルスなど）ワクチンと組合せて投与することが可能である。他の実施形態は細菌抗原などを同時に含有することが可能である。さらに、本発明の方法において使用する好ましい免疫原性組成物またはワクチンとしては、若齢（例えば、１日齢）で及び／又は卵内に投与されうるワクチンが挙げられる。
【００２４】
本発明の方法における免疫原性組成物またはワクチンの投与は、トリレオウイルスの投与に一般に用いられる任意の経路によるものでありうる。好ましい投与経路には、大量適用経路、例えば飲料水（経口）および噴霧が含まれる。しかし、投与の他の具体例には、注射などが含まれうる。
【００２５】
飲料水経路による投与においては、免疫原性組成物またはワクチンを含有する水を動物の前に配置する前の約２〜４時間にわたり動物に水を与えないのが一般的である。均等にワクチンが分配されうるよう全てのトリが均等に水を飲めるのに十分な給水空間があることが重要である。該ワクチンは、新鮮な飲料水中に有効量（すなわち、免疫原性組成物またはワクチンに関して十分な用量を各トリに与える算出濃度）で適用される。
【００２６】
種々の実施形態においては、該飲料水中の少量の塩素、鉄、亜鉛または銅イオンの存在による生存可能ワクチンウイルスの減少を妨げるために、および／または、該飲料水の乾燥による溶存塩の濃度の増加による生ワクチンウイルスの不活性化を妨げるために、少量のタンパク質保護物質、例えば脱脂乳、脱脂粉乳またはゼラチンを水相に加えることが可能である。
【００２７】
噴霧法を用いる種々の実施形態においては、一般的な適用方法には、粗（ｃｏａｒｓｅ）噴霧適用およびエアゾール投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。粗噴霧法においては、粒子は、通常、１０〜１００ミクロンの範囲の初期滴サイズを有し、エアゾール投与法においては、滴は、通常、＜１〜５０ミクロンの範囲である。しかし、本発明の種々の実施形態においては、任意の滴サイズを用いることが可能である。
【００２８】
小さな粒子の発生のための通常の噴霧装置およびエアゾール発生装置、例えば、背負噴霧、孵化場噴霧および霧吹（ａｔｏｍｉｓｔ）噴霧のための商業的に入手可能な噴霧発生装置を使用するのが、当産業において一般的である。通常の噴霧／エアゾールワクチン接種および飲料水ワクチン接種に関する詳細は、ｔｈｅ Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｓｔ ｖｏｏｒ Ｐｌｕｉｍｖｅｅ， Ｄｏｏｒｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより発行された“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ ｖａｃｃｉｎｅｓ”，ｖａｎ Ｅｃｋら，ＶＩ−ＶＩＩ，１９８８に記載されている。
【００２９】
本発明の方法の他の実施形態においては、点眼および／または嘴の浸漬および／または当技術分野で一般的な任意の他の方法によりワクチンの投与を行うことが可能である。
【００３０】
本発明の他の実施形態においては、不活化トリレオウイルスの投与を行うことが可能である。不活化形態は、長期間にわたって防御抗体が高レベルで得られるという利点を潜在的にもたらす。この特性は、場合によっては、不活化ワクチンを畜種ワクチン接種に特に良く適したものとする。
【００３１】
当技術分野において公知のとおり、増殖後に集めたウイルスの不活化における目的はウイルスの複製を排除することである。一般に、これは、化学的または物理的手段により達成することができる。化学的不活化は、例えば酵素、ホルムアルデヒド、βプロピオラクトン、エチレン−イミンまたはそれらの誘導体でウイルスを処理することにより行うことができる。ついで、必要に応じて、該不活化物質を中和する。例えば、ホルムアルデヒドで不活化された物質をチオスルファートで中和することが可能である。物理的不活化は、好ましくは、ウイルスを高エネルギー放射、例えばＵＶ光またはγ線に付すことにより行うことができる。所望により、処理後にｐＨを約７の値に調節することが可能である。
【００３２】
不活化ワクチンは、非経口的、例えば筋肉内、皮下または当技術分野で一般的な任意の他の方法で投与することが可能である。
【００３３】
本発明はその特定の実施形態に関して説明されているが、さらに修飾が施されうると理解され、添付の特許請求の範囲は、一般には本発明の原則に従う本発明の任意の変更、使用または応用を包含し、また、本発明に関連した技術分野における公知または通常の実施の範囲内に含まれる及び現在存在するか後に生じるかにかかわらず前記で説明されている本質的特徴に適用されうる本開示からのそのような逸脱を含む本発明の任意の変更、用途または応用を包含すると意図される。さらに、本発明の実施形態は特定の寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）特性および／または測定値に関して説明されているが、該実施形態は、本発明の原理から逸脱することなく、異なる寸法特性および／または測定値も許容されうると理解され、添付の特許請求の範囲はそのような相違を包含すると意図される。さらに、本明細書中に挙げてあるすべての特許、特許出願、文献および他の刊行物を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００３４】
本発明の種々の実施形態を更に理解するためには、以下の実施例を参照すべきである。
【００３５】
実施例：
米国におけるニワトリの集団からのサンプルを採取し、株に分離した。これらの株のうちの或る株をＥＲＳ ０６０Ｅ、ＥＲＳ ０７４およびＥＲＳ １０３７として同定した。これらのニワトリが選択された集団はＥＲＳの典型的な症状（例えば、腸炎が挙げられるが、これに限定されるものではない）を示していた。あるニワトリからの血清をＢｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに送って、ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａｌにおいて同定された抗原クラスに該ニワトリが属していたことを確認するためのパネルパターンを行った。すべての血清は、モノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴとのＩＦＴにおける反応性が存在しないことを示した。
【００３６】
この研究を含む結果に基づき、株ＥＲＳ １０３７、ＥＲＳ ０６０ＥおよびＥＲＳ ０７４は、ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａ１においてＥＲＳとして同定されたレオウイルスの新規抗原クラスに属することが確認された。
【００３７】
株ＥＲＳ、ＥＲＳ ０６０ＥおよびＥＲＳ ０７４の更なる研究は、レオウイルスの新規抗原クラスが感染家禽において神経学的症状を引き起こすことを示した。そのような神経学的症状には、頚部のねじれ、振戦などが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの観察は、レオウイルスの新規抗原クラスＥＲＳによる感染の後、レオウイルスに対する母体由来抗体を有する市販ブロイラーおよびＳＰＦニワトリの両方において行った。
【００３８】
１日齢のニワトリの足肉趾（ｆｏｏｔ ｐａｄ）経路および／または皮下に接種を行った１つの実施例においては、生存ニワトリは振戦および頚部のねじれのような神経症状を現した。これらの症状は接種後に認められうる。
【００３９】
野外において、神経学的症状を示すニワトリからＥＲＳを分離した。これらの神経学的症状は、該分離ＥＲＳ株を使用する実験条件下で再現することができた。
【実施例１】
【００４０】
進行中の研究は、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスの株が脳および／または脊髄から分離されうることを示した。
【００４１】
１つの実施例においては、以下の方法を用いて、ＥＲＳ ０７４をＳＰＦニワトリの脳および脊髄から再分離した。
１．神経学的症状を示すニワトリを屍検し、頭部および頚部を集め凍結した。ニワトリが、ねじれた頚部および／または振戦を示すことが観察された場合に、該ニワトリは神経学的症状を示していると判定した。
２．頭部および頚部を解凍した。
３．脳および脊髄上部を無菌的にスワブで拭き取った。
４．スワブをＴＰＢ内に配置し、ボルテックスした。
５．サンプルを３回、凍結／解凍した。
６．サンプルを約３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
７．上清を取り出し、０．４５μｍおよび０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。
８．０．１ｍｌの濾過物質を滴ＣＡＭ経路により１０日の卵内に接種した。
９．卵を毎日明かりに透かして、卵が死んでいないかどうか観察した。
１０．接種の６日後に、すべての卵を開いた。
１１．感染胚から肝臓および漿尿膜を集めた。
１２．Ｗａｒｉｎｇブレンダーを使用して、肝臓および漿尿膜をホモジナイズした。
１３．ホモジネートを３回、凍結・解凍した。
１４．トリレオウイルス抗原を検出するためにＡＧＰ（寒天ゲル沈降素試験（Ａｇａｒ Ｇｅｌ Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ Ｔｅｓｔ））を用いた。ＡＧＰ試験はトリレオウイルス抗原に関して陽性であった。
【実施例２】
【００４２】
（パネルパターン）：
精製トリレオウイルス株１１３３をウサギ（１〜１．５ｋｇ）に感染させることにより、ポリクローナル抗血清を調製した。初回注射の２８日および８４日後、ブースター注射を行った。最後の注射の１４日後、血液を集め、血清を単離した。
【００４３】
モノクローナル抗体によって異なるレオウイルスが特徴づけられた。１つの実施形態においては、初代ＣＥＬ細胞を９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上で増殖させた。未感染細胞を対照として使用した。３７℃、５％ ＣＯ２で２〜４日間のインキュベーションの後、感染した単層を冷９６％ エタノールで固定した。このアルコールを廃棄し、該プレートを洗浄バッファーで洗浄し、ＰＢＳで１：５０または１：２００に希釈された１００μｌの異なるハイブリドーマ細胞培養上清、あるいは１：５０に希釈された１００μｌのウサギポリクローナル血清（ウサギ６８Ａ）を各ウェルに加えた。該プレートを３７℃で６０〜９０分間インキュベートし、洗浄バッファーで２回洗浄し、１：１００希釈蛍光イソチオシアナート標識ウサギ抗マウスまたは１：１００希釈イソチオシアナート標識ヤギ抗ウサギ血清と反応させた。ついで該プレートを洗浄し、グリセロール／ＰＢＳ溶液（１：１）で固定した。蛍光顕微鏡で蛍光の存在を観察した。
【００４４】
この実験で使用した抗血清パネルは、原型トリレオウイルス株１１３３に対して産生させた以下のポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体よりなるものであった。
ウサギ６８Ａ ウサギポリクローナル抗血清
モノクローナル抗体１５４ Ｖａｋｈａｒｉａら １９９６（前掲）
モノクローナル抗体１４−６７ Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．
モノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６ ＥＣＡＣＣ受託番号９９０１１４７２＊
モノクローナル抗体ＩＮＴ １４−１１ ＥＣＡＣＣ受託番号９９０１１４７３＊
モノクローナル抗体１５−０１ ＩＮＴ ＥＣＡＣＣ受託番号９９０１１４７４＊
該パネルパターンは以下のとおりであった。
【００４５】
【表１】
該パネルパターンから理解されうるとおり、株ＥＲＳ １０３７、ＥＲＳ ０６０ＥおよびＥＲＳ ０７４は、株ＥＲＳ（分離体１）に匹敵するパターンを有するが、株Ｓ１１３３、２４０８、１７３３および２１７７とは異なっている。
【実施例３】
【００４６】
以下の実験は、種々の同定株で行った研究を示す。
【００４７】
実験３ａ
実験計画
２０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．５ｍｌのプラーク精製株ＥＲＳ（分離体１）（６．０９ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／トリ）を経口接種した。該ニワトリを臨床徴候に関して毎日１４日間にわたり観察した。１４日齢の時点で、すべてのニワトリを屠殺した。
【００４８】
結果
該ニワトリの３５％が最初の６日間に死亡した（表１）。第１０日に、１羽のニワトリが神経学的症状を現し、第１３日に、もう１羽のニワトリが神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳに感染した雛ニワトリは１０．１グラム／日の体重増加を示し、一方、対照群は１７．０グラム／日の体重増加を示した。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
実験３ｂ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第１５日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
結果：
該トリの２０％が最初の１５日間に死亡した。該トリの４０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは平均９３．８２グラム／日の体重増加を示した。
【００５４】
実験３ｃ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第２０日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００５５】
【表６】
【００５６】
【表７】
結果：
該トリの３０％が最初の２０日間に死亡した。該トリの０．０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは１２６．３８グラム／日の体重増加を示した。
【００５７】
実験３ｄ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第２０日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００５８】
【表８】
【００５９】
【表９】
結果：
該トリの２０％が最初の２０日間に死亡した。該トリの１０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは８７．８１グラム／日の体重増加を示した。
【００６０】
実験３ｅ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第２０日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００６１】
【表１０】
【００６２】
【表１１】
結果：
該トリの１００％が最初の２０日間に死亡した。該トリの５０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは９４．３７グラム／日の体重増加を示した。
【００６３】
実験３ｆ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００６４】
【表１２】
【００６５】
【表１３】
結果：
該トリの１５％が最初の１４日間に死亡した。該トリの１０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは接種の２１日後に５４３グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００６６】
実験３ｇ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００６７】
【表１４】
【００６８】
【表１５】
結果：
該トリの２５％が最初の１４日間に死亡した。該トリの２５％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは接種の２１日後に４８８グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００６９】
実験３ｈ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０２ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００７０】
【表１６】
【００７１】
【表１７】
結果：
該トリの２５％が最初の１４日間に死亡した。該トリの５％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは接種の２１日後に４４２グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００７２】
実験３ｉ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０２ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００７３】
【表１８】
【００７４】
【表１９】
結果：
該トリの５０％が最初の１４日間に死亡した。該トリの５％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは接種の２１日後に４７３グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００７５】
実験３ｊ
実験計画
レオウイルスに対する母体由来抗体を有する７５羽の市販ブロイラー（ＭＤＡ＋）および７５羽のＳＰＦニワトリを１５羽のトリの5群に分けた。該トリにはプラーク精製ＥＲＳ株分離体１を経口的またはＳＣで１または７日齢で与えた。表１は実験計画の詳細を示す。該ニワトリを臨床徴候に関して７週間にわたり毎日観察した。７週齢の時点で、残りのすべてのニワトリを屠殺した。
【００７６】
【表２０】
【００７７】
【表２１】
結果
表２は、ＥＲＳ接種後に死亡したトリの割合（％）を示す。ＳＰＦトリの１００％およびＭＤＡ＋トリの４６．６％は１日齢でのＳＣ接種後３〜７日以内に死亡した。１日齢での経口接種後の４〜８日以内の死亡率（％）はＳＰＦニワトリおよびＭＤＡ＋ニワトリでそれぞれ１３．３％および２０％であった。７日齢でトリに接種した場合には、それらのトリはいずれも死亡しなかった。表３は、ねじれた頚部（％）を示す。ＳＰＦトリおよびＭＤＡ＋トリのどちらにおいても、１または７日齢での経口またはＳＣ接種後に神経学的症状が生じた。該神経学的症状は接種の６日後から認められた。
【００７８】
【表２２】
【００７９】
実験３ｋ
実験計画
２８羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌのプラーク精製株ＥＲＳ Ｐｏｌａｎｄ２（４．６ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／トリ）をＳＣ接種した。該ニワトリを臨床徴候に関して１４日間にわたり毎日観察した。１４日齢の時点で、すべてのニワトリを屠殺した。
【００８０】
結果
該ニワトリの９６．４％が最初の６日間に死亡した（表１）。第９日に、残りの１羽のニワトリが頚部のねじれを示した。
【００８１】
【表２３】
【００８２】
実験３ｌ：相対的非病原性株
１日齢のブロイラーニワトリに気管内経路で接種するために使用するウイルスのストックを調製するために、ＥＲＳ株１０３７を孵化卵内で約１０回継代した。ＥＲＳ株１０３７の研究を高病原性レオウイルス株１７３３に対して行った。
【００８３】
【表２４】
株１０３７は相対的に非病原性であることが示された。なぜなら、該ニワトリの約２０％だけが侵され、吸収不良症候群または成長低下のいずれかの徴候を示したに過ぎず、該ニワトリは１羽も試験期間中に死亡しなかったからである。これは、同様に吸収不良ウイルスである１７３３とは対照的であり、１７３３では、該ニワトリの１００％が侵され、体重減少および／または死亡を示した。同様に、認められうるとおり、株１７３３は該雛ニワトリの３５％を死亡させが、株１０３７は１羽も死亡させなかった。したがって、株１０３７は、本明細書中に定義されているとおりに相対的に非病原性である。
【００８４】
実験４：経口接種後のニワトリの脳のＳ１１３３感染
実験計画
・１０羽のＳＰＦトリに第１日に２．６ ｌｏｇ１０／トリのＳ１１３３ウイルスを経口接種する。
・屍検：２、３、５、７および１０ｄｐｃにおいて２羽のトリ。
・ニワトリ胚肝細胞を使用することによる、脳からのレオウイルスの分離。
【００８５】
結果：
いずれの時点においても脳からレオウイルスは分離されない。
【００８６】
結論：
先行技術の株であるＳ１１３３は経口接種後にニワトリの脳に感染しない。
【００８７】
実験５：ＥＲＳ株の病原性態様
ウイルス株
ＥＲＳ ０１５は、１９９９年にポーランドにおいて、十分にワクチン接種された親に由来する市販ブロイラーから分離された。該トリは高い致死性を示しており、屍検において、肝臓の白色斑点および漿液性心膜炎が見出された。ＩＦＴを用いて、この分離体はレオウイルスであると確認された。モノクローナル抗体のパネルでの更なる特徴づけは、該分離体がＥＲＳクラスに属することを証明した。該分離体を３回プラーク精製した。それは有効性の研究におけるチャレンジ株として使用することになる。予備実験は、ＥＲＳ ０１５分離体が１日齢のＳＰＦトリにおいて振戦および頚部のねじれの症状を引き起こしうることを示した。観察された症状が該新規レオウイルス株により引き起こされたことを確認するために、病原性研究を行った。
【００８８】
実験計画
ＥＲＳ ０１５株をＣＥＦ上で３回プラーク精製し、チャレンジ株として使用した。１３２羽の１日齢ＳＰＦトリを３群に分けた。群１は５５羽のトリを含み、それらに１日齢で０．２ｍｌのＥＲＳ ０１５（１．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／トリ）を筋肉内接種した。群２は５５羽のトリを含み、それらに１日齢で０．２ｍｌのＥＲＳ ０１５（２．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／トリ）を経口接種した。群３は２２羽のトリを含み、それらに０．２ｍｌのＰＢＳを筋肉内接種し、該トリを陰性対照トリとして使用した。
【００８９】
すべてのニワトリを疾患の臨床症状の出現に関して毎日観察した。本明細書中で定義されているとおりの神経学的症状に特別の注意を払った。
【００９０】
接種の７、１４および２１日後、犠死させたトリから血液を採取した。、レオウイルス株ＥＲＳに対する抗体の存在に関してはＩＦＴにおいて、ニューカッスル病に対する抗体の存在に関してはＨＩ試験において、伝染性ニワトリ脳脊髄炎ウイルス（ＡＥＶ）に対する抗体の存在に関してはＥＬＩＳＡにおいて、およびマレック病に対する抗体の存在に関してはＥＬＩＳＡにおいて、血清サンプルを検査した。
【００９１】
群１および２の２または３羽のトリ、および群３の１羽のトリをチャレンジの１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、１７および２１日後に犠死させ、肉眼的病変に関して検査した。
【００９２】
ウイルスの分離のために脳のサンプルを集めた。該器官を、ガラスビーズと１ｍｌのＰＢＳ＋Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐｔ（１０００μｇＵ／ｍｌ）とを含有するピコクリアス（ｐｙｃｏｃｒｉａｓ）チューブ内に配置した。該混合物をＲｅｔｃｈミキサーミル内で最高速度で２０分間振とうした。ホモジネーション後、該懸濁液の０．１ｍｌをニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬｉ）（Ｍ６Ｂ８＋０．１％ ＮＰＰＴ＋５％ ＦＣＳ中、１＊１０６細胞／ｍｌ）上に接種した。５％ ＣＯ２、３５℃で５日間のインキュベーションの後、すべての培養を特異的ＲＥＯ ＣＰＥに関して検査した。懸濁液が陰性であれば、ＣＥＬ上の第２の接種を行った。
【００９３】
組織学的および免疫組織化学的検査のために、脳、胸脊髄、左および右坐骨神経のサンプルを集めた。一次抗体としてのモノクローナル抗体１４−６７、ビオチン化二次（ウサギ抗マウス）抗体、酵素としてのアルカリホスファターゼとのストレプトアビジン−ビオチン−酵素−複合体、および基質としての新たなフクシンを使用して、レオウイルス抗原の検出のために免疫組織化学的検査を行った。
【００９４】
結果の解釈
臨床症状、ウイルス分離およびウイルス抗原の脳内存在の結果を用いて、中枢神経障害を評価した。臨床症状がＥＲＳ ０１５の接種により誘発され、ウイルスが脳に存在する場合には、ＥＲＳは、振戦および頚部のねじれのような中枢神経障害を誘発する原因因子として示された。
【００９５】
結果
臨床症状
群１および２の臨床徴候の結果。臨床徴候は群３のトリにおいては認められなかった。ＩＭの７日以内には高い致死性（８０％）が認められたが、経口接種の１０日後には１羽のトリが死亡したに過ぎなかった。第４日から、乏しい成長およびヘリコプター（ｈｅｌｉｃｏｐｔｅｒ）ニワトリが認められ、どちらの群においても、該実験の終了時まではニワトリは小さいままであった。どちらの群においても、それぞれＩＭまたは経口接種の９または１０日後に１羽のトリが振戦および頚部のねじれを現した。
【００９６】
【表２５】
【００９７】
【表２６】
【００９８】
血清学
陰性対照群においては抗体は見出されず、検査したニワトリにおいてはＮＤＶ、マレック病およびＡＥＶに対する抗体は見出されなかった。ＩＭおよび経口接種した場合には、ＥＲＳに対する抗体価はそれぞれ７、１４および２１日齢で＜２．０、５．０および７．０ ｌｏｇ２であった。
【００９９】
肉眼的および顕微鏡的検査
群１および２のニワトリの種々の器官において見出された肉眼的病変の結果をそれぞれ表１および２に示す。群３のトリにおいては肉眼的異常は見出されなかった。群１および２においては、病変は肝臓（多数の白色ないし黄色の病巣を伴う肥大）、脾臓（変色を伴う肥大、硬化）、水心膜（ｈｙｄｒｏｐｅｒｉｃａｒｄ）、脳（大脳の背部の大出血、萎縮）において見出された。群１においては、病変は脚部筋肉および腱においても見出された（浮腫を伴う腫脹）。
【０１００】
顕微鏡的検査：
坐骨神経において、レオウイルス感染に（見掛け上）関連している所見は、小さな壊死病巣を伴う又は伴わないコラーゲン線維の変性、線維芽細胞の存在、単核または混合浸潤を伴う（多数）病巣炎症であった。この炎症は主として隣接（または周辺／間質／介在）結合組織において観察され、少数の場合には坐骨神経組織自体に広がっていた。さらに、単核または異親和性浸潤が観察され、レオウイルス感染に関連づけられうるであろう。脊髄においてサテリトーシスを有すると疑われる３羽の動物が見出された。脊髄神経節に隣接する脊髄神経節の結合組織（またはその証拠を有さない脊髄神経節の領域）においては、坐骨神経における浸潤と比較しうる浸潤が観察された。第２に、グリア細胞凝集体である可能性もあり、同様にレオウイルス感染に関連しているとみなされる脊髄神経節内の単核浸潤の病巣が観察された。坐骨神経（中央部分）においては、末梢坐骨神経において認められるのと同様の隣接結合組織の炎症は1羽の動物において観察されたに過ぎなかった。少数の動物において、結合組織における単核浸潤が観察された。脳においては、１病巣のグリオーシスまたは血管周囲単核浸潤、浸潤の存在を伴う又は伴わない脈絡叢ループの充血を含むいくつかの所見が観察された。
【０１０１】
群１のトリの右坐骨神経、腹部脊髄および脳ならびに群２の腹部脊髄および脳においてＩＨＣを行った。陽性ＩＨＣを結合組織における浸潤／炎症の症例として記録した。７ｄｐｃにおいて群１の１羽の動物を除き、神経節細胞はウイルス抗原に関して陽性であることが判明した。脳においては、脈絡叢細胞または関連細胞は、群１では第４日から第７日まで及び群２では第５日から第７日まで陽性となった。
【０１０２】
【表２７】
【０１０３】
【表２８】
【０１０４】
レオウイルスの分離
群１および２のトリの種々の器官からのレオウイルスの分離の結果をそれぞれ表３ａおよび３ｂに示す。群３のニワトリからはウイルスは分離されなかった。群１および２のニワトリのすべての器官においてレオウイルスが検出された。ＩＭまたは経口接種の後、ウイルスの分離は接種のそれぞれ１または２日後から始まった。どちらの群においても、脳は接種の１０日後までは陽性であり、腱は接種の２１日後まで陽性のままであった。
【０１０５】
考察
この報告は、中枢神経系に感染するＥＲＳの経路を明らかにするためにＥＲＳ ０１５の病原性を記載している。ＩＭおよび経口の２つの接種経路を用いた。どちらの場合においても、ＥＲＳ ０１５は接種の９または１０日後に1羽のトリにおいて頚部のねじれを誘発することが可能であった。これらの神経学的症状は脳内のウイルスの存在に関連づけられうる。ＥＲＳ ０１５は、接種の１または２日後から、検査したすべてのニワトリの脳から分離された。ウイルス抗原も脳内に示された。
【０１０６】
組織学的評価は、レオウイルスの広がりが、ＩＭ接種後には経口接種後より迅速（いくつかの器官においては病変がより早期に認められる）かつより有効（病変がより長期にわたって認められる）に生じることを示している。さらに、神経組織（末梢坐骨神経または周辺結合組織）は株ＥＲＳによるレオウイルス感染の標的組織でありうることが示された。組織学的所見は、脳へのレオウイルスの広がりが神経線維沿いにではなく血行性経路によって生じることを示唆している。
【０１０７】
本発明者らが知る限りにおいて、これは、トリレオウイルス分離体が中枢神経系障害を引き起こしうることを初めて示すものである。
【０１０８】
【表２９】
【０１０９】
【表３０】
【０１１０】
実験６：
ＥＲＳを含有する不活化ワクチンでワクチン接種された産卵鶏からの後代のＥＲＳ ０１５チャレンジに対する防御
目的
本研究の目的は、ＥＲＳを含有する不活化ワクチンでワクチン接種された産卵鶏からの後代のＥＲＳ ０１５チャレンジに対する防御のレベルを評価することであった。中枢神経障害に対する有効性のクレームの保護をこの実験において評価した。
【０１１１】
実験計画
不活化ＥＲＳワクチンでワクチン接種されていない又はワクチン接種されたＳＰＦ産卵鶏に由来する卵を集め、孵化させた。ＥＲＳでワクチン接種された産卵鶏からの４０羽の雛ニワトリ（群１と称される）、およびＥＲＳ（１８０ＥＵ／用量）でワクチン接種されていない産卵鶏からの４０羽の雛ニワトリ（群２と称される）を、１日齢で０．２ｍｌのＥＲＳ ０１５（２．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／トリ）で経口チャレンジした。ＥＲＳでワクチン接種されていない産卵鶏からの８羽の雛ニワトリ（群３と称される）に０．２ｍｌのＰＢＳを経口およびＩＭ接種した。
【０１１２】
標準的な方法に従い、疾患の臨床徴候の出現に関して、すべてのニワトリを毎日観察した。振戦および頚部のねじれのような中枢神経障害に特別な注意を払った。
【０１１３】
チャレンジの３、７、１０、１４、２１、２８、３５および４２日後、群１および２の５羽のニワトリならびに群３の１羽のニワトリを犠死させた。ウイルスの分離のために、脳のサンプルを集めた。実験５に記載されているのと同じ方法に従った。
【０１１４】
結果の解釈
脳に関するウイルス分離の結果を用いて、神経症状に対する防御を評価した。ワクチン接種されていない産卵鶏からの後代と比較して、ワクチン接種された産卵鶏からの後代の脳においてウイルス複製における有意な減少が示された場合に、該後代は防御されているとみなされた。
【０１１５】
結果
臨床症状
群３のトリにおいては臨床徴候は認められなかった。群１（５羽のニワトリ）および群２（９羽のニワトリ）においては致死性が認められた。屍検において、レオウイルス感染に関連づけられうる多数の白色斑点を伴う肥大した肝臓、肥大した脾臓および／または水心膜が、群１の５羽中２羽および群２の９羽中８羽で見出された。群１の１羽のトリで、１４ｄｐｃにおいて頚部のねじれが認められた。
【０１１６】
レオウイルスの分離
トリの脳からの２継代後のレオウイルスの分離の結果を表１に示す。群１および２における死亡したトリの数に基づき、それは、ある屍検日においては、より少数のトリ（３または４羽）を死亡させたと判定した。群１および３のニワトリの脳からはウイルスは分離されなかった。群２においては、脳は接種の１４日後まで陽性であった。
【０１１７】
【表３１】
【０１１８】
考察
この実験はＣＮＳ障害に対するＥＲＳ不活化ワクチンの有効性を示している。不活化ＥＲＳワクチンでの産卵鶏のワクチン接種がＥＲＳ感染から後代を防御することは明らかである。母体由来抗体を有するトリでは、死亡率はより低かった。ＥＲＳ感染で死亡したトリは僅か２羽であったが、抗体を有さない群では８羽であった。さらに、母体由来抗体を有するトリはいずれも、脳内にウイルスを有していなかったが、群２のすべてのトリは１４ｄｐｃまでは陽性であった。群１においては１羽のニワトリが頚部のねじれを示したが、これは恐らく、ＥＲＳの抗原量が少な過ぎるワクチンによるものであろう。群２においてはＣＮＳは認められなかったが、４０羽中９羽のトリが１３ｄｐｃ以内に死亡し、この時点で頚部のねじれが現れた。それらのニワトリは、神経症状が現れうる前に死亡した可能性があろう。致死性および脳からのＥＲＳ分離に基づき、抗ＥＲＳ母体由来抗体は、ＥＲＳにより引き起こされるＣＮＳ障害から後代を防御すると結論づけることができる。
【０１１９】
本発明の範囲を更に理解するためには、添付の特許請求の範囲を考慮すべきである。
【技術分野】
【０００１】
トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および予防方法ならびに新規付随的特徴に関する。
【背景技術】
【０００２】
レオウイルス感染は世界中で家禽において一般的に見られ、ウイルス性関節炎／腱滑膜炎、吸収不良症候群（ＭＡＳ）、心膜炎、心筋炎および免疫抑制を含む多種多様な臨床徴候を示すニワトリから分離されている［ＭｃＮｕｌｔｙら，“Ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｒｄｓ，”Ｒｅｏｖｉｒｕｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １３，ｐｐｌ８１−１９３（１９９３）］。
【０００３】
特にブロイラー品種におけるウイルス性関節炎／腱滑膜炎は、レオウイルス感染に起因する最も重要な疾患である［Ｎｉｂｅｒｔら， Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８１（２００１）］。それは、ニワトリの飛節および脚腱に主に限局した、慢性炎症性病変を伴う持続的ウイルス感染である。該病変は滑液構造体に限局している［Ｍｅｎｅｎｄｅｚら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１９：１１２−１１７（１９７５）；Ｅｌｌｉｓら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２７：６４４−６５１（１９８３）；Ｋｉｂｅｎｇｅら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１４：８７−９８（１９８５）］；［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８１−１６８２（２００１）］。
【０００４】
レオウイルス感染の臨床徴候／症状は、いくつかのグループにより吸収不良症候群（ＭＡＳ）に関連づけられている［Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．７：１８３−１８７（１９７８）；Ｐａｇｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２６：６１８−６２４（１９８２）；Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２７：２５５−２６０（１９８３）；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３７：４５１−４５８（１９９３）］。該症候群は、不均一な成長、不完全な羽毛および未消化の食物と水様性含有物とを伴う下痢を伴った体重増加の減少により特徴づけられる。病的変化は、ほとんどの場合、前胃腸炎、膵炎および肝炎を含む。ＭＡＳは消化不良もしくは吸収不良のいずれか又はそれらの両方によって引き起こされうる。見出される病変は、不十分な消化液分泌による消化不良、または不十分な吸収能による吸収不良を引き起こしうる。しかし、体重増加の減少にばらつきがあることからも分かるとおり、ＭＡＳから分離されたレオウイルスの病原性は様々である［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８１−１６８２（２００１）；Ｐａｇｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２６：６１８−６２４（１９８２）；ＭｃＮｕｌｔｙら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１３：４２９−４３９（１９８４）；Ｄｅｃａｅｓｓｔｅｃｋｅｒら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１５：７６９−７８２（１９８６）；ＫｉｂｅｎｇｅおよびＤｈｉｌｌｏｎ，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３１：３９−４２（１９８７）；Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎら，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１７：８７９−８９２（１９８８）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．４１：８０−９２（１９９７） Ｓｏｎｇｓｅｒｍら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．４６：８７−９４（２００２）］。現在のところ、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスは先行技術においては開示されていない。
【０００５】
先行技術において、公知トリレオウイルスに対する幾つかのワクチンが存在する。生ワクチンの具体例には、株Ｓ１１３３および２１７７が含まれる。米国における生ワクチンは、腱滑膜炎の野外症例からｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅにより分離され特徴づけられた、種々の継代レベルのトリレオウイルス株Ｓ１１３３から開発された。株Ｓ１１３３は漿尿膜（ＣＡＭ）内で３７℃で連続的に２３５回、ついでニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）内で３２℃で６５回培養された。さらに１３５回の継代がＣＥＦ内で３７℃で行われた［ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．，２７：６９８−７０６（１９８３）］。株２１７７はＲｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒによりトリレオウイルスの野外症例から分離され特徴づけられた［米国特許第５，５２５，３４２号］。株２１７７は、組織サンプルを孵化卵内に接種し卵黄流体を集めることにより、レオウイルス疾患を示すニワトリから分離された。ついで、この卵黄流体はＣＥＦ内に接種され、細胞病理が観察されるまで１４回継代され、その時点で該ウイルスがプラーク精製された。ついで、ウイルスのストックを得るために、この卵黄流体は孵化卵内での増殖に付された。該ストックは非病原性であることが判明し、株２１７７と命名された。現在のところ、馴化無しのＶｅｒｏ細胞上で直接、レオウイルスを増殖させる／培養することは不可能である［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐｐ．１６８１−１６８２（２００１）］。最も一般的な方法は孵化鶏卵内での増殖である。先行技術においては、哺乳類細胞内で増殖しうるトリオルトレオウイルス（レオウイルス）のいくつかの特徴を有する哺乳類レオウイルスである、オーストラリアオオコウモリ由来のオルトレオウイルスが開示されている［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８２（２００１）］。しかし、馴化無しで哺乳類細胞内で増殖しうるトリレオウイルスは先行技術においては開示されていない［Ｎｉｂｅｒｔら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：ｐ．１６８２（２００１）］。また、先行技術は、トリレオウイルスにより引き起こされる家禽における神経学的症状の治療および／または予防方法を開示していない。したがって、当技術分野においては、トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／予防方法が求められている。
【０００６】
最近、ｖａｎ Ｌｏｏｎら［Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］は、腸レオウイルス株（ＥＲＳ）と称される新規クラスのレオウイルスの単離および同定を記載した。ＥＲＳは、高い致死性を示すものとしてブロイラーから単離された。それらのブロイラーは、レオウイルス感染に対して十分にワクチン接種された親集団に由来するものであった。ＥＲＳはレオウイルスの新規血清型であることが明らかとなった。なぜなら、該ウイルスは、プラーク減少試験を用いた場合に公知レオウイルスにより中和され得なかったからである［ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］。さらに、モノクローナル抗体のパネルでのＥＲＳの特徴づけは、これらの株が、文献に既に記載されているレオウイルス株とは異なるパネルパターンを示すことを明らかにした［Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２７：２４６−２５４（１９８３）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１６：１０６７−１０７２（１９７２）；Ｏｌｓｏｎら，Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．１８：７３５−７３９（１９５７）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３３：５３５−５４４（１９８９）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１８：２８９−２９６（１９７４）］。さらに、当技術分野で受け入れられている方法でプラーク減少アッセイを行うことにより、これがレオウイルスの新規抗原クラスであると同定された（米国特許出願第号）。プラーク減少アッセイの説明はＮｅｒｓｅｓｓｉａｎらによる文献（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．Ｎ５０，１９８９，ｐｐ．１４７５−１４８０）に記載されている。この文献は、トリレオウイルスの異種免疫特性を証明しており、レオウイルス分離体間の抗原関係（類似性および相違を含むが、これらに限定されるものではない）を決定し特徴づけるためのプラーク減少アッセイの使用の正当性を立証している。野外のレオウイルスに関するスクリーニングにおいて、オランダ、ベルギー、アイルランド、英国、スペイン、ドイツ、イタリア、米国、アルゼンチン、アラブ首長国連邦、南アフリカ、フィリピンおよびインドネシアにもＥＲＳ型株が存在することが認められた。これらのＥＲＳ型株は、通常、ＭＡＳを有する鳥類から分離された。特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリにおけるＥＲＳの病原性および散在は、ＥＲＳが高い致死性、腱滑膜炎（未公開の観察）およびＭＡＳを誘発しうることを証明した［ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］。レオウイルスに対する母体由来抗体を有する商業的ブロイラーにおいても、ｖａｎ Ｌｏｏｎら［Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，２３：１２９−１３３（２００１）］は、１日齢または７日齢に接種されたブロイラーにおいてそれぞれ３５％および２５％の成長遅延を示した。この新規クラスの更なる研究および評価は、他の驚くべき特徴を提供している。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の概要）
全般的には、本発明の実施形態は、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスのクラス、ならびにトリレオウイルスのクラスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／または予防方法に関する。
【０００８】
１つの実施形態において、トリ腸レオウイルス株（Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎ）（ＥＲＳ）と称されるレオウイルスのクラスが神経学的症状を引き起こすことが見出された。そのような神経学的症状には、頚部のねじれ、振戦などが含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。さらに、１つの実施形態においては、トリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／または予防方法が、生、弱毒化または不活化形態のＥＲＳトリレオウイルスと担体または希釈剤とを含む免疫原性組成物またはワクチンの有効量を投与することを含むことが見出された。
【０００９】
本発明の方法の１つの実施形態においては、投与する免疫原性組成物またはワクチンは、米国特許出願第０９／４９３，４８４号（以下、‘４８４出願と称する）のウイルスのクラスの実施形態の特徴を有するものとして特徴づけられるレオウイルスの抗原クラスのレオウイルスを含む。‘４８４出願は、公開されている２０００年１月２５日付け出願の欧州特許出願番号００２００２５６．６からの優先権を主張している。該欧州特許出願は公開番号ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａ１として２０００年８月２日付けで公開された。
【００１０】
レオウイルスのそのようなクラスは、ＥＣＡＣＣ（英国ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ））に受託番号９９０１１４７５でサンプルが寄託されている株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも７５％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属するものとして特徴づけられ、そのようなクラスは更に、トリレオウイルス分離体（好ましくは原型レオウイルス株１１３３）に対して産生させたポリクローナル抗血清とのＩＦＴにおける反応性により、ならびにモノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴ（それらのハイブリドーマはそれぞれ受託番号９９０１１４７２、９９０１１４７３および９９０１１４７４でＥＣＡＣＣに寄託されている）とのＩＦＴにおける反応性の非存在により特徴づけられる。
【００１１】
この概要のいかなる点も、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明の範囲を更に詳しく理解するためには、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲に注目すべきである。
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書中で用いる「相対的（に）非病原性」なる語は、ウイルスの病原性が有意に減少していて、該ウイルスの生株で免疫された家禽の約２０％以下が該ウイルスに侵されることを意味する。本明細書中で用いる「ニワトリ」なる語は、ブロイラー、繁殖株、産卵株などを含むすべてのニワトリを意味する。「家禽」なる語はニワトリ、シチメンチョウ、水鳥、ホロホロチョウ（ｇｕｉｎｅａ）、ウズラ、ハト、ダチョウなどを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書中で用いる「天然」なる語は、人的介入が存在しないことを意味する。しかし、「天然に非病原性」な株は、種々の実施形態においては、ウイルスストックなどを調製するために継代されうると意図される。さらに、該ウイルスが、継代の前に、定義されているとおりの「相対的（に）非病原性」である場合には、そのような継代により、ウイルスが「天然に非病原性」でないとみなされるようになることはないと意図される。
【００１３】
本明細書中で用いる「ワクチン株」なる語は、免疫原性組成物またはワクチンにおいて使用するのに適したウイルス株を意味する。「ワクチン株」には、非病原性株または相対的に非病原性の株、不活化株および／または弱毒化株が含まれうるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００１４】
２０００年１月２８日付けの‘４８１出願は、トリレオウイルスの新規抗原クラスを初めて明らかにした。‘４８１出願は、公開されている２０００年１月２５日付け出願の欧州特許出願番号００２００２５６．６からの優先権を主張している。該欧州特許出願は公開番号ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａ１として２０００年８月２日付けで公開された。
【００１５】
本出願における新規クラスはトリレオウイルスＥＲＳ（腸レオウイルス株）として特徴づけられた。該クラスは腸障害、レオウイルス関連疾患（例えば、過度に液状の便および／または消化不良の食物）を引き起こすことが判明したため、該クラスはＥＲＳとして同定された。本発明において、驚くべきことに、トリレオウイルスＥＲＳであるレオウイルスクラスが神経学的症状を引き起こすことが見出された。神経学的症状には、頚部のねじれ（斜頚（ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｏｓｉｓ）とも称される）および振戦が含まれるが、これらに限定されるものではなく、これらのすべてが要求されるわけではない。
【００１６】
したがって、本発明の実施形態は全般的には、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスのクラス、ならびにトリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療方法に関する。１つの実施形態においては、本発明の方法は、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスの生、弱毒化または不活化形態と担体または希釈剤とを含む免疫原性組成物またはワクチンの有効量を投与することを含む。したがって、更なる実施形態は、欧州出願ＥＰ１ ０２４ １８９ Ａ１のウイルスのクラスの特徴を有するレオウイルスの抗原クラスのレオウイルスを含む免疫原性組成物またはワクチンに関する。
【００１７】
レオウイルスのそのようなクラスは、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫに受託番号９９０１１４７５でサンプルが寄託されている株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも７５％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属するものとして特徴づけられ、および／または、そのようなクラスは更に、トリレオウイルス分離体（好ましくは原型レオウイルス株１１３３）に対して産生させたポリクローナル抗血清とのＩＦＴにおける反応性により、ならびにモノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴ（それらのハイブリドーマはそれぞれ受託番号９９０１１４７２、９９０１１４７３および９９０１１４７４でＥＣＡＣＣに寄託されている）とのＩＦＴにおける反応性の非存在により特徴づけられる。
【００１８】
本発明の他のレオウイルス、および本発明のワクチン／方法において使用するための他のレオウイルスは、株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも８０％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属する免疫原性組成物またはワクチンのレオウイルスとして特徴づけられる。本発明の他のレオウイルス、および本発明のワクチン／方法において使用するための他のレオウイルスは、株ＥＲＳにより形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも９０％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属する免疫原性組成物またはワクチンのレオウイルスとして特徴づけられる。
【００１９】
本発明の方法における使用に適したレオウイルスを代表する典型的で非限定的な株には、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫに受託番号９９０１１４７５で寄託されている株ＥＲＳ（分離体１）、２００２年１０月１日にＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号ｐｔａ−４７３５で寄託されている株ＥＲＳ １０３７、２００２年１０月３０日にＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号ｐｔａ−４７８２として寄託されている株ＥＲＳ ０６０Ｅ、および２００２年１０月３０日にＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号ＰＴＡ−４７８３で寄託されている株ＥＲＳ ０７４が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の株、および本発明の方法のための免疫原性組成物またはワクチンにおいて使用する株は、当技術分野において一般的な方法に従い家禽から分離することが可能である。ニワトリの場合には、レオウイルスの株は、レオウイルス関連疾患を有するニワトリから分離される。ウイルス分離のための方法は当技術分野において一般的である。分離においては、該ウイルスは、レオウイルス関連疾患の徴候を示すブロイラーから集めた感染腱から分離した。しかし、本発明の方法は、トリのどの部分から該ウイルスが分離されたかによっては限定されない。
【００２１】
実際のところ、驚くべきことに、本発明のトリレオウイルスは、トリレオウイルスにより誘発される神経学的症状に罹患した家禽の神経系、例えば脳および脊髄から分離されうることが見出された。これまでには、トリレオウイルスは、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体からは分離されていない。さらに、神経学的症状を引き起こす株のみが、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体から分離されうると考えられる。実際のところ、神経学的症状を引き起こさない先行技術のレオウイルスは、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体からは分離され得ないことが、実験の部において示されている。
【００２２】
したがって、本発明は、家禽の神経系から分離されうるトリレオウイルスのクラスを開示する。種々の実施形態においては、そのように特徴づけられるトリレオウイルスのクラスは、脳、脊髄、および／または神経系に関連した他の構造体から分離されうる。
【００２３】
種々の実施形態においては、本発明の方法において使用する免疫原性組成物またはワクチンは、単独で又は家禽に対する他のウイルス（例えば、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、ニワトリ貧血ウイルスなど）ワクチンと組合せて投与することが可能である。他の実施形態は細菌抗原などを同時に含有することが可能である。さらに、本発明の方法において使用する好ましい免疫原性組成物またはワクチンとしては、若齢（例えば、１日齢）で及び／又は卵内に投与されうるワクチンが挙げられる。
【００２４】
本発明の方法における免疫原性組成物またはワクチンの投与は、トリレオウイルスの投与に一般に用いられる任意の経路によるものでありうる。好ましい投与経路には、大量適用経路、例えば飲料水（経口）および噴霧が含まれる。しかし、投与の他の具体例には、注射などが含まれうる。
【００２５】
飲料水経路による投与においては、免疫原性組成物またはワクチンを含有する水を動物の前に配置する前の約２〜４時間にわたり動物に水を与えないのが一般的である。均等にワクチンが分配されうるよう全てのトリが均等に水を飲めるのに十分な給水空間があることが重要である。該ワクチンは、新鮮な飲料水中に有効量（すなわち、免疫原性組成物またはワクチンに関して十分な用量を各トリに与える算出濃度）で適用される。
【００２６】
種々の実施形態においては、該飲料水中の少量の塩素、鉄、亜鉛または銅イオンの存在による生存可能ワクチンウイルスの減少を妨げるために、および／または、該飲料水の乾燥による溶存塩の濃度の増加による生ワクチンウイルスの不活性化を妨げるために、少量のタンパク質保護物質、例えば脱脂乳、脱脂粉乳またはゼラチンを水相に加えることが可能である。
【００２７】
噴霧法を用いる種々の実施形態においては、一般的な適用方法には、粗（ｃｏａｒｓｅ）噴霧適用およびエアゾール投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。粗噴霧法においては、粒子は、通常、１０〜１００ミクロンの範囲の初期滴サイズを有し、エアゾール投与法においては、滴は、通常、＜１〜５０ミクロンの範囲である。しかし、本発明の種々の実施形態においては、任意の滴サイズを用いることが可能である。
【００２８】
小さな粒子の発生のための通常の噴霧装置およびエアゾール発生装置、例えば、背負噴霧、孵化場噴霧および霧吹（ａｔｏｍｉｓｔ）噴霧のための商業的に入手可能な噴霧発生装置を使用するのが、当産業において一般的である。通常の噴霧／エアゾールワクチン接種および飲料水ワクチン接種に関する詳細は、ｔｈｅ Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｓｔ ｖｏｏｒ Ｐｌｕｉｍｖｅｅ， Ｄｏｏｒｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより発行された“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ ｖａｃｃｉｎｅｓ”，ｖａｎ Ｅｃｋら，ＶＩ−ＶＩＩ，１９８８に記載されている。
【００２９】
本発明の方法の他の実施形態においては、点眼および／または嘴の浸漬および／または当技術分野で一般的な任意の他の方法によりワクチンの投与を行うことが可能である。
【００３０】
本発明の他の実施形態においては、不活化トリレオウイルスの投与を行うことが可能である。不活化形態は、長期間にわたって防御抗体が高レベルで得られるという利点を潜在的にもたらす。この特性は、場合によっては、不活化ワクチンを畜種ワクチン接種に特に良く適したものとする。
【００３１】
当技術分野において公知のとおり、増殖後に集めたウイルスの不活化における目的はウイルスの複製を排除することである。一般に、これは、化学的または物理的手段により達成することができる。化学的不活化は、例えば酵素、ホルムアルデヒド、βプロピオラクトン、エチレン−イミンまたはそれらの誘導体でウイルスを処理することにより行うことができる。ついで、必要に応じて、該不活化物質を中和する。例えば、ホルムアルデヒドで不活化された物質をチオスルファートで中和することが可能である。物理的不活化は、好ましくは、ウイルスを高エネルギー放射、例えばＵＶ光またはγ線に付すことにより行うことができる。所望により、処理後にｐＨを約７の値に調節することが可能である。
【００３２】
不活化ワクチンは、非経口的、例えば筋肉内、皮下または当技術分野で一般的な任意の他の方法で投与することが可能である。
【００３３】
本発明はその特定の実施形態に関して説明されているが、さらに修飾が施されうると理解され、添付の特許請求の範囲は、一般には本発明の原則に従う本発明の任意の変更、使用または応用を包含し、また、本発明に関連した技術分野における公知または通常の実施の範囲内に含まれる及び現在存在するか後に生じるかにかかわらず前記で説明されている本質的特徴に適用されうる本開示からのそのような逸脱を含む本発明の任意の変更、用途または応用を包含すると意図される。さらに、本発明の実施形態は特定の寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）特性および／または測定値に関して説明されているが、該実施形態は、本発明の原理から逸脱することなく、異なる寸法特性および／または測定値も許容されうると理解され、添付の特許請求の範囲はそのような相違を包含すると意図される。さらに、本明細書中に挙げてあるすべての特許、特許出願、文献および他の刊行物を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００３４】
本発明の種々の実施形態を更に理解するためには、以下の実施例を参照すべきである。
【００３５】
実施例：
米国におけるニワトリの集団からのサンプルを採取し、株に分離した。これらの株のうちの或る株をＥＲＳ ０６０Ｅ、ＥＲＳ ０７４およびＥＲＳ １０３７として同定した。これらのニワトリが選択された集団はＥＲＳの典型的な症状（例えば、腸炎が挙げられるが、これに限定されるものではない）を示していた。あるニワトリからの血清をＢｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに送って、ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａｌにおいて同定された抗原クラスに該ニワトリが属していたことを確認するためのパネルパターンを行った。すべての血清は、モノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴとのＩＦＴにおける反応性が存在しないことを示した。
【００３６】
この研究を含む結果に基づき、株ＥＲＳ １０３７、ＥＲＳ ０６０ＥおよびＥＲＳ ０７４は、ＥＰ １ ０２４ １８９ Ａ１においてＥＲＳとして同定されたレオウイルスの新規抗原クラスに属することが確認された。
【００３７】
株ＥＲＳ、ＥＲＳ ０６０ＥおよびＥＲＳ ０７４の更なる研究は、レオウイルスの新規抗原クラスが感染家禽において神経学的症状を引き起こすことを示した。そのような神経学的症状には、頚部のねじれ、振戦などが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの観察は、レオウイルスの新規抗原クラスＥＲＳによる感染の後、レオウイルスに対する母体由来抗体を有する市販ブロイラーおよびＳＰＦニワトリの両方において行った。
【００３８】
１日齢のニワトリの足肉趾（ｆｏｏｔ ｐａｄ）経路および／または皮下に接種を行った１つの実施例においては、生存ニワトリは振戦および頚部のねじれのような神経症状を現した。これらの症状は接種後に認められうる。
【００３９】
野外において、神経学的症状を示すニワトリからＥＲＳを分離した。これらの神経学的症状は、該分離ＥＲＳ株を使用する実験条件下で再現することができた。
【実施例１】
【００４０】
進行中の研究は、神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスの株が脳および／または脊髄から分離されうることを示した。
【００４１】
１つの実施例においては、以下の方法を用いて、ＥＲＳ ０７４をＳＰＦニワトリの脳および脊髄から再分離した。
１．神経学的症状を示すニワトリを屍検し、頭部および頚部を集め凍結した。ニワトリが、ねじれた頚部および／または振戦を示すことが観察された場合に、該ニワトリは神経学的症状を示していると判定した。
２．頭部および頚部を解凍した。
３．脳および脊髄上部を無菌的にスワブで拭き取った。
４．スワブをＴＰＢ内に配置し、ボルテックスした。
５．サンプルを３回、凍結／解凍した。
６．サンプルを約３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
７．上清を取り出し、０．４５μｍおよび０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。
８．０．１ｍｌの濾過物質を滴ＣＡＭ経路により１０日の卵内に接種した。
９．卵を毎日明かりに透かして、卵が死んでいないかどうか観察した。
１０．接種の６日後に、すべての卵を開いた。
１１．感染胚から肝臓および漿尿膜を集めた。
１２．Ｗａｒｉｎｇブレンダーを使用して、肝臓および漿尿膜をホモジナイズした。
１３．ホモジネートを３回、凍結・解凍した。
１４．トリレオウイルス抗原を検出するためにＡＧＰ（寒天ゲル沈降素試験（Ａｇａｒ Ｇｅｌ Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ Ｔｅｓｔ））を用いた。ＡＧＰ試験はトリレオウイルス抗原に関して陽性であった。
【実施例２】
【００４２】
（パネルパターン）：
精製トリレオウイルス株１１３３をウサギ（１〜１．５ｋｇ）に感染させることにより、ポリクローナル抗血清を調製した。初回注射の２８日および８４日後、ブースター注射を行った。最後の注射の１４日後、血液を集め、血清を単離した。
【００４３】
モノクローナル抗体によって異なるレオウイルスが特徴づけられた。１つの実施形態においては、初代ＣＥＬ細胞を９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上で増殖させた。未感染細胞を対照として使用した。３７℃、５％ ＣＯ２で２〜４日間のインキュベーションの後、感染した単層を冷９６％ エタノールで固定した。このアルコールを廃棄し、該プレートを洗浄バッファーで洗浄し、ＰＢＳで１：５０または１：２００に希釈された１００μｌの異なるハイブリドーマ細胞培養上清、あるいは１：５０に希釈された１００μｌのウサギポリクローナル血清（ウサギ６８Ａ）を各ウェルに加えた。該プレートを３７℃で６０〜９０分間インキュベートし、洗浄バッファーで２回洗浄し、１：１００希釈蛍光イソチオシアナート標識ウサギ抗マウスまたは１：１００希釈イソチオシアナート標識ヤギ抗ウサギ血清と反応させた。ついで該プレートを洗浄し、グリセロール／ＰＢＳ溶液（１：１）で固定した。蛍光顕微鏡で蛍光の存在を観察した。
【００４４】
この実験で使用した抗血清パネルは、原型トリレオウイルス株１１３３に対して産生させた以下のポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体よりなるものであった。
ウサギ６８Ａ ウサギポリクローナル抗血清
モノクローナル抗体１５４ Ｖａｋｈａｒｉａら １９９６（前掲）
モノクローナル抗体１４−６７ Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．
モノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６ ＥＣＡＣＣ受託番号９９０１１４７２＊
モノクローナル抗体ＩＮＴ １４−１１ ＥＣＡＣＣ受託番号９９０１１４７３＊
モノクローナル抗体１５−０１ ＩＮＴ ＥＣＡＣＣ受託番号９９０１１４７４＊
該パネルパターンは以下のとおりであった。
【００４５】
【表１】
該パネルパターンから理解されうるとおり、株ＥＲＳ １０３７、ＥＲＳ ０６０ＥおよびＥＲＳ ０７４は、株ＥＲＳ（分離体１）に匹敵するパターンを有するが、株Ｓ１１３３、２４０８、１７３３および２１７７とは異なっている。
【実施例３】
【００４６】
以下の実験は、種々の同定株で行った研究を示す。
【００４７】
実験３ａ
実験計画
２０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．５ｍｌのプラーク精製株ＥＲＳ（分離体１）（６．０９ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／トリ）を経口接種した。該ニワトリを臨床徴候に関して毎日１４日間にわたり観察した。１４日齢の時点で、すべてのニワトリを屠殺した。
【００４８】
結果
該ニワトリの３５％が最初の６日間に死亡した（表１）。第１０日に、１羽のニワトリが神経学的症状を現し、第１３日に、もう１羽のニワトリが神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳに感染した雛ニワトリは１０．１グラム／日の体重増加を示し、一方、対照群は１７．０グラム／日の体重増加を示した。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
実験３ｂ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第１５日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
結果：
該トリの２０％が最初の１５日間に死亡した。該トリの４０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは平均９３．８２グラム／日の体重増加を示した。
【００５４】
実験３ｃ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第２０日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００５５】
【表６】
【００５６】
【表７】
結果：
該トリの３０％が最初の２０日間に死亡した。該トリの０．０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは１２６．３８グラム／日の体重増加を示した。
【００５７】
実験３ｄ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第２０日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００５８】
【表８】
【００５９】
【表９】
結果：
該トリの２０％が最初の２０日間に死亡した。該トリの１０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは８７．８１グラム／日の体重増加を示した。
【００６０】
実験３ｅ
１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第２０日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００６１】
【表１０】
【００６２】
【表１１】
結果：
該トリの１００％が最初の２０日間に死亡した。該トリの５０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは９４．３７グラム／日の体重増加を示した。
【００６３】
実験３ｆ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００６４】
【表１２】
【００６５】
【表１３】
結果：
該トリの１５％が最初の１４日間に死亡した。該トリの１０％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは接種の２１日後に５４３グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００６６】
実験３ｇ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０３ ＴＣＩＤ５０／トリ）を皮下接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００６７】
【表１４】
【００６８】
【表１５】
結果：
該トリの２５％が最初の１４日間に死亡した。該トリの２５％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは接種の２１日後に４８８グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００６９】
実験３ｈ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０６０Ｅ（１０２ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００７０】
【表１６】
【００７１】
【表１７】
結果：
該トリの２５％が最初の１４日間に死亡した。該トリの５％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０６０Ｅに感染した雛ニワトリは接種の２１日後に４４２グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００７２】
実験３ｉ
２０羽の１日齢のブロイラーニワトリに０．２ｍｌの株ＥＲＳ ０７４（１０２ ＴＣＩＤ５０／トリ）を足肉趾経路で接種した。第１４日に該ニワトリを臨床徴候に関して観察した。
【００７３】
【表１８】
【００７４】
【表１９】
結果：
該トリの５０％が最初の１４日間に死亡した。該トリの５％が神経学的症状を示した。さらに、ＥＲＳ ０７４に感染した雛ニワトリは接種の２１日後に４７３グラムの平均体重を示した。陰性対照トリは接種の２１日後に７５１グラムの平均体重を有していた。
【００７５】
実験３ｊ
実験計画
レオウイルスに対する母体由来抗体を有する７５羽の市販ブロイラー（ＭＤＡ＋）および７５羽のＳＰＦニワトリを１５羽のトリの5群に分けた。該トリにはプラーク精製ＥＲＳ株分離体１を経口的またはＳＣで１または７日齢で与えた。表１は実験計画の詳細を示す。該ニワトリを臨床徴候に関して７週間にわたり毎日観察した。７週齢の時点で、残りのすべてのニワトリを屠殺した。
【００７６】
【表２０】
【００７７】
【表２１】
結果
表２は、ＥＲＳ接種後に死亡したトリの割合（％）を示す。ＳＰＦトリの１００％およびＭＤＡ＋トリの４６．６％は１日齢でのＳＣ接種後３〜７日以内に死亡した。１日齢での経口接種後の４〜８日以内の死亡率（％）はＳＰＦニワトリおよびＭＤＡ＋ニワトリでそれぞれ１３．３％および２０％であった。７日齢でトリに接種した場合には、それらのトリはいずれも死亡しなかった。表３は、ねじれた頚部（％）を示す。ＳＰＦトリおよびＭＤＡ＋トリのどちらにおいても、１または７日齢での経口またはＳＣ接種後に神経学的症状が生じた。該神経学的症状は接種の６日後から認められた。
【００７８】
【表２２】
【００７９】
実験３ｋ
実験計画
２８羽の１日齢のＳＰＦニワトリに０．２ｍｌのプラーク精製株ＥＲＳ Ｐｏｌａｎｄ２（４．６ ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／トリ）をＳＣ接種した。該ニワトリを臨床徴候に関して１４日間にわたり毎日観察した。１４日齢の時点で、すべてのニワトリを屠殺した。
【００８０】
結果
該ニワトリの９６．４％が最初の６日間に死亡した（表１）。第９日に、残りの１羽のニワトリが頚部のねじれを示した。
【００８１】
【表２３】
【００８２】
実験３ｌ：相対的非病原性株
１日齢のブロイラーニワトリに気管内経路で接種するために使用するウイルスのストックを調製するために、ＥＲＳ株１０３７を孵化卵内で約１０回継代した。ＥＲＳ株１０３７の研究を高病原性レオウイルス株１７３３に対して行った。
【００８３】
【表２４】
株１０３７は相対的に非病原性であることが示された。なぜなら、該ニワトリの約２０％だけが侵され、吸収不良症候群または成長低下のいずれかの徴候を示したに過ぎず、該ニワトリは１羽も試験期間中に死亡しなかったからである。これは、同様に吸収不良ウイルスである１７３３とは対照的であり、１７３３では、該ニワトリの１００％が侵され、体重減少および／または死亡を示した。同様に、認められうるとおり、株１７３３は該雛ニワトリの３５％を死亡させが、株１０３７は１羽も死亡させなかった。したがって、株１０３７は、本明細書中に定義されているとおりに相対的に非病原性である。
【００８４】
実験４：経口接種後のニワトリの脳のＳ１１３３感染
実験計画
・１０羽のＳＰＦトリに第１日に２．６ ｌｏｇ１０／トリのＳ１１３３ウイルスを経口接種する。
・屍検：２、３、５、７および１０ｄｐｃにおいて２羽のトリ。
・ニワトリ胚肝細胞を使用することによる、脳からのレオウイルスの分離。
【００８５】
結果：
いずれの時点においても脳からレオウイルスは分離されない。
【００８６】
結論：
先行技術の株であるＳ１１３３は経口接種後にニワトリの脳に感染しない。
【００８７】
実験５：ＥＲＳ株の病原性態様
ウイルス株
ＥＲＳ ０１５は、１９９９年にポーランドにおいて、十分にワクチン接種された親に由来する市販ブロイラーから分離された。該トリは高い致死性を示しており、屍検において、肝臓の白色斑点および漿液性心膜炎が見出された。ＩＦＴを用いて、この分離体はレオウイルスであると確認された。モノクローナル抗体のパネルでの更なる特徴づけは、該分離体がＥＲＳクラスに属することを証明した。該分離体を３回プラーク精製した。それは有効性の研究におけるチャレンジ株として使用することになる。予備実験は、ＥＲＳ ０１５分離体が１日齢のＳＰＦトリにおいて振戦および頚部のねじれの症状を引き起こしうることを示した。観察された症状が該新規レオウイルス株により引き起こされたことを確認するために、病原性研究を行った。
【００８８】
実験計画
ＥＲＳ ０１５株をＣＥＦ上で３回プラーク精製し、チャレンジ株として使用した。１３２羽の１日齢ＳＰＦトリを３群に分けた。群１は５５羽のトリを含み、それらに１日齢で０．２ｍｌのＥＲＳ ０１５（１．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／トリ）を筋肉内接種した。群２は５５羽のトリを含み、それらに１日齢で０．２ｍｌのＥＲＳ ０１５（２．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／トリ）を経口接種した。群３は２２羽のトリを含み、それらに０．２ｍｌのＰＢＳを筋肉内接種し、該トリを陰性対照トリとして使用した。
【００８９】
すべてのニワトリを疾患の臨床症状の出現に関して毎日観察した。本明細書中で定義されているとおりの神経学的症状に特別の注意を払った。
【００９０】
接種の７、１４および２１日後、犠死させたトリから血液を採取した。、レオウイルス株ＥＲＳに対する抗体の存在に関してはＩＦＴにおいて、ニューカッスル病に対する抗体の存在に関してはＨＩ試験において、伝染性ニワトリ脳脊髄炎ウイルス（ＡＥＶ）に対する抗体の存在に関してはＥＬＩＳＡにおいて、およびマレック病に対する抗体の存在に関してはＥＬＩＳＡにおいて、血清サンプルを検査した。
【００９１】
群１および２の２または３羽のトリ、および群３の１羽のトリをチャレンジの１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、１７および２１日後に犠死させ、肉眼的病変に関して検査した。
【００９２】
ウイルスの分離のために脳のサンプルを集めた。該器官を、ガラスビーズと１ｍｌのＰＢＳ＋Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐｔ（１０００μｇＵ／ｍｌ）とを含有するピコクリアス（ｐｙｃｏｃｒｉａｓ）チューブ内に配置した。該混合物をＲｅｔｃｈミキサーミル内で最高速度で２０分間振とうした。ホモジネーション後、該懸濁液の０．１ｍｌをニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬｉ）（Ｍ６Ｂ８＋０．１％ ＮＰＰＴ＋５％ ＦＣＳ中、１＊１０６細胞／ｍｌ）上に接種した。５％ ＣＯ２、３５℃で５日間のインキュベーションの後、すべての培養を特異的ＲＥＯ ＣＰＥに関して検査した。懸濁液が陰性であれば、ＣＥＬ上の第２の接種を行った。
【００９３】
組織学的および免疫組織化学的検査のために、脳、胸脊髄、左および右坐骨神経のサンプルを集めた。一次抗体としてのモノクローナル抗体１４−６７、ビオチン化二次（ウサギ抗マウス）抗体、酵素としてのアルカリホスファターゼとのストレプトアビジン−ビオチン−酵素−複合体、および基質としての新たなフクシンを使用して、レオウイルス抗原の検出のために免疫組織化学的検査を行った。
【００９４】
結果の解釈
臨床症状、ウイルス分離およびウイルス抗原の脳内存在の結果を用いて、中枢神経障害を評価した。臨床症状がＥＲＳ ０１５の接種により誘発され、ウイルスが脳に存在する場合には、ＥＲＳは、振戦および頚部のねじれのような中枢神経障害を誘発する原因因子として示された。
【００９５】
結果
臨床症状
群１および２の臨床徴候の結果。臨床徴候は群３のトリにおいては認められなかった。ＩＭの７日以内には高い致死性（８０％）が認められたが、経口接種の１０日後には１羽のトリが死亡したに過ぎなかった。第４日から、乏しい成長およびヘリコプター（ｈｅｌｉｃｏｐｔｅｒ）ニワトリが認められ、どちらの群においても、該実験の終了時まではニワトリは小さいままであった。どちらの群においても、それぞれＩＭまたは経口接種の９または１０日後に１羽のトリが振戦および頚部のねじれを現した。
【００９６】
【表２５】
【００９７】
【表２６】
【００９８】
血清学
陰性対照群においては抗体は見出されず、検査したニワトリにおいてはＮＤＶ、マレック病およびＡＥＶに対する抗体は見出されなかった。ＩＭおよび経口接種した場合には、ＥＲＳに対する抗体価はそれぞれ７、１４および２１日齢で＜２．０、５．０および７．０ ｌｏｇ２であった。
【００９９】
肉眼的および顕微鏡的検査
群１および２のニワトリの種々の器官において見出された肉眼的病変の結果をそれぞれ表１および２に示す。群３のトリにおいては肉眼的異常は見出されなかった。群１および２においては、病変は肝臓（多数の白色ないし黄色の病巣を伴う肥大）、脾臓（変色を伴う肥大、硬化）、水心膜（ｈｙｄｒｏｐｅｒｉｃａｒｄ）、脳（大脳の背部の大出血、萎縮）において見出された。群１においては、病変は脚部筋肉および腱においても見出された（浮腫を伴う腫脹）。
【０１００】
顕微鏡的検査：
坐骨神経において、レオウイルス感染に（見掛け上）関連している所見は、小さな壊死病巣を伴う又は伴わないコラーゲン線維の変性、線維芽細胞の存在、単核または混合浸潤を伴う（多数）病巣炎症であった。この炎症は主として隣接（または周辺／間質／介在）結合組織において観察され、少数の場合には坐骨神経組織自体に広がっていた。さらに、単核または異親和性浸潤が観察され、レオウイルス感染に関連づけられうるであろう。脊髄においてサテリトーシスを有すると疑われる３羽の動物が見出された。脊髄神経節に隣接する脊髄神経節の結合組織（またはその証拠を有さない脊髄神経節の領域）においては、坐骨神経における浸潤と比較しうる浸潤が観察された。第２に、グリア細胞凝集体である可能性もあり、同様にレオウイルス感染に関連しているとみなされる脊髄神経節内の単核浸潤の病巣が観察された。坐骨神経（中央部分）においては、末梢坐骨神経において認められるのと同様の隣接結合組織の炎症は1羽の動物において観察されたに過ぎなかった。少数の動物において、結合組織における単核浸潤が観察された。脳においては、１病巣のグリオーシスまたは血管周囲単核浸潤、浸潤の存在を伴う又は伴わない脈絡叢ループの充血を含むいくつかの所見が観察された。
【０１０１】
群１のトリの右坐骨神経、腹部脊髄および脳ならびに群２の腹部脊髄および脳においてＩＨＣを行った。陽性ＩＨＣを結合組織における浸潤／炎症の症例として記録した。７ｄｐｃにおいて群１の１羽の動物を除き、神経節細胞はウイルス抗原に関して陽性であることが判明した。脳においては、脈絡叢細胞または関連細胞は、群１では第４日から第７日まで及び群２では第５日から第７日まで陽性となった。
【０１０２】
【表２７】
【０１０３】
【表２８】
【０１０４】
レオウイルスの分離
群１および２のトリの種々の器官からのレオウイルスの分離の結果をそれぞれ表３ａおよび３ｂに示す。群３のニワトリからはウイルスは分離されなかった。群１および２のニワトリのすべての器官においてレオウイルスが検出された。ＩＭまたは経口接種の後、ウイルスの分離は接種のそれぞれ１または２日後から始まった。どちらの群においても、脳は接種の１０日後までは陽性であり、腱は接種の２１日後まで陽性のままであった。
【０１０５】
考察
この報告は、中枢神経系に感染するＥＲＳの経路を明らかにするためにＥＲＳ ０１５の病原性を記載している。ＩＭおよび経口の２つの接種経路を用いた。どちらの場合においても、ＥＲＳ ０１５は接種の９または１０日後に1羽のトリにおいて頚部のねじれを誘発することが可能であった。これらの神経学的症状は脳内のウイルスの存在に関連づけられうる。ＥＲＳ ０１５は、接種の１または２日後から、検査したすべてのニワトリの脳から分離された。ウイルス抗原も脳内に示された。
【０１０６】
組織学的評価は、レオウイルスの広がりが、ＩＭ接種後には経口接種後より迅速（いくつかの器官においては病変がより早期に認められる）かつより有効（病変がより長期にわたって認められる）に生じることを示している。さらに、神経組織（末梢坐骨神経または周辺結合組織）は株ＥＲＳによるレオウイルス感染の標的組織でありうることが示された。組織学的所見は、脳へのレオウイルスの広がりが神経線維沿いにではなく血行性経路によって生じることを示唆している。
【０１０７】
本発明者らが知る限りにおいて、これは、トリレオウイルス分離体が中枢神経系障害を引き起こしうることを初めて示すものである。
【０１０８】
【表２９】
【０１０９】
【表３０】
【０１１０】
実験６：
ＥＲＳを含有する不活化ワクチンでワクチン接種された産卵鶏からの後代のＥＲＳ ０１５チャレンジに対する防御
目的
本研究の目的は、ＥＲＳを含有する不活化ワクチンでワクチン接種された産卵鶏からの後代のＥＲＳ ０１５チャレンジに対する防御のレベルを評価することであった。中枢神経障害に対する有効性のクレームの保護をこの実験において評価した。
【０１１１】
実験計画
不活化ＥＲＳワクチンでワクチン接種されていない又はワクチン接種されたＳＰＦ産卵鶏に由来する卵を集め、孵化させた。ＥＲＳでワクチン接種された産卵鶏からの４０羽の雛ニワトリ（群１と称される）、およびＥＲＳ（１８０ＥＵ／用量）でワクチン接種されていない産卵鶏からの４０羽の雛ニワトリ（群２と称される）を、１日齢で０．２ｍｌのＥＲＳ ０１５（２．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／トリ）で経口チャレンジした。ＥＲＳでワクチン接種されていない産卵鶏からの８羽の雛ニワトリ（群３と称される）に０．２ｍｌのＰＢＳを経口およびＩＭ接種した。
【０１１２】
標準的な方法に従い、疾患の臨床徴候の出現に関して、すべてのニワトリを毎日観察した。振戦および頚部のねじれのような中枢神経障害に特別な注意を払った。
【０１１３】
チャレンジの３、７、１０、１４、２１、２８、３５および４２日後、群１および２の５羽のニワトリならびに群３の１羽のニワトリを犠死させた。ウイルスの分離のために、脳のサンプルを集めた。実験５に記載されているのと同じ方法に従った。
【０１１４】
結果の解釈
脳に関するウイルス分離の結果を用いて、神経症状に対する防御を評価した。ワクチン接種されていない産卵鶏からの後代と比較して、ワクチン接種された産卵鶏からの後代の脳においてウイルス複製における有意な減少が示された場合に、該後代は防御されているとみなされた。
【０１１５】
結果
臨床症状
群３のトリにおいては臨床徴候は認められなかった。群１（５羽のニワトリ）および群２（９羽のニワトリ）においては致死性が認められた。屍検において、レオウイルス感染に関連づけられうる多数の白色斑点を伴う肥大した肝臓、肥大した脾臓および／または水心膜が、群１の５羽中２羽および群２の９羽中８羽で見出された。群１の１羽のトリで、１４ｄｐｃにおいて頚部のねじれが認められた。
【０１１６】
レオウイルスの分離
トリの脳からの２継代後のレオウイルスの分離の結果を表１に示す。群１および２における死亡したトリの数に基づき、それは、ある屍検日においては、より少数のトリ（３または４羽）を死亡させたと判定した。群１および３のニワトリの脳からはウイルスは分離されなかった。群２においては、脳は接種の１４日後まで陽性であった。
【０１１７】
【表３１】
【０１１８】
考察
この実験はＣＮＳ障害に対するＥＲＳ不活化ワクチンの有効性を示している。不活化ＥＲＳワクチンでの産卵鶏のワクチン接種がＥＲＳ感染から後代を防御することは明らかである。母体由来抗体を有するトリでは、死亡率はより低かった。ＥＲＳ感染で死亡したトリは僅か２羽であったが、抗体を有さない群では８羽であった。さらに、母体由来抗体を有するトリはいずれも、脳内にウイルスを有していなかったが、群２のすべてのトリは１４ｄｐｃまでは陽性であった。群１においては１羽のニワトリが頚部のねじれを示したが、これは恐らく、ＥＲＳの抗原量が少な過ぎるワクチンによるものであろう。群２においてはＣＮＳは認められなかったが、４０羽中９羽のトリが１３ｄｐｃ以内に死亡し、この時点で頚部のねじれが現れた。それらのニワトリは、神経症状が現れうる前に死亡した可能性があろう。致死性および脳からのＥＲＳ分離に基づき、抗ＥＲＳ母体由来抗体は、ＥＲＳにより引き起こされるＣＮＳ障害から後代を防御すると結論づけることができる。
【０１１９】
本発明の範囲を更に理解するためには、添付の特許請求の範囲を考慮すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスと薬学的に許容される担体または希釈剤を含む免疫原性組成物またはワクチンの有効量を家禽に投与することを含んでなる、家禽におけるトリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／または予防方法。
【請求項２】
該レオウイルスが生、弱毒化または不活化形態である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該トリレオウイルスが、ＥＣＡＣＣ（英国ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に受託番号９９０１１４７５でサンプルが寄託されている腸レオウイルス株（ＥＲＳ）により形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも７５％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属する腸レオウイルス株（ＥＲＳ）である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
株ＥＲＳにより形成されるプラークの減少がプラーク減少アッセイにおいて少なくとも８０％である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
株ＥＲＳにより形成されるプラークの減少がプラーク減少アッセイにおいて少なくとも９０％である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
該レオウイルスが、第２のトリレオウイルス分離体に対して産生させたポリクローナル抗血清との免疫蛍光技術（ＩＦＴ）における反応性により、ならびにモノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴ（それらのサンプルはそれぞれ受託番号９９０１１４７２、９９０１１４７３および９９０１４７４でＥＣＡＣＣに寄託されている）とのＩＦＴにおける反応性の非存在により特徴づけられる、請求項１または３記載の方法。
【請求項７】
第２のトリレオウイルスが、株Ｓ１１３３、株２４０８、株１７３３、株２１７７、株ＥＲＳ、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該免疫原性組成物またはワクチンが更に、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびニワトリ貧血因子の少なくとも１つのワクチン株を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該免疫原性組成物またはワクチンが更にアジュバントを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該神経学的症状が、振戦および頚部のねじれよりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該トリレオウイルスが、株ＥＲＳ（分離体１）、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該家禽が、ニワトリ、シチメンチョウ、水鳥、ホロホロチョウ（ｇｕｉｎｅａ）、ウズラ、ハトおよびダチョウよりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
腸レオウイルス株（ＥＲＳ）と担体または希釈剤とを含んでなる、神経学的症状を予防するための免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４】
該ＥＲＳが、株ＥＲＳ（分離体１）、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項１３記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５】
該免疫原性組成物またはワクチンが更に、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびニワトリ貧血因子の少なくとも１つのワクチン株を含む、請求項１３記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６】
ａ．家禽の神経系の少なくとも一部を得、
ｂ．該神経系からトリレオウイルスを分離する工程を含んでなる、家禽から腸レオウイルス株を分離するための方法。
【請求項１７】
家禽において神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスのクラス。
【請求項１８】
該レオウイルスが腸レオウイルス株（ＥＲＳ）である、請求項１７記載のクラス。
【請求項１９】
該ＥＲＳが、株ＥＲＳ（分離体１）、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項１７記載のクラス。
【請求項１】
神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスと薬学的に許容される担体または希釈剤を含む免疫原性組成物またはワクチンの有効量を家禽に投与することを含んでなる、家禽におけるトリレオウイルスにより引き起こされる神経学的症状の治療および／または予防方法。
【請求項２】
該レオウイルスが生、弱毒化または不活化形態である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該トリレオウイルスが、ＥＣＡＣＣ（英国ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に受託番号９９０１１４７５でサンプルが寄託されている腸レオウイルス株（ＥＲＳ）により形成されるプラークをプラーク減少アッセイにおいて少なくとも７５％減少させる抗血清を動物において誘導しうるレオウイルスのクラスに属する腸レオウイルス株（ＥＲＳ）である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
株ＥＲＳにより形成されるプラークの減少がプラーク減少アッセイにおいて少なくとも８０％である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
株ＥＲＳにより形成されるプラークの減少がプラーク減少アッセイにおいて少なくとも９０％である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
該レオウイルスが、第２のトリレオウイルス分離体に対して産生させたポリクローナル抗血清との免疫蛍光技術（ＩＦＴ）における反応性により、ならびにモノクローナル抗体ＩＮＴ １３−０６、ＩＮＴ １４−１１および１５−０１ ＩＮＴ（それらのサンプルはそれぞれ受託番号９９０１１４７２、９９０１１４７３および９９０１４７４でＥＣＡＣＣに寄託されている）とのＩＦＴにおける反応性の非存在により特徴づけられる、請求項１または３記載の方法。
【請求項７】
第２のトリレオウイルスが、株Ｓ１１３３、株２４０８、株１７３３、株２１７７、株ＥＲＳ、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該免疫原性組成物またはワクチンが更に、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびニワトリ貧血因子の少なくとも１つのワクチン株を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該免疫原性組成物またはワクチンが更にアジュバントを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該神経学的症状が、振戦および頚部のねじれよりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該トリレオウイルスが、株ＥＲＳ（分離体１）、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該家禽が、ニワトリ、シチメンチョウ、水鳥、ホロホロチョウ（ｇｕｉｎｅａ）、ウズラ、ハトおよびダチョウよりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
腸レオウイルス株（ＥＲＳ）と担体または希釈剤とを含んでなる、神経学的症状を予防するための免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４】
該ＥＲＳが、株ＥＲＳ（分離体１）、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項１３記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５】
該免疫原性組成物またはワクチンが更に、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびニワトリ貧血因子の少なくとも１つのワクチン株を含む、請求項１３記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１６】
ａ．家禽の神経系の少なくとも一部を得、
ｂ．該神経系からトリレオウイルスを分離する工程を含んでなる、家禽から腸レオウイルス株を分離するための方法。
【請求項１７】
家禽において神経学的症状を引き起こすトリレオウイルスのクラス。
【請求項１８】
該レオウイルスが腸レオウイルス株（ＥＲＳ）である、請求項１７記載のクラス。
【請求項１９】
該ＥＲＳが、株ＥＲＳ（分離体１）、株ＥＲＳ ０６０Ｅ、株ＥＲＳ ０７４および株ＥＲＳ １０３７よりなる群から選ばれる、請求項１７記載のクラス。
【公表番号】特表２００６−５１６１４６（Ｐ２００６−５１６１４６Ａ）
【公表日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０１１３０（Ｐ２００５−５０１１３０）
【出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３１９０１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３２９５９
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（３９４０１０９８６）アクゾ・ノベル・エヌ・ベー (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３１９０１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３２９５９
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（３９４０１０９８６）アクゾ・ノベル・エヌ・ベー (31)
【Ｆターム（参考）】
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