ナノ粒子製剤に基づく光学イメージング用診断物質
本発明は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及び近赤外線蛍光色素を含むナノ粒子製剤の提供、これらのナノ粒子製剤の調製、本発明に係るナノ粒子製剤を含む医薬組成物、並びにそれらの造影剤としての使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及び近赤外線（ＮＩＲ）蛍光色素を含むナノ粒子製剤の提供、これらのナノ粒子製剤の調製、本発明に係るナノ粒子製剤を含む医薬組成物、並びにそれらの造影剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、イメージングプロセスの使用は、疾病の診断、治療、及び予防において重要な役割を果たしている。臨床医療において、毎年３億以上の画像検査が実施されている。超音波技術又はＸ線に基づく検査等の、技術的観点から容易に実施できるプロセスは、これらの検査の主要なものとして挙げられる。技術的観点から容易に実施できる他のプロセスは、光学イメージングである。
【０００３】
光学イメージングは、十分に確立された診断イメージングプロセスである。このプロセスの最も単純な種類においては、器官の検査に白色光が使用される（徹照法）が、技術的により洗練されたプロセスは、明確に規定されたスペクトル特性を有する光を使用する。この方法は、非特異的なバックグラウンドシグナルを減少することができるが、同時に診断光の浸透深度が増大する。いずれのパラメーターも、光学イメージングの診断精度に顕著に影響する。
【０００４】
光学イメージングの特異性及び感度を改善する他の可能な方法は、蛍光色素の使用である。最近の約３０〜４０年間で、様々な診断的蛍光色素が使用できるようになった。ポリメチン色素の物質のクラス、特にシアニン色素が、この点において特に重要である。インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、光学イメージングにおいて広く使用される既知の蛍光色素である。ＩＣＧ適用の主要な分野は、眼科及び血管外科の蛍光血管造影である。ＩＣＧの使用により、血管の描画が可能となる。内科医は、この方法により、例えば疾病を示す病理的血管の新生を検出することができる。他の非常に重要な適用は、血管手術である。蛍光色素を使用して、血管における特定の形成術が所望の結果をもたらしたか否かを評価することができる。例えば、血管内に注入した造影剤が血管内の特定の位置でもれていたとき、執刀医はその手術が失敗していたことを明確に認識する。ＩＣＧは、血漿タンパク質に完全に結合していることから、血管床に残留して濃縮されることが無いため、これらの適用に適している。
【０００５】
しかしながら、ＩＣＧは循環系から迅速に排除されるために、診断シグナル強度は迅速に減衰する（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ２０００， ７２， ３９２）。故に、医師は、長時間にわたり微小な血管を確実に表示することができない。他のＩＣＧの短所は、溶解度特性が乏しいことである。ＩＣＧ分子の分子凝集体を形成する強い傾向は、一方で、投与されるべき物質の完全な溶液の調製を妨げる。他の短所は、凝集したＩＣＧ分子により引き起こされる傾向活性の低下である（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ． １９９８， ５５；Ｓｕｒｖｅｙ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． ２０００， ４５， １５）。なおも他のＩＣＧの短所は、該有効成分の医薬組成物の不安定性である。水性媒体中の該有効成分の分解の短所は、ポリメチン色素のクラスの他の有効成分においても観察される。この不利な特性は、水性液の収率を低下させ、生産コストの増大をもたらす。
【０００６】
当業者は、頻繁に使用されるＩＣＧの前記短所を克服する幾つかの方法を知っている。まず、特性を改善した新規蛍光色素の合成は、当該技術分野で既知である。該新規蛍光色素の合成により、ＩＣＧと比較して、溶解度特性が改善され、そして蛍光量子効率が向上した有効成分がもたらされた。しかしながら、既知の物質は全て、注射の一定時間後に血管系を脱出し、そして血管外スペースの蓄積する傾向を有する（Ａｃａｄ． Ｒａｄｉｏｌ． ２００６， １３， ４； Ｊ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ． ２００５， １５， ４４３）。血管外溢出のプロセスは、血管内注射後僅か一分で開始する。この挙動の理由の一つは、血漿タンパク質への結合が不完全なことである。ＩＣＧの血管外溢出は、血漿タンパク質への完全な結合により防止される。
【０００７】
血管系を脱出する傾向を有する蛍光色素は、血管外組織における蛍光シグナルの増大を引き起こす。その結果、該既知の物質は、ＩＣＧと比較して、蛍光量子収率は改善しているが、シグナル対バックグラウンドが悪化している。
【０００８】
当業者に知られたＩＣＧと比較して特性が改善した新規蛍光色素を提供する他の方法は、色素−タンパク質コンジュゲートの合成である（Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ２００４， ３， ３９３）。７０ｋＤａを超える分子量を有するタンパク質とのカップリングにより、又はポリエチレングリコールをコンジュゲートすることによりそれだけの分子量に至らしめるＡｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ２００３， ５５， １２６１−７７）ことにより、その色素の腎排出は著しく低下する。故に、この方法は、循環時間の直接的な延長をもたらす。しかしながら、このプロセスは、ＩＣＧと比較して、新たな短所を生じる。短所の一つは、タンパク質の追加的使用による望ましくない効果のリスクの増大である。アルブミン又はイムノグロブリン等のカップリングパートナーとして使用されるタンパク質は、免疫応答の増大を引き起こす場合があることが知られている。診断プロセスは高いレベルの薬物安全性を要求するので、蛍光色素−タンパク質コンジュゲートの使用は好ましくない。ＩＣＧと比較して著しく高い蛍光色素−タンパク質コンジュゲートの生産コストは、もう一つの短所である。
【０００９】
特性を改善したＩＣＧの取得を目標とする改変医薬組成物の調製も知られている。Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ２０００， ７１， ３４７ （Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ ｅｔ ａｌ．）， ＷＯ２００７／０２５７６８ （Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｏｃｙａｍｎｅ ｇｒｅｅｎ： Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｍｉｃｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ， ２００４， ２７８， ９３−３０１， Ｓａｘｅｎａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．： Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｔｏ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｂ．， ２００４， ７４， ２９−３８， ＷＯ２００４／０６４７５１に、様々な医薬組成物が記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
故に、特性を改善したナノ粒子製剤を提供することが、本発明の目的の一つであった。これらのナノ粒子製剤は、造影剤として特に適している。
【００１１】
本発明は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及びＮＩＲ（近赤外線）蛍光色素を含む、ナノ粒子製剤を対象とする。ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーは、ポリマー性両親媒性物質又は界面活性剤であり、水性媒体中で仕切られた分子構造、特にミセル又はエマルジョンを形成する。本発明の意味において、ミセルは、ナノ粒子製剤の一つの構成材である。
【００１２】
故に、本発明の枠組み内で、「ナノ粒子製剤」という用語は、前記構成材を含む、本質的に区分単位（ｓｅｐａｒａｔｅ ｕｎｉｔ）を意味する。ミセルは、そのような区分単位の一例である。
【００１３】
本発明の枠組み内で、「水性媒体」という用語は、少なくとも７５重量％、好ましくは少なくとも９０重量％の水を含有する水性液を意味する。本発明において、前記水性媒体の追加的な成分として、塩、例えば無機塩又は有機塩等の生理的に適合する成分が含まれてもよい。無機塩として、例えば、塩化物、炭酸塩、酢酸塩、二水素リン酸塩（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、一水素リン酸塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等が挙げられる。有機塩として、例えば、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、メグルミン、リシン、グリシン、アスパラギンの塩酸塩等が挙げられる。該塩は、水酸化ナトリウム溶液、炭酸水素ナトリウム、塩酸、リン酸、酢酸、アスコルビン酸又はクエン酸等の酸及び塩基と組み合わされ、緩衝系を形成する場合がある。更に、そのような緩衝系は、共溶媒、例えばエタノール、ジエタノールアミン、グリセリン、ポリエチレングリコール等を含む場合がある。他の生理的に適合する成分として、糖、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース、マンニトール、ソルビトール、デキストラン、デキストロース等を含む。本発明において使用される緩衝系の概説は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ ｅｄ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで読むことができる。
【００１４】
本発明の枠組み内で、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はメトキシポリエチレングリコールを親水性構造要素として含み、アルキル鎖を親油性構造要素として含む化合物である。本発明において、３〜１５０オキシエチレン単位（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、好ましくは３〜５０オキシエチレン単位のポリエチレングリコールが好ましい。ＰＥＧは一様（ｕｎｉｆｏｒｍ）である必要は無く、むしろ平均分子量が一定の、様々な個数のオキシエチレン単位から成る混合物である。好ましくは、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーの分子量は、２００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌｅである。好ましくは、ＰＥＧ−アルキルブロック子ポリマーの分子量は、２５０〜３，０００ｇ／ｍｏｌｅである。ＰＥＧ−アルキルブロック子ポリマーの分子量は、３００〜１，０００ｇ／ｍｏｌｅであるのが特に好ましい。ここで、ＰＥＧ−アルキルブロック子ポリマーは、親水性構造要素及び親油性構造要素が連結し、好ましくは共有結合を通じて結合している分子である。
【００１５】
本発明に係るナノ粒子製剤の平均分子量は、好ましくは、１００，０００〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内である。これは、水性媒体中で形成される区分単位の１分子の平均質量を意味する。
【００１６】
本発明に係る製剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーの１重量％未満、好ましくは０．１重量％未満、そして特に好ましくは０．０１重量％未満である。ここで、重量％は、水性製剤中の相対重量％を示す。
【００１７】
本出願の枠組み内で、「アルキル鎖」という用語は、飽和又は不飽和炭化水素を意味する。本発明のアルキル鎖は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシル又はフェニルで一置換又は多置換されている場合がある、３〜３０個の炭素原子を含むアルキル鎖である。飽和、不飽和、又は化学的に／生化学的に修飾された脂肪酸由来のアルキル鎖が好ましい。ここで、化学的又は生化学的修飾は、特に、以下：ヒドロキシル化、エポキシド化、アセチル化、カルボキシル化、エステル化、任意で上記修飾の一つを含み得るアルキル基による分岐化を含む群から選択される。
【００１８】
例えば、飽和脂肪酸は、酪酸、ヘキサノン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸、ヘキサコサン酸、ステアリン酸、エイコサン酸、マルガリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリル酸、デカン酸、オクタン酸を含む。不飽和脂肪酸は、例えば、パルミトレイン酸、バクセン酸、エライジン酸、オレイン酸、イコセン酸、ネルボン酸、エルカ酸、セトール酸、リノール酸、リノレン酸、チムノドン酸（ｔｉｍｎｏｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クルパンドン酸、アラキドン酸を含む。化学的に又は生化学的に修飾された脂肪酸は、ヒドロキシル脂肪酸又はアリール脂肪酸、例えば１２−ヒドロキシステアリン酸である。
【００１９】
よって、特に好ましいナノ粒子製剤は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーがＰＥＧ−脂肪酸エステルブロックコポリマーであるものである。
【００２０】
ポリエチレングリコール−１２−ヒドロキシステアリン酸は、特に好ましい。
【００２１】
本発明において、脂肪酸は、前記酸性基（ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）、又は前記酸性基の誘導体を有するＰＥＧとの結合を形成する。結合は、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、チオカルバメート、チオエーテル、又は尿素結合であってもよい。ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、アミン、チオール、又は他の官能基に転換している場合がある。脂肪酸の三世紀とＰＥＧとの直接の結合が好ましい。エステル結合は、特に好ましい。
【００２２】
更に、本発明は、ＰＥＧ−脂肪酸エステルブロックコポリマーに関し、ここで、構造要素としてのグリセロールがＰＥＧと共有結合し、そして脂肪酸は該グリセロールのヒドロキシル基とエステルを形成する。ポリエチレングリコール−ポリグリセロール−リシノレアート（ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）は、特に好ましい。
【００２３】
ＮＩＲ−蛍光色素は、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光を発するクロモフォア又はフルオロフォアである。
【００２４】
親油性のＮＩＲ蛍光色素が好ましい。本発明の意味における親油性ＮＩＲ蛍光色素は、スルホネート、硫酸、カルボキシル、ポリヒドロキシアルキル（４〜６ヒドロキシル基）から選択される最大で２つの官能基を担持するものである。
【００２５】
前記ＮＩＲ蛍光色素は、ポリメチン色素、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｉｎｅ）、クロコニウム色素、スクアリリウム（ｓｑｕａｒｉｌｉｕｍ）を含む群から選択されるものが特に好ましい。
【００２６】
前記ＮＩＲ蛍光色素は、ポリメチン色素、シアニン色素、インドトリカルボシアニン、３，３’−ジエチルオキサジカルボ−シアニンヨーダイド（ＤＯＤＣＩ）、３，３’−ジエチルチオジカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＤＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチオトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＴＣＩ）、インドシアニングリーンを含む群から選択されるものが最も好ましい。
【００２７】
好ましいインドトリカルボシアニンは、ベンゾインドレニン（ｂｅｎｚｏｉｎｄｏｌｅｎｉｎｅ）及び不飽和若しくは飽和ペンタメチン鎖、並びにアルキル基を基礎として、該ベンゾインドール構造中の各窒素が親水基で置換されている。特に、ＮＩＲ蛍光色素のインドシアニングリーン（ＩＣＧ、ＣａｒｄｉｏＧｒｅｅｎ、ＩＣ Ｇｒｅｅｎ、ＤｉａｇｎｏＧｒｅｅｎ）が好ましい。インドシアニングリーンに加えて、インドシアニングリーンの誘導体も、特に好ましい。インドシアニングリーンの誘導体は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル、クロリン、アルコキシ及び／又は該インドシアニングリーンのヘプタメチン鎖と共に５〜６員環を形成するアルキル基で置換されたポリメチン鎖を有するインドシアニングリーン構造である。
【００２８】
インドシアニングリーンは、
ａ）インドール窒素における１つ又は２つのスルホブチル鎖が、−Ｃ１−６−ａｌｋｙｌ−Ｒ２で置換され、ここでＲ２は、−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３−Ｎａ＋、−ＮＨ２、−Ｎ３、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｎａ＋、−Ｃ≡Ｃ、−Ｃ１−２０−アルキル、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−２０−アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−２０−アルキル、及び−０−Ｃ１−２０−アルキルを含む群から選択され、ここでＣ１−２０−アルキルは、１つ以上の（好ましくは１〜３個）の非連続的メチレン単位が、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ２、ＳＯ、アリール、エテン（ｅｔｈｅｎ）又はエチン（ｅｔｈｉｎｅ）を含む群から選択される単位で置換されている場合がある分岐鎖又は直鎖アルキルであり、そして、ここでアルキルは、−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３−Ｎａ＋、−ＮＨ２、−Ｎ３、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａ＋、−Ｃ≡Ｃを含む群から選択される少なくとも１つの（好ましくは１〜３個の）基で置換され；及び／又は
ｂ）ポリメチン鎖は、中心炭素原子がＲ３基で置換されたポリメチン鎖で置換され、ここで２つの隣接する炭素原子が、ポリメチン鎖の３つの炭素原子と共に５〜６員環を形成し得て、ここでＲ３は、−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｓ−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｏ−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２を含む群から選択され、ここでＲ２は上記のものであり、及び／又は
ｃ）外側のベンズインドール環（ｏｕｔｅｒ ｂｅｎｚｉｎｄｏｌｅ ｒｉｎｇ）は、独立して−ＳＯ３−Ｎａ＋、−ＣＯＯＨ又は−ＯＨから選択される１つ以上の基で置換された
ものが好ましい。
【００２９】
本発明に係るＩＣＧ及び誘導体の構造を示す図８を、そのような構造の例として示す。
【００３０】
ＩＣＧの誘導体は、
ａ）インドール窒素における１つ又は２つのスルホブチル鎖が、−Ｃ１−４−ａｌｋｙｌ−Ｒ２で置換され、ここでＲ２は、−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３−Ｎａ＋、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｎａ＋を含む群から選択され、及び／又は
ｂ）ポリメチン鎖は、中心炭素原子がＲ３基で置換されたポリメチン鎖で置換され、ここで２つの隣接する炭素原子が、ポリメチン鎖の３つの炭素原子と共に６員環を形成し得て、ここでＲ３は、−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｏ−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２を含む群から選択され、ここでＲ２は、−ＣＯＯＨ又は−ＳＯ３−Ｎａ＋を表し、及び／又は
ｃ）外側のベンズインドール環は１つ又は２つの−ＳＯ３−Ｎａ＋で置換された
ものが好ましい。
【００３１】
インドシアニングリーン（図８Ａ）の誘導体の模式図を、図８Ｂに示す。
【００３２】
本発明に係るナノ粒子製剤の直径は、１〜１，０００ｎｍ、好ましくは５ ｎｍ〜５００ ｎｍの範囲内であってもよい。
【００３３】
本発明に係る製剤の蛍光又はＮＩＲ蛍光は、６００ｎｍ〜１，０００ｎｍ、好ましくは７５０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲内である。
【００３４】
本発明に係る製剤の蛍光量子効率は、少なくとも水中の色素溶液と同等、好ましくは２倍、そして特に好ましくは４倍である。インドシアニングリーンにおいて、ナノ粒子製剤の蛍光量子効率は、少なくとも４％、特に好ましくは少なくとも８％である。
【００３５】
クエンチング、即ち濃度が増大したときの蛍光強度の低下は、本発明に係る製剤の場合、純水性製剤（ｐｕｒｅｌｙ ａｑｕｅｏｕｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と比較して、より高濃度のときに限って生じる。インドシアニングリーンの場合、クエンチングは、純水性製剤の１０倍の濃度で優位に生じる。
【００３６】
更に、本発明に係る製剤は、前記色素の精製水性製剤よりも高濃度で得られる。少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度が好ましい。
【００３７】
本発明に係る製剤の保存安定性は、純水性製剤及びＳａｘｅｎａ ｅｔ ａｌに記載される製剤と比較して、顕著に改善されている。製造の７日後に、製剤化ＮＩＲ蛍光色素の９０％以上が、なおも活性状態として検出され得る。
【００３８】
本発明に係る製剤中のＩＣＧの血漿タンパク質への結合は、ＩＣＧのそれに対応する。ヒト血清中でミセル製剤を４時間インキュベーションし、未結合のＩＣＧを超遠心分離により除去し多後、遊離部分（ｆｒｅｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）ＩＣＧを測定すると、遊離部分は５％未満である。この値は、ＩＣＧの水性液を用いた類似の実験において得られる。
【００３９】
ＩＣＧの水性液（吸収極大７８０ｎｍ）と比較して、ＩＣＧミセル製剤中のＩＣＧの吸収極大は７９７ｎｍであり、長波長側に１７ｎｍシフトしている（赤方偏移）。組織の光学的特性のため、このシフトは、励起光の透過深度を増大させ、それにより組織中の検出が改善する。更に、吸収極大の７９７ｎｍは、血漿中のＩＣＧの吸収極大（８０５ｎｍ）に近い。既存の診断装置は、この特性が製剤を直接使用できるように、この波長に調整される。
【００４０】
更に、本発明は、本発明に係るナノ粒子製剤を含む医薬組成物に関する。
【００４１】
また、本発明は、造影剤として使用するための本発明に係るナノ粒子製剤に関する。
【００４２】
本発明の他の目的は、以下のプロセスを含むナノ粒子製剤を調製するプロセスである。
【００４３】
ナノ粒子製剤の調製の本質的な工程は、（１）ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーを、好ましくは０．０５〜１ｇ／ｍｌの濃度となるように水に溶解する工程、及び（２）該溶液に蛍光色素を加えてミセル製剤を形成する工程である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】水中のＩＣＧ （点線）及び実施例１に従い調製した水中のＩＣＧミセル（実線）の吸収スペクトルを示す。ミセル溶液に対する標準化＝１とした。
【図１Ｂ】水中のＩＣＧ （点線）及び実施例１に従い調製した水中のＩＣＧミセル（実線）の蛍光発光スペクトルを示す。ミセル溶液に対する標準化＝１とした。
【図１Ｃ】ＩＣＧの濃度（０．００１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ）に対する、水中のＩＣＧ （正方形）及び水中のＩＣＧミセルの蛍光強度を示す。
【図１Ｄ】動的光散乱を利用した粒子サイズ分布を示す。
【図１Ｅ】様々な製剤の時間に対する最高の吸光度を測定することによる、安定性の決定を示す。水中のＩＣＧ（正方形）及び３つのミセル製剤；Ｓｏｌｕｔｏｌ １０％（円）、２０％（三角形）、４０％（逆三角形）を比較している。
【図２Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルの吸収スペクトルを示す。
【図２Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルの発光スペクトルを示す。
【図２Ｃ】Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図３Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルの吸収スペクトルを示す。
【図３Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルの発光スペクトルを示す。
【図３Ｃ】Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図４Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ５８ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図４Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ５８ミセルの発光スペクトルを示す。
【図４Ｃ】Ｂｉｒｊ（登録商標） ５８ミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図５Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ９８ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図５Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ９８ミセルの発光スペクトルを示す。
【図５Ｃ】Ｂｉｒｊ（登録商標） ９８ミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図６Ａ】ＩＣＧ誘導体ＮＷ００３．５の構造を示す。
【図６Ｂ】水中のＮＷ００３．５及びＮＷ００３．５−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図６Ｃ】ＤＭＳＯ中のＮＷ００３．５及びＮＷ００３．５−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの発光スペクトルを示す。
【図６Ｄ】Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセル中のＮＷ００３．５（０．００５％ ＮＷ００３．５）の安定性を示す。
【図７Ａ】ＩＣＧ誘導体ＩＲ−７８３の構造を示す。
【図７Ｂ】水中のＩＲ−７８３及びＩＲ−７８３−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図７Ｃ】ＤＭＳＯ中のＩＲ−７８３及びＩＲ−７８３−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの発光スペクトルを示す。
【図７Ｄ】Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセル中のＩＲ−７８３ （０．００５％ ＩＲ−７８３）の安定性を示す。
【図８Ａ】本発明において使用される色素の例であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の模式図を示す。
【図８Ｂ】本発明において使用される色素の例であるインドシアニングリーンの誘導体の模式図を示す。
【００４５】
以下の実施例において、本発明はより詳細に説明される。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ミセル製剤の調製
例示物１：２ｇのＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５を、６５℃に加熱する。注射用の水１０ｍｌを攪拌しながら添加し、得られた透明の溶液を室温まで冷却する。５０ｍｌのＩＣＧを該ミセル溶液中に溶解し、０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌する。
【００４７】
例示物２：２ｇのＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５を、室温で、攪拌しながら１０ｍｌの注射用の水に添加する。透明の溶液が得られる。５０ｍｌのＩＣＧを該ミセル溶液中に溶解し、０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌する。
【００４８】
吸収及び蛍光測定
ＵＶＩＫＯＮ ９３３分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ社製）７００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において測定する。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７８０ｎｍ、ＩＣＧミセルのλｍａｘ＝７９７ｎｍであった（図１Ａ）。
【００４９】
Ｓｐｅｘ社製ＦｌｕｏｒｏＬｏｇ−２蛍光分光光度計（３５０ Ｗキセノンランプ）を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７００ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、それぞれの製剤の吸収スペクトルの吸収極大と対応していた（水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７８０ｎｍ及びＩＣＧミセルのλｍａｘ＝７９７ｎｍ）。ＤＭ３０００ソフトウェアのｓ及びｒモーダス（ｍｏｄｕｓ）により、評価の際に、異なる励起波長の異なるランプ強度が考慮され得る。
【００５０】
放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１３）。
【００５１】
その結果、水中ＩＣＧの量子効率はΦ＝０．０２であるのに対し、ＩＣＧミセルの量子効率はΦ＝０．０８であることが分かった。クエンチングは、より高濃度（ＩＣＧが０．１ｍｇ／ｍｌから発生する）の場合にのみ起こる（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
【００５２】
安定性試験
安定性試験において、時間に対する様々な製剤の最高の吸光度を測定した。ここでは、０．０００５％のＩＣＧ溶液を調製し、これを常温で保存した。純水性ＩＣＧ製剤の安定性としては、僅か７日後に、標準吸光度が１０％を下回るところまで低下を示す。一方、ＩＣＧのミセル製剤は、７日の保存後にあっても初期の数値と比較してなおも９０％を上回る吸光度を示し、４週間を経過してもなお、吸光度は７０％を下回らない（図１Ｅ）。
【００５３】
粒子サイズ
動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ社製 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ）を利用して、粒子サイズ分布を決定した。Ｈｅ−Ｎｅ−レーザー（６３３ｎｍ、４ｍＷ）を用いて、測定を実施した。４５μｌクォーツキュベット中で、試料を希釈せずに直接測定した。
【００５４】
その結果、ＰＤＩ（多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ））０．０６１で、流体力学的直径が１２ｎｍであることが分かった（図１Ｄ）。
【００５５】
血漿タンパク質との結合
血漿タンパク質との結合を判定するために、吸収スペクトルの波長のシフトを測定した。ここでは、水中及び血漿中のＩＣＧの７００ｎｍ〜９００ｎｍのスペクトルを、水中及び血漿中のＩＣミセルのスペクトルと比較した。
【００５６】
その結果、両製剤において、血漿中の吸収極大が、８０５ｎｍにシフトすることが分かった。本発明に係る製剤中のＩＣＧの血漿タンパク質との結合の挙動は、水性媒体中のＩＣＧの挙動と対応する。
【００５７】
溶血アッセイ
ＩＣＧミセルの溶血活性の実験において、まず、ヘパリン化した全血から血漿を除去したものを、３回ＰＢＳで洗浄した。赤血球のＰＢＳ中２％懸濁物を調製して、これを３７℃で１時間、ＩＣＧミセル製剤を加えてインキュベーションした。純粋なＰＢＳ溶液をブランク読取り値（０％溶血）として、及び２％トライトン溶液を１００％溶血値として使用した。インキュベーション後、赤血球を遠心分離で除去し、上澄の赤色の色素を、光度的に５４０ｎｍで測定した。
【００５８】
その結果、ＩＣＧミセルは、溶血活性を示さないことが分かった。
【００５９】
ＰＥＧ−アルキル化合物
実施例２：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、０．３ｇのＣｉｔｌｉｒｏｌ １０ＭＳ（ＰＥＧ ２０ステアリン酸）を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）５０ｍｇＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００６０】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において測定する。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図２Ａ）。
【００６１】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルはφ＝０．０８であることが分かった（図２Ｂ）。
【００６２】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルは、初期の値と比較して、なおも９４％を超える吸光度を示した（図２Ｃ）。
【００６３】
実施例３：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、０．４ｇのＣｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤ（ＰＥＧ ４０ステアリン酸）を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００６４】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図３Ａ）。
【００６５】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルはφ＝０．０７であることが分かった（図３Ｂ）。
【００６６】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９７％を超える吸光度を示した（図３Ｃ）。
【００６７】
実施例４：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、０．５ｇのＢｒｉｊ（登録商標） ５８（ＰＥＧ ２０セチルエーテル（ｃｅｔｙｌｅｔｈｅｌ））を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）５０ｍｇＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００６８】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ５８ミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図４Ａ）。
【００６９】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ５８ミセルはφ＝０．０７であることが分かった（図４Ｂ）。
【００７０】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ５８ミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９７％を超える吸光度を示した（図４Ｃ）。
【００７１】
実施例５：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、１ｇのＢｒｉｊ（登録商標） ９８（ＰＥＧ ２０オレイルエーテル（ｏｌｅｙｌｅｔｈｅｌ））を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）５０ｍｇＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００７２】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ９８ミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図５Ａ）。
【００７３】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ９８ミセルはφ＝０．０６であることが分かった（図５Ｂ）。
【００７４】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ９８ミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９５％を超える吸光度を示した（図５Ｃ）。
【００７５】
ＩＣＧ誘導体
実施例６：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、１ｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ＮＷ０００３．５ （図６Ａ）溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００７６】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＮＷ０００３．５ のλｍａｘ（モノマー）＝７８８ｎｍ、ＮＷ０００３．５ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルのλｍａｘ＝８０６ｎｍであった（図６Ｂ）。
【００７７】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＮＷ０００３．５ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルはφ＝０．０６であることが分かった（図６Ｃ）。
【００７８】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で１ヶ月保存後、ＮＷ０００３．５ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９５％を超える吸光度を示した。
【００７９】
実施例６：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、１ｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ＩＲ−７８３溶液（図７Ａ）溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００８０】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＲ−７８３のλｍａｘ（モノマー）＝７７５ｎｍ、ＩＲ−７８３ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルのλｍａｘ＝７９７ｎｍであった（図７Ｂ）。
【００８１】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＲ−７８３ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルはφ＝０．１１であることが分かった（図７Ｃ）。
【００８２】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で１ヶ月保存後、ＩＲ−７８３ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセル製剤は、初期の値と比較して、顕著に変化しなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及び近赤外線（ＮＩＲ）蛍光色素を含むナノ粒子製剤の提供、これらのナノ粒子製剤の調製、本発明に係るナノ粒子製剤を含む医薬組成物、並びにそれらの造影剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、イメージングプロセスの使用は、疾病の診断、治療、及び予防において重要な役割を果たしている。臨床医療において、毎年３億以上の画像検査が実施されている。超音波技術又はＸ線に基づく検査等の、技術的観点から容易に実施できるプロセスは、これらの検査の主要なものとして挙げられる。技術的観点から容易に実施できる他のプロセスは、光学イメージングである。
【０００３】
光学イメージングは、十分に確立された診断イメージングプロセスである。このプロセスの最も単純な種類においては、器官の検査に白色光が使用される（徹照法）が、技術的により洗練されたプロセスは、明確に規定されたスペクトル特性を有する光を使用する。この方法は、非特異的なバックグラウンドシグナルを減少することができるが、同時に診断光の浸透深度が増大する。いずれのパラメーターも、光学イメージングの診断精度に顕著に影響する。
【０００４】
光学イメージングの特異性及び感度を改善する他の可能な方法は、蛍光色素の使用である。最近の約３０〜４０年間で、様々な診断的蛍光色素が使用できるようになった。ポリメチン色素の物質のクラス、特にシアニン色素が、この点において特に重要である。インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、光学イメージングにおいて広く使用される既知の蛍光色素である。ＩＣＧ適用の主要な分野は、眼科及び血管外科の蛍光血管造影である。ＩＣＧの使用により、血管の描画が可能となる。内科医は、この方法により、例えば疾病を示す病理的血管の新生を検出することができる。他の非常に重要な適用は、血管手術である。蛍光色素を使用して、血管における特定の形成術が所望の結果をもたらしたか否かを評価することができる。例えば、血管内に注入した造影剤が血管内の特定の位置でもれていたとき、執刀医はその手術が失敗していたことを明確に認識する。ＩＣＧは、血漿タンパク質に完全に結合していることから、血管床に残留して濃縮されることが無いため、これらの適用に適している。
【０００５】
しかしながら、ＩＣＧは循環系から迅速に排除されるために、診断シグナル強度は迅速に減衰する（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ２０００， ７２， ３９２）。故に、医師は、長時間にわたり微小な血管を確実に表示することができない。他のＩＣＧの短所は、溶解度特性が乏しいことである。ＩＣＧ分子の分子凝集体を形成する強い傾向は、一方で、投与されるべき物質の完全な溶液の調製を妨げる。他の短所は、凝集したＩＣＧ分子により引き起こされる傾向活性の低下である（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ． １９９８， ５５；Ｓｕｒｖｅｙ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． ２０００， ４５， １５）。なおも他のＩＣＧの短所は、該有効成分の医薬組成物の不安定性である。水性媒体中の該有効成分の分解の短所は、ポリメチン色素のクラスの他の有効成分においても観察される。この不利な特性は、水性液の収率を低下させ、生産コストの増大をもたらす。
【０００６】
当業者は、頻繁に使用されるＩＣＧの前記短所を克服する幾つかの方法を知っている。まず、特性を改善した新規蛍光色素の合成は、当該技術分野で既知である。該新規蛍光色素の合成により、ＩＣＧと比較して、溶解度特性が改善され、そして蛍光量子効率が向上した有効成分がもたらされた。しかしながら、既知の物質は全て、注射の一定時間後に血管系を脱出し、そして血管外スペースの蓄積する傾向を有する（Ａｃａｄ． Ｒａｄｉｏｌ． ２００６， １３， ４； Ｊ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ． ２００５， １５， ４４３）。血管外溢出のプロセスは、血管内注射後僅か一分で開始する。この挙動の理由の一つは、血漿タンパク質への結合が不完全なことである。ＩＣＧの血管外溢出は、血漿タンパク質への完全な結合により防止される。
【０００７】
血管系を脱出する傾向を有する蛍光色素は、血管外組織における蛍光シグナルの増大を引き起こす。その結果、該既知の物質は、ＩＣＧと比較して、蛍光量子収率は改善しているが、シグナル対バックグラウンドが悪化している。
【０００８】
当業者に知られたＩＣＧと比較して特性が改善した新規蛍光色素を提供する他の方法は、色素−タンパク質コンジュゲートの合成である（Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ２００４， ３， ３９３）。７０ｋＤａを超える分子量を有するタンパク質とのカップリングにより、又はポリエチレングリコールをコンジュゲートすることによりそれだけの分子量に至らしめるＡｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ２００３， ５５， １２６１−７７）ことにより、その色素の腎排出は著しく低下する。故に、この方法は、循環時間の直接的な延長をもたらす。しかしながら、このプロセスは、ＩＣＧと比較して、新たな短所を生じる。短所の一つは、タンパク質の追加的使用による望ましくない効果のリスクの増大である。アルブミン又はイムノグロブリン等のカップリングパートナーとして使用されるタンパク質は、免疫応答の増大を引き起こす場合があることが知られている。診断プロセスは高いレベルの薬物安全性を要求するので、蛍光色素−タンパク質コンジュゲートの使用は好ましくない。ＩＣＧと比較して著しく高い蛍光色素−タンパク質コンジュゲートの生産コストは、もう一つの短所である。
【０００９】
特性を改善したＩＣＧの取得を目標とする改変医薬組成物の調製も知られている。Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ２０００， ７１， ３４７ （Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ ｅｔ ａｌ．）， ＷＯ２００７／０２５７６８ （Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｏｃｙａｍｎｅ ｇｒｅｅｎ： Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｍｉｃｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ， ２００４， ２７８， ９３−３０１， Ｓａｘｅｎａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．： Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｔｏ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｂ．， ２００４， ７４， ２９−３８， ＷＯ２００４／０６４７５１に、様々な医薬組成物が記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
故に、特性を改善したナノ粒子製剤を提供することが、本発明の目的の一つであった。これらのナノ粒子製剤は、造影剤として特に適している。
【００１１】
本発明は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及びＮＩＲ（近赤外線）蛍光色素を含む、ナノ粒子製剤を対象とする。ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーは、ポリマー性両親媒性物質又は界面活性剤であり、水性媒体中で仕切られた分子構造、特にミセル又はエマルジョンを形成する。本発明の意味において、ミセルは、ナノ粒子製剤の一つの構成材である。
【００１２】
故に、本発明の枠組み内で、「ナノ粒子製剤」という用語は、前記構成材を含む、本質的に区分単位（ｓｅｐａｒａｔｅ ｕｎｉｔ）を意味する。ミセルは、そのような区分単位の一例である。
【００１３】
本発明の枠組み内で、「水性媒体」という用語は、少なくとも７５重量％、好ましくは少なくとも９０重量％の水を含有する水性液を意味する。本発明において、前記水性媒体の追加的な成分として、塩、例えば無機塩又は有機塩等の生理的に適合する成分が含まれてもよい。無機塩として、例えば、塩化物、炭酸塩、酢酸塩、二水素リン酸塩（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、一水素リン酸塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等が挙げられる。有機塩として、例えば、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、メグルミン、リシン、グリシン、アスパラギンの塩酸塩等が挙げられる。該塩は、水酸化ナトリウム溶液、炭酸水素ナトリウム、塩酸、リン酸、酢酸、アスコルビン酸又はクエン酸等の酸及び塩基と組み合わされ、緩衝系を形成する場合がある。更に、そのような緩衝系は、共溶媒、例えばエタノール、ジエタノールアミン、グリセリン、ポリエチレングリコール等を含む場合がある。他の生理的に適合する成分として、糖、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース、マンニトール、ソルビトール、デキストラン、デキストロース等を含む。本発明において使用される緩衝系の概説は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ ｅｄ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで読むことができる。
【００１４】
本発明の枠組み内で、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はメトキシポリエチレングリコールを親水性構造要素として含み、アルキル鎖を親油性構造要素として含む化合物である。本発明において、３〜１５０オキシエチレン単位（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、好ましくは３〜５０オキシエチレン単位のポリエチレングリコールが好ましい。ＰＥＧは一様（ｕｎｉｆｏｒｍ）である必要は無く、むしろ平均分子量が一定の、様々な個数のオキシエチレン単位から成る混合物である。好ましくは、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーの分子量は、２００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌｅである。好ましくは、ＰＥＧ−アルキルブロック子ポリマーの分子量は、２５０〜３，０００ｇ／ｍｏｌｅである。ＰＥＧ−アルキルブロック子ポリマーの分子量は、３００〜１，０００ｇ／ｍｏｌｅであるのが特に好ましい。ここで、ＰＥＧ−アルキルブロック子ポリマーは、親水性構造要素及び親油性構造要素が連結し、好ましくは共有結合を通じて結合している分子である。
【００１５】
本発明に係るナノ粒子製剤の平均分子量は、好ましくは、１００，０００〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内である。これは、水性媒体中で形成される区分単位の１分子の平均質量を意味する。
【００１６】
本発明に係る製剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーの１重量％未満、好ましくは０．１重量％未満、そして特に好ましくは０．０１重量％未満である。ここで、重量％は、水性製剤中の相対重量％を示す。
【００１７】
本出願の枠組み内で、「アルキル鎖」という用語は、飽和又は不飽和炭化水素を意味する。本発明のアルキル鎖は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシル又はフェニルで一置換又は多置換されている場合がある、３〜３０個の炭素原子を含むアルキル鎖である。飽和、不飽和、又は化学的に／生化学的に修飾された脂肪酸由来のアルキル鎖が好ましい。ここで、化学的又は生化学的修飾は、特に、以下：ヒドロキシル化、エポキシド化、アセチル化、カルボキシル化、エステル化、任意で上記修飾の一つを含み得るアルキル基による分岐化を含む群から選択される。
【００１８】
例えば、飽和脂肪酸は、酪酸、ヘキサノン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸、ヘキサコサン酸、ステアリン酸、エイコサン酸、マルガリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリル酸、デカン酸、オクタン酸を含む。不飽和脂肪酸は、例えば、パルミトレイン酸、バクセン酸、エライジン酸、オレイン酸、イコセン酸、ネルボン酸、エルカ酸、セトール酸、リノール酸、リノレン酸、チムノドン酸（ｔｉｍｎｏｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クルパンドン酸、アラキドン酸を含む。化学的に又は生化学的に修飾された脂肪酸は、ヒドロキシル脂肪酸又はアリール脂肪酸、例えば１２−ヒドロキシステアリン酸である。
【００１９】
よって、特に好ましいナノ粒子製剤は、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーがＰＥＧ−脂肪酸エステルブロックコポリマーであるものである。
【００２０】
ポリエチレングリコール−１２−ヒドロキシステアリン酸は、特に好ましい。
【００２１】
本発明において、脂肪酸は、前記酸性基（ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）、又は前記酸性基の誘導体を有するＰＥＧとの結合を形成する。結合は、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、チオカルバメート、チオエーテル、又は尿素結合であってもよい。ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、アミン、チオール、又は他の官能基に転換している場合がある。脂肪酸の三世紀とＰＥＧとの直接の結合が好ましい。エステル結合は、特に好ましい。
【００２２】
更に、本発明は、ＰＥＧ−脂肪酸エステルブロックコポリマーに関し、ここで、構造要素としてのグリセロールがＰＥＧと共有結合し、そして脂肪酸は該グリセロールのヒドロキシル基とエステルを形成する。ポリエチレングリコール−ポリグリセロール−リシノレアート（ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）は、特に好ましい。
【００２３】
ＮＩＲ−蛍光色素は、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光を発するクロモフォア又はフルオロフォアである。
【００２４】
親油性のＮＩＲ蛍光色素が好ましい。本発明の意味における親油性ＮＩＲ蛍光色素は、スルホネート、硫酸、カルボキシル、ポリヒドロキシアルキル（４〜６ヒドロキシル基）から選択される最大で２つの官能基を担持するものである。
【００２５】
前記ＮＩＲ蛍光色素は、ポリメチン色素、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｉｎｅ）、クロコニウム色素、スクアリリウム（ｓｑｕａｒｉｌｉｕｍ）を含む群から選択されるものが特に好ましい。
【００２６】
前記ＮＩＲ蛍光色素は、ポリメチン色素、シアニン色素、インドトリカルボシアニン、３，３’−ジエチルオキサジカルボ−シアニンヨーダイド（ＤＯＤＣＩ）、３，３’−ジエチルチオジカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＤＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチオトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＴＣＩ）、インドシアニングリーンを含む群から選択されるものが最も好ましい。
【００２７】
好ましいインドトリカルボシアニンは、ベンゾインドレニン（ｂｅｎｚｏｉｎｄｏｌｅｎｉｎｅ）及び不飽和若しくは飽和ペンタメチン鎖、並びにアルキル基を基礎として、該ベンゾインドール構造中の各窒素が親水基で置換されている。特に、ＮＩＲ蛍光色素のインドシアニングリーン（ＩＣＧ、ＣａｒｄｉｏＧｒｅｅｎ、ＩＣ Ｇｒｅｅｎ、ＤｉａｇｎｏＧｒｅｅｎ）が好ましい。インドシアニングリーンに加えて、インドシアニングリーンの誘導体も、特に好ましい。インドシアニングリーンの誘導体は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル、クロリン、アルコキシ及び／又は該インドシアニングリーンのヘプタメチン鎖と共に５〜６員環を形成するアルキル基で置換されたポリメチン鎖を有するインドシアニングリーン構造である。
【００２８】
インドシアニングリーンは、
ａ）インドール窒素における１つ又は２つのスルホブチル鎖が、−Ｃ１−６−ａｌｋｙｌ−Ｒ２で置換され、ここでＲ２は、−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３−Ｎａ＋、−ＮＨ２、−Ｎ３、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｎａ＋、−Ｃ≡Ｃ、−Ｃ１−２０−アルキル、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−２０−アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−２０−アルキル、及び−０−Ｃ１−２０−アルキルを含む群から選択され、ここでＣ１−２０−アルキルは、１つ以上の（好ましくは１〜３個）の非連続的メチレン単位が、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ２、ＳＯ、アリール、エテン（ｅｔｈｅｎ）又はエチン（ｅｔｈｉｎｅ）を含む群から選択される単位で置換されている場合がある分岐鎖又は直鎖アルキルであり、そして、ここでアルキルは、−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３−Ｎａ＋、−ＮＨ２、−Ｎ３、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａ＋、−Ｃ≡Ｃを含む群から選択される少なくとも１つの（好ましくは１〜３個の）基で置換され；及び／又は
ｂ）ポリメチン鎖は、中心炭素原子がＲ３基で置換されたポリメチン鎖で置換され、ここで２つの隣接する炭素原子が、ポリメチン鎖の３つの炭素原子と共に５〜６員環を形成し得て、ここでＲ３は、−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｓ−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｏ−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２を含む群から選択され、ここでＲ２は上記のものであり、及び／又は
ｃ）外側のベンズインドール環（ｏｕｔｅｒ ｂｅｎｚｉｎｄｏｌｅ ｒｉｎｇ）は、独立して−ＳＯ３−Ｎａ＋、−ＣＯＯＨ又は−ＯＨから選択される１つ以上の基で置換された
ものが好ましい。
【００２９】
本発明に係るＩＣＧ及び誘導体の構造を示す図８を、そのような構造の例として示す。
【００３０】
ＩＣＧの誘導体は、
ａ）インドール窒素における１つ又は２つのスルホブチル鎖が、−Ｃ１−４−ａｌｋｙｌ−Ｒ２で置換され、ここでＲ２は、−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３−Ｎａ＋、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｎａ＋を含む群から選択され、及び／又は
ｂ）ポリメチン鎖は、中心炭素原子がＲ３基で置換されたポリメチン鎖で置換され、ここで２つの隣接する炭素原子が、ポリメチン鎖の３つの炭素原子と共に６員環を形成し得て、ここでＲ３は、−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２、−Ｏ−フェニル−Ｃ１−６アルキル−Ｒ２を含む群から選択され、ここでＲ２は、−ＣＯＯＨ又は−ＳＯ３−Ｎａ＋を表し、及び／又は
ｃ）外側のベンズインドール環は１つ又は２つの−ＳＯ３−Ｎａ＋で置換された
ものが好ましい。
【００３１】
インドシアニングリーン（図８Ａ）の誘導体の模式図を、図８Ｂに示す。
【００３２】
本発明に係るナノ粒子製剤の直径は、１〜１，０００ｎｍ、好ましくは５ ｎｍ〜５００ ｎｍの範囲内であってもよい。
【００３３】
本発明に係る製剤の蛍光又はＮＩＲ蛍光は、６００ｎｍ〜１，０００ｎｍ、好ましくは７５０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲内である。
【００３４】
本発明に係る製剤の蛍光量子効率は、少なくとも水中の色素溶液と同等、好ましくは２倍、そして特に好ましくは４倍である。インドシアニングリーンにおいて、ナノ粒子製剤の蛍光量子効率は、少なくとも４％、特に好ましくは少なくとも８％である。
【００３５】
クエンチング、即ち濃度が増大したときの蛍光強度の低下は、本発明に係る製剤の場合、純水性製剤（ｐｕｒｅｌｙ ａｑｕｅｏｕｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と比較して、より高濃度のときに限って生じる。インドシアニングリーンの場合、クエンチングは、純水性製剤の１０倍の濃度で優位に生じる。
【００３６】
更に、本発明に係る製剤は、前記色素の精製水性製剤よりも高濃度で得られる。少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度が好ましい。
【００３７】
本発明に係る製剤の保存安定性は、純水性製剤及びＳａｘｅｎａ ｅｔ ａｌに記載される製剤と比較して、顕著に改善されている。製造の７日後に、製剤化ＮＩＲ蛍光色素の９０％以上が、なおも活性状態として検出され得る。
【００３８】
本発明に係る製剤中のＩＣＧの血漿タンパク質への結合は、ＩＣＧのそれに対応する。ヒト血清中でミセル製剤を４時間インキュベーションし、未結合のＩＣＧを超遠心分離により除去し多後、遊離部分（ｆｒｅｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）ＩＣＧを測定すると、遊離部分は５％未満である。この値は、ＩＣＧの水性液を用いた類似の実験において得られる。
【００３９】
ＩＣＧの水性液（吸収極大７８０ｎｍ）と比較して、ＩＣＧミセル製剤中のＩＣＧの吸収極大は７９７ｎｍであり、長波長側に１７ｎｍシフトしている（赤方偏移）。組織の光学的特性のため、このシフトは、励起光の透過深度を増大させ、それにより組織中の検出が改善する。更に、吸収極大の７９７ｎｍは、血漿中のＩＣＧの吸収極大（８０５ｎｍ）に近い。既存の診断装置は、この特性が製剤を直接使用できるように、この波長に調整される。
【００４０】
更に、本発明は、本発明に係るナノ粒子製剤を含む医薬組成物に関する。
【００４１】
また、本発明は、造影剤として使用するための本発明に係るナノ粒子製剤に関する。
【００４２】
本発明の他の目的は、以下のプロセスを含むナノ粒子製剤を調製するプロセスである。
【００４３】
ナノ粒子製剤の調製の本質的な工程は、（１）ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーを、好ましくは０．０５〜１ｇ／ｍｌの濃度となるように水に溶解する工程、及び（２）該溶液に蛍光色素を加えてミセル製剤を形成する工程である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】水中のＩＣＧ （点線）及び実施例１に従い調製した水中のＩＣＧミセル（実線）の吸収スペクトルを示す。ミセル溶液に対する標準化＝１とした。
【図１Ｂ】水中のＩＣＧ （点線）及び実施例１に従い調製した水中のＩＣＧミセル（実線）の蛍光発光スペクトルを示す。ミセル溶液に対する標準化＝１とした。
【図１Ｃ】ＩＣＧの濃度（０．００１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ）に対する、水中のＩＣＧ （正方形）及び水中のＩＣＧミセルの蛍光強度を示す。
【図１Ｄ】動的光散乱を利用した粒子サイズ分布を示す。
【図１Ｅ】様々な製剤の時間に対する最高の吸光度を測定することによる、安定性の決定を示す。水中のＩＣＧ（正方形）及び３つのミセル製剤；Ｓｏｌｕｔｏｌ １０％（円）、２０％（三角形）、４０％（逆三角形）を比較している。
【図２Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルの吸収スペクトルを示す。
【図２Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルの発光スペクトルを示す。
【図２Ｃ】Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図３Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルの吸収スペクトルを示す。
【図３Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルの発光スペクトルを示す。
【図３Ｃ】Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図４Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ５８ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図４Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ５８ミセルの発光スペクトルを示す。
【図４Ｃ】Ｂｉｒｊ（登録商標） ５８ミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図５Ａ】水中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ９８ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図５Ｂ】ＤＭＳＯ中のＩＣＧ及びＩＣＧ−Ｂｉｒｊ（登録商標） ９８ミセルの発光スペクトルを示す。
【図５Ｃ】Ｂｉｒｊ（登録商標） ９８ミセル中のＩＣＧ（０．００５％ ＩＣＧ）の安定性を示す。
【図６Ａ】ＩＣＧ誘導体ＮＷ００３．５の構造を示す。
【図６Ｂ】水中のＮＷ００３．５及びＮＷ００３．５−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図６Ｃ】ＤＭＳＯ中のＮＷ００３．５及びＮＷ００３．５−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの発光スペクトルを示す。
【図６Ｄ】Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセル中のＮＷ００３．５（０．００５％ ＮＷ００３．５）の安定性を示す。
【図７Ａ】ＩＣＧ誘導体ＩＲ−７８３の構造を示す。
【図７Ｂ】水中のＩＲ−７８３及びＩＲ−７８３−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの吸収スペクトルを示す。
【図７Ｃ】ＤＭＳＯ中のＩＲ−７８３及びＩＲ−７８３−Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセルの発光スペクトルを示す。
【図７Ｄ】Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５ミセル中のＩＲ−７８３ （０．００５％ ＩＲ−７８３）の安定性を示す。
【図８Ａ】本発明において使用される色素の例であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の模式図を示す。
【図８Ｂ】本発明において使用される色素の例であるインドシアニングリーンの誘導体の模式図を示す。
【００４５】
以下の実施例において、本発明はより詳細に説明される。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ミセル製剤の調製
例示物１：２ｇのＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５を、６５℃に加熱する。注射用の水１０ｍｌを攪拌しながら添加し、得られた透明の溶液を室温まで冷却する。５０ｍｌのＩＣＧを該ミセル溶液中に溶解し、０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌する。
【００４７】
例示物２：２ｇのＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５を、室温で、攪拌しながら１０ｍｌの注射用の水に添加する。透明の溶液が得られる。５０ｍｌのＩＣＧを該ミセル溶液中に溶解し、０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌する。
【００４８】
吸収及び蛍光測定
ＵＶＩＫＯＮ ９３３分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ社製）７００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において測定する。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７８０ｎｍ、ＩＣＧミセルのλｍａｘ＝７９７ｎｍであった（図１Ａ）。
【００４９】
Ｓｐｅｘ社製ＦｌｕｏｒｏＬｏｇ−２蛍光分光光度計（３５０ Ｗキセノンランプ）を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７００ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、それぞれの製剤の吸収スペクトルの吸収極大と対応していた（水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７８０ｎｍ及びＩＣＧミセルのλｍａｘ＝７９７ｎｍ）。ＤＭ３０００ソフトウェアのｓ及びｒモーダス（ｍｏｄｕｓ）により、評価の際に、異なる励起波長の異なるランプ強度が考慮され得る。
【００５０】
放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１３）。
【００５１】
その結果、水中ＩＣＧの量子効率はΦ＝０．０２であるのに対し、ＩＣＧミセルの量子効率はΦ＝０．０８であることが分かった。クエンチングは、より高濃度（ＩＣＧが０．１ｍｇ／ｍｌから発生する）の場合にのみ起こる（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
【００５２】
安定性試験
安定性試験において、時間に対する様々な製剤の最高の吸光度を測定した。ここでは、０．０００５％のＩＣＧ溶液を調製し、これを常温で保存した。純水性ＩＣＧ製剤の安定性としては、僅か７日後に、標準吸光度が１０％を下回るところまで低下を示す。一方、ＩＣＧのミセル製剤は、７日の保存後にあっても初期の数値と比較してなおも９０％を上回る吸光度を示し、４週間を経過してもなお、吸光度は７０％を下回らない（図１Ｅ）。
【００５３】
粒子サイズ
動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ社製 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ）を利用して、粒子サイズ分布を決定した。Ｈｅ−Ｎｅ−レーザー（６３３ｎｍ、４ｍＷ）を用いて、測定を実施した。４５μｌクォーツキュベット中で、試料を希釈せずに直接測定した。
【００５４】
その結果、ＰＤＩ（多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ））０．０６１で、流体力学的直径が１２ｎｍであることが分かった（図１Ｄ）。
【００５５】
血漿タンパク質との結合
血漿タンパク質との結合を判定するために、吸収スペクトルの波長のシフトを測定した。ここでは、水中及び血漿中のＩＣＧの７００ｎｍ〜９００ｎｍのスペクトルを、水中及び血漿中のＩＣミセルのスペクトルと比較した。
【００５６】
その結果、両製剤において、血漿中の吸収極大が、８０５ｎｍにシフトすることが分かった。本発明に係る製剤中のＩＣＧの血漿タンパク質との結合の挙動は、水性媒体中のＩＣＧの挙動と対応する。
【００５７】
溶血アッセイ
ＩＣＧミセルの溶血活性の実験において、まず、ヘパリン化した全血から血漿を除去したものを、３回ＰＢＳで洗浄した。赤血球のＰＢＳ中２％懸濁物を調製して、これを３７℃で１時間、ＩＣＧミセル製剤を加えてインキュベーションした。純粋なＰＢＳ溶液をブランク読取り値（０％溶血）として、及び２％トライトン溶液を１００％溶血値として使用した。インキュベーション後、赤血球を遠心分離で除去し、上澄の赤色の色素を、光度的に５４０ｎｍで測定した。
【００５８】
その結果、ＩＣＧミセルは、溶血活性を示さないことが分かった。
【００５９】
ＰＥＧ−アルキル化合物
実施例２：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、０．３ｇのＣｉｔｌｉｒｏｌ １０ＭＳ（ＰＥＧ ２０ステアリン酸）を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）５０ｍｇＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００６０】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において測定する。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図２Ａ）。
【００６１】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルはφ＝０．０８であることが分かった（図２Ｂ）。
【００６２】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｃｉｔｈｒｏｌ １０ＭＳミセルは、初期の値と比較して、なおも９４％を超える吸光度を示した（図２Ｃ）。
【００６３】
実施例３：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、０．４ｇのＣｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤ（ＰＥＧ ４０ステアリン酸）を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００６４】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図３Ａ）。
【００６５】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセルはφ＝０．０７であることが分かった（図３Ｂ）。
【００６６】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｃｒｏｄｅｔ Ｓ４０ ＬＤミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９７％を超える吸光度を示した（図３Ｃ）。
【００６７】
実施例４：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、０．５ｇのＢｒｉｊ（登録商標） ５８（ＰＥＧ ２０セチルエーテル（ｃｅｔｙｌｅｔｈｅｌ））を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）５０ｍｇＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００６８】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ５８ミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図４Ａ）。
【００６９】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ５８ミセルはφ＝０．０７であることが分かった（図４Ｂ）。
【００７０】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ５８ミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９７％を超える吸光度を示した（図４Ｃ）。
【００７１】
実施例５：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、１ｇのＢｒｉｊ（登録商標） ９８（ＰＥＧ ２０オレイルエーテル（ｏｌｅｙｌｅｔｈｅｌ））を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）５０ｍｇＩＣＧ溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００７２】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＣＧのλｍａｘ＝７７９ｎｍ、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ９８ミセルのλｍａｘ＝８００ｎｍであった（図５Ａ）。
【００７３】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ９８ミセルはφ＝０．０６であることが分かった（図５Ｂ）。
【００７４】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で２ヶ月保存後、ＩＣＧ Ｂｒｉｊ（登録商標） ９８ミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９５％を超える吸光度を示した（図５Ｃ）。
【００７５】
ＩＣＧ誘導体
実施例６：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、１ｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ＮＷ０００３．５ （図６Ａ）溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００７６】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＮＷ０００３．５ のλｍａｘ（モノマー）＝７８８ｎｍ、ＮＷ０００３．５ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルのλｍａｘ＝８０６ｎｍであった（図６Ｂ）。
【００７７】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＮＷ０００３．５ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルはφ＝０．０６であることが分かった（図６Ｃ）。
【００７８】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で１ヶ月保存後、ＮＷ０００３．５ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセル製剤は、初期の値と比較して、なおも９５％を超える吸光度を示した。
【００７９】
実施例６：
１０ｍｌの注射用水に、室温攪拌下で、１ｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５を溶解する。透明な溶液が得られる。５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ＩＲ−７８３溶液（図７Ａ）溶液を該ミセル溶液に溶解し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを用いて濾過滅菌する。
【００８０】
吸光度及び蛍光の測定
ＤＵ（登録商標）５３０ Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長の吸収スペクトルを、前記様々な溶媒において記録した。その結果、水中ＩＲ−７８３のλｍａｘ（モノマー）＝７７５ｎｍ、ＩＲ−７８３ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルのλｍａｘ＝７９７ｎｍであった（図７Ｂ）。
【００８１】
ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−６５００分光光度計を用いて、蛍光測定を実行した。ここでは、７７０ｎｍ〜９００ｎｍの発光スペクトルを記録した。励起波長は、各ケースで７６０ｎｍであった。放出曲線下表面積により、量子効率を計算する。ＤＭＳＯ中のＩＣＧを、標準として使用した（Φ＝０．１２）。その結果、量子効率は、水中ＩＣＧはφ＝０．０２であるのに対して、ＩＲ−７８３ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセルはφ＝０．１１であることが分かった（図７Ｃ）。
【００８２】
安定性試験
安定性試験において、前記様々な製剤の時間に対する吸収スペクトルを測定した。遮光下４℃で１ヶ月保存後、ＩＲ−７８３ Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５ミセル製剤は、初期の値と比較して、顕著に変化しなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及び近赤外線蛍光色素を含むナノ粒子製剤であり、ここで、該ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーが、以下の構造要素：
親水構造要素としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はメトキシポリエチレングリコール、及び
親油性構造要素として、独立してＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシル又はフェニルで一置換又は多置換されたものであり得る、３〜３０個の炭素原子を有する炭化水素鎖；
を含み、ここで、直径が１ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であり、蛍光が６００ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であり、水性媒体中でミセルを形成する、該ナノ粒子製剤。
【請求項２】
前記炭化水素鎖が、飽和、不飽和又は化学的に／生化学的に修飾された脂肪酸に由来する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
【請求項３】
前記近赤外線蛍光色素が親油性蛍光色素である、請求項１又は２のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項４】
前記近赤外線蛍光色素が、ポリメチン色素、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｉｎｅ）、クロコニウム色素、スクアリリウム（ｓｑｕａｒｙｌｉｕｍ）色素から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項５】
前記近赤外線蛍光色素が、ポリメチン色素、シアニン色素、インドトリカルボシアニン、３，３’−ジエチルオキサジカルボ−シアニンヨーダイド（ＤＯＤＣＩ）、３，３’−ジエチルチオジカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＤＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチオトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＴＣＩ）、インドシアニングリーン及びインドシアニングリーンの誘導体を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項６】
前記ＮＩＲ蛍光色素が、インドシアニングリーンである、請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子製剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
インビボ造影剤として使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項９】
以下の：（１）前記ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーを水に溶解し、（２）該溶液に前記蛍光色素を添加してミセル製剤を形成する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子製剤を調製するプロセス。
【請求項１】
ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマー及び近赤外線蛍光色素を含むナノ粒子製剤であり、ここで、該ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーが、以下の構造要素：
親水構造要素としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はメトキシポリエチレングリコール、及び
親油性構造要素として、独立してＣ１−Ｃ３アルキル、ヒドロキシル又はフェニルで一置換又は多置換されたものであり得る、３〜３０個の炭素原子を有する炭化水素鎖；
を含み、ここで、直径が１ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であり、蛍光が６００ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であり、水性媒体中でミセルを形成する、該ナノ粒子製剤。
【請求項２】
前記炭化水素鎖が、飽和、不飽和又は化学的に／生化学的に修飾された脂肪酸に由来する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
【請求項３】
前記近赤外線蛍光色素が親油性蛍光色素である、請求項１又は２のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項４】
前記近赤外線蛍光色素が、ポリメチン色素、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｉｎｅ）、クロコニウム色素、スクアリリウム（ｓｑｕａｒｙｌｉｕｍ）色素から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項５】
前記近赤外線蛍光色素が、ポリメチン色素、シアニン色素、インドトリカルボシアニン、３，３’−ジエチルオキサジカルボ−シアニンヨーダイド（ＤＯＤＣＩ）、３，３’−ジエチルチオジカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＤＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチオトリカルボシアニンヨーダイド（ＤＴＴＣＩ）、インドシアニングリーン及びインドシアニングリーンの誘導体を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項６】
前記ＮＩＲ蛍光色素が、インドシアニングリーンである、請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子製剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
インビボ造影剤として使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子製剤。
【請求項９】
以下の：（１）前記ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーを水に溶解し、（２）該溶液に前記蛍光色素を添加してミセル製剤を形成する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子製剤を調製するプロセス。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３９１３８（Ｐ２０１０−５３９１３８Ａ）
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２４５１２（Ｐ２０１０−５２４５１２）
【出願日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６２１９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３４１７７
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５１００４０１３４）ミフェニオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６２１９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３４１７７
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５１００４０１３４）ミフェニオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (4)
【Ｆターム（参考）】
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