ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善剤のスクリーニング方法
【課題】ストレスによる皮膚の病変、特に、ニキビやアトピー性皮膚炎の増悪や、ステロイド剤による皮膚疾患、例えば、ステロイドニキビの症状を改善又は軽減する薬剤をスクリーニング及び／又は評価を行うために、ケラチノサイトを用いるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を開発すること。
【解決手段】本発明は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む。
【解決手段】本発明は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法、具体的には、ＴＬＲ２発現の抑制を指標とする、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ストレスの多い日常生活を送っている女性はニキビができやすく、悪化しやすいといわれている。またアトピー性皮膚炎患者の皮膚の炎症はストレスによって悪化することが知られている。
【０００３】
ストレスに曝されると、脳下垂体前葉から分泌されるＡＣＴＨを介して副腎皮質から糖質コルチコイドが産生され、全身の細胞に抗ストレス作用、抗炎症作用等のさまざまな作用を発揮する。糖質コルチコイドの作用のほとんどはコルチゾールによるものであり、糖質コルチコイドと同一の作用機序の物質としては、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン等の合成ステロイドが知られている。ステロイドの抗炎症作用は、蛋白分解酵素を含んだライソゾーム顆粒膜の安定化、毛細血管壁の透過性低下、炎症組織への白血球浸潤の抑制等の作用による。
【０００４】
上皮細胞が微生物を認識して免疫反応及び炎症反応を引き起こす受容体としてＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）の遺伝子ファミリーが重要な役割を果たす（非特許文献１）。ＴＬＲ遺伝子ファミリーのうちＴＬＲ２は、さまざまな微生物由来のペプチドグリカン、リポタンパク質、リポアラビノマンナン等の分子パターンを認識して炎症反応を誘発する（非特許文献２）。子宮、気道、肺等の上皮細胞の系では、糖質コルチコイドが微生物刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現を増強する（非特許文献３−５）。
【非特許文献１】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、Ｒ．ら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８：３９４−３９７．
【非特許文献２】Ａｄｅｒｅｍ、Ａ．及びＵｌｅｖｉｔｃｈ、Ｒ．Ｊ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ、４０６：７８２−７８７．
【非特許文献３】Ｈｏｍｍａ、Ｔ．ら、（２００４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３１：４６３−４６９．
【非特許文献４】Ｉｍａｓａｔｏ、Ａ．ら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７４４４−４７４５０．
【非特許文献５】Ｓｈｕｔｏ、Ｔ．ら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：１７２６３−１７２７０． ニキビやアトピー性皮膚炎では、皮膚細胞、特に、ケラチノサイトにおける微生物の認識と炎症反応の誘発が問題となる。しかし、これまでケラチノサイトにおいて糖質コルチコイドによる炎症反応の増強を再現する実験系の報告はほとんどみあたらなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ストレスによる皮膚の病変、特に、ニキビやアトピー性皮膚炎の増悪や、ステロイド剤による皮膚疾患、例えば、ステロイドニキビの症状を改善又は軽減する薬剤をスクリーニング及び／又は評価を行うために、皮膚細胞、特に、ケラチノサイトを用いるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を開発する必要がある。また、微生物や炎症性サイトカインの刺激によるケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現を糖質コルチコイドが増強する現象を再現する実験系を利用して、ストレス又はステロイド剤によるＴＬＲ２遺伝子の発現増強を阻害する活性を、微生物や炎症性サイトカインの刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導を阻害する活性と区別して評価する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む。
【０００７】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【０００８】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【０００９】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地の場合がある。
【００１０】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００１１】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現刺激剤は炎症性サイトカインの場合がある。
【００１２】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現刺激剤はＴＮＦ−αの場合がある。
【００１３】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００１４】
本発明は、被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、デキサメタゾンとをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む、ステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、デキサメタゾンとを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【００１６】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、コルチゾールを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【００１７】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００１８】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２発現刺激剤はアクネ菌抽出物の場合がある。
【００１９】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００２０】
本発明は、被験物質と、アクネ菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む、ニキビ改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２１】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記アクネ菌抽出物と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記アクネ菌抽出物とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【００２２】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【００２３】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地の場合がある。
【００２４】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００２５】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００２６】
本発明は、被験物質と、黄色ブドウ球菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む、アトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記黄色ブドウ球菌抽出物と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記黄色ブドウ球菌抽出物とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【００２８】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【００２９】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地の場合がある。
【００３０】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００３１】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００３２】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法における、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップ、及び／又は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等と、前記ＴＬＲ２発現増強剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップとは、本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬の活性の評価方法にも利用することができる。
【００３３】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法及び評価方法において、被験物質は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬の有効成分となりうるいずれかの物質をいう。前記被験物質は、鉱物、化学合成物質を含む無生物由来の物質と、遺伝子工学又は細胞工学的な手法を含む生物由来の物質とを含む。人体に無害であることが知られているか、香辛料その他の食料と、香料その他の化粧料と、薬草その他の医薬品原料として伝統的に従来から利用されてきた物質を被験物質とすることが好ましい。植物を被験物質とする場合には、葉部、小枝部等の乾燥粉砕物をそのまま使用することもできるが、それらの抽出物を使用するのが好ましい。植物の抽出物は、主に葉部、小枝部等を乾燥又は乾燥することなく、あるいは、真空処理又は常圧から６００ＭＰａまでの加圧処理で粉砕した後、常温又は加温で、溶剤により、又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得ることができる。なお、本発明における植物抽出物とは、各種溶媒抽出液又はその希釈液、濃縮液もしくは乾燥末を意味するものとする。溶媒抽出物は、植物又はその乾燥末を、中性、酸又はアルカリ性の水性溶媒、有機溶媒等を用いて抽出処理することにより得られる場合がある。
【００３４】
本発明のＴＬＲ２発現刺激剤とは、ＴＬＲ２遺伝子の発現を誘導すること、すなわち、ケラチノサイトと接触させるときにケラチノサイトが発現するＴＬＲ２遺伝子の発現量が増加するいずれかの物質をいう。本発明のＴＬＲ２発現刺激剤は、ＴＮＦ−αの他、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を含むがこれらに限られない炎症性サイトカインと、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）と、ＮＢＲＣ１２７３２株を含むがこれに限られない黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と、ＮＢＲＣ１２９９３株を含むがこれに限られない表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とを含むグラム陽性及び／又は陰性細菌と、結核菌その他のマイコバクテリアを含む放線菌と、酵母等の真核細胞とを含む、微生物を含む場合がある。あるいは、前記微生物の成分である、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、リポタンパク質、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、リポアラビノマンナン、ザイモザン等を含む場合がある。本発明のＴＬＲ２発現刺激剤は、ＴＬＲ２タンパク質のリガンドとして認識され、シグナル伝達を活性化することができることを条件として、いかなる物質でもかまわない。
【００３５】
本発明のＴＬＲ２発現増強剤は、ＴＬＲ２発現刺激剤とともにケラチノサイトと接触させるときにケラチノサイトが発現するＴＬＲ２遺伝子の発現量が、ＴＬＲ２発現刺激剤だけをケラチノサイトと接触させるときにケラチノサイトが発現するＴＬＲ２遺伝子の発現量より増加することを条件としていかなる物質でもかまわない。本発明のＴＬＲ２発現増強剤には、糖質コルチコイドを含むが、これらに限られない。糖質コルチコイドには、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）と、コルチゾールと同一の作用機序で生物活性を発揮する合成化合物である、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン等の合成ステロイドを含む。
【００３６】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法における、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップ、及び／又は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等と、前記ＴＬＲ２発現増強剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップとは、本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法又は評価方法にも利用することができる。
【００３７】
本明細書において、ＴＬＲ２遺伝子の発現量は、ＴＬＲ２遺伝子ｍＲＮＡの量か、ＴＬＲ２遺伝子産物であるＴＬＲ２タンパク質の量かを検出する場合がある。代替策としては、ＴＬＲ２遺伝子の発現調節制御の関与するプロモーター、エンハンサー等のシス調節領域を、ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ等のレポータ遺伝子と連結した発現レポータコンストラクトを、予め、あるいは、ＴＬＲ２発現刺激剤と同時にケラチノサイトに導入することによって、レポータ遺伝子産物に由来する発光、蛍光、酵素反応産物等を検出する場合もある。
【００３８】
本明細書において、ＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の測定は、定量的ＰＣＲ法の他、ノザンブロット法、ドットブロット法等の固相ハイブリダイゼーション法を含む、当業者に知られたいずれの方法を用いて実行してもかまわない。
【００３９】
本発明のＴＬＲ２遺伝子の発現量は、実験に用いた試料のケラチノサイトの細胞数や細胞の生理状態の相違を標準化するために、本発明のＴＬＲ２発現刺激剤又はＴＬＲ２発現発現剤によって遺伝子発現が変化しないいずれかの遺伝子の発現量によって除算して標準化した相対値で表すことが望ましい。標準化に好ましい遺伝子は、いわゆるハウスキーピング遺伝子である、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、βアクチン等を含むが、これらに限らず、例えば遺伝子発現アレイチップ等の手段で見つけることができる。
【００４０】
本発明のＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質等のスクリーニング方法又は評価方法において、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを実行することにより、被験物質のＴＬＲ遺伝子発現への効果のうち、ＴＬＲ発現刺激剤の作用を阻害する効果と、ＴＬＲ発現増強剤の作用を阻害する効果を区別することができる。これによって、コルチゾールを含むＴＬＲ発現増強剤によるＴＬＲ２遺伝子の発現増強を阻害する効果を有する物質をスクリーニング又は評価することができる。
【００４１】
本発明のＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質等のスクリーニング方法又は評価方法において、ＴＬＲ２発現刺激剤及び／又はＴＬＲ発現増強剤に接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップは、少なくとも６時間以上、終夜、又は１日実行することが好ましいが、実行する時間は、ケラチノサイトがＴＬＲ発現刺激剤及びＴＬＲ発現増強剤の効果を奏することを条件としていかなる長さであってもかまわない。ケラチノサイトの培養下での増殖維持に用いる培地にＴＬＲ発現増強剤のデキサメタゾンと同一の作用機序で生物活性を発揮するコルチゾールを添加する必要がある。そこで、接触させる前に、一定期間コルチゾールを含まない培地に交換して、コルチゾールの影響を除去することが、ケラチノサイトでのＴＬＲ２発現刺激に対する糖質コルチコイドの発現増強効果を検出することを可能にしたと考えられる。
【００４２】
本発明で用いるケラチノサイトは、正常表皮由来のケラチノサイトであり、皮膚組織から単離してそのまま使用してもよいが、好ましくはその培養系を使用する。ヒトケラチノサイトは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社や倉敷紡績株式会社等から市販されており、これらを培養及び継代して用いることもできる。培地は表皮細胞の培養増殖に適するいかなる培地を用いてもよく、例えば、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｍ−ＥＰＩ−２１５０、倉敷紡績株式会社）のような市販の培地を用いてもかまわない。コルチゾール不含培地又はコルチゾールの濃度が明記される場合を除き、前記ＥｐｉＬｉｆｅ培地は０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含む。
【００４３】
新たに培養表皮ケラチノサイトを得る場合には、以下の手順にしたがう。包皮の真皮と表皮を物理的に分離し、表皮を細断して０．３％のトリプシン存在下で３７℃、３０分間インキュベーションを行い、その後トリプシン阻害剤を添加して反応を停止させる。トリプシン処理後の表皮組織を外科用ピンセットでさらに細かくし、金属製メッシュで濾過し、単離ケラチノサイトを遠心し、回収し、ペレットを０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含むＥｐｉＬｉｆｅ培地に懸濁して培養する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下の実施例により本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含有するＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養維持した表皮ケラチノサイトを、６穴培養プレートにウェルあたり５×１０４ないし２×１０５個播種して、０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含有するＥｐｉＬｉｆｅ培地中で３日間培養後に新鮮なコルチゾール不含ＥｐｉＬｉｆｅ培地で培地交換を行い、さらに２４時間後に、スクリーニング対象物質と、１μＭのデキサメタゾンと、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αとを添加したコルチゾール不含ＥｐｉＬｉｆｅ培地で培地交換を行って、６時間ＴＮＦ−α刺激処理を施した。培地中のコルチゾールの影響を調べる実験では、６穴培養プレートに表皮ケラチノサイトを播種し、コルチゾール（１．２７μＭ）含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地で３日間培養した後、新鮮なコルチゾール（１．２７μＭ）含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地で培地交換してさらに２４時間培養した表皮ケラチノサイトをＴＮＦ−α刺激処理に供した。
【００４６】
ＴＬＲ２遺伝子の発現量の定量
前記ＴＮＦ−α刺激処理の後、培地をアスピレータで除去し、各ウェルの細胞をそれぞれＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）で破壊し、製造者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。定法に従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを作成し、定量的ＰＣＲ法によってＴＬＲ２遺伝子の発現量を測定した。ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で標準化された。
【００４７】
結果
培地中のコルチゾールの影響
培地中のコルチゾールがＴＮＦ−α刺激処理に及ぼす効果を調べた実験の結果のグラフを図１に示す。本実験では各条件ごとに３回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。ＴＮＦ−α刺激処理の直前までコルチゾール含有培地で培養したケラチノサイトよりも、ＴＮＦ−α刺激処理の前日からコルチゾール不含培地で培養したケラチノサイトのほうが、デキサメタゾン及びＴＮＦ−αの両方を添加した条件でのＴＬＲ２遺伝子の発現誘導は顕著であった。グラフ中で＊＊で表す２つのデータの有意水準のｐ値は１％未満であった。そこで以下の実験では、ＴＮＦ−α刺激処理の前日からコルチゾール不含培地中で培養したケラチノサイトを用いた。
【実施例２】
【００４８】
ＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子発現誘導の最適化
実施例１のコルチゾール不含培地で１日前培養したケラチノサイトのＴＮＦ−α刺激処理をする際に添加するデキサメタゾンの濃度と、ＴＬＲ２遺伝子発現の測定までのインキュベーション時間とを最適化するために、１００ｎＭ又は１０００ｎＭのデキサメタゾンを１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αでケラチノサイトを刺激する際に添加して、飽和水蒸気、５％ＣＯ２下３７°Ｃでインキュベーションを行った。１時間又は６時間のインキュベーションの後、ケラチノサイトのＲＮＡを抽出して、ＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量的ＰＣＲ法で測定した。
【００４９】
結果
ＴＮＦ−α刺激処理をする際に添加するデキサメタゾンの濃度と、ＴＬＲ２遺伝子発現の測定までのインキュベーション時間とを最適化するために行った実験の結果のグラフを図２に示す。本実験では各条件ごとに４回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。グラフにおいて、＊で表す２つのデータの有意水準のｐ値は５％未満であり、＊＊で表す２つのデータの有意水準のｐ値は１％未満であった。１時間のインキュベーションでは、ＴＮＦ−α刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導はほとんど認められなかった。しかし、６時間のインキュベーションでは、ＴＮＦ−α刺激によってＴＬＲ２遺伝子の発現の顕著な誘導が認められた。そして、デキサメタゾンの添加によりＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導が増強された。
【実施例３】
【００５０】
細菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導
アクネ菌はヒトのニキビ部位から採取した菌を用いた。黄色ブドウ球菌（ＮＢＲＣ１２７３２株）及び表皮ブドウ球菌（ＮＢＲＣ１２９９３株）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手した菌を用いた。それぞれの菌について一般的な培養法で増殖させ、生菌をＥｐｉＬｉｆｅ培地に懸濁して前記ケラチノサイト培養系に添加した。菌数は、少量のアクネ菌（図３のＰ．ａｃｎｅｓＩ）が約３ ｘ １０８ ｃｆｕ、大量のアクネ菌（図３のＰ．ａｃｎｅｓＩＩ）が約７ ｘ １０８ ｃｆｕ、黄色ブドウ球菌（図４のＳ．ａｕｒｅｕｓ）が約５ ｘ １０８ ｃｆｕ、表皮ブドウ球菌（図４のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が約７ ｘ １０８ ｃｆｕであった。６時間のインキュベーションの後、ＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量ＰＣＲ法で測定した。
【００５１】
結果
異なる菌数のアクネ菌生菌菌体によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフを図３に示す。本実験では各条件ごとに２回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。約３ ｘ １０８ ｃｆｕ及び約７ ｘ １０８ ｃｆｕの菌数のアクネ菌（それぞれ図３のＰ．ａｃｎｅｓＩ及びＰ．ａｃｎｅｓＩＩ）によってもＴＮＦ−α刺激処理と同様のＴＬＲ２遺伝子の発現誘導がみられ、デキサメタゾン添加によってＴＬＲ２遺伝子の発現誘導は増強された。
【００５２】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフを図４に示す。本実験では各条件ごとに４回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。約５ ｘ １０８ ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（図４のＳ．ａｕｒｅｕｓ）及び約７ ｘ １０８ ｃｆｕ表皮ブドウ球菌（図４のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）によってもＴＮＦ−α刺激処理と同様のＴＬＲ２遺伝子の発現誘導がみられ、デキサメタゾン添加によってＴＬＲ２遺伝子の発現誘導は増強された。
【実施例４】
【００５３】
ＴＬＲ２遺伝子の発現抑制活性を有する物質の探索
本発明のスクリーニング方法を利用して、さまざまな植物抽出物のＴＬＲ２遺伝子の発現抑制活性を検討した。コルチゾール不含培地で前培養されたケラチノサイト培養系にデキサメタゾン（１μＭ）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに、サクラ抽出物（１０又は５０μｇ/ｍＬ）、ニーム抽出物（１５又は７５μｇ/ｍＬ）、ウーロン茶抽出物（２又は２０μｇ/ｍＬ）又はバラ抽出物（２又は２０μｇ/ｍＬ）をそれぞれ添加し、６時間のインキュベーション後のＴＬＲ２遺伝子の発現量を測定した。
【００５４】
結果
図５に４種類の植物抽出物のＴＬＲ２遺伝子発現抑制効果を検討する実験の結果の表を示す。図５ではデキサメタゾンによって増強されたＴＮＦ−α刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現量を陽性対照として、これに対する各植物抽出物添加培地でのＴＬＲ２遺伝子の発現量の百分率で表した。本実験ではサクラとニームとについては４回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定され、ウーロン茶とバラとについては３回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。いずれの植物抽出物でもＴＬＲ２遺伝子の発現が濃度依存的に抑制されたが、特に５０μｇ／ｍＬのサクラ抽出物はＴＬＲ２遺伝子の発現量のデキサメタゾンによる増強を顕著に抑制することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】培地中のコルチゾールがＴＮＦ−α刺激処理に及ぼす効果を調べた実験の結果のグラフ。
【図２】ケラチノサイトのＴＮＦ−α刺激処理をする際に添加するデキサメタゾンの濃度と、ＴＬＲ２遺伝子発現の測定までのインキュベーション時間とを最適化するために行った実験の結果のグラフ。
【図３】アクネ菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフ。
【図４】黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフ。
【図５】４種類の植物抽出物のＴＬＲ２遺伝子発現抑制効果を検討した実験の結果の表。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法、具体的には、ＴＬＲ２発現の抑制を指標とする、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ストレスの多い日常生活を送っている女性はニキビができやすく、悪化しやすいといわれている。またアトピー性皮膚炎患者の皮膚の炎症はストレスによって悪化することが知られている。
【０００３】
ストレスに曝されると、脳下垂体前葉から分泌されるＡＣＴＨを介して副腎皮質から糖質コルチコイドが産生され、全身の細胞に抗ストレス作用、抗炎症作用等のさまざまな作用を発揮する。糖質コルチコイドの作用のほとんどはコルチゾールによるものであり、糖質コルチコイドと同一の作用機序の物質としては、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン等の合成ステロイドが知られている。ステロイドの抗炎症作用は、蛋白分解酵素を含んだライソゾーム顆粒膜の安定化、毛細血管壁の透過性低下、炎症組織への白血球浸潤の抑制等の作用による。
【０００４】
上皮細胞が微生物を認識して免疫反応及び炎症反応を引き起こす受容体としてＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）の遺伝子ファミリーが重要な役割を果たす（非特許文献１）。ＴＬＲ遺伝子ファミリーのうちＴＬＲ２は、さまざまな微生物由来のペプチドグリカン、リポタンパク質、リポアラビノマンナン等の分子パターンを認識して炎症反応を誘発する（非特許文献２）。子宮、気道、肺等の上皮細胞の系では、糖質コルチコイドが微生物刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現を増強する（非特許文献３−５）。
【非特許文献１】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、Ｒ．ら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８：３９４−３９７．
【非特許文献２】Ａｄｅｒｅｍ、Ａ．及びＵｌｅｖｉｔｃｈ、Ｒ．Ｊ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ、４０６：７８２−７８７．
【非特許文献３】Ｈｏｍｍａ、Ｔ．ら、（２００４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３１：４６３−４６９．
【非特許文献４】Ｉｍａｓａｔｏ、Ａ．ら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７４４４−４７４５０．
【非特許文献５】Ｓｈｕｔｏ、Ｔ．ら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：１７２６３−１７２７０． ニキビやアトピー性皮膚炎では、皮膚細胞、特に、ケラチノサイトにおける微生物の認識と炎症反応の誘発が問題となる。しかし、これまでケラチノサイトにおいて糖質コルチコイドによる炎症反応の増強を再現する実験系の報告はほとんどみあたらなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ストレスによる皮膚の病変、特に、ニキビやアトピー性皮膚炎の増悪や、ステロイド剤による皮膚疾患、例えば、ステロイドニキビの症状を改善又は軽減する薬剤をスクリーニング及び／又は評価を行うために、皮膚細胞、特に、ケラチノサイトを用いるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を開発する必要がある。また、微生物や炎症性サイトカインの刺激によるケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現を糖質コルチコイドが増強する現象を再現する実験系を利用して、ストレス又はステロイド剤によるＴＬＲ２遺伝子の発現増強を阻害する活性を、微生物や炎症性サイトカインの刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導を阻害する活性と区別して評価する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む。
【０００７】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【０００８】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【０００９】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地の場合がある。
【００１０】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００１１】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現刺激剤は炎症性サイトカインの場合がある。
【００１２】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現刺激剤はＴＮＦ−αの場合がある。
【００１３】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００１４】
本発明は、被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、デキサメタゾンとをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む、ステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、デキサメタゾンとを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【００１６】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、コルチゾールを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【００１７】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００１８】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２発現刺激剤はアクネ菌抽出物の場合がある。
【００１９】
本発明のステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００２０】
本発明は、被験物質と、アクネ菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む、ニキビ改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２１】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記アクネ菌抽出物と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記アクネ菌抽出物とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【００２２】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【００２３】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地の場合がある。
【００２４】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００２５】
本発明のニキビ改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００２６】
本発明は、被験物質と、黄色ブドウ球菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含む、アトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法は、前記被験物質と、前記黄色ブドウ球菌抽出物と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記黄色ブドウ球菌抽出物とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含む場合がある。
【００２８】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法は、前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含む場合がある。
【００２９】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地の場合がある。
【００３０】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法において、前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトの場合がある。
【００３１】
本発明のアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法において、前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の場合がある。
【００３２】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法における、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップ、及び／又は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等と、前記ＴＬＲ２発現増強剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップとは、本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬の活性の評価方法にも利用することができる。
【００３３】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法及び評価方法において、被験物質は、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬の有効成分となりうるいずれかの物質をいう。前記被験物質は、鉱物、化学合成物質を含む無生物由来の物質と、遺伝子工学又は細胞工学的な手法を含む生物由来の物質とを含む。人体に無害であることが知られているか、香辛料その他の食料と、香料その他の化粧料と、薬草その他の医薬品原料として伝統的に従来から利用されてきた物質を被験物質とすることが好ましい。植物を被験物質とする場合には、葉部、小枝部等の乾燥粉砕物をそのまま使用することもできるが、それらの抽出物を使用するのが好ましい。植物の抽出物は、主に葉部、小枝部等を乾燥又は乾燥することなく、あるいは、真空処理又は常圧から６００ＭＰａまでの加圧処理で粉砕した後、常温又は加温で、溶剤により、又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得ることができる。なお、本発明における植物抽出物とは、各種溶媒抽出液又はその希釈液、濃縮液もしくは乾燥末を意味するものとする。溶媒抽出物は、植物又はその乾燥末を、中性、酸又はアルカリ性の水性溶媒、有機溶媒等を用いて抽出処理することにより得られる場合がある。
【００３４】
本発明のＴＬＲ２発現刺激剤とは、ＴＬＲ２遺伝子の発現を誘導すること、すなわち、ケラチノサイトと接触させるときにケラチノサイトが発現するＴＬＲ２遺伝子の発現量が増加するいずれかの物質をいう。本発明のＴＬＲ２発現刺激剤は、ＴＮＦ−αの他、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を含むがこれらに限られない炎症性サイトカインと、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）と、ＮＢＲＣ１２７３２株を含むがこれに限られない黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と、ＮＢＲＣ１２９９３株を含むがこれに限られない表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とを含むグラム陽性及び／又は陰性細菌と、結核菌その他のマイコバクテリアを含む放線菌と、酵母等の真核細胞とを含む、微生物を含む場合がある。あるいは、前記微生物の成分である、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、リポタンパク質、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、リポアラビノマンナン、ザイモザン等を含む場合がある。本発明のＴＬＲ２発現刺激剤は、ＴＬＲ２タンパク質のリガンドとして認識され、シグナル伝達を活性化することができることを条件として、いかなる物質でもかまわない。
【００３５】
本発明のＴＬＲ２発現増強剤は、ＴＬＲ２発現刺激剤とともにケラチノサイトと接触させるときにケラチノサイトが発現するＴＬＲ２遺伝子の発現量が、ＴＬＲ２発現刺激剤だけをケラチノサイトと接触させるときにケラチノサイトが発現するＴＬＲ２遺伝子の発現量より増加することを条件としていかなる物質でもかまわない。本発明のＴＬＲ２発現増強剤には、糖質コルチコイドを含むが、これらに限られない。糖質コルチコイドには、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）と、コルチゾールと同一の作用機序で生物活性を発揮する合成化合物である、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン等の合成ステロイドを含む。
【００３６】
本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質、ステロイドニキビ改善薬、ニキビ改善薬及びアトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法における、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップ、及び／又は、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等と、前記ＴＬＲ２発現増強剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤等とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップとは、本発明の皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法又は評価方法にも利用することができる。
【００３７】
本明細書において、ＴＬＲ２遺伝子の発現量は、ＴＬＲ２遺伝子ｍＲＮＡの量か、ＴＬＲ２遺伝子産物であるＴＬＲ２タンパク質の量かを検出する場合がある。代替策としては、ＴＬＲ２遺伝子の発現調節制御の関与するプロモーター、エンハンサー等のシス調節領域を、ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ等のレポータ遺伝子と連結した発現レポータコンストラクトを、予め、あるいは、ＴＬＲ２発現刺激剤と同時にケラチノサイトに導入することによって、レポータ遺伝子産物に由来する発光、蛍光、酵素反応産物等を検出する場合もある。
【００３８】
本明細書において、ＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量の測定は、定量的ＰＣＲ法の他、ノザンブロット法、ドットブロット法等の固相ハイブリダイゼーション法を含む、当業者に知られたいずれの方法を用いて実行してもかまわない。
【００３９】
本発明のＴＬＲ２遺伝子の発現量は、実験に用いた試料のケラチノサイトの細胞数や細胞の生理状態の相違を標準化するために、本発明のＴＬＲ２発現刺激剤又はＴＬＲ２発現発現剤によって遺伝子発現が変化しないいずれかの遺伝子の発現量によって除算して標準化した相対値で表すことが望ましい。標準化に好ましい遺伝子は、いわゆるハウスキーピング遺伝子である、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、βアクチン等を含むが、これらに限らず、例えば遺伝子発現アレイチップ等の手段で見つけることができる。
【００４０】
本発明のＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質等のスクリーニング方法又は評価方法において、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを実行することにより、被験物質のＴＬＲ遺伝子発現への効果のうち、ＴＬＲ発現刺激剤の作用を阻害する効果と、ＴＬＲ発現増強剤の作用を阻害する効果を区別することができる。これによって、コルチゾールを含むＴＬＲ発現増強剤によるＴＬＲ２遺伝子の発現増強を阻害する効果を有する物質をスクリーニング又は評価することができる。
【００４１】
本発明のＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質等のスクリーニング方法又は評価方法において、ＴＬＲ２発現刺激剤及び／又はＴＬＲ発現増強剤に接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップは、少なくとも６時間以上、終夜、又は１日実行することが好ましいが、実行する時間は、ケラチノサイトがＴＬＲ発現刺激剤及びＴＬＲ発現増強剤の効果を奏することを条件としていかなる長さであってもかまわない。ケラチノサイトの培養下での増殖維持に用いる培地にＴＬＲ発現増強剤のデキサメタゾンと同一の作用機序で生物活性を発揮するコルチゾールを添加する必要がある。そこで、接触させる前に、一定期間コルチゾールを含まない培地に交換して、コルチゾールの影響を除去することが、ケラチノサイトでのＴＬＲ２発現刺激に対する糖質コルチコイドの発現増強効果を検出することを可能にしたと考えられる。
【００４２】
本発明で用いるケラチノサイトは、正常表皮由来のケラチノサイトであり、皮膚組織から単離してそのまま使用してもよいが、好ましくはその培養系を使用する。ヒトケラチノサイトは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社や倉敷紡績株式会社等から市販されており、これらを培養及び継代して用いることもできる。培地は表皮細胞の培養増殖に適するいかなる培地を用いてもよく、例えば、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｍ−ＥＰＩ−２１５０、倉敷紡績株式会社）のような市販の培地を用いてもかまわない。コルチゾール不含培地又はコルチゾールの濃度が明記される場合を除き、前記ＥｐｉＬｉｆｅ培地は０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含む。
【００４３】
新たに培養表皮ケラチノサイトを得る場合には、以下の手順にしたがう。包皮の真皮と表皮を物理的に分離し、表皮を細断して０．３％のトリプシン存在下で３７℃、３０分間インキュベーションを行い、その後トリプシン阻害剤を添加して反応を停止させる。トリプシン処理後の表皮組織を外科用ピンセットでさらに細かくし、金属製メッシュで濾過し、単離ケラチノサイトを遠心し、回収し、ペレットを０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含むＥｐｉＬｉｆｅ培地に懸濁して培養する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下の実施例により本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含有するＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養維持した表皮ケラチノサイトを、６穴培養プレートにウェルあたり５×１０４ないし２×１０５個播種して、０．５μｇ／ｍL（１．２７μＭ）のコルチゾールを含有するＥｐｉＬｉｆｅ培地中で３日間培養後に新鮮なコルチゾール不含ＥｐｉＬｉｆｅ培地で培地交換を行い、さらに２４時間後に、スクリーニング対象物質と、１μＭのデキサメタゾンと、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αとを添加したコルチゾール不含ＥｐｉＬｉｆｅ培地で培地交換を行って、６時間ＴＮＦ−α刺激処理を施した。培地中のコルチゾールの影響を調べる実験では、６穴培養プレートに表皮ケラチノサイトを播種し、コルチゾール（１．２７μＭ）含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地で３日間培養した後、新鮮なコルチゾール（１．２７μＭ）含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地で培地交換してさらに２４時間培養した表皮ケラチノサイトをＴＮＦ−α刺激処理に供した。
【００４６】
ＴＬＲ２遺伝子の発現量の定量
前記ＴＮＦ−α刺激処理の後、培地をアスピレータで除去し、各ウェルの細胞をそれぞれＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）で破壊し、製造者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。定法に従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを作成し、定量的ＰＣＲ法によってＴＬＲ２遺伝子の発現量を測定した。ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で標準化された。
【００４７】
結果
培地中のコルチゾールの影響
培地中のコルチゾールがＴＮＦ−α刺激処理に及ぼす効果を調べた実験の結果のグラフを図１に示す。本実験では各条件ごとに３回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。ＴＮＦ−α刺激処理の直前までコルチゾール含有培地で培養したケラチノサイトよりも、ＴＮＦ−α刺激処理の前日からコルチゾール不含培地で培養したケラチノサイトのほうが、デキサメタゾン及びＴＮＦ−αの両方を添加した条件でのＴＬＲ２遺伝子の発現誘導は顕著であった。グラフ中で＊＊で表す２つのデータの有意水準のｐ値は１％未満であった。そこで以下の実験では、ＴＮＦ−α刺激処理の前日からコルチゾール不含培地中で培養したケラチノサイトを用いた。
【実施例２】
【００４８】
ＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子発現誘導の最適化
実施例１のコルチゾール不含培地で１日前培養したケラチノサイトのＴＮＦ−α刺激処理をする際に添加するデキサメタゾンの濃度と、ＴＬＲ２遺伝子発現の測定までのインキュベーション時間とを最適化するために、１００ｎＭ又は１０００ｎＭのデキサメタゾンを１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αでケラチノサイトを刺激する際に添加して、飽和水蒸気、５％ＣＯ２下３７°Ｃでインキュベーションを行った。１時間又は６時間のインキュベーションの後、ケラチノサイトのＲＮＡを抽出して、ＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量的ＰＣＲ法で測定した。
【００４９】
結果
ＴＮＦ−α刺激処理をする際に添加するデキサメタゾンの濃度と、ＴＬＲ２遺伝子発現の測定までのインキュベーション時間とを最適化するために行った実験の結果のグラフを図２に示す。本実験では各条件ごとに４回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。グラフにおいて、＊で表す２つのデータの有意水準のｐ値は５％未満であり、＊＊で表す２つのデータの有意水準のｐ値は１％未満であった。１時間のインキュベーションでは、ＴＮＦ−α刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導はほとんど認められなかった。しかし、６時間のインキュベーションでは、ＴＮＦ−α刺激によってＴＬＲ２遺伝子の発現の顕著な誘導が認められた。そして、デキサメタゾンの添加によりＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導が増強された。
【実施例３】
【００５０】
細菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導
アクネ菌はヒトのニキビ部位から採取した菌を用いた。黄色ブドウ球菌（ＮＢＲＣ１２７３２株）及び表皮ブドウ球菌（ＮＢＲＣ１２９９３株）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手した菌を用いた。それぞれの菌について一般的な培養法で増殖させ、生菌をＥｐｉＬｉｆｅ培地に懸濁して前記ケラチノサイト培養系に添加した。菌数は、少量のアクネ菌（図３のＰ．ａｃｎｅｓＩ）が約３ ｘ １０８ ｃｆｕ、大量のアクネ菌（図３のＰ．ａｃｎｅｓＩＩ）が約７ ｘ １０８ ｃｆｕ、黄色ブドウ球菌（図４のＳ．ａｕｒｅｕｓ）が約５ ｘ １０８ ｃｆｕ、表皮ブドウ球菌（図４のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が約７ ｘ １０８ ｃｆｕであった。６時間のインキュベーションの後、ＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量ＰＣＲ法で測定した。
【００５１】
結果
異なる菌数のアクネ菌生菌菌体によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフを図３に示す。本実験では各条件ごとに２回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。約３ ｘ １０８ ｃｆｕ及び約７ ｘ １０８ ｃｆｕの菌数のアクネ菌（それぞれ図３のＰ．ａｃｎｅｓＩ及びＰ．ａｃｎｅｓＩＩ）によってもＴＮＦ−α刺激処理と同様のＴＬＲ２遺伝子の発現誘導がみられ、デキサメタゾン添加によってＴＬＲ２遺伝子の発現誘導は増強された。
【００５２】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフを図４に示す。本実験では各条件ごとに４回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。約５ ｘ １０８ ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（図４のＳ．ａｕｒｅｕｓ）及び約７ ｘ １０８ ｃｆｕ表皮ブドウ球菌（図４のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）によってもＴＮＦ−α刺激処理と同様のＴＬＲ２遺伝子の発現誘導がみられ、デキサメタゾン添加によってＴＬＲ２遺伝子の発現誘導は増強された。
【実施例４】
【００５３】
ＴＬＲ２遺伝子の発現抑制活性を有する物質の探索
本発明のスクリーニング方法を利用して、さまざまな植物抽出物のＴＬＲ２遺伝子の発現抑制活性を検討した。コルチゾール不含培地で前培養されたケラチノサイト培養系にデキサメタゾン（１μＭ）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに、サクラ抽出物（１０又は５０μｇ/ｍＬ）、ニーム抽出物（１５又は７５μｇ/ｍＬ）、ウーロン茶抽出物（２又は２０μｇ/ｍＬ）又はバラ抽出物（２又は２０μｇ/ｍＬ）をそれぞれ添加し、６時間のインキュベーション後のＴＬＲ２遺伝子の発現量を測定した。
【００５４】
結果
図５に４種類の植物抽出物のＴＬＲ２遺伝子発現抑制効果を検討する実験の結果の表を示す。図５ではデキサメタゾンによって増強されたＴＮＦ−α刺激によるＴＬＲ２遺伝子の発現量を陽性対照として、これに対する各植物抽出物添加培地でのＴＬＲ２遺伝子の発現量の百分率で表した。本実験ではサクラとニームとについては４回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定され、ウーロン茶とバラとについては３回重複してＴＬＲ２遺伝子の発現量が測定された。いずれの植物抽出物でもＴＬＲ２遺伝子の発現が濃度依存的に抑制されたが、特に５０μｇ／ｍＬのサクラ抽出物はＴＬＲ２遺伝子の発現量のデキサメタゾンによる増強を顕著に抑制することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】培地中のコルチゾールがＴＮＦ−α刺激処理に及ぼす効果を調べた実験の結果のグラフ。
【図２】ケラチノサイトのＴＮＦ−α刺激処理をする際に添加するデキサメタゾンの濃度と、ＴＬＲ２遺伝子発現の測定までのインキュベーション時間とを最適化するために行った実験の結果のグラフ。
【図３】アクネ菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフ。
【図４】黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌によるＴＬＲ２遺伝子発現の誘導をＴＮＦ−α刺激処理によるＴＬＲ２遺伝子の発現誘導と比較した実験の結果のグラフ。
【図５】４種類の植物抽出物のＴＬＲ２遺伝子発現抑制効果を検討した実験の結果の表。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地であることを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトであることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ発現刺激剤は炎症性サイトカインであることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ発現刺激剤はＴＮＦ−αであることを特徴とする、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、デキサメタゾンとをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、ステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被験物質と、アクネ菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、ニキビ改善薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被験物質と、黄色ブドウ球菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、アトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法。
【請求項１】
被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、皮膚におけるＴＬＲ２遺伝子の発現阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤と、前記ＴＬＲ２発現増強剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量を、前記被験物質と、前記ＴＬＲ２発現刺激剤とを接触させたケラチノサイトにおけるＴＬＲ２遺伝子の発現量と比較するステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記接触させるステップの前に、前記ＴＬＲ発現増強剤と、該増強剤と同一の作用機序の物質とを含まない培地でケラチノサイトを前培養するステップを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ＴＬＲ発現増強剤はデキサメタゾンであり、前記培地はコルチゾールを含まない培地であることを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ケラチノサイトはヒト皮膚由来のケラチノサイトであることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ発現刺激剤は炎症性サイトカインであることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ発現刺激剤はＴＮＦ−αであることを特徴とする、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ２遺伝子の発現量はＴＬＲ２遺伝子のｍＲＮＡ量であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
被験物質と、ＴＬＲ２発現刺激剤と、デキサメタゾンとをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、ステロイドニキビ改善薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被験物質と、アクネ菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、ニキビ改善薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被験物質と、黄色ブドウ球菌抽出物と、ＴＬＲ２発現増強剤とをケラチノサイトに接触させるステップと、前記ケラチノサイトでのＴＬＲ２遺伝子の発現量を定量するステップとを含むことを特徴とする、アトピー性皮膚炎改善薬のスクリーニング方法。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−９９０１５（Ｐ２０１０−９９０１５Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７３８２８（Ｐ２００８−２７３８２８）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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