ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）の予防及び治療剤
【課題】ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）の増殖を特異的に抑制する二本鎖RNA
（dsRNA）分子およびそれを用いたFIPVの増殖を阻害するための組成物の提供。
【解決手段】FIPVのマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを標的とするdsRNA分子であ
って、該dsRNA分子の一方の鎖はFIPVのＭ遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を
有するセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、上記dsRNA分子およびそれを用いたFIPVの増殖を阻害するための組
成物。
（dsRNA）分子およびそれを用いたFIPVの増殖を阻害するための組成物の提供。
【解決手段】FIPVのマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを標的とするdsRNA分子であ
って、該dsRNA分子の一方の鎖はFIPVのＭ遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を
有するセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、上記dsRNA分子およびそれを用いたFIPVの増殖を阻害するための組
成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）のマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子に関するものである。また本発明は、当該dsRNA分子を含む、FIPVの複製を阻害するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコ伝染性腹膜炎（Feline Infectious Peritonitis：FIP）は、コロナウイルスがネコ体内で突然変異したネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）によって起こる病気で、発症すると非治療時の致死率はほぼ100％と非常に高い恐ろしい疾患である。
【０００３】
FIPの特徴的な症状には、「ウエットタイプ」と「ドライタイプ」という二つの型があ
る。症例の多い「ウエットタイプ」は、発熱や下痢、貧血などとともに腹部や胸部にひどい血管炎を起こし、腹水や胸水がたまって腹部が膨れたり、呼吸困難がみられる。「ドライタイプ」は、腹部にリンパ腫のような、大きなしこりができる。さらにこのタイプは脳内に炎症を起こして、麻痺や痙攣などの神経症状を引き起こすこともある。
【０００４】
現在のところ、FIPの根治療法は存在せず、いったんFIPが発症すると、インターフェロンやステロイド剤を投与して症状を緩和する対症療法しか方法はなく、ほとんどの場合助からない。また、有効なワクチンも存在しないため、十分な治療効果を得ることは難しい(非特許文献１)。
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Virological Methods, 124 (2005), p.111-116.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来法では、FIPを十分に予防および／または治療することができなかったため、FIPを有効に治療することができる新たな方法が望まれていた。そこで、本発明では、FIPVの増殖を阻害する、FIPVのＭ遺伝子のmRNAを標的とするdsRNA分子を提供する。また、当該dsRNA分子を含む、FIPVの複製を阻害するための組成物も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
FIPVは、図１に示す構造を有するポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｍ遺伝子はＭタンパク質をコードする。Ｍタンパク質は、Eタンパク質と共にウイルスエン
ベロープの形成に必須のタンパク質である。また、Ｍタンパク質は、Ｎタンパク質に結合して、ウイルスヌクレオカプシッドをウイルス粒子に取り込ませる機能を有する（J. Virology, 75: 1312-1324, 2001, J. Virology, 75: 9059-9067, 2001, J. Virology, 76: 4987-4999, 2002）。
【０００８】
そこで、本願発明者らは、Ｍタンパク質の発現を抑制することによって、感染細胞からのウイルス放出を抑制し、病原性を抑制することができるものと考えた。そして、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、FIPVのＭ遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が、Ｍ遺伝子の発現を特異的に抑制することを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）のマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを
標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列中の少なくとも１９個以上の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、dsRNA分子。
【００１０】
［２］ dsRNA分子が、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列の６９５〜７１７
番目の塩基を有する配列、５２７〜５４９番目の塩基を有する配列、および４００〜４２２番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、［１］のdsRNA分子。
【００１１】
［３］ dsRNA分子が、配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセ
ンス鎖、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、［２］のdsRNA分子。
［４］ センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、［１］〜［３］のいずれかのdsRNA分子。
【００１２】
［５］ ［４］のdsRNA分子の鋳型DNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
［６］ FIPVの複製を阻害するための、［１］〜［４］のいずれかのdsRNA分子を１つま
たは複数含む組成物。
［７］ FIPVの複製を阻害するための、［５］のベクターを含む組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるdsRNA分子を用いて、FIPVのＭ遺伝子の発現を特異的に抑制することがで
き、それによってFIPVの複製を阻害することができる。本発明のdsRNAは、ネコFIPの予防または治療剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
一実施形態において、本発明はFIPVのＭ遺伝子のmRNAを標的とするdsRNA分子であって
、該dsRNA分子の一方の鎖はFIPVのＭ遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有す
るセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、上記dsRNA分子に関する。
【００１５】
本発明のdsRNA分子は、配列特異的にFIPVのＭ遺伝子のmRNAを切断し、その結果Ｍ遺伝
子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こすことができる。
【００１６】
本発明のdsRNA分子は、30塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に2塩基のオーバーハ
ングを有する21〜27塩基のsiRNA（small interfering RNA）分子を生じ得る。このsiRNA
分子が、RISC(RNA-induced silencing complex)と呼ばれるタンパク質複合体に取り込ま
れ、Ｍ遺伝子 mRNAをsiRNA分子との相同性により認識し分解し、発現抑制を行う。
【００１７】
本発明においてdsRNA分子は、siRNA分子を含む。
本発明のdsRNA分子の塩基数は、特に限定されないが、15〜50塩基、好ましくは19塩基
以上、さらに好ましくは19〜35塩基、特に好ましくは21塩基である。
【００１８】
本発明において、Ｍ遺伝子の遺伝子配列に同一なセンス鎖とは、配列番号１で表されるＭ遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列を有するRNA鎖を意味する。本
発明のdsRNA分子を構成するセンス鎖は、Ｍ遺伝子の遺伝子配列と同一であることが望ま
しいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、dsRNA分子のセ
ンス鎖と実際に標的となるＭ遺伝子のmRNA配列がハイブリダイズする限り１または複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよい。したがって、本発明のdsRNA分子のセンス鎖配列と
Ｍ遺伝子の遺伝子配列は、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは95、96、97、98もしくは99％以上の配列相同性を有する。
【００１９】
本発明において、好ましくはセンス鎖が、配列番号１で表されるＭ遺伝子配列の６９５−７１７番目の塩基を有する配列、５２７−５４９番目の塩基を有する配列および４００−４２２番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一であることが好ましく、特に６９５−７１７番目の塩基を有する配列および４００−４２２番目の塩基を有する配列と同一であることが好ましい。
【００２０】
dsRNA分子を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、公知の方法に基づいて、化学
合成や、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いた転写系によってin vitroで合成す
ることができる。また、適当な発現ベクターに当該アンチセンス鎖およびセンス鎖の鋳型DNAを導入し、当該ベクターを適当な宿主細胞内に投与することによってin vivoで合成することも可能である。合成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれdsRNA用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等モル数）を混合
し、二本鎖が解離するまで温度を加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることによって行う。アニーリング条件は、例えば、９０℃にて１分間、続いて37℃にて１時間静置することによって行う。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行うことによって、dsRNA分子を得ることができる。
【００２１】
一実施形態において、本願発明のdsRNA分子は、配列番号２で表されるセンス鎖と配列
番号３で表されるアンチセンス鎖、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなり、特に配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセンス鎖および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が好ましい。
【００２２】
また、本発明のdsRNA分子は、上に定義されたセンス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分
子を介して連結され、そのリンカー部でループ構造を形成し折りたたまれたshRNA(short hairpin RNA）分子として提供され得る。shRNA分子もまた、ダイサーによってプロセッシングされ、siRNA分子を生じ得る。
【００２３】
shRNA分子に含まれるリンカー分子は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムルー
プ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知であるポリヌクレオチドリンカーが好ましい。
【００２４】
shRNA分子も、上記したように公知の方法に基づいて、in vitroまたはin vivoにて合成することが可能である。合成に際しては、センス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む1本のRNA鎖を合成し、その後この1本のRNA鎖を自己相補的結合によって二本鎖構造を形成させshRNA分子を得ることができる。
【００２５】
dsRNA分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、3'末端にオーバ
ーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げら
れ、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、dsRNA分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングはDNAを構成する塩基であって
もよい。さらに、dsRNA分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は、遺伝子の配列
決定など種々の実験操作を円滑に行うために、siRNA活性に対して影響を与えない範囲で
必要に応じて１〜３塩基、さらに好ましくは１もしくは２塩基の置換、付加、欠失をさらに含んでも良い。
【００２６】
また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、5'末端がリン酸化されていてもよく、shRNA分子については5'末端に三リン酸（ppp）が結合していても良い。
また、一実施形態において、本発明は、上記shRNA分子を発現するベクターに関する。
【００２７】
本願発明に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを用いることができる。プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター等を用いることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を用いることができる。非ウイルスベクターとしては、リポソームベクター等を用いることができ、特にセンダイウイルス−リポソームベクターが好ましい。
【００２８】
ベクターには、プロモーターおよび／またはその他の制御配列を機能し得るかたちで連結して挿入しても良い。「機能し得るかたちで連結して挿入する」とは、当該ベクターが導入された細胞において、プロモーターおよび／またはその他の制御配列の制御の下、上記shRNA分子が発現され標的となるＭ遺伝子のmRNAが分解されるように、プロモーターお
よび／またはその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。ベクターに組み込むことができるプロモーターおよび／またはその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、その他の調節エレメントなど、当該分野で公知のプロモーターおよび／またはその他の制御配列を適宜選択することが可能である。
【００２９】
このように作製された上記shRNA分子を発現するベクターは、導入された細胞内でshRNA分子を発現し、Ｍ遺伝子のmRNAを特異的に分解する。
【００３０】
また、一実施形態において、本発明は、FIPVの複製を阻害するための、本発明のdsRNA
分子を含む組成物および本発明のベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、本発明のdsRNA分子またはベクターを１種または複数種を組み合わせて含んでも良い。例え
ば、配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセンス鎖、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、または配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなるdsRNA分子の１種、２種、ま
たは３種を含んでも良い。本発明の組成物はまた、本発明のdsRNA分子またはベクターと
共に、適当なキャリア、希釈剤、エマルジョンなどを含んでも良い。例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水などを組成物中に含めることができる。本発明の組成物が、医薬的組成物として用いられる場合には、組成物は、経口ルート、ならびに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することに適した形態で調製することが可能である。
【００３１】
本発明は、上記dsRNA分子または発現ベクターを有効成分として含むFIPの予防または治療剤を提供し得る。該予防または治療剤は正常ネコ、FIPVに感染しているネコまたはFIP
を発症しているネコに投与することにより、FIPVの感染を予防し、感染したFIPVの増殖を抑制しFIPVの発症を予防し、またはFIPV感染症を治療することができる。該予防または治療剤の投与量は限定されないが、例えば、腸上皮細胞やマクロファージなどの場合、一細
胞あたり少なくとも１コピーのdsRNA分子が導入されるように投与することができ、例え
ば１投与単位あたり、dsRNA分子量で1nM〜100μM、好ましくは10nM〜50μM、より好まし
くは100nM〜20μMである。投与量は、患者ネコの状態、年齢、性別、重篤度などに応じて変化させることができ、専門獣医の判断により決定される。さらに、本発明は上記dsRNA
分子または発現ベクターをネコに投与してネコFIPVを予防または治療する方法を提供し得る。
【００３２】
本発明の組成物は、その成分として含まれるdsRNA分子またはベクターの働きにより、FIPVのＭ遺伝子の発現を抑制し、その結果FIPVの複製を阻害し得る。
【００３３】
また、本発明は、上記組成物を用いた、FIPVの複製阻害方法を提供し得る。本方法において、上記組成物をFIPVに感染した細胞、組織または個体に投与し、組成物中に含まれる本発明のdsRNA分子および発現ベクターを送達する。送達されたdsRNA分子および発現ベクターは、FIPVのＭ遺伝子の発現を抑制し、その結果FIPVの複製を阻害し得る。
【００３４】
dsRNA分子および発現ベクターは、当業者に公知である核酸導入法、例えば、これらに
限定さないがHydrodynamic法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃を用いた方法などを用いて細胞や組織に導入することが可能である。被験体が動物個体である場合には、dsRNA分子および発現ベクターは
、適当なキャリア、希釈剤、エマルジョンなどと共に含む組成物の形態で、経口ルート、ならびに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することが可能である。
【００３５】
本発明のdsRNA分子の効果は、dsRNA分子を導入された細胞や組織、および個体におけるＭ遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量が、当該dsRNA分子を導入していない（または
導入前の）細胞や組織、および個体におけるＭ遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量と比較して低下していることを指標にして評価することが可能である。ここで測定されるＭ遺伝子は、予めおよび／または同時に導入されたＭ遺伝子を発現する発現ベクターより発現されたものであっても、FIPV感染により検出されるものであってもよい。発現量が低下しているとは、対照と比較して9割以上発現量が減少している場合のみならず、5割以上あるいは1割以上発現量が減少している場合も含まれる。測定対象がmRNAである場合には、
ノザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridizationなどによって測定する
ことができる。また、測定対象がタンパク質である場合には、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定などによって測定することができる。検出されるＭ遺伝子が、予めおよび／または同時に導入したベクターに由来するものである場合には、当該ベクターにＭ遺伝子と共に検出可能な標識（例えば、EGFPなど）遺伝子を組み込み、Ｍ遺伝子と該標識からなる発現された融合タンパク質を適当な手段で検出して、比較することができる。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
実施例１．Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターの作製
FIPVは、腸コロナウイルスの変異株でありその多くは公知である。このうち、FIP 79-1146系統は感染性が強く、日本国内でいちばん発症しているFIPの原因ウイルスと同じ血清型であると考えられている。そこで本実施例では、感染性が強く、日本国内で多発するFIPの原因ウイルスと同血清型のFIP79-1146株の遺伝子を用いて、実験を行った。FIP79-1146株のＭ遺伝子（配列番号１：AY994055）の配列を基に、FLAG tag 配列および制限酵素（NheIおよびBamHI）認識配列を含む以下のプライマーを作製し：
[Nhe-FLAG FW] 5'-CCCGCTAGCATGGTGGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAGTACATTTTGCTAATAC
-3' (配列番号１０)
[FIP79-1146M-Bam RV] 5'-GCGGGATCCCACCATATGTAATAATTTTT-3' （配列番号１１）
これらプライマーと鋳型DNAとしてpBRDI-1(Peter J. M. Rottier博士（Utrecht University, Netherlands）より分与された(J. Virol. 77 (8), 4528-4538 (2003))）を用いてPCRを行い、Ｍ遺伝子をクローニングした。クローニングしたＭ遺伝子を、NheIおよびBamHIで制限酵素処理し、断片を精製した後、pACGFP1-N1（タカラバイオ株式会社製）のNheI- BamHI 部位にクローニングした。当該ベクターより発現されたＭ遺伝子タンパク質は、EGFPとの融合体であるため、蛍光顕微鏡下で可視化できる。
【００３８】
実施例２．siRNAの選択および合成
FIP79-1146株のＭ遺伝子配列（配列番号１：AY994055）
を基に、Ｍ遺伝子を特異的標的とする以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる４種類のsiRNAをコンピュータープログラムにより選定し（RNAi社に委託）、それぞれ合成し
た（PROLIGO社に委託）。
siRNA1：標的遺伝子領域695〜717塩基
センス鎖 ：GCUUACUACGUAAAAUCUAAA （配列番号２）
アンチセンス鎖：UAGAUUUUACGUAGUAAGCCC （配列番号３）
siRNA2：標的遺伝子領域527〜549塩基
センス鎖 ：GUUACCCUUACUCUACUUUCA （配列番号４）
アンチセンス鎖：AAAGUAGAGUAAGGGUAACAC （配列番号５）
siRNA3：標的遺伝子領域253〜275塩基
センス鎖 ：GCUGAUCAUGUGGCUAUUAUG （配列番号６）
アンチセンス鎖：UAAUAGCCACAUGAUCAGCAU （配列番号７）
siRNA4：標的遺伝子領域400〜422塩基
センス鎖 ：GAGAUCUGUUCAGCUAUAUAG （配列番号８）
アンチセンス鎖：AUAUAGCUGAACAGAUCUCAC （配列番号９）
ネガティブコントロール(非対象siRNA)：対応部位なし
センス鎖 ：CACACAGGUUGAGAUGAUUGA （配列番号１２）
アンチセンス鎖：AAUCAUCUCAACCUGUGUGUC （配列番号１３）
【００３９】
実施例３．siRNA分子によるＭ遺伝子発現抑制効果の解析
上記４種類の各siRNA分子をＭ遺伝子−EGFP発現ベクターとともに、培養細胞にトラン
スフェクションし、各siRNA分子によるＭ遺伝子発現抑制効果を以下の解析系を用いて調
べた。
【００４０】
（I）共焦点レーザー顕微鏡およびFACSによるＭ遺伝子タンパク質の発現量低下の確認
（i）Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターおよび各siRNA分子の導入
AD293細胞株を、10％ウシ胎児血清（FCS）含有Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(D-MEM)中で37℃，5％ CO2環境下にて培養及び維持した。当該細胞株を、6ウェルプレートに4×105／wellの密度で播き、20時間後細胞が80〜90％コンフルエントの状態になったところで、培地を1 mlの5% FCS 含有D-MEMに置換し、上記Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターと各種siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションは以下の通りに行った：Ｍ遺
伝子−EGFP発現ベクターを1.0μgと各種siRNA 1.0μl (終濃度50 nM)およびDsRed発現ベ
クター（pDsRed2-N1ベクター，Clontech）0.5μｇを0pti-MEM 50μlに混合し、一方、Lipofectamine 2000（Invitrogen） 4μlと50μlのOpti-MEM 培地を混合して、それぞれ5分間室温で静置した後に両者を混合し、20分間室温でインキュベートした。この混合液を各ウェルに添加し、37℃にて培養した。
【００４１】
トランスフェクションから48時間後に、各ウェルの細胞を回収した。培養上清を除いた後、EDTAトリプシンにて細胞を剥離した。その後PBS(−)で洗浄し，10％ホルマリン含有PBS(−)にて固定した。遠心して上清を除いた後、1mlの0.1％ BSA-PBS (-)を加えて遮光保存した。
【００４２】
回収した細胞のFIP79-1146株M遺伝子発現量をEGFPの蛍光強度として解析した。DsRedは、トランスフェクション効率を各siRNA導入細胞で比較するために用いた。
【００４３】
(ii)解析結果
ａ．共焦点レーザー顕微鏡によるＭ遺伝子タンパク質の発現量低下の確認
Ｍ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を、EGFPの蛍光強度を共焦点レーザー顕微鏡によって解析することによって調べた結果を図２に示す。siRNA分子を導入していない系の
蛍光強度に比べて、各種siRNA分子を導入した系では蛍光強度が低下していることが観察
された。特に、siRNA1分子またはsiRNA4分子を導入した系では顕著に蛍光強度が低下した。
【００４４】
ｂ．FACSによるＭ遺伝子タンパク質の発現量低下の確認
Ｍ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を、EGFPの蛍光強度をFACSよって定量解析した結果を、図３に示す。この定量解析から、siRNA分子を導入していない系と比較して、各
種siRNA分子を導入した系では検出されるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質量が減少してい
ることが示された。特にsiRNA1およびsiRNA4を導入した系では、siRNA分子を導入してい
ない系と比べてＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量が約70％抑制されることが示された。
【００４５】
（II）リアルタイムPCR法によるＭ遺伝子−EGFP mRNAの発現量低下の確認
AD293細胞を4×105／wellの密度で12ウェルプレートに播き、16時間後に、各ウェルあ
たり、1.0μｇのＭ遺伝子−EGFP発現ベクターおよび1.0μl(終濃度50 nM)の各種siRNAを
上記(I)(i)と同様の方法で細胞にトランスフェクションした。
【００４６】
（i）細胞の回収とRNA 抽出
遺伝子導入から20時間後に共焦点レーザー顕微鏡 (Leica)にて79-1146株Ｍ遺伝子の発
現を確認し、その後、細胞の回収を行った。培養上清を捨てて、各ウェルにISOGEN (ニッポンジーン)を1ml加え、シリンジと18 G 針を用いてウェル内の細胞を良く溶かした。そ
の後1.5 mlチューブにサンプルを回収し、再度細胞を良く溶かし室温にて5分間静置した
。チューブにクロロホルム（Wako)を200μl加え攪拌し室温にて2分間静置した後、14000rpm、4℃、15分間遠心分離をし、水層を別の1.5mlチューブに移した。これにイソプロパノール(Wako)を500μl加え、静かに転倒混和をした後室温にて5〜10分間静置した。14000rpm、4℃、10分間遠心分離をして上清を除去した。残ったペレットを70%エタノール1000μlにて2回洗い、最後に4℃、5分間、14000rpmにて遠心分離後、上清を除去しペレットを自然乾燥した。このペレットに、DEPC処理水を16μl、DNaseI Enzyme (Wako)を1μl、10×DNase buffer(Wako)を2μl、RNase out (Wako)を1μl加えてペレットを溶かし37℃にて15分間静置した後、STOP solution (Wako)を1μl加えて氷上に置いた。これにDEPC処理水を80 μl、フェノール(Wako)を50μl加えた後、1分間攪拌し、12000rpm、23℃、1分間遠心分離を行い、別の1.5 mlチューブに水層を回収した。その後エタノール沈殿により得られたペレットにDEPC処理水を20 μl加えた後、RNA濃度測定を行った。
【００４７】
(ii) cDNA 合成
PrimeScriptTM ｃDNA合成キット（Takara Bio）を用いてcDNA合成を行った。まず1μg
分のRNAを含むようにDEPC処理水にてRNAを希釈した。希釈した液を65℃にて3分反応させ
、その後すぐに氷上にて2分間急冷した。その後、2×RT Reaction Mixを2 μl、RT Enzyme Mix を0.5μl、Oligo (dT) primer を0.5μｌ、Random primer を0.5μl を加えて混和後、25℃にて10 分、50℃にて30 分、85℃にて5 秒間反応させた後、速やかに氷上に静置した。
【００４８】
（iii）反応と解析
合成したcDNAと、2×Premix EXTaq (Takara Bio)、Forwardプライマー(10 pmol/μl)、Reverseプライマー(10 pmol/μl)、プローブ (5 pmol/μl)、Rox dye II（原液）、RNase
free water を以下の容量で混合した。
【００４９】
使用したプライマーとプローブの配列は以下の通りである。
順方向プライマー：AATGCTGATCATGTGGCTATTATGG（配列番号１４）
逆方向プライマー：AAATACATCATCCAAAGTGCAAACG（配列番号１５）
プローブ：GTGCACCTGCAACACTAAAGCCGAACA（配列番号１６）
【００５０】
【００５１】
調製済みのサンプルを96穴プレートに入れた後にReal Time PCR 7500 Systemを用いて
反応させた。反応条件として、初期変性として95℃にて10秒ののち、95℃にて5秒、60℃
にて34秒を40サイクル行った。
解析は、Real Time PCR SystemのSDS システムソフトウェアを用いて行った。
【００５２】
（iv）解析結果
Ｍ遺伝子−EGFP mRNAの発現量を、リアルタイムPCR法によって定量解析した結果を、図４に示す。この定量解析から、siRNA分子を導入していない系と比較して、各種siRNA分子を導入した系では検出されるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質量が減少していることが示された。特にsiRNA1、siRNA2およびsiRNA4を導入した系では、siRNA分子を導入していない
系と比べてＭ遺伝子−EGFP mRNAの発現量が有意に抑制されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のFIPVのＭ遺伝子 mRNAを標的とするdsRNA分子は、Ｍ遺伝子のタンパク質の発現量を有効に抑制することが可能であり、それによってFIPVの複製を阻害し得る。また、本発明のdsRNA分子を用いてFIPVの複製を阻害することによって、ネコ伝染性腹膜炎を有効
に予防および／または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】FIPVの一本鎖ＲＮＡを示す模式図である。
【図２】共焦点レーザー顕微鏡によるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の解析結果を示す図である。図中a-gは、それぞれ以下の発現系を示すa:MOCK、b: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRedのみ、c: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA1、d: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA2、e: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA3、f: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA4、g: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋非対象siRNA。それぞれ左の写真はEGFP、右の写真はDsRedの蛍光像を示す。
【図３】FACS法によるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現解析結果を示す図である。Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターを単独で導入した際のＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を100％として、各系におけるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を相対的に示す。横軸は左より、それぞれ以下の発現系を示す：MOCK；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRedのみ；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA1；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA2；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA3；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA4；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋非対象siRNA。
【図４】リアルタイムPCR法によるＭ遺伝子−EGFP mRNAの発現解析結果を示す図である。Real Time PCR System のSDSシステムソフトウェアにて解析を行い、Ｍ遺伝子−EGFP mRNA量を縦軸に示す。横軸は左より、それぞれ以下の発現系を示す：MOCK； Ｍ遺伝子−EGFPのみ； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA1； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA2； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA3； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA4； Ｍ遺伝子−EGFP＋非対象siRNA。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号２〜１６は、合成オリゴヌクレオチド配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）のマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子に関するものである。また本発明は、当該dsRNA分子を含む、FIPVの複製を阻害するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコ伝染性腹膜炎（Feline Infectious Peritonitis：FIP）は、コロナウイルスがネコ体内で突然変異したネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）によって起こる病気で、発症すると非治療時の致死率はほぼ100％と非常に高い恐ろしい疾患である。
【０００３】
FIPの特徴的な症状には、「ウエットタイプ」と「ドライタイプ」という二つの型があ
る。症例の多い「ウエットタイプ」は、発熱や下痢、貧血などとともに腹部や胸部にひどい血管炎を起こし、腹水や胸水がたまって腹部が膨れたり、呼吸困難がみられる。「ドライタイプ」は、腹部にリンパ腫のような、大きなしこりができる。さらにこのタイプは脳内に炎症を起こして、麻痺や痙攣などの神経症状を引き起こすこともある。
【０００４】
現在のところ、FIPの根治療法は存在せず、いったんFIPが発症すると、インターフェロンやステロイド剤を投与して症状を緩和する対症療法しか方法はなく、ほとんどの場合助からない。また、有効なワクチンも存在しないため、十分な治療効果を得ることは難しい(非特許文献１)。
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Virological Methods, 124 (2005), p.111-116.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来法では、FIPを十分に予防および／または治療することができなかったため、FIPを有効に治療することができる新たな方法が望まれていた。そこで、本発明では、FIPVの増殖を阻害する、FIPVのＭ遺伝子のmRNAを標的とするdsRNA分子を提供する。また、当該dsRNA分子を含む、FIPVの複製を阻害するための組成物も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
FIPVは、図１に示す構造を有するポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｍ遺伝子はＭタンパク質をコードする。Ｍタンパク質は、Eタンパク質と共にウイルスエン
ベロープの形成に必須のタンパク質である。また、Ｍタンパク質は、Ｎタンパク質に結合して、ウイルスヌクレオカプシッドをウイルス粒子に取り込ませる機能を有する（J. Virology, 75: 1312-1324, 2001, J. Virology, 75: 9059-9067, 2001, J. Virology, 76: 4987-4999, 2002）。
【０００８】
そこで、本願発明者らは、Ｍタンパク質の発現を抑制することによって、感染細胞からのウイルス放出を抑制し、病原性を抑制することができるものと考えた。そして、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、FIPVのＭ遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が、Ｍ遺伝子の発現を特異的に抑制することを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）のマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを
標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列中の少なくとも１９個以上の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、dsRNA分子。
【００１０】
［２］ dsRNA分子が、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列の６９５〜７１７
番目の塩基を有する配列、５２７〜５４９番目の塩基を有する配列、および４００〜４２２番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、［１］のdsRNA分子。
【００１１】
［３］ dsRNA分子が、配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセ
ンス鎖、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、［２］のdsRNA分子。
［４］ センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、［１］〜［３］のいずれかのdsRNA分子。
【００１２】
［５］ ［４］のdsRNA分子の鋳型DNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
［６］ FIPVの複製を阻害するための、［１］〜［４］のいずれかのdsRNA分子を１つま
たは複数含む組成物。
［７］ FIPVの複製を阻害するための、［５］のベクターを含む組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるdsRNA分子を用いて、FIPVのＭ遺伝子の発現を特異的に抑制することがで
き、それによってFIPVの複製を阻害することができる。本発明のdsRNAは、ネコFIPの予防または治療剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
一実施形態において、本発明はFIPVのＭ遺伝子のmRNAを標的とするdsRNA分子であって
、該dsRNA分子の一方の鎖はFIPVのＭ遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有す
るセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、上記dsRNA分子に関する。
【００１５】
本発明のdsRNA分子は、配列特異的にFIPVのＭ遺伝子のmRNAを切断し、その結果Ｍ遺伝
子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こすことができる。
【００１６】
本発明のdsRNA分子は、30塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に2塩基のオーバーハ
ングを有する21〜27塩基のsiRNA（small interfering RNA）分子を生じ得る。このsiRNA
分子が、RISC(RNA-induced silencing complex)と呼ばれるタンパク質複合体に取り込ま
れ、Ｍ遺伝子 mRNAをsiRNA分子との相同性により認識し分解し、発現抑制を行う。
【００１７】
本発明においてdsRNA分子は、siRNA分子を含む。
本発明のdsRNA分子の塩基数は、特に限定されないが、15〜50塩基、好ましくは19塩基
以上、さらに好ましくは19〜35塩基、特に好ましくは21塩基である。
【００１８】
本発明において、Ｍ遺伝子の遺伝子配列に同一なセンス鎖とは、配列番号１で表されるＭ遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列を有するRNA鎖を意味する。本
発明のdsRNA分子を構成するセンス鎖は、Ｍ遺伝子の遺伝子配列と同一であることが望ま
しいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、dsRNA分子のセ
ンス鎖と実際に標的となるＭ遺伝子のmRNA配列がハイブリダイズする限り１または複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよい。したがって、本発明のdsRNA分子のセンス鎖配列と
Ｍ遺伝子の遺伝子配列は、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは95、96、97、98もしくは99％以上の配列相同性を有する。
【００１９】
本発明において、好ましくはセンス鎖が、配列番号１で表されるＭ遺伝子配列の６９５−７１７番目の塩基を有する配列、５２７−５４９番目の塩基を有する配列および４００−４２２番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一であることが好ましく、特に６９５−７１７番目の塩基を有する配列および４００−４２２番目の塩基を有する配列と同一であることが好ましい。
【００２０】
dsRNA分子を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、公知の方法に基づいて、化学
合成や、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いた転写系によってin vitroで合成す
ることができる。また、適当な発現ベクターに当該アンチセンス鎖およびセンス鎖の鋳型DNAを導入し、当該ベクターを適当な宿主細胞内に投与することによってin vivoで合成することも可能である。合成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれdsRNA用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等モル数）を混合
し、二本鎖が解離するまで温度を加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることによって行う。アニーリング条件は、例えば、９０℃にて１分間、続いて37℃にて１時間静置することによって行う。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行うことによって、dsRNA分子を得ることができる。
【００２１】
一実施形態において、本願発明のdsRNA分子は、配列番号２で表されるセンス鎖と配列
番号３で表されるアンチセンス鎖、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなり、特に配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセンス鎖および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が好ましい。
【００２２】
また、本発明のdsRNA分子は、上に定義されたセンス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分
子を介して連結され、そのリンカー部でループ構造を形成し折りたたまれたshRNA(short hairpin RNA）分子として提供され得る。shRNA分子もまた、ダイサーによってプロセッシングされ、siRNA分子を生じ得る。
【００２３】
shRNA分子に含まれるリンカー分子は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムルー
プ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知であるポリヌクレオチドリンカーが好ましい。
【００２４】
shRNA分子も、上記したように公知の方法に基づいて、in vitroまたはin vivoにて合成することが可能である。合成に際しては、センス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む1本のRNA鎖を合成し、その後この1本のRNA鎖を自己相補的結合によって二本鎖構造を形成させshRNA分子を得ることができる。
【００２５】
dsRNA分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、3'末端にオーバ
ーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げら
れ、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、dsRNA分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングはDNAを構成する塩基であって
もよい。さらに、dsRNA分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は、遺伝子の配列
決定など種々の実験操作を円滑に行うために、siRNA活性に対して影響を与えない範囲で
必要に応じて１〜３塩基、さらに好ましくは１もしくは２塩基の置換、付加、欠失をさらに含んでも良い。
【００２６】
また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、5'末端がリン酸化されていてもよく、shRNA分子については5'末端に三リン酸（ppp）が結合していても良い。
また、一実施形態において、本発明は、上記shRNA分子を発現するベクターに関する。
【００２７】
本願発明に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを用いることができる。プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター等を用いることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を用いることができる。非ウイルスベクターとしては、リポソームベクター等を用いることができ、特にセンダイウイルス−リポソームベクターが好ましい。
【００２８】
ベクターには、プロモーターおよび／またはその他の制御配列を機能し得るかたちで連結して挿入しても良い。「機能し得るかたちで連結して挿入する」とは、当該ベクターが導入された細胞において、プロモーターおよび／またはその他の制御配列の制御の下、上記shRNA分子が発現され標的となるＭ遺伝子のmRNAが分解されるように、プロモーターお
よび／またはその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。ベクターに組み込むことができるプロモーターおよび／またはその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、その他の調節エレメントなど、当該分野で公知のプロモーターおよび／またはその他の制御配列を適宜選択することが可能である。
【００２９】
このように作製された上記shRNA分子を発現するベクターは、導入された細胞内でshRNA分子を発現し、Ｍ遺伝子のmRNAを特異的に分解する。
【００３０】
また、一実施形態において、本発明は、FIPVの複製を阻害するための、本発明のdsRNA
分子を含む組成物および本発明のベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、本発明のdsRNA分子またはベクターを１種または複数種を組み合わせて含んでも良い。例え
ば、配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセンス鎖、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、または配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなるdsRNA分子の１種、２種、ま
たは３種を含んでも良い。本発明の組成物はまた、本発明のdsRNA分子またはベクターと
共に、適当なキャリア、希釈剤、エマルジョンなどを含んでも良い。例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水などを組成物中に含めることができる。本発明の組成物が、医薬的組成物として用いられる場合には、組成物は、経口ルート、ならびに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することに適した形態で調製することが可能である。
【００３１】
本発明は、上記dsRNA分子または発現ベクターを有効成分として含むFIPの予防または治療剤を提供し得る。該予防または治療剤は正常ネコ、FIPVに感染しているネコまたはFIP
を発症しているネコに投与することにより、FIPVの感染を予防し、感染したFIPVの増殖を抑制しFIPVの発症を予防し、またはFIPV感染症を治療することができる。該予防または治療剤の投与量は限定されないが、例えば、腸上皮細胞やマクロファージなどの場合、一細
胞あたり少なくとも１コピーのdsRNA分子が導入されるように投与することができ、例え
ば１投与単位あたり、dsRNA分子量で1nM〜100μM、好ましくは10nM〜50μM、より好まし
くは100nM〜20μMである。投与量は、患者ネコの状態、年齢、性別、重篤度などに応じて変化させることができ、専門獣医の判断により決定される。さらに、本発明は上記dsRNA
分子または発現ベクターをネコに投与してネコFIPVを予防または治療する方法を提供し得る。
【００３２】
本発明の組成物は、その成分として含まれるdsRNA分子またはベクターの働きにより、FIPVのＭ遺伝子の発現を抑制し、その結果FIPVの複製を阻害し得る。
【００３３】
また、本発明は、上記組成物を用いた、FIPVの複製阻害方法を提供し得る。本方法において、上記組成物をFIPVに感染した細胞、組織または個体に投与し、組成物中に含まれる本発明のdsRNA分子および発現ベクターを送達する。送達されたdsRNA分子および発現ベクターは、FIPVのＭ遺伝子の発現を抑制し、その結果FIPVの複製を阻害し得る。
【００３４】
dsRNA分子および発現ベクターは、当業者に公知である核酸導入法、例えば、これらに
限定さないがHydrodynamic法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃を用いた方法などを用いて細胞や組織に導入することが可能である。被験体が動物個体である場合には、dsRNA分子および発現ベクターは
、適当なキャリア、希釈剤、エマルジョンなどと共に含む組成物の形態で、経口ルート、ならびに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することが可能である。
【００３５】
本発明のdsRNA分子の効果は、dsRNA分子を導入された細胞や組織、および個体におけるＭ遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量が、当該dsRNA分子を導入していない（または
導入前の）細胞や組織、および個体におけるＭ遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量と比較して低下していることを指標にして評価することが可能である。ここで測定されるＭ遺伝子は、予めおよび／または同時に導入されたＭ遺伝子を発現する発現ベクターより発現されたものであっても、FIPV感染により検出されるものであってもよい。発現量が低下しているとは、対照と比較して9割以上発現量が減少している場合のみならず、5割以上あるいは1割以上発現量が減少している場合も含まれる。測定対象がmRNAである場合には、
ノザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridizationなどによって測定する
ことができる。また、測定対象がタンパク質である場合には、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定などによって測定することができる。検出されるＭ遺伝子が、予めおよび／または同時に導入したベクターに由来するものである場合には、当該ベクターにＭ遺伝子と共に検出可能な標識（例えば、EGFPなど）遺伝子を組み込み、Ｍ遺伝子と該標識からなる発現された融合タンパク質を適当な手段で検出して、比較することができる。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
実施例１．Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターの作製
FIPVは、腸コロナウイルスの変異株でありその多くは公知である。このうち、FIP 79-1146系統は感染性が強く、日本国内でいちばん発症しているFIPの原因ウイルスと同じ血清型であると考えられている。そこで本実施例では、感染性が強く、日本国内で多発するFIPの原因ウイルスと同血清型のFIP79-1146株の遺伝子を用いて、実験を行った。FIP79-1146株のＭ遺伝子（配列番号１：AY994055）の配列を基に、FLAG tag 配列および制限酵素（NheIおよびBamHI）認識配列を含む以下のプライマーを作製し：
[Nhe-FLAG FW] 5'-CCCGCTAGCATGGTGGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAGTACATTTTGCTAATAC
-3' (配列番号１０)
[FIP79-1146M-Bam RV] 5'-GCGGGATCCCACCATATGTAATAATTTTT-3' （配列番号１１）
これらプライマーと鋳型DNAとしてpBRDI-1(Peter J. M. Rottier博士（Utrecht University, Netherlands）より分与された(J. Virol. 77 (8), 4528-4538 (2003))）を用いてPCRを行い、Ｍ遺伝子をクローニングした。クローニングしたＭ遺伝子を、NheIおよびBamHIで制限酵素処理し、断片を精製した後、pACGFP1-N1（タカラバイオ株式会社製）のNheI- BamHI 部位にクローニングした。当該ベクターより発現されたＭ遺伝子タンパク質は、EGFPとの融合体であるため、蛍光顕微鏡下で可視化できる。
【００３８】
実施例２．siRNAの選択および合成
FIP79-1146株のＭ遺伝子配列（配列番号１：AY994055）
を基に、Ｍ遺伝子を特異的標的とする以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる４種類のsiRNAをコンピュータープログラムにより選定し（RNAi社に委託）、それぞれ合成し
た（PROLIGO社に委託）。
siRNA1：標的遺伝子領域695〜717塩基
センス鎖 ：GCUUACUACGUAAAAUCUAAA （配列番号２）
アンチセンス鎖：UAGAUUUUACGUAGUAAGCCC （配列番号３）
siRNA2：標的遺伝子領域527〜549塩基
センス鎖 ：GUUACCCUUACUCUACUUUCA （配列番号４）
アンチセンス鎖：AAAGUAGAGUAAGGGUAACAC （配列番号５）
siRNA3：標的遺伝子領域253〜275塩基
センス鎖 ：GCUGAUCAUGUGGCUAUUAUG （配列番号６）
アンチセンス鎖：UAAUAGCCACAUGAUCAGCAU （配列番号７）
siRNA4：標的遺伝子領域400〜422塩基
センス鎖 ：GAGAUCUGUUCAGCUAUAUAG （配列番号８）
アンチセンス鎖：AUAUAGCUGAACAGAUCUCAC （配列番号９）
ネガティブコントロール(非対象siRNA)：対応部位なし
センス鎖 ：CACACAGGUUGAGAUGAUUGA （配列番号１２）
アンチセンス鎖：AAUCAUCUCAACCUGUGUGUC （配列番号１３）
【００３９】
実施例３．siRNA分子によるＭ遺伝子発現抑制効果の解析
上記４種類の各siRNA分子をＭ遺伝子−EGFP発現ベクターとともに、培養細胞にトラン
スフェクションし、各siRNA分子によるＭ遺伝子発現抑制効果を以下の解析系を用いて調
べた。
【００４０】
（I）共焦点レーザー顕微鏡およびFACSによるＭ遺伝子タンパク質の発現量低下の確認
（i）Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターおよび各siRNA分子の導入
AD293細胞株を、10％ウシ胎児血清（FCS）含有Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(D-MEM)中で37℃，5％ CO2環境下にて培養及び維持した。当該細胞株を、6ウェルプレートに4×105／wellの密度で播き、20時間後細胞が80〜90％コンフルエントの状態になったところで、培地を1 mlの5% FCS 含有D-MEMに置換し、上記Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターと各種siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションは以下の通りに行った：Ｍ遺
伝子−EGFP発現ベクターを1.0μgと各種siRNA 1.0μl (終濃度50 nM)およびDsRed発現ベ
クター（pDsRed2-N1ベクター，Clontech）0.5μｇを0pti-MEM 50μlに混合し、一方、Lipofectamine 2000（Invitrogen） 4μlと50μlのOpti-MEM 培地を混合して、それぞれ5分間室温で静置した後に両者を混合し、20分間室温でインキュベートした。この混合液を各ウェルに添加し、37℃にて培養した。
【００４１】
トランスフェクションから48時間後に、各ウェルの細胞を回収した。培養上清を除いた後、EDTAトリプシンにて細胞を剥離した。その後PBS(−)で洗浄し，10％ホルマリン含有PBS(−)にて固定した。遠心して上清を除いた後、1mlの0.1％ BSA-PBS (-)を加えて遮光保存した。
【００４２】
回収した細胞のFIP79-1146株M遺伝子発現量をEGFPの蛍光強度として解析した。DsRedは、トランスフェクション効率を各siRNA導入細胞で比較するために用いた。
【００４３】
(ii)解析結果
ａ．共焦点レーザー顕微鏡によるＭ遺伝子タンパク質の発現量低下の確認
Ｍ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を、EGFPの蛍光強度を共焦点レーザー顕微鏡によって解析することによって調べた結果を図２に示す。siRNA分子を導入していない系の
蛍光強度に比べて、各種siRNA分子を導入した系では蛍光強度が低下していることが観察
された。特に、siRNA1分子またはsiRNA4分子を導入した系では顕著に蛍光強度が低下した。
【００４４】
ｂ．FACSによるＭ遺伝子タンパク質の発現量低下の確認
Ｍ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を、EGFPの蛍光強度をFACSよって定量解析した結果を、図３に示す。この定量解析から、siRNA分子を導入していない系と比較して、各
種siRNA分子を導入した系では検出されるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質量が減少してい
ることが示された。特にsiRNA1およびsiRNA4を導入した系では、siRNA分子を導入してい
ない系と比べてＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量が約70％抑制されることが示された。
【００４５】
（II）リアルタイムPCR法によるＭ遺伝子−EGFP mRNAの発現量低下の確認
AD293細胞を4×105／wellの密度で12ウェルプレートに播き、16時間後に、各ウェルあ
たり、1.0μｇのＭ遺伝子−EGFP発現ベクターおよび1.0μl(終濃度50 nM)の各種siRNAを
上記(I)(i)と同様の方法で細胞にトランスフェクションした。
【００４６】
（i）細胞の回収とRNA 抽出
遺伝子導入から20時間後に共焦点レーザー顕微鏡 (Leica)にて79-1146株Ｍ遺伝子の発
現を確認し、その後、細胞の回収を行った。培養上清を捨てて、各ウェルにISOGEN (ニッポンジーン)を1ml加え、シリンジと18 G 針を用いてウェル内の細胞を良く溶かした。そ
の後1.5 mlチューブにサンプルを回収し、再度細胞を良く溶かし室温にて5分間静置した
。チューブにクロロホルム（Wako)を200μl加え攪拌し室温にて2分間静置した後、14000rpm、4℃、15分間遠心分離をし、水層を別の1.5mlチューブに移した。これにイソプロパノール(Wako)を500μl加え、静かに転倒混和をした後室温にて5〜10分間静置した。14000rpm、4℃、10分間遠心分離をして上清を除去した。残ったペレットを70%エタノール1000μlにて2回洗い、最後に4℃、5分間、14000rpmにて遠心分離後、上清を除去しペレットを自然乾燥した。このペレットに、DEPC処理水を16μl、DNaseI Enzyme (Wako)を1μl、10×DNase buffer(Wako)を2μl、RNase out (Wako)を1μl加えてペレットを溶かし37℃にて15分間静置した後、STOP solution (Wako)を1μl加えて氷上に置いた。これにDEPC処理水を80 μl、フェノール(Wako)を50μl加えた後、1分間攪拌し、12000rpm、23℃、1分間遠心分離を行い、別の1.5 mlチューブに水層を回収した。その後エタノール沈殿により得られたペレットにDEPC処理水を20 μl加えた後、RNA濃度測定を行った。
【００４７】
(ii) cDNA 合成
PrimeScriptTM ｃDNA合成キット（Takara Bio）を用いてcDNA合成を行った。まず1μg
分のRNAを含むようにDEPC処理水にてRNAを希釈した。希釈した液を65℃にて3分反応させ
、その後すぐに氷上にて2分間急冷した。その後、2×RT Reaction Mixを2 μl、RT Enzyme Mix を0.5μl、Oligo (dT) primer を0.5μｌ、Random primer を0.5μl を加えて混和後、25℃にて10 分、50℃にて30 分、85℃にて5 秒間反応させた後、速やかに氷上に静置した。
【００４８】
（iii）反応と解析
合成したcDNAと、2×Premix EXTaq (Takara Bio)、Forwardプライマー(10 pmol/μl)、Reverseプライマー(10 pmol/μl)、プローブ (5 pmol/μl)、Rox dye II（原液）、RNase
free water を以下の容量で混合した。
【００４９】
使用したプライマーとプローブの配列は以下の通りである。
順方向プライマー：AATGCTGATCATGTGGCTATTATGG（配列番号１４）
逆方向プライマー：AAATACATCATCCAAAGTGCAAACG（配列番号１５）
プローブ：GTGCACCTGCAACACTAAAGCCGAACA（配列番号１６）
【００５０】
【００５１】
調製済みのサンプルを96穴プレートに入れた後にReal Time PCR 7500 Systemを用いて
反応させた。反応条件として、初期変性として95℃にて10秒ののち、95℃にて5秒、60℃
にて34秒を40サイクル行った。
解析は、Real Time PCR SystemのSDS システムソフトウェアを用いて行った。
【００５２】
（iv）解析結果
Ｍ遺伝子−EGFP mRNAの発現量を、リアルタイムPCR法によって定量解析した結果を、図４に示す。この定量解析から、siRNA分子を導入していない系と比較して、各種siRNA分子を導入した系では検出されるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質量が減少していることが示された。特にsiRNA1、siRNA2およびsiRNA4を導入した系では、siRNA分子を導入していない
系と比べてＭ遺伝子−EGFP mRNAの発現量が有意に抑制されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のFIPVのＭ遺伝子 mRNAを標的とするdsRNA分子は、Ｍ遺伝子のタンパク質の発現量を有効に抑制することが可能であり、それによってFIPVの複製を阻害し得る。また、本発明のdsRNA分子を用いてFIPVの複製を阻害することによって、ネコ伝染性腹膜炎を有効
に予防および／または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】FIPVの一本鎖ＲＮＡを示す模式図である。
【図２】共焦点レーザー顕微鏡によるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の解析結果を示す図である。図中a-gは、それぞれ以下の発現系を示すa:MOCK、b: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRedのみ、c: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA1、d: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA2、e: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA3、f: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA4、g: Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋非対象siRNA。それぞれ左の写真はEGFP、右の写真はDsRedの蛍光像を示す。
【図３】FACS法によるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現解析結果を示す図である。Ｍ遺伝子−EGFP発現ベクターを単独で導入した際のＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を100％として、各系におけるＭ遺伝子−EGFP融合タンパク質の発現量を相対的に示す。横軸は左より、それぞれ以下の発現系を示す：MOCK；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRedのみ；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA1；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA2；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA3；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋siRNA4；Ｍ遺伝子−EGFP＋DsRed＋非対象siRNA。
【図４】リアルタイムPCR法によるＭ遺伝子−EGFP mRNAの発現解析結果を示す図である。Real Time PCR System のSDSシステムソフトウェアにて解析を行い、Ｍ遺伝子−EGFP mRNA量を縦軸に示す。横軸は左より、それぞれ以下の発現系を示す：MOCK； Ｍ遺伝子−EGFPのみ； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA1； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA2； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA3； Ｍ遺伝子−EGFP＋siRNA4； Ｍ遺伝子−EGFP＋非対象siRNA。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号２〜１６は、合成オリゴヌクレオチド配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）のマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列中の少なくとも１９個以上の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、dsRNA分子
。
【請求項２】
dsRNA分子が、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列の６９５〜７１７番目の
塩基を有する配列、５２７〜５４９番目の塩基を有する配列、および４００〜４２２番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、請求項１記載のdsRNA分子。
【請求項３】
dsRNA分子が、配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセンス鎖
、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、請求項２記載のdsRNA分子。
【請求項４】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のdsRNA分子。
【請求項５】
請求項４に記載のdsRNA分子の鋳型DNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
【請求項６】
FIPVの複製を阻害するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載されるdsRNA分子を
１つまたは複数含む組成物。
【請求項７】
FIPVの複製を阻害するための、請求項５に記載されるベクターを含む組成物。
【請求項１】
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）のマトリックス遺伝子（Ｍ遺伝子）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列中の少なくとも１９個以上の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、dsRNA分子
。
【請求項２】
dsRNA分子が、一方の鎖が配列番号１で表されるＭ遺伝子配列の６９５〜７１７番目の
塩基を有する配列、５２７〜５４９番目の塩基を有する配列、および４００〜４２２番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、請求項１記載のdsRNA分子。
【請求項３】
dsRNA分子が、配列番号２で表されるセンス鎖と配列番号３で表されるアンチセンス鎖
、配列番号４で表されるセンス鎖と配列番号５で表されるアンチセンス鎖、および配列番号８で表されるセンス鎖と配列番号９で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、請求項２記載のdsRNA分子。
【請求項４】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のdsRNA分子。
【請求項５】
請求項４に記載のdsRNA分子の鋳型DNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
【請求項６】
FIPVの複製を阻害するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載されるdsRNA分子を
１つまたは複数含む組成物。
【請求項７】
FIPVの複製を阻害するための、請求項５に記載されるベクターを含む組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１６５３５６（Ｐ２００９−１６５３５６Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３８２（Ｐ２００８−１３８２）
【出願日】平成２０年１月８日（２００８．１．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年８月２７日 第１４４回日本獣医学会学術集会発行の「第１４４回日本獣医学会学術集会講演要旨集」に発表
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月８日（２００８．１．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年８月２７日 第１４４回日本獣医学会学術集会発行の「第１４４回日本獣医学会学術集会講演要旨集」に発表
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]