ノロウイルスワクチン製剤
本発明は、ノロウイルス抗原およびアジュバント、詳細には１価ＶＬＰの混合物および多価ＶＬＰの混合物を含む抗原およびワクチン組成物、ならびに１価および多価両方のＶＬＰを生成するための方法に関し、ＶＬＰは１つ以上のノロウイルスの遺伝子型由来のカプシドタンパク質を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全文が本明細書に参照として組み入れられる、２００６年９月２９日出願の米国特許出願第６０／８４７，９１２号、および２００７年９月１８日出願の米国特許出願第６０／９７３，３９２号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ワクチンの分野のもの、詳細にはノロウイルスのワクチンの分野のものである。さらに、本発明は、ワクチン組成物を調製する方法、および免疫原性反応を誘発する方法に関する。
【０００３】
（政府支援の陳述）
本発明は、契約番号ＤＡＭＤ１７−０１−Ｃ−０４００およびＷ８１ＸＷＨ−０５−０１３５の下で、米国陸軍医学研究及び材料司令（United States Army Medical Research and Material Command）からの政府支援を受けてもたらされたものである。政府は、本発明に対してある種の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
ノロウイルスは、非細菌性胃腸炎の集団発生の唯一の最も重要な原因として出現した、培養不可能なヒトカリシウイルスである（Ｇｌａｓｓら、２０００年、Ｈａｒｄｙら、１９９９年）。ノロウイルスの臨床上の重要性は、高感度の分子診断アッセイの開発前は過小評価されていた。プロトタイプの遺伝子型Ｉノーウォークウイルス（ＮＶ）ゲノムのクローニングおよび組換えバキュロウイルス発現系からのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成により、広範なノロウイルス感染を明らかにするアッセイが開発された（Ｊｉａｎｇら、１９９０年、１９９２年）。
【０００５】
ノロウイルスは、非分節型（non-segmented）ＲＮＡゲノムを含む、１本鎖のポシティブセンスＲＮＡウイルスである。ウイルスのゲノムは３つのオープンリーディングフレームをコードしており、その中では後の２つが、各々大きい方のカプシドタンパク質および小さい方の構造タンパク質の生成をそれぞれ特定している（Ｇｌａｓｓら、２０００年）。真核細胞の発現系において高レベルで発現される場合は、ＮＶのカプシドタンパク質およびある種の他のノロウイルスは自己集合して、天然（native）ノロウイルスビリオンを構造的に模倣するＶＬＰになる。透過型電子顕微鏡によって観察した場合、ＶＬＰは、ヒト糞便サンプルから単離された感染性のビリオンと形態学的に区別できない。
【０００６】
ノロウイルスに対する免疫反応は複雑であり、保護作用の関連性は、今や解明されつつある。天然ウイルスで行ったヒト志願者の試験は、粘膜由来の記憶免疫反応により感染から短期の保護作用がもたらされることを実証し、ワクチン媒介性の保護作用が実現可能であることを示唆していた（Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈら、２００３年；Ｐａｒｒｉｎｏら、１９９７年；Ｗｙａｔｔら、１９７４年）。
【０００７】
ノロウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができないが、ＶＬＰの利用可能性およびそれらが大量に生成される能力によって、ノロウイルスのカプシドの抗原のおよび構造上のトポグラフィーを規定する上でかなりの進歩がなされている。ＶＬＰはウイルスのカプシドタンパク質の真正の確証は保持しているが、感染性の遺伝物質は欠いている。その結果、ＶＬＰは、細胞受容体とのウイルスの機能的な相互作用を模倣し、それによって適切な宿主の免疫反応は誘発するが、感染を再現または引き起こす能力は欠いている。ＮＩＨと連携して、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅは、学問的な医師主導の第Ｉ相臨床試験で、ヒト志願者におけるＮＶ ＶＬＰに対する体液、粘膜、および細胞の免疫反応を試験した。経口投与したＶＬＰは安全であり、健常成人において免疫原性であった（Ｂａｌｌら、１９９９年、Ｔａｃｋｅｔら、２００３年）。他の学術的機関では、動物モデルにおける前臨床実験により、細菌外毒素アジュバントとともに鼻腔内投与した場合に、ＶＬＰに対する免疫反応の増強が実証された（Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、２００１年、Ｎｉｃｏｌｌｉｅｒ−Ｊａｍｏｔら、２００４年、Ｐｅｒｉｗａｌら、２００３年）。まとめると、これらのデータは、適切に製剤化されたＶＬＰからなるワクチンは、ノロウイルス感染に対して免疫化するための実行可能な戦略となることを示唆している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ノロウイルス抗原を含む抗原製剤およびワクチン製剤を提供する。一実施形態では、製剤は少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。ノロウイルス抗原は、遺伝子型Ｉまたは遺伝子型ＩＩのウイルス配列またはコンセンサスウイルス配列に由来し得る。ノロウイルス製剤は、抗原のペプチド、タンパク質、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。一実施形態では、ＶＬＰは変性していてよい。別の実施形態では、抗原のペプチドおよびタンパク質は、カプシドモノマー、カプシドマルチマー、タンパク質凝集体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、ノロウイルス抗原は、重量で約０．０１％から約８０％までの濃度で存在する。ノロウイルス抗原の投与量は、投与１回あたり約１μｇから約１００ｍｇまでの量で存在する。
【０００９】
別の実施形態では、ノロウイルスＶＬＰは、少なくとも１つのカプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするノロウイルス核酸配列を用いた発現系で生成した組換えのＶＬＰである。カプシドタンパク質は、ＶＰ１およびＶＰ２またはその組合せからなる群から選択される。発現系は、酵母、細菌、昆虫、哺乳動物の発現系などの組換え細胞発現系でもよく、またはバキュロウイルス感染細胞発現系でもよい。
【００１０】
さらに別の実施形態では、組成物は、貯蔵効果をもたらすことによって抗原の取込みを増強し、送達部位で抗原保持時間を増大し、または送達部位で細胞の緊密な接合を緩和することによって免疫反応を増強するように機能する送達剤をさらに含む。送達剤は生物付着剤（bioadhesive）でよく、好ましくはグリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、ウヌリン（unulin）、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、および他のムコ多糖を含む）セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸からなる群から選択される粘膜付着剤（mucoadhesive）でよい。粘膜付着剤が多糖であることが好ましい。粘膜付着剤が、キトサン、またはキトサン塩もしくはキトサン塩基などのキトサンを含む混合物であることがより好ましい。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明はアジュバントをさらに含む組成物を提供する。アジュバントは、トール様受容体（ＴＬＲ）作用薬、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、合成脂質Ａ、脂質Ａミメティックまたは類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロゾーム、コクリエート（cochleate）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、細菌外毒素などの外毒素、およびリポソームからなる群から選択される。アジュバントがトール様受容体（ＴＬＲ）作用薬であることが好ましい。アジュバントがＭＰＬ（登録商標）であることがより好ましい。
【００１２】
本発明の組成物は、液体製剤または乾燥粉末製剤として提供することができる。本発明の乾燥粉末製剤は、直径約１０から約５００マイクロメートルまでの平均粒子サイズを含むことができる。一実施形態では、組成物は抗原製剤である。別の実施形態では、組成物は、ワクチンとして投与するために製剤化される。好適な投与経路には、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、真皮下、または経皮が含まれる。特に、投与経路は筋肉内または粘膜であってよく、粘膜投与の好ましい経路には鼻腔内、経口、または膣内の投与経路が含まれる。別の実施形態では、組成物は、鼻内噴霧、点鼻薬、または乾燥粉末として製剤化され、この場合、製剤を、鼻の通路に近接して保持されまたは通路中に挿入する製剤を含む装置から鼻の通路内に速やかに沈着させることによって投与する。別の実施形態では、製剤を一方または両方の鼻孔に投与する。
【００１３】
本発明は、ノロウイルス組成物を含む抗原製剤またはワクチンを対象に投与することを含む、対象におけるノロウイルスに対する免疫反応を生じさせるための方法も提供する。一実施形態では、ノロウイルス組成物を含む抗原製剤およびワクチンは、１つ以上のノロウイルス抗原に対する抗体を産生することにおける使用を見出す。別の実施形態では、ノロウイルスのワクチン製剤を用いてノロウイルス感染症を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｉｎ ｖｉｖｏのＶＬＰ１０μｇでの鼻腔内免疫化後の、ネズミ頸部リンパ節細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。
【図２】ｉｎ ｖｉｖｏのＶＬＰ１０μｇでの鼻腔内免疫化後の、脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。
【図３】ｉｎ ｖｉｖｏのＶＬＰ２５μｇでの鼻腔内免疫化後の、脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。
【図４】ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した抗体分泌細胞（ＡＳＣ）由来のＶＬＰ特異的なＩｇＧまたはＩｇＡを示す図である。
【図５】ＥＬＩＳＡによって測定したＶＬＰ特異的なＩｇＧを示す図である。
【図６】ノーウォークＶＬＰに対する血清ＩｇＧ反応に対する効力アッセイの結果を示す図である。
【図７】抗原の液体製剤または乾燥粉末から再構成した製剤のいずれかで免疫化したマウスにおける、ノーウォークＶＬＰに対する血清ＩｇＧ反応を比較する効力アッセイの結果を示す図である。グラフは様々な製剤におけるノーウォークＶＬＰの効力対濃度を示す。
【図８】ノロウイルスＶＬＰワクチンの様々な製剤を投与後、２１日目（左パネル）および４２日目（右パネル）のウサギにおける血清ＩｇＧ反応を示す図である。
【図９】ノーウォークＶＬＰの液体製剤または乾燥粉末製剤のいずれかで鼻腔内免疫化したウサギにおける血清ＩｇＧ反応を示す図である。
【図１０】定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した乾燥粉末製剤の安定性を示す図である。回帰分析は、１年超、乾燥粉末１０ｍｇあたり全てのまたは完全ないずれかのＶＬＰμｇにおいて統計的趨勢がないことを示している。パーセント凝集は、ＳＥＣによって検出されなかったＶＬＰタンパク質は、定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された全ＶＬＰタンパク質に比べて凝集していることを仮定した計算値である。
【図１１】複数のノロウイルス抗原で腹腔内免疫化したマウスにおける、抗ノロウイルス抗体反応のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。細矢印は、ノーウォークＶＬＰだけを含む製剤でのブースター注射を示している。太矢印は、ノーウォークおよびヒューストンのＶＬＰ両方を含む製剤でのブースター注射を示している。
【図１２】ノーウォークＶＬＰ、ヒューストンＶＬＰ、またはノーウォークおよびヒューストンのＶＬＰの組合せのいずれかで腹腔内免疫化したマウスにおける抗ノロウイルス抗体反応のＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。
【図１３】マウスにおいてノーウォークＶＬＰでの鼻腔内免疫化１１４日後の、マウスにおける脾細胞（Ａ）、頸部リンパ節（Ｂ）、および骨髄（Ｃ）におけるノーウォークＶＬＰ特異的な長寿命の形質細胞の存在を示す図である。
【図１４】ノーウォークＶＬＰで鼻腔内免疫化したマウスの脾細胞における、ノーウォーク特異的記憶Ｂ細胞反応を示す図である。パネルＡは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における０日目（左グラフ）および４日目（右グラフ）のＩｇＡ抗体分泌細胞を示す。パネルＢは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における０日目（左グラフ）および４日目のＩｇＧ抗体分泌細胞を示す。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の拡大および分化のレベルを示すものである。
【図１５】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギから単離した末梢血単核細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰ特異的抗原分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における４日後のノーウォークＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１６】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギから回収した脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰ特異的抗原分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における４日後のノーウォークＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１７】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギの脛骨から回収した骨髄細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰ特異的抗原分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における４日後のノーウォークＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。０日目にＡＳＣが存在することは長寿命の形質細胞の存在を示すものである。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１８】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギから回収した腸間膜リンパ節細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。パネルＡは、ノーウォークＶＬＰに特異的なＩｇＧポジティブ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を示す。パネルＢは、ノーウォークＶＬＰに特異的なＩｇＡポジティブＡＳＣを示す。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰに特異的なＡＳＣの数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養物における４日後のノーウォークＶＬＰに特異的なＡＳＣの数を示す。０日目にＡＳＣが存在することは長寿命の形質細胞の存在を示すものである。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１９】ウサギにおいてｉｎ ｖｉｖｏで鼻腔内免疫化した後の、脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。左パネルは、非分画化の脾細胞においてノーウォークＶＬＰで再刺激したときのＴ細胞の増殖を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰで再刺激したときのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ノロウイルスの抗原およびワクチンの組成物、ならびに組成物を調製する方法に関する。特に、本発明は、ノロウイルス抗原および少なくとも１つのアジュバントを含む組成物を提供する。さらに、またはあるいは、組成物は、少なくとも１つの送達剤をさらに含んでもよい。本発明は、ノロウイルス抗原に対する免疫反応を生成し、または抗体を産生するために、動物に組成物を投与する方法も提供する。
【００１６】
（ノロウイルス抗原）
本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原を含む組成物を提供する。「ノロウイルス（Norovirus）」、「ノロウイルス（ＮＯＲ）」、「ノロウイルス（norovirus）」、および本明細書における文法上の同等物は、カリシウイルス科ノロウイルス属のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、ノロウイルスは、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物の種に感染し得る、関連するポシティブセンス１本鎖ＲＮＡの非エンベロープ（nonenveloped）ウイルスの群を含むことができる。いくつかの実施形態では、ノロウイルスはヒトに急性胃腸炎を引き起こすことができる。ノロウイルスは、電子顕微鏡で観察した場合に明確な表面構造またはデコボコの変縁を有する、小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）と称することもできる。ノロウイルス内には、１５の遺伝子群を含む、核酸およびアミノ酸配列によって定義される少なくとも４つの遺伝子型（ＧＩ〜ＩＶ）が含まれる。主な遺伝子型はＧＩおよびＧＩＩである。ＧＩＩＩおよびＧＩＶは提唱されているが、一般に認められている。代表的なＧＩＩＩは、ウシのイエナ（Jena）株である。ＧＩＶは、現時点では１つのウイルスであるアルファトロン型を含んでいる。ノロウイルスのさらなる記載は、Ｖｉｎｊｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、４１巻、１４２３〜１４３３頁（２００３年）を参照されたい。「ノロウイルス」は、本明細書における組換えのノロウイルスウイルス様粒子（ｒＮＯＲ ＶＬＰ）も意味する。いくつかの実施形態では、組換えのノロウイルスＶＬＰは、少なくとも１つのカプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするノロウイルス核酸配列を用いた発現系において生成される。他の実施形態では、細胞におけるＯＲＦ２によってコードされる少なくともノロウイルスのカプシドタンパク質の組換えの発現、例えばＳｆ９細胞においてバキュロウイルスのベクターからの発現は、カプシドタンパク質のＶＬＰへの自発的な自己集合をもたらすことができる。さらに他の実施形態では、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２によってコードされる少なくともノロウイルスのタンパク質の組換えの発現、例えばＳｆ９細胞においてバキュロウイルスのベクターからの発現は、カプシドタンパク質のＶＬＰへの自発的な自己集合をもたらすことができる。ノロウイルス核酸配列は、様々なノロウイルス株、あるいは収量もしくは安定性を増強するように、またはコードされる抗原の抗原性もしくは免疫原性の性質を改善するように改変された合成構築物を含むコンセンサス配列であってもよい。ＶＬＰは、構造的にノロウイルスに類似しているが、ウイルスのＲＮＡゲノムを欠いており、それゆえ感染性ではない。したがって、「ノロウイルス」は、不完全な粒子を含む、感染性または非感染性の粒子であり得るビリオンを含む。
【００１７】
ノロウイルスの非限定的な例には、ノーウォークウイルス（ＮＶ、ジーンバンク Ｍ８７６６１、ＮＰ０５６８２１）、サザンプトンウイルス（ＳＨＶ、ジーンバンク Ｌ０７４１８）、デザートシールドウイルス（ＤＳＶ、Ｕ０４４６９）、ヘッセウイルス（ＨＳＶ）、チバウイルス（ＣＨＶ、ジーンバンク ＡＢ０４２８０８）、ハワイウイルス（ＨＶ、ジーンバンク Ｕ０７６１１）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ、ジーンバンク Ｕ７００５９）、トロントウイルス（ＴＶ、Ｌｅｉｔｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４１巻、８６５〜８７５頁）、ブリストルウイルス（ＢＶ）、イエナウイルス（ＪＶ、ＡＪ０１０９９）、メリーランドウイルス（ＭＶ、ＡＹ０３２６０５）、セトウイルス（ＳＶ、ジーンバンク ＡＢ０３１０１３）、キャンバーウェル（ＣＶ、ＡＦ１４５８９６）、ローズスデールウイルス（ＬＶ、ジーンバンク Ｘ８６５５７）、グリムズビーウイルス（ＧｒＶ、ＡＪ００４８６４）、メキシコウイルス（ＭＸＶ、ジーンバンク Ｕ２２４９８）、ボクサー（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、ヒューストンウイルス（ＨｏＶ）、ミネルバ株（ＥＦ１２６９６３．１）、ローレンス株（ＥＦ１２６９６６．１）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、パリスアイランド（ＰｉＶ；ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、およびオペレーションイラクフリーダム（Operation Iraqi Freedom）（ＯＩＦ、ＡＹ６７５５５４）が含まれる。核酸、および対応するアミノ酸配列の各々は、その全てが参照により全て組み入れられる。いくつかの実施例では、暗号を同定の目的に用いることができ、組織化される：それからウイルスが単離される宿主の種／属の略語／種の略語／株名／発生年／起源の国（Ｇｒｅｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ、「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、１巻、８４１〜８７４頁（ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ編集長、第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００１年）。ある実施形態では、遺伝子型Ｉ．１（ノーウォークウイルス）およびＩＩ．４（ヒューストンウイルス）などのノロウイルスの遺伝子型の組合せ、または他の一般的に流通している株、またはそれらの組合せもしくは部分を表す合成構築物の使用が好ましい。ノロウイルスの新規な株は、日常的に同定されており（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ、５６巻（３３）、８４２〜８４６頁（２００７年））、２つ以上のウイルス株のコンセンサス配列を用いてノロウイルス抗原をまた発現してもよい。
【００１８】
ノロウイルス抗原は、ペプチド、タンパク質、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態であってよい。好ましい実施形態では、ノロウイルス抗原はＶＬＰを含む。本明細書で用いる場合、「ウイルス様粒子またはＶＬＰ」は、ノロウイルスのカプシドタンパク質コード配列から生成され、感染性のノロウイルス粒子のこれらに類似の抗原の特徴を含む、ウイルス様粒子、フラグメント、凝集体、またはそれらの部分を意味する。ノロウイルス抗原は、カプシドモノマー、カプシドマルチマー、ＶＬＰのタンパク質もしくはペプチドフラグメント、または凝集体もしくはそれらの混合物の形態であってもよい。ノロウイルス抗原のタンパク質またはペプチドは、当技術分野で知られている方法を用いて生成された、変性した形態であってもよい。
【００１９】
ノロウイルス抗原は、本発明のＶＬＰ上で、またはＶＬＰにおいて発現された、前記カプシドタンパク質の変異体またはそのフラグメントを含んでもよい。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列における変更を含むことができる。ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、参照配列に関して１つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を意味する。変異体は「保存的な」変化を有していてよく、この場合置換されたアミノ酸は類似の構造上のまたは化学的な性質を有する（例えば、イソロイシンでのロイシンの置換）。あるいは、変異体は「非保存的な」変化を有することができる（例えば、トリプトファンでのグリシンの置換）。類似のマイナーな変異体は、アミノ酸の欠失もしくは挿入、または両方を含むこともできる。生物学的または免疫学的活性を排除せずに、どのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失することができるかを決定する手引きは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアなど、当技術分野ではよく知られているコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。
【００２０】
クローニング、突然変異など、本発明に適用可能である分子生物学の技術を記載している一般的な教科書には、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００年（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる。これらの教科書には、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、ならびに、例えばノロウイルスのカプシドタンパク質のクローニングおよび突然変異に関する他の多くの関連の話題が記載されている。したがって、本発明は、本発明のＶＬＰ上に、またはＶＬＰにおいて発現されるタンパク質の特徴を改善または変更するための、タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の知られている方法の使用も包含する。様々なタイプの突然変異誘発を用いて、タンパク質分子をコードするコンセンサス配列を含む変異体の核酸を生成および／もしくは単離し、かつ／または本発明のＶＬＰにおける、またはＶＬＰ上のタンパク質をさらに修飾する／突然変異させることができる。これらには、それだけには限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異、相同的組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップを有する２本鎖ＤＮＡ（gapped duplex DNA)を用いた突然変異誘発などが含まれる。さらなる好適な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全体の遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復などが含まれる。
【００２１】
本発明のＶＬＰは、当技術分野では標準の方法を用いて、ＶＰ１および／もしくはＶＰ２タンパク質などの全長のノロウイルスカプシドタンパク質またはある種のＶＰ１もしくはＶＰ１誘導体のいずれかから形成することができる。あるいは、ＶＬＰを形成するために用いられるカプシドタンパク質は、切断されたカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、例えば、少なくとも１つのＶＬＰは切断されたＶＰ１タンパク質を含む。他の実施形態では、全てのＶＬＰは切断されたＶＰ１タンパク質を含む。切断は、Ｎ−またはＣ−末端切断であってよい。切断されたカプシドタンパク質は、機能的なカプシドタンパク質誘導体であることが好適である。機能的なカプシドタンパク質誘導体は、全長のカプシドタンパク質からなるＶＬＰによって生じる免疫反応と同じ方法で、免疫反応（必要な場合には、好適にアジュバント化されている場合）を生じさせることができる。
【００２２】
ＶＬＰは、大きい方のＶＰ１タンパク質および／または小さい方のＶＰ２タンパク質を含むことができる。各ＶＬＰは、１価ＶＬＰを生じるたった１つのノロウイルス遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含むことが好ましい。本明細書で用いられる「１価」の用語は、抗原タンパク質が単一のノロウイルス遺伝子型に由来することを意味する。例えば、ＶＬＰは、遺伝子型Ｉのウイルス株由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含む（例えば、ノーウォークウイルス由来のＶＰ１およびＶＰ２）。ＶＬＰが、主にＶＰ１タンパク質からなることが好ましい。本発明の一実施形態では、抗原は１価ＶＬＰの混合物であり、この場合、組成物は、複数のウイルス株（例えば、ノーウォークウイルスおよびヒューストンウイルス）から取った異なるノロウイルスの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２からなるＶＬＰと混合した、単一のノロウイルスの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２からなるＶＬＰを含む。単に例示として、組成物は、ノロウイルスの遺伝子型Ｉの１つ以上の株由来の１価ＶＬＰを、ノロウイルスの遺伝子型ＩＩの１つ以上の株由来の１価ＶＬＰと一緒に含むことができる。ノロウイルスＶＬＰの混合物が、ノーウォークおよびヒューストンのノロウイルスの株からなることが好ましい。
【００２３】
しかし、本発明の代替の実施形態では、ＶＬＰは、例えば、第２のノロウイルスの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質と混合したノロウイルスの１つの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含む多価ＶＬＰであってよく、この場合異なるＶＰ１およびＶＰ２タンパク質はキメラのＶＰ１およびＶＰ２タンパク質ではなく、同じカプシド構造内で一緒に会合して免疫原性のＶＬＰを形成する。本明細書で用いられる「多価」という語は、抗原タンパク質が２つ以上のノロウイルス遺伝子型に由来することを意味する。多価ＶＬＰは、２つ以上のウイルス株から取ったＶＬＰ抗原を含むことができる。単に例示として、組成物は、ノロウイルス遺伝子型Ｉの１つ以上の株由来のカプシドモノマーまたはマルチマーからなる多価ＶＬＰを、ノロウイルス遺伝子型ＩＩの１つ以上の株由来のカプシドモノマーまたはマルチマーと一緒に含むことができる。多価ＶＬＰが、ノーウォークおよびヒューストンのノロウイルスの株由来のカプシドタンパク質を含むことが好ましい。
【００２４】
組成物内の１価または多価ＶＬＰの組合せが、各ＶＬＰ型の免疫原性を阻止しないことが好ましい。特に、組み合わされた本発明のＶＬＰ組成物が、ワクチンで表されるノロウイルスの各遺伝子型による感染に対して免疫性を誘発することができるように、本発明の組合せにおけるノロウイルスＶＬＰの間に干渉が存在しないことが好ましい。組合せにおける所与のＶＬＰ型に対する免疫反応は、個々に測定した場合、同じＶＬＰ型に対する免疫反応の少なくとも５０％、好ましくは１００％、または実質的に１００％であるのが好適である。免疫反応は、例えば、本明細書の実施例で説明するように、抗体の反応によって好適に測定することができる。
【００２５】
多価ＶＬＰは、個々のカプシドタンパク質を別々に発現し、その後ＶＬＰを形成するように組み合わせることによって生成することができる。あるいは、多数のカプシドタンパク質を、１つ以上のＤＮＡ構築物から、同じ細胞内で発現させてもよい。例えば、複数のＤＮＡ構築物を、各々のベクターが異なるカプシドタンパク質をコードする、宿主細胞内に形質転換または形質移入してもよい。あるいは、共有するプロモーターまたは多数の個々のプロモーターによって制御される多数のカプシド遺伝子を有する単一のベクターを用いてもよい。適当な場合には、ＩＲＥＳエレメントをベクター内に組み入れてもよい。このような発現の戦略を用いて、同時発現されたカプシドタンパク質を、その後のＶＬＰ形成用に同時精製してもよく、またはその後精製することができる多価ＶＬＰを自発的に形成してもよい。
【００２６】
多価ＶＬＰを生成するための好ましいプロセスは、ノロウイルスの異なる遺伝子型由来の、ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質などのＶＬＰカプシドタンパク質または誘導体の調製、タンパク質の混合、および多価ＶＬＰを生成するためのタンパク質の構築を含む。カプシドタンパク質は、部分的に精製され、または混合前に精製される粗製抽出物の形態であってよい。構築された異なる遺伝子型の１価ＶＬＰを、分解し、一緒に混合し、多価ＶＬＰに再構築してもよい。タンパク質またはＶＬＰは、少なくとも部分的に精製し、その後組み合わせることが好ましい。場合により、多価ＶＬＰのさらなる精製を、構築後に行ってもよい。
【００２７】
本発明のＶＬＰは、均一かつ純粋なＶＬＰを提供するために、分解および再構築により作製するのが好適である。一実施形態では、多価ＶＬＰは、２つ以上のＶＬＰを分解し、その後再構築前のあらゆる好適な時点で、分解したＶＬＰの構成成分を組み合わせることによって作製することができる。この取り組みは、例えばいくつかの酵母菌株で起こるように、ＶＬＰが、発現されたＶＰ１タンパク質から自発的に形成する場合に好適である。ＶＰ１タンパク質の発現が自発的なＶＬＰの形成をもたらさない場合は、ＶＰ１タンパク質またはカプソメアの調製を、ＶＬＰへの構築前に組み合わせることができる。
【００２８】
多価ＶＬＰを用いる場合は、ＶＬＰの構成成分を、最終の混合したＶＬＰにおいてそれらが所望される割合で混合することが好ましい。例えば、ノーウォークおよびヒューストンウイルス（または他のノロウイルス株）からの部分的に精製したＶＰ１タンパク質の同量の混合物により、各タンパク質がおよそ等しい量で多価ＶＬＰがもたらされる。
【００２９】
多価ＶＬＰを含む組成物は、参照として本明細書に組み入れられるＷＯ９８／４４９４４、ＷＯ００４５８４１のものなど、当技術分野では知られている溶液によって安定化してもよい。
【００３０】
本発明の組成物は、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質または誘導体の他に、他のタンパク質またはタンパク質フラグメントを含むことができる。他のタンパク質またはペプチドを、本発明の組成物と一緒に投与してもよい。場合により、組成物を、非ノロウイルス抗原と製剤化し、または同時投与してもよい。これらの抗原が、他の疾患からの保護を提供することができるのが好適である。
【００３１】
ＶＰ１タンパク質または機能上のタンパク質誘導体は、ＶＬＰを好適に形成することができ、ＶＬＰの形成は、例えば、電子顕微鏡および動的レーザー光散乱などの標準の技術によって評価することができる。
【００３２】
（抗原の調製）
本発明の抗原分子を、それらが天然に存在する生物体から単離および精製することによって調製することもでき、またはそれらを組換え技術によって調製することもできる。ノロウイルスＶＬＰ抗原を、Ｓｆ９またはＨ５細胞などの昆虫細胞から調製することが好ましいが、大腸菌または酵母菌の細胞（例えば、出芽酵母（S.cerevisiae）、分裂酵母（S.pombe）、ピキアパストリ（Pichia pastori）、もしくは他のピキアの発現系）などのあらゆる好適な細胞、ＣＨＯもしくはＨＥＫなどの哺乳動物細胞の発現系も用いてもよい。組換え法によって、または合成によって調製する場合は、ペプチドを構成するアミノ酸の１つ以上の挿入、欠失、逆位、または置換がなされていてよい。上述の抗原は各々、実質的に純粋な状態で用いることが好ましい。
【００３３】
昆虫細胞の培養でノロウイルスＶＬＰを生成する手順は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６９４２８６５号に先に開示されている。簡潔に述べると、ウイルスのカプシド遺伝子（ＯＲＦ２）および小さい方の構造遺伝子（ＯＲＦ３）を含むゲノムの３’終端からｃＤＮＡをクローニングした。ウイルスのカプシド遺伝子を保有する組換えのバキュロウイルスを、クローニングしたｃＤＮＡから構築した。ノロウイルスＶＬＰを、Ｓｆ９またはＨ５昆虫細胞の培養物で生成した。
【００３４】
（アジュバント）
本発明は、ノロウイルス抗原と使用するためのアジュバントを含む組成物をさらに提供する。殆どのアジュバントは、抗原を速やかな異化作用から保護するように設計されている物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および免疫反応の刺激薬（例えば、百日咳菌（Bordatella pertussis）または結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のタンパク質）を含んでいる。好適なアジュバントは、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｐｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ）、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、カルシウム、鉄、または亜鉛の塩、アシル化したチロシンの不溶性懸濁液、アシル化した糖、陽イオン性または陰イオン性に誘導体化した多糖、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、ならびにＱｕｉｌ Ａなどが市販されている。
【００３５】
好適なアジュバントには、それだけには限定されないが、トール様受容体（ＴＬＲ）作用薬、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａミメティックまたは類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、およびリポソームも含まれる。アジュバントが細菌由来の外毒素ではないことが好ましい。好ましいアジュバントは、３ＤＭＰＬまたはＱＳ２１など、Ｔｈ１型反応を刺激するものである。
【００３６】
サルモネラ由来の脂質Ａの非毒性誘導体である一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）は、ワクチンのアジュバントとして開発されている強力なＴＬＲ−４作用薬である（Ｅｖａｎｓら、２００３年）。ネズミの前臨床試験では、鼻腔内のＭＰＬは分泌性および全身性の体液性反応を増強することが示されている（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら、２０００年、Ｙａｎｇら、２００２年）。これは、１２０，０００名を超える患者の臨床試験において、ワクチンのアジュバントとして安全かつ有効であることも証明されている（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００２年、２００４年）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４受容体によって自然免疫の誘発を刺激し、したがって、グラム陰性およびグラム陽性両方の細菌、ウイルス、および寄生体を含めた広範な感染性病原体に対する非特異的な免疫反応を誘発することが可能である（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００４年、Ｐｅｒｓｉｎｇら、２００２年）。鼻腔内製剤にＭＰＬを含めることにより、生得的な反応の速やかな誘発をもたらし、ウイルス暴露からの非特異的な免疫反応を誘発し、一方ワクチンの抗原性の構成成分によって産生される特異的な反応は増強するはずである。
【００３７】
したがって、一実施形態では、本発明は、適応性のおよび自然免疫の増強剤として、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））または３Ｄｅ−Ｏ−アシル化一リン酸化脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標））を含む組成物を提供する。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）は、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化一リン酸化脂質Ａの、４、５、または６アシル化鎖との混合物である。好ましい形態の３Ｄｅ−Ｏ−アシル化一リン酸化脂質Ａは、本明細書に参照として組み入れられる、欧州特許第０６８９４５４Ｂ１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ）に開示されている。別の実施形態では、本発明は、合成脂質Ａ、脂質Ａのミメティックまたは類似体（例えば、ＢｉｏＭｉｒａのＰＥＴ Ｌｉｐｉｄ Ａ）、またはＴＬＲ−４作用薬のように機能するように設計されている合成の誘導体を含む組成物を提供する。
【００３８】
「有効なアジュバントの量」または「有効な量のアジュバント」という用語は、当業者であれば十分理解され、投与された抗原に対する免疫反応を刺激することが可能な１つ以上のアジュバントの量、すなわち、鼻の洗浄物におけるＩｇＡレベル、血清ＩｇＧもしくはＩｇＭレベル、またはＢ細胞およびＴ細胞の増殖に関して測定して、投与した抗原組成物の免疫反応を増大する量が含まれる。免疫グロブリンレベルの好適に有効な増大には、いかなるアジュバントなしの同じ抗原組成物に比べて、５％を超える、好ましくは２５％を超える、特に５０％を超える増大が含まれる。
【００３９】
（送達剤（delivery agent)）
本発明は、限定するものではないが、宿主のムコ多糖の部分的脱水の単一効果または組合せ効果、送達剤の物理的性質、または送達剤と貯蔵効果をもたらす暴露部位の宿主の組織との間のイオン性の相互作用による液体の粘性の増大に基づく、抗原の取込みを増強するように機能する送達剤を含む組成物も提供する。あるいは、送達剤は、送達部位の抗原保持時間を増大することができる（例えば、抗原の排出を遅らせる）。このような送達剤は、生物付着剤であってよい。特に、生物付着剤は、グリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、ウヌリン（unulin）、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、および他のムコ多糖を含む）セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸からなる群から選択される粘膜付着剤であってよい。粘膜付着剤が、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基（例えば、キトサングルタメート）などの多糖であることが好ましい。
【００４０】
キトサンは、甲殻類の殻におけるキチンに由来する正に荷電した直鎖状の多糖であり、上皮細胞およびその表面を覆う粘液層の生物付着剤である。抗原のキトサンとの製剤は抗原の鼻粘膜との接触時間を増大し、したがって貯蔵効果のおかげで取込みを増大する（Ｉｌｌｕｍら、２００１年、２００３年；Ｄａｖｉｓら、１９９９年；Ｂａｃｏｎら、２０００年；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｂｂｅｎら、２００１年、２００１年；Ｌｉｍら、２００１年）。キトサンは、動物モデルおよびヒトの両方で、インフルエンザ、百日咳、およびジフテリアを含めたいくつかのワクチンに対する経鼻の送達系として試験されている（Ｉｌｌｕｍ、２００１年、２００３年；Ｂａｃｏｎら、２０００年；Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌら、１９９８年；Ｍｉｌｌｓら、２００３年；ＭｃＮｅｅｌａら、２００４年）。これらの治験では、キトサンは全身の免疫反応を、非経口のワクチン接種と等しいレベルに増強することが示されている。さらに、著しい抗原特異的なＩｇＡレベルが、粘膜性の分泌においてやはり測定された。このように、キトサンは経鼻のワクチンの有効性を大幅に増強することができる。さらに、キトサンはその物理的特徴により、粉末剤として製剤化された鼻腔内ワクチンに特によく適している（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｂｂｅｎら、２００１年；Ｍｉｋｓｚｔａら、２００５年；Ｈｕａｎｇら、２００４年）。
【００４１】
したがって、一実施形態では、本発明は、鼻腔内投与に適合される抗原またはワクチンの組成物を提供し、組成物は抗原、および任意選択で有効な量のアジュバントを含む。好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのキトサンなどの送達剤、および少なくとも１つのＭＰＬ（登録商標）などのアジュバント、ＣＰＧ、イミキモド、ガーディキモド（gardiquimod）、あるいは合成の脂質Ａまたは脂質Ａミメティックもしくは類似体などの送達剤と組み合わせた、ノロウイルスＶＬＰなどのノロウイルス抗原を含む抗原またはワクチンの組成物を提供する。
【００４２】
キトサンの分子量は１０ｋＤａと８００ｋＤａとの間、好ましくは１００ｋＤａと７００ｋＤａとの間、より好ましくは２００ｋＤａと６００ｋＤａとの間であってよい。組成物におけるキトサンの濃度は、典型的には最高約８０％（ｗ／ｗ）であり、例えば、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、または８０％である。キトサンは、少なくとも７５％脱アセチル化されていることが好ましく、例えば、８０〜９０％、より好ましくは８２〜８８％脱アセチル化されており、特定の例では８３％、８４％、８５％、８６％、および８７％脱アセチル化されている。
【００４３】
（ワクチンおよび抗原製剤）
本発明の組成物を、ワクチンまたは抗原製剤として投与するために製剤化することができる。本明細書で用いられる場合、「ワクチン」という用語は、上記に記載したような本発明のノロウイルスＶＬＰまたは他のノロウイルス抗原を含む製剤、脊椎動物に投与するのが可能である形態における製剤、および感染を軽減するために、かつ／または感染の少なくとも１つの症状を低減するために、かつ／または別の投与量のＶＬＰもしくは抗原の有効性を増強するために治療上の免疫を誘発するのに十分な免疫反応を誘発する製剤を意味する。本明細書で用いられる「抗原製剤（antigenic formulation)」または「抗原組成物」という用語は、哺乳動物などの脊椎動物に投与した場合に免疫反応を誘発する製剤を意味する。本明細書で用いられる「免疫反応」という用語は、体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応の両方を意味する。体液性免疫反応は、例えば、感染性物質を中和し、感染性物質が細胞に入るのを阻止し、前記感染性物質の複製を阻止し、かつ／または宿主細胞を感染および破壊から保護するＢリンパ球による抗体の生成の刺激を伴う。細胞媒介性免疫反応は、脊椎動物（例えばヒト）が表す、感染を防止もしくは軽減し、または少なくとも１つのその症状を低減する、Ｔリンパ球および／またはマクロファージなどの他の細胞によって媒介される感染性物質に対する免疫反応を意味する。ワクチン製剤は、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ．編集）（１９９５年）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に概ね記載されている。本発明の組成物は、例えば、経口の、胃腸の、および呼吸器（例えば、鼻の）粘膜の１つ以上に送達するために製剤化することができる。
【００４４】
組成物を呼吸器（例えば、鼻の）粘膜に送達することが企図される場合、典型的には、これをエアロゾルまたは点鼻薬として投与するための水溶液として製剤化し、あるいは、例えば、鼻道内に速やかに沈着させるための乾燥粉末として製剤化する。点鼻薬として投与するための組成物は、例えば、保存剤、粘度調整剤、等張化剤、緩衝剤など、通常このような組成物に含まれるタイプの１つ以上の賦形剤を含むことができる。粘度調整剤は、微結晶性セルロース、キトサン、デンプン、多糖などであってよい。乾燥粉末として投与するための組成物は、例えば、粘膜付着剤、増量剤、および適当な粉末の流動およびサイズの特徴を送達するための物質など、このような組成物に通常含まれる１つ以上の賦形剤も含むことができる。増量剤および粉末流動剤およびサイズ剤には、マンニトール、ショ糖、トレハロース、およびキシリトールが含まれ得る。
【００４５】
一実施形態では、本発明のノロウイルスのワクチンまたは抗原製剤を、免疫原として１つ以上のノロウイルスの遺伝子型の抗原、ＭＰＬ（登録商標）などのアジュバント、粘膜表面への接着を促進するためのキトサンなどの生体高分子、ならびにマンニトールおよびショ糖などの増量剤を含む乾燥粉末として製剤化してもよい。例えば、ノロウイルスのワクチンを、１つ以上のノロウイルスの遺伝子型の抗原（例えば、ノーウォークウイルス、ヒューストンウイルス、スノーマウンテンウイルス）、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント、キトサン粘膜接着性、ならびに増量剤としておよび適当な流動の特徴を提供するためのマンニトールおよびショ糖を含む乾燥粉末１０ｍｇとして製剤化してもよい。製剤は、キトサン約７．０ｍｇ（２５から９０％ｗ／ｗの範囲）、マンニトール約１．５ｍｇ（０から５０％ｗ／ｗの範囲）、ショ糖約１．５ｍｇ（０から５０％ｗ／ｗの範囲）、ＭＰＬ（登録商標）約２５μｇ（０．１から５％ｗ／ｗの範囲）、およびノロウイルス抗原約１００μｇ（０．０５から５％ｗ／ｗの範囲）を含むことができる。
【００４６】
ノロウイルス抗原は約０．０１％（ｗ／ｗ）から約８０％（ｗ／ｗ）までの濃度で存在することができる。一実施形態では、ノロウイルス抗原を、両方の鼻孔中に投与するために乾燥粉末製剤１０ｍｇあたり約５μｇ、約１５μｇ、および約５０μｇ（０．０２５、０．０７５、および０．２５％ｗ／ｗ）の投与量で、または一方の鼻孔中に投与するために約１０μｇ、約３０μｇ、および約１００μｇ（０．１、０．３、および１．０％ｗ／ｗ）の投与量で製剤化することができる。製剤を、各投与の間に一方または両方の鼻孔に投与することができる。免疫反応を増強するために、第１の投与の後１から１２週のブースター投与も存在し得る。ワクチンおよび抗原製剤におけるノロウイルス抗原の含量は、１μｇから１００ｍｇの範囲、好ましくは１〜５００μｇの範囲、より好ましくは５〜２００μｇ、最も典型的には１０〜１００μｇの範囲であってよい。各投与量で投与するノロウイルスの全抗原は、両方の鼻孔に投与する場合は乾燥粉末全２０ｍｇにおいて約１０μｇ、約３０μｇ、または約１００μｇのいずれかであり、または一方の鼻孔に投与する場合は乾燥粉末１０ｍｇである。乾燥粉末の特徴は、粒子の１０％未満は直径１０μｍ未満であることである。平均粒子サイズは、直径１０から５００μｍの範囲である。
【００４７】
別の実施形態では、抗原およびワクチン組成物は、対象に引き続き投与するための液体として製剤化することができる。鼻腔内投与を企図した液体製剤は、ノロウイルスの遺伝子型の抗原、アジュバント、およびキトサンなどの送達剤を含む。筋肉内（ｉ．ｍ．）または経口投与のための液体製剤は、ノロウイルス遺伝子型の抗原、アジュバント、およびバッファーを含み、送達剤（例えば、キトサン）を含まない。
【００４８】
本明細書上記に記載した抗原およびワクチン組成物は、凍結乾燥され、無水で貯蔵されてから使用に準備され、その時点で、液体製剤で用いる場合は希釈剤で再構成されることが好ましい。あるいは、組成物の様々な成分を、キットまたは装置において別々に貯蔵してもよい（あらゆるまたは全ての構成成分を凍結乾燥する）。構成成分は、乾燥製剤では凍結乾燥の形態のままでもよく、または液体製剤では再構成されていてもよく、混合してから使用または患者に別々に投与する。乾燥粉末を投与するためには、ワクチンまたは抗原製剤を、鼻腔内送達装置または局所（例えば、経皮）送達パッチ中に予め充填し、使用まで貯蔵してもよい。このような送達装置および付随する包装は、その内容物を保護し、安定性を確実にすることが好ましい。
【００４９】
抗原製剤およびワクチンの凍結乾燥は、当技術分野ではよく知られている。典型的には、凍結乾燥のプロセスの間抗原を保護するための、および望ましい特徴の粉末を得るための物質の存在下で液体の抗原を凍結乾燥する。タンパク質の抗原を凍結保護および溶解保護するために、かつ望ましい特徴の凍結乾燥したケークまたは粉末を得るために、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはラクトースなどの糖（初期濃度１０〜２００ｍｇ／ｍＬで存在する）を通常用いる。凍結乾燥した組成物は、理論的にはより安定である。噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥などの他の乾燥技術も用いることができる。殆どの製剤のプロセスの目標はタンパク質の凝集および分解を最小にすることであり、本発明者らは、凝集した抗原が存在すると、ノロウイルスＶＬＰに対する免疫反応を増強することを実証した（動物モデルにおける実施例３および４を参照されたい）。したがって、本発明者らは、凝集した抗原の完全な抗原に対する最適な比率を生成して動物モデルにおいて最大の免疫反応を誘発するために、それによって凍結乾燥プロセスの間に抗原の凝集の百分率を制御することができる方法を開発した。
【００５０】
このように、本発明は、ノロウイルス抗原製剤を作製する方法であって、（ａ）ショ糖とキトサンとの比が約０：１から約１０：１までである、ノロウイルス抗原、ショ糖、およびキトサンを含む凍結乾燥前溶液を調製することと、（ｂ）前記溶液を凍結することと、（ｃ）凍結溶液を３０〜７２時間凍結乾燥することであって、凍結乾燥最終生成物がある百分率の凝集形態の前記ノロウイルス抗原を含むこととを含む方法も包含する。凍結乾燥は、周囲の温度で行ってもよく、低温で行ってもよく、または様々な温度の循環で進めてもよい。例示のみの目的では、凍結乾燥は、例えば、−６９℃で開始し、３時間かけて−２４℃に徐々に調節し、次いでこの温度を１８時間保持し、次いで１時間かけて−１６℃に徐々に調節し、次いでこの温度を６時間保持し、次いで３時間かけて＋３４℃に徐々に調節し、最後に９時間にわたってこの温度を保持するサイクルの、一連の工程にわたって行ってよい。一実施形態では、凍結乾燥前溶液は増量剤をさらに含む。別の実施形態では、前記増量剤はマンニトールである。
【００５１】
望ましい百分率の凝集をもたらすのに適当なショ糖とキトサンとの比率は、以下の指針によって決定することができる。約２：１から約１０：１までの範囲の重量比のショ糖とキトサンとを含む凍結乾燥前混合物から、凍結乾燥前溶液濃度に応じて、約５０％から１００％までの範囲の完全なノロウイルス抗原（すなわち、０％から５０％の凝集した抗原）の凍結乾燥後物が得られる（実施例１３を参照されたい）。ショ糖とキトサンとの重量比０：１で、３０％未満の完全なノロウイルス抗原（すなわち、７０％を超える凝集した抗原）が生成される。ショ糖およびキトサンを両方とも省略し、マンニトールなどの増量剤だけを用いると、１０％未満の完全な抗原を生成する（すなわち、凍結乾燥前溶液濃度に応じて凝集した抗原の９０％を超える）。これらの指針を用いれば、当業者であれば、最適の免疫反応を生成するのに必要な望ましい量の凝集物を得るために、凍結乾燥前混合物におけるショ糖とキトサンとの重量比および濃度を調節することができる。
【００５２】
さらに、凍結乾燥前溶液にショ糖、キトサン、およびマンニトールを含んでも、長時間にわたる完全なノロウイルス抗原の安定性に負の作用はなく、すなわち、製剤における凝集した抗原／完全な抗原の比率は、約１２カ月以上の期間乾燥粉末として貯蔵した場合に増大しない（実施例１０を参照されたい）。このように、この凍結乾燥手順により、予想可能かつ制御可能な、完全なノロウイルス抗原に対する凝集体の比率を有する安定な製剤が確実となる。
【００５３】
（免疫反応を刺激する方法）
各々の抗原またはワクチン製剤の投与量における抗原の量は、重大な、有害な副作用なしに強力な免疫反応を誘発する量として選択される。このような量は、どの特異的な抗原を使用するか、投与経路、および用いるアジュバントに応じて変化する。一般には、本発明の状況では、患者に投与する投与量は、長時間にわたって患者に有益な治療反応をもたらすのに十分でなければならず、または抗原に特異的な抗体の生成を誘発するのに十分でなければならない。したがって、特異的な抗原に対する免疫反応を誘発するのに、かつ／または疾患もしくは感染症からの症状および／もしくは合併症を軽減し、低減し、もしくは治療するのに十分な量の組成物を患者に投与する。これを遂行するのに十分な量を、「治療上有効な投与量」と定義する。
【００５４】
実質的に純粋な形態のノロウイルス抗原では、各投与量は、製剤における各ノロウイルス抗原に対して、約１μｇから１０ｍｇ、好ましくは約２〜５０μｇを含むことが予想される。本発明の抗原製剤を使用する典型的な免疫化計画では、製剤を、各投与量が各抗原１〜１００μｇを含む、いくつかの投与量（例えば、１〜４投与量）で投与することができる。投与量は、組成物が生成する免疫学的活性および患者の状態、ならびに治療する患者の体重または体表面積によって決定する。投与量のサイズは、特定の患者における特定の組成物の投与に付随し得る、あらゆる有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【００５５】
本発明の抗原およびワクチン製剤を、非粘膜の、または粘膜の経路によって投与してもよい。これらの投与には、非経口の注射（例えば、静脈内、皮下、および筋肉内）によるｉｎ ｖｉｖｏの投与、または、バッカル／舌下、直腸、経口、経鼻、局所（例えば、経皮および目薬）、膣内、肺内、動脈内、腹腔内、眼内、もしくは鼻腔内の経路などの他の伝統的な直接経路、あるいは直接特定の組織内が含まれ得る。あるいは、本発明のワクチンを、経口、局所、皮下、粘膜、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、経皮、真皮下、皮内などの様々な経路のいずれかによって、および坐剤によって投与してもよい。投与は、単に、パッチ、針、カテーテル、または関連の装置を用いた直接投与によって、単一の時間点で、または複数の時間点で遂行してもよい。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の抗原およびワクチン製剤を、粘膜表面に投与する。粘膜表面による免疫化は、他の免疫化の経路に勝る多くの潜在的な利点を提供する。最も明らかな利点は、１）粘膜の免疫化は、投与に針または高度な訓練を受けた人員を必要とせず、２）免疫反応が、病原体が侵入した部位で、および全身的に生じることである（Ｉｓａｋａら、１９９９年；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら、１９９７年；Ｍｅｓｔｅｃｋｙら、１９９７年；Ｗｕら、１９９７年）。
【００５７】
さらなる一態様では、本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原、少なくとも１つの有効なアジュバント、および／または少なくとも１つの送達剤を含む抗原またはワクチン組成物を、患者の粘膜表面に投与（好ましくは、鼻腔内または経口）することによって、ＩｇＡの粘膜性の免疫反応およびＩｇＧの全身の免疫反応を誘発する方法を提供する。
【００５８】
本発明は、本明細書上記に定義したノロウイルス抗原、および本明細書上記に定義した少なくとも１つのアジュバント、または少なくとも１つの送達剤の鼻腔内製剤を投薬するための手段の提供も企図するものである。投薬装置は、例えば、エアロゾルの送達系の形態をとってよく、単回投与量のみまたは多数の投与量を投薬するように配列されていてよい。このような装置は、定量のワクチンまたは抗原製剤を鼻道に送達する。適当な装置の他の例には、それだけには限定されないが、ドロッパ、スワブ、エアロゾライザー（aerosolizer）、空気吸入器（例えば、Ｖａｌｏｉｓ Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｂｅｓｐａｋ ＵｎｉＤｏｓｅ ＤＰ）、ネブライザー、および吸入器が含まれる。装置は、対象が鼻の孔中に製剤を吸入することを必要とする受動的な方法によって抗原性またはワクチン製剤を送達することができる。あるいは、装置は、投与量を鼻の孔中に供給または噴射することによって製剤を積極的に送達することができる。抗原製剤またはワクチンを、１つ以上のこのような装置によって一方または両方の鼻孔中に送達することができる。投与は、対象１人あたり２つの装置を含むことができる（鼻孔１つにつき１装置）。有効成分（ノロウイルス抗原）の実際の投与量は、約５〜１０００μｇである。好ましい実施形態では、抗原またはワクチン製剤を、鼻の通路近くに保持し、または通路内に挿入した製剤を含んでいる装置から鼻の通路内に速やかに沈着させることによって、鼻粘膜に投与する。
【００５９】
本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原に対する抗体を産生する方法も提供し、前記方法は、上記に記載した本発明のワクチンまたは抗原製剤を対象に投与することを含む。これら抗体は、当技術分野における日常的な方法によって、単離および精製することができる。ノロウイルス抗原に特異的な単離抗体を、診断上の免疫学的アッセイの開発に用いることができる。これらのアッセイを用いて、臨床サンプルにおいてノロウイルスを検出し、感染を引き起こす特定のウイルス（例えば、ノーウォーク、ヒューストン、スノーマウンテンなど）を同定することができる。あるいは、単離した抗体を、ノロウイルスウイルス感染が疑われる対象に投与して、受動免疫または短期免疫を付与することができる。
【００６０】
上記に記載したように、本発明のワクチン製剤を対象に投与してノロウイルス感染の症状を治療することができる。ノロウイルス感染の症状は、当技術分野ではよく知られており、悪心、嘔吐、下痢、および胃痙攣が含まれる。さらに、ノロウイルスに感染した患者は、低度の発熱、頭痛、悪寒、筋肉痛、および疲労感を有することがある。本発明は、ノロウイルス感染に付随する少なくとも１つの症状を緩和および／または低減するように、本発明のワクチン製剤を対象に投与することによって、ノロウイルス感染を経験している対象における免疫反応を誘発する方法を包含する。症状の低減は、例えば、生活の質の評価、ノロウイルス感染またはさらなる症状の進行の減速、ノロウイルスの症状の重症度の低減、または好適なアッセイ（例えば、抗体の力価および／またはＴ細胞活性化アッセイ）を含めた、例えば、対象による自己評価によって、医師の評価によって、または好適なアッセイもしくは測定（例えば、体温）を行うことによって主観的または客観的に決定することができる。客観的な評価は、動物およびヒトの評価両方を含む。
【実施例】
【００６１】
次に、本発明を、以下の実施例に記載する特定の実施形態を参考にしてさらに詳しく説明する。実施例は、単に本発明の説明を意図するものであり、決してその範囲を制限しようとするものではない。
【００６２】
［実施例１］
（様々なノロウイルス抗原形態に対する免疫反応についての調査）
ワクチン製剤の有効性を調査するために、マイクロピペットによって液体懸濁液ワクチン製剤でマウスを鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化した。マウスに、単回のワクチン投与量のみを与えた（初回抗原刺激）。
【００６３】
実験用に、ワクチン製剤を３つ調製した。第１は１００％凝集と呼び、ＶＬＰの天然の構造を破壊し、凝集を誘発する条件下でＶＬＰを凍結乾燥することによって調製した。第２は１００％完全（intact）であり、非凍結乾燥のＶＬＰストックから１００％天然の単分散のＶＬＰを加えた、再水和した凍結乾燥のプラセボで調製した。第３の製剤は、５０／５０混合であり、先の２つの製剤を１：１の比で混合することによって、または〜５０％完全および５０％凝集のＶＬＰを産生する条件下で凍結乾燥することによって作製する。完全な天然のＶＬＰの構造上の状態および濃度を、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および紫外部（ＵＶ）吸光度によってアッセイした。製剤の全タンパク質濃度（凝集体を含む）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）溶解したタンパク質の定量的染色によって決定した。凝集／完全のパーセントを、全タンパク質に対する完全な天然ＶＬＰの比として計算した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
この実験は、様々なノロウイルスＶＬＰ製剤に対するマウスにおける免疫反応を測定するものである。マウスの群（１群あたり５匹）に、表１に示した再水和した乾燥粉末製剤を１回鼻腔内（ｉ．ｎ．）ワクチン接種した。ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量の全タンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然、単分散のＶＬＰ）、５０／５０混合（単分散および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（naive）（ＶＬＰタンパク質なし）。ｉ．ｎ．免疫化後１４日目にマウスを安楽死させ、頸部リンパ節および脾臓を回収し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的な細胞増殖アッセイ用に単一細胞懸濁液を調製した。これらのアッセイにおいては、頸部リンパ節細胞または脾細胞の反応をアッセイして、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化後の抗原に対する免疫原性反応を判定した。頸部リンパ節細胞または脾細胞を、天然の単分散ＶＬＰ（天然のＶＬＰ、黒線）または熱変性したＶＬＰタンパク質（ΔＶＬＰ、白線）のいずれかで再刺激し、各抗原の形態（１００％凝集、１００％完全、５０／５０混合、または無処置）からの細胞増殖の程度を、縦軸上に示すようにトリチウム標識したチミジンの取込み（ＣＰＭ）によって測定した（図１、頸部リンパ節細胞；図２、脾細胞）。
【００６６】
［実施例２］
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原特異的増殖アッセイ）
ワクチン製剤の効力をさらに調査するために、マウスを、液体懸濁液ワクチン製剤で腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化した。マウスに、単回のみのワクチンの投与量を与えた（初回抗原刺激）。
【００６７】
実施例１と同様、マウスの群（１群あたり５匹）にワクチン接種をしたが、今回は表２に示す再水和した乾燥粉末製剤を１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。繰り返すと、ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量の全タンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然、完全なＶＬＰ）、５０／５０混合（完全および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（ＶＬＰタンパク質なし）。
【００６８】
【表２】
【００６９】
このアッセイでは、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化後のＶＬＰに対する様々なネズミ細胞の反応を測定した。免疫化後１４日目にマウスを安楽死させ、脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を調製した。完全な天然のＶＬＰ（天然ＶＬＰ、点線）、または熱変性したＶＬＰタンパク質（ΔＶＬＰ、白線）のいずれかで脾細胞を再刺激し、各抗原の形態（１００％凝集、１００％完全、５０／５０混合、または無処置）からの細胞増殖の程度を、縦軸上に示すように（ＣＰＭ）トリチウム標識したチミジンの取込みによって測定した（図３）。これらのデータは、ワクチン製剤において調製した様々な生物物理学的形態のＶＬＰは、同程度のＴ細胞反応を誘発することを示している。
【００７０】
［実施例３］
（ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＶＬＰ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の反応を、実施例２に記載した様々なＮＶ−ＶＬＰ製剤で腹腔内免疫化したマウスから測定した。マウスの群（１群あたり５匹）を、表２に示した（実施例２）再水和した乾燥粉末製剤で１回ｉ．ｐ．ワクチン接種した。ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量のタンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然、完全なＶＬＰ）、５０／５０混合（完全および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（ＶＬＰタンパク質なし）。１４日目にマウスを安楽死させ、頸部リンパ節を回収した。頸部リンパ節細胞を、天然の完全なＶＬＰでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート上で一夜培養し、適当なＨＲＰコンジュゲートした２次抗体を用いて、ＩｇＧまたはＩｇＡいずれかに特異的なＥＬＩＳＰＯＴ用に発色させた（図４）。これらのデータは、３つのＶＬＰ抗原製剤は全て、抗原特異的なＢ細胞反応を誘発することを示している。１００％凝集ＶＬＰで免疫化した群は最大の免疫反応を表した。
【００７１】
［実施例４］
（ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＡ）
血清ＩｇＧレベルを、様々なＮＶ−ＶＬＰ製剤でｉ．ｐ．免疫化したマウスから測定した。マウスの群（１群あたり５匹）に、表２に示した（実施例２）再水和した乾燥粉末製剤を１回ｉ．ｐ．ワクチン接種した。ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量の全タンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然の、完全なＶＬＰ）、５０／５０混合（完全および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（ＶＬＰタンパク質なし）。１４日目に血清を回収し、抗ＶＬＰ特異的血清ＩｇＧに対してＥＬＩＳＡによってアッセイした（図５）。これらのデータは、実施例３に示した結果と相関しており、３つのＶＬＰ抗原製剤は全て、抗原特異的なＢ細胞反応を誘発することを示している。繰り返すと、１００％凝集ＶＬＰで免疫化した群は最大の免疫反応を表した。
【００７２】
［実施例５］
（ウサギにおけるワクチン製剤）
Ｖａｌｏｉｓ Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅを用いて、ウサギに製剤を鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与した。乾燥粉末製剤を、表３および４に示す。
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【００７５】
［実施例６］
（マウスにおけるノロウイルスワクチン製剤の効力のアッセイ）
Ｃ５７Ｂ１６メスマウスを、０日目に、様々な希釈の再構成したノーウォークＶＬＰ乾燥粉末ワクチン（ノーウォークＶＬＰ、ＭＰＬ、およびキトサンを含む）で腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化した。各動物に、示した製剤１００μＬを注射した。血清を毎週回収し、血清抗ＶＬＰ ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。免疫化後３週間回収した血清に対する値を図６に示す。
【００７６】
各個体のマウスに対する値を表し、バーは群の平均値を示す。血清抗ＶＬＰ ＩｇＧ値は、示したワクチンの投与量と相関していた。この実験設計を、ヒト臨床試験用にＧＭＰ製造したワクチンの放出に必要とされる効力アッセイとして、改良し、開発した（図６）。
【００７７】
［実施例７］
（マウスにおける、液体対再構成したノロウイルス製剤の効力）
Ｃ５７Ｂ１６メスマウスを、０日目に、体積１００μＬの、キトサン、マンニトール、ＭＰＬ、および様々な濃度のノーウォークＶＬＰ（表５）を含む製剤でｉ．ｐ．免疫化した。乾燥粉末マトリックス（マンニトール、ＭＰＬ、およびキトサン）１０ｍｇ／ｍＬを純水に可溶化し、特定の量の液体ノーウォークＶＬＰを加えることによって、内部検量線を作成した（群１〜５）。一方、ＧＭＰ ＶＬＰのロットを予め凍結乾燥し、次いで純水１．０ｍｌに可溶化した（群６〜８）。１４、２１、および３０日目にマウスから血清を回収し、血清抗ノーウォークＶＬＰ ＩｇＩをＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７８】
【表５】
【００７９】
各製剤に対する相対的な効力を以下の式：Ｉｎｖ Ｌｏｇ（平均値−Ｙ切片／勾配）を用いて計算した。効力を、製剤におけるＶＬＰ濃度に対してプロットし、マトリックスのバックグラウンド中に既知量のＶＬＰを加えたものを用いて作成した検量線に関して報告する（図７）。示した結果は、３つの別々の血清回収時間点を表している。これらのデータは、乾燥粉末から再構成したノーウォークＶＬＰ製剤は、液体製剤よりも全体に高い効力を有することを示している。
【００８０】
［実施例８］
（ウサギにおける乾燥粉末製剤の効力）
ニュージーランドシロウサギのメス４３羽に、乾燥粉末中に製剤化したノーウォークＶＬＰ５μｇ（低）または２５μｇ（高）のいずれか±ＭＬＰおよび±キトサンで、Ｖａｌｏｉｓ ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化した。１群には、液体として製剤化した高投与量のＶＬＰおよびＭＰＬを投与し、筋肉内投与した（ｉ．ｍ．）。０日目および２１日目に、ウサギにワクチン接種した。ＭＬＰを用いる場合は、ＶＬＰと同じ投与量を用いた（すなわち、ノーウォークＶＬＰ５μｇおよびＭＰＬ５μｇ）。キトサンを用いる場合は、７ｍｇ／投与量であった。
【００８１】
ノーウォークのＶＬＰに特異的な血清ＩｇＧ（ＥＬＩＳＡによって決定して）を、図８に示す。各処置群に対する平均値を、２１日目（左パネル、追加免疫化の投与の直前に回収）、および４２日目（右パネル）に対して示す。値を、１Ｕを１μｇと見積もり、ＶＬＰ特異的ＩｇＧのＵ／ｍＬで報告する。標準偏差をバーによって示す。ネガティブコントロール群（ウサギ３羽）および筋肉内免疫化群（４羽）以外は、処置群の動物は全て６羽であった。これらのデータは、一般的に、ＶＬＰ投与量が高いほど、より高い血清抗ＶＬＰ ＩｇＧレベルがもたらされることを示している。特にキトサンは鼻腔内ワクチンに対する反応を増強する。ｉ．ｍ．免疫化した群は、最も大きな反応を示した。しかし、鼻腔内免疫化した群におけるＶＬＰ特異的ＩｇＧレベルは、やはりかなり強力であった。
【００８２】
［実施例９］
（ウサギに鼻腔内投与した液体対乾燥ノロウイルス製剤の効力）
ニュージーランドシロウサギのメスに、乾燥粉末または液体のいずれかに製剤化したノーウォークＶＬＰ５０μｇ＋ＭＬＰ５０μｇ＋キトサン１４ｍｇで、Ｖａｌｏｉｓ ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅを用いて鼻腔内免疫化した。ワクチンの内容は、物理的状態以外は同一であった。０日目および２１日目（０週目および３週目）に免疫化し、最初のワクチン接種後３週間および６週間に再び、追加免疫前に血清を回収した。ノーウォークＶＬＰに特異的な血清ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定し、結果を図９に示す。
【００８３】
群平均を示し、バーは標準偏差を表す。乾燥粉末免疫化群のウサギは６羽であり、液体免疫化群のウサギは１０羽であった。ネガティブコントロールを表すウサギは８羽であった。３週間では液体と乾燥粉末との免疫化群間では違いは殆んど見られなかった。しかし、最初の免疫化６週間後に、乾燥粉末製剤で免疫化したウサギは、液体免疫化群に比べて優れた血清抗ＶＬＰ ＩｇＧ反応を有していた。
【００８４】
［実施例１０］
（ノロウイルス乾燥粉末製剤の安定性）
乾燥粉末ＶＬＰ製剤の安定性を調査するために、（薬物生成物１０ｍｇあたり）遺伝子型ＩのＶＬＰ２５μｇの溶液を、ＭＰＬ２５μｇ、キトサングルタメート７００μｇ、マンニトール１．４７５ｍｇ、およびショ糖１．４７５ｍｇと混合することによってバルクの薬物生成物を調製した。溶液を凍結乾燥し、さらなるキトサングルタメート６．３ｍｇ（薬物生成物１０ｍｇあたり）と混和し、名目上１０ｍｇの乾燥粉末でＢｅｓｐａｋ ｕｎｉｄｏｓｅ装置中に充填し、乾燥剤のカプセルとともに密封したホイル袋に貯蔵した。全ＶＬＰ含量をＩｍｐｅｒｉａｌ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスキャニングデンシトメトリーを用いて測定し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて完全なＶＬＰ含量を定量した。これらの測定値は、実験誤差内では、１２カ月の期間にわたって全ＶＬＰまたは完全なＶＬＰのいずれかにおいて変化が検出されなかったことを示していた（図１０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と比べた場合、ＳＥＣによるＶＬＰタンパク質の回復が低いのは凝集のためであったと仮定すると、％凝集の計算値は時間とともに増大せず、むしろ１２カ月の貯蔵を通して一定のまま、または低減した。タンパク質にいっそう一般的な安定性の問題の一つは、貯蔵での凝集の増大である。図１０における結果に基づくと、製剤は、完全なＶＬＰの安定な百分率をもたらし、生成物を製造し、少なくとも１年間にわたって使用することができると結論付けることができる。
【００８５】
［実施例１１］
（複数のノロウイルス抗原）
Ｃ５７Ｂ１／６マウス（メス、９週齢）８匹を、キトサン０．７ｍｇ、ＭＰＬ２．５μｇ、およびマンニトール０．３ｍｇを水で０．１ｍＬにして製剤化したノーウォークＶＬＰ２．５μｇで、０日目および１４日目に腹腔内（ＩＰ）免疫化した。コントロールのマウス２匹を食塩水で免疫化した。２８日目および４９日目に、これらを、キトサン０．７ｍｇ、ＭＰＬ２．５μｇ、およびマンニトール０．３ｍｇを水で０．１ｍＬにして製剤化したノーウォークＶＬＰ２．５μｇ＋ヒューストンＶＬＰ２．５μｇで再びＩＰ免疫化した。コントロールのマウスには再び食塩水を与えた。血清サンプルを、５週目（３５日目）に開始して毎週回収し、ノーウォークＶＬＰまたはヒューストンＶＬＰとの反応性に対してＥＬＩＳＡによって分析した。ノーウォークだけの混合物で追加免疫した時間を、細矢印によって示し、ノーウォーク＋ヒューストンＶＬＰ混合物で追加免疫した時間を太矢印で示す。Ｕ／ｍＬ（１ＵをＩｇＧ１μｇに近似させる）における、ノーウォークＶＬＰ（上パネル）およびヒューストンＶＬＰ（下パネル）に特異的な個々の血清ＩｇＧ反応を示す。平均値をバーによって示す。抗ノーウォーク反応は、０日目および１４日目（０週目および２週目）の先の２回の免疫化によって非常に強力であったので、Ｙ軸のスケールが異なることに留意されたい。しかし、ヒューストンＶＬＰに対する反応は極めて強力であり、追加免疫後２週目に大幅な増大が出現している。これらのデータは、同じ免疫化混合物におけるノロウイルスＶＬＰの様々な抗原株に対して特異的な免疫反応が産生され得ることを実証するものである（図１１）。
【００８６】
［実施例１２］
（様々なノロウイルス抗原に対する免疫反応）
Ｃ５７Ｂ１６メスマウスを、０日目および１４日目に、ノーウォークＶＬＰ２５μｇ、ヒューストンＶＬＰ２５μｇ、またはノーウォークおよびヒューストンＶＬＰ各２５μｇの組合せで、腹腔内（ＩＰ）免疫化した。血清を毎週回収し、血清抗ＶＬＰ ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。免疫化後４週に回収した血清に対する値を図１２に示す。
【００８７】
免疫化のＶＬＰ含量をＸ軸上に示す。各個体のマウスに対する値を表し、バーは群平均を示す。抗体レベルをＵ／ｍＬで表し、１Ｕを血清ＩｇＧの１μｇに近似させる。左パネルにおける値は捕捉剤としてノーウォークＶＬＰを用いて決定したものであり、右パネル上の値を測定するためにヒューストンＶＬＰを用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。これらのデータは、ノーウォークＶＬＰで免疫化しても、ヒューストンＶＬＰを認識することができる血清抗体をもたらすことはなく、または逆も同じであることを示している。
【００８８】
［実施例１３］
（ショ糖およびキトサンの混合物は乾燥粉末製剤においてノロウイルスＶＬＰ構造を保存する）
以下の実験は、凍結乾燥前溶液における、ショ糖、キトサン、およびマンニトールの、単独または組合せの、凍結乾燥中の天然のノーウォークＶＬＰの４次構造に対する作用を調べたものである。表６は、対象の成分の凍結乾燥前溶液濃度、混合物の全体積、および対応する重量比を示すいくつかの実験の複合である。溶液は全て手操作で回転し、穏やかにボルテックスして均一にし、次いで液体窒素中シェル凍結し、約３０から６０時間までの範囲の時間サイドアーム付き容器を用いてユニットの外側に凍結乾燥した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
表７は、表６に示した凍結乾燥した試料の、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析の結果を示している。凍結乾燥した試料を水で再構成し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。未処理のＮＶ−ＶＬＰを同時に分析し、再構成した試験試料のＮＶ−ＶＬＰ含量を定量するための参照基準として用いた。ＵＶおよび蛍光検出器の両方を定量に用いた（示したデータは、蛍光検出器からのものである）。ＳＥ−ＨＰＬＣを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ １０−３００カラムを用いて行い、移動相はリン酸ナトリウム１０ｍＭ、クエン酸１０ｍＭ、ｐＨ５、およびＮａＣｌ５００ｍＭからなり、流速は０．５ｍＬ／分であった。溶出したピークの積分面積を用いてタンパク質濃度を定量した。「ＶＬＰ」は、約１５分にカラムから溶出したピークであり、あらゆる先行するショルダーおよび／またはピークテイルは同時に分析した参照基準のＮＶ−ＶＬＰのおよその溶出時間ウインドウ内にあった。約３２分にカラムから溶出したＶＬＰフラグメントは、ＶＬＰの不安定化および結果としての分解に起因する高度に安定な単一の種である。中間体およびより小さなフラグメントは観察されなかった。
【００９１】
結果は、ショ糖およびキトサンの組合せは、最高の（約１００％の回復）凍結乾燥後物（試料ＬＧ１０−ＬＧ１２）を含む、広範囲の天然の単分散ＮＶ−ＶＬＰの回復をもたらすことを示していた。さらに、これらのサンプルからのＮＶ−ＶＬＰ溶出ピークの形状は、未処理のＮＶ−ＶＬＰの参照基準と同一であり、天然構造が高度に保存されていたことを示していた。ショ糖のみを含む試料は、参照基準に類似のピークの形状を表したが、ＮＶ−ＶＬＰ回復は低かった（約６０％の回復（試料ＬＧ１３））。マンニトールのみを含む試料は、ＶＬＰの殆んど完全な凝集をもたらした（試料ＬＥ１−ＬＥ６およびＬＩＧ１ｄ−Ｓ３）。ＮＶ−ＶＬＰ構造に対するマンニトールの有害作用は、キトサンおよびショ糖の存在によって対抗された（試料ＬＩＧ１ｄ−Ｓ２およびＬＩＧ１ｄ−ＳＢ）。
【００９２】
【表７】
【００９３】
［実施例１４］
（鼻腔内免疫化したマウスにおけるノロウイルス特異的長寿命形質細胞および記憶Ｂ細胞の誘発）
Ａ．ノーウォークＶＬＰ特異的長寿命形質細胞
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ノロウイルスＶＬＰおよびアジュバントで鼻腔内免疫化した。無処置のコントロールにはアジュバント単独を投与した。免疫化１１４日後、両群のマウスから脾臓、頸部リンパ節、および骨髄を収集した。組織を収集した日（０日目）、細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて抗原特異的な抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の存在に対してアッセイした。結果を、様々な組織に対して図１３Ａ〜Ｃに表す。これらの組織において免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ）が検出されると、ノロウイルス特異的長寿命形質細胞の存在が示される。
【００９４】
Ｂ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞
ノーウォークＶＬＰで鼻腔内免疫化したマウスからノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞の存在を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを開発した。様々なリンパ組織、または全血（末梢血単核細胞、脾細胞、リンパ節細胞など）を、このアッセイを用いて記憶Ｂ細胞の存在に対してアッセイすることができる細胞の供給源として使用することができる。
【００９５】
この実験では、免疫化した動物および無処置の動物（コントロール）から脾臓を収集および処理し、脾細胞を、ノーウォークＶＬＰ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下（コントロール）で４日間培養した。組織を収集する日（０日目）に最初のＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行ってＡＳＣ（上記セクションＡを参照されたい）のバックグラウンドレベルを確立した。培養４日後、細胞を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで再びアッセイしてＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を定量した。０日目と４日目のアッセイとの間のＶＬＰ特異的ＡＳＣの数における違いが、抗原特異的記憶Ｂ細胞の集団を表している。この実験の結果を、図１４ＡおよびＢに示す。
【００９６】
［実施例１５］
（ウサギにおけるノロウイルス記憶Ｂ細胞反応）
ニュージーランドシロウサギのメス２羽を、Ｖａｌｏｉｓ Ｍａｒｋ４鼻腔内送達装置中に充填した乾燥粉末１０ｍｇあたりノーウォークＶＬＰ２５μｇ、ＭＰＬ２５μｇ、マンニトール１．５ｍｇ、ショ糖１．５ｍｇ、およびキトサン７．０ｍｇからなる乾燥粉末製剤で鼻腔内免疫化した。ウサギ２羽には、１４日間隔で全３回の免疫化を与えた。この実験では、非免疫化のメスウサギを無処置のコントロールとして用いた。
【００９７】
Ａ．ウサギ組織の回収および処理
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）：凝固を防ぐためにＥＤＴＡを含む採血管に、ウサギから全血（〜５０ｍＬ）を得た。全血を滅菌Ｄ−ＰＢＳで１：３に希釈し、希釈した全血〜３５ｍＬを、５０ｍＬ滅菌遠心管中のリンパ球分離液１５ｍＬ上に重層した。管を室温で２０分間、８００×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを含むバフィーコート層を、５ｍＬ滅菌ピペットを用いて注意深く除去し、細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。必要に応じて、汚染性の赤血球をＡＣＫ溶解によって除去した。細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０−１０％ＦＢＳ（１６４０−Ｃ）に再懸濁し、トリパン排除法を用いて血球計算機で計数した。
【００９８】
腸間膜リンパ節細胞：各ウサギを安楽死させた後、別々に、リンパ節を無菌的に回収した。組織を、〜１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０−無血清（１６４０−ＮＳ）を含むプラスチック製滅菌ペトリ皿に維持した。リンパ節を、滅菌乳棒を用いて滅菌網目スクリーンを押して通過させて組織を分散させ、リンパ節細胞の単一細胞懸濁液を得た。細胞を回収し、１６４０−ＮＳで２回洗浄し、最後に７０μｍの滅菌ろ紙を通してろ過して凝集塊および残骸を除去した。細胞を１６４０−Ｃに再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。
【００９９】
脾細胞：安楽死後、各ウサギから脾臓を無菌的に得た。脾臓を１６４０−ＮＳ約１０ｍＬを含む滅菌ペトリ皿に配置した。２２ゲージの滅菌針およびシリンジを用いて、培地を組織中に繰り返し注入して脾皮膜を破壊し、細胞を浮遊させた。次いで、滅菌ピンセットを用いて残りの組織フラグメントを細かく裂いて引き離した。ペトリ皿の内容物を滅菌遠心管に移し、細胞懸濁液および破壊した脾臓組織を６〜８分間寝かせて、大きな組織フラグメントを沈澱させた。単一細胞の懸濁液を第２の滅菌遠心管に移し、細胞を１６４０−ＮＳで１回洗浄した。脾細胞製剤における赤血球を、ＡＣＫ溶解（ＡＣＫバッファー８ｍＬ、８分、室温）によって除去し、細胞を１６４０−ＮＳでもう１回洗浄し、最後に７０μｍの滅菌ろ紙を通してろ過して凝集塊および残骸を除去した。最終の細胞ペレットを１６４０−完全培地に再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。
【０１００】
骨髄細胞：安楽死後、個々のウサギから下腿における脛骨を除去した。骨髄細胞を除去するには、骨鋸を用いて骨の終端を無菌的に切り落とし、骨の内容物を、１６４０−ＮＳ培地を繰り返し注入することによって流し出した。骨髄細胞をピペットで繰り返し吸い上げ、吐き出して、細胞の凝集塊をばらばらにし、分散させた。細胞を１６４０−ＮＳで１回洗浄し、赤血球をＡＣＫで溶解し、細胞を１６４０−ＮＳでもう１回洗浄した。最後に、細胞を７０μｍの滅菌ろ紙を通してろ過して凝集塊および残骸を除去した。最終の細胞ペレットを１６４０−完全培地に再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。
【０１０１】
Ｂ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＶＤＦフィルタープレートを予め湿潤し、洗浄した後、４０μｇ／ｍｌの濃度の天然ノーウォークＶＬＰの滅菌溶液で最終体積５０μｌ／ウェルにコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベートし、Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、１６４０−Ｃを添加してブロックした。免疫化したウサギからの、および無処置のコントロールのウサギからの、腸間膜リンパ節細胞、脾細胞、および骨髄細胞を、様々な濃度で（１×１０６、５×１０５、２×１０５、および１×１０５細胞／ウェル）ウェルに加え、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで徹底的に洗浄し、ウサギＩｇＧおよびＩｇＡに特異的な２次試薬をウェルに加え、室温でさらに２時間インキュベートした。広範に洗浄した後、プレートをＤＡＢクロマゲン（chromagen）／基質で発色させ、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーで読み取った。無処置のコントロールの動物からのウェル上に表れたスポットを、実験群から差し引いた。データを、ノーウォークＶＬＰ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）として表し、１×１０６細胞あたりで標準化した。
【０１０２】
Ｃ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞アッセイ
上記に記載した様々な組織から単離したリンパ細胞を、ノーウォークＶＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）存在下、１６４０−Ｃ培地に１ｍＬあたり５×１０６細胞の密度で再懸濁した。細胞を１ｍＬの体積で２４ウェルプレート中、３７℃で４日間インキュベートした。ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、培養時にこれらの細胞に対して行った。培養４日後、細胞を収集し、１６４０−ＮＳ培地で２回洗浄し、１６４０−完全培地に再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。細胞を、ノーウォークＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでもう１回試験した。組織収集日に行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得たデータを、０日目（バックグラウンド）のＡＳＣ活性と呼ぶ。０日目の時間点に検出されたあらゆるスポットを、活発に分泌している形質細胞または長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）と仮定した。４日間培養細胞に対して行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られたデータを４日目ＡＳＣ活性と呼び、記憶Ｂ細胞の活性を、４日目ＡＳＣ活性と０日目ＡＳＣ活性との間の違いによって表す。
【０１０３】
Ｄ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は鼻腔内免疫化したウサギの末梢血に存在する
上記に記載したノーウォークＶＬＰを含む乾燥粉末製剤ワクチンで、３回鼻腔内免疫化した最後の１４１日後、免疫化したウサギ（ＲＢ７３５、ＲＢ１４１１）２羽から全血を得た。非免疫化の無処置のウサギからも血液を得た。血液を処理して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、ＰＢＭＣをノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞アッセイ（上記セクションＣ）に配置した。結果を図１５に示す。左パネルは、組織収集時（０日目ＡＳＣ）の最初のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。右パネルは、ノーウォークＶＬＰと培養４日後のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す（４日目ＡＳＣ）。
【０１０４】
０日目のＥＬＩＳＰＯＴの結果（図１５、左パネル）は、ノーウォークＶＬＰ乾燥粉末ワクチンで最後に追加免疫した約１４０日後には、末梢血にＶＬＰ特異的形質細胞は残存しないことを図示している。図１５の右パネルは、ノーウォークＶＬＰとｉｎ ｖｉｔｒｏで４日培養したＰＢＭＣからのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。免疫化した２羽のウサギでは、おそらく記憶Ｂ細胞の亜集団であるＰＢＭＣの著しい数が、活性のＩｇＧ分泌性ノーウォークＶＬＰ特異的形質細胞に成熟する。ＩｇＡ分泌性記憶Ｂ細胞に対するアッセイを行ったが、ＰＢＭＣの集団でＩｇＧ分泌性記憶Ｂ細胞だけが検出された。予想通り、無処置の動物は抗原特異的記憶Ｂ細胞を示さなかった。このようにＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は、３回の鼻腔内免疫化の最後の後１４０＋日のウサギの末梢循環に見出された。
【０１０５】
Ｅ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は鼻腔内免疫化したウサギの脾臓に存在する
ワクチン免疫化した２羽のウサギ、および非免疫化のコントロールのウサギの脾臓から脾細胞を得た。ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞アッセイ（上記に記載）を、これらの細胞に対して行い、結果を図１６に示す。ＰＢＭＣの集団に観察されるように、０日目のＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、抗原特異的な形質細胞が脾臓には存在しないことが示された（図１６、左パネル）。しかし、ノーウォークＶＬＰとｉｎ ｖｉｔｒｏで４日インキュベート後は、ＩｇＧ分泌性ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞が脾細胞集団において明らかである。このように、脾臓は、鼻腔内免疫化後の記憶Ｂ細胞の遊走に対する一部位を代表している。
【０１０６】
Ｆ．ノーウォークＶＬＰ特異的長寿命形質細胞の集団は骨髄に見出されるが、記憶Ｂ細胞は存在しない
実験用ウサギの脛骨から骨髄細胞を得、長寿命形質細胞および記憶Ｂ細胞の存在に対してアッセイした。結果を図１７に表す。図１７の左パネルは、ウサギ１４１１は、骨髄に著しい集団の抗原特異的形質細胞を有していたことを示している。免疫化後、骨髄に遊走し、そこに長期間存在する形質細胞を、長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）と呼ぶ。ウサギ７３５は、高数値のＬＬＰＣを示さなかった。無処置のウサギの骨髄にはＬＬＰＣは見出されなかった。骨髄細胞を記憶Ｂ細胞アッセイで培養し、記憶Ｂ細胞の存在に対して再試験した。図１７の右パネルは、骨髄には抗原特異的記憶Ｂ細胞が本質的に存在しないことを示している。このように、長寿命形質細胞は骨髄に遊走するが、記憶Ｂ細胞はそこに見出されない。
【０１０７】
Ｇ．ＩｇＧ分泌性およびＩｇＡ分泌性ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は両方とも鼻腔内免疫化したウサギの腸間膜リンパ節に存在する
実験用ウサギ全てから腸間膜リンパ節を得て、単離した細胞をＬＬＰＣおよび記憶Ｂ細胞に対してアッセイした。このアッセイからの結果を図１８Ａに示す。骨髄以外の、分析した殆どのリンパ組織と同様、腸間膜節にＬＬＰＣは見出されなかった（図１８Ａ、左パネル）。ノーウォークＶＬＰとのｉｎ ｖｉｔｒｏのインキュベート後に、非常に高い数値のＩｇＧ分泌性ＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞が、腸間膜リンパ節の集団に明らかであった（図１８Ａ、右パネル）。腸間膜リンパ節に観察された記憶Ｂ細胞の数は、アッセイした他のリンパ組織に観察されたものよりも有意に高かった。
【０１０８】
多くの研究者たちが、鼻の通路または腸などの粘膜の誘導部位を免疫化することで、いわゆる粘膜免疫反応を誘発できることを示していた。この反応は、一般的には、粘膜のリンパ組織に局在しているＩｇＡ＋Ｂ細胞およびＩｇＡ分泌性形質細胞の存在を特徴とする。この理由から、腸間膜リンパ節細胞を、また、ＩｇＡ分泌性ＬＬＰＣまたは記憶Ｂ細胞の存在に対してアッセイした。これらのアッセイからの結果を図１８Ｂに示す。繰り返すと、ＩｇＡ＋ＬＬＰＣは腸間膜リンパ節の集団には見出されなかった（図１８Ｂ、左パネル）。しかし、ＩｇＡ分泌性記憶Ｂ細胞はこの組織に検出された（図１８Ｂ、右パネル）。このように、乾燥粉末ノーウォークＶＬＰワクチン製剤での鼻腔内免疫化により、ＩｇＧ＋およびＩｇＡ＋両方の抗原特異的記憶Ｂ細胞の、腸関連のリンパ組織への遊走をもたらす粘膜免疫反応が誘発される。ノーウォークワクチン製剤での免疫化が誘発する抗原特異的記憶Ｂ細胞の生成は、ワクチンの有効性の考えられる指標である。記憶Ｂ細胞の存在は、長寿命免疫の１つのマーカーである。
【０１０９】
Ｈ．ＶＬＰ特異的ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞
免疫化したウサギから収集した脾細胞を、完全なノーウォークＶＬＰで再刺激し、細胞の増殖の度合いを、縦軸上に示すように（ＣＰＭ）トリチウム標識したチミジンの取り組みによって測定した（図１９）。左パネルは、脾細胞の非分画化集団の細胞の増殖を示し、右パネルはＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞集団を示す。
【０１１０】
本発明は、本発明の個々の態様を単に例示するものとして企図される、記載される特定の実施形態によって範囲を限定しようとするものではなく、機能上同等の方法および構成成分は本発明の範囲内である。実際、前述の説明および添付の図面から、当業者には、わずかな日常的実験を用いれば、本明細書に示し、記載したものの他にも、本発明の様々な改変は明らかになるであろう。そのような改変や等価物は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０１１１】
本明細書において言及した全ての出版物、特許、および特許出願は、各個々の出版物、特許、または特許出願が、特に、かつ個々に、本明細書に参照として組み入れられるように示されるがごとく、本明細書において本明細書中に同程度に参照として組み入れられる。
【０１１２】
本明細書における参考文献の引用または考察は、このようなものが本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈してはならない。
【０１１３】
参照
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【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全文が本明細書に参照として組み入れられる、２００６年９月２９日出願の米国特許出願第６０／８４７，９１２号、および２００７年９月１８日出願の米国特許出願第６０／９７３，３９２号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ワクチンの分野のもの、詳細にはノロウイルスのワクチンの分野のものである。さらに、本発明は、ワクチン組成物を調製する方法、および免疫原性反応を誘発する方法に関する。
【０００３】
（政府支援の陳述）
本発明は、契約番号ＤＡＭＤ１７−０１−Ｃ−０４００およびＷ８１ＸＷＨ−０５−０１３５の下で、米国陸軍医学研究及び材料司令（United States Army Medical Research and Material Command）からの政府支援を受けてもたらされたものである。政府は、本発明に対してある種の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
ノロウイルスは、非細菌性胃腸炎の集団発生の唯一の最も重要な原因として出現した、培養不可能なヒトカリシウイルスである（Ｇｌａｓｓら、２０００年、Ｈａｒｄｙら、１９９９年）。ノロウイルスの臨床上の重要性は、高感度の分子診断アッセイの開発前は過小評価されていた。プロトタイプの遺伝子型Ｉノーウォークウイルス（ＮＶ）ゲノムのクローニングおよび組換えバキュロウイルス発現系からのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成により、広範なノロウイルス感染を明らかにするアッセイが開発された（Ｊｉａｎｇら、１９９０年、１９９２年）。
【０００５】
ノロウイルスは、非分節型（non-segmented）ＲＮＡゲノムを含む、１本鎖のポシティブセンスＲＮＡウイルスである。ウイルスのゲノムは３つのオープンリーディングフレームをコードしており、その中では後の２つが、各々大きい方のカプシドタンパク質および小さい方の構造タンパク質の生成をそれぞれ特定している（Ｇｌａｓｓら、２０００年）。真核細胞の発現系において高レベルで発現される場合は、ＮＶのカプシドタンパク質およびある種の他のノロウイルスは自己集合して、天然（native）ノロウイルスビリオンを構造的に模倣するＶＬＰになる。透過型電子顕微鏡によって観察した場合、ＶＬＰは、ヒト糞便サンプルから単離された感染性のビリオンと形態学的に区別できない。
【０００６】
ノロウイルスに対する免疫反応は複雑であり、保護作用の関連性は、今や解明されつつある。天然ウイルスで行ったヒト志願者の試験は、粘膜由来の記憶免疫反応により感染から短期の保護作用がもたらされることを実証し、ワクチン媒介性の保護作用が実現可能であることを示唆していた（Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈら、２００３年；Ｐａｒｒｉｎｏら、１９９７年；Ｗｙａｔｔら、１９７４年）。
【０００７】
ノロウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができないが、ＶＬＰの利用可能性およびそれらが大量に生成される能力によって、ノロウイルスのカプシドの抗原のおよび構造上のトポグラフィーを規定する上でかなりの進歩がなされている。ＶＬＰはウイルスのカプシドタンパク質の真正の確証は保持しているが、感染性の遺伝物質は欠いている。その結果、ＶＬＰは、細胞受容体とのウイルスの機能的な相互作用を模倣し、それによって適切な宿主の免疫反応は誘発するが、感染を再現または引き起こす能力は欠いている。ＮＩＨと連携して、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅは、学問的な医師主導の第Ｉ相臨床試験で、ヒト志願者におけるＮＶ ＶＬＰに対する体液、粘膜、および細胞の免疫反応を試験した。経口投与したＶＬＰは安全であり、健常成人において免疫原性であった（Ｂａｌｌら、１９９９年、Ｔａｃｋｅｔら、２００３年）。他の学術的機関では、動物モデルにおける前臨床実験により、細菌外毒素アジュバントとともに鼻腔内投与した場合に、ＶＬＰに対する免疫反応の増強が実証された（Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、２００１年、Ｎｉｃｏｌｌｉｅｒ−Ｊａｍｏｔら、２００４年、Ｐｅｒｉｗａｌら、２００３年）。まとめると、これらのデータは、適切に製剤化されたＶＬＰからなるワクチンは、ノロウイルス感染に対して免疫化するための実行可能な戦略となることを示唆している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ノロウイルス抗原を含む抗原製剤およびワクチン製剤を提供する。一実施形態では、製剤は少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。ノロウイルス抗原は、遺伝子型Ｉまたは遺伝子型ＩＩのウイルス配列またはコンセンサスウイルス配列に由来し得る。ノロウイルス製剤は、抗原のペプチド、タンパク質、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。一実施形態では、ＶＬＰは変性していてよい。別の実施形態では、抗原のペプチドおよびタンパク質は、カプシドモノマー、カプシドマルチマー、タンパク質凝集体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、ノロウイルス抗原は、重量で約０．０１％から約８０％までの濃度で存在する。ノロウイルス抗原の投与量は、投与１回あたり約１μｇから約１００ｍｇまでの量で存在する。
【０００９】
別の実施形態では、ノロウイルスＶＬＰは、少なくとも１つのカプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするノロウイルス核酸配列を用いた発現系で生成した組換えのＶＬＰである。カプシドタンパク質は、ＶＰ１およびＶＰ２またはその組合せからなる群から選択される。発現系は、酵母、細菌、昆虫、哺乳動物の発現系などの組換え細胞発現系でもよく、またはバキュロウイルス感染細胞発現系でもよい。
【００１０】
さらに別の実施形態では、組成物は、貯蔵効果をもたらすことによって抗原の取込みを増強し、送達部位で抗原保持時間を増大し、または送達部位で細胞の緊密な接合を緩和することによって免疫反応を増強するように機能する送達剤をさらに含む。送達剤は生物付着剤（bioadhesive）でよく、好ましくはグリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、ウヌリン（unulin）、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、および他のムコ多糖を含む）セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸からなる群から選択される粘膜付着剤（mucoadhesive）でよい。粘膜付着剤が多糖であることが好ましい。粘膜付着剤が、キトサン、またはキトサン塩もしくはキトサン塩基などのキトサンを含む混合物であることがより好ましい。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明はアジュバントをさらに含む組成物を提供する。アジュバントは、トール様受容体（ＴＬＲ）作用薬、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、合成脂質Ａ、脂質Ａミメティックまたは類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロゾーム、コクリエート（cochleate）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、細菌外毒素などの外毒素、およびリポソームからなる群から選択される。アジュバントがトール様受容体（ＴＬＲ）作用薬であることが好ましい。アジュバントがＭＰＬ（登録商標）であることがより好ましい。
【００１２】
本発明の組成物は、液体製剤または乾燥粉末製剤として提供することができる。本発明の乾燥粉末製剤は、直径約１０から約５００マイクロメートルまでの平均粒子サイズを含むことができる。一実施形態では、組成物は抗原製剤である。別の実施形態では、組成物は、ワクチンとして投与するために製剤化される。好適な投与経路には、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、真皮下、または経皮が含まれる。特に、投与経路は筋肉内または粘膜であってよく、粘膜投与の好ましい経路には鼻腔内、経口、または膣内の投与経路が含まれる。別の実施形態では、組成物は、鼻内噴霧、点鼻薬、または乾燥粉末として製剤化され、この場合、製剤を、鼻の通路に近接して保持されまたは通路中に挿入する製剤を含む装置から鼻の通路内に速やかに沈着させることによって投与する。別の実施形態では、製剤を一方または両方の鼻孔に投与する。
【００１３】
本発明は、ノロウイルス組成物を含む抗原製剤またはワクチンを対象に投与することを含む、対象におけるノロウイルスに対する免疫反応を生じさせるための方法も提供する。一実施形態では、ノロウイルス組成物を含む抗原製剤およびワクチンは、１つ以上のノロウイルス抗原に対する抗体を産生することにおける使用を見出す。別の実施形態では、ノロウイルスのワクチン製剤を用いてノロウイルス感染症を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｉｎ ｖｉｖｏのＶＬＰ１０μｇでの鼻腔内免疫化後の、ネズミ頸部リンパ節細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。
【図２】ｉｎ ｖｉｖｏのＶＬＰ１０μｇでの鼻腔内免疫化後の、脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。
【図３】ｉｎ ｖｉｖｏのＶＬＰ２５μｇでの鼻腔内免疫化後の、脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。
【図４】ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した抗体分泌細胞（ＡＳＣ）由来のＶＬＰ特異的なＩｇＧまたはＩｇＡを示す図である。
【図５】ＥＬＩＳＡによって測定したＶＬＰ特異的なＩｇＧを示す図である。
【図６】ノーウォークＶＬＰに対する血清ＩｇＧ反応に対する効力アッセイの結果を示す図である。
【図７】抗原の液体製剤または乾燥粉末から再構成した製剤のいずれかで免疫化したマウスにおける、ノーウォークＶＬＰに対する血清ＩｇＧ反応を比較する効力アッセイの結果を示す図である。グラフは様々な製剤におけるノーウォークＶＬＰの効力対濃度を示す。
【図８】ノロウイルスＶＬＰワクチンの様々な製剤を投与後、２１日目（左パネル）および４２日目（右パネル）のウサギにおける血清ＩｇＧ反応を示す図である。
【図９】ノーウォークＶＬＰの液体製剤または乾燥粉末製剤のいずれかで鼻腔内免疫化したウサギにおける血清ＩｇＧ反応を示す図である。
【図１０】定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した乾燥粉末製剤の安定性を示す図である。回帰分析は、１年超、乾燥粉末１０ｍｇあたり全てのまたは完全ないずれかのＶＬＰμｇにおいて統計的趨勢がないことを示している。パーセント凝集は、ＳＥＣによって検出されなかったＶＬＰタンパク質は、定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された全ＶＬＰタンパク質に比べて凝集していることを仮定した計算値である。
【図１１】複数のノロウイルス抗原で腹腔内免疫化したマウスにおける、抗ノロウイルス抗体反応のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。細矢印は、ノーウォークＶＬＰだけを含む製剤でのブースター注射を示している。太矢印は、ノーウォークおよびヒューストンのＶＬＰ両方を含む製剤でのブースター注射を示している。
【図１２】ノーウォークＶＬＰ、ヒューストンＶＬＰ、またはノーウォークおよびヒューストンのＶＬＰの組合せのいずれかで腹腔内免疫化したマウスにおける抗ノロウイルス抗体反応のＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。
【図１３】マウスにおいてノーウォークＶＬＰでの鼻腔内免疫化１１４日後の、マウスにおける脾細胞（Ａ）、頸部リンパ節（Ｂ）、および骨髄（Ｃ）におけるノーウォークＶＬＰ特異的な長寿命の形質細胞の存在を示す図である。
【図１４】ノーウォークＶＬＰで鼻腔内免疫化したマウスの脾細胞における、ノーウォーク特異的記憶Ｂ細胞反応を示す図である。パネルＡは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における０日目（左グラフ）および４日目（右グラフ）のＩｇＡ抗体分泌細胞を示す。パネルＢは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における０日目（左グラフ）および４日目のＩｇＧ抗体分泌細胞を示す。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の拡大および分化のレベルを示すものである。
【図１５】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギから単離した末梢血単核細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰ特異的抗原分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における４日後のノーウォークＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１６】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギから回収した脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰ特異的抗原分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における４日後のノーウォークＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１７】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギの脛骨から回収した骨髄細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰ特異的抗原分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養における４日後のノーウォークＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。０日目にＡＳＣが存在することは長寿命の形質細胞の存在を示すものである。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１８】ノーウォークＶＬＰワクチン製剤で鼻腔内免疫化したウサギから回収した腸間膜リンパ節細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。パネルＡは、ノーウォークＶＬＰに特異的なＩｇＧポジティブ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を示す。パネルＢは、ノーウォークＶＬＰに特異的なＩｇＡポジティブＡＳＣを示す。左パネルは、０日目（組織回収日）のノーウォークＶＬＰに特異的なＡＳＣの数を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰを用いた培養物における４日後のノーウォークＶＬＰに特異的なＡＳＣの数を示す。０日目にＡＳＣが存在することは長寿命の形質細胞の存在を示すものである。０日目と４日目との間の細胞数における違いは、記憶Ｂ細胞の反応を示すものである。
【図１９】ウサギにおいてｉｎ ｖｉｖｏで鼻腔内免疫化した後の、脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的増殖アッセイを示す図である。左パネルは、非分画化の脾細胞においてノーウォークＶＬＰで再刺激したときのＴ細胞の増殖を示し、右パネルは、ノーウォークＶＬＰで再刺激したときのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ノロウイルスの抗原およびワクチンの組成物、ならびに組成物を調製する方法に関する。特に、本発明は、ノロウイルス抗原および少なくとも１つのアジュバントを含む組成物を提供する。さらに、またはあるいは、組成物は、少なくとも１つの送達剤をさらに含んでもよい。本発明は、ノロウイルス抗原に対する免疫反応を生成し、または抗体を産生するために、動物に組成物を投与する方法も提供する。
【００１６】
（ノロウイルス抗原）
本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原を含む組成物を提供する。「ノロウイルス（Norovirus）」、「ノロウイルス（ＮＯＲ）」、「ノロウイルス（norovirus）」、および本明細書における文法上の同等物は、カリシウイルス科ノロウイルス属のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、ノロウイルスは、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物の種に感染し得る、関連するポシティブセンス１本鎖ＲＮＡの非エンベロープ（nonenveloped）ウイルスの群を含むことができる。いくつかの実施形態では、ノロウイルスはヒトに急性胃腸炎を引き起こすことができる。ノロウイルスは、電子顕微鏡で観察した場合に明確な表面構造またはデコボコの変縁を有する、小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）と称することもできる。ノロウイルス内には、１５の遺伝子群を含む、核酸およびアミノ酸配列によって定義される少なくとも４つの遺伝子型（ＧＩ〜ＩＶ）が含まれる。主な遺伝子型はＧＩおよびＧＩＩである。ＧＩＩＩおよびＧＩＶは提唱されているが、一般に認められている。代表的なＧＩＩＩは、ウシのイエナ（Jena）株である。ＧＩＶは、現時点では１つのウイルスであるアルファトロン型を含んでいる。ノロウイルスのさらなる記載は、Ｖｉｎｊｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、４１巻、１４２３〜１４３３頁（２００３年）を参照されたい。「ノロウイルス」は、本明細書における組換えのノロウイルスウイルス様粒子（ｒＮＯＲ ＶＬＰ）も意味する。いくつかの実施形態では、組換えのノロウイルスＶＬＰは、少なくとも１つのカプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするノロウイルス核酸配列を用いた発現系において生成される。他の実施形態では、細胞におけるＯＲＦ２によってコードされる少なくともノロウイルスのカプシドタンパク質の組換えの発現、例えばＳｆ９細胞においてバキュロウイルスのベクターからの発現は、カプシドタンパク質のＶＬＰへの自発的な自己集合をもたらすことができる。さらに他の実施形態では、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２によってコードされる少なくともノロウイルスのタンパク質の組換えの発現、例えばＳｆ９細胞においてバキュロウイルスのベクターからの発現は、カプシドタンパク質のＶＬＰへの自発的な自己集合をもたらすことができる。ノロウイルス核酸配列は、様々なノロウイルス株、あるいは収量もしくは安定性を増強するように、またはコードされる抗原の抗原性もしくは免疫原性の性質を改善するように改変された合成構築物を含むコンセンサス配列であってもよい。ＶＬＰは、構造的にノロウイルスに類似しているが、ウイルスのＲＮＡゲノムを欠いており、それゆえ感染性ではない。したがって、「ノロウイルス」は、不完全な粒子を含む、感染性または非感染性の粒子であり得るビリオンを含む。
【００１７】
ノロウイルスの非限定的な例には、ノーウォークウイルス（ＮＶ、ジーンバンク Ｍ８７６６１、ＮＰ０５６８２１）、サザンプトンウイルス（ＳＨＶ、ジーンバンク Ｌ０７４１８）、デザートシールドウイルス（ＤＳＶ、Ｕ０４４６９）、ヘッセウイルス（ＨＳＶ）、チバウイルス（ＣＨＶ、ジーンバンク ＡＢ０４２８０８）、ハワイウイルス（ＨＶ、ジーンバンク Ｕ０７６１１）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ、ジーンバンク Ｕ７００５９）、トロントウイルス（ＴＶ、Ｌｅｉｔｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４１巻、８６５〜８７５頁）、ブリストルウイルス（ＢＶ）、イエナウイルス（ＪＶ、ＡＪ０１０９９）、メリーランドウイルス（ＭＶ、ＡＹ０３２６０５）、セトウイルス（ＳＶ、ジーンバンク ＡＢ０３１０１３）、キャンバーウェル（ＣＶ、ＡＦ１４５８９６）、ローズスデールウイルス（ＬＶ、ジーンバンク Ｘ８６５５７）、グリムズビーウイルス（ＧｒＶ、ＡＪ００４８６４）、メキシコウイルス（ＭＸＶ、ジーンバンク Ｕ２２４９８）、ボクサー（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、ヒューストンウイルス（ＨｏＶ）、ミネルバ株（ＥＦ１２６９６３．１）、ローレンス株（ＥＦ１２６９６６．１）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、パリスアイランド（ＰｉＶ；ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、およびオペレーションイラクフリーダム（Operation Iraqi Freedom）（ＯＩＦ、ＡＹ６７５５５４）が含まれる。核酸、および対応するアミノ酸配列の各々は、その全てが参照により全て組み入れられる。いくつかの実施例では、暗号を同定の目的に用いることができ、組織化される：それからウイルスが単離される宿主の種／属の略語／種の略語／株名／発生年／起源の国（Ｇｒｅｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ、「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、１巻、８４１〜８７４頁（ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ編集長、第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００１年）。ある実施形態では、遺伝子型Ｉ．１（ノーウォークウイルス）およびＩＩ．４（ヒューストンウイルス）などのノロウイルスの遺伝子型の組合せ、または他の一般的に流通している株、またはそれらの組合せもしくは部分を表す合成構築物の使用が好ましい。ノロウイルスの新規な株は、日常的に同定されており（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ、５６巻（３３）、８４２〜８４６頁（２００７年））、２つ以上のウイルス株のコンセンサス配列を用いてノロウイルス抗原をまた発現してもよい。
【００１８】
ノロウイルス抗原は、ペプチド、タンパク質、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態であってよい。好ましい実施形態では、ノロウイルス抗原はＶＬＰを含む。本明細書で用いる場合、「ウイルス様粒子またはＶＬＰ」は、ノロウイルスのカプシドタンパク質コード配列から生成され、感染性のノロウイルス粒子のこれらに類似の抗原の特徴を含む、ウイルス様粒子、フラグメント、凝集体、またはそれらの部分を意味する。ノロウイルス抗原は、カプシドモノマー、カプシドマルチマー、ＶＬＰのタンパク質もしくはペプチドフラグメント、または凝集体もしくはそれらの混合物の形態であってもよい。ノロウイルス抗原のタンパク質またはペプチドは、当技術分野で知られている方法を用いて生成された、変性した形態であってもよい。
【００１９】
ノロウイルス抗原は、本発明のＶＬＰ上で、またはＶＬＰにおいて発現された、前記カプシドタンパク質の変異体またはそのフラグメントを含んでもよい。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列における変更を含むことができる。ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、参照配列に関して１つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を意味する。変異体は「保存的な」変化を有していてよく、この場合置換されたアミノ酸は類似の構造上のまたは化学的な性質を有する（例えば、イソロイシンでのロイシンの置換）。あるいは、変異体は「非保存的な」変化を有することができる（例えば、トリプトファンでのグリシンの置換）。類似のマイナーな変異体は、アミノ酸の欠失もしくは挿入、または両方を含むこともできる。生物学的または免疫学的活性を排除せずに、どのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失することができるかを決定する手引きは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアなど、当技術分野ではよく知られているコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。
【００２０】
クローニング、突然変異など、本発明に適用可能である分子生物学の技術を記載している一般的な教科書には、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００年（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる。これらの教科書には、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、ならびに、例えばノロウイルスのカプシドタンパク質のクローニングおよび突然変異に関する他の多くの関連の話題が記載されている。したがって、本発明は、本発明のＶＬＰ上に、またはＶＬＰにおいて発現されるタンパク質の特徴を改善または変更するための、タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の知られている方法の使用も包含する。様々なタイプの突然変異誘発を用いて、タンパク質分子をコードするコンセンサス配列を含む変異体の核酸を生成および／もしくは単離し、かつ／または本発明のＶＬＰにおける、またはＶＬＰ上のタンパク質をさらに修飾する／突然変異させることができる。これらには、それだけには限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異、相同的組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップを有する２本鎖ＤＮＡ（gapped duplex DNA)を用いた突然変異誘発などが含まれる。さらなる好適な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全体の遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復などが含まれる。
【００２１】
本発明のＶＬＰは、当技術分野では標準の方法を用いて、ＶＰ１および／もしくはＶＰ２タンパク質などの全長のノロウイルスカプシドタンパク質またはある種のＶＰ１もしくはＶＰ１誘導体のいずれかから形成することができる。あるいは、ＶＬＰを形成するために用いられるカプシドタンパク質は、切断されたカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、例えば、少なくとも１つのＶＬＰは切断されたＶＰ１タンパク質を含む。他の実施形態では、全てのＶＬＰは切断されたＶＰ１タンパク質を含む。切断は、Ｎ−またはＣ−末端切断であってよい。切断されたカプシドタンパク質は、機能的なカプシドタンパク質誘導体であることが好適である。機能的なカプシドタンパク質誘導体は、全長のカプシドタンパク質からなるＶＬＰによって生じる免疫反応と同じ方法で、免疫反応（必要な場合には、好適にアジュバント化されている場合）を生じさせることができる。
【００２２】
ＶＬＰは、大きい方のＶＰ１タンパク質および／または小さい方のＶＰ２タンパク質を含むことができる。各ＶＬＰは、１価ＶＬＰを生じるたった１つのノロウイルス遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含むことが好ましい。本明細書で用いられる「１価」の用語は、抗原タンパク質が単一のノロウイルス遺伝子型に由来することを意味する。例えば、ＶＬＰは、遺伝子型Ｉのウイルス株由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含む（例えば、ノーウォークウイルス由来のＶＰ１およびＶＰ２）。ＶＬＰが、主にＶＰ１タンパク質からなることが好ましい。本発明の一実施形態では、抗原は１価ＶＬＰの混合物であり、この場合、組成物は、複数のウイルス株（例えば、ノーウォークウイルスおよびヒューストンウイルス）から取った異なるノロウイルスの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２からなるＶＬＰと混合した、単一のノロウイルスの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２からなるＶＬＰを含む。単に例示として、組成物は、ノロウイルスの遺伝子型Ｉの１つ以上の株由来の１価ＶＬＰを、ノロウイルスの遺伝子型ＩＩの１つ以上の株由来の１価ＶＬＰと一緒に含むことができる。ノロウイルスＶＬＰの混合物が、ノーウォークおよびヒューストンのノロウイルスの株からなることが好ましい。
【００２３】
しかし、本発明の代替の実施形態では、ＶＬＰは、例えば、第２のノロウイルスの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質と混合したノロウイルスの１つの遺伝子型由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含む多価ＶＬＰであってよく、この場合異なるＶＰ１およびＶＰ２タンパク質はキメラのＶＰ１およびＶＰ２タンパク質ではなく、同じカプシド構造内で一緒に会合して免疫原性のＶＬＰを形成する。本明細書で用いられる「多価」という語は、抗原タンパク質が２つ以上のノロウイルス遺伝子型に由来することを意味する。多価ＶＬＰは、２つ以上のウイルス株から取ったＶＬＰ抗原を含むことができる。単に例示として、組成物は、ノロウイルス遺伝子型Ｉの１つ以上の株由来のカプシドモノマーまたはマルチマーからなる多価ＶＬＰを、ノロウイルス遺伝子型ＩＩの１つ以上の株由来のカプシドモノマーまたはマルチマーと一緒に含むことができる。多価ＶＬＰが、ノーウォークおよびヒューストンのノロウイルスの株由来のカプシドタンパク質を含むことが好ましい。
【００２４】
組成物内の１価または多価ＶＬＰの組合せが、各ＶＬＰ型の免疫原性を阻止しないことが好ましい。特に、組み合わされた本発明のＶＬＰ組成物が、ワクチンで表されるノロウイルスの各遺伝子型による感染に対して免疫性を誘発することができるように、本発明の組合せにおけるノロウイルスＶＬＰの間に干渉が存在しないことが好ましい。組合せにおける所与のＶＬＰ型に対する免疫反応は、個々に測定した場合、同じＶＬＰ型に対する免疫反応の少なくとも５０％、好ましくは１００％、または実質的に１００％であるのが好適である。免疫反応は、例えば、本明細書の実施例で説明するように、抗体の反応によって好適に測定することができる。
【００２５】
多価ＶＬＰは、個々のカプシドタンパク質を別々に発現し、その後ＶＬＰを形成するように組み合わせることによって生成することができる。あるいは、多数のカプシドタンパク質を、１つ以上のＤＮＡ構築物から、同じ細胞内で発現させてもよい。例えば、複数のＤＮＡ構築物を、各々のベクターが異なるカプシドタンパク質をコードする、宿主細胞内に形質転換または形質移入してもよい。あるいは、共有するプロモーターまたは多数の個々のプロモーターによって制御される多数のカプシド遺伝子を有する単一のベクターを用いてもよい。適当な場合には、ＩＲＥＳエレメントをベクター内に組み入れてもよい。このような発現の戦略を用いて、同時発現されたカプシドタンパク質を、その後のＶＬＰ形成用に同時精製してもよく、またはその後精製することができる多価ＶＬＰを自発的に形成してもよい。
【００２６】
多価ＶＬＰを生成するための好ましいプロセスは、ノロウイルスの異なる遺伝子型由来の、ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質などのＶＬＰカプシドタンパク質または誘導体の調製、タンパク質の混合、および多価ＶＬＰを生成するためのタンパク質の構築を含む。カプシドタンパク質は、部分的に精製され、または混合前に精製される粗製抽出物の形態であってよい。構築された異なる遺伝子型の１価ＶＬＰを、分解し、一緒に混合し、多価ＶＬＰに再構築してもよい。タンパク質またはＶＬＰは、少なくとも部分的に精製し、その後組み合わせることが好ましい。場合により、多価ＶＬＰのさらなる精製を、構築後に行ってもよい。
【００２７】
本発明のＶＬＰは、均一かつ純粋なＶＬＰを提供するために、分解および再構築により作製するのが好適である。一実施形態では、多価ＶＬＰは、２つ以上のＶＬＰを分解し、その後再構築前のあらゆる好適な時点で、分解したＶＬＰの構成成分を組み合わせることによって作製することができる。この取り組みは、例えばいくつかの酵母菌株で起こるように、ＶＬＰが、発現されたＶＰ１タンパク質から自発的に形成する場合に好適である。ＶＰ１タンパク質の発現が自発的なＶＬＰの形成をもたらさない場合は、ＶＰ１タンパク質またはカプソメアの調製を、ＶＬＰへの構築前に組み合わせることができる。
【００２８】
多価ＶＬＰを用いる場合は、ＶＬＰの構成成分を、最終の混合したＶＬＰにおいてそれらが所望される割合で混合することが好ましい。例えば、ノーウォークおよびヒューストンウイルス（または他のノロウイルス株）からの部分的に精製したＶＰ１タンパク質の同量の混合物により、各タンパク質がおよそ等しい量で多価ＶＬＰがもたらされる。
【００２９】
多価ＶＬＰを含む組成物は、参照として本明細書に組み入れられるＷＯ９８／４４９４４、ＷＯ００４５８４１のものなど、当技術分野では知られている溶液によって安定化してもよい。
【００３０】
本発明の組成物は、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質または誘導体の他に、他のタンパク質またはタンパク質フラグメントを含むことができる。他のタンパク質またはペプチドを、本発明の組成物と一緒に投与してもよい。場合により、組成物を、非ノロウイルス抗原と製剤化し、または同時投与してもよい。これらの抗原が、他の疾患からの保護を提供することができるのが好適である。
【００３１】
ＶＰ１タンパク質または機能上のタンパク質誘導体は、ＶＬＰを好適に形成することができ、ＶＬＰの形成は、例えば、電子顕微鏡および動的レーザー光散乱などの標準の技術によって評価することができる。
【００３２】
（抗原の調製）
本発明の抗原分子を、それらが天然に存在する生物体から単離および精製することによって調製することもでき、またはそれらを組換え技術によって調製することもできる。ノロウイルスＶＬＰ抗原を、Ｓｆ９またはＨ５細胞などの昆虫細胞から調製することが好ましいが、大腸菌または酵母菌の細胞（例えば、出芽酵母（S.cerevisiae）、分裂酵母（S.pombe）、ピキアパストリ（Pichia pastori）、もしくは他のピキアの発現系）などのあらゆる好適な細胞、ＣＨＯもしくはＨＥＫなどの哺乳動物細胞の発現系も用いてもよい。組換え法によって、または合成によって調製する場合は、ペプチドを構成するアミノ酸の１つ以上の挿入、欠失、逆位、または置換がなされていてよい。上述の抗原は各々、実質的に純粋な状態で用いることが好ましい。
【００３３】
昆虫細胞の培養でノロウイルスＶＬＰを生成する手順は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６９４２８６５号に先に開示されている。簡潔に述べると、ウイルスのカプシド遺伝子（ＯＲＦ２）および小さい方の構造遺伝子（ＯＲＦ３）を含むゲノムの３’終端からｃＤＮＡをクローニングした。ウイルスのカプシド遺伝子を保有する組換えのバキュロウイルスを、クローニングしたｃＤＮＡから構築した。ノロウイルスＶＬＰを、Ｓｆ９またはＨ５昆虫細胞の培養物で生成した。
【００３４】
（アジュバント）
本発明は、ノロウイルス抗原と使用するためのアジュバントを含む組成物をさらに提供する。殆どのアジュバントは、抗原を速やかな異化作用から保護するように設計されている物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および免疫反応の刺激薬（例えば、百日咳菌（Bordatella pertussis）または結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のタンパク質）を含んでいる。好適なアジュバントは、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｐｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ）、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、カルシウム、鉄、または亜鉛の塩、アシル化したチロシンの不溶性懸濁液、アシル化した糖、陽イオン性または陰イオン性に誘導体化した多糖、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、ならびにＱｕｉｌ Ａなどが市販されている。
【００３５】
好適なアジュバントには、それだけには限定されないが、トール様受容体（ＴＬＲ）作用薬、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａミメティックまたは類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、およびリポソームも含まれる。アジュバントが細菌由来の外毒素ではないことが好ましい。好ましいアジュバントは、３ＤＭＰＬまたはＱＳ２１など、Ｔｈ１型反応を刺激するものである。
【００３６】
サルモネラ由来の脂質Ａの非毒性誘導体である一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）は、ワクチンのアジュバントとして開発されている強力なＴＬＲ−４作用薬である（Ｅｖａｎｓら、２００３年）。ネズミの前臨床試験では、鼻腔内のＭＰＬは分泌性および全身性の体液性反応を増強することが示されている（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら、２０００年、Ｙａｎｇら、２００２年）。これは、１２０，０００名を超える患者の臨床試験において、ワクチンのアジュバントとして安全かつ有効であることも証明されている（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００２年、２００４年）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４受容体によって自然免疫の誘発を刺激し、したがって、グラム陰性およびグラム陽性両方の細菌、ウイルス、および寄生体を含めた広範な感染性病原体に対する非特異的な免疫反応を誘発することが可能である（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００４年、Ｐｅｒｓｉｎｇら、２００２年）。鼻腔内製剤にＭＰＬを含めることにより、生得的な反応の速やかな誘発をもたらし、ウイルス暴露からの非特異的な免疫反応を誘発し、一方ワクチンの抗原性の構成成分によって産生される特異的な反応は増強するはずである。
【００３７】
したがって、一実施形態では、本発明は、適応性のおよび自然免疫の増強剤として、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））または３Ｄｅ−Ｏ−アシル化一リン酸化脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標））を含む組成物を提供する。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）は、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化一リン酸化脂質Ａの、４、５、または６アシル化鎖との混合物である。好ましい形態の３Ｄｅ−Ｏ−アシル化一リン酸化脂質Ａは、本明細書に参照として組み入れられる、欧州特許第０６８９４５４Ｂ１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ）に開示されている。別の実施形態では、本発明は、合成脂質Ａ、脂質Ａのミメティックまたは類似体（例えば、ＢｉｏＭｉｒａのＰＥＴ Ｌｉｐｉｄ Ａ）、またはＴＬＲ−４作用薬のように機能するように設計されている合成の誘導体を含む組成物を提供する。
【００３８】
「有効なアジュバントの量」または「有効な量のアジュバント」という用語は、当業者であれば十分理解され、投与された抗原に対する免疫反応を刺激することが可能な１つ以上のアジュバントの量、すなわち、鼻の洗浄物におけるＩｇＡレベル、血清ＩｇＧもしくはＩｇＭレベル、またはＢ細胞およびＴ細胞の増殖に関して測定して、投与した抗原組成物の免疫反応を増大する量が含まれる。免疫グロブリンレベルの好適に有効な増大には、いかなるアジュバントなしの同じ抗原組成物に比べて、５％を超える、好ましくは２５％を超える、特に５０％を超える増大が含まれる。
【００３９】
（送達剤（delivery agent)）
本発明は、限定するものではないが、宿主のムコ多糖の部分的脱水の単一効果または組合せ効果、送達剤の物理的性質、または送達剤と貯蔵効果をもたらす暴露部位の宿主の組織との間のイオン性の相互作用による液体の粘性の増大に基づく、抗原の取込みを増強するように機能する送達剤を含む組成物も提供する。あるいは、送達剤は、送達部位の抗原保持時間を増大することができる（例えば、抗原の排出を遅らせる）。このような送達剤は、生物付着剤であってよい。特に、生物付着剤は、グリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、ウヌリン（unulin）、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、および他のムコ多糖を含む）セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸からなる群から選択される粘膜付着剤であってよい。粘膜付着剤が、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基（例えば、キトサングルタメート）などの多糖であることが好ましい。
【００４０】
キトサンは、甲殻類の殻におけるキチンに由来する正に荷電した直鎖状の多糖であり、上皮細胞およびその表面を覆う粘液層の生物付着剤である。抗原のキトサンとの製剤は抗原の鼻粘膜との接触時間を増大し、したがって貯蔵効果のおかげで取込みを増大する（Ｉｌｌｕｍら、２００１年、２００３年；Ｄａｖｉｓら、１９９９年；Ｂａｃｏｎら、２０００年；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｂｂｅｎら、２００１年、２００１年；Ｌｉｍら、２００１年）。キトサンは、動物モデルおよびヒトの両方で、インフルエンザ、百日咳、およびジフテリアを含めたいくつかのワクチンに対する経鼻の送達系として試験されている（Ｉｌｌｕｍ、２００１年、２００３年；Ｂａｃｏｎら、２０００年；Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌら、１９９８年；Ｍｉｌｌｓら、２００３年；ＭｃＮｅｅｌａら、２００４年）。これらの治験では、キトサンは全身の免疫反応を、非経口のワクチン接種と等しいレベルに増強することが示されている。さらに、著しい抗原特異的なＩｇＡレベルが、粘膜性の分泌においてやはり測定された。このように、キトサンは経鼻のワクチンの有効性を大幅に増強することができる。さらに、キトサンはその物理的特徴により、粉末剤として製剤化された鼻腔内ワクチンに特によく適している（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｂｂｅｎら、２００１年；Ｍｉｋｓｚｔａら、２００５年；Ｈｕａｎｇら、２００４年）。
【００４１】
したがって、一実施形態では、本発明は、鼻腔内投与に適合される抗原またはワクチンの組成物を提供し、組成物は抗原、および任意選択で有効な量のアジュバントを含む。好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのキトサンなどの送達剤、および少なくとも１つのＭＰＬ（登録商標）などのアジュバント、ＣＰＧ、イミキモド、ガーディキモド（gardiquimod）、あるいは合成の脂質Ａまたは脂質Ａミメティックもしくは類似体などの送達剤と組み合わせた、ノロウイルスＶＬＰなどのノロウイルス抗原を含む抗原またはワクチンの組成物を提供する。
【００４２】
キトサンの分子量は１０ｋＤａと８００ｋＤａとの間、好ましくは１００ｋＤａと７００ｋＤａとの間、より好ましくは２００ｋＤａと６００ｋＤａとの間であってよい。組成物におけるキトサンの濃度は、典型的には最高約８０％（ｗ／ｗ）であり、例えば、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、または８０％である。キトサンは、少なくとも７５％脱アセチル化されていることが好ましく、例えば、８０〜９０％、より好ましくは８２〜８８％脱アセチル化されており、特定の例では８３％、８４％、８５％、８６％、および８７％脱アセチル化されている。
【００４３】
（ワクチンおよび抗原製剤）
本発明の組成物を、ワクチンまたは抗原製剤として投与するために製剤化することができる。本明細書で用いられる場合、「ワクチン」という用語は、上記に記載したような本発明のノロウイルスＶＬＰまたは他のノロウイルス抗原を含む製剤、脊椎動物に投与するのが可能である形態における製剤、および感染を軽減するために、かつ／または感染の少なくとも１つの症状を低減するために、かつ／または別の投与量のＶＬＰもしくは抗原の有効性を増強するために治療上の免疫を誘発するのに十分な免疫反応を誘発する製剤を意味する。本明細書で用いられる「抗原製剤（antigenic formulation)」または「抗原組成物」という用語は、哺乳動物などの脊椎動物に投与した場合に免疫反応を誘発する製剤を意味する。本明細書で用いられる「免疫反応」という用語は、体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応の両方を意味する。体液性免疫反応は、例えば、感染性物質を中和し、感染性物質が細胞に入るのを阻止し、前記感染性物質の複製を阻止し、かつ／または宿主細胞を感染および破壊から保護するＢリンパ球による抗体の生成の刺激を伴う。細胞媒介性免疫反応は、脊椎動物（例えばヒト）が表す、感染を防止もしくは軽減し、または少なくとも１つのその症状を低減する、Ｔリンパ球および／またはマクロファージなどの他の細胞によって媒介される感染性物質に対する免疫反応を意味する。ワクチン製剤は、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ．編集）（１９９５年）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に概ね記載されている。本発明の組成物は、例えば、経口の、胃腸の、および呼吸器（例えば、鼻の）粘膜の１つ以上に送達するために製剤化することができる。
【００４４】
組成物を呼吸器（例えば、鼻の）粘膜に送達することが企図される場合、典型的には、これをエアロゾルまたは点鼻薬として投与するための水溶液として製剤化し、あるいは、例えば、鼻道内に速やかに沈着させるための乾燥粉末として製剤化する。点鼻薬として投与するための組成物は、例えば、保存剤、粘度調整剤、等張化剤、緩衝剤など、通常このような組成物に含まれるタイプの１つ以上の賦形剤を含むことができる。粘度調整剤は、微結晶性セルロース、キトサン、デンプン、多糖などであってよい。乾燥粉末として投与するための組成物は、例えば、粘膜付着剤、増量剤、および適当な粉末の流動およびサイズの特徴を送達するための物質など、このような組成物に通常含まれる１つ以上の賦形剤も含むことができる。増量剤および粉末流動剤およびサイズ剤には、マンニトール、ショ糖、トレハロース、およびキシリトールが含まれ得る。
【００４５】
一実施形態では、本発明のノロウイルスのワクチンまたは抗原製剤を、免疫原として１つ以上のノロウイルスの遺伝子型の抗原、ＭＰＬ（登録商標）などのアジュバント、粘膜表面への接着を促進するためのキトサンなどの生体高分子、ならびにマンニトールおよびショ糖などの増量剤を含む乾燥粉末として製剤化してもよい。例えば、ノロウイルスのワクチンを、１つ以上のノロウイルスの遺伝子型の抗原（例えば、ノーウォークウイルス、ヒューストンウイルス、スノーマウンテンウイルス）、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント、キトサン粘膜接着性、ならびに増量剤としておよび適当な流動の特徴を提供するためのマンニトールおよびショ糖を含む乾燥粉末１０ｍｇとして製剤化してもよい。製剤は、キトサン約７．０ｍｇ（２５から９０％ｗ／ｗの範囲）、マンニトール約１．５ｍｇ（０から５０％ｗ／ｗの範囲）、ショ糖約１．５ｍｇ（０から５０％ｗ／ｗの範囲）、ＭＰＬ（登録商標）約２５μｇ（０．１から５％ｗ／ｗの範囲）、およびノロウイルス抗原約１００μｇ（０．０５から５％ｗ／ｗの範囲）を含むことができる。
【００４６】
ノロウイルス抗原は約０．０１％（ｗ／ｗ）から約８０％（ｗ／ｗ）までの濃度で存在することができる。一実施形態では、ノロウイルス抗原を、両方の鼻孔中に投与するために乾燥粉末製剤１０ｍｇあたり約５μｇ、約１５μｇ、および約５０μｇ（０．０２５、０．０７５、および０．２５％ｗ／ｗ）の投与量で、または一方の鼻孔中に投与するために約１０μｇ、約３０μｇ、および約１００μｇ（０．１、０．３、および１．０％ｗ／ｗ）の投与量で製剤化することができる。製剤を、各投与の間に一方または両方の鼻孔に投与することができる。免疫反応を増強するために、第１の投与の後１から１２週のブースター投与も存在し得る。ワクチンおよび抗原製剤におけるノロウイルス抗原の含量は、１μｇから１００ｍｇの範囲、好ましくは１〜５００μｇの範囲、より好ましくは５〜２００μｇ、最も典型的には１０〜１００μｇの範囲であってよい。各投与量で投与するノロウイルスの全抗原は、両方の鼻孔に投与する場合は乾燥粉末全２０ｍｇにおいて約１０μｇ、約３０μｇ、または約１００μｇのいずれかであり、または一方の鼻孔に投与する場合は乾燥粉末１０ｍｇである。乾燥粉末の特徴は、粒子の１０％未満は直径１０μｍ未満であることである。平均粒子サイズは、直径１０から５００μｍの範囲である。
【００４７】
別の実施形態では、抗原およびワクチン組成物は、対象に引き続き投与するための液体として製剤化することができる。鼻腔内投与を企図した液体製剤は、ノロウイルスの遺伝子型の抗原、アジュバント、およびキトサンなどの送達剤を含む。筋肉内（ｉ．ｍ．）または経口投与のための液体製剤は、ノロウイルス遺伝子型の抗原、アジュバント、およびバッファーを含み、送達剤（例えば、キトサン）を含まない。
【００４８】
本明細書上記に記載した抗原およびワクチン組成物は、凍結乾燥され、無水で貯蔵されてから使用に準備され、その時点で、液体製剤で用いる場合は希釈剤で再構成されることが好ましい。あるいは、組成物の様々な成分を、キットまたは装置において別々に貯蔵してもよい（あらゆるまたは全ての構成成分を凍結乾燥する）。構成成分は、乾燥製剤では凍結乾燥の形態のままでもよく、または液体製剤では再構成されていてもよく、混合してから使用または患者に別々に投与する。乾燥粉末を投与するためには、ワクチンまたは抗原製剤を、鼻腔内送達装置または局所（例えば、経皮）送達パッチ中に予め充填し、使用まで貯蔵してもよい。このような送達装置および付随する包装は、その内容物を保護し、安定性を確実にすることが好ましい。
【００４９】
抗原製剤およびワクチンの凍結乾燥は、当技術分野ではよく知られている。典型的には、凍結乾燥のプロセスの間抗原を保護するための、および望ましい特徴の粉末を得るための物質の存在下で液体の抗原を凍結乾燥する。タンパク質の抗原を凍結保護および溶解保護するために、かつ望ましい特徴の凍結乾燥したケークまたは粉末を得るために、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはラクトースなどの糖（初期濃度１０〜２００ｍｇ／ｍＬで存在する）を通常用いる。凍結乾燥した組成物は、理論的にはより安定である。噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥などの他の乾燥技術も用いることができる。殆どの製剤のプロセスの目標はタンパク質の凝集および分解を最小にすることであり、本発明者らは、凝集した抗原が存在すると、ノロウイルスＶＬＰに対する免疫反応を増強することを実証した（動物モデルにおける実施例３および４を参照されたい）。したがって、本発明者らは、凝集した抗原の完全な抗原に対する最適な比率を生成して動物モデルにおいて最大の免疫反応を誘発するために、それによって凍結乾燥プロセスの間に抗原の凝集の百分率を制御することができる方法を開発した。
【００５０】
このように、本発明は、ノロウイルス抗原製剤を作製する方法であって、（ａ）ショ糖とキトサンとの比が約０：１から約１０：１までである、ノロウイルス抗原、ショ糖、およびキトサンを含む凍結乾燥前溶液を調製することと、（ｂ）前記溶液を凍結することと、（ｃ）凍結溶液を３０〜７２時間凍結乾燥することであって、凍結乾燥最終生成物がある百分率の凝集形態の前記ノロウイルス抗原を含むこととを含む方法も包含する。凍結乾燥は、周囲の温度で行ってもよく、低温で行ってもよく、または様々な温度の循環で進めてもよい。例示のみの目的では、凍結乾燥は、例えば、−６９℃で開始し、３時間かけて−２４℃に徐々に調節し、次いでこの温度を１８時間保持し、次いで１時間かけて−１６℃に徐々に調節し、次いでこの温度を６時間保持し、次いで３時間かけて＋３４℃に徐々に調節し、最後に９時間にわたってこの温度を保持するサイクルの、一連の工程にわたって行ってよい。一実施形態では、凍結乾燥前溶液は増量剤をさらに含む。別の実施形態では、前記増量剤はマンニトールである。
【００５１】
望ましい百分率の凝集をもたらすのに適当なショ糖とキトサンとの比率は、以下の指針によって決定することができる。約２：１から約１０：１までの範囲の重量比のショ糖とキトサンとを含む凍結乾燥前混合物から、凍結乾燥前溶液濃度に応じて、約５０％から１００％までの範囲の完全なノロウイルス抗原（すなわち、０％から５０％の凝集した抗原）の凍結乾燥後物が得られる（実施例１３を参照されたい）。ショ糖とキトサンとの重量比０：１で、３０％未満の完全なノロウイルス抗原（すなわち、７０％を超える凝集した抗原）が生成される。ショ糖およびキトサンを両方とも省略し、マンニトールなどの増量剤だけを用いると、１０％未満の完全な抗原を生成する（すなわち、凍結乾燥前溶液濃度に応じて凝集した抗原の９０％を超える）。これらの指針を用いれば、当業者であれば、最適の免疫反応を生成するのに必要な望ましい量の凝集物を得るために、凍結乾燥前混合物におけるショ糖とキトサンとの重量比および濃度を調節することができる。
【００５２】
さらに、凍結乾燥前溶液にショ糖、キトサン、およびマンニトールを含んでも、長時間にわたる完全なノロウイルス抗原の安定性に負の作用はなく、すなわち、製剤における凝集した抗原／完全な抗原の比率は、約１２カ月以上の期間乾燥粉末として貯蔵した場合に増大しない（実施例１０を参照されたい）。このように、この凍結乾燥手順により、予想可能かつ制御可能な、完全なノロウイルス抗原に対する凝集体の比率を有する安定な製剤が確実となる。
【００５３】
（免疫反応を刺激する方法）
各々の抗原またはワクチン製剤の投与量における抗原の量は、重大な、有害な副作用なしに強力な免疫反応を誘発する量として選択される。このような量は、どの特異的な抗原を使用するか、投与経路、および用いるアジュバントに応じて変化する。一般には、本発明の状況では、患者に投与する投与量は、長時間にわたって患者に有益な治療反応をもたらすのに十分でなければならず、または抗原に特異的な抗体の生成を誘発するのに十分でなければならない。したがって、特異的な抗原に対する免疫反応を誘発するのに、かつ／または疾患もしくは感染症からの症状および／もしくは合併症を軽減し、低減し、もしくは治療するのに十分な量の組成物を患者に投与する。これを遂行するのに十分な量を、「治療上有効な投与量」と定義する。
【００５４】
実質的に純粋な形態のノロウイルス抗原では、各投与量は、製剤における各ノロウイルス抗原に対して、約１μｇから１０ｍｇ、好ましくは約２〜５０μｇを含むことが予想される。本発明の抗原製剤を使用する典型的な免疫化計画では、製剤を、各投与量が各抗原１〜１００μｇを含む、いくつかの投与量（例えば、１〜４投与量）で投与することができる。投与量は、組成物が生成する免疫学的活性および患者の状態、ならびに治療する患者の体重または体表面積によって決定する。投与量のサイズは、特定の患者における特定の組成物の投与に付随し得る、あらゆる有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【００５５】
本発明の抗原およびワクチン製剤を、非粘膜の、または粘膜の経路によって投与してもよい。これらの投与には、非経口の注射（例えば、静脈内、皮下、および筋肉内）によるｉｎ ｖｉｖｏの投与、または、バッカル／舌下、直腸、経口、経鼻、局所（例えば、経皮および目薬）、膣内、肺内、動脈内、腹腔内、眼内、もしくは鼻腔内の経路などの他の伝統的な直接経路、あるいは直接特定の組織内が含まれ得る。あるいは、本発明のワクチンを、経口、局所、皮下、粘膜、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、経皮、真皮下、皮内などの様々な経路のいずれかによって、および坐剤によって投与してもよい。投与は、単に、パッチ、針、カテーテル、または関連の装置を用いた直接投与によって、単一の時間点で、または複数の時間点で遂行してもよい。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の抗原およびワクチン製剤を、粘膜表面に投与する。粘膜表面による免疫化は、他の免疫化の経路に勝る多くの潜在的な利点を提供する。最も明らかな利点は、１）粘膜の免疫化は、投与に針または高度な訓練を受けた人員を必要とせず、２）免疫反応が、病原体が侵入した部位で、および全身的に生じることである（Ｉｓａｋａら、１９９９年；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら、１９９７年；Ｍｅｓｔｅｃｋｙら、１９９７年；Ｗｕら、１９９７年）。
【００５７】
さらなる一態様では、本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原、少なくとも１つの有効なアジュバント、および／または少なくとも１つの送達剤を含む抗原またはワクチン組成物を、患者の粘膜表面に投与（好ましくは、鼻腔内または経口）することによって、ＩｇＡの粘膜性の免疫反応およびＩｇＧの全身の免疫反応を誘発する方法を提供する。
【００５８】
本発明は、本明細書上記に定義したノロウイルス抗原、および本明細書上記に定義した少なくとも１つのアジュバント、または少なくとも１つの送達剤の鼻腔内製剤を投薬するための手段の提供も企図するものである。投薬装置は、例えば、エアロゾルの送達系の形態をとってよく、単回投与量のみまたは多数の投与量を投薬するように配列されていてよい。このような装置は、定量のワクチンまたは抗原製剤を鼻道に送達する。適当な装置の他の例には、それだけには限定されないが、ドロッパ、スワブ、エアロゾライザー（aerosolizer）、空気吸入器（例えば、Ｖａｌｏｉｓ Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｂｅｓｐａｋ ＵｎｉＤｏｓｅ ＤＰ）、ネブライザー、および吸入器が含まれる。装置は、対象が鼻の孔中に製剤を吸入することを必要とする受動的な方法によって抗原性またはワクチン製剤を送達することができる。あるいは、装置は、投与量を鼻の孔中に供給または噴射することによって製剤を積極的に送達することができる。抗原製剤またはワクチンを、１つ以上のこのような装置によって一方または両方の鼻孔中に送達することができる。投与は、対象１人あたり２つの装置を含むことができる（鼻孔１つにつき１装置）。有効成分（ノロウイルス抗原）の実際の投与量は、約５〜１０００μｇである。好ましい実施形態では、抗原またはワクチン製剤を、鼻の通路近くに保持し、または通路内に挿入した製剤を含んでいる装置から鼻の通路内に速やかに沈着させることによって、鼻粘膜に投与する。
【００５９】
本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原に対する抗体を産生する方法も提供し、前記方法は、上記に記載した本発明のワクチンまたは抗原製剤を対象に投与することを含む。これら抗体は、当技術分野における日常的な方法によって、単離および精製することができる。ノロウイルス抗原に特異的な単離抗体を、診断上の免疫学的アッセイの開発に用いることができる。これらのアッセイを用いて、臨床サンプルにおいてノロウイルスを検出し、感染を引き起こす特定のウイルス（例えば、ノーウォーク、ヒューストン、スノーマウンテンなど）を同定することができる。あるいは、単離した抗体を、ノロウイルスウイルス感染が疑われる対象に投与して、受動免疫または短期免疫を付与することができる。
【００６０】
上記に記載したように、本発明のワクチン製剤を対象に投与してノロウイルス感染の症状を治療することができる。ノロウイルス感染の症状は、当技術分野ではよく知られており、悪心、嘔吐、下痢、および胃痙攣が含まれる。さらに、ノロウイルスに感染した患者は、低度の発熱、頭痛、悪寒、筋肉痛、および疲労感を有することがある。本発明は、ノロウイルス感染に付随する少なくとも１つの症状を緩和および／または低減するように、本発明のワクチン製剤を対象に投与することによって、ノロウイルス感染を経験している対象における免疫反応を誘発する方法を包含する。症状の低減は、例えば、生活の質の評価、ノロウイルス感染またはさらなる症状の進行の減速、ノロウイルスの症状の重症度の低減、または好適なアッセイ（例えば、抗体の力価および／またはＴ細胞活性化アッセイ）を含めた、例えば、対象による自己評価によって、医師の評価によって、または好適なアッセイもしくは測定（例えば、体温）を行うことによって主観的または客観的に決定することができる。客観的な評価は、動物およびヒトの評価両方を含む。
【実施例】
【００６１】
次に、本発明を、以下の実施例に記載する特定の実施形態を参考にしてさらに詳しく説明する。実施例は、単に本発明の説明を意図するものであり、決してその範囲を制限しようとするものではない。
【００６２】
［実施例１］
（様々なノロウイルス抗原形態に対する免疫反応についての調査）
ワクチン製剤の有効性を調査するために、マイクロピペットによって液体懸濁液ワクチン製剤でマウスを鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化した。マウスに、単回のワクチン投与量のみを与えた（初回抗原刺激）。
【００６３】
実験用に、ワクチン製剤を３つ調製した。第１は１００％凝集と呼び、ＶＬＰの天然の構造を破壊し、凝集を誘発する条件下でＶＬＰを凍結乾燥することによって調製した。第２は１００％完全（intact）であり、非凍結乾燥のＶＬＰストックから１００％天然の単分散のＶＬＰを加えた、再水和した凍結乾燥のプラセボで調製した。第３の製剤は、５０／５０混合であり、先の２つの製剤を１：１の比で混合することによって、または〜５０％完全および５０％凝集のＶＬＰを産生する条件下で凍結乾燥することによって作製する。完全な天然のＶＬＰの構造上の状態および濃度を、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および紫外部（ＵＶ）吸光度によってアッセイした。製剤の全タンパク質濃度（凝集体を含む）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）溶解したタンパク質の定量的染色によって決定した。凝集／完全のパーセントを、全タンパク質に対する完全な天然ＶＬＰの比として計算した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
この実験は、様々なノロウイルスＶＬＰ製剤に対するマウスにおける免疫反応を測定するものである。マウスの群（１群あたり５匹）に、表１に示した再水和した乾燥粉末製剤を１回鼻腔内（ｉ．ｎ．）ワクチン接種した。ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量の全タンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然、単分散のＶＬＰ）、５０／５０混合（単分散および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（naive）（ＶＬＰタンパク質なし）。ｉ．ｎ．免疫化後１４日目にマウスを安楽死させ、頸部リンパ節および脾臓を回収し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの抗原特異的な細胞増殖アッセイ用に単一細胞懸濁液を調製した。これらのアッセイにおいては、頸部リンパ節細胞または脾細胞の反応をアッセイして、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化後の抗原に対する免疫原性反応を判定した。頸部リンパ節細胞または脾細胞を、天然の単分散ＶＬＰ（天然のＶＬＰ、黒線）または熱変性したＶＬＰタンパク質（ΔＶＬＰ、白線）のいずれかで再刺激し、各抗原の形態（１００％凝集、１００％完全、５０／５０混合、または無処置）からの細胞増殖の程度を、縦軸上に示すようにトリチウム標識したチミジンの取込み（ＣＰＭ）によって測定した（図１、頸部リンパ節細胞；図２、脾細胞）。
【００６６】
［実施例２］
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原特異的増殖アッセイ）
ワクチン製剤の効力をさらに調査するために、マウスを、液体懸濁液ワクチン製剤で腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化した。マウスに、単回のみのワクチンの投与量を与えた（初回抗原刺激）。
【００６７】
実施例１と同様、マウスの群（１群あたり５匹）にワクチン接種をしたが、今回は表２に示す再水和した乾燥粉末製剤を１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。繰り返すと、ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量の全タンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然、完全なＶＬＰ）、５０／５０混合（完全および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（ＶＬＰタンパク質なし）。
【００６８】
【表２】
【００６９】
このアッセイでは、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化後のＶＬＰに対する様々なネズミ細胞の反応を測定した。免疫化後１４日目にマウスを安楽死させ、脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を調製した。完全な天然のＶＬＰ（天然ＶＬＰ、点線）、または熱変性したＶＬＰタンパク質（ΔＶＬＰ、白線）のいずれかで脾細胞を再刺激し、各抗原の形態（１００％凝集、１００％完全、５０／５０混合、または無処置）からの細胞増殖の程度を、縦軸上に示すように（ＣＰＭ）トリチウム標識したチミジンの取込みによって測定した（図３）。これらのデータは、ワクチン製剤において調製した様々な生物物理学的形態のＶＬＰは、同程度のＴ細胞反応を誘発することを示している。
【００７０】
［実施例３］
（ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＶＬＰ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の反応を、実施例２に記載した様々なＮＶ−ＶＬＰ製剤で腹腔内免疫化したマウスから測定した。マウスの群（１群あたり５匹）を、表２に示した（実施例２）再水和した乾燥粉末製剤で１回ｉ．ｐ．ワクチン接種した。ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量のタンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然、完全なＶＬＰ）、５０／５０混合（完全および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（ＶＬＰタンパク質なし）。１４日目にマウスを安楽死させ、頸部リンパ節を回収した。頸部リンパ節細胞を、天然の完全なＶＬＰでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート上で一夜培養し、適当なＨＲＰコンジュゲートした２次抗体を用いて、ＩｇＧまたはＩｇＡいずれかに特異的なＥＬＩＳＰＯＴ用に発色させた（図４）。これらのデータは、３つのＶＬＰ抗原製剤は全て、抗原特異的なＢ細胞反応を誘発することを示している。１００％凝集ＶＬＰで免疫化した群は最大の免疫反応を表した。
【００７１】
［実施例４］
（ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＡ）
血清ＩｇＧレベルを、様々なＮＶ−ＶＬＰ製剤でｉ．ｐ．免疫化したマウスから測定した。マウスの群（１群あたり５匹）に、表２に示した（実施例２）再水和した乾燥粉末製剤を１回ｉ．ｐ．ワクチン接種した。ＶＬＰ含有製剤でワクチン接種した動物に、同量の全タンパク質を投与した。１００％凝集（１００％凝集したＶＬＰタンパク質）、１００％完全（１００％天然の、完全なＶＬＰ）、５０／５０混合（完全および凝集のＶＬＰの１：１混合物）、無処置（ＶＬＰタンパク質なし）。１４日目に血清を回収し、抗ＶＬＰ特異的血清ＩｇＧに対してＥＬＩＳＡによってアッセイした（図５）。これらのデータは、実施例３に示した結果と相関しており、３つのＶＬＰ抗原製剤は全て、抗原特異的なＢ細胞反応を誘発することを示している。繰り返すと、１００％凝集ＶＬＰで免疫化した群は最大の免疫反応を表した。
【００７２】
［実施例５］
（ウサギにおけるワクチン製剤）
Ｖａｌｏｉｓ Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅを用いて、ウサギに製剤を鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与した。乾燥粉末製剤を、表３および４に示す。
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【００７５】
［実施例６］
（マウスにおけるノロウイルスワクチン製剤の効力のアッセイ）
Ｃ５７Ｂ１６メスマウスを、０日目に、様々な希釈の再構成したノーウォークＶＬＰ乾燥粉末ワクチン（ノーウォークＶＬＰ、ＭＰＬ、およびキトサンを含む）で腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化した。各動物に、示した製剤１００μＬを注射した。血清を毎週回収し、血清抗ＶＬＰ ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。免疫化後３週間回収した血清に対する値を図６に示す。
【００７６】
各個体のマウスに対する値を表し、バーは群の平均値を示す。血清抗ＶＬＰ ＩｇＧ値は、示したワクチンの投与量と相関していた。この実験設計を、ヒト臨床試験用にＧＭＰ製造したワクチンの放出に必要とされる効力アッセイとして、改良し、開発した（図６）。
【００７７】
［実施例７］
（マウスにおける、液体対再構成したノロウイルス製剤の効力）
Ｃ５７Ｂ１６メスマウスを、０日目に、体積１００μＬの、キトサン、マンニトール、ＭＰＬ、および様々な濃度のノーウォークＶＬＰ（表５）を含む製剤でｉ．ｐ．免疫化した。乾燥粉末マトリックス（マンニトール、ＭＰＬ、およびキトサン）１０ｍｇ／ｍＬを純水に可溶化し、特定の量の液体ノーウォークＶＬＰを加えることによって、内部検量線を作成した（群１〜５）。一方、ＧＭＰ ＶＬＰのロットを予め凍結乾燥し、次いで純水１．０ｍｌに可溶化した（群６〜８）。１４、２１、および３０日目にマウスから血清を回収し、血清抗ノーウォークＶＬＰ ＩｇＩをＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７８】
【表５】
【００７９】
各製剤に対する相対的な効力を以下の式：Ｉｎｖ Ｌｏｇ（平均値−Ｙ切片／勾配）を用いて計算した。効力を、製剤におけるＶＬＰ濃度に対してプロットし、マトリックスのバックグラウンド中に既知量のＶＬＰを加えたものを用いて作成した検量線に関して報告する（図７）。示した結果は、３つの別々の血清回収時間点を表している。これらのデータは、乾燥粉末から再構成したノーウォークＶＬＰ製剤は、液体製剤よりも全体に高い効力を有することを示している。
【００８０】
［実施例８］
（ウサギにおける乾燥粉末製剤の効力）
ニュージーランドシロウサギのメス４３羽に、乾燥粉末中に製剤化したノーウォークＶＬＰ５μｇ（低）または２５μｇ（高）のいずれか±ＭＬＰおよび±キトサンで、Ｖａｌｏｉｓ ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化した。１群には、液体として製剤化した高投与量のＶＬＰおよびＭＰＬを投与し、筋肉内投与した（ｉ．ｍ．）。０日目および２１日目に、ウサギにワクチン接種した。ＭＬＰを用いる場合は、ＶＬＰと同じ投与量を用いた（すなわち、ノーウォークＶＬＰ５μｇおよびＭＰＬ５μｇ）。キトサンを用いる場合は、７ｍｇ／投与量であった。
【００８１】
ノーウォークのＶＬＰに特異的な血清ＩｇＧ（ＥＬＩＳＡによって決定して）を、図８に示す。各処置群に対する平均値を、２１日目（左パネル、追加免疫化の投与の直前に回収）、および４２日目（右パネル）に対して示す。値を、１Ｕを１μｇと見積もり、ＶＬＰ特異的ＩｇＧのＵ／ｍＬで報告する。標準偏差をバーによって示す。ネガティブコントロール群（ウサギ３羽）および筋肉内免疫化群（４羽）以外は、処置群の動物は全て６羽であった。これらのデータは、一般的に、ＶＬＰ投与量が高いほど、より高い血清抗ＶＬＰ ＩｇＧレベルがもたらされることを示している。特にキトサンは鼻腔内ワクチンに対する反応を増強する。ｉ．ｍ．免疫化した群は、最も大きな反応を示した。しかし、鼻腔内免疫化した群におけるＶＬＰ特異的ＩｇＧレベルは、やはりかなり強力であった。
【００８２】
［実施例９］
（ウサギに鼻腔内投与した液体対乾燥ノロウイルス製剤の効力）
ニュージーランドシロウサギのメスに、乾燥粉末または液体のいずれかに製剤化したノーウォークＶＬＰ５０μｇ＋ＭＬＰ５０μｇ＋キトサン１４ｍｇで、Ｖａｌｏｉｓ ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅを用いて鼻腔内免疫化した。ワクチンの内容は、物理的状態以外は同一であった。０日目および２１日目（０週目および３週目）に免疫化し、最初のワクチン接種後３週間および６週間に再び、追加免疫前に血清を回収した。ノーウォークＶＬＰに特異的な血清ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定し、結果を図９に示す。
【００８３】
群平均を示し、バーは標準偏差を表す。乾燥粉末免疫化群のウサギは６羽であり、液体免疫化群のウサギは１０羽であった。ネガティブコントロールを表すウサギは８羽であった。３週間では液体と乾燥粉末との免疫化群間では違いは殆んど見られなかった。しかし、最初の免疫化６週間後に、乾燥粉末製剤で免疫化したウサギは、液体免疫化群に比べて優れた血清抗ＶＬＰ ＩｇＧ反応を有していた。
【００８４】
［実施例１０］
（ノロウイルス乾燥粉末製剤の安定性）
乾燥粉末ＶＬＰ製剤の安定性を調査するために、（薬物生成物１０ｍｇあたり）遺伝子型ＩのＶＬＰ２５μｇの溶液を、ＭＰＬ２５μｇ、キトサングルタメート７００μｇ、マンニトール１．４７５ｍｇ、およびショ糖１．４７５ｍｇと混合することによってバルクの薬物生成物を調製した。溶液を凍結乾燥し、さらなるキトサングルタメート６．３ｍｇ（薬物生成物１０ｍｇあたり）と混和し、名目上１０ｍｇの乾燥粉末でＢｅｓｐａｋ ｕｎｉｄｏｓｅ装置中に充填し、乾燥剤のカプセルとともに密封したホイル袋に貯蔵した。全ＶＬＰ含量をＩｍｐｅｒｉａｌ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスキャニングデンシトメトリーを用いて測定し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて完全なＶＬＰ含量を定量した。これらの測定値は、実験誤差内では、１２カ月の期間にわたって全ＶＬＰまたは完全なＶＬＰのいずれかにおいて変化が検出されなかったことを示していた（図１０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と比べた場合、ＳＥＣによるＶＬＰタンパク質の回復が低いのは凝集のためであったと仮定すると、％凝集の計算値は時間とともに増大せず、むしろ１２カ月の貯蔵を通して一定のまま、または低減した。タンパク質にいっそう一般的な安定性の問題の一つは、貯蔵での凝集の増大である。図１０における結果に基づくと、製剤は、完全なＶＬＰの安定な百分率をもたらし、生成物を製造し、少なくとも１年間にわたって使用することができると結論付けることができる。
【００８５】
［実施例１１］
（複数のノロウイルス抗原）
Ｃ５７Ｂ１／６マウス（メス、９週齢）８匹を、キトサン０．７ｍｇ、ＭＰＬ２．５μｇ、およびマンニトール０．３ｍｇを水で０．１ｍＬにして製剤化したノーウォークＶＬＰ２．５μｇで、０日目および１４日目に腹腔内（ＩＰ）免疫化した。コントロールのマウス２匹を食塩水で免疫化した。２８日目および４９日目に、これらを、キトサン０．７ｍｇ、ＭＰＬ２．５μｇ、およびマンニトール０．３ｍｇを水で０．１ｍＬにして製剤化したノーウォークＶＬＰ２．５μｇ＋ヒューストンＶＬＰ２．５μｇで再びＩＰ免疫化した。コントロールのマウスには再び食塩水を与えた。血清サンプルを、５週目（３５日目）に開始して毎週回収し、ノーウォークＶＬＰまたはヒューストンＶＬＰとの反応性に対してＥＬＩＳＡによって分析した。ノーウォークだけの混合物で追加免疫した時間を、細矢印によって示し、ノーウォーク＋ヒューストンＶＬＰ混合物で追加免疫した時間を太矢印で示す。Ｕ／ｍＬ（１ＵをＩｇＧ１μｇに近似させる）における、ノーウォークＶＬＰ（上パネル）およびヒューストンＶＬＰ（下パネル）に特異的な個々の血清ＩｇＧ反応を示す。平均値をバーによって示す。抗ノーウォーク反応は、０日目および１４日目（０週目および２週目）の先の２回の免疫化によって非常に強力であったので、Ｙ軸のスケールが異なることに留意されたい。しかし、ヒューストンＶＬＰに対する反応は極めて強力であり、追加免疫後２週目に大幅な増大が出現している。これらのデータは、同じ免疫化混合物におけるノロウイルスＶＬＰの様々な抗原株に対して特異的な免疫反応が産生され得ることを実証するものである（図１１）。
【００８６】
［実施例１２］
（様々なノロウイルス抗原に対する免疫反応）
Ｃ５７Ｂ１６メスマウスを、０日目および１４日目に、ノーウォークＶＬＰ２５μｇ、ヒューストンＶＬＰ２５μｇ、またはノーウォークおよびヒューストンＶＬＰ各２５μｇの組合せで、腹腔内（ＩＰ）免疫化した。血清を毎週回収し、血清抗ＶＬＰ ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。免疫化後４週に回収した血清に対する値を図１２に示す。
【００８７】
免疫化のＶＬＰ含量をＸ軸上に示す。各個体のマウスに対する値を表し、バーは群平均を示す。抗体レベルをＵ／ｍＬで表し、１Ｕを血清ＩｇＧの１μｇに近似させる。左パネルにおける値は捕捉剤としてノーウォークＶＬＰを用いて決定したものであり、右パネル上の値を測定するためにヒューストンＶＬＰを用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。これらのデータは、ノーウォークＶＬＰで免疫化しても、ヒューストンＶＬＰを認識することができる血清抗体をもたらすことはなく、または逆も同じであることを示している。
【００８８】
［実施例１３］
（ショ糖およびキトサンの混合物は乾燥粉末製剤においてノロウイルスＶＬＰ構造を保存する）
以下の実験は、凍結乾燥前溶液における、ショ糖、キトサン、およびマンニトールの、単独または組合せの、凍結乾燥中の天然のノーウォークＶＬＰの４次構造に対する作用を調べたものである。表６は、対象の成分の凍結乾燥前溶液濃度、混合物の全体積、および対応する重量比を示すいくつかの実験の複合である。溶液は全て手操作で回転し、穏やかにボルテックスして均一にし、次いで液体窒素中シェル凍結し、約３０から６０時間までの範囲の時間サイドアーム付き容器を用いてユニットの外側に凍結乾燥した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
表７は、表６に示した凍結乾燥した試料の、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析の結果を示している。凍結乾燥した試料を水で再構成し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。未処理のＮＶ−ＶＬＰを同時に分析し、再構成した試験試料のＮＶ−ＶＬＰ含量を定量するための参照基準として用いた。ＵＶおよび蛍光検出器の両方を定量に用いた（示したデータは、蛍光検出器からのものである）。ＳＥ−ＨＰＬＣを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ １０−３００カラムを用いて行い、移動相はリン酸ナトリウム１０ｍＭ、クエン酸１０ｍＭ、ｐＨ５、およびＮａＣｌ５００ｍＭからなり、流速は０．５ｍＬ／分であった。溶出したピークの積分面積を用いてタンパク質濃度を定量した。「ＶＬＰ」は、約１５分にカラムから溶出したピークであり、あらゆる先行するショルダーおよび／またはピークテイルは同時に分析した参照基準のＮＶ−ＶＬＰのおよその溶出時間ウインドウ内にあった。約３２分にカラムから溶出したＶＬＰフラグメントは、ＶＬＰの不安定化および結果としての分解に起因する高度に安定な単一の種である。中間体およびより小さなフラグメントは観察されなかった。
【００９１】
結果は、ショ糖およびキトサンの組合せは、最高の（約１００％の回復）凍結乾燥後物（試料ＬＧ１０−ＬＧ１２）を含む、広範囲の天然の単分散ＮＶ−ＶＬＰの回復をもたらすことを示していた。さらに、これらのサンプルからのＮＶ−ＶＬＰ溶出ピークの形状は、未処理のＮＶ−ＶＬＰの参照基準と同一であり、天然構造が高度に保存されていたことを示していた。ショ糖のみを含む試料は、参照基準に類似のピークの形状を表したが、ＮＶ−ＶＬＰ回復は低かった（約６０％の回復（試料ＬＧ１３））。マンニトールのみを含む試料は、ＶＬＰの殆んど完全な凝集をもたらした（試料ＬＥ１−ＬＥ６およびＬＩＧ１ｄ−Ｓ３）。ＮＶ−ＶＬＰ構造に対するマンニトールの有害作用は、キトサンおよびショ糖の存在によって対抗された（試料ＬＩＧ１ｄ−Ｓ２およびＬＩＧ１ｄ−ＳＢ）。
【００９２】
【表７】
【００９３】
［実施例１４］
（鼻腔内免疫化したマウスにおけるノロウイルス特異的長寿命形質細胞および記憶Ｂ細胞の誘発）
Ａ．ノーウォークＶＬＰ特異的長寿命形質細胞
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ノロウイルスＶＬＰおよびアジュバントで鼻腔内免疫化した。無処置のコントロールにはアジュバント単独を投与した。免疫化１１４日後、両群のマウスから脾臓、頸部リンパ節、および骨髄を収集した。組織を収集した日（０日目）、細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて抗原特異的な抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の存在に対してアッセイした。結果を、様々な組織に対して図１３Ａ〜Ｃに表す。これらの組織において免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ）が検出されると、ノロウイルス特異的長寿命形質細胞の存在が示される。
【００９４】
Ｂ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞
ノーウォークＶＬＰで鼻腔内免疫化したマウスからノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞の存在を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを開発した。様々なリンパ組織、または全血（末梢血単核細胞、脾細胞、リンパ節細胞など）を、このアッセイを用いて記憶Ｂ細胞の存在に対してアッセイすることができる細胞の供給源として使用することができる。
【００９５】
この実験では、免疫化した動物および無処置の動物（コントロール）から脾臓を収集および処理し、脾細胞を、ノーウォークＶＬＰ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下（コントロール）で４日間培養した。組織を収集する日（０日目）に最初のＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行ってＡＳＣ（上記セクションＡを参照されたい）のバックグラウンドレベルを確立した。培養４日後、細胞を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで再びアッセイしてＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を定量した。０日目と４日目のアッセイとの間のＶＬＰ特異的ＡＳＣの数における違いが、抗原特異的記憶Ｂ細胞の集団を表している。この実験の結果を、図１４ＡおよびＢに示す。
【００９６】
［実施例１５］
（ウサギにおけるノロウイルス記憶Ｂ細胞反応）
ニュージーランドシロウサギのメス２羽を、Ｖａｌｏｉｓ Ｍａｒｋ４鼻腔内送達装置中に充填した乾燥粉末１０ｍｇあたりノーウォークＶＬＰ２５μｇ、ＭＰＬ２５μｇ、マンニトール１．５ｍｇ、ショ糖１．５ｍｇ、およびキトサン７．０ｍｇからなる乾燥粉末製剤で鼻腔内免疫化した。ウサギ２羽には、１４日間隔で全３回の免疫化を与えた。この実験では、非免疫化のメスウサギを無処置のコントロールとして用いた。
【００９７】
Ａ．ウサギ組織の回収および処理
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）：凝固を防ぐためにＥＤＴＡを含む採血管に、ウサギから全血（〜５０ｍＬ）を得た。全血を滅菌Ｄ−ＰＢＳで１：３に希釈し、希釈した全血〜３５ｍＬを、５０ｍＬ滅菌遠心管中のリンパ球分離液１５ｍＬ上に重層した。管を室温で２０分間、８００×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを含むバフィーコート層を、５ｍＬ滅菌ピペットを用いて注意深く除去し、細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。必要に応じて、汚染性の赤血球をＡＣＫ溶解によって除去した。細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０−１０％ＦＢＳ（１６４０−Ｃ）に再懸濁し、トリパン排除法を用いて血球計算機で計数した。
【００９８】
腸間膜リンパ節細胞：各ウサギを安楽死させた後、別々に、リンパ節を無菌的に回収した。組織を、〜１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０−無血清（１６４０−ＮＳ）を含むプラスチック製滅菌ペトリ皿に維持した。リンパ節を、滅菌乳棒を用いて滅菌網目スクリーンを押して通過させて組織を分散させ、リンパ節細胞の単一細胞懸濁液を得た。細胞を回収し、１６４０−ＮＳで２回洗浄し、最後に７０μｍの滅菌ろ紙を通してろ過して凝集塊および残骸を除去した。細胞を１６４０−Ｃに再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。
【００９９】
脾細胞：安楽死後、各ウサギから脾臓を無菌的に得た。脾臓を１６４０−ＮＳ約１０ｍＬを含む滅菌ペトリ皿に配置した。２２ゲージの滅菌針およびシリンジを用いて、培地を組織中に繰り返し注入して脾皮膜を破壊し、細胞を浮遊させた。次いで、滅菌ピンセットを用いて残りの組織フラグメントを細かく裂いて引き離した。ペトリ皿の内容物を滅菌遠心管に移し、細胞懸濁液および破壊した脾臓組織を６〜８分間寝かせて、大きな組織フラグメントを沈澱させた。単一細胞の懸濁液を第２の滅菌遠心管に移し、細胞を１６４０−ＮＳで１回洗浄した。脾細胞製剤における赤血球を、ＡＣＫ溶解（ＡＣＫバッファー８ｍＬ、８分、室温）によって除去し、細胞を１６４０−ＮＳでもう１回洗浄し、最後に７０μｍの滅菌ろ紙を通してろ過して凝集塊および残骸を除去した。最終の細胞ペレットを１６４０−完全培地に再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。
【０１００】
骨髄細胞：安楽死後、個々のウサギから下腿における脛骨を除去した。骨髄細胞を除去するには、骨鋸を用いて骨の終端を無菌的に切り落とし、骨の内容物を、１６４０−ＮＳ培地を繰り返し注入することによって流し出した。骨髄細胞をピペットで繰り返し吸い上げ、吐き出して、細胞の凝集塊をばらばらにし、分散させた。細胞を１６４０−ＮＳで１回洗浄し、赤血球をＡＣＫで溶解し、細胞を１６４０−ＮＳでもう１回洗浄した。最後に、細胞を７０μｍの滅菌ろ紙を通してろ過して凝集塊および残骸を除去した。最終の細胞ペレットを１６４０−完全培地に再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。
【０１０１】
Ｂ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＶＤＦフィルタープレートを予め湿潤し、洗浄した後、４０μｇ／ｍｌの濃度の天然ノーウォークＶＬＰの滅菌溶液で最終体積５０μｌ／ウェルにコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベートし、Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、１６４０−Ｃを添加してブロックした。免疫化したウサギからの、および無処置のコントロールのウサギからの、腸間膜リンパ節細胞、脾細胞、および骨髄細胞を、様々な濃度で（１×１０６、５×１０５、２×１０５、および１×１０５細胞／ウェル）ウェルに加え、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで徹底的に洗浄し、ウサギＩｇＧおよびＩｇＡに特異的な２次試薬をウェルに加え、室温でさらに２時間インキュベートした。広範に洗浄した後、プレートをＤＡＢクロマゲン（chromagen）／基質で発色させ、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーで読み取った。無処置のコントロールの動物からのウェル上に表れたスポットを、実験群から差し引いた。データを、ノーウォークＶＬＰ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）として表し、１×１０６細胞あたりで標準化した。
【０１０２】
Ｃ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞アッセイ
上記に記載した様々な組織から単離したリンパ細胞を、ノーウォークＶＬＰ（１０μｇ／ｍＬ）存在下、１６４０−Ｃ培地に１ｍＬあたり５×１０６細胞の密度で再懸濁した。細胞を１ｍＬの体積で２４ウェルプレート中、３７℃で４日間インキュベートした。ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、培養時にこれらの細胞に対して行った。培養４日後、細胞を収集し、１６４０−ＮＳ培地で２回洗浄し、１６４０−完全培地に再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いて血球計算機で計数した。細胞を、ノーウォークＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでもう１回試験した。組織収集日に行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得たデータを、０日目（バックグラウンド）のＡＳＣ活性と呼ぶ。０日目の時間点に検出されたあらゆるスポットを、活発に分泌している形質細胞または長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）と仮定した。４日間培養細胞に対して行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られたデータを４日目ＡＳＣ活性と呼び、記憶Ｂ細胞の活性を、４日目ＡＳＣ活性と０日目ＡＳＣ活性との間の違いによって表す。
【０１０３】
Ｄ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は鼻腔内免疫化したウサギの末梢血に存在する
上記に記載したノーウォークＶＬＰを含む乾燥粉末製剤ワクチンで、３回鼻腔内免疫化した最後の１４１日後、免疫化したウサギ（ＲＢ７３５、ＲＢ１４１１）２羽から全血を得た。非免疫化の無処置のウサギからも血液を得た。血液を処理して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、ＰＢＭＣをノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞アッセイ（上記セクションＣ）に配置した。結果を図１５に示す。左パネルは、組織収集時（０日目ＡＳＣ）の最初のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。右パネルは、ノーウォークＶＬＰと培養４日後のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す（４日目ＡＳＣ）。
【０１０４】
０日目のＥＬＩＳＰＯＴの結果（図１５、左パネル）は、ノーウォークＶＬＰ乾燥粉末ワクチンで最後に追加免疫した約１４０日後には、末梢血にＶＬＰ特異的形質細胞は残存しないことを図示している。図１５の右パネルは、ノーウォークＶＬＰとｉｎ ｖｉｔｒｏで４日培養したＰＢＭＣからのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。免疫化した２羽のウサギでは、おそらく記憶Ｂ細胞の亜集団であるＰＢＭＣの著しい数が、活性のＩｇＧ分泌性ノーウォークＶＬＰ特異的形質細胞に成熟する。ＩｇＡ分泌性記憶Ｂ細胞に対するアッセイを行ったが、ＰＢＭＣの集団でＩｇＧ分泌性記憶Ｂ細胞だけが検出された。予想通り、無処置の動物は抗原特異的記憶Ｂ細胞を示さなかった。このようにＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は、３回の鼻腔内免疫化の最後の後１４０＋日のウサギの末梢循環に見出された。
【０１０５】
Ｅ．ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は鼻腔内免疫化したウサギの脾臓に存在する
ワクチン免疫化した２羽のウサギ、および非免疫化のコントロールのウサギの脾臓から脾細胞を得た。ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞アッセイ（上記に記載）を、これらの細胞に対して行い、結果を図１６に示す。ＰＢＭＣの集団に観察されるように、０日目のＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、抗原特異的な形質細胞が脾臓には存在しないことが示された（図１６、左パネル）。しかし、ノーウォークＶＬＰとｉｎ ｖｉｔｒｏで４日インキュベート後は、ＩｇＧ分泌性ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞が脾細胞集団において明らかである。このように、脾臓は、鼻腔内免疫化後の記憶Ｂ細胞の遊走に対する一部位を代表している。
【０１０６】
Ｆ．ノーウォークＶＬＰ特異的長寿命形質細胞の集団は骨髄に見出されるが、記憶Ｂ細胞は存在しない
実験用ウサギの脛骨から骨髄細胞を得、長寿命形質細胞および記憶Ｂ細胞の存在に対してアッセイした。結果を図１７に表す。図１７の左パネルは、ウサギ１４１１は、骨髄に著しい集団の抗原特異的形質細胞を有していたことを示している。免疫化後、骨髄に遊走し、そこに長期間存在する形質細胞を、長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）と呼ぶ。ウサギ７３５は、高数値のＬＬＰＣを示さなかった。無処置のウサギの骨髄にはＬＬＰＣは見出されなかった。骨髄細胞を記憶Ｂ細胞アッセイで培養し、記憶Ｂ細胞の存在に対して再試験した。図１７の右パネルは、骨髄には抗原特異的記憶Ｂ細胞が本質的に存在しないことを示している。このように、長寿命形質細胞は骨髄に遊走するが、記憶Ｂ細胞はそこに見出されない。
【０１０７】
Ｇ．ＩｇＧ分泌性およびＩｇＡ分泌性ノーウォークＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞は両方とも鼻腔内免疫化したウサギの腸間膜リンパ節に存在する
実験用ウサギ全てから腸間膜リンパ節を得て、単離した細胞をＬＬＰＣおよび記憶Ｂ細胞に対してアッセイした。このアッセイからの結果を図１８Ａに示す。骨髄以外の、分析した殆どのリンパ組織と同様、腸間膜節にＬＬＰＣは見出されなかった（図１８Ａ、左パネル）。ノーウォークＶＬＰとのｉｎ ｖｉｔｒｏのインキュベート後に、非常に高い数値のＩｇＧ分泌性ＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞が、腸間膜リンパ節の集団に明らかであった（図１８Ａ、右パネル）。腸間膜リンパ節に観察された記憶Ｂ細胞の数は、アッセイした他のリンパ組織に観察されたものよりも有意に高かった。
【０１０８】
多くの研究者たちが、鼻の通路または腸などの粘膜の誘導部位を免疫化することで、いわゆる粘膜免疫反応を誘発できることを示していた。この反応は、一般的には、粘膜のリンパ組織に局在しているＩｇＡ＋Ｂ細胞およびＩｇＡ分泌性形質細胞の存在を特徴とする。この理由から、腸間膜リンパ節細胞を、また、ＩｇＡ分泌性ＬＬＰＣまたは記憶Ｂ細胞の存在に対してアッセイした。これらのアッセイからの結果を図１８Ｂに示す。繰り返すと、ＩｇＡ＋ＬＬＰＣは腸間膜リンパ節の集団には見出されなかった（図１８Ｂ、左パネル）。しかし、ＩｇＡ分泌性記憶Ｂ細胞はこの組織に検出された（図１８Ｂ、右パネル）。このように、乾燥粉末ノーウォークＶＬＰワクチン製剤での鼻腔内免疫化により、ＩｇＧ＋およびＩｇＡ＋両方の抗原特異的記憶Ｂ細胞の、腸関連のリンパ組織への遊走をもたらす粘膜免疫反応が誘発される。ノーウォークワクチン製剤での免疫化が誘発する抗原特異的記憶Ｂ細胞の生成は、ワクチンの有効性の考えられる指標である。記憶Ｂ細胞の存在は、長寿命免疫の１つのマーカーである。
【０１０９】
Ｈ．ＶＬＰ特異的ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞
免疫化したウサギから収集した脾細胞を、完全なノーウォークＶＬＰで再刺激し、細胞の増殖の度合いを、縦軸上に示すように（ＣＰＭ）トリチウム標識したチミジンの取り組みによって測定した（図１９）。左パネルは、脾細胞の非分画化集団の細胞の増殖を示し、右パネルはＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞集団を示す。
【０１１０】
本発明は、本発明の個々の態様を単に例示するものとして企図される、記載される特定の実施形態によって範囲を限定しようとするものではなく、機能上同等の方法および構成成分は本発明の範囲内である。実際、前述の説明および添付の図面から、当業者には、わずかな日常的実験を用いれば、本明細書に示し、記載したものの他にも、本発明の様々な改変は明らかになるであろう。そのような改変や等価物は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０１１１】
本明細書において言及した全ての出版物、特許、および特許出願は、各個々の出版物、特許、または特許出願が、特に、かつ個々に、本明細書に参照として組み入れられるように示されるがごとく、本明細書において本明細書中に同程度に参照として組み入れられる。
【０１１２】
本明細書における参考文献の引用または考察は、このようなものが本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈してはならない。
【０１１３】
参照
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのノロウイルス抗原および少なくとも１つのアジュバントを含む組成物。
【請求項２】
前記ノロウイルス抗原がペプチド、タンパク質、ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）、変性したＶＬＰ、カプシドモノマー、カプシドマルチマー、凝集体、またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ノロウイルス抗原がノロウイルス遺伝子型Ｉおよび遺伝子型ＩＩウイルス株からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ノロウイルスＶＬＰが、ノロウイルス核酸配列を用いた発現系で生成される組換えＶＬＰである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸配列がカプシドタンパク質をコードする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カプシドタンパク質がＶＰ１およびＶＰ２からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＬＰが１価ＶＬＰである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬＰが多価ＶＬＰである、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記多価ＶＬＰが遺伝子型Ｉおよび遺伝子型ＩＩのノロウイルスからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発現系が組換え細胞発現系またはバキュロウイルス感染細胞発現系である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞発現系が、酵母、細菌、昆虫、および哺乳動物の発現系からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
第２のノロウイルス抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１および第２のノロウイルス抗原が、異なる遺伝子型由来の１価ＶＬＰである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
送達剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記送達剤が、抗原の取込みを増強し、貯蔵効果をもたらし、または送達部位で抗原保持時間を増大するように機能する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記送達剤が生物付着剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生物付着剤が粘膜付着剤である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記粘膜付着剤が、グリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、ウヌリン、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、および他のムコ多糖を含む）、ポリイオン、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記粘膜付着剤が多糖である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記多糖が、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ノロウイルス抗原がノロウイルスＶＬＰであり、前記アジュバントがＭＰＬであり、前記送達剤がキトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントが、トール様受容体（ＴＬＲ）作用薬、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａミメティックまたは類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、およびリポソームからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アジュバントがトール様受容体（ＴＬＲ）作用薬である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントがＭＰＬである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
アジュバントが毒素アジュバントではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が液体製剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が粉末製剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が直径約１０から５００マイクロメートルまでの平均粒子サイズを有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
１つ以上の投与量の前記組成物を投与するための１つ以上の装置と組み合わせた、請求項２７に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３０】
前記１つ以上の投与量が単位投与量である、請求項２９に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３１】
前記装置が単回使用経鼻投与装置である、請求項２９に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３２】
前記組成物が前記装置に貯えられている、請求項２９に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の組成物を含む抗原製剤。
【請求項３４】
請求項１に記載の組成物を含むワクチン製剤。
【請求項３５】
前記製剤を、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、真皮下、および経皮の投与経路からなる群から選択される経路によって対象に投与する、請求項３３または３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記投与経路が筋肉内である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記粘膜の投与経路が、鼻腔内、経口、または膣内である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３８】
前記製剤が、鼻内噴霧、点鼻薬、または乾燥粉末の形態である、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
鼻の通路に近接して保持されまたは鼻の通路中に挿入される製剤の装置から鼻の通路内に速やかに沈着させることによって製剤を鼻粘膜に投与する、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
前記製剤を一方または両方の鼻孔に投与する、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記ノロウイルス抗原が約０．０１％（ｗ／ｗ）から約８０％（ｗ／ｗ）までの濃度で存在する、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約１００ｍｇまでの量で存在する、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約１ｍｇまでである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約５００μｇまでである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約１００μｇまでである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項３３に記載の抗原製剤を対象に投与することを含む、ノロウイルス抗原に対する抗体を産生する方法。
【請求項４７】
ノロウイルス感染を経験している対象における免疫反応を誘発する方法であって、請求項３４に記載のワクチン製剤を対象に投与することを含み、前記免疫反応が治療的である、方法。
【請求項４８】
ノロウイルス抗原製剤を作製する方法であって、
（ａ）ショ糖とキトサンとの質量比が約０：１から約１０：１までである、ノロウイルス抗原、ショ糖、およびキトサンを含む凍結乾燥前溶液を調製することと、
（ｂ）前記溶液を凍結することと、
（ｃ）前記凍結溶液を３０〜７２時間凍結乾燥することであって、凍結乾燥最終生成物が、ある百分率の凝集形態の前記ノロウイルス抗原を含むことと、
を含む方法。
【請求項４９】
前記凍結乾燥前溶液が増量剤をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記増量剤がマンニトールである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記凍結乾燥前溶液がマンニトールおよびノロウイルス抗原からなり、前記凝集したノロウイルス抗原の百分率が９０％を超える、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ショ糖とキトサンとの前記質量比が約２：１から約１０：１までであり、前記凝集したノロウイルス抗原の百分率が約０％から約５０％までである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ショ糖とキトサンとの前記重量比が約０：１であり、前記凝集したノロウイルス抗原の百分率が７０％を超える、請求項４８に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つのノロウイルス抗原および少なくとも１つのアジュバントを含む組成物。
【請求項２】
前記ノロウイルス抗原がペプチド、タンパク質、ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）、変性したＶＬＰ、カプシドモノマー、カプシドマルチマー、凝集体、またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ノロウイルス抗原がノロウイルス遺伝子型Ｉおよび遺伝子型ＩＩウイルス株からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ノロウイルスＶＬＰが、ノロウイルス核酸配列を用いた発現系で生成される組換えＶＬＰである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸配列がカプシドタンパク質をコードする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カプシドタンパク質がＶＰ１およびＶＰ２からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＬＰが１価ＶＬＰである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬＰが多価ＶＬＰである、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記多価ＶＬＰが遺伝子型Ｉおよび遺伝子型ＩＩのノロウイルスからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発現系が組換え細胞発現系またはバキュロウイルス感染細胞発現系である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞発現系が、酵母、細菌、昆虫、および哺乳動物の発現系からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
第２のノロウイルス抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１および第２のノロウイルス抗原が、異なる遺伝子型由来の１価ＶＬＰである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
送達剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記送達剤が、抗原の取込みを増強し、貯蔵効果をもたらし、または送達部位で抗原保持時間を増大するように機能する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記送達剤が生物付着剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生物付着剤が粘膜付着剤である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記粘膜付着剤が、グリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、ウヌリン、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、および他のムコ多糖を含む）、ポリイオン、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、およびデオキシリボ核酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記粘膜付着剤が多糖である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記多糖が、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ノロウイルス抗原がノロウイルスＶＬＰであり、前記アジュバントがＭＰＬであり、前記送達剤がキトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントが、トール様受容体（ＴＬＲ）作用薬、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａミメティックまたは類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、およびリポソームからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アジュバントがトール様受容体（ＴＬＲ）作用薬である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントがＭＰＬである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
アジュバントが毒素アジュバントではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が液体製剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が粉末製剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が直径約１０から５００マイクロメートルまでの平均粒子サイズを有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
１つ以上の投与量の前記組成物を投与するための１つ以上の装置と組み合わせた、請求項２７に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３０】
前記１つ以上の投与量が単位投与量である、請求項２９に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３１】
前記装置が単回使用経鼻投与装置である、請求項２９に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３２】
前記組成物が前記装置に貯えられている、請求項２９に記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の組成物を含む抗原製剤。
【請求項３４】
請求項１に記載の組成物を含むワクチン製剤。
【請求項３５】
前記製剤を、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、真皮下、および経皮の投与経路からなる群から選択される経路によって対象に投与する、請求項３３または３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記投与経路が筋肉内である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記粘膜の投与経路が、鼻腔内、経口、または膣内である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３８】
前記製剤が、鼻内噴霧、点鼻薬、または乾燥粉末の形態である、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
鼻の通路に近接して保持されまたは鼻の通路中に挿入される製剤の装置から鼻の通路内に速やかに沈着させることによって製剤を鼻粘膜に投与する、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
前記製剤を一方または両方の鼻孔に投与する、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記ノロウイルス抗原が約０．０１％（ｗ／ｗ）から約８０％（ｗ／ｗ）までの濃度で存在する、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約１００ｍｇまでの量で存在する、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約１ｍｇまでである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約５００μｇまでである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ノロウイルス抗原の投与量が、投与１回あたり約１μｇから約１００μｇまでである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項３３に記載の抗原製剤を対象に投与することを含む、ノロウイルス抗原に対する抗体を産生する方法。
【請求項４７】
ノロウイルス感染を経験している対象における免疫反応を誘発する方法であって、請求項３４に記載のワクチン製剤を対象に投与することを含み、前記免疫反応が治療的である、方法。
【請求項４８】
ノロウイルス抗原製剤を作製する方法であって、
（ａ）ショ糖とキトサンとの質量比が約０：１から約１０：１までである、ノロウイルス抗原、ショ糖、およびキトサンを含む凍結乾燥前溶液を調製することと、
（ｂ）前記溶液を凍結することと、
（ｃ）前記凍結溶液を３０〜７２時間凍結乾燥することであって、凍結乾燥最終生成物が、ある百分率の凝集形態の前記ノロウイルス抗原を含むことと、
を含む方法。
【請求項４９】
前記凍結乾燥前溶液が増量剤をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記増量剤がマンニトールである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記凍結乾燥前溶液がマンニトールおよびノロウイルス抗原からなり、前記凝集したノロウイルス抗原の百分率が９０％を超える、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ショ糖とキトサンとの前記質量比が約２：１から約１０：１までであり、前記凝集したノロウイルス抗原の百分率が約０％から約５０％までである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ショ糖とキトサンとの前記重量比が約０：１であり、前記凝集したノロウイルス抗原の百分率が７０％を超える、請求項４８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１０−５０５７６６（Ｐ２０１０−５０５７６６Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３０６３９（Ｐ２００９−５３０６３９）
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７９９２９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４２７８９
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（５０７０２８４７９）リゴサイト ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７９９２９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４２７８９
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（５０７０２８４７９）リゴサイト ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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