ハイブリダイゼーション検出に適する反応部などを有する流路系、該流路系を用いるハイブリダイゼーション検出装置
【課題】 反応効率がよく、しかも繰り返しの利用が可能なハイブリダイゼーション検出用の流路系及び装置を提供すること。
【解決手段】 ビーズ２が充填された反応部１１１を所定箇所に備える細管１１からなる流路系１ａであって、前記ビーズ２には、同種塩基配列を有するリンカーが固定されているとともに、該リンカーの同種塩基配列に相補結合したターゲット核酸が保持されている流路系を提供する。並びに、このような構成の流路系と、反応部１１１でのハイブリダイゼーションを検出するための検出部を備えるハイブリダイゼーション検出装置を提供する。
【解決手段】 ビーズ２が充填された反応部１１１を所定箇所に備える細管１１からなる流路系１ａであって、前記ビーズ２には、同種塩基配列を有するリンカーが固定されているとともに、該リンカーの同種塩基配列に相補結合したターゲット核酸が保持されている流路系を提供する。並びに、このような構成の流路系と、反応部１１１でのハイブリダイゼーションを検出するための検出部を備えるハイブリダイゼーション検出装置を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出に係わる技術に関する。より詳しくは、流路系に設けられた所定の反応部においてハイブリダイゼーションを進行させて、これを検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が開発され、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用されるようになり、さらには、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、テーラーメイド医療、進化の研究、法医学その他の分野において、幅広い応用が期待されている。
【０００３】
このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、固層基板上に固定された検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、対象物の存在量を定量化する。
【０００４】
ＤＮＡチップを例に挙げると、分析対象の遺伝子配列の一部をもつ一本鎖ＤＮＡ断片を予め固定しておき、試料中に、そのＤＮＡ断片と相補的な配列をもつ遺伝子が存在すると、両者は特異的に結合し（即ちハイブリダイゼーション）、二本鎖ＤＮＡを形成する。この二本鎖ＤＮＡを蛍光標識法などで検出することで、その遺伝子が試料溶液中で発現しているかどうかを判定する。異なる遺伝子配列の一本鎖ＤＮＡ断片を多数固定しておくことにより、一つの試料に対して、複数の遺伝子の発現解析を効率的に行い、あるいは、一つの遺伝子の発現解析に冗長性をもたせて解析の精度を上げることが可能である。
【０００５】
最近では、ＤＮＡチップなどにおいて、流路やキャピラリーを利用する技術が提案されている。例えば、特許文献１には、基板上に形成された流路中で相互作用分析を行うようにすることで、分析に要する液体検体の量を少量に抑えることができる技術が提案されている。また、特許文献２には、キャピラリーの周辺に光学的な検出手段を形成し、このキャピラリー自体を検出用のセルとして利用する技術が開示されている。特許文献３には、毛細管通路内で相互作用を進行させ、その流れ特性を検出する技術が開示されている。
【０００６】
これらの先行技術は、本発明との関係では特に重要ではないが、物質間の相互作用の検出技術において、細い流路を用いる一般的技術を示すことを目的として掲げる。
【特許文献１】特開２００５−０３０９０６号公報。
【特許文献２】特開平１０−１７０４２７号公報。
【特許文献３】特開０６−０９４７２２号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
基板上に反応場を形成し、この反応場内でオリゴヌクレオチドをプローブ核酸として用いる構成である既存のＤＮＡチップなどのデバイス、あるいはハイブリダイゼーション検出システムでは、基板上に設けられた反応場の空間容積が比較的大きい。このため、自然のブラウン運動に委ねられながら進行するハイブリダイゼーションの効率が悪く、ハイブリダイゼーションに要する時間が長くなるという技術的課題あった。また、基板の汚れ等のために、繰り返し利用することが難しいという技術的課題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、反応効率がよく、また繰り返しの利用が可能な新規ハイブリダイゼーション検出技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ビーズが充填された反応部を所定箇所に備える細管からなる流路系であって、充填された前記ビーズには、同種塩基配列を有するリンカーが固定されているとともに、該リンカーの同種塩基配列に相補結合したターゲット核酸が保持されている流路系、更には、この流路系が複数経路設けられているマルチ流路系を提供する。
【００１０】
なお、本発明において、「塩基配列」とは、重合している２以上の塩基を意味し、「リンカー」とは、ビーズに対してターゲット核酸を保持するために利用される所定配列の核酸である。「ターゲット核酸」とは、流路系内の反応部へ送り込まれてくる溶液中に存在するプローブ核酸との間での相補鎖形成を確認するために反応部内に待ち受けている核酸であり、本発明では、前記リンカーを介してビーズに保持されている。
【００１１】
この流路系に設けられた「反応部」は、例えば、前記ターゲット核酸の一本鎖部分と前記反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させる場として機能する。
【００１２】
なお、本発明において「プローブ核酸」とは、ハイブリダイゼーション検出に有用な情報を提供できる核酸であって、例えば、蛍光物質が標識された一本鎖核酸、あるいは放射性物質が標識された一本鎖核酸などを挙げることができ、前者では励起蛍光を検出し、後者では放射線を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００１３】
前記リンカーの同種塩基配列は、例えば、ポリＴであって、前記プローブ核酸は、例えば、このポリＴに相補結合するポリＡテール部分を有するｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、例えば、流路系へ注入された細胞を、該流路系の所定箇所で溶解することにより得られるｍＲＮＡである。なお、「ポリ」とは、塩基が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味し、「ポリＴ」とは塩基チミン（Ｔ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＡテール（poli(A)tail）」は、ｍＲＮＡの３’末端に付加されているアデニル酸残基（ＡＴＰの鎖）である。
【００１４】
また、前記プローブ核酸は、目的のハイブリダイゼーションを検出するための情報を提供できる機能を有する核酸であれば採用でき、一例を挙げれば、蛍光物質で標識されている核酸や放射性物質でラベルされた核酸である。
【００１５】
また、本発明に係る流路系では、前記反応部の下流側領域に、送液の高速化に寄与する送液促進部を設けてもよい。この送液促進部は、例えば、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が充填されている構成を採用できる。また、反応部とそれに続く送液促進部が、２以上繰り返した形態構成を採用することもできる。この送液促進部では、反応部を通過してきた物質、例えば、ハイブリダイゼーションに関与しなかったプローブ核酸や有害物質をトラップするようにしてもよい。
【００１６】
次に、上記したような構成の流路系と、該流路系の反応部に存在する前記ターゲット核酸と該反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する検出部と、を備えることを特徴とするハイブリダイゼーション検出装置を提供する。
【００１７】
該検出装置の検出部としては、プローブ核酸から発せられる情報を捕捉できる構成の検出手段を有するものであれば、特に限定されない。例えば、前記プローブ核酸にラベルされた蛍光物質を励起させるための励起光照射部と、前記反応部から得られる励起蛍光を捕捉する光ディテクタ部と、を少なくとも備えるものを採用できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、流路系の狭小な空間においてハイブリダイゼーションを進行させる構成であるので、反応効率がよく、ハイブリダイゼーション検出の高速化を達成できる。反応部の後段に送液促進部を設けることで、送液の高速化を達成できる。また、反応部のビーズは、洗浄を行うことで繰り返し利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２０】
まず、図１は、本発明に係る流路系の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００２１】
この図１に符号１ａで示す流路系は、大別して、サンプル溶液の流路となる口径５００μｍ程度の細管１１と、該細管１１の一端に形成された導入部１２と、該細管１１の他端側に形成された排出部１３と、から構成されている。なお、図１に示された矢印Ｗは、サンプル溶液の流れる方向を示している。
【００２２】
この図示された流路系１ａには、導入部１２に近接する細管１１部分の内部に微少粒径のビーズ２が多数充填されている構成である反応部１１１が、少なくとも設けられている。この反応部１１１は、ハイブリダイゼーションなどの所望の相互作用が進行する部分（領域）として機能する。
【００２３】
図２は、反応部１１１内に充填されているビーズ２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【００２４】
ビーズ２は、ポリスチレンなどの材料で形成された微少なマイクロビーズであって、その表面は、ポリＴ配列を有するリンカーＬの一末端を、化学的に結合させるのに好適な構成を備えている。
【００２５】
このビーズ２は、該ビーズ２の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたオリゴ核酸であるリンカーＬを備えている。そして、ビーズ２は、該リンカーＬのポリＴ塩基配列部分に対し、ポリＡセレクションプロセスに基づいてポリＡ部位が相補結合したターゲット核酸Ｘを保持している。なお、ターゲット核酸Ｘの好適例の一つは、ポリＡテールを有するｍＲＮＡである。
【００２６】
前記ターゲット核酸Ｘは、リンカーＬを介してビーズ２に保持された状態で、反応部１１１において待ち受けており、該反応部１１１に送液されてくるサンプル溶液中の相補的なプローブ核酸Ｙとのハイブリダイゼーションを進行するという役割を果たす。
【００２７】
図３は、ビーズ２に保持された状態のターゲット核酸Ｘの一本鎖部分に対して、プローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子が模式的に示されている。
【００２８】
この図３に示されているように、プローブ核酸Ｙには、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質Ｆ、あるいは放射性物質（図示せず）などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。
【００２９】
このようなハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、被験者の細胞から抽出されたｍＲＮＡを予めビーズ２に（リンカーＬを介して）保持しておき、このｍＲＮＡに対して、公知の疾病発現原因遺伝子に係わる塩基配列を有するプローブ核酸Ｙがハイブリダイズするか否かを判定する目的の検査などに利用できる。
【００３０】
以上のアッセイは、例えば、図４の工程図に示された方法に基づいて実施できる。具体的には、まず、流路系１を構成する細管１１の所定位置に向けて、リンカーＬが固定化されているビーズ２を充填し、カラム状の反応部１１１を形成する第一工程を行う（図４中の（１）工程）。
【００３１】
次に、ビーズ２が充填されている反応部１１１に向けて、ターゲット核酸Ｘを含む第１サンプル溶液Ｓ１を送液し（図４中の（２）工程）、さらに、ビーズ２に固定化されたリンカーＬのポリＴ配列部分に対して、前記ターゲット核酸ＸのポリＡ配列をハイブリダイゼーションさせる工程（ポリＡセレクションプロセス、図４中の（３）工程）を行う。
【００３２】
続いて、プローブ核酸Ｙを含有する第２サンプル溶液Ｓ２を反応部１１１へ向けて送液し（図４中の（４）工程）、所定温度、ｐＨ条件で所定時間、ターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙとの間のハイブリダイゼーションを進行させる（図４中の（５）工程）。そして、プローブ核酸Ｙから得られる情報（例えば、標識された蛍光物質からの励起蛍光情報）により、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００３３】
図５は、本発明に係る流路系の第２実施形態を示す図である。
【００３４】
この図５に示された第２実施形態である流路系１ｂは、反応部１１１の下流側（即ち、排出部１３側）に送液促進部１１２が設けられていることが特徴である。即ち、この流路系１ｂには、導入部１２、反応部１１１、送液促進部１１２、排出部１３が、上流側からこの順番で設けられている。
【００３５】
この送液促進部１１２は、反応部１１１へ向けて送液されてくるサンプル溶液Ｓ１、Ｓ２や洗浄用のバッファー溶液などの送液速度を促進するための役割を担う部分であって、例えば、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を充填することによって好適に形成することができる。
【００３６】
このパフュージョンクロマトグラフィー粒子の典型的なものは、貫通孔（Through pore）と称される大きなポアと吸着孔（Diffusive pore）と称される小さなポアを持っている。これにより、バッファー溶液に溶け込んだ分子は、前記貫通孔を通りぬけ、吸着孔の隅々まで運ばれる。このため、分子と充填材表面の官能基との接触面積が大きくなり、バッファーの流れと官能基との距離は充填材の粒径に関係がなく非常に小さくなる（１μｍ以下）ので、高流速で、かつ低圧の送液を行うことができる。
【００３７】
また、導入部１２や排出部１３の近傍の細管部分では、外部ポンプ等との接続のためのナットなどの諸部材が設けられることから、この部分に反応部１１１を設けると観察や測定が困難となる。しかし、送液促進部１１２を反応部１１１の下流側に設けることによって、検出・測定の対象となる反応部１１１が流路系１ｂの中央部近くに配置できるようになるので、検出が容易になるという利点が生まれる。
【００３８】
さらには、パフュージョンクロマトグラフィー粒子の種類を選択することによって、余剰物質や有害物質（例えば、放射性物質）を吸着させてトラップし、外部へ排出されないようにできるので、流路系１ｂを廃棄する時に同時に廃棄することができるという利点が生まれる。
【００３９】
以上で説明した流路系１ａ、あるいは１ｂを単独で使用してもより、多数本セットした構成のマルチ流路系（図示せず。）を採用してもよい。例えば、導入部１２を共通にして、同一のサンプル溶液を同時に多数の流路系１ａ（１ｂ）へ送液できるようにし、さらには、各流路系の反応部１１１には、異なる種類のターゲット核酸Ｘを保持させておくことによって、網羅的なハイブリダイゼーション検出を同時一斉に行うようにしてもよい。
【００４０】
次に、図６は、流路系１ａあるいは１ｂを用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００４１】
図６に示された検出部３は、ハイブリダイゼーションを蛍光検出する場合の典型的な構成を備える。反応部１１１においてハイブリダイゼーションした状態で存在するプローブ核酸Ｙには、予め蛍光物質が標識されている。
【００４２】
流路系１ａ（１ｂ）の反応部１１１へ向けて、所定波長の蛍光励起光Ｐを図示しない光源から出射して平行光に途中変換し、反応部１１１の近傍に配置されたレンズ３１によって反応部１１１へ向けて絞り込んで照射する。
【００４３】
これにより、反応部１１１内で励起された蛍光ｆを、前記レンズ３１で平行光に変換し、さらに後方に配置されたレンズ３２で絞り込み、その後方に配置された光ディテクタ３３で検出し、蛍光強度を測定する。なお、本発明に係わる検出部は、この蛍光検出手段に限定されず、プローブ核酸Ｙが提供する情報種に応じて、これを検出できる構成を採用すればよい。
【実施例１】
【００４４】
＜流路系デバイスの作製に係わる実施例＞。
まず、流路系を構成する細管として、内径０．５３ｍｍ、外径０．６８ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ（ジーエルサイエンス社製）を用意した。
【００４５】
そして、送液の下流側端部に、孔径１μｍのフィルタをセットした排出部、上流側にはフィルタをセットしない導入部を、それぞれチュービングスリーブ、フェラル、ナットを用いて取り付けた。また、上流側の導入部には、レオダイン型シリンジに対応するフィルポートを取り付け、下流側の排出部にはルアー・ロック・ニードルを取り付けた。
【００４６】
＜パフュージョンクロマトグラフィー粒子の調整＞。
パフュージョンクロマトグラフィー粒子として、POROS 20 R1（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた。これを１０％エタノール溶液に分散させて、粒子分散溶液（以下、「POROS溶液」）を調製した。
【００４７】
＜オリゴヌクレオチド結合マイクロビーズの調製＞。
次に、Streptavidin Coated Microsphere plain（Polysciences）の水溶液に、５'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジンのオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を加えて、アビジン−ビオチン結合によりオリゴｄＴが固定されたビーズ（以下、「オリゴｄＴビーズ」）を調製した。
【００４８】
＜カラム（溶液促進部と反応部）の形成＞。
流路系デバイスの排出部のルアー・ロック・ニードルにシリンジを取り付けた。POROS溶液を吸い込んだレオダイン型シリンジを、導入部のフィルポートに取り付け、ルアー・ロック・ニードルに取り付けた前記シリンジを吸引し、前記チューブ内に、パフュージョンクロマトグラフィー粒子である「POROS粒子」を注入した。
【００４９】
続いて、上記手順で調整した「オリゴｄＴ結合ビーズ」を同様の方法で、チューブ内へ注入した。これにより、送液促進部（パフュージョンクロマトグラフィー粒子充填部）と反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）の二段カラム構造を備える、図５同様の流路系デバイスを形成した。
【００５０】
次に、この流路系デバイスからルアー・ロック・ニードルとフィルポートを取り外し、蛍光顕微鏡のステージであるヒートプレート上に固定した。フェラルとナットを両側に取り付け、導入部と連結できる細管、片側のみフェラルとナットを取り付けた細管、シリンジ・ポンプ、排液瓶を用意した。
【００５１】
次に、両側にフェラルとナットを持つ細管を準備し、前記流路系デバイスの上流側の導入部に取り付けた。この細管の反対側のフェラルとナットをルアー・ロック・ニードルに取り付け、シリンジ・ポンプにセットされるシリンジと接続した。流路系デバイスの下流側には、片側のみフェラルとナットを取り付けた細管を取り付け、この細管の反対側は排液瓶に導入した。
【実施例２】
【００５２】
＜オリゴヌクレオチド溶液の調製＞。
まず、ターゲット核酸として、５'末端に蛍光色素Ｃｙ３を標識した21mer デオキシグアノシンに21merデオキシアデノシンを連結した計42merのオリゴヌクレオチド（以下「Cy3-oligo dG+oligo-dA」と表す）用意した(表１参照)。
【００５３】
【表１】
【００５４】
次に、プローブ核酸として、５'末端に蛍光色素Ｃｙ３を標識した21-merオリゴデオキシグアノシン（Cy3-oligo dG）と、これと同様に標識した21-merオリゴデオキシシチジン（Cy3-oligo dC）のオリゴヌクレオチドの２種類を用意した（表２参照）。
【００５５】
【表２】
【００５６】
用意された各オリゴヌクレオチドは、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液中５μＭ濃度に溶解した。なお、塩化ナトリウム０．５Ｍの条件では、オリゴヌクレオチド同士のハイブリッド形成が生じることが知られている（真壁和裕「バイオ実験イラストレイテッド 4 苦労なしのクローニング」第１章、第２節（秀潤社, 1997，東京））。
【００５７】
＜実験手順と結果＞。
本実験は、上記の通りの方法で作製した流路系デバイスを用いて行った。この流路系デバイスの温度制御は、ヒートプレートを用いて行った。流路系へ送り込まれる各オリゴヌクレオチド溶液の送液量は、２００μＬで送液速度は５０μ／ｍｉｎとした。ハイブリダイゼーション確認のためのＣｙ３の蛍光観察は、蛍光顕微鏡に接続された顕微分光システム（大塚電子社製）で行った。
【００５８】
本実験の各工程での反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）において測定された蛍光強度の測定結果を図７に示した。なお、この図７中では、横軸には工程を順番に示し、縦軸には各工程を実施した直後の蛍光強度値を示している。
【００５９】
まず、本実験では、上記プローブ核酸（表１参照）をデバイスへ送液する前に、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液でカラムのコンディショニングを３７℃の温度条件で行った（図７の１（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。なお、このときの送液量は８００μＬであった。この段階では、蛍光強度はほとんど測定されなかった。
【００６０】
次に、42merのターゲット核酸である「Cy3-oligo dG + oligo-dA」（表１参照）をデバイス中へ２００μＬ送液した（温度条件３７℃）。この時の蛍光強度は、図７中の２（PolyG-PolyA 37）の棒グラフに示すように、蛍光強度が０．２を超える程度に上昇した。
【００６１】
その後、３７℃の温度条件に保ち、洗浄のために８００μＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を送液した（図７の３（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。このとき、蛍光強度は低下したものの０．１強の値を示したことから、ビーズに固定されたオリゴｄＴ（リンカー）とプローブ核酸との間のポリＡセレクションを確認できた。即ち、ビーズに固定されたオリゴｄＴとターゲット核酸の３'側のoligo-dAとの間でのハイブリダイズを確認した。
【００６２】
次に、第１プローブ核酸であるCy3-oligo dG（表２参照）を含有するサンプル溶液を２００μＬ送液してみたところ（温度条件３７℃）、蛍光強度が０．１７程度に上昇した（図７の４（PolyG 37）の棒グラフ参照）。
【００６３】
しかし、次に、温度条件を３７℃に保って、８００μＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を洗浄のために送液したところ、蛍光強度は低下した（図７の５（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。この時の蛍光強度は、ターゲット核酸（表１参照）を送液した後の最初の洗浄工程後の蛍光強度と同等であった（図７参照）。これは、第１プローブ核酸Cy3-oligo dGを含有するサンプル溶液を送液した後の蛍光強度の上昇は、完全なハイブリッド形成によってもたらされたものではなく、非特異的な吸着が発生したことが原因と考えられた。
【００６４】
次に、用意した第２プローブ核酸であるCy3-oligo dCを含有するサンプル溶液を、温度条件３７℃でデバイス中へ２００μＬ送液した。このとき、再び蛍光強度は０．２５を超える程度に上昇し、先の第１プローブ核酸Cy3-oligo dGを送液した場合よりも高い値を示した（図７の６（polyC37）の棒グラフ参照）。
【００６５】
続いて、温度条件を３７℃に保ち、洗浄のため８００μＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を送液したところ、蛍光強度は低下した（図７の７（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。しかし、二回目の洗浄後の蛍光強度（図７の５の棒グラフを比較参照）よりも高かったことから、第２プローブ核酸Cy3-oligo dCが、反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）に依然として残っていることが明らかであった。
【００６６】
念のため、真壁和裕「バイオ実験イラストレイテッド4 苦労なしのクローニング」第1章，第2節（秀潤社, 1997，東京）に準拠し、ビーズへの非特異的吸着の排除に効果があると言われる0.1%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.5 M 塩化ナトリウム水溶液８００μＬを用いた洗浄を、温度条件３７℃で行った（図７の８（Wash SDS 37）の棒グラフ参照）。
【００６７】
このときの蛍光強度に殆ど変化なかった。したがって、蛍光強度の増加は、ビーズのオリゴｄＴとポリＡ部分（oligo dA部分）で相補結合している状態のターゲット核酸の一本鎖ポリＧ部分（oligodG部分）と第２プローブ核酸であるCy3-oligo dCとが、相補的なＧ-Ｃ結合を形成してハイブリダイズしたことによるものと考えられた。即ち、オリゴｄＴビーズ上に保持されたターゲット核酸（表１参照）と第２プローブ核酸（表２参照）との間のハイブリダイゼーションを確認した。
【００６８】
次に、温度条件を３７℃に保ちつつ、純水８００μＬを送液したところ、蛍光強度が激減した（図７の９（Wash Water 37）の棒グラフ参照）。これは、塩濃度の低下によりハイブリッドが１本鎖に分離し、蛍光物質Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドが送液によって廃液されたためと考えられる。
【００６９】
更に、温度条件を６５℃に昇温して純水８００μＬを送液したところ、蛍光強度は最初の洗浄工程のレベルまで低下した（図７の１０（Wash Water 65）の棒グラフ参照）。これは、その後３７℃に温度を低下させ、純水８００μＬを送液しても変わらなかった（図７の１１（Wash Water 37）の棒グラフ参照）。これは、二本鎖が完全に１本鎖に解離し、廃液されたからと考えられる。
【００７０】
以上の実験の結果から、相補的なオリゴヌクレオチドのみが流路系内でハイブリッド形成を生じることを確認した。即ち、ポリＡセレクションによりオリドｄＴビーズに保持されたターゲット核酸の一本鎖部分が、この一本鎖部分と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とハイブリダイゼーションをすることを確認できた。
【００７１】
図７に示された蛍光強度のデータに基づいて、ハイブリッド形成による蛍光量をオリゴヌクレオチドに結合している蛍光物質Ｃｙ３の吸光度で補正した結果を図８に示した。
【００７２】
この図８に示された結果から、ターゲット核酸とプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションによる補正後蛍光値（図８のpolyＣで示す棒グラフ参照）は、約０．０２である。一方、ポリＡセレクションによるリンカー（ビーズに固定されたオリゴｄＴ）とターゲット核酸との間のハイブリダイゼーションによる補正後蛍光値（図８のPolyG-PolyAで示す棒グラフ参照）は、約１．０である。したがって、ターゲット核酸とプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションは、ポリＡセレクションによるハイブリダイゼーションの２割程度であることが分かった。
【実施例３】
【００７３】
実施例１で作製した流路系デバイスを用いて、ターゲット核酸である「42mer Cy3-oligo dG +oligodA」（表１参照）の濃度を、２０μＭ、２μＭ、０．２μＭ、０．０２μＭの計４段階に変化させて、オリゴｄＴビーズ上のポリＡセレクションによるターゲット核酸の捕捉感度を検証した。
【００７４】
反応部カラムのコンディショニングは、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（温度３７℃）を、８００μＬを送液することにより行った。前記プローブ核酸の送液量は２００μＬとした。洗浄は、０．１％ＳＤＳを含む０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（温度３７℃）を、８００μＬを送液することにより行った。更に、反応部カラムに残るプローブ核酸を除く工程では、温度６５℃条件の純水を８００μＬ送液することにより行った。
【００７５】
本実験の結果を図９に示した。図９中の横軸の「C」はコンディショニング，「Wash」は洗浄，「Ext」は65度Cでの純水送液をそれぞれ示している。濃度はターゲット核酸（Cy3-oligo dG + oligo dA）の濃度を示している。
【００７６】
この図９に示された結果に示すように、洗浄後の蛍光強度をみたところ、ターゲット核酸（Cy3-oligo dG + oligodA）の濃度に応じて変化することが確認できた。また、本実験で作成したオリゴdTビーズの繰り返し利用が可能であることも分かった。
【００７７】
図１０は、図９の蛍光強度値をターゲット核酸の濃度に対してプロットした図面代用グラフである。
【００７８】
この図１０に示したように、測定したターゲット核酸の濃度範囲で蛍光強度が片対数でリニアに変化した。これに対して、図８に示したように、ターゲット核酸に対してプローブ核酸がハイブリダイズすることを考えると、プローブ核酸の蛍光強度はターゲット核酸の濃度に応じて変化するので、プローブ核酸の蛍光強度からターゲット核酸を定量できることも分かった。
【実施例４】
【００７９】
本実験中に、流路系デバイスにおける「送液促進部」の蛍光観察を行った。
【００８０】
その結果、実験の工程で蛍光が増大した。その結果を図１１に示した。図１１には、本実験前（Ｐｒｅ）と本実験後（Ｐｏｓｔ）の蛍光強度が棒グラフで示されている。これは、パフュージョンクロマトグラフィー粒子（POROS粒子）へのCy3-オリゴヌクレオチドの吸着によるものと考えられる。
【００８１】
パフュージョンクロマトグラフィー粒子を選択することで、該粒子への吸着物を選ぶことができる。これにより，送液する液相中に有害物質（例えば、放射性物質）が含まれている場合、反応部の後段の送液促進部に存在するパフュージョンクロマトグラフィー粒子に吸着させることで、該デバイス内に前記有害物質を閉じ込め、デバイス廃棄時にいっしょに廃棄することができる。
【００８２】
ビーズが充填された細管の送液は、ビーズの抵抗により２０μＬ/ｍｉｎ以上にすることが難しい。今回作製した流路系デバイスでその流量を調べたところ、送液促進部を設けた効果によって、１０ｍＬ/ｍｉｎまで問題がなかった。したがって、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を充填した送液促進部を流路系に設けることによって、流速を上昇させることができることを検証できた。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。より詳しくは、反応効率がよく、短時間でハイブリダイゼーション検出を実施できるハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明に係る流路系の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図２】反応部（１１１）内に充填されているビーズ（２）の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【図３】ビーズ（２）に保持された状態のターゲット核酸（Ｘ）の一本鎖部分に対して、プローブ核酸（Ｙ）がハイブリダイゼーションしている様子を模式的に示した図である。
【図４】本発明に係る流路系を用いたアッセイの工程例を示す図である。
【図５】本発明に係る流路系の第２実施形態を示す図である。
【図６】流路系（１ａ、１ｂ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図７】実施例２係わる実験の各工程での反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）において測定された蛍光強度の測定結果を示す図面代用グラフである。
【図８】図７に示された蛍光強度のデータに基づいて、ハイブリッド形成による蛍光量をオリゴヌクレオチドに結合している蛍光物質Ｃｙ３の吸光度で補正した結果を示す図面代用グラフである。
【図９】実施例３に係わる実験の結果を示す図面代用グラフである。
【図１０】図９の蛍光強度値をターゲット核酸の濃度に対してプロットした図面代用グラフである。
【図１１】実施例４に係わる実験（流路系デバイスにおける「送液促進部」の蛍光観察実験）の結果を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００８５】
１ａ,１ｂ 流路系
２ ビーズ
３ 検出部
１１ 細管
１１１ 反応部
１１２ 送液促進部
Ｌ リンカー
Ｘ ターゲット核酸
Ｙ プローブ核酸
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出に係わる技術に関する。より詳しくは、流路系に設けられた所定の反応部においてハイブリダイゼーションを進行させて、これを検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が開発され、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用されるようになり、さらには、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、テーラーメイド医療、進化の研究、法医学その他の分野において、幅広い応用が期待されている。
【０００３】
このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、固層基板上に固定された検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、対象物の存在量を定量化する。
【０００４】
ＤＮＡチップを例に挙げると、分析対象の遺伝子配列の一部をもつ一本鎖ＤＮＡ断片を予め固定しておき、試料中に、そのＤＮＡ断片と相補的な配列をもつ遺伝子が存在すると、両者は特異的に結合し（即ちハイブリダイゼーション）、二本鎖ＤＮＡを形成する。この二本鎖ＤＮＡを蛍光標識法などで検出することで、その遺伝子が試料溶液中で発現しているかどうかを判定する。異なる遺伝子配列の一本鎖ＤＮＡ断片を多数固定しておくことにより、一つの試料に対して、複数の遺伝子の発現解析を効率的に行い、あるいは、一つの遺伝子の発現解析に冗長性をもたせて解析の精度を上げることが可能である。
【０００５】
最近では、ＤＮＡチップなどにおいて、流路やキャピラリーを利用する技術が提案されている。例えば、特許文献１には、基板上に形成された流路中で相互作用分析を行うようにすることで、分析に要する液体検体の量を少量に抑えることができる技術が提案されている。また、特許文献２には、キャピラリーの周辺に光学的な検出手段を形成し、このキャピラリー自体を検出用のセルとして利用する技術が開示されている。特許文献３には、毛細管通路内で相互作用を進行させ、その流れ特性を検出する技術が開示されている。
【０００６】
これらの先行技術は、本発明との関係では特に重要ではないが、物質間の相互作用の検出技術において、細い流路を用いる一般的技術を示すことを目的として掲げる。
【特許文献１】特開２００５−０３０９０６号公報。
【特許文献２】特開平１０−１７０４２７号公報。
【特許文献３】特開０６−０９４７２２号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
基板上に反応場を形成し、この反応場内でオリゴヌクレオチドをプローブ核酸として用いる構成である既存のＤＮＡチップなどのデバイス、あるいはハイブリダイゼーション検出システムでは、基板上に設けられた反応場の空間容積が比較的大きい。このため、自然のブラウン運動に委ねられながら進行するハイブリダイゼーションの効率が悪く、ハイブリダイゼーションに要する時間が長くなるという技術的課題あった。また、基板の汚れ等のために、繰り返し利用することが難しいという技術的課題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、反応効率がよく、また繰り返しの利用が可能な新規ハイブリダイゼーション検出技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ビーズが充填された反応部を所定箇所に備える細管からなる流路系であって、充填された前記ビーズには、同種塩基配列を有するリンカーが固定されているとともに、該リンカーの同種塩基配列に相補結合したターゲット核酸が保持されている流路系、更には、この流路系が複数経路設けられているマルチ流路系を提供する。
【００１０】
なお、本発明において、「塩基配列」とは、重合している２以上の塩基を意味し、「リンカー」とは、ビーズに対してターゲット核酸を保持するために利用される所定配列の核酸である。「ターゲット核酸」とは、流路系内の反応部へ送り込まれてくる溶液中に存在するプローブ核酸との間での相補鎖形成を確認するために反応部内に待ち受けている核酸であり、本発明では、前記リンカーを介してビーズに保持されている。
【００１１】
この流路系に設けられた「反応部」は、例えば、前記ターゲット核酸の一本鎖部分と前記反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させる場として機能する。
【００１２】
なお、本発明において「プローブ核酸」とは、ハイブリダイゼーション検出に有用な情報を提供できる核酸であって、例えば、蛍光物質が標識された一本鎖核酸、あるいは放射性物質が標識された一本鎖核酸などを挙げることができ、前者では励起蛍光を検出し、後者では放射線を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００１３】
前記リンカーの同種塩基配列は、例えば、ポリＴであって、前記プローブ核酸は、例えば、このポリＴに相補結合するポリＡテール部分を有するｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、例えば、流路系へ注入された細胞を、該流路系の所定箇所で溶解することにより得られるｍＲＮＡである。なお、「ポリ」とは、塩基が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味し、「ポリＴ」とは塩基チミン（Ｔ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＡテール（poli(A)tail）」は、ｍＲＮＡの３’末端に付加されているアデニル酸残基（ＡＴＰの鎖）である。
【００１４】
また、前記プローブ核酸は、目的のハイブリダイゼーションを検出するための情報を提供できる機能を有する核酸であれば採用でき、一例を挙げれば、蛍光物質で標識されている核酸や放射性物質でラベルされた核酸である。
【００１５】
また、本発明に係る流路系では、前記反応部の下流側領域に、送液の高速化に寄与する送液促進部を設けてもよい。この送液促進部は、例えば、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が充填されている構成を採用できる。また、反応部とそれに続く送液促進部が、２以上繰り返した形態構成を採用することもできる。この送液促進部では、反応部を通過してきた物質、例えば、ハイブリダイゼーションに関与しなかったプローブ核酸や有害物質をトラップするようにしてもよい。
【００１６】
次に、上記したような構成の流路系と、該流路系の反応部に存在する前記ターゲット核酸と該反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する検出部と、を備えることを特徴とするハイブリダイゼーション検出装置を提供する。
【００１７】
該検出装置の検出部としては、プローブ核酸から発せられる情報を捕捉できる構成の検出手段を有するものであれば、特に限定されない。例えば、前記プローブ核酸にラベルされた蛍光物質を励起させるための励起光照射部と、前記反応部から得られる励起蛍光を捕捉する光ディテクタ部と、を少なくとも備えるものを採用できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、流路系の狭小な空間においてハイブリダイゼーションを進行させる構成であるので、反応効率がよく、ハイブリダイゼーション検出の高速化を達成できる。反応部の後段に送液促進部を設けることで、送液の高速化を達成できる。また、反応部のビーズは、洗浄を行うことで繰り返し利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２０】
まず、図１は、本発明に係る流路系の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００２１】
この図１に符号１ａで示す流路系は、大別して、サンプル溶液の流路となる口径５００μｍ程度の細管１１と、該細管１１の一端に形成された導入部１２と、該細管１１の他端側に形成された排出部１３と、から構成されている。なお、図１に示された矢印Ｗは、サンプル溶液の流れる方向を示している。
【００２２】
この図示された流路系１ａには、導入部１２に近接する細管１１部分の内部に微少粒径のビーズ２が多数充填されている構成である反応部１１１が、少なくとも設けられている。この反応部１１１は、ハイブリダイゼーションなどの所望の相互作用が進行する部分（領域）として機能する。
【００２３】
図２は、反応部１１１内に充填されているビーズ２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【００２４】
ビーズ２は、ポリスチレンなどの材料で形成された微少なマイクロビーズであって、その表面は、ポリＴ配列を有するリンカーＬの一末端を、化学的に結合させるのに好適な構成を備えている。
【００２５】
このビーズ２は、該ビーズ２の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたオリゴ核酸であるリンカーＬを備えている。そして、ビーズ２は、該リンカーＬのポリＴ塩基配列部分に対し、ポリＡセレクションプロセスに基づいてポリＡ部位が相補結合したターゲット核酸Ｘを保持している。なお、ターゲット核酸Ｘの好適例の一つは、ポリＡテールを有するｍＲＮＡである。
【００２６】
前記ターゲット核酸Ｘは、リンカーＬを介してビーズ２に保持された状態で、反応部１１１において待ち受けており、該反応部１１１に送液されてくるサンプル溶液中の相補的なプローブ核酸Ｙとのハイブリダイゼーションを進行するという役割を果たす。
【００２７】
図３は、ビーズ２に保持された状態のターゲット核酸Ｘの一本鎖部分に対して、プローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子が模式的に示されている。
【００２８】
この図３に示されているように、プローブ核酸Ｙには、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質Ｆ、あるいは放射性物質（図示せず）などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。
【００２９】
このようなハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、被験者の細胞から抽出されたｍＲＮＡを予めビーズ２に（リンカーＬを介して）保持しておき、このｍＲＮＡに対して、公知の疾病発現原因遺伝子に係わる塩基配列を有するプローブ核酸Ｙがハイブリダイズするか否かを判定する目的の検査などに利用できる。
【００３０】
以上のアッセイは、例えば、図４の工程図に示された方法に基づいて実施できる。具体的には、まず、流路系１を構成する細管１１の所定位置に向けて、リンカーＬが固定化されているビーズ２を充填し、カラム状の反応部１１１を形成する第一工程を行う（図４中の（１）工程）。
【００３１】
次に、ビーズ２が充填されている反応部１１１に向けて、ターゲット核酸Ｘを含む第１サンプル溶液Ｓ１を送液し（図４中の（２）工程）、さらに、ビーズ２に固定化されたリンカーＬのポリＴ配列部分に対して、前記ターゲット核酸ＸのポリＡ配列をハイブリダイゼーションさせる工程（ポリＡセレクションプロセス、図４中の（３）工程）を行う。
【００３２】
続いて、プローブ核酸Ｙを含有する第２サンプル溶液Ｓ２を反応部１１１へ向けて送液し（図４中の（４）工程）、所定温度、ｐＨ条件で所定時間、ターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙとの間のハイブリダイゼーションを進行させる（図４中の（５）工程）。そして、プローブ核酸Ｙから得られる情報（例えば、標識された蛍光物質からの励起蛍光情報）により、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００３３】
図５は、本発明に係る流路系の第２実施形態を示す図である。
【００３４】
この図５に示された第２実施形態である流路系１ｂは、反応部１１１の下流側（即ち、排出部１３側）に送液促進部１１２が設けられていることが特徴である。即ち、この流路系１ｂには、導入部１２、反応部１１１、送液促進部１１２、排出部１３が、上流側からこの順番で設けられている。
【００３５】
この送液促進部１１２は、反応部１１１へ向けて送液されてくるサンプル溶液Ｓ１、Ｓ２や洗浄用のバッファー溶液などの送液速度を促進するための役割を担う部分であって、例えば、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を充填することによって好適に形成することができる。
【００３６】
このパフュージョンクロマトグラフィー粒子の典型的なものは、貫通孔（Through pore）と称される大きなポアと吸着孔（Diffusive pore）と称される小さなポアを持っている。これにより、バッファー溶液に溶け込んだ分子は、前記貫通孔を通りぬけ、吸着孔の隅々まで運ばれる。このため、分子と充填材表面の官能基との接触面積が大きくなり、バッファーの流れと官能基との距離は充填材の粒径に関係がなく非常に小さくなる（１μｍ以下）ので、高流速で、かつ低圧の送液を行うことができる。
【００３７】
また、導入部１２や排出部１３の近傍の細管部分では、外部ポンプ等との接続のためのナットなどの諸部材が設けられることから、この部分に反応部１１１を設けると観察や測定が困難となる。しかし、送液促進部１１２を反応部１１１の下流側に設けることによって、検出・測定の対象となる反応部１１１が流路系１ｂの中央部近くに配置できるようになるので、検出が容易になるという利点が生まれる。
【００３８】
さらには、パフュージョンクロマトグラフィー粒子の種類を選択することによって、余剰物質や有害物質（例えば、放射性物質）を吸着させてトラップし、外部へ排出されないようにできるので、流路系１ｂを廃棄する時に同時に廃棄することができるという利点が生まれる。
【００３９】
以上で説明した流路系１ａ、あるいは１ｂを単独で使用してもより、多数本セットした構成のマルチ流路系（図示せず。）を採用してもよい。例えば、導入部１２を共通にして、同一のサンプル溶液を同時に多数の流路系１ａ（１ｂ）へ送液できるようにし、さらには、各流路系の反応部１１１には、異なる種類のターゲット核酸Ｘを保持させておくことによって、網羅的なハイブリダイゼーション検出を同時一斉に行うようにしてもよい。
【００４０】
次に、図６は、流路系１ａあるいは１ｂを用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００４１】
図６に示された検出部３は、ハイブリダイゼーションを蛍光検出する場合の典型的な構成を備える。反応部１１１においてハイブリダイゼーションした状態で存在するプローブ核酸Ｙには、予め蛍光物質が標識されている。
【００４２】
流路系１ａ（１ｂ）の反応部１１１へ向けて、所定波長の蛍光励起光Ｐを図示しない光源から出射して平行光に途中変換し、反応部１１１の近傍に配置されたレンズ３１によって反応部１１１へ向けて絞り込んで照射する。
【００４３】
これにより、反応部１１１内で励起された蛍光ｆを、前記レンズ３１で平行光に変換し、さらに後方に配置されたレンズ３２で絞り込み、その後方に配置された光ディテクタ３３で検出し、蛍光強度を測定する。なお、本発明に係わる検出部は、この蛍光検出手段に限定されず、プローブ核酸Ｙが提供する情報種に応じて、これを検出できる構成を採用すればよい。
【実施例１】
【００４４】
＜流路系デバイスの作製に係わる実施例＞。
まず、流路系を構成する細管として、内径０．５３ｍｍ、外径０．６８ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ（ジーエルサイエンス社製）を用意した。
【００４５】
そして、送液の下流側端部に、孔径１μｍのフィルタをセットした排出部、上流側にはフィルタをセットしない導入部を、それぞれチュービングスリーブ、フェラル、ナットを用いて取り付けた。また、上流側の導入部には、レオダイン型シリンジに対応するフィルポートを取り付け、下流側の排出部にはルアー・ロック・ニードルを取り付けた。
【００４６】
＜パフュージョンクロマトグラフィー粒子の調整＞。
パフュージョンクロマトグラフィー粒子として、POROS 20 R1（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた。これを１０％エタノール溶液に分散させて、粒子分散溶液（以下、「POROS溶液」）を調製した。
【００４７】
＜オリゴヌクレオチド結合マイクロビーズの調製＞。
次に、Streptavidin Coated Microsphere plain（Polysciences）の水溶液に、５'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジンのオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を加えて、アビジン−ビオチン結合によりオリゴｄＴが固定されたビーズ（以下、「オリゴｄＴビーズ」）を調製した。
【００４８】
＜カラム（溶液促進部と反応部）の形成＞。
流路系デバイスの排出部のルアー・ロック・ニードルにシリンジを取り付けた。POROS溶液を吸い込んだレオダイン型シリンジを、導入部のフィルポートに取り付け、ルアー・ロック・ニードルに取り付けた前記シリンジを吸引し、前記チューブ内に、パフュージョンクロマトグラフィー粒子である「POROS粒子」を注入した。
【００４９】
続いて、上記手順で調整した「オリゴｄＴ結合ビーズ」を同様の方法で、チューブ内へ注入した。これにより、送液促進部（パフュージョンクロマトグラフィー粒子充填部）と反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）の二段カラム構造を備える、図５同様の流路系デバイスを形成した。
【００５０】
次に、この流路系デバイスからルアー・ロック・ニードルとフィルポートを取り外し、蛍光顕微鏡のステージであるヒートプレート上に固定した。フェラルとナットを両側に取り付け、導入部と連結できる細管、片側のみフェラルとナットを取り付けた細管、シリンジ・ポンプ、排液瓶を用意した。
【００５１】
次に、両側にフェラルとナットを持つ細管を準備し、前記流路系デバイスの上流側の導入部に取り付けた。この細管の反対側のフェラルとナットをルアー・ロック・ニードルに取り付け、シリンジ・ポンプにセットされるシリンジと接続した。流路系デバイスの下流側には、片側のみフェラルとナットを取り付けた細管を取り付け、この細管の反対側は排液瓶に導入した。
【実施例２】
【００５２】
＜オリゴヌクレオチド溶液の調製＞。
まず、ターゲット核酸として、５'末端に蛍光色素Ｃｙ３を標識した21mer デオキシグアノシンに21merデオキシアデノシンを連結した計42merのオリゴヌクレオチド（以下「Cy3-oligo dG+oligo-dA」と表す）用意した(表１参照)。
【００５３】
【表１】
【００５４】
次に、プローブ核酸として、５'末端に蛍光色素Ｃｙ３を標識した21-merオリゴデオキシグアノシン（Cy3-oligo dG）と、これと同様に標識した21-merオリゴデオキシシチジン（Cy3-oligo dC）のオリゴヌクレオチドの２種類を用意した（表２参照）。
【００５５】
【表２】
【００５６】
用意された各オリゴヌクレオチドは、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液中５μＭ濃度に溶解した。なお、塩化ナトリウム０．５Ｍの条件では、オリゴヌクレオチド同士のハイブリッド形成が生じることが知られている（真壁和裕「バイオ実験イラストレイテッド 4 苦労なしのクローニング」第１章、第２節（秀潤社, 1997，東京））。
【００５７】
＜実験手順と結果＞。
本実験は、上記の通りの方法で作製した流路系デバイスを用いて行った。この流路系デバイスの温度制御は、ヒートプレートを用いて行った。流路系へ送り込まれる各オリゴヌクレオチド溶液の送液量は、２００μＬで送液速度は５０μ／ｍｉｎとした。ハイブリダイゼーション確認のためのＣｙ３の蛍光観察は、蛍光顕微鏡に接続された顕微分光システム（大塚電子社製）で行った。
【００５８】
本実験の各工程での反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）において測定された蛍光強度の測定結果を図７に示した。なお、この図７中では、横軸には工程を順番に示し、縦軸には各工程を実施した直後の蛍光強度値を示している。
【００５９】
まず、本実験では、上記プローブ核酸（表１参照）をデバイスへ送液する前に、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液でカラムのコンディショニングを３７℃の温度条件で行った（図７の１（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。なお、このときの送液量は８００μＬであった。この段階では、蛍光強度はほとんど測定されなかった。
【００６０】
次に、42merのターゲット核酸である「Cy3-oligo dG + oligo-dA」（表１参照）をデバイス中へ２００μＬ送液した（温度条件３７℃）。この時の蛍光強度は、図７中の２（PolyG-PolyA 37）の棒グラフに示すように、蛍光強度が０．２を超える程度に上昇した。
【００６１】
その後、３７℃の温度条件に保ち、洗浄のために８００μＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を送液した（図７の３（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。このとき、蛍光強度は低下したものの０．１強の値を示したことから、ビーズに固定されたオリゴｄＴ（リンカー）とプローブ核酸との間のポリＡセレクションを確認できた。即ち、ビーズに固定されたオリゴｄＴとターゲット核酸の３'側のoligo-dAとの間でのハイブリダイズを確認した。
【００６２】
次に、第１プローブ核酸であるCy3-oligo dG（表２参照）を含有するサンプル溶液を２００μＬ送液してみたところ（温度条件３７℃）、蛍光強度が０．１７程度に上昇した（図７の４（PolyG 37）の棒グラフ参照）。
【００６３】
しかし、次に、温度条件を３７℃に保って、８００μＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を洗浄のために送液したところ、蛍光強度は低下した（図７の５（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。この時の蛍光強度は、ターゲット核酸（表１参照）を送液した後の最初の洗浄工程後の蛍光強度と同等であった（図７参照）。これは、第１プローブ核酸Cy3-oligo dGを含有するサンプル溶液を送液した後の蛍光強度の上昇は、完全なハイブリッド形成によってもたらされたものではなく、非特異的な吸着が発生したことが原因と考えられた。
【００６４】
次に、用意した第２プローブ核酸であるCy3-oligo dCを含有するサンプル溶液を、温度条件３７℃でデバイス中へ２００μＬ送液した。このとき、再び蛍光強度は０．２５を超える程度に上昇し、先の第１プローブ核酸Cy3-oligo dGを送液した場合よりも高い値を示した（図７の６（polyC37）の棒グラフ参照）。
【００６５】
続いて、温度条件を３７℃に保ち、洗浄のため８００μＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を送液したところ、蛍光強度は低下した（図７の７（Wash NaCl 37）の棒グラフ参照）。しかし、二回目の洗浄後の蛍光強度（図７の５の棒グラフを比較参照）よりも高かったことから、第２プローブ核酸Cy3-oligo dCが、反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）に依然として残っていることが明らかであった。
【００６６】
念のため、真壁和裕「バイオ実験イラストレイテッド4 苦労なしのクローニング」第1章，第2節（秀潤社, 1997，東京）に準拠し、ビーズへの非特異的吸着の排除に効果があると言われる0.1%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.5 M 塩化ナトリウム水溶液８００μＬを用いた洗浄を、温度条件３７℃で行った（図７の８（Wash SDS 37）の棒グラフ参照）。
【００６７】
このときの蛍光強度に殆ど変化なかった。したがって、蛍光強度の増加は、ビーズのオリゴｄＴとポリＡ部分（oligo dA部分）で相補結合している状態のターゲット核酸の一本鎖ポリＧ部分（oligodG部分）と第２プローブ核酸であるCy3-oligo dCとが、相補的なＧ-Ｃ結合を形成してハイブリダイズしたことによるものと考えられた。即ち、オリゴｄＴビーズ上に保持されたターゲット核酸（表１参照）と第２プローブ核酸（表２参照）との間のハイブリダイゼーションを確認した。
【００６８】
次に、温度条件を３７℃に保ちつつ、純水８００μＬを送液したところ、蛍光強度が激減した（図７の９（Wash Water 37）の棒グラフ参照）。これは、塩濃度の低下によりハイブリッドが１本鎖に分離し、蛍光物質Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドが送液によって廃液されたためと考えられる。
【００６９】
更に、温度条件を６５℃に昇温して純水８００μＬを送液したところ、蛍光強度は最初の洗浄工程のレベルまで低下した（図７の１０（Wash Water 65）の棒グラフ参照）。これは、その後３７℃に温度を低下させ、純水８００μＬを送液しても変わらなかった（図７の１１（Wash Water 37）の棒グラフ参照）。これは、二本鎖が完全に１本鎖に解離し、廃液されたからと考えられる。
【００７０】
以上の実験の結果から、相補的なオリゴヌクレオチドのみが流路系内でハイブリッド形成を生じることを確認した。即ち、ポリＡセレクションによりオリドｄＴビーズに保持されたターゲット核酸の一本鎖部分が、この一本鎖部分と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とハイブリダイゼーションをすることを確認できた。
【００７１】
図７に示された蛍光強度のデータに基づいて、ハイブリッド形成による蛍光量をオリゴヌクレオチドに結合している蛍光物質Ｃｙ３の吸光度で補正した結果を図８に示した。
【００７２】
この図８に示された結果から、ターゲット核酸とプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションによる補正後蛍光値（図８のpolyＣで示す棒グラフ参照）は、約０．０２である。一方、ポリＡセレクションによるリンカー（ビーズに固定されたオリゴｄＴ）とターゲット核酸との間のハイブリダイゼーションによる補正後蛍光値（図８のPolyG-PolyAで示す棒グラフ参照）は、約１．０である。したがって、ターゲット核酸とプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションは、ポリＡセレクションによるハイブリダイゼーションの２割程度であることが分かった。
【実施例３】
【００７３】
実施例１で作製した流路系デバイスを用いて、ターゲット核酸である「42mer Cy3-oligo dG +oligodA」（表１参照）の濃度を、２０μＭ、２μＭ、０．２μＭ、０．０２μＭの計４段階に変化させて、オリゴｄＴビーズ上のポリＡセレクションによるターゲット核酸の捕捉感度を検証した。
【００７４】
反応部カラムのコンディショニングは、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（温度３７℃）を、８００μＬを送液することにより行った。前記プローブ核酸の送液量は２００μＬとした。洗浄は、０．１％ＳＤＳを含む０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（温度３７℃）を、８００μＬを送液することにより行った。更に、反応部カラムに残るプローブ核酸を除く工程では、温度６５℃条件の純水を８００μＬ送液することにより行った。
【００７５】
本実験の結果を図９に示した。図９中の横軸の「C」はコンディショニング，「Wash」は洗浄，「Ext」は65度Cでの純水送液をそれぞれ示している。濃度はターゲット核酸（Cy3-oligo dG + oligo dA）の濃度を示している。
【００７６】
この図９に示された結果に示すように、洗浄後の蛍光強度をみたところ、ターゲット核酸（Cy3-oligo dG + oligodA）の濃度に応じて変化することが確認できた。また、本実験で作成したオリゴdTビーズの繰り返し利用が可能であることも分かった。
【００７７】
図１０は、図９の蛍光強度値をターゲット核酸の濃度に対してプロットした図面代用グラフである。
【００７８】
この図１０に示したように、測定したターゲット核酸の濃度範囲で蛍光強度が片対数でリニアに変化した。これに対して、図８に示したように、ターゲット核酸に対してプローブ核酸がハイブリダイズすることを考えると、プローブ核酸の蛍光強度はターゲット核酸の濃度に応じて変化するので、プローブ核酸の蛍光強度からターゲット核酸を定量できることも分かった。
【実施例４】
【００７９】
本実験中に、流路系デバイスにおける「送液促進部」の蛍光観察を行った。
【００８０】
その結果、実験の工程で蛍光が増大した。その結果を図１１に示した。図１１には、本実験前（Ｐｒｅ）と本実験後（Ｐｏｓｔ）の蛍光強度が棒グラフで示されている。これは、パフュージョンクロマトグラフィー粒子（POROS粒子）へのCy3-オリゴヌクレオチドの吸着によるものと考えられる。
【００８１】
パフュージョンクロマトグラフィー粒子を選択することで、該粒子への吸着物を選ぶことができる。これにより，送液する液相中に有害物質（例えば、放射性物質）が含まれている場合、反応部の後段の送液促進部に存在するパフュージョンクロマトグラフィー粒子に吸着させることで、該デバイス内に前記有害物質を閉じ込め、デバイス廃棄時にいっしょに廃棄することができる。
【００８２】
ビーズが充填された細管の送液は、ビーズの抵抗により２０μＬ/ｍｉｎ以上にすることが難しい。今回作製した流路系デバイスでその流量を調べたところ、送液促進部を設けた効果によって、１０ｍＬ/ｍｉｎまで問題がなかった。したがって、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を充填した送液促進部を流路系に設けることによって、流速を上昇させることができることを検証できた。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。より詳しくは、反応効率がよく、短時間でハイブリダイゼーション検出を実施できるハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明に係る流路系の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図２】反応部（１１１）内に充填されているビーズ（２）の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【図３】ビーズ（２）に保持された状態のターゲット核酸（Ｘ）の一本鎖部分に対して、プローブ核酸（Ｙ）がハイブリダイゼーションしている様子を模式的に示した図である。
【図４】本発明に係る流路系を用いたアッセイの工程例を示す図である。
【図５】本発明に係る流路系の第２実施形態を示す図である。
【図６】流路系（１ａ、１ｂ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図７】実施例２係わる実験の各工程での反応部（オリゴｄＴビーズ充填部）において測定された蛍光強度の測定結果を示す図面代用グラフである。
【図８】図７に示された蛍光強度のデータに基づいて、ハイブリッド形成による蛍光量をオリゴヌクレオチドに結合している蛍光物質Ｃｙ３の吸光度で補正した結果を示す図面代用グラフである。
【図９】実施例３に係わる実験の結果を示す図面代用グラフである。
【図１０】図９の蛍光強度値をターゲット核酸の濃度に対してプロットした図面代用グラフである。
【図１１】実施例４に係わる実験（流路系デバイスにおける「送液促進部」の蛍光観察実験）の結果を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００８５】
１ａ,１ｂ 流路系
２ ビーズ
３ 検出部
１１ 細管
１１１ 反応部
１１２ 送液促進部
Ｌ リンカー
Ｘ ターゲット核酸
Ｙ プローブ核酸
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズが充填された反応部を所定箇所に備える細管からなる流路系であって、前記ビーズには、同種塩基配列を有するリンカーが固定されているとともに、該リンカーの同種塩基配列に相補結合したターゲット核酸が保持されている流路系。
【請求項２】
前記反応部では、前記ターゲット核酸の一本鎖部分と前記反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項３】
前記リンカーの同種塩基配列はポリＴであり、前記ターゲット核酸はポリＡテール部分を有するｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡは、流路系へ注入された細胞を、該流路系の所定箇所で溶解することにより得られるｍＲＮＡであることを特徴とする請求項３記載の流路系。
【請求項５】
前記プローブ核酸は、蛍光物質で標識されていることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項６】
前記反応部の下流側領域に、送液の高速化に寄与する送液促進部が設けられたことを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項７】
前記送液促進部には、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が充填されていることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項８】
前記反応部とそれに続く前記送液促進部が、２以上繰り返して設けられていることを特徴とする請求項６に記載の流路系。
【請求項９】
ハイブリダイゼーションに関与しなかった前記プローブ核酸を、前記送液促進部でトラップすることを特徴とする請求項６記載の流路系。
【請求項１０】
請求項１記載の流路系が、複数経路設けられていることを特徴とするマルチ流路系。
【請求項１１】
請求項１記載の流路系と、
該流路系の反応部に存在する前記ターゲット核酸と、該反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する検出部と、
を備えることを特徴とするハイブリダイゼーション検出装置。
【請求項１２】
前記検出部は、前記プローブ核酸にラベルされた蛍光物質を励起させるための励起光照射部と、前記反応部から得られる励起蛍光を捕捉する光ディテクタ部と、を少なくとも備えることを特徴とする請求項１１記載のハイブリダイゼーション検出装置。
【請求項１】
ビーズが充填された反応部を所定箇所に備える細管からなる流路系であって、前記ビーズには、同種塩基配列を有するリンカーが固定されているとともに、該リンカーの同種塩基配列に相補結合したターゲット核酸が保持されている流路系。
【請求項２】
前記反応部では、前記ターゲット核酸の一本鎖部分と前記反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項３】
前記リンカーの同種塩基配列はポリＴであり、前記ターゲット核酸はポリＡテール部分を有するｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡは、流路系へ注入された細胞を、該流路系の所定箇所で溶解することにより得られるｍＲＮＡであることを特徴とする請求項３記載の流路系。
【請求項５】
前記プローブ核酸は、蛍光物質で標識されていることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項６】
前記反応部の下流側領域に、送液の高速化に寄与する送液促進部が設けられたことを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項７】
前記送液促進部には、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が充填されていることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項８】
前記反応部とそれに続く前記送液促進部が、２以上繰り返して設けられていることを特徴とする請求項６に記載の流路系。
【請求項９】
ハイブリダイゼーションに関与しなかった前記プローブ核酸を、前記送液促進部でトラップすることを特徴とする請求項６記載の流路系。
【請求項１０】
請求項１記載の流路系が、複数経路設けられていることを特徴とするマルチ流路系。
【請求項１１】
請求項１記載の流路系と、
該流路系の反応部に存在する前記ターゲット核酸と、該反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する検出部と、
を備えることを特徴とするハイブリダイゼーション検出装置。
【請求項１２】
前記検出部は、前記プローブ核酸にラベルされた蛍光物質を励起させるための励起光照射部と、前記反応部から得られる励起蛍光を捕捉する光ディテクタ部と、を少なくとも備えることを特徴とする請求項１１記載のハイブリダイゼーション検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−２６６６９２（Ｐ２００６−２６６６９２Ａ）
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−８１０３３（Ｐ２００５−８１０３３）
【出願日】平成１７年３月２２日（２００５．３．２２）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２２日（２００５．３．２２）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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