バイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子７（Ｆｇｆ７）及び受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用
ＺＫ２３０２１１又はＺＫ−ＰＲＡの名称でも知られる、式（Ｉ）のプロゲステロン受容体アンタゴニスト、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンのための、及び抗エストロゲンのためのバイオマーカー候補としての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び対応する受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用が記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロゲステロン受容体アンタゴニスト、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン及び抗エストロゲンのためのバイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び対応する受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用に関する。
【０００２】
プロゲステロン受容体アンタゴニスト、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンは、ＺＫ２３０２１１又はＺＫ−ＰＲＡの名称でも知られており、以下の式：
【化１】
を有し、他の内分泌学的効果をほとんど伴わずに、あるいは全く伴わずに、高い抗プロゲステロン活性を示す (Fuhrmann, U. et al., J. Med. Chem. 2000, 43, 5010-5016)。
【０００３】
線維芽細胞成長因子７（Ｆｇｆ７）又は他のケラチノサイト成長因子（ｋｇｆ）は、２２のメンバーを含む分泌性糖タンパク質ファミリーに属する (Grose and Dickson 2005)。Ｆｇｆ７は、間葉に由来する細胞により産生され、そして上皮細胞により発現されるＦｇｆｒ２ｂに特異的に結合する。したがって、Ｆｇｆ７は、間葉−上皮シグナルを媒介する傍分泌因子である。異種移植実験において、Ｆｇｆ７を過剰発現するＭＣＦ−７腫瘍は、Ｆｇｆ７過剰発現を伴わないＭＣＦ−７細胞の腫瘍よりも明らかに大きかった (Zang, Bullen et al. 2006)。Ｆｇｆ７はＤＮＡ合成、ならびに腫瘍細胞の増殖及び遊走を刺激する。Ｆｇｆ７を投与した雌ラットは、巨大な管過形成を発生し、そしてＦｇｆ７を過剰発現するマウスは、まず、乳癌に発達する過形成を発生した。ＥＲ及びＰＲを伴わない高度に脱分化した乳癌は、極めて低レベルのＦｇｆｒ２ｂを示したが、よく脱分化した腫瘍はＦｇｆｒ２ｂの強い発現を示したことから、Ｆｇｆ７媒介刺激及び増殖は、進行や転移に導く分子カスケードにおいて極めて初期の事象であるものと推測される。ＥＲ−陽性細胞株、例えばＭＣＦ−７、Ｔ４７−Ｄ及びＺＲ７５−１は、Ｆｇｆ７による刺激において増大した増殖及び遊走を示す一方、ＥＲ−陰性細胞株、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１はこれらを示さないことが判明している (Zang and Pento 2000)。Ｆｇｆ７、Ｆｇｆｒ２ｂの発現及びＥＲ−αの発現において相関関係を示す可能性がある。同時に、強いＦｇｆ７発現を伴う腫瘍のアポトーシス率は明らかに低かった(Tamaru, Hishikawa et al. 2004)。
【０００４】
間質細胞におけるＦｇｆ７の発現は多数の因子によって制御される。マクロファージや他のいくつかの細胞により産生される前炎症性サイトカインのインターロイキン１及びインターロイキン６での刺激によって線維芽細胞におけるＦｇｆ７発現を増大することができた。他の成長因子、例えば血小板由来成長因子ＢＢ（ｐｄｇｆＢＢ）及び形質転換成長因子αも同様に、間葉細胞におけるＦｇｆ７の発現を増大した(Finch and Rubin 2006)。
【０００５】
Ｆｇｆ７はタモキシフェンによる治療に対してＭＣＦ−７細胞の耐性を誘発することが示されている。培養培地への組換えＦｇｆ７の添加は、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいてＥＲ−α及びＰＲの両方を明らかに下方制御し、タモキシフェンは増殖試験において活性を示さなかった。正のフィードバックメカニズムが仮定される：
Ｆｇｆ７は内因性アロマターゼの産生を刺激し、これによりアンドロゲンのＥ２への転化を増大する(Chang, Sugimoto et al. 2006)。
【０００６】
線維芽細胞成長因子受容体（Ｆｇｆｒ）は、構造的に関係がある４つの遺伝子（Ｆｇｆｒ１〜Ｆｇｆｒ４）によってコードされる膜貫通チロシンキナーゼである。オルタナティブ・スプライシングは、該受容体の更なるアイソフォームをもたらす。Ｆｇｆｒ２のスプライス変異はＦｇｆｒ２ｂとＦｇｆｒ２ｃである。Ｆｇｆｒ２ｂは、上皮起源の細胞でのみ産生され、そしてＦｇｆｒ２ｃは間葉細胞でのみ産生される。Ｆｇｆｒ２ｂは成長因子Ｆｇｆ７に特異的な受容体であり、乳癌の約５％において発現され(Finch and Rubin 2006)、そしてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐｌ３Ｋ）を介してシグナル伝達カスケードを媒介する (Moffa, Tannheimer et al. 2004)。免疫組織学的研究において、ＦＧＦＲ２ｂは乳房組織の上皮細胞において検出された。この場合、正常な組織と悪性組織における定量的な相違は検出されず、そして間質細胞においてＦＧＦＲ２ｂは検出できなかった(Palmieri, Roberts-Clark et al. 2003)。
【０００７】
腫瘍や癌の進行及びそれに関係する制御における細胞過程の複雑な関係を考慮すれば、活性成分による治療を目的としたバイオマーカーの使用は極めて必要とされる。
【発明の概要】
【０００８】
このたび、驚くべきことに、Ｆｇｆｒ２ｂ遺伝子発現における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療の影響が、細胞株において示されることが発見された。Ｆｇｆｒ２ｂはＦｇｆ７の特異的な受容体である。このたび、驚くべきことに、Ｆｇｆ７による刺激が、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療に対する耐性の発達に相関することが発見された（Ｔ４７Ｄ／Ｔ４７Ｄ−耐性を参照のこと）。同時に、高度なＦｇｆｒ２発現を伴う細胞は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンによる治療に対してあまりよく応答しないか、あるいは全く応答しないことから、Ｆｇｆｒ２は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンの使用のための潜在的な分類マーカー（stratifying marker)として考えられる。
【０００９】
したがって、例えば、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンに耐性であるＴ４７−Ｄ細胞においては、感受性細胞よりも発現が高いことが発見された。
【００１０】
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療は、該細胞においてＦｇｆｒ２ｂの下方制御に導き、該受容体Ｆｇｆｒ２ｂの応答マーカーとしての用途が示唆される。
【００１１】
ｓｉＲＮＡノックダウン手段による、耐性Ｔ４７Ｄ細胞におけるＦＧＦＲ２ｂ発現の減少は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンに対する感受性を回復することを示すことができた。これは、ＦＧＦＲ２ｂが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの耐性に打ち勝ち、その効果を強化するための、ＦＧＦＲ２ｂキナーゼを阻害する小分子、ＦＧＦＲ２ｂに対する抗体又は遺伝子治療のいずれかによる併用治療の標的であることを示す。
【００１２】
したがって、本発明は、癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニスト１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン
【化２】
のためのバイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７の使用に関する。
【００１３】
本発明はさらに、癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニスト１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンのためのバイオマーカーとしての受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用に関し、ここで線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂは、腫瘍又は腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして使用され、そして血清中の高濃度のＦＧＦ７は、該腫瘍及び腫瘍細胞における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療に対する内因性抵抗及び高いＦｇｆｒ２ｂ発現に関係する。
【００１４】
本発明は更に、細胞培養液及び血清中のプロゲステロン受容体アンタゴニスト１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性を測定するためのインビトロ方法であって、ここで線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが該測定のためのバイオマーカーとして使用される方法に関する。
【００１５】
これに関して、線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂは、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍又は腫瘍細胞において、あるいは高いＦｇｆｒ２発現を伴う細胞において、Ｆｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられる。
【００１６】
分類マーカーとしてのこれらの特性において、線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び受容体Ｆｇｆｒ２ｂはまた、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの使用における耐性調節のための標的としても用いられる。
【００１７】
本発明は更に、抗エストロゲンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用、及び線維芽細胞成長因子又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、抗エストロゲンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられるインビトロ方法に関する。
【００１８】
線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂと一緒に利用される適当な抗エストロゲンは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、アルゾキシフェン、ＧＷ５６３８*）、ＥＭ−８００**)、イドキシフェン及びバセドキシフェンである。
【００１９】
*）該化学構造は、Wilson et al., Endocrinology 138, 3901 , (1997) 及びWu et al., Mol. Cell, 18, 413, (2005)に開示されている。
**)該化学構造は、Labrie et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 79, 213, (2001)に開示されている。
【００２０】
本発明はまた、腫瘍組織及び腫瘍細胞におけるＦＧＦ７及びＦＧＦＲ２の非侵襲的な測定のためのインビトロ造影（imaging)方法であって、造影を許容する標識を含むこれらのタンパク質に対する抗体を使用する方法に関する。造影を許容する標識は、例えば蛍光標識又は他の放射性標識である。
【００２１】
使用することができる適当な蛍光マーカーや適当な放射性マーカーは、一般に知られており、かつ十分に記載されている。
【００２２】
本発明は更に、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムのＦＧＦ７発現を低下するため、ならびにＦＧＦ７−遮断抗体及び可溶性受容体の循環を不活性化するためのインビトロ方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理におけるＭＸＴ腫瘍モデルにおける腫瘍面積の変化を示す。
【図２】１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理におけるＭＸＴ腫瘍モデルにおける腫瘍面積の変化を示す（試験再現）。
【図３】培養培地にＦｇｆ７（２０ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌ）添加して、２４時間及び７２時間培養し、その後ウェスタンブロットにおいてＰＲの量が測定されたＴ４７−Ｄ細胞を示す。
【図４】Ｆｇｆ７の影響下における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによるＴ４７−Ｄ細胞の増殖アッセイを示す。
【図５】６つのモデル細胞株におけるＦｇｆｒ２対１８Ｓ ｒＲＮＡの相対発現を示す。
【００２４】
以下の実施例は、これらの例に限定することなく本発明の実施可能性を実証するものである。
【実施例】
【００２５】
例１
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対して良好に応答する腫瘍（レスポンダー)、及び１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理において良好な成長を示し続け、かつ耐性メカニズムの可能性を示す腫瘍（ノンレスポンダー）の同定
該試験のために、すでに厳密なホルモン依存性ではないＭＸＴ−Ｍ３腫瘍をマウスに移植した。
【００２６】
ウレタン溶液の腹腔内投与により、Ｃ５７ＢＬｘＤＢＡ２Ｆ１マウスにおいてＭＸＴ（＋）腫瘍モデルを誘発させた。進行中の乳房腫瘍は同じ遺伝的背景を有するマウス（同系）に更に移植することができ、そしてこれはすでに確立されたモデルである。ＭＸＴ（＋）モデルは、生理学的濃度において該腫瘍がＥＲとＰＲの両方を発現するという事実によって特に区別される。他のホルモン受容体陽性腫瘍モデルも存在するが、しばしばこれらのＥＲ及びＰＲは機能的ではなく、刺激後に細胞質から核への転座を示さない。そしてまた、ホルモン消失（ablation)による成長阻害を示すこともできない。このようなモデルは、抗ホルモン物質の研究のためには不適当である(Watson, Medina et al. 1977)。
腫瘍成長の結果は図１に示される。
【００２７】
試験の終了時に動物を犠牲にし、そして腫瘍を除去し、その後該腫瘍の重量を測定した。該腫瘍重量の変動は各々のグループにおいて高い。溶媒対照グループにおける平均腫瘍重量（４２７ｍｇ）は、卵巣切除グループ（１５５ｍｇ）よりも２．８倍高く、そして１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループ（１９２ｍｇ）よりも２．２倍高かった。
【００２８】
更なる遺伝子発現実験のために、選択した腫瘍のＲＮＡを単離し、そしてGeneChip分析及びリアルタイムＰＣＲでさらに分析した。
【００２９】
溶媒対照グループから最も大きな５つの腫瘍を選択した。処理グループにおける１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンに対するノンレスポンダーにより上方制御されることが発見された遺伝子が、各々の腫瘍サイズにおける排他的な成長に起因せず、該物質への暴露における腫瘍成長に特異的に上方制御されることを保証することを目的とした。
【００３０】
卵巣切除グループ及び１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループにおいて制限を設定した：１００ｍｇ以上の重量を有する腫瘍をノンレスポンダーとして評価し、そして１００ｍｇ以下の重量を有する腫瘍をレスポンダーとして分類した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
ノンレスポンダー腫瘍において、Ｆｇｆ７は溶媒対照よりも３．１２倍強く発現し、そしてレスポンダー腫瘍においては、対照と比較して７０％に小さく下方制御した。
【００３３】
処理において、Ｆｇｆｒ２は、３０％（レスポンダー腫瘍対対照）及び５５％（ノンレスポンダー対対照）に明確に下方制御される。しかしながら、一般的に、発現はノンレスポンダーでより高い。
【００３４】
例２
インビボ確認実験
例１からのインビボ実験の腫瘍ＲＮＡの研究において、バイオマーカー候補を同定することができた。これらの可能性のある候補を確認するために、グループあたり動物数を１０〜２０増やして、同じ研究デザインにより独立した動物実験を行った。
【００３５】
試験の終了時に、腫瘍を除去し、該腫瘍重量を測定し、そしてＲＮＡが単離されるまで−８０℃で腫瘍を保存した。該結果は図２に示される。
【００３６】
確認実験において、腫瘍重量は、グループ内で高い変動を示した。溶媒対照グループにおける平均腫瘍重量は５７７ｍｇであり、そして卵巣切除グループ（１８０ｍｇ）よりも３．２倍高く、そして１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループ（２１５ｍｇ）よりも２．７倍高かった。例１の実験と同様に、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループの平均腫瘍重量は、卵巣切除グループよりも僅かに高かったが、対照グループよりも明らかに低かった。
【００３７】
先の実験において、溶媒対照動物の平均腫瘍重量は、卵巣切除グループ及び１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループよりも極めて高いといえるほどではなく、この実験においては、僅かに優れた腫瘍のホルモン依存性を示唆する。
【００３８】
試験１と同様に、治療の応答（レスポンス）及び非応答（ノンレスポンス）についての制限を、１００ｍｇの腫瘍重量に設定した。対照グループから最も大きな５つの腫瘍を選択した。該腫瘍からＲＮＡを単離し、そしてバイオマーカー候補の遺伝子発現を測定した。結果を以下の表に挙げる：
【００３９】
【表２】
【００４０】
例３
ＦＧＦ７の影響下におけるプロゲステロン受容体のウェスタンブロット分析
ＦＧＦ７がＥＲとＰＲの両方を下方制御することは文献中に報告されている。この効果を検証するために、様々な量のＦＧＦ７を有する培地において、細胞を２４時間及び７２時間インキュベートし、その後ＰＲ含有量を測定した。
【００４１】
ＰＲの量におけるＦｇｆ７の影響は極めて明確である。濃度の減少とともに、ＰＲの明らかな減少が見られる。ＰＲ−ＡとＰＲ−Ｂの両方のアイソフォームは、顕著に減少する。２４時間及び７２時間のＦｇｆ７でのインキュベーション後、該効果は明白であった。
該結果は図３に示される。
【００４２】
例４
ＦＧＦ７の影響下における細胞成長
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性におけるＦＧＦ７の影響を、Ｔ４７−Ｄ細胞において調査した。該細胞は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対して感受性応答を示した。５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７を培地に添加し、そして増殖アッセイにおいてＺＫ−ＰＲＡの活性を測定した。
【００４３】
該増殖アッセイにおいて、感受性のＴ４７−Ｄ細胞で１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンは良好な活性を示した。最大の成長対照（全ての添加及びＥ２を伴う培地）は、同様に１００％で設定し、そして最小対照（全ての添加を伴うが、Ｅ２がなく、血清を奪われている）は４２％の成長を示した。したがって、Ｅ２の退薬を介して５８％成長を阻害することができた。
【００４４】
最も高い物質濃度（１０-5ｍｏｌ／ｌ）において、成長は４２％阻害され、１０-6ｍｏｌ／ｌにおいて４７％阻害され、そして１０-7ｍｏｌ／ｌにおいて５０％阻害された。より低い濃度において、成長はさらに増大する。最も低い濃度（１０-11ｍｏｌ／ｌ）における成長は１１４％であった。
【００４５】
ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍｌ）の培地への添加において、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンは、感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の増殖において、より小さな阻害を示した。最小対照（Ｅ２消失）においては、細胞増殖を２９％だけ減少でき、これは依然最大対照の７１％であった。最も高い濃度（１０-5ｍｏｌ／ｌ）において、成長は２４％阻害され、そして次に低い濃度においては１８％阻害された。最も低い濃度（１０-11ｍｏｌ／ｌ）において、成長は最大対照の１１４％に達した。
該結果は図４に示される。
【００４６】
例５
インビボにおける６つのモデル細胞株におけるＦｇｆｒ２対１８Ｓ ｒＲＮＡの相対発現
インビボ実験（上記を参照のこと）において、ノンレスポンダー腫瘍及びレスポンダー腫瘍におけるＦｇｆｒ２の発現は、未処理対照グループよりも２分の１〜４分の１弱かった。
【００４７】
線維芽細胞成長因子７（Ｆｇｆ７）の受容体の発現は、ＺＫ−ＰＲＡの処理における感受性Ｔ４７−Ｄ細胞において制御されなかった（ＺＫ−ＰＲＡでの処理において１．１倍高い）。未処理のＺＫ−ＰＲＡ−耐性Ｔ４７−Ｄにおける発現は、感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の場合よりも２倍高く、そしてＺＫ−ＰＲＡ処理により、未処理の感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の１．３倍の値まで僅かに減少した。他の全ての細胞における発現は、通常の培地及びＺＫ−ＰＲＡによる処理の両方において顕著に少なかった：
【００４８】
未処理ＢＴ−４７４細胞におけるｍＲＮＡの量は、未処理Ｔ４７−Ｄ細胞よりも２１倍少なく、そしてＺＫ−ＰＲＡによる処理においては、３７倍低い値まで低下した。ＭＣＦ−７について見られた初期値は６４倍低く、そしてＺＫ−ＰＲＡ処理では、未処理の感受性Ｔ４７−Ｄ細胞と比較して、実際に１５３倍低かった。ＺＲ７５−１における発現は、未処理のＴ４７−Ｄ細胞よりも３．７倍低く、そして処理により通常の条件下のＴ４７−Ｄと比較して、９．４倍低い発現まで低下した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１における発現は、実際に１００００倍低く、検出限界を僅かに超えるものであった。
該結果は図５に示される。
【００４９】
例えば、ノンレスポンダー腫瘍においてＦｇｆ７が、溶媒対照と比較して、レスポンダー腫瘍の場合よりも３倍強いことは、例１から明らかであり、これは確認実験において再現可能であった。
【００５０】
インビトロ実験において、ヒト乳癌細胞中ではＦｇｆ７ｍＲＮＡは検出できなかった。Ｆｇｆ７は間葉細胞中で産生される成長因子であるため、上皮発現は、乳房腫瘍細胞中のＦｇｆ７については予測されなかった。インビボ発現が見出されたという事実は、動物の腫瘍の成長における自然な状態に関係し、ここで該細胞は、腫瘍中でも成長する通常の間質細胞により包囲されている。間質細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、マスト細胞及び含脂肪細胞を含む。（レスポンダー腫瘍に対して）より大きなノンレスポンダー腫瘍におけるＦｇｆ７の高い発現は、間質のより高い割合のために排除できる。これは、溶媒対照の分析された腫瘍がいくつかのケースにおいて３倍大きく、そしてこれらの腫瘍におけるＦｇｆ７発現が３倍低いことから、特異的な効果が推定できるためである。
【００５１】
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン−感受性細胞株Ｔ４７−Ｄにおける間葉因子Ｆｇｆ７の影響をインビトロで調査した。組換えＦｇｆ７が添加された培地中の細胞は、ＰＲを顕著に下方制御することが示された。該受容体のＰＲ−Ａアイソフォームは顕著に下方制御されたため、ウェスタンブロットにおいて極めて弱いバンドが見えただけであり、したがってＰＲ特性は、おおよそＰＲ陽性であるが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン−耐性細胞株であるＢＴ−４７４とＺＲ７５−１に対応した。これは、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの効果がＰＲ−Ａアイソフォームによって媒介されることを示唆している。
【００５２】
続いて、Ｆｇｆ７の影響下における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対する感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の応答を調査した。培地にＦｇｆ７を伴わない増殖アッセイは、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン−成長阻害の明確な用量−応答関係が、濃度上昇に従い大きくなることを明らかにし、５０％成長阻害を達することができた。非用量−応答関係は、培養培地へのＦｇｆ７（５０ｎｇ／ｍｌ）の添加においては見られなかった。最大成長阻害は約２０％であったが、用量と応答の相関は存在しなかった。この効果はおそらく、高濃度のＦｇｆ７によって強化されたものと考えられる；文献中、いくつかのケースで５００ｎｇ／ｍｌが利用されているが、予備実験は、５０ｎｇ／ｍｌの濃度がＰＲの顕著な下方制御をもたらすため、これは１００ｎｇ／ｍｌの場合よりも強くないが、この濃度が選択された。
【００５３】
Ｆｇｆ７の影響下において細胞が完全にホルモン−独立性の成長を示したことは特に興味深い。これは、結局、標的としてＥＲを必要とする抗エストロゲンに対する耐性についてのマーカーとしてＦＧＦ７の重要性を実証することに寄与する。Ｔ４７−Ｄ細胞は、Ｅ２の存在においてのみ増殖し、Ｅ２消失は最大成長阻害のチェックとして寄与する。Ｆｇｆ７を伴わない増殖試験において、６０％程度の最大阻害を達成することができた。Ｆｇｆ７の培地への添加において、該効果は実質的に小さく、阻害は僅か２９％であった。したがって、Ｆｇｆ７はＥＲやＰＲのみを下方制御するだけでなく、抗エストロゲンやプロゲスターゲンの標的が喪失しても、成長ホルモンとしてそれ自体が更に作用し、抗ホルモン効果又はホルモン消去が補償される。
【００５４】
Ｆｇｆ７はタンパク質バイオマーカー候補である。１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理におけるノンレスポンダー腫瘍において、Ｆｇｆ７はレスポンダー腫瘍と対比して、対照腫瘍と比較して３倍上方制御した。これは、２回目のインビボ実験において独立に確認された。Ｆｇｆ７は、局所効果を有するが、分泌される一方向傍分泌因子であるため、上昇したＦｇｆ７血清レベルが１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対する非応答との関連性の調査が必要となる。更に、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの効果は、Ｆｇｆ７の影響下において顕著に減少され、そしてＴ４７−Ｄ細胞のホルモン依存性もまた取り除かれたことが示された。
【００５５】
参考文献
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロゲステロン受容体アンタゴニスト、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン及び抗エストロゲンのためのバイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び対応する受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用に関する。
【０００２】
プロゲステロン受容体アンタゴニスト、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンは、ＺＫ２３０２１１又はＺＫ−ＰＲＡの名称でも知られており、以下の式：
【化１】
を有し、他の内分泌学的効果をほとんど伴わずに、あるいは全く伴わずに、高い抗プロゲステロン活性を示す (Fuhrmann, U. et al., J. Med. Chem. 2000, 43, 5010-5016)。
【０００３】
線維芽細胞成長因子７（Ｆｇｆ７）又は他のケラチノサイト成長因子（ｋｇｆ）は、２２のメンバーを含む分泌性糖タンパク質ファミリーに属する (Grose and Dickson 2005)。Ｆｇｆ７は、間葉に由来する細胞により産生され、そして上皮細胞により発現されるＦｇｆｒ２ｂに特異的に結合する。したがって、Ｆｇｆ７は、間葉−上皮シグナルを媒介する傍分泌因子である。異種移植実験において、Ｆｇｆ７を過剰発現するＭＣＦ−７腫瘍は、Ｆｇｆ７過剰発現を伴わないＭＣＦ−７細胞の腫瘍よりも明らかに大きかった (Zang, Bullen et al. 2006)。Ｆｇｆ７はＤＮＡ合成、ならびに腫瘍細胞の増殖及び遊走を刺激する。Ｆｇｆ７を投与した雌ラットは、巨大な管過形成を発生し、そしてＦｇｆ７を過剰発現するマウスは、まず、乳癌に発達する過形成を発生した。ＥＲ及びＰＲを伴わない高度に脱分化した乳癌は、極めて低レベルのＦｇｆｒ２ｂを示したが、よく脱分化した腫瘍はＦｇｆｒ２ｂの強い発現を示したことから、Ｆｇｆ７媒介刺激及び増殖は、進行や転移に導く分子カスケードにおいて極めて初期の事象であるものと推測される。ＥＲ−陽性細胞株、例えばＭＣＦ−７、Ｔ４７−Ｄ及びＺＲ７５−１は、Ｆｇｆ７による刺激において増大した増殖及び遊走を示す一方、ＥＲ−陰性細胞株、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１はこれらを示さないことが判明している (Zang and Pento 2000)。Ｆｇｆ７、Ｆｇｆｒ２ｂの発現及びＥＲ−αの発現において相関関係を示す可能性がある。同時に、強いＦｇｆ７発現を伴う腫瘍のアポトーシス率は明らかに低かった(Tamaru, Hishikawa et al. 2004)。
【０００４】
間質細胞におけるＦｇｆ７の発現は多数の因子によって制御される。マクロファージや他のいくつかの細胞により産生される前炎症性サイトカインのインターロイキン１及びインターロイキン６での刺激によって線維芽細胞におけるＦｇｆ７発現を増大することができた。他の成長因子、例えば血小板由来成長因子ＢＢ（ｐｄｇｆＢＢ）及び形質転換成長因子αも同様に、間葉細胞におけるＦｇｆ７の発現を増大した(Finch and Rubin 2006)。
【０００５】
Ｆｇｆ７はタモキシフェンによる治療に対してＭＣＦ−７細胞の耐性を誘発することが示されている。培養培地への組換えＦｇｆ７の添加は、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいてＥＲ−α及びＰＲの両方を明らかに下方制御し、タモキシフェンは増殖試験において活性を示さなかった。正のフィードバックメカニズムが仮定される：
Ｆｇｆ７は内因性アロマターゼの産生を刺激し、これによりアンドロゲンのＥ２への転化を増大する(Chang, Sugimoto et al. 2006)。
【０００６】
線維芽細胞成長因子受容体（Ｆｇｆｒ）は、構造的に関係がある４つの遺伝子（Ｆｇｆｒ１〜Ｆｇｆｒ４）によってコードされる膜貫通チロシンキナーゼである。オルタナティブ・スプライシングは、該受容体の更なるアイソフォームをもたらす。Ｆｇｆｒ２のスプライス変異はＦｇｆｒ２ｂとＦｇｆｒ２ｃである。Ｆｇｆｒ２ｂは、上皮起源の細胞でのみ産生され、そしてＦｇｆｒ２ｃは間葉細胞でのみ産生される。Ｆｇｆｒ２ｂは成長因子Ｆｇｆ７に特異的な受容体であり、乳癌の約５％において発現され(Finch and Rubin 2006)、そしてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐｌ３Ｋ）を介してシグナル伝達カスケードを媒介する (Moffa, Tannheimer et al. 2004)。免疫組織学的研究において、ＦＧＦＲ２ｂは乳房組織の上皮細胞において検出された。この場合、正常な組織と悪性組織における定量的な相違は検出されず、そして間質細胞においてＦＧＦＲ２ｂは検出できなかった(Palmieri, Roberts-Clark et al. 2003)。
【０００７】
腫瘍や癌の進行及びそれに関係する制御における細胞過程の複雑な関係を考慮すれば、活性成分による治療を目的としたバイオマーカーの使用は極めて必要とされる。
【発明の概要】
【０００８】
このたび、驚くべきことに、Ｆｇｆｒ２ｂ遺伝子発現における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療の影響が、細胞株において示されることが発見された。Ｆｇｆｒ２ｂはＦｇｆ７の特異的な受容体である。このたび、驚くべきことに、Ｆｇｆ７による刺激が、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療に対する耐性の発達に相関することが発見された（Ｔ４７Ｄ／Ｔ４７Ｄ−耐性を参照のこと）。同時に、高度なＦｇｆｒ２発現を伴う細胞は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンによる治療に対してあまりよく応答しないか、あるいは全く応答しないことから、Ｆｇｆｒ２は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンの使用のための潜在的な分類マーカー（stratifying marker)として考えられる。
【０００９】
したがって、例えば、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンに耐性であるＴ４７−Ｄ細胞においては、感受性細胞よりも発現が高いことが発見された。
【００１０】
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療は、該細胞においてＦｇｆｒ２ｂの下方制御に導き、該受容体Ｆｇｆｒ２ｂの応答マーカーとしての用途が示唆される。
【００１１】
ｓｉＲＮＡノックダウン手段による、耐性Ｔ４７Ｄ細胞におけるＦＧＦＲ２ｂ発現の減少は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ４，９−ジエン−３−オンに対する感受性を回復することを示すことができた。これは、ＦＧＦＲ２ｂが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの耐性に打ち勝ち、その効果を強化するための、ＦＧＦＲ２ｂキナーゼを阻害する小分子、ＦＧＦＲ２ｂに対する抗体又は遺伝子治療のいずれかによる併用治療の標的であることを示す。
【００１２】
したがって、本発明は、癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニスト１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン
【化２】
のためのバイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７の使用に関する。
【００１３】
本発明はさらに、癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニスト１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンのためのバイオマーカーとしての受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用に関し、ここで線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂは、腫瘍又は腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして使用され、そして血清中の高濃度のＦＧＦ７は、該腫瘍及び腫瘍細胞における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療に対する内因性抵抗及び高いＦｇｆｒ２ｂ発現に関係する。
【００１４】
本発明は更に、細胞培養液及び血清中のプロゲステロン受容体アンタゴニスト１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性を測定するためのインビトロ方法であって、ここで線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが該測定のためのバイオマーカーとして使用される方法に関する。
【００１５】
これに関して、線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂは、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍又は腫瘍細胞において、あるいは高いＦｇｆｒ２発現を伴う細胞において、Ｆｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられる。
【００１６】
分類マーカーとしてのこれらの特性において、線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び受容体Ｆｇｆｒ２ｂはまた、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの使用における耐性調節のための標的としても用いられる。
【００１７】
本発明は更に、抗エストロゲンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用、及び線維芽細胞成長因子又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、抗エストロゲンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられるインビトロ方法に関する。
【００１８】
線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂと一緒に利用される適当な抗エストロゲンは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、アルゾキシフェン、ＧＷ５６３８*）、ＥＭ−８００**)、イドキシフェン及びバセドキシフェンである。
【００１９】
*）該化学構造は、Wilson et al., Endocrinology 138, 3901 , (1997) 及びWu et al., Mol. Cell, 18, 413, (2005)に開示されている。
**)該化学構造は、Labrie et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 79, 213, (2001)に開示されている。
【００２０】
本発明はまた、腫瘍組織及び腫瘍細胞におけるＦＧＦ７及びＦＧＦＲ２の非侵襲的な測定のためのインビトロ造影（imaging)方法であって、造影を許容する標識を含むこれらのタンパク質に対する抗体を使用する方法に関する。造影を許容する標識は、例えば蛍光標識又は他の放射性標識である。
【００２１】
使用することができる適当な蛍光マーカーや適当な放射性マーカーは、一般に知られており、かつ十分に記載されている。
【００２２】
本発明は更に、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムのＦＧＦ７発現を低下するため、ならびにＦＧＦ７−遮断抗体及び可溶性受容体の循環を不活性化するためのインビトロ方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理におけるＭＸＴ腫瘍モデルにおける腫瘍面積の変化を示す。
【図２】１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理におけるＭＸＴ腫瘍モデルにおける腫瘍面積の変化を示す（試験再現）。
【図３】培養培地にＦｇｆ７（２０ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌ）添加して、２４時間及び７２時間培養し、その後ウェスタンブロットにおいてＰＲの量が測定されたＴ４７−Ｄ細胞を示す。
【図４】Ｆｇｆ７の影響下における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによるＴ４７−Ｄ細胞の増殖アッセイを示す。
【図５】６つのモデル細胞株におけるＦｇｆｒ２対１８Ｓ ｒＲＮＡの相対発現を示す。
【００２４】
以下の実施例は、これらの例に限定することなく本発明の実施可能性を実証するものである。
【実施例】
【００２５】
例１
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対して良好に応答する腫瘍（レスポンダー)、及び１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理において良好な成長を示し続け、かつ耐性メカニズムの可能性を示す腫瘍（ノンレスポンダー）の同定
該試験のために、すでに厳密なホルモン依存性ではないＭＸＴ−Ｍ３腫瘍をマウスに移植した。
【００２６】
ウレタン溶液の腹腔内投与により、Ｃ５７ＢＬｘＤＢＡ２Ｆ１マウスにおいてＭＸＴ（＋）腫瘍モデルを誘発させた。進行中の乳房腫瘍は同じ遺伝的背景を有するマウス（同系）に更に移植することができ、そしてこれはすでに確立されたモデルである。ＭＸＴ（＋）モデルは、生理学的濃度において該腫瘍がＥＲとＰＲの両方を発現するという事実によって特に区別される。他のホルモン受容体陽性腫瘍モデルも存在するが、しばしばこれらのＥＲ及びＰＲは機能的ではなく、刺激後に細胞質から核への転座を示さない。そしてまた、ホルモン消失（ablation)による成長阻害を示すこともできない。このようなモデルは、抗ホルモン物質の研究のためには不適当である(Watson, Medina et al. 1977)。
腫瘍成長の結果は図１に示される。
【００２７】
試験の終了時に動物を犠牲にし、そして腫瘍を除去し、その後該腫瘍の重量を測定した。該腫瘍重量の変動は各々のグループにおいて高い。溶媒対照グループにおける平均腫瘍重量（４２７ｍｇ）は、卵巣切除グループ（１５５ｍｇ）よりも２．８倍高く、そして１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループ（１９２ｍｇ）よりも２．２倍高かった。
【００２８】
更なる遺伝子発現実験のために、選択した腫瘍のＲＮＡを単離し、そしてGeneChip分析及びリアルタイムＰＣＲでさらに分析した。
【００２９】
溶媒対照グループから最も大きな５つの腫瘍を選択した。処理グループにおける１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンに対するノンレスポンダーにより上方制御されることが発見された遺伝子が、各々の腫瘍サイズにおける排他的な成長に起因せず、該物質への暴露における腫瘍成長に特異的に上方制御されることを保証することを目的とした。
【００３０】
卵巣切除グループ及び１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループにおいて制限を設定した：１００ｍｇ以上の重量を有する腫瘍をノンレスポンダーとして評価し、そして１００ｍｇ以下の重量を有する腫瘍をレスポンダーとして分類した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
ノンレスポンダー腫瘍において、Ｆｇｆ７は溶媒対照よりも３．１２倍強く発現し、そしてレスポンダー腫瘍においては、対照と比較して７０％に小さく下方制御した。
【００３３】
処理において、Ｆｇｆｒ２は、３０％（レスポンダー腫瘍対対照）及び５５％（ノンレスポンダー対対照）に明確に下方制御される。しかしながら、一般的に、発現はノンレスポンダーでより高い。
【００３４】
例２
インビボ確認実験
例１からのインビボ実験の腫瘍ＲＮＡの研究において、バイオマーカー候補を同定することができた。これらの可能性のある候補を確認するために、グループあたり動物数を１０〜２０増やして、同じ研究デザインにより独立した動物実験を行った。
【００３５】
試験の終了時に、腫瘍を除去し、該腫瘍重量を測定し、そしてＲＮＡが単離されるまで−８０℃で腫瘍を保存した。該結果は図２に示される。
【００３６】
確認実験において、腫瘍重量は、グループ内で高い変動を示した。溶媒対照グループにおける平均腫瘍重量は５７７ｍｇであり、そして卵巣切除グループ（１８０ｍｇ）よりも３．２倍高く、そして１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループ（２１５ｍｇ）よりも２．７倍高かった。例１の実験と同様に、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループの平均腫瘍重量は、卵巣切除グループよりも僅かに高かったが、対照グループよりも明らかに低かった。
【００３７】
先の実験において、溶媒対照動物の平均腫瘍重量は、卵巣切除グループ及び１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンで処理したグループよりも極めて高いといえるほどではなく、この実験においては、僅かに優れた腫瘍のホルモン依存性を示唆する。
【００３８】
試験１と同様に、治療の応答（レスポンス）及び非応答（ノンレスポンス）についての制限を、１００ｍｇの腫瘍重量に設定した。対照グループから最も大きな５つの腫瘍を選択した。該腫瘍からＲＮＡを単離し、そしてバイオマーカー候補の遺伝子発現を測定した。結果を以下の表に挙げる：
【００３９】
【表２】
【００４０】
例３
ＦＧＦ７の影響下におけるプロゲステロン受容体のウェスタンブロット分析
ＦＧＦ７がＥＲとＰＲの両方を下方制御することは文献中に報告されている。この効果を検証するために、様々な量のＦＧＦ７を有する培地において、細胞を２４時間及び７２時間インキュベートし、その後ＰＲ含有量を測定した。
【００４１】
ＰＲの量におけるＦｇｆ７の影響は極めて明確である。濃度の減少とともに、ＰＲの明らかな減少が見られる。ＰＲ−ＡとＰＲ−Ｂの両方のアイソフォームは、顕著に減少する。２４時間及び７２時間のＦｇｆ７でのインキュベーション後、該効果は明白であった。
該結果は図３に示される。
【００４２】
例４
ＦＧＦ７の影響下における細胞成長
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性におけるＦＧＦ７の影響を、Ｔ４７−Ｄ細胞において調査した。該細胞は、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対して感受性応答を示した。５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７を培地に添加し、そして増殖アッセイにおいてＺＫ−ＰＲＡの活性を測定した。
【００４３】
該増殖アッセイにおいて、感受性のＴ４７−Ｄ細胞で１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンは良好な活性を示した。最大の成長対照（全ての添加及びＥ２を伴う培地）は、同様に１００％で設定し、そして最小対照（全ての添加を伴うが、Ｅ２がなく、血清を奪われている）は４２％の成長を示した。したがって、Ｅ２の退薬を介して５８％成長を阻害することができた。
【００４４】
最も高い物質濃度（１０-5ｍｏｌ／ｌ）において、成長は４２％阻害され、１０-6ｍｏｌ／ｌにおいて４７％阻害され、そして１０-7ｍｏｌ／ｌにおいて５０％阻害された。より低い濃度において、成長はさらに増大する。最も低い濃度（１０-11ｍｏｌ／ｌ）における成長は１１４％であった。
【００４５】
ＦＧＦ７（５０ｎｇ／ｍｌ）の培地への添加において、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンは、感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の増殖において、より小さな阻害を示した。最小対照（Ｅ２消失）においては、細胞増殖を２９％だけ減少でき、これは依然最大対照の７１％であった。最も高い濃度（１０-5ｍｏｌ／ｌ）において、成長は２４％阻害され、そして次に低い濃度においては１８％阻害された。最も低い濃度（１０-11ｍｏｌ／ｌ）において、成長は最大対照の１１４％に達した。
該結果は図４に示される。
【００４６】
例５
インビボにおける６つのモデル細胞株におけるＦｇｆｒ２対１８Ｓ ｒＲＮＡの相対発現
インビボ実験（上記を参照のこと）において、ノンレスポンダー腫瘍及びレスポンダー腫瘍におけるＦｇｆｒ２の発現は、未処理対照グループよりも２分の１〜４分の１弱かった。
【００４７】
線維芽細胞成長因子７（Ｆｇｆ７）の受容体の発現は、ＺＫ−ＰＲＡの処理における感受性Ｔ４７−Ｄ細胞において制御されなかった（ＺＫ−ＰＲＡでの処理において１．１倍高い）。未処理のＺＫ−ＰＲＡ−耐性Ｔ４７−Ｄにおける発現は、感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の場合よりも２倍高く、そしてＺＫ−ＰＲＡ処理により、未処理の感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の１．３倍の値まで僅かに減少した。他の全ての細胞における発現は、通常の培地及びＺＫ−ＰＲＡによる処理の両方において顕著に少なかった：
【００４８】
未処理ＢＴ−４７４細胞におけるｍＲＮＡの量は、未処理Ｔ４７−Ｄ細胞よりも２１倍少なく、そしてＺＫ−ＰＲＡによる処理においては、３７倍低い値まで低下した。ＭＣＦ−７について見られた初期値は６４倍低く、そしてＺＫ−ＰＲＡ処理では、未処理の感受性Ｔ４７−Ｄ細胞と比較して、実際に１５３倍低かった。ＺＲ７５−１における発現は、未処理のＴ４７−Ｄ細胞よりも３．７倍低く、そして処理により通常の条件下のＴ４７−Ｄと比較して、９．４倍低い発現まで低下した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１における発現は、実際に１００００倍低く、検出限界を僅かに超えるものであった。
該結果は図５に示される。
【００４９】
例えば、ノンレスポンダー腫瘍においてＦｇｆ７が、溶媒対照と比較して、レスポンダー腫瘍の場合よりも３倍強いことは、例１から明らかであり、これは確認実験において再現可能であった。
【００５０】
インビトロ実験において、ヒト乳癌細胞中ではＦｇｆ７ｍＲＮＡは検出できなかった。Ｆｇｆ７は間葉細胞中で産生される成長因子であるため、上皮発現は、乳房腫瘍細胞中のＦｇｆ７については予測されなかった。インビボ発現が見出されたという事実は、動物の腫瘍の成長における自然な状態に関係し、ここで該細胞は、腫瘍中でも成長する通常の間質細胞により包囲されている。間質細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、マスト細胞及び含脂肪細胞を含む。（レスポンダー腫瘍に対して）より大きなノンレスポンダー腫瘍におけるＦｇｆ７の高い発現は、間質のより高い割合のために排除できる。これは、溶媒対照の分析された腫瘍がいくつかのケースにおいて３倍大きく、そしてこれらの腫瘍におけるＦｇｆ７発現が３倍低いことから、特異的な効果が推定できるためである。
【００５１】
１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン−感受性細胞株Ｔ４７−Ｄにおける間葉因子Ｆｇｆ７の影響をインビトロで調査した。組換えＦｇｆ７が添加された培地中の細胞は、ＰＲを顕著に下方制御することが示された。該受容体のＰＲ−Ａアイソフォームは顕著に下方制御されたため、ウェスタンブロットにおいて極めて弱いバンドが見えただけであり、したがってＰＲ特性は、おおよそＰＲ陽性であるが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン−耐性細胞株であるＢＴ−４７４とＺＲ７５−１に対応した。これは、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの効果がＰＲ−Ａアイソフォームによって媒介されることを示唆している。
【００５２】
続いて、Ｆｇｆ７の影響下における１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対する感受性Ｔ４７−Ｄ細胞の応答を調査した。培地にＦｇｆ７を伴わない増殖アッセイは、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン−成長阻害の明確な用量−応答関係が、濃度上昇に従い大きくなることを明らかにし、５０％成長阻害を達することができた。非用量−応答関係は、培養培地へのＦｇｆ７（５０ｎｇ／ｍｌ）の添加においては見られなかった。最大成長阻害は約２０％であったが、用量と応答の相関は存在しなかった。この効果はおそらく、高濃度のＦｇｆ７によって強化されたものと考えられる；文献中、いくつかのケースで５００ｎｇ／ｍｌが利用されているが、予備実験は、５０ｎｇ／ｍｌの濃度がＰＲの顕著な下方制御をもたらすため、これは１００ｎｇ／ｍｌの場合よりも強くないが、この濃度が選択された。
【００５３】
Ｆｇｆ７の影響下において細胞が完全にホルモン−独立性の成長を示したことは特に興味深い。これは、結局、標的としてＥＲを必要とする抗エストロゲンに対する耐性についてのマーカーとしてＦＧＦ７の重要性を実証することに寄与する。Ｔ４７−Ｄ細胞は、Ｅ２の存在においてのみ増殖し、Ｅ２消失は最大成長阻害のチェックとして寄与する。Ｆｇｆ７を伴わない増殖試験において、６０％程度の最大阻害を達成することができた。Ｆｇｆ７の培地への添加において、該効果は実質的に小さく、阻害は僅か２９％であった。したがって、Ｆｇｆ７はＥＲやＰＲのみを下方制御するだけでなく、抗エストロゲンやプロゲスターゲンの標的が喪失しても、成長ホルモンとしてそれ自体が更に作用し、抗ホルモン効果又はホルモン消去が補償される。
【００５４】
Ｆｇｆ７はタンパク質バイオマーカー候補である。１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理におけるノンレスポンダー腫瘍において、Ｆｇｆ７はレスポンダー腫瘍と対比して、対照腫瘍と比較して３倍上方制御した。これは、２回目のインビボ実験において独立に確認された。Ｆｇｆ７は、局所効果を有するが、分泌される一方向傍分泌因子であるため、上昇したＦｇｆ７血清レベルが１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンによる処理に対する非応答との関連性の調査が必要となる。更に、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの効果は、Ｆｇｆ７の影響下において顕著に減少され、そしてＴ４７−Ｄ細胞のホルモン依存性もまた取り除かれたことが示された。
【００５５】
参考文献
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン
【化１】
のためのバイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７の使用。
【請求項２】
癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンのためのバイオマーカーとしての受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用。
【請求項３】
癌及び腫瘍に関連する細胞増殖の治療のための医薬の製造のための、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンでの治療に対して内因性抵抗を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のため、又は腫瘍細胞における高いＦｇｆｒ２発現の上方制御のための分類マーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用。
【請求項４】
細胞培養液及び血清中のプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性を測定するためのインビトロ方法であって、線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７が測定のためのバイオマーカーとして使用されることを特徴とする方法。
【請求項５】
細胞培養液中のプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性を測定するためのインビトロ方法であって、受容体Ｆｇｆｒ２ｂが測定のためのバイオマーカーとして使用されることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンでの治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞において、又は高いＦｇｆｒ２発現を伴う細胞において、Ｆｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項４及び５のいずれか１項に記載のインビトロ方法。
【請求項７】
線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの使用における耐性調節のための標的として用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
腫瘍細胞におけるＦＧＦ７及びＦＧＦＲ２の非侵襲的な測定のための造影方法であって、造影を許容する標識を含むこれらのタンパク質に対する抗体が用いられる方法。
【請求項９】
蛍光標識又は放射性標識が造影のための標識として存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、抗エストロゲンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられることを特徴とする、インビトロ方法。
【請求項１１】
抗エストロゲンとして、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、アルゾキシフェン、ＧＷ５６３８*）、ＥＭ−８００**)、イドキシフェン又はバセドキシフェンが使用されることを特徴とする、請求項１０に記載のインビトロ方法。
【請求項１２】
ＦＧＦ７発現を減少させ、かつＦＧＦ７遮断抗体及び可溶性受容体の循環を不活性化するためのインビトロ方法。
【請求項１】
癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン
【化１】
のためのバイオマーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７の使用。
【請求項２】
癌及び腫瘍に関する細胞増殖の治療のための医薬の製造のためのプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンのためのバイオマーカーとしての受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用。
【請求項３】
癌及び腫瘍に関連する細胞増殖の治療のための医薬の製造のための、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンでの治療に対して内因性抵抗を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のため、又は腫瘍細胞における高いＦｇｆｒ２発現の上方制御のための分類マーカーとしての線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂの使用。
【請求項４】
細胞培養液及び血清中のプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性を測定するためのインビトロ方法であって、線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７が測定のためのバイオマーカーとして使用されることを特徴とする方法。
【請求項５】
細胞培養液中のプロゲステロン受容体アンタゴニストである１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの活性を測定するためのインビトロ方法であって、受容体Ｆｇｆｒ２ｂが測定のためのバイオマーカーとして使用されることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンでの治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞において、又は高いＦｇｆｒ２発現を伴う細胞において、Ｆｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられることを特徴とする、請求項４及び５のいずれか１項に記載のインビトロ方法。
【請求項７】
線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７及び受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オンの使用における耐性調節のための標的として用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
腫瘍細胞におけるＦＧＦ７及びＦＧＦＲ２の非侵襲的な測定のための造影方法であって、造影を許容する標識を含むこれらのタンパク質に対する抗体が用いられる方法。
【請求項９】
蛍光標識又は放射性標識が造影のための標識として存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
線維芽細胞成長因子Ｆｇｆ７又は受容体Ｆｇｆｒ２ｂが、抗エストロゲンによる治療に対して耐性を伴う腫瘍細胞におけるＦｇｆ７の上方制御のための分類マーカーとして用いられることを特徴とする、インビトロ方法。
【請求項１１】
抗エストロゲンとして、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、アルゾキシフェン、ＧＷ５６３８*）、ＥＭ−８００**)、イドキシフェン又はバセドキシフェンが使用されることを特徴とする、請求項１０に記載のインビトロ方法。
【請求項１２】
ＦＧＦ７発現を減少させ、かつＦＧＦ７遮断抗体及び可溶性受容体の循環を不活性化するためのインビトロ方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３０５２３（Ｐ２０１０−５３０５２３Ａ）
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０７０２（Ｐ２０１０−５１０７０２）
【出願日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４６７５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４８５８２
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（３０００４９９５８）バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４６７５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４８５８２
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（３０００４９９５８）バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト (357)
【Ｆターム（参考）】
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