ヒトまたは動物の体表面感染の治療
ヒトまたは動物の体表面感染、特に真菌感染の治療方法は、感染した体表面、例えば爪部位に水性液体を塗布し、その後、過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む。また、その方法に使用するためのドレッシング材の液体の組み合わせが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染症、特にヒトの爪部位における真菌感染症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
見た目にも良好なコンディションにある健康な爪は、ヒトの外見にとって極めて重要な一面である。爪の外見、強さおよび健康は、病原性真菌細胞、代表的にはトリコフィトン（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属の真菌細胞に感染することによって悪影響を受けることが少なくなく、感染性真菌を除去することにより、影響を受けた爪の外見を改善する治療法が強く求められている。市場には多くの治療薬が出回っているものの、利用できる技術や製品に対する不満が広がっている。
【０００３】
全身に送られた薬剤は血流によって爪部位に到達し得るが、血液の循環から爪部位への浸透が困難なことや重大な副作用があるために、このアプローチの有用性は低い。
【０００４】
真菌に感染した爪は、多くの場合、侵入した真菌の作用で多孔質または多くの穴が開いた状態になる。このため、爪にはしばしば細菌による共コロニー化が起こり、破壊酵素および局所活性毒素がさらに放出される結果、真菌による損傷の影響が増幅されるおそれがある。
【０００５】
既知の治療法により爪の真菌感染が軽減されたとしても、完全に除去されることは殆どなく、普通は治療を止めるとすぐに感染が元に戻ることはよく知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、活性成分が容易に爪に浸透せず、浸透したとしても最表面に塗布した物質のほんの僅かしか、真菌細胞が比較的安全に棲むことができる下部構造には到達しないことを見出した。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染、例えば真菌感染の治療方法であって、感染した体表面、例えば爪部位に水性液体を塗布し、その後、過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む方法に関する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染、例えば、特にヒトまたは動物の爪部位（これ以外を排除するものではない）の真菌感染の治療における、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせに関する。
【０００９】
第３の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染、例えば、特にヒトまたは動物の爪部位（これ以外を排除するものではない）の真菌感染の治療用薬剤の製造における、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせの使用に関する。
【００１０】
水性液体を感染体表面に塗布すると、体表面は軟化してより多孔質になる。これにより、例えば、存在する孔から爪部位の内部への液体の浸入が可能になる。このように、液体は、体表面、例えば爪部位の内部への水の流路を提供する。
【００１１】
したがって、その後、過酸化水素源を含有するドレッシング材を適用すれば、形成された水の流路に沿って過酸化水素が、体表面、例えば爪部位の内部の到達し難い部分に十分に拡散することになり、過酸化水素が深く浸透して、例えば爪部位のあらゆる部分における感染、例えば真菌感染を大きく低減ないし除去することができる。
【００１２】
爪は特有の組織および組成を有しており、このことは、爪板およびその下部の爪床、並びに付随する全ての構造を対象とする治療法の新しいアプローチを考える際に認識しておかなければならないことである。爪の最も目立つ部分である爪板は、死んで角質化した細胞（角質細胞）から作られ、爪の基部にある爪母基から押し上げられた、硬質のケラチン構造体から構成されている。爪板の殆どの部分は半透明であるため、真皮中の血液供給の色が透けて見え、ピンク色を呈する。爪自体は水分をあまり含まないが、水に晒されると比較的水和状態になり、柔軟で曲げやすい状態になる。
【００１３】
爪郭、すなわち爪の側部と重なり合う皮膚の襞は、爪板を在るべき位置に保持し、その端部を保護する。生きていて再生する爪の唯一の部分は爪母基であり、あま皮の直下にある。新しい細胞はここで生まれ、成長とともに絶えず前方に押し出されて爪板を形成する。爪母基には、また、神経と、細胞に栄養および酸素を供給するための多くの血管が備わっている。
【００１４】
爪板は爪床の上に載っており、この爪床は母基と繋がっている。これにもまた血管と神経が多く備わっている。その表面には多数の平行な稜が形成されており、それらは爪板の下面の稜に正確に嵌合している。あま皮は爪と重なり合う、皮膚の表皮の一部である。それは細菌の侵入や物理的ダメージから母基を保護する。
【００１５】
真菌細胞はこれらの構造体のどの部分にも棲息し増殖することができ、爪板主要部の感染を除去するとともに、残留する感染病巣もすべて除去するためには、治療があらゆる部位に広く行き渡ることが重要である。
【００１６】
用語「爪部位」は、本明細書中では、爪板、爪床、爪母基、爪郭およびあま皮を含むものと定義する。
【００１７】
本発明は、また、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した細胞の治療方法であって、本明細書中で定義した水性液体を感染細胞へ塗布し、その後、本明細書中で定義した過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、また、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した細胞の治療における、本明細書中で定義した水性液体と、本明細書中で定義した過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせに関する。
【００１９】
好ましい実施形態では、水性液体はペルオキシダーゼ酵素を含む。ペルオキシダーゼは体表面、例えば爪部位の内部へ拡散する。
【００２０】
ペルオキシダーゼ酵素は、体表面、例えば爪の内部に浸透しても、過酸化水素がドレッシング材から水性通路を経て拡散してくるまで、実質的に不活性を維持する。ペルオキシダーゼが存在すると、過酸化水素の酸化作用が促進される。
【００２１】
このようにペルオキシダーゼは、真菌細胞の細胞膜および／または細胞質の上または内部の、傷つきやすいが必須である真菌分子の酸化を触媒するので、過酸化水素の活性、特に抗真菌活性を大幅に促進することがわかった。
【００２２】
ラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ヨウ化物ペルオキシダーゼ、塩化物ペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼなどの、任意の適切なペルオキシダーゼを使用することができる。しかしながら、これまでのところでは、ラクトペルオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。
【００２３】
水性液体中のペルオキシダーゼ酵素の濃度は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００〜５００μｇ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００２４】
水性液体は、また、界面活性剤および／または溶媒を含むことが好ましい。それらは体表面、例えば爪への液体の浸透を促進することがわかった。
【００２５】
ドレッシング材は、それを適用するとすぐに過酸化水素が爪部位へ効率良く拡散し得るよう、含水状態にあることが好ましい。爪部位とドレッシング材との間に接触液体接合部を形成するために、ドレッシング材には十分な水が必要である。
【００２６】
流体および溶質の必要な流れを促進するため、水性液体の浸透力がドレッシング材中の液体のそれと同じか近似していることが好ましい。
【００２７】
ドレッシング材は使用時に爪部位に水分を与えることが好ましく、これは知られた方法で適切な浸透特性を選択することにより達成される。
【００２８】
ドレッシング材の材料は、ドレッシング材と爪部位との間に、制御された拡散通路を作るために十分な水分を保持することができる、ヒドロゲル、スポンジ、発泡体の形態、または親水性マトリックスのいくつかの他の形態とすることができる。ドレッシング材は、例えば水素結合によって過酸化水素の通路を調節する働きのある溶質を含有することが好ましい。これは、ポリマー、例えば、グリコサミノグリカンなどのポリサッカライドの濃度を適切に調節することにより達成し得る。
【００２９】
ドレッシング材は、湿った綿のドレッシング材を含んでもよく、あるいは湿った成分を含む構造用芯材を含んでもよい。しかしながら、ドレッシング材は、１種以上の水をベースとしたゲル、すなわち水性のゲル（水和ヒドロゲルともいう）を含むことが好ましい。そのようなゲルは、後述するように、種々の材料で生成することができ、種々の薬剤を含有することができる。
【００３０】
典型的には、ドレッシング材は、シート、層またはフィルムの形態を有するであろう。あるいは、ドレッシング材は、ノズルから絞り出されるなど、固定した形態または形状を持たず、３次元的に変形し、形作ることができる、アモルファスのゲルまたはローションの形態であってもよい。好ましくは、ヒドロゲルである。アモルファスゲルは、通常、架橋されていないか、あるいは僅かに架橋されている。剪断減粘性アモルファスゲルを使用してもよい。そのようなゲルは、剪断応力を受けているとき（例えば、ノズルから注出または絞り出されるとき）は液体であるが、静止しているときは固まっている。
【００３１】
適切な水和ヒドロゲルは、国際公開第０３／０９０８００号パンフレットに開示されている。水和ヒドロゲルは、親水性ポリマー物質を含んでいると好都合である。適切な親水性ポリマー物質としては、例えばＦｉｒｓｔ Ｗａｔｅｒ Ｌｔｄからシート状ヒドロゲルの形態で供給されるポリアクリレートおよびメタクリレートが挙げられる他、さらに、ポリ２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸（ポリＡＭＰＳ）またはその塩（例えば、国際公開第０１／９６４２２号パンフレットに記載）、ポリサッカライド、例えばポリサッカライドガム、特にキサンタンガム（例えば、Ｋｅｌｔｒｏｌの商標で入手可能）、各種糖類、ポリカルボン酸（例えば、ＩＳＰ ＥｕｒｏｐｅからＧａｎｔｒｅｚ ＡＮ−１６９ ＢＦの商標で入手可能）、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ ＡＮ １３９の商標で入手可能、分子量２０，０００〜４０，０００の範囲）、ポリビニルピロリドン（例えば、ＰＶＰ Ｋ−３０およびＰＶＰ Ｋ−９０として知られる、商業的に入手可能なグレードの形態で）、ポリエチレンオキサイド（例えば、Ｐｏｌｙｏｘ ＷＳＲ−３０１の商標で入手可能）、ポリビニルアルコール（例えば、Ｅｌｖａｎｏｌの商標で入手可能）、架橋ポリアクリル酸ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ＥＺ−１の商標で入手可能）、セルロース、並びに、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ ＥＥＦの商標で入手可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｇｕｍ ７ＬＦの商標で入手可能）およびヒドロキシエチルセルロース（例えば、Ｎａｔｒｏｓｏｌ ２５０ ＬＲの商標で入手可能）などの変性セルロースなどが挙げられる。
【００３２】
親水性ポリマー物質の混合物は、ゲルの状態で使用することができる。
親水性ポリマー物質の水和ヒドロゲルでは、親水性ポリマー物質は、ゲルの全重量に対して、少なくとも０．１重量％、好ましくは少なくとも０．５重量％、好ましくは少なくとも１重量％、好ましくは少なくとも２重量％、より好ましくは少なくとも５重量％、より一層好ましくは少なくとも１０重量％、または少なくとも２０重量％、望ましくは少なくとも２５重量％、より一層望ましくは少なくとも３０重量％の濃度で存在することが望ましい。さらに大量に（ゲルの全重量に対して約４０重量％以下）使用してもよい。
【００３３】
好ましい水和ヒドロゲルは、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ポリＡＭＰＳ）またはその塩を、好ましくはゲルの全重量に対して約２０重量％の量で含む。
【００３４】
過酸化水素源は、過酸化水素それ自体か、または他の成分と組み合わせるか、もしくは複合化した過酸化水素を含むことができる。あるいは、過酸化水素源は、過酸化水素発生手段であってもよい。
【００３５】
好ましい実施形態では、過酸化水素源は、オキシドリダクターゼ酵素、酸素源、および酵素の基質源を含む過酸化水素発生手段である。オキシドリダクターゼ酵素は、適当な基質と酸素との反応を触媒し、過酸化水素を生成させる。
【００３６】
本発明での使用に適したオキシドリダクターゼ酵素と対応する基質（これらは血液および組織液中に存在する）としては、次のものが挙げられる。
【００３７】
【表１】
【００３８】
現時点で好ましいオキシドリダクターゼ酵素は、グルコースオキシダーゼである。これはβ−Ｄグルコース基質の反応を触媒して、過酸化水素とグルコン酸を与える。
【００３９】
オキシドリダクターゼ酵素の混合物を使用してもよい。
オキシドリダクターゼ酵素およびグルコースは、場合により酸素源と十分に混合してもよい。酸素は任意の適切な酸素供与体から供給することができるが、好ましい供給源は大気中の酸素である。
【００４０】
酸素源が大気中の酸素の場合、ドレッシング材は個別の第１および第２の層を含むことが好ましい。第１の層は、オキシドリダクターゼ酵素を含み、使用時には、大気の酸素濃度が最も高いドレッシング材の外側部分近く、すなわち爪部位から離れて位置する。第２の層は基質源を含み、ドレッシング材の内側部分近く、すなわち爪部位に接して位置し、したがって生成したヒドロゲルパーオキサイドは直ちに爪部位に入り込むことができる。
【００４１】
この層を重ねた実施形態の好ましい形態は、第１および第２の層が共に架橋した水和ヒドロゲルを含むものである。ヒドロゲルは、綿ガーゼ、または不活性で柔軟なメッシュなどの機械的補強構造材の回りにキャスティングして、例えば、構造的に補強されたヒドロゲル層またはスラブを提供するようにしてもよい。あるいは、酵素を含有する第１の層を、乾燥状態とするが、使用時には第２の層と流体連結するようにしてもよい。これにより、水が第１の層に移動して、酵素を湿潤化する。
【００４２】
この層を重ねた実施形態では、第１の層は比較的薄く、すなわち０．０１〜２．０ｍｍとし、第２の層は比較的厚く、すなわち０．５〜５．０ｍｍとするのが好ましい。第１の層が水和ヒドロゲルの場合、０．１〜２．０ｍｍの厚さが好ましい。第１の層がドライフィルムの場合、０．０１〜０．１ｍｍの厚さが好ましい。
【００４３】
第１の層の第２の層の対する厚さの比は、１：２〜１：２００であることが好ましく、好ましくは１：５〜１：５０、より好ましくは１：５〜１：２０である。
【００４４】
オキシドリダクターゼ酵素は、第２の層へ移動しないように固定化することが好ましい。
【００４５】
基質、例えばグルコースは、水和ヒドロゲル構造体に溶解させたり、徐々に溶解する固体として存在させたり、徐放用の他の構造体に入れてカプセル化するなど、種々の形態で存在させることができる。
【００４６】
ドレッシング材は、過剰の基質を含み、それにより、使用時に長時間にわたって、例えば少なくとも１時間、例えば１〜１０時間もしくはそれ以上、過酸化水素を発生させる機能が働くように構成することが好ましい。
【００４７】
本発明の組み合わせは、典型的には、上述したような水性溶液と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせを含むパッケージキットである。
【００４８】
構成要素は、通常、防水パッケージに入れられ、シールされる。
以下、実施例により、また次に示す図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】過酸化水素の発生を示す、測定電流対時間の関係を示したチャートである。
【図２ａ】真菌ティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）の殺菌曲線を示したチャートである。
【図２ｂ】真菌ティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）の殺菌曲線を示した他のチャートである。
【実施例】
【００５０】
実験の概要
高タンパク質環境を再現するために、１０７個の真菌細胞を含有する５０％血清に試験ディスクを浸漬した。爪床との接触を模擬するために、同様に５０％の血清を含有するゲル床上にこれらを置いた。ディスクに、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはラクトペルオキシダーゼのいずれかの水溶液を、各ディスクの酵素用量濃度が異なるように投与した。対照用ディスクにはいずれの種類のペルオキシダーゼも投与しないでおいた。実験は、過酸化水素発生用の層状のパッチ（後述）を大部分の試験ディスクの表面に貼付することにより開始し、所定時間放置した。処理せずに放置したときの真菌細胞の生存率を求めるための追加実験用対照として、いくつかのディスクはカバーで覆わずにおいた。所定の時間間隔で、サンプリングとして代表するディスクを取り出し、標準的な方法で真菌細胞の生存数を測定した。これらの実験から、層状のゲルパッチから供給される過酸化水素が、数時間の放置で真菌細胞を殺滅し得ることがわかった。しかしながら、真菌の殺滅速度は、ペルオキシダーゼ酵素がさらに存在して真菌と接触することにより大きく増大した。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素はラクトペルオキシダーゼより効力が強く、その効果は一般に用量と共に増加した。
【００５１】
実施例１：過酸化水素発生の観点から行った過酸化水素供与層状パッチの作成と評価
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の発生を電気化学的に（低速クロノ技法（ｓｌｏｗ ｃｈｒｏｎｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ））測定した。ドレッシング材を特注のセンサー上に置き、電極間に電位をかけ、Ｈ２Ｏ２の存在を測定した。
【００５２】
ドレッシング材を２層、すなわち（ｉ）水和ヒドロゲル層および（ｉｉ）グルコースオキシダーゼを含むドライフィルムの活性化層で構成した。
【００５３】
層１の調製：ヒドロゲルのシートを以下のように調製した。
２０％の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、貯蔵用５０％水溶液）、１０％グルコース（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、分析グレード）、０．１％の乳酸亜鉛（Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる水溶液を調製した。架橋剤としてＰｅｇ ７００ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、また光開始剤として２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この溶液６．５ｇおよび１３ｇを、１０×１０ｃｍのペトリ皿に分注し、１００ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光を２０秒間照射した。
【００５４】
層２の調製：ドライフィルムを以下のように調製した。
２５重量％のＰＶＡ（日本合成化学工業株式会社から供給されるＧｏｈｓｅｎｏｌ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ、コードＥＧ０５Ｐ）水溶液を調製した。さらに、４０．３ｍｇのグルコースオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、１５０，０００単位／グラム）＋３００ｍｇのヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）＋１５０ｍｇのクエン酸（Ｆｉｃｈｅｒ、分析グレード）＋７５ｍｇヨウ化カリウム（Ｓｉｇｍａ）を２ｍｌの分析グレードの水（Ｆｉｓｈｅｒ）に溶解した。３０ｇの２５％ＰＶＡ溶液をグルコースオキシダーゼ／ヒスチジン／クエン酸／ヨウ化カリウム溶液と混合し、静置させて混入した気泡を除去した。その後、混合物を５０℃で乾燥させて４０〜４５ミクロン厚さのドライフィルムを得た。
【００５５】
電気化学分析
特注の３電極センサー（作動用、カウンター用および参照用）を分析に使用した。ＥｚｅＳｃａｎ機材およびソフトウェアーは、ＵＫ、ＬｕｔｏｎのＷｈｉｓｔｏｎｂｒｏｏｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。電極をテフロン（登録商標）ボックスに装着し、２５℃のインキュベータに入れた。使用時に０．１ＭのＫＣｌ溶液２０μｌをセンサーの電極端に塗布した。層１のヒドロゲルシート（キャスティング重量６．５ｇおよび１３ｇの）から１．５×２ｃｍ片を切り出し、電極と確実に均一に接触させ、かつゲルとセンサー間に気泡が取り込まれないようにしてＫＣｌ溶液の上に置いた。蒸発を抑えるためにゲルをカバーで覆った。電極間に＋９５０ｍＶの電位を印加し、発生した電流を記録した。安定したベースライン電流が得られてから、ドライフィルムの１．５×２ｃｍ片を層１のヒドロゲルシートの表面に貼付した。発生した電流を記録した。図１を参照されたい。
【００５６】
図１は、センサー上の層１のヒドロゲルシートに＋９５０ｍＶの電位を印加したとき、測定可能なバックグラウンド電流が殆ど流れず、したがって、この与えられた電位では、ヒドロゲルの調製に使用した材料による干渉は殆ど受けないことを明確に示している。ドライ酵素フィルムを貼付後（グラフの約４０００秒）、グルコースオキシダーゼの化学反応が活性化され、Ｈ２Ｏ２が生成し、これは層１のヒドロゲルを通って電極に速やかに拡散し、そのとき電流の顕著な増加が測定される。これは、２層システムが２層システム内部でＨ２Ｏ２を発生させ、それを接触表面に配送することを明瞭に示すものである。チャートの主たるプラトー（５，０００〜１３，０００秒の間）に関係して発生した電流は、一般に、約０．１％のＨ２Ｏ２（水溶液）に等しい。さらに、薄い方のゲル（１０×１０ｃｍの面積当たり、６．５ｇのゲル）が貼付時（活性化の約３０００秒後）に著しく高いピーク電流（したがってＨ２Ｏ２濃度）を示す点を除けば、層１のヒドロゲルの厚さが異なっても非常によく似たカーブを描いた。Ｈ２Ｏ２の測定値はその後徐々に減少し、活性化の約４０，０００秒（約１１時間）後に、曲線は平坦な応答に戻る。
【００５７】
実施例２：水溶液としてのペルオキシダーゼ含有プライマーサンプルの調製
ペルオキシダーゼ用の適切で基本的な担体を次のように調製した。５０ｍＭの、ｐＨが６〜６．５のリン酸ナトリウム緩衝液を０．２重量％のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）界面活性剤と混合した。これにペルオキシダーゼ酵素を溶解させ、最終濃度を１００μｇ／ｍｌとした。
【００５８】
担体の調合は必要に応じて異なる特性を与えるように変えてもよい。例えば、緩衝塩の濃度と種類を、用途と、使用する酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）の最適ｐＨに応じて、緩衝限界をある範囲にし、かつ溶液のｐＨを変えるために変更してもよく；界面活性剤の濃度と種類を、異なる濡れ特性を与えるように変更してもよく；流体の流動性を低減するために（例えば、塗布してすぐに爪から溶液が流れ落ちないようにするために）、ポリマー性増粘剤を追加的に含有させてもよく；治療する構造体の上または内部でペルオキシダーゼによってもたらされる作用を強化または抑制するために、使用する酵素の濃度もまた変更してもよい。ドレッシング材の効率を向上させるために、添加剤、例えば抗微生物剤も追加で加えてもよい。
【００５９】
実施例３：モデル系によるトリコフィトン・ルブラム（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）に対する本発明の抗真菌治療系の試験
Ｊ．Ｇｒｅｅｎｍａｎ、Ｒ．Ｍ．Ｓ．Ｔｈｏｒｎ、Ｓ．Ｓａａｄ、Ａ．Ａｕｓｔｉｎ著、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｂｅｄ， ３−ｄａｙ ｒｅｐｅａｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ‘ｃａｐａｃｉｔｙ’ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｗｏｕｎｄ ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００６）、３、３２２−３２９に記載の方法に基づき、インビトロの平坦床静的拡散モデルを使用した。
【００６０】
ポテトデキストロース寒天培地で十分に表面成長させたトリコフィトン・ラブラム（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）のバイオマスをサブロー液体培地に乳化させ、懸濁物を除き、渦流混合を行い、その後、溶液から大きい粒子を沈殿させて、試験用接種材料を調製した。得られた懸濁液を分光光度法により調節して、約１０７ｃｆｕ ｍｌ−１の標準接種材料を得た。これは殺菌効果の検出を可能とするには十分な濃度である（殺菌効果の指標として、＞１０３ｃｆｕの減少が見られる）。
【００６１】
体積１００μｌの、上で定義した接種材料を、ポリＡＭＰＳ試験床（この配合は実施例１に記載した層１のヒドロゲルと同じであるが、１０×１０ｃｍのディッシュ１枚当たり２５ｇのゲルシートとして成形）表面の複製用セルロースディスク内で再懸濁させた。これにより試験用生成物を塗布することができる（図１）。２層ドレッシング材を試験した。層は実施例１に記載したように調製した。ラクトペルオキシダーゼ酵素または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を、使用前の必要な濃度になるように分析用の水に溶解して調製した。ラクトペルオキシダーゼは、新規な局所治療の抗菌効果を増強し得ると考えられ、効果の差を明らかにするため、いくつかの実験系では、セルロースディスクをラクトペルオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液で予備処理した。提案した実験の試験および対照条件の範囲を表１に示す。
【００６２】
２層ドレッシング材を、２つの層を一緒にすることにより活性化した。ヒドロゲルシートをセルロースディスクと接触させて置き、その後、ドライフィルムをヒドロゲルシートの最上面に貼付した。試験床を２８℃でインキュベートし、決められた時間間隔（０、１、２、４および２４時間）でセルロースディスクを取り出し、ＰＢＳａ中に再懸濁させ、次いで希釈し、その後、サブローデキストロース寒天培地上に渦巻状に植えた。インキュベーション後（５日間）、治療暴露後の異なる時点における白癬菌（ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅ）の生存数を、コロニー数の計測（ｃｆｕ ディスク−１）により測定した。結果をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．４）を使用して解析した。
【００６３】
結果
実験結果を図２に示すが、全ての試験条件で顕著な抗菌作用が引き起こされ、かつ治療暴露後３時間までに、いかなる局所治療の下にも生存細胞が検出されなかったことが明らかである。ディスク内のラクトペルオキシダーゼは、１μｇ ｍｌ−１では試験用治療単独の場合と比べて顕著な効果は認められなかったものの、濃度に依存して局所治療の効果が増大するようである（図２ａ）。ディスク内の西洋ワサビペルオキシダーゼもまた、濃度に依存して局所治療の効果を増大させており、この場合、最も低い濃度（１μｇ ｍｌ−１）でも顕著な効果を示している（図２ｂ）。対照試料内では、ティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）の細胞数が僅かに減少した。これはこの微生物が、特に２４時間のインキュベーション後の真菌試験床分析プレート上ではあまり順調に生育できないことを示している。しかし、全ての試験治療は、対照に比べて顕著な効果を示した。興味深いことに、２４時間後のカバーなしの対照と比べると、不活性な治療対照は微生物に対し幾分かの保護効果を示しているようである。
【００６４】
結論
局所治療が単独でティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）に対して顕著な抗菌効果を有し、３時間以内に、殺菌作用を有することの指標（＞３対数倍の減少）である、生存細胞数をこの系の最小検出点（２×１０２個の細胞）未満まで減少させることは、結果から明らかである。ペルオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼの両者とも局所治療の効果を増大させるが、西洋ワサビペルオキシダーゼの方がより効果的であることは明らかである。
【００６５】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染症、特にヒトの爪部位における真菌感染症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
見た目にも良好なコンディションにある健康な爪は、ヒトの外見にとって極めて重要な一面である。爪の外見、強さおよび健康は、病原性真菌細胞、代表的にはトリコフィトン（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属の真菌細胞に感染することによって悪影響を受けることが少なくなく、感染性真菌を除去することにより、影響を受けた爪の外見を改善する治療法が強く求められている。市場には多くの治療薬が出回っているものの、利用できる技術や製品に対する不満が広がっている。
【０００３】
全身に送られた薬剤は血流によって爪部位に到達し得るが、血液の循環から爪部位への浸透が困難なことや重大な副作用があるために、このアプローチの有用性は低い。
【０００４】
真菌に感染した爪は、多くの場合、侵入した真菌の作用で多孔質または多くの穴が開いた状態になる。このため、爪にはしばしば細菌による共コロニー化が起こり、破壊酵素および局所活性毒素がさらに放出される結果、真菌による損傷の影響が増幅されるおそれがある。
【０００５】
既知の治療法により爪の真菌感染が軽減されたとしても、完全に除去されることは殆どなく、普通は治療を止めるとすぐに感染が元に戻ることはよく知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、活性成分が容易に爪に浸透せず、浸透したとしても最表面に塗布した物質のほんの僅かしか、真菌細胞が比較的安全に棲むことができる下部構造には到達しないことを見出した。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染、例えば真菌感染の治療方法であって、感染した体表面、例えば爪部位に水性液体を塗布し、その後、過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む方法に関する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染、例えば、特にヒトまたは動物の爪部位（これ以外を排除するものではない）の真菌感染の治療における、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせに関する。
【０００９】
第３の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体表面感染、例えば、特にヒトまたは動物の爪部位（これ以外を排除するものではない）の真菌感染の治療用薬剤の製造における、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせの使用に関する。
【００１０】
水性液体を感染体表面に塗布すると、体表面は軟化してより多孔質になる。これにより、例えば、存在する孔から爪部位の内部への液体の浸入が可能になる。このように、液体は、体表面、例えば爪部位の内部への水の流路を提供する。
【００１１】
したがって、その後、過酸化水素源を含有するドレッシング材を適用すれば、形成された水の流路に沿って過酸化水素が、体表面、例えば爪部位の内部の到達し難い部分に十分に拡散することになり、過酸化水素が深く浸透して、例えば爪部位のあらゆる部分における感染、例えば真菌感染を大きく低減ないし除去することができる。
【００１２】
爪は特有の組織および組成を有しており、このことは、爪板およびその下部の爪床、並びに付随する全ての構造を対象とする治療法の新しいアプローチを考える際に認識しておかなければならないことである。爪の最も目立つ部分である爪板は、死んで角質化した細胞（角質細胞）から作られ、爪の基部にある爪母基から押し上げられた、硬質のケラチン構造体から構成されている。爪板の殆どの部分は半透明であるため、真皮中の血液供給の色が透けて見え、ピンク色を呈する。爪自体は水分をあまり含まないが、水に晒されると比較的水和状態になり、柔軟で曲げやすい状態になる。
【００１３】
爪郭、すなわち爪の側部と重なり合う皮膚の襞は、爪板を在るべき位置に保持し、その端部を保護する。生きていて再生する爪の唯一の部分は爪母基であり、あま皮の直下にある。新しい細胞はここで生まれ、成長とともに絶えず前方に押し出されて爪板を形成する。爪母基には、また、神経と、細胞に栄養および酸素を供給するための多くの血管が備わっている。
【００１４】
爪板は爪床の上に載っており、この爪床は母基と繋がっている。これにもまた血管と神経が多く備わっている。その表面には多数の平行な稜が形成されており、それらは爪板の下面の稜に正確に嵌合している。あま皮は爪と重なり合う、皮膚の表皮の一部である。それは細菌の侵入や物理的ダメージから母基を保護する。
【００１５】
真菌細胞はこれらの構造体のどの部分にも棲息し増殖することができ、爪板主要部の感染を除去するとともに、残留する感染病巣もすべて除去するためには、治療があらゆる部位に広く行き渡ることが重要である。
【００１６】
用語「爪部位」は、本明細書中では、爪板、爪床、爪母基、爪郭およびあま皮を含むものと定義する。
【００１７】
本発明は、また、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した細胞の治療方法であって、本明細書中で定義した水性液体を感染細胞へ塗布し、その後、本明細書中で定義した過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、また、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した細胞の治療における、本明細書中で定義した水性液体と、本明細書中で定義した過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせに関する。
【００１９】
好ましい実施形態では、水性液体はペルオキシダーゼ酵素を含む。ペルオキシダーゼは体表面、例えば爪部位の内部へ拡散する。
【００２０】
ペルオキシダーゼ酵素は、体表面、例えば爪の内部に浸透しても、過酸化水素がドレッシング材から水性通路を経て拡散してくるまで、実質的に不活性を維持する。ペルオキシダーゼが存在すると、過酸化水素の酸化作用が促進される。
【００２１】
このようにペルオキシダーゼは、真菌細胞の細胞膜および／または細胞質の上または内部の、傷つきやすいが必須である真菌分子の酸化を触媒するので、過酸化水素の活性、特に抗真菌活性を大幅に促進することがわかった。
【００２２】
ラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ヨウ化物ペルオキシダーゼ、塩化物ペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼなどの、任意の適切なペルオキシダーゼを使用することができる。しかしながら、これまでのところでは、ラクトペルオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。
【００２３】
水性液体中のペルオキシダーゼ酵素の濃度は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００〜５００μｇ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００２４】
水性液体は、また、界面活性剤および／または溶媒を含むことが好ましい。それらは体表面、例えば爪への液体の浸透を促進することがわかった。
【００２５】
ドレッシング材は、それを適用するとすぐに過酸化水素が爪部位へ効率良く拡散し得るよう、含水状態にあることが好ましい。爪部位とドレッシング材との間に接触液体接合部を形成するために、ドレッシング材には十分な水が必要である。
【００２６】
流体および溶質の必要な流れを促進するため、水性液体の浸透力がドレッシング材中の液体のそれと同じか近似していることが好ましい。
【００２７】
ドレッシング材は使用時に爪部位に水分を与えることが好ましく、これは知られた方法で適切な浸透特性を選択することにより達成される。
【００２８】
ドレッシング材の材料は、ドレッシング材と爪部位との間に、制御された拡散通路を作るために十分な水分を保持することができる、ヒドロゲル、スポンジ、発泡体の形態、または親水性マトリックスのいくつかの他の形態とすることができる。ドレッシング材は、例えば水素結合によって過酸化水素の通路を調節する働きのある溶質を含有することが好ましい。これは、ポリマー、例えば、グリコサミノグリカンなどのポリサッカライドの濃度を適切に調節することにより達成し得る。
【００２９】
ドレッシング材は、湿った綿のドレッシング材を含んでもよく、あるいは湿った成分を含む構造用芯材を含んでもよい。しかしながら、ドレッシング材は、１種以上の水をベースとしたゲル、すなわち水性のゲル（水和ヒドロゲルともいう）を含むことが好ましい。そのようなゲルは、後述するように、種々の材料で生成することができ、種々の薬剤を含有することができる。
【００３０】
典型的には、ドレッシング材は、シート、層またはフィルムの形態を有するであろう。あるいは、ドレッシング材は、ノズルから絞り出されるなど、固定した形態または形状を持たず、３次元的に変形し、形作ることができる、アモルファスのゲルまたはローションの形態であってもよい。好ましくは、ヒドロゲルである。アモルファスゲルは、通常、架橋されていないか、あるいは僅かに架橋されている。剪断減粘性アモルファスゲルを使用してもよい。そのようなゲルは、剪断応力を受けているとき（例えば、ノズルから注出または絞り出されるとき）は液体であるが、静止しているときは固まっている。
【００３１】
適切な水和ヒドロゲルは、国際公開第０３／０９０８００号パンフレットに開示されている。水和ヒドロゲルは、親水性ポリマー物質を含んでいると好都合である。適切な親水性ポリマー物質としては、例えばＦｉｒｓｔ Ｗａｔｅｒ Ｌｔｄからシート状ヒドロゲルの形態で供給されるポリアクリレートおよびメタクリレートが挙げられる他、さらに、ポリ２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸（ポリＡＭＰＳ）またはその塩（例えば、国際公開第０１／９６４２２号パンフレットに記載）、ポリサッカライド、例えばポリサッカライドガム、特にキサンタンガム（例えば、Ｋｅｌｔｒｏｌの商標で入手可能）、各種糖類、ポリカルボン酸（例えば、ＩＳＰ ＥｕｒｏｐｅからＧａｎｔｒｅｚ ＡＮ−１６９ ＢＦの商標で入手可能）、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ ＡＮ １３９の商標で入手可能、分子量２０，０００〜４０，０００の範囲）、ポリビニルピロリドン（例えば、ＰＶＰ Ｋ−３０およびＰＶＰ Ｋ−９０として知られる、商業的に入手可能なグレードの形態で）、ポリエチレンオキサイド（例えば、Ｐｏｌｙｏｘ ＷＳＲ−３０１の商標で入手可能）、ポリビニルアルコール（例えば、Ｅｌｖａｎｏｌの商標で入手可能）、架橋ポリアクリル酸ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ＥＺ−１の商標で入手可能）、セルロース、並びに、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ ＥＥＦの商標で入手可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｇｕｍ ７ＬＦの商標で入手可能）およびヒドロキシエチルセルロース（例えば、Ｎａｔｒｏｓｏｌ ２５０ ＬＲの商標で入手可能）などの変性セルロースなどが挙げられる。
【００３２】
親水性ポリマー物質の混合物は、ゲルの状態で使用することができる。
親水性ポリマー物質の水和ヒドロゲルでは、親水性ポリマー物質は、ゲルの全重量に対して、少なくとも０．１重量％、好ましくは少なくとも０．５重量％、好ましくは少なくとも１重量％、好ましくは少なくとも２重量％、より好ましくは少なくとも５重量％、より一層好ましくは少なくとも１０重量％、または少なくとも２０重量％、望ましくは少なくとも２５重量％、より一層望ましくは少なくとも３０重量％の濃度で存在することが望ましい。さらに大量に（ゲルの全重量に対して約４０重量％以下）使用してもよい。
【００３３】
好ましい水和ヒドロゲルは、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ポリＡＭＰＳ）またはその塩を、好ましくはゲルの全重量に対して約２０重量％の量で含む。
【００３４】
過酸化水素源は、過酸化水素それ自体か、または他の成分と組み合わせるか、もしくは複合化した過酸化水素を含むことができる。あるいは、過酸化水素源は、過酸化水素発生手段であってもよい。
【００３５】
好ましい実施形態では、過酸化水素源は、オキシドリダクターゼ酵素、酸素源、および酵素の基質源を含む過酸化水素発生手段である。オキシドリダクターゼ酵素は、適当な基質と酸素との反応を触媒し、過酸化水素を生成させる。
【００３６】
本発明での使用に適したオキシドリダクターゼ酵素と対応する基質（これらは血液および組織液中に存在する）としては、次のものが挙げられる。
【００３７】
【表１】
【００３８】
現時点で好ましいオキシドリダクターゼ酵素は、グルコースオキシダーゼである。これはβ−Ｄグルコース基質の反応を触媒して、過酸化水素とグルコン酸を与える。
【００３９】
オキシドリダクターゼ酵素の混合物を使用してもよい。
オキシドリダクターゼ酵素およびグルコースは、場合により酸素源と十分に混合してもよい。酸素は任意の適切な酸素供与体から供給することができるが、好ましい供給源は大気中の酸素である。
【００４０】
酸素源が大気中の酸素の場合、ドレッシング材は個別の第１および第２の層を含むことが好ましい。第１の層は、オキシドリダクターゼ酵素を含み、使用時には、大気の酸素濃度が最も高いドレッシング材の外側部分近く、すなわち爪部位から離れて位置する。第２の層は基質源を含み、ドレッシング材の内側部分近く、すなわち爪部位に接して位置し、したがって生成したヒドロゲルパーオキサイドは直ちに爪部位に入り込むことができる。
【００４１】
この層を重ねた実施形態の好ましい形態は、第１および第２の層が共に架橋した水和ヒドロゲルを含むものである。ヒドロゲルは、綿ガーゼ、または不活性で柔軟なメッシュなどの機械的補強構造材の回りにキャスティングして、例えば、構造的に補強されたヒドロゲル層またはスラブを提供するようにしてもよい。あるいは、酵素を含有する第１の層を、乾燥状態とするが、使用時には第２の層と流体連結するようにしてもよい。これにより、水が第１の層に移動して、酵素を湿潤化する。
【００４２】
この層を重ねた実施形態では、第１の層は比較的薄く、すなわち０．０１〜２．０ｍｍとし、第２の層は比較的厚く、すなわち０．５〜５．０ｍｍとするのが好ましい。第１の層が水和ヒドロゲルの場合、０．１〜２．０ｍｍの厚さが好ましい。第１の層がドライフィルムの場合、０．０１〜０．１ｍｍの厚さが好ましい。
【００４３】
第１の層の第２の層の対する厚さの比は、１：２〜１：２００であることが好ましく、好ましくは１：５〜１：５０、より好ましくは１：５〜１：２０である。
【００４４】
オキシドリダクターゼ酵素は、第２の層へ移動しないように固定化することが好ましい。
【００４５】
基質、例えばグルコースは、水和ヒドロゲル構造体に溶解させたり、徐々に溶解する固体として存在させたり、徐放用の他の構造体に入れてカプセル化するなど、種々の形態で存在させることができる。
【００４６】
ドレッシング材は、過剰の基質を含み、それにより、使用時に長時間にわたって、例えば少なくとも１時間、例えば１〜１０時間もしくはそれ以上、過酸化水素を発生させる機能が働くように構成することが好ましい。
【００４７】
本発明の組み合わせは、典型的には、上述したような水性溶液と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせを含むパッケージキットである。
【００４８】
構成要素は、通常、防水パッケージに入れられ、シールされる。
以下、実施例により、また次に示す図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】過酸化水素の発生を示す、測定電流対時間の関係を示したチャートである。
【図２ａ】真菌ティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）の殺菌曲線を示したチャートである。
【図２ｂ】真菌ティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）の殺菌曲線を示した他のチャートである。
【実施例】
【００５０】
実験の概要
高タンパク質環境を再現するために、１０７個の真菌細胞を含有する５０％血清に試験ディスクを浸漬した。爪床との接触を模擬するために、同様に５０％の血清を含有するゲル床上にこれらを置いた。ディスクに、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはラクトペルオキシダーゼのいずれかの水溶液を、各ディスクの酵素用量濃度が異なるように投与した。対照用ディスクにはいずれの種類のペルオキシダーゼも投与しないでおいた。実験は、過酸化水素発生用の層状のパッチ（後述）を大部分の試験ディスクの表面に貼付することにより開始し、所定時間放置した。処理せずに放置したときの真菌細胞の生存率を求めるための追加実験用対照として、いくつかのディスクはカバーで覆わずにおいた。所定の時間間隔で、サンプリングとして代表するディスクを取り出し、標準的な方法で真菌細胞の生存数を測定した。これらの実験から、層状のゲルパッチから供給される過酸化水素が、数時間の放置で真菌細胞を殺滅し得ることがわかった。しかしながら、真菌の殺滅速度は、ペルオキシダーゼ酵素がさらに存在して真菌と接触することにより大きく増大した。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素はラクトペルオキシダーゼより効力が強く、その効果は一般に用量と共に増加した。
【００５１】
実施例１：過酸化水素発生の観点から行った過酸化水素供与層状パッチの作成と評価
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の発生を電気化学的に（低速クロノ技法（ｓｌｏｗ ｃｈｒｏｎｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ））測定した。ドレッシング材を特注のセンサー上に置き、電極間に電位をかけ、Ｈ２Ｏ２の存在を測定した。
【００５２】
ドレッシング材を２層、すなわち（ｉ）水和ヒドロゲル層および（ｉｉ）グルコースオキシダーゼを含むドライフィルムの活性化層で構成した。
【００５３】
層１の調製：ヒドロゲルのシートを以下のように調製した。
２０％の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、貯蔵用５０％水溶液）、１０％グルコース（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、分析グレード）、０．１％の乳酸亜鉛（Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる水溶液を調製した。架橋剤としてＰｅｇ ７００ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、また光開始剤として２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この溶液６．５ｇおよび１３ｇを、１０×１０ｃｍのペトリ皿に分注し、１００ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光を２０秒間照射した。
【００５４】
層２の調製：ドライフィルムを以下のように調製した。
２５重量％のＰＶＡ（日本合成化学工業株式会社から供給されるＧｏｈｓｅｎｏｌ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ、コードＥＧ０５Ｐ）水溶液を調製した。さらに、４０．３ｍｇのグルコースオキシダーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、１５０，０００単位／グラム）＋３００ｍｇのヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）＋１５０ｍｇのクエン酸（Ｆｉｃｈｅｒ、分析グレード）＋７５ｍｇヨウ化カリウム（Ｓｉｇｍａ）を２ｍｌの分析グレードの水（Ｆｉｓｈｅｒ）に溶解した。３０ｇの２５％ＰＶＡ溶液をグルコースオキシダーゼ／ヒスチジン／クエン酸／ヨウ化カリウム溶液と混合し、静置させて混入した気泡を除去した。その後、混合物を５０℃で乾燥させて４０〜４５ミクロン厚さのドライフィルムを得た。
【００５５】
電気化学分析
特注の３電極センサー（作動用、カウンター用および参照用）を分析に使用した。ＥｚｅＳｃａｎ機材およびソフトウェアーは、ＵＫ、ＬｕｔｏｎのＷｈｉｓｔｏｎｂｒｏｏｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。電極をテフロン（登録商標）ボックスに装着し、２５℃のインキュベータに入れた。使用時に０．１ＭのＫＣｌ溶液２０μｌをセンサーの電極端に塗布した。層１のヒドロゲルシート（キャスティング重量６．５ｇおよび１３ｇの）から１．５×２ｃｍ片を切り出し、電極と確実に均一に接触させ、かつゲルとセンサー間に気泡が取り込まれないようにしてＫＣｌ溶液の上に置いた。蒸発を抑えるためにゲルをカバーで覆った。電極間に＋９５０ｍＶの電位を印加し、発生した電流を記録した。安定したベースライン電流が得られてから、ドライフィルムの１．５×２ｃｍ片を層１のヒドロゲルシートの表面に貼付した。発生した電流を記録した。図１を参照されたい。
【００５６】
図１は、センサー上の層１のヒドロゲルシートに＋９５０ｍＶの電位を印加したとき、測定可能なバックグラウンド電流が殆ど流れず、したがって、この与えられた電位では、ヒドロゲルの調製に使用した材料による干渉は殆ど受けないことを明確に示している。ドライ酵素フィルムを貼付後（グラフの約４０００秒）、グルコースオキシダーゼの化学反応が活性化され、Ｈ２Ｏ２が生成し、これは層１のヒドロゲルを通って電極に速やかに拡散し、そのとき電流の顕著な増加が測定される。これは、２層システムが２層システム内部でＨ２Ｏ２を発生させ、それを接触表面に配送することを明瞭に示すものである。チャートの主たるプラトー（５，０００〜１３，０００秒の間）に関係して発生した電流は、一般に、約０．１％のＨ２Ｏ２（水溶液）に等しい。さらに、薄い方のゲル（１０×１０ｃｍの面積当たり、６．５ｇのゲル）が貼付時（活性化の約３０００秒後）に著しく高いピーク電流（したがってＨ２Ｏ２濃度）を示す点を除けば、層１のヒドロゲルの厚さが異なっても非常によく似たカーブを描いた。Ｈ２Ｏ２の測定値はその後徐々に減少し、活性化の約４０，０００秒（約１１時間）後に、曲線は平坦な応答に戻る。
【００５７】
実施例２：水溶液としてのペルオキシダーゼ含有プライマーサンプルの調製
ペルオキシダーゼ用の適切で基本的な担体を次のように調製した。５０ｍＭの、ｐＨが６〜６．５のリン酸ナトリウム緩衝液を０．２重量％のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）界面活性剤と混合した。これにペルオキシダーゼ酵素を溶解させ、最終濃度を１００μｇ／ｍｌとした。
【００５８】
担体の調合は必要に応じて異なる特性を与えるように変えてもよい。例えば、緩衝塩の濃度と種類を、用途と、使用する酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）の最適ｐＨに応じて、緩衝限界をある範囲にし、かつ溶液のｐＨを変えるために変更してもよく；界面活性剤の濃度と種類を、異なる濡れ特性を与えるように変更してもよく；流体の流動性を低減するために（例えば、塗布してすぐに爪から溶液が流れ落ちないようにするために）、ポリマー性増粘剤を追加的に含有させてもよく；治療する構造体の上または内部でペルオキシダーゼによってもたらされる作用を強化または抑制するために、使用する酵素の濃度もまた変更してもよい。ドレッシング材の効率を向上させるために、添加剤、例えば抗微生物剤も追加で加えてもよい。
【００５９】
実施例３：モデル系によるトリコフィトン・ルブラム（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）に対する本発明の抗真菌治療系の試験
Ｊ．Ｇｒｅｅｎｍａｎ、Ｒ．Ｍ．Ｓ．Ｔｈｏｒｎ、Ｓ．Ｓａａｄ、Ａ．Ａｕｓｔｉｎ著、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｂｅｄ， ３−ｄａｙ ｒｅｐｅａｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ‘ｃａｐａｃｉｔｙ’ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｗｏｕｎｄ ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００６）、３、３２２−３２９に記載の方法に基づき、インビトロの平坦床静的拡散モデルを使用した。
【００６０】
ポテトデキストロース寒天培地で十分に表面成長させたトリコフィトン・ラブラム（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）のバイオマスをサブロー液体培地に乳化させ、懸濁物を除き、渦流混合を行い、その後、溶液から大きい粒子を沈殿させて、試験用接種材料を調製した。得られた懸濁液を分光光度法により調節して、約１０７ｃｆｕ ｍｌ−１の標準接種材料を得た。これは殺菌効果の検出を可能とするには十分な濃度である（殺菌効果の指標として、＞１０３ｃｆｕの減少が見られる）。
【００６１】
体積１００μｌの、上で定義した接種材料を、ポリＡＭＰＳ試験床（この配合は実施例１に記載した層１のヒドロゲルと同じであるが、１０×１０ｃｍのディッシュ１枚当たり２５ｇのゲルシートとして成形）表面の複製用セルロースディスク内で再懸濁させた。これにより試験用生成物を塗布することができる（図１）。２層ドレッシング材を試験した。層は実施例１に記載したように調製した。ラクトペルオキシダーゼ酵素または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を、使用前の必要な濃度になるように分析用の水に溶解して調製した。ラクトペルオキシダーゼは、新規な局所治療の抗菌効果を増強し得ると考えられ、効果の差を明らかにするため、いくつかの実験系では、セルロースディスクをラクトペルオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液で予備処理した。提案した実験の試験および対照条件の範囲を表１に示す。
【００６２】
２層ドレッシング材を、２つの層を一緒にすることにより活性化した。ヒドロゲルシートをセルロースディスクと接触させて置き、その後、ドライフィルムをヒドロゲルシートの最上面に貼付した。試験床を２８℃でインキュベートし、決められた時間間隔（０、１、２、４および２４時間）でセルロースディスクを取り出し、ＰＢＳａ中に再懸濁させ、次いで希釈し、その後、サブローデキストロース寒天培地上に渦巻状に植えた。インキュベーション後（５日間）、治療暴露後の異なる時点における白癬菌（ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅ）の生存数を、コロニー数の計測（ｃｆｕ ディスク−１）により測定した。結果をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．４）を使用して解析した。
【００６３】
結果
実験結果を図２に示すが、全ての試験条件で顕著な抗菌作用が引き起こされ、かつ治療暴露後３時間までに、いかなる局所治療の下にも生存細胞が検出されなかったことが明らかである。ディスク内のラクトペルオキシダーゼは、１μｇ ｍｌ−１では試験用治療単独の場合と比べて顕著な効果は認められなかったものの、濃度に依存して局所治療の効果が増大するようである（図２ａ）。ディスク内の西洋ワサビペルオキシダーゼもまた、濃度に依存して局所治療の効果を増大させており、この場合、最も低い濃度（１μｇ ｍｌ−１）でも顕著な効果を示している（図２ｂ）。対照試料内では、ティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）の細胞数が僅かに減少した。これはこの微生物が、特に２４時間のインキュベーション後の真菌試験床分析プレート上ではあまり順調に生育できないことを示している。しかし、全ての試験治療は、対照に比べて顕著な効果を示した。興味深いことに、２４時間後のカバーなしの対照と比べると、不活性な治療対照は微生物に対し幾分かの保護効果を示しているようである。
【００６４】
結論
局所治療が単独でティー・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）に対して顕著な抗菌効果を有し、３時間以内に、殺菌作用を有することの指標（＞３対数倍の減少）である、生存細胞数をこの系の最小検出点（２×１０２個の細胞）未満まで減少させることは、結果から明らかである。ペルオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼの両者とも局所治療の効果を増大させるが、西洋ワサビペルオキシダーゼの方がより効果的であることは明らかである。
【００６５】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の体表面感染の治療に使用するための、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせ。
【請求項２】
ヒトまたは動物の体表面感染の治療方法であって、前記感染した体表面に水性液体を塗布し、その後、過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む方法。
【請求項３】
ヒトまたは動物の体表面感染の治療用薬剤の製造における、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせの使用。
【請求項４】
前記体表面感染が、真菌感染である請求項１〜３のいずれか一項に記載の発明。
【請求項５】
前記体表面が、爪部位、特にヒトの爪部位である請求項１〜４のいずれか一項に記載の発明。
【請求項６】
前記水性液体が、ペルオキシダーゼ酵素を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の発明。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼが、ラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはそれらの混合物を含む請求項６に記載の発明。
【請求項８】
前記水性液体中のペルオキシダーゼ酵素の濃度が、１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である請求項６または７に記載の発明。
【請求項９】
前記水性液体が、界面活性剤および／または溶媒を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１０】
前記ドレッシング材は、使用時に前記爪部位に水分を与える請求項１〜９のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１１】
前記ドレッシング材が、水和ヒドロゲル材を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１２】
前記過酸化水素源が、オキシドリダクターゼ酵素、酸素源、および前記酵素の基質源を含む過酸化水素発生手段である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１３】
前記オキシドリダクターゼ酵素が、グルコースオキシダーゼを含む請求項１２に記載の発明。
【請求項１４】
前記ドレッシング材は、個別の第１および第２の層を含み、前記第１の層は、オキシドリダクターゼ酵素を含み、かつ前記ドレッシング材の外側部分近くに位置し、前記第２の層は、前記基質源を含み、かつ前記ドレッシング材の内側部分近くに位置する請求項１２または１３に記載の発明。
【請求項１】
ヒトまたは動物の体表面感染の治療に使用するための、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせ。
【請求項２】
ヒトまたは動物の体表面感染の治療方法であって、前記感染した体表面に水性液体を塗布し、その後、過酸化水素源を含むドレッシング材を適用することを含む方法。
【請求項３】
ヒトまたは動物の体表面感染の治療用薬剤の製造における、水性液体と、過酸化水素源を含むドレッシング材との組み合わせの使用。
【請求項４】
前記体表面感染が、真菌感染である請求項１〜３のいずれか一項に記載の発明。
【請求項５】
前記体表面が、爪部位、特にヒトの爪部位である請求項１〜４のいずれか一項に記載の発明。
【請求項６】
前記水性液体が、ペルオキシダーゼ酵素を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の発明。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼが、ラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはそれらの混合物を含む請求項６に記載の発明。
【請求項８】
前記水性液体中のペルオキシダーゼ酵素の濃度が、１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である請求項６または７に記載の発明。
【請求項９】
前記水性液体が、界面活性剤および／または溶媒を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１０】
前記ドレッシング材は、使用時に前記爪部位に水分を与える請求項１〜９のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１１】
前記ドレッシング材が、水和ヒドロゲル材を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１２】
前記過酸化水素源が、オキシドリダクターゼ酵素、酸素源、および前記酵素の基質源を含む過酸化水素発生手段である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１３】
前記オキシドリダクターゼ酵素が、グルコースオキシダーゼを含む請求項１２に記載の発明。
【請求項１４】
前記ドレッシング材は、個別の第１および第２の層を含み、前記第１の層は、オキシドリダクターゼ酵素を含み、かつ前記ドレッシング材の外側部分近くに位置し、前記第２の層は、前記基質源を含み、かつ前記ドレッシング材の内側部分近くに位置する請求項１２または１３に記載の発明。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２５３６６（Ｐ２０１２−５２５３６６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０７８２４（Ｐ２０１２−５０７８２４）
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０７２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２５３９８
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５１１１８３９５１）インセンス・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＮＳＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０７２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２５３９８
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５１１１８３９５１）インセンス・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＮＳＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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