合理的に設計されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ及びそのようなメガヌクレアーゼを作製する方法を提供する。さらに、病原体感染の処置及び診断や研究におけるインビトロ適用のための遺伝子治療の方法に加え、ゲノム内の限定された数の遺伝子座に挿入された所望のＤＮＡ配列を有する組換え細胞及び生物を作製するためにメガヌクレアーゼを使用する方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び組換え核酸技術分野に関する。特に、合理的に設計された、天然に存在しないメガヌクレアーゼであって、ＤＮＡ認識配列に対する特異性及び／又は親和性が改変されているメガヌクレアーゼに関する。本発明はまた、該メガヌクレアーゼの製造方法及び該メガヌクレアーゼを使用する組換え核酸及び生物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム工学は、ゲノム内において特定の遺伝子配列を挿入、削除、置換及び、場合によっては操作する能力を必要とするが、多くの治療及びバイオテクノロジーへの応用が可能である。ゲノム改変の効果的な手法の開発は、遺伝子治療、農業科学技術、合成生物学に主要な目的を置いている（Porteusら, (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Tzfiraら, (2005), Trends Biotechnol. 23: 567-9; McDanielら, (2005), Curr. Opin. Biotechnol. 16: 476-83）。ＤＮＡ配列を挿入又は改変する通常の方法は、ゲノム標的に相同な配列に挟まれたトランスジェニックＤＮＡ配列を導入し、相同的組換えを良好に行うために、それを選択又はスクリーニングすることを含む。トランスジェニックＤＮＡとの組換えは起こりにくいが、標的部位におけるゲノムＤＮＡの二本鎖切断により促進される。ＤＮＡ二本鎖切断を引き起こすために、放射線照射や化学処理を含む多くの方法が使用されてきた。これらの方法は組換えを効果的に促進するが、二本鎖切断はゲノム内でばらばらに起こるので、変異原性及び毒性が高いことがある。現在、ある染色体背景における固有の部位に標的遺伝子改変を行えないことが、ゲノム工学の成功にとって主要な障害となっている。
【０００３】
この目標を達成する一つのアプローチは、ゲノム内で単一部位のみに存在する十分に大きな配列に特異性を有するヌクレアーゼを使用して、標的遺伝子座に二本鎖切断を起こして相同的組換えを促進することである（例えば、Porteusら, (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73参照）。この方法の有効性は、遺伝子操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素の非特異的ヌクレーゼドメインのキメラ融合を利用して様々な生物において実証されている（Porteus, (2006), Mol Ther 13: 438-46; Wrightら, (2005), Plant J. 44: 693-705; Urnovら, (2005), Nature 435: 646-51）。これらの人工的なジンクフィンガーヌクレアーゼは部位特異的な組換えを促進するが、ヌクレアーゼドメインの下方制御により非特異的切断活性が残存し、しばしば意図しない部位を切断する（Smithら, (2000), Nucleic Acids Res. 28: 3361-9）。このような意図しない切断は、処理生物に突然変異や毒性を引き起こすことがある（Porteusら, (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73）。
【０００４】
植物や菌類のゲノムに普通に見出される１５〜４０の塩基対切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼ群は、より毒性の低いゲノム工学代替手段を提供できるかも知れない。そのような「メガヌクレアーゼ」又は「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、グループ１自己スプライシングイントロン及びインテインのような寄生性ＤＮＡエレメントを伴うことが多い。これらは本来、染色体に二本鎖切断を作製して宿主ゲノムの特異的な位置に相同的組換え又は遺伝子挿入を促進し、細胞のＤＮＡ修復機構を補強する（Stoddard, (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49- 95）。メガヌクレアーゼは、通常４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ‐ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ‐Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフにより特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの保存コピーを１つ又は２つ有することにより特徴付けられる（Chevalierら, (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774参照）。２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するメンバーは単量体を形成するのに対して、単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、ホモ二量体を形成する。同様に、ＧＩＹ‐ＹＩＧファミリーメンバーは、７０〜１００残基長であり、その内の２つは活性に不可欠である４つの不変残基を有する４つ又は５つの保存配列モチーフを有するＧＩＹ‐ＹＩＧモジュールを有している（Van Roeyら, (2002), Nature Struct. Biol. 9: 806-811参照）。Ｈｉｓ‐Ｃｙｓボックスメガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を含有する領域にわたるヒスチジンとシステインの高度保存配列により特徴付けられる（Chevalierら, (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774参照）。ＮＨＮファミリーの場合には、メンバーはアスパラギン残基に囲まれた２組の保存ヒスチジンを有するモチーフにより定義される（Chevalierら, (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774参照）。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存構造エレメントに関して互いに大きく離れており、そのため、ＤＮＡ認識配列の特異性及び触媒活性が大きく異なる。
【０００５】
本来、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーである天然のメガヌクレアーゼは、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞及びネズミの部位特異的ゲノム修飾を効果的に促進するために使用されてきたが、この方法はメガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子（Monnatら. (l999),Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 88-93）又は認識配列を導入した予め遺伝子操作されたゲノム（Rouetら, (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 8096-106; Chiltonら, (2003), Plant Physiol. 133: 956-65; Puchtaら, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5055-60; Rongら, (2002), Genes Dev. 16: 1568-81; Goubleら, (2006), J. Gene Med. 8(5): 616-622）の改変に限定されていた。
【０００６】
ヌクレアーゼ刺激遺伝子改変の体系的な実現には、ゲノムに存在する部位に標的ＤＮＡ切断に特異性を持たせた改変酵素を使用する必要があるので、医学的又は生物工学的に関連のある部位で遺伝子改変を促進させるためにメガヌクレアーゼを適応させることには大きな関心が寄せられている（Porteusら, (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Sussmanら, (2004), J. MoI. Biol. 342: 31-41; Epinatら, (2003), Nucleic Acids Res. 31 : 2952-62）。
【０００７】
コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のメガヌクレアーゼＩ‐ＣｒｅＩは、葉緑体染色体の２２塩基対認識配列を認識して切断するＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーであり、メガヌクレアーゼ再設計の標的として魅力的である。その野生型酵素は、各単量体が完全長認識配列中の９塩基対と直接接触するホモ二量体である。この認識配列の１箇所で（Sussmanら, (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chamesら, (2005), Nucleic Acids Res. 33: el78; Seligmanら, (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9）、さらに最近では、この認識配列の３箇所で（Arnouldら, (2006), J. MoI. Biol. 355: 443-58）、塩基優先性を改変する変異をＩ‐ＣｒｅＩ内に同定するために、遺伝子選択法が使用されてきた。Ｉ‐ＣｒｅＩタンパク質‐ＤＮＡ界面は、ＤＮＡ塩基に直接接する９つのアミノ酸と改変界面に対する潜在的接触を形成することができる少なくとも５つの追加的位置を含有する。この界面の大きさにより組合せの複雑さが生じ、大きく改変した切断部位を有する酵素を選択するために構築された配列ライブラリーから適切にサンプルを抽出することは困難である。
【０００８】
ゲノムの正確な改変を促進するヌクレアーゼは依然として必要である。更に、特定の遺伝子座での遺伝子配列の操作が可能な所定の、合理的に設計された認識配列を有するヌクレアーゼを作製できる技術と、正確な配列改変を有する生物を遺伝子操作するためのヌクレアーゼを利用できる技術も必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、一つには、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列に結合する場合にＤＮＡ塩基及びＤＮＡ骨格に接触し、従って、該酵素の特異性及び活性に影響を及ぼす、メガヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー内の特異的アミノ酸残基の同定及び特徴付けに基づいている。この発見を利用して、以下に詳述するように、メガヌクレアーゼの認識配列の特異性及び／又はＤＮＡ結合親和性を変えることができるアミノ酸置換の同定、及び天然に存在するメガヌクレアーゼでは認識できない目的ＤＮＡ配列を認識することができるメガヌクレアーゼの合理的な設計及び展開がなされてきた。本発明はさらに、組換え核酸及び生物を作製するためにメガヌクレアーゼを使用する方法を提供し、メガヌクレアーゼを利用して生物のゲノム内の限定された数の遺伝子座に目的遺伝子配列の組換えを引き起こして、遺伝子治療、病原性感染症の治療及び診断・研究におけるインビトロ利用に適用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
次に述べるように、ある実施形態において、本発明は、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：１の野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、該組換えメガヌクレアーゼは配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５から選択されるＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に特異性を有し、該組換えメガヌクレアーゼは従来知られている削除改変ではない、表１に記載の少なくとも一つの改変を有する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、野生型Ｉ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：６の野生型Ｉ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、該組換えメガヌクレアーゼは配列番号：７及び配列番号：８から選択されるＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に特異性を有し、該組換えメガヌクレアーゼは従来知られている削除改変ではない、表２に記載の少なくとも一つの改変を有する。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、野生型Ｉ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと比較して認識配列に対する特異性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：９のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの３〜１８６残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、該組換えメガヌクレアーゼは配列番号：１０及び配列番号：１１のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列に特異性を有し、該組換えメガヌクレアーゼは従来知られている削除改変ではない、表３に記載の少なくとも一つの改変を有する。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：１２の野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、該組換えメガヌクレアーゼは配列番号：１３及び配列番号：１４から選択されるＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に特異性を有し、該組換えメガヌクレアーゼは従来知られている削除改変ではない、表４に記載の少なくとも一つの改変を有する。
【００１４】
本発明のメガヌクレアーゼは、組換えメガヌクレアーゼの配列特異性に影響を及ぼすように、認識配列内の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の位置に、本明細書に開示された１つ、２つ、３つ又はそれ以上の改変を有することができる。メガヌクレアーゼは、本明細書に開示された新規の改変のみを有することもできるし、従来知られている改変との組み合わせとして本明細書に開示された新規の改変を有することもできるが、従来知られている改変のみを有する組換えメガヌクレアーゼは特に除外される。
【００１５】
他の態様では、本発明は配列非特異的である二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供する。これは、二本鎖ＤＮＡ認識配列の骨格に接触するメガヌクレアーゼ残基の改変により達成される。該改変は、結合親和性を上昇又は低下させることができるので、該酵素の活性全体を上昇又は低下させることができる。更に、結合及び活性の上昇／低下は、配列特異性を低下／上昇させることが知られている。従って、本発明は、主にＤＮＡ結合親和性を変化させることによって、配列特異性を変化させる方法を提供する。
【００１６】
従って、ある実施形態において、本発明は、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、該ＤＮＡ結合親和性が（１）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＥ８０、Ｄ１３７、Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４又はＹ６６の置換又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＴ４６、Ｔ１４０又はＴ１４３の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇しているか、反対に、（２）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋｌ１６又はＫｌ３９の置換又は（ｂ）Ｄ又はＥでのＩ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４６、Ｔ１４０又はＴ１４３の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下しているものである。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、野生型Ｉ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、該ＤＮＡ結合親和性が（１）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＥ１４７、Ｉ８５、Ｇ８６又はＹ１１８の置換又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＱ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０又はＮ１５２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇しているか、反対に、（２）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ３６、Ｒ５１、Ｋ１２３、Ｋ１４３又はＫ１４４の置換又は（ｂ）Ｄ又はＥでのＩ８５、Ｇ８６、Ｙ１１８、Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０又はＮ１５２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下しているものである。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、野生型Ｉ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：９のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの３〜１８６残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、該ＤＮＡ結合親和性が（１）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＤ２０１、Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９又はＹ２２２の置換又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＮ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４又はＳ２０２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇しているか、反対に、（２）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ２０、Ｋ２３、Ｋ６３、Ｋ１２２、Ｋ１４８、Ｋ１５３、Ｋ１９０、Ｋ１９３、Ｋ１９５又はＫ２２３の置換又は（ｂ）Ｄ又はＥでのＬ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９、Ｙ２２２、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４又はＳ２０２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下しているものである。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼを提供するものであって、該メガヌクレアーゼは配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、該ＤＮＡ結合親和性が（１）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＤ２５又はＤ１２８の置換又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９又はＨ１７２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇しているか、反対に、（２）（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ２１、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ１１２、Ｒ１１４又はＲ１３０の置換又は（ｂ）Ｄ又はＥでのＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９又はＨ１７２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下しているものである。
【００２０】
本発明のメガヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように、本明細書に開示された骨格接触残基の１つ、２つ、３つ又はそれ以上に改変を有することができる。更に、ＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすこれらの改変は、認識配列内の特定の位置での組換えメガヌクレアーゼの配列特異性を変更するような上記の骨格接触残基の１つ又は複数の新規改変と組み合わせることが可能であり、また、上述の従来の改変と、又は新規の改変と従来の改変との組み合わせと組み合わせることも可能である。特に、骨格接触改変と塩基接触改変を組み合わせることによって、所望の特異性及び活性を有する組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計することができる。例えば、ＤＮＡ結合親和性の上昇は、塩基接触残基への変化を設計することによる親和性の喪失を相殺することによって設計でき、この親和性の低下は、配列特異性も低下させ一連の酵素の認識配列を広くすることによって設計することができる。
【００２１】
他の態様では、本発明はホモまたはヘテロ二量体形成に対する親和性が変化している合理的に設計されたメガヌクレアーゼ単量体を提供する。二量体形成に対する親和性は、参照野生型メガヌクレアーゼのように、同じ単量体で（すなわち、ホモ二量体形成）又は異なる単量体で（すなわち、ヘテロ二量体形成）測定することができる。これらの組換えメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ二量体における単量体間のタンパク質−タンパク質界面に存在するアミノ酸残基の改変を有する。該改変はヘテロ二量体形成を促進し、非回文認識配列を有するメガヌクレアーゼを作成することができる。
【００２２】
従って、ある実施形態において、本発明は、参照メガヌクレアーゼ単量体との二量体形成に対する親和性が変化している組換えメガヌクレアーゼ単量体を提供するものであって、該組換え単量体は配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＫ７、Ｋ５７又はＫ９６の置換、又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ８又はＥ６１の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである。そのような組換え単量体に基づいて、本発明はまた、（１）配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するが、二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＫ７、Ｋ５７又はＫ９６の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである第１のポリペプチドと、（２）配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するが、二量体形成親和性が（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ８又はＥ６１の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである第２のポリペプチドと、を有する組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を提供する。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、参照メガヌクレアーゼ単量体との二量体形成親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼ単量体を提供するものであって、該組換え単量体は配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＲ３０２の置換又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＤ２０、Ｅ１１又はＱ６４の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである。そのような組換え単量体に基づいて、本発明はまた、（１）配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するが、二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＲ３０２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである第１のポリペプチドと、（２）配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するが、二量体形成親和性が（ｂ）Ｋ又はＲでのＤ２０、Ｅ１１又はＱ６４の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである第２のポリペプチドと、を有する組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を提供する。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、参照メガヌクレアーゼ単量体との二量体形成親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼ単量体を提供するものであって、該組換え単量体は配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有するが、二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＲ９３の置換又は（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ１５２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである。そのような組換え単量体に基づいて、本発明はまた、（１）配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するが、二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＲ９３の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである第１のポリペプチドと、（２）配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するが、二量体形成親和性が（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ１５２の置換から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化しているものである第２のポリペプチドと、を有する組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を提供する。
【００２５】
二量体形成親和性が変化している組換えメガヌクレアーゼ単量体又はヘテロ二量体はまた、上述の塩基接触残基の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の改変、上述の骨格接触残基の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の改変、又は両者の組み合わせを有することができる。従って、例えば、単量体の塩基接触を改変して配列特異性を変化させることができ、単量体の骨格接触を改変してＤＮＡ結合親和性を変化させることができ、タンパク質‐タンパク質界面を改変して二量体形成に影響を与えることができる。そのような組換え単量体は同様に改変された単量体と組み合わせて、所望の配列特異性及び活性を有する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体を作成することができる。
【００２６】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載され、及び本明細書によって可能となる合理的に設計されたメガヌクレアーゼの様々な使用方法を提供する。これらの方法には、遺伝子改変された細胞及び生物の作製、遺伝子治療による疾患の処置、病原体感染の治療並びに診断及び研究のインビトロ適用が含まれる。
【００２７】
従って、一つの態様において、本発明は、（i）本発明のメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び（ii）該目的配列を有する第２の核酸配列で該細胞をトランスフェクトすることによって、染色体に挿入された目的の外因性配列を含有する遺伝子改変された真核細胞を作製する方法を提供する。メガヌクレアーゼは染色体に切断部位を形成し、相同的組換え又は非相同的末端結合により染色体の該切断部位に該目的配列が挿入される。
【００２８】
または、他の態様において、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入し、該目的配列を有する核酸で該細胞をトランスフェクトすることによって、染色体に挿入された目的の外因性配列を含有する遺伝子改変された真核細胞を作製する方法を提供する。メガヌクレアーゼは染色体に切断部位を形成し、相同的組換え又は非相同的末端結合により染色体の該切断部位に該目的配列が挿入される。
【００２９】
他の態様において、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼをコードする核酸で該細胞をトランスフェクトすることによって、染色体の標的配列を破壊して遺伝子改変された真核細胞を作製する方法を提供する。メガヌクレアーゼは染色体に切断部位を形成し、該切断部位での非相同的末端結合により標的配列を破壊する。
【００３０】
他の態様において、本発明は、上述の方法により遺伝子改変された真核細胞を作製し、該遺伝子改変された真核細胞を成長させて遺伝子改変された生物を作製する、遺伝子改変された生物を製造する方法を提供する。これらの実施形態において、真核細胞は、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞及びプロトプラスト細胞から選択することができる。
【００３１】
他の態様において、本発明は、（i）本発明のメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び（ii）目的の配列を有する第２の核酸配列を含有する１つ又は複数の核酸で真核生物の少なくとも１つの細胞をトランスフェクトすることによって、真核生物における遺伝子治療による疾患の処置方法を提供する。メガヌクレアーゼは染色体に切断部位を形成し、該目的配列が相同的組換え又は非相同的末端結合により染色体に挿入され、該目的配列の挿入により疾患の遺伝子治療がなされる。
【００３２】
または、他の態様において、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼタンパク質を真核生物の少なくとも１つの細胞に導入し、目的配列を有する核酸で該細胞をトランスフェクトすることによって、真核生物における遺伝子治療による疾患の処置方法を提供する。メガヌクレアーゼは染色体に切断部位を形成し、相同的組換え又は非相同的末端結合により染色体の該切断部位に該目的配列が挿入され、該目的配列の挿入により疾患の遺伝子治療がなされる。
【００３３】
他の態様において、本発明は、真核生物の染色体の標的配列を破壊して真核生物における遺伝子治療による疾患の処置方法を提供する。該方法では、本発明のメガヌクレアーゼをコードする核酸で真核生物の少なくとも１つの細胞をトランスフェクトする。メガヌクレアーゼは染色体に切断部位を形成し、該切断部位での非相同的末端結合により標的配列を破壊し、該標的配列の破壊により疾患の遺伝子治療がなされる。
【００３４】
他の態様において、本発明は、病原体ゲノムの標的配列を破壊し、本発明のメガヌクレアーゼをコードする核酸で少なくとも１つの感染宿主細胞をトランスフェクトすることによって、真核生物宿主におけるウィルス又は原核生物病原体感染を処置する方法を提供する。メガヌクレアーゼは該ゲノムに切断部位を形成し、（１）該切断部位での非相同的末端結合又は（２）第２の核酸での相同的組換えにより該標的配列が破壊され、該標的配列の破壊により感染の処置がなされる。
【００３５】
さらに一般的には、他の態様において、本発明は、認識配列の少なくとも１つの塩基位置に対する特異性を変化させた組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法を提供する。該方法では、（１）参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し、（２）該塩基位置の塩基接触面を形成するアミノ酸残基を同定し、（３）該接触面の少なくとも第１の残基のβ‐炭素と該塩基位置の少なくとも第１の塩基との距離を決定し、（４）（ａ）該第１の塩基から６Å未満である第１の残基に対しては、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の好適なメンバーの１つである１群及び／又は２群から置換を選択し、（ｂ）該第１の塩基から６Åを超える第１の残基に対しては、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の好適なメンバーの１つである２群及び／又は３群から置換を選択することにより、望ましい変化を促進するアミノ酸置換を同定する。各群は本明細書に定義される。この方法は、別の位置はもちろんのこと、同じ塩基に対して別の接触残基について繰り返してもよく、同じ位置で別の塩基に対しての接触残基について繰り返してもよい。
【００３６】
更に、他の一般的態様において、本発明は、ＤＮＡ結合親和性を高めた組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法を提供する。該方法では、（１）参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し、（２）骨格接触面を形成するアミノ酸接触残基を同定し、（３）（ａ）負に荷電されているか又は疎水性の側鎖を有する接触残基に対しては、非荷電／極性又は正荷電の側鎖を有する置換を選択し、又は（ｂ）非荷電／極性側鎖を有する接触残基に対しては、正荷電の側鎖を有する置換を選択して、ＤＮＡ結合親和性を高めるアミノ酸置換を同定する。逆に、本発明は、ＤＮＡ結合親和性を低下させた組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法を提供する。該方法では、（１）参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し、（２）骨格接触面を形成するアミノ酸接触残基を同定し、（３）（ａ）正に荷電されている側鎖を有する接触残基に対しては、非荷電／極性又は負荷電の側鎖を有する置換を選択し、又は（ｂ）疎水性又は非荷電／極性の側鎖を有する接触残基に対しては、負荷電の側鎖を有する置換を選択して、ＤＮＡ結合親和性を低下させるアミノ酸置換を同定する。
【００３７】
前述の態様のいずれの実施形態においても、組換えメガヌクレアーゼは配列番号：３７から配列番号：８７の群から選択される認識配列を有する。
【００３８】
本発明のこれら及び他の態様及び実施形態は、以下の本発明の詳細な説明により当業者に明白である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１（Ａ）】図１（Ａ）は、Ｉ‐ＣｒｅＩホモ二量体とその天然に存在する二本鎖認識配列との相互作用を結晶学的データに基づいて図示する。この概略図は、２つの楕円形として示されるホモ二量体が結合する、説明目的のみのために巻き戻した状態として示される認識配列（配列番号：２及び配列番号：３）を描写している。各ＤＮＡ半部位の塩基は、−１から−９まで番号が付けられ、認識表面を形成するＩ‐ＣｒｅＩのアミノ酸残基は、アミノ酸一文字表記及び残基の位置を示す数字により表示されている。黒の実線はＤＮＡ塩基との水素結合を、点線は酵素設計により接触が新たに形成されるが、野生型複合体ではＤＮＡと接触しないアミノ酸の位置を、矢印はＤＮＡ骨格に相互作用し、切断活性に影響を与える残基を示す。
【図１（Ｂ）】図１（Ｂ）は、図１（Ａ）の右側の切断半部位の−４位置におけるＡ−Ｔ塩基対間の野生型接触を示す。具体的には、Ｑ２６残基のＡ塩基との相互作用を示している。１７７残基は塩基対に近接しているが、特に相互作用はしていない。
【図１（Ｃ）】図１（Ｃ）は、１７７残基がＥ７７に改変された、合理的に設計されたＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの変異体との相互作用を示す。この変更の結果として、−４位置にはＧ−Ｃ塩基対が好ましい。図１（Ａ）の左側の切断半部位に結晶学的に観察されたように、Ｑ２６とＧ塩基との相互作用には水分子が介在している。
【図１（Ｄ）】図１（Ｄ）は、Ｑ２６がＥ２６に変異され、Ｉ７７残基がＲ７７に変異された、合理的に設計されたＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの変異体との相互作用を示す。この変更の結果として、−４位置にはＣ−Ｇ塩基対が好ましい。
【図１（Ｅ）】図１（Ｅ）は、Ｑ２６がＡ２６に変異され、Ｉ７７残基がＱ７７に変異された、合理的に設計されたＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの変異体との相互作用を示す。この変更の結果として、−４位置にはＴ−Ａ塩基対が好ましい。
【図２（Ａ）】図２（Ａ）は、認識配列の１つについての、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ（ＷＴ）と１１個の本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体との比較を示す。ＷＴ認識配列と比較して保存されている塩基には影が付けられている。９つの塩基対半部位が太字になっている。ＷＴは野生型（配列番号：４）、ＣＦは嚢胞性線維症のほとんどの症例に関与しているヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ５０８対立遺伝子（配列番号：２５）、ＭＹＤは筋緊張性ジストロフィーに関与しているヒトＤＭキナーゼ遺伝子（配列番号：２７）、ＣＣＲはヒトＣＣＲ５遺伝子（主要ＨＩＶ共受容体）（配列番号：２６）、ＡＣＨは軟骨形成不全症に関連しているヒトＦＧＦＲ３遺伝子（配列番号：２３）、ＴＡＴはＨＩＶ‐ＩのＴＡＴ／ＲＥＶ遺伝子（配列番号：１５）、ＨＳＶはＨＳＶ‐ＩのＵＬ３６遺伝子（配列番号：２８）、ＬＡＭはバクテリオファージλｐ０５遺伝子（配列番号：２２）、ＰＯＸは痘瘡（天然痘）ウィルスｇｐ００９遺伝子（配列番号：３０）、ＵＲＡは出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子（配列番号：３６）、ＧＬＡはシロイヌナズナＧＬ２遺伝子（配列番号：３２）、ＢＲＰはシロイヌナズナＢＰ‐１遺伝子（配列番号：３３）を示す。
【図２（Ｂ）】図２（Ｂ）は、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩ（ＷＴ）及びと１１個の合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体のそれぞれを全１２酵素に対する認識部位を提供するプラスミドと６時間３７℃でインキュベートした結果を示す。切断率を各四角内に示す。
【図３】図３は、野生型及び合理的に設計されたＩ‐ＣｒｅＩホモ二量体の切断パターンを示す。Ａは野生型Ｉ‐ＣｒｅＩ、ＢはＩ‐ＣｒｅＩ Ｋ１１６Ｄ、Ｃ〜Ｌは本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼである。酵素は、目的の切断半部位の回文配列及び２７の対応する一塩基対変異体を提供するプラスミドのセットとインキュベートした。棒グラフは３７℃で４時間での分別切断（Ｆ）を示す。黒いバーは表１に基づいて期待される切断パターンを、灰色のバーは期待される切断パターンから外れたＤＮＡ部位を、白い丸は期待される認識部位の塩基を表す。更に、２時間の切断の経時変化が示される。白丸経時変化はＥ８０Ｑ変異を欠くＣＣＲｌ及びＢＲＰ２酵素による切断に対応するＣ及びＬにプロットしている。切断部位は、図２（Ａ）で説明したヘテロ二量体酵素の５'（左欄）及び３'（右欄）半部位に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
１．１．導入
本発明は、ひとつには、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と結合するとＤＮＡ塩基とは特異的な接触を形成するが、ＤＮＡ骨格とは非特異的な接触を形成し、従って、該酵素の認識配列に対する特異性及びＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼす、メガヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー内の特定のアミノ酸の同定及び特徴付けに基づいている。この発見は、以下に詳述するように、該酵素の特異性及び／又は親和性に変化を与えることができるメガヌクレアーゼ内のアミノ酸置換の同定、及び、天然に存在するメガヌクレアーゼは認識しない所望のＤＮＡ配列を認識することができ、及び／又は天然に存在するメガヌクレアーゼと比較して特異性及び／又は親和性を上昇又は低下させたメガヌクレアーゼの合理的設計と開発に使用されてきた。更に、ＤＮＡ結合親和性は、配列特異性だけでなく、酵素活性にも影響を与えるので、本発明は、天然に存在するメガヌクレアーゼと比較して活性を変化させた合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。また、本発明は、ヘテロ二量体の形成を促進するために、二量体の形成に関与する単量体間の界面での残基が改変を受けている合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。最後に、本発明は、本明細書に記載のように、遺伝子治療、抗病原体、抗癌及びインビトロ適用に加えて、組換え細胞及び生物の作製に対して合理的に設計されたメガヌクレアーゼの使用を提供する。
【００４１】
全般的なこととして、本発明は、（１）二本鎖ＤＮＡ認識配列の個々の塩基への配列特異的結合又は（２）二本鎖ＤＮＡ分子のリン酸ジエステル骨格への配列非特異的結合に関与するメガヌクレアーゼ内の部位のアミノ酸残基を変化させた、合理的に設計されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを形成する方法を提供する。酵素活性はＤＮＡ結合親和性に相関するが、ＤＮＡ認識配列への結合に関与するアミノ酸を変化させることによって、特異的な塩基対相互作用を介してメガヌクレアーゼの特異性を変化させることができるだけでなく、二本鎖ＤＮＡに対する全体的な結合親和性を上昇又は低下させることによってメガヌクレアーゼの活性も変化させることができる。同様に、ＤＮＡ骨格への結合に関与するアミノ酸を変化させることによって、酵素の活性を変化させることができるだけでなく、二本鎖ＤＮＡに対する全体的な結合親和性を上昇又は低下させて認識配列への結合の特異性又は縮重度を変化させることができる。
【００４２】
以下に詳述するように、メガヌクレアーゼを合理的に設計する方法は、ＤＮＡ認識／結合に関与するアミノ酸の同定、及び適切なアミノ酸変化を選択する一連の法則の適用を有する。メガヌクレアーゼ配列特異性に関して、該法則は、メガヌクレアーゼのアミノ酸側鎖とＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基との間のメガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の距離に関する立体的検討、及び該アミノ酸側鎖の官能基と関連位置の目的とするＤＮＡ塩基との間の非共有化学的相互作用に関する検討を有する。
【００４３】
最後に、ホモ二量体としてＤＮＡを結合する天然のメガヌクレアーゼの大部分は、偽‐又は完全な回文認識配列を認識する。長い回文配列は稀であると考えられるので、目的のゲノム部位が回文配列である可能性は極めて低い。従って、これらの酵素を目的のゲノム部位を認識するように再設計する場合には、ヘテロ二量体化して非回文ハイブリッド認識配列を切断できる、異なる半部位を認識する２つの酵素単量体を設計する必要がある。従って、ある態様において、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸位置が異なる単量体を二量体化してヘテロ二量体が形成されている、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。ある場合においては、非回文認識配列を認識するヘテロ二量体を作製するために両単量体が合理的に設計される。異なる２つの単量体の混合物は、メガヌクレアーゼ二量体の３つの活性型、すなわち、２つのホモ二量体と１つのヘテロ二量体を作製することができる。加えて、又は、代わりに、ある場合には、ホモ二量体又はヘテロ二量体が形成される可能性を高める又は低めるために、単量体が相互作用して二量体を形成しうる界面においてアミノ酸残基を変化させる。
【００４４】
従って、１つの態様において、本発明は、酵素の特異性及び／又は活性を変化させるようなアミノ酸の変化を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、これらの方法によって得られる合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。更に他の態様において、本発明は、生物のゲノム内の目的とするＤＮＡ配列又は遺伝子座が挿入、削除、置換又はＤＮＡ配列のその他の操作により改変されている組換え核酸及び生物を作製するために、そのように合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使用する方法を提供する。他の態様において、本発明は、病原体特異的又は癌特異的認識配列を有する合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使用して、病原体又は癌細胞の生存を抑制する方法を提供する。
【００４５】
１．２．参照及び定義
本発明及び本明細書に引用された科学文献は、当業者が利用できる知識を確立する。本明細書で引用された、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを含め、米国特許、許可された出願、公開された外国出願及び引用文献は、それぞれを参照することにより具体的かつ個々に組み込まれたように、参照することによりそのまま本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本明細書において、「メガヌクレアーゼ」とは、１２塩基対以上の認識配列において二本鎖ＤＮＡを結合するエンドヌクレアーゼを指す。天然に存在するメガヌクレアーゼは単量体（すなわち、Ｉ‐ＳｃｅＩ）でも、二量体(すなわち、Ｉ‐ＣｒｅＩ）でもよい。本明細書において、メガヌクレアーゼは、単量体メガヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、又は二量体メガヌクレアーゼを形成する単量体を指すものとして使用することができる。
【００４７】
「ホーミングエンドヌクレアーゼ」とは、「メガヌクレアーゼ」と同義である。
【００４８】
本明細書において、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」とは、天然の二量体である単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するメガヌクレアーゼ又は天然の単量体である２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するメガヌクレアーゼを指す。本明細書において、これら２つを区別する必要がある場合には、「モノ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するメガヌクレアーゼを指し、「ジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するメガヌクレアーゼを指す。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの２つの構造ドメインのそれぞれを、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと称する。
【００４９】
本明細書において、「合理的に設計された」とは、天然に存在しない及び／又は遺伝子操作されたことを意味する。本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型又は天然に存在するメガヌクレアーゼとアミノ酸配列又は一次構造が異なっており、その二次、三次又は四次構造が異なっていてもよい。更に、本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型又は天然に存在するメガヌクレアーゼとその認識配列の特異性及び／又は活性も異なっている。
【００５０】
本明細書において、タンパク質に関して「組換え」とは、該タンパク質をコードする核酸に遺伝子操作技術を適用して得られた改変されたアミノ酸配列を有すること、及び該タンパク質を発現する細胞又は生物を意味する。核酸に関して「組換え」とは、遺伝子操作技術を適用して得られた改変された核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術は、これらに限定されないが、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、形質転換及び他の遺伝子導入技術、相同的組換え技術、部位特異的変異誘発技術及び遺伝子融合を含む。この定義に従って、異種宿主でクローニング及び発現されたが、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、組換え体とはみなされない。
【００５１】
本明細書において、組換えタンパク質に関して「改変」とは、参照配列（すなわち、野生型）と比較した場合の組換え配列のアミノ酸残基の挿入、削除又は置換のいずれかを意味する。
【００５２】
本明細書において、「遺伝子改変された」とは、細胞又は生物或いはその原細胞のゲノムＤＮＡ配列が計画的に組換え技術により改変されていることを言う。本明細書において、「遺伝子改変された」には「遺伝子組換えの」が包含される。
【００５３】
本明細書において、「野生型」とは、天然に存在するメガヌクレアーゼのいずれかの形状を指す。「野生型」とは、自然界の酵素の最も一般的な対立遺伝子変異体を意味するものではなく、むしろ自然界に見られるいずれかの対立遺伝子変異体を指す。野生型メガヌクレアーゼは、組換え又は天然に存在しないメガヌクレアーゼから区別される。
【００５４】
本明細書において、「認識配列半部位」又は単に「半部位」とは、モノ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ又はジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの１つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにより認識される二本鎖ＤＮＡ分子の核酸配列を意味する。
【００５５】
本明細書において、「認識配列」とは、モノ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ二量体又はジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体によって結合され切断された一対の半部位を指す。２つの半部位は、該酵素によって特異的に認識されない塩基対によって分離されても分離されなくてもよい。Ｉ‐ＣｒｅＩ、Ｉ‐ＭｓｏＩ及びＩ‐ＣｅｕＩの場合には、各単量体の認識配列半部位は９つの塩基対にわたり、２つの半部位は、特異的には認識されないが、（４塩基対突出部分を有する）実際の切断部位を構成する４つの塩基対により分離される。従って、Ｉ‐ＣｒｅＩ、Ｉ‐ＭｓｏＩ及びＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ二量体の結合された認識配列は、通常、４塩基対切断部位と上下流に隣接する２つの９塩基対半部位を有する、２２塩基対にわたる。各半部位の塩基対は、−９から−１に指定され、−９の位置は切断部位から最も離れており、−１の位置はＮ_１〜Ｎ_４に指定される４つの中央塩基対に隣接する。−９から−１への方向（すなわち、切断部位に向かって）に５’から３’へ方向付けされている各半部位のストランドは「センス」鎖とされ、反対のストランドは「アンチセンス」鎖とされるが、どちらのストランドもタンパク質をコードしなくてもよい。従って、一つの半部位の「センス」鎖は、他方の半部位のアンチセンス鎖である。例えば、図１（Ａ）を参照。ジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体であるＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの場合には、その認識配列はほぼ１８塩基対の非回文配列であり、特異的に認識されない中央塩基対は存在しない。慣習により、２つのストランドの１つを「センス」鎖、他方を「アンチセンス」鎖と称するが、どちらのストランドもタンパク質をコードしなくてもよい。
【００５６】
本明細書において、「特異性」とは、二本鎖ＤＮＡ分子を、認識配列と称される塩基対の特定の配列のみ又は認識配列の特定の一組のみにおいて認識し、切断するメガヌクレアーゼの能力を意味する。認識配列の組は、ある保存位置又は配列モチーフを共有するが、１つ又は複数の位置で縮重されてよい。特異性の高いメガヌクレアーゼは１つ又は非常に数少ない認識配列のみを切断することができる。特異性は、実施例１に記載の切断アッセイにより決定することができる。本明細書において、メガヌクレアーゼが参照メガヌクレアーゼ（すなわち、野生型）を結合、切断されない認識配列を結合、切断するか、又は参照メガヌクレアーゼと比較して認識配列の切断率が統計的に有意に（ｐ＜０．０５）増加又は低下している場合には、メガヌクレアーゼは「変化した」特異性を有する。
【００５７】
本明細書において、「縮重性」は「特異性」の逆の意味である。高縮重性メガヌクレアーゼは、多数の異なる認識配列を切断することができる。メガヌクレアーゼは、半部位内の単一位置又は複数、更には半部位の全ての位置に、配列の縮重を有することができる。そのような配列の縮重は、（i）メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインのどのアミノ酸も、認識配列の１つ又は複数の位置のどの塩基とも特異的な接触を形成できない、（ii）メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインの１つ又は複数のアミノ酸が、認識配列の１つ又は複数の位置で複数の塩基と特異的な接触を形成する、及び／又は（iii）活性のための十分な非特異的ＤＮＡ結合親和性に起因する。「完全に」縮重である位置は、４つの塩基のいずれかが位置を占めるることができ、半部位では「Ｎ」を付けて指定される。「部分的に」縮重である位置は、４つの塩基の２つ又は３つのいずれかが位置を占めることができる（例えば、プリン（Ｐｕ）のいずれか、ピリミジン（Ｐｙ）のいずれか、又はＧ以外）。
【００５８】
本明細書において、メガヌクレアーゼに関して、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」とは、メガヌクレアーゼにおける参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）との非共有的関与の傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋ_Ｄ（例えば、ＷＴ認識配列に対するＩ‐ＣｒｅＩのＫ_Ｄは約０．１ｎＭである）により測定される。本明細書において、参照認識配列に対する組換えメガヌクレアーゼのＫ_Ｄが参照メガヌクレアーゼと比較して統計的に有意に（ｐ＜０．０５）増加又は低下している場合には、メガヌクレアーゼは「変化した」結合親和性を有する。
【００５９】
本明細書において、メガヌクレアーゼ単量体に関して、「二量体形成に対する親和性」とは、メガヌクレアーゼ単量体における参照メガヌクレアーゼ単量体との非共有的関与の傾向を意味する。二量体形成に対する親和性は、参照野生型メガヌクレアーゼと同様に、同じ単量体（すなわち、ホモ二量体形成）を使って又は異なる単量体（すなわち、ヘテロ二量体形成）を使って測定することができる。結合親和性は解離定数Ｋ_Ｄにより測定される。本明細書において、参照メガヌクレアーゼ単量体に対する組換えメガヌクレアーゼ単量体のＫ_Ｄが参照メガヌクレアーゼ単量体と比較して統計的に有意に（ｐ＜０．０５）増加又は低下している場合には、メガヌクレアーゼは二量体形成に対して「変化した」親和性を有する。
【００６０】
本明細書において、「回文」とは、同一の半部位の逆方向の繰り返しからなる認識配列を指すが、この場合、回文配列は、酵素に接触しない４つの中央塩基対については回文的である必要はない。二量体のメガヌクレアーゼの場合には、回文ＤＮＡ配列は、２つの単量体が同一の半部位に対して接触を形成するホモ二量体により認識される。
【００６１】
本明細書において、「偽回文」とは、同一でない又は不完全な回文配列の半部位の逆方向の繰り返しからなる認識配列を指す。この場合、偽回文配列は、４つの中央塩基対に対して回文的である必要がないだけでなく、２つの半部位間の回文配列から逸脱してもよい。偽回文ＤＮＡ配列は、２つの同一の酵素単量体が異なる半部位に接触を形成する野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼにより認識される、典型的な天然ＤＮＡ部位である。
【００６２】
本明細書において、「非回文」とは、メガヌクレアーゼの２つの無関係な半部位からなる認識配列を指す。この場合、非回文配列は、４つの中央塩基対又は２つの単量体半部位のいずれに関しても回文的である必要はない。非回文ＤＮＡ配列は、ジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ又は高縮重モノ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ‐ＣｅｕＩ）のいずれかにより、又は同一でない半部位を認識するモノ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のヘテロ二量体により認識される。
【００６３】
本明細書において、「活性」とは、本発明のメガヌクレアーゼが特定の認識配列を切断する速度を指す。そのような活性は、二本鎖ＤＮＡのリン酸ジエステル結合の加水分解を含む、測定可能な酵素反応である。特定のＤＮＡ基質に作用するメガヌクレアーゼの活性は、特定のＤＮＡ基質に対するメガヌクレアーゼの親和性又は結合力に影響され、これは、同様に、ＤＮＡとの配列特異的及び配列非特異的相互作用により影響される。
【００６４】
本明細書において、「相同的組換え」とは、二本鎖ＤＮＡ切断が相同ＤＮＡ配列を修復鋳型として使用して修復される自然の細胞工程を指す（例えば、Cahillら, (2006), Front. Biosci. 11: 1958-1976参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列であっても、細胞に搬送された外因性核酸であってもよい。従って、ある実施形態においては、合理的に設計されたメガヌクレアーゼが標的配列内で認識配列を切断するために使用され、該標的配列に相同又は実質的に配列相似性を有する外因性核酸は細胞内に搬送されて相同的組換えによる修復の鋳型として使用される。結果として、標的配列と著しく異なってもよい外因性核酸のＤＮＡ配列は、染色体配列に取り込まれる。相同的組換えの工程は主として真核生物で起こる。本明細書では、「相同」は「配列相似性」と同義に使用され、系統的又は系統発生学的な同系性に基づく同一性を求めるものではない。
【００６５】
本明細書において、「非相同的末端結合」とは、二本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接連結により修復される自然の細胞工程を指す（例えば、Cahillら, (2006), Front. Biosci. 11: 1958-1976参照）。非相同的末端結合によるＤＮＡ修復は、誤りが起こりやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の非鋳型付加又は欠失が頻繁に起こる。従って、ある実施形態では、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使用して標的配列内のメガヌクレアーゼ認識配列に二本鎖切断を作成し、非相同的末端結合により遺伝子破壊（例えば、塩基挿入、塩基欠失又はフレームシフト変異の導入）することができる。他の実施形態では、メガヌクレアーゼの刺激により切断された二本鎖ＤＮＡ切断位置に、標的配列に相同性又は実質的な配列相似性を有さない外因性核酸を非相同的末端結合により捕捉してもよい（例えば、Salomonら, (1998), EMBO J. 17: 6086-6095参照）。非相同的末端結合の工程は、真核生物及びバクテリアなどの原核生物の両者で起こる。
【００６６】
本明細書において、「目的の配列」とは、タンパク質、ＲＮＡ又は調節エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー又はプロモーター配列）をコードしているかにかかわらず、メガヌクレアーゼタンパク質を使用してゲノムに挿入できる又はゲノムＤＮＡ配列との置換に使用できる核酸配列、を意味する。目的の配列は、目的の配列から発現されるタンパク質又はＲＮＡに印を付けるための異種ＤＮＡ配列を有することができる。例えば、タンパク質は、これらに限定されないが、エピトープ（例えば、Ｃ‐ｍｙｃやＦＬＡＧ）又は他のリガンド（例えば、ポリＨｉｓ）を有する標識でタグ付けされることができる。更に、目的の配列は、本技術分野で公知の技術に従って、融合タンパク質をコードすることもできる（例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999参照）。ある実施形態においては、目的の配列には、組換えメガヌクレアーゼにより認識されるＤＮＡ配列が切断のために隣接する。それにより、隣接する配列が切断され、組換えメガヌクレアーゼによって切断されたゲノム認識配列内に目的の配列が適切に挿入される。いくつか実施形態においては、相同的組換えにより標的配列が目的の配列で効果的に置換されるように、目的の全配列がゲノムの標的配列と相同であるか又は実質的に配列相似性を有する。他の実施形態では、相同的組換えにより目的の配列をゲノム内で標的配列の遺伝子座に挿入できるように、目的の配列は標的配列と相同性又は実質的な配列相似性を有するＤＮＡ配列に隣接される。ある実施形態では、メガヌクレアーゼが目的の配列により改変された後に標的配列を切断できないように、目的の配列は、メガヌクレアーゼ認識配列内の変異又は他の改変を除く標的配列に実質的に同一である。
【００６７】
本明細書において、アミノ酸配列と核酸配列とに関して、「相似率」及び「配列相似性」とは、配列されたアミノ酸残基の間又はヌクレオチドの間の相似性を最大にする配列のアラインメントに基づく２つの配列の相似度を指し、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、全残基又はヌクレオチドの数及び配列アラインメント内のギャップの存在及び長さの関数である。標準パラメータを使用して配列相似性を決定するための様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムがある。本明細書においては、配列相似性について、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴｐプログラムを、核酸配列についてはＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定した。これらのプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/)）を通して利用可能であり、例えば、Altschulら, (1990), J. MoL. Biol. 215: 403-410; Gish and States (1993), Nature Genet. 3: 266-272; Maddenら, (1996), Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschulら, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 33 89-3402; Zhangら, (2000), J. Comput. Biol. 7(l-2): 203-14に記載されている。本明細書において、２つのアミノ酸配列の相似率は、次のＢＬＡＳＴｐアルゴリズムのパラメータに基づくスコアである。ワードサイズ＝３、ギャップオープニングペナルティ＝−１１、ギャップエクステンションペナルティ＝−１及びスコアマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書において、２つの核酸配列の相似率は、次のＢＬＡＳＴｎアルゴリズムのパラメータに基づくスコアである。ワードサイズ＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝−５、ギャップエクステンションペナルティ＝−２、マッチリワード＝１及びミスマッチペナルティ＝−３。
【００６８】
本明細書において、２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して、「対応する」とは、２つのタンパク質の標準配列アラインメントを（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）実行した場合に、第１のタンパク質の特定の改変が第２のタンパク質の改変と同じアミノ酸残基の置換であり、第１のタンパク質の改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するか又は一致することを示すために使用される。従って、残基ＸとＹが互いに配列アラインメントにおいて対応する場合、ＸとＹが異なる順位であるかもしれないという事実に係わらず、第１タンパク質の残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク質の残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。
【００６９】
本明細書において、変数の数値範囲の記述は、本発明がその範囲内の値のいずれかに等しい変数で実行されるということを表明するものである。従って、本質的に不連続な変数では、変数は範囲の終点を含む数値範囲内の整数値いずれかに等しくできる。同様に、本質的に連続する変数では、変数は範囲の終点を含む数値範囲内の実際の値いずれかに等しくできる。一つの例として、限定されるものではないが、０と２の間の値を有するとして記載される変数は、本質的に不連続な変数では０、１又は２の値をとることができ、本質的に連続する変数では０．０、０．１、０．０１、０．００１又は＞０及び≦２の範囲の他の実際の値のいずれかをとることができる。
【００７０】
本明細書において、特に断らない限り、「又は」は、「及び／又は」の包括的な意味に使用され、「二者択一」の排他的な意味ではない。
【００７１】
２．１．変異された配列特異性を有する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
本発明の１つの態様において、組換えＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法が提供される。この態様において、組換えメガヌクレアーゼは、まず、半部位の各位置における塩基優先順位を変えることができるアミノ酸置換を予測することによって合理的に設計される。これらの置換は個別に、又は所望の切断特異性を有するメガヌクレアーゼの作製と合わせて、実験的に確認することができる。
【００７２】
本発明に従って、所望の塩基優先順位に変えることができるアミノ酸置換は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識配列及びＤＮＡリン酸ジエステル骨格の核酸塩基との接触に関与できる参照メガヌクレアーゼ（例えば、野生型メガヌクレアーゼ又は天然に存在しない参照メガヌクレアーゼ）のアミノ酸側鎖、及びそれらの接触の空間的及び化学的特質を決定することにより予測される。これらのアミノ酸には、限定されるものではないが、参照ＤＮＡ半部位の接触に関与する側鎖が含まれる。一般に、この決定には、メガヌクレアーゼとその二本鎖ＤＮＡ認識配列との間の複合体の構造に関する知識、又は高類似複合体（例えば、同じメガヌクレアーゼと別のＤＮＡ認識配列間又はメガヌクレアーゼの対立遺伝子又は系統発生的変異体とそのＤＮＡ認識配列間）の構造に関する知識を有する必要がある。
【００７３】
原子座標データにより説明されるように、ポリペプチド又は２つ以上のポリペプチドの複合体の三次元構造は、いくつかの方法により得ることができる。例えば、タンパク質の構造は、それらに限定されないが、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ及び質量分析を含む技術により決定することができる。他のアプローチとしては、既存の目的のメガヌクレアーゼ又は関連するメガヌクレアーゼの構造座標のデータ分析がある。そのような構造データは、三次元座標の形でデータベースから取得できることも多く、大抵、オンラインデータベースを通じてアクセスできるデータである（例えば、ＲＣＳＢタンパク質データバンク：www.rcsb.org/pdb）。
【００７４】
構造情報は、タンパク質又はタンパク質複合体の規則的な二次元又は三次元配列（例えば、結晶）により形成される、例えば、Ｘ線又は電子の回折パターンを分析することにより実験的に得ることができる。回折データの空間での三次元原子座標への変換には、コンピュータによる方法が使用される。例えば、メガヌクレアーゼを含む多くのタンパク質‐ＤＮＡ複合体に関する三次元構造情報を作成するためにＸ線結晶学分野が使用されている（例えば、Chevalierら, (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774参照）。
【００７５】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）もまた溶液中の分子の原子間距離を決定するために使用されている。コンピュータによる方法と組み合わせた多次元ＮＭＲ法は、大きなポリペプチドの原子座標の決定に成功している（例えば、Tzakosら, (2006), Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35: 19-42参照）。
【００７６】
或いは、コンピュータによるモデリングは、アミノ酸側鎖、核酸塩基及び結合相互作用の既知の生理化学的特性と同様、タンパク質／ＤＮＡの既知一次構造、可能である場合には、二次、三次及び／又は四次構造に基づくアルゴリズムを適用して使用することができる。そのような方法は、相互作用的アプローチ又は実験的に導出された制約を任意に包含することもできる。そのようなコンピュータソフトウェアの１つの例が、Adamsら, (1999), Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1): 181-90に記載のＣＮＳプログラムである。その他にも、タンパク質構造中のアミノ酸の空間的配置を予測し、様々な標的分子との該タンパク質のアミノ酸側鎖の相互作用を予測するコンピュータプログラムが多種開発されている（例えば、米国特許第6,988,041号参照）。
【００７７】
従って、本発明のある実施形態では、コンピュータによるモデリングにより、ＤＮＡ核酸塩基と特異的に相互作用する及び／又は非特異的リン酸ジエステル骨格相互作用を促進する特定のアミノ酸残基を同定する。例えば、メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ相互作用ポテンシャルの全体についてのコンピュータモデルは、これらに限定されないが、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ^ＴＭ２．０(Avatar Software AB、ストックホルム、スウェーデン）、グラフィカルディスプレイプログラムＯ（Jonesら, (1991), Acta Crystallography, A47: 110）、グラフィカルディスプレイプログラムＧＲＡＳＰ^ＴＭ(Nichollsら, (1991), PROTEINS, Structure, Function and Genetics 11(4): 281ff)又はグラフィカルディスプレイプログラムＩＮＳＩＧＨＴ^ＴＭ(TSI, Inc., Shoreview, ミネソタ）を含む適当なソフトウェアプログラムを使用して作成できる。タンパク質‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の描写を作成、表示、操作するコンピュータハードウェアは市販されており、本技術分野で周知である（例えば、Silicon Graphics Workstation, Silicon Graphics, Inc., Mountainview, カリフォルニア）。
【００７８】
具体的には、メガヌクレアーゼとその二本鎖ＤＮＡ認識配列との相互作用は、本技術分野で公知の方法により決定することができる。例えば、結晶が作製された多成分複合体構造の三次元構造の描写又はモデルは、分子置換又はＳＩＲ／ＭＩＲ（単一／多重同形置換）を含む方法を使用して決定することが可能であり（例えば、Brunger (1997), Meth. Enzym. 276: 558-580; Navaza及びSaludjian (1997), Meth. Enzym. 276: 581-594; Tong及びRossmann (1997), Meth. Enzym. 276: 594-611; 及びBentley (1997), Meth. Enzym. 276: 611-619参照）、ＡＭｏＲｅ／Ｍｏｓｆｌｍ（Navaza (1994), Acta Cryst. A50: 157-163; CCP4 (1994), Acta Cryst. D50: 760-763)又はＸＰＬＯＲ（Brungerら, (1992), X-PLOR Version 3.1. A System for X-ray Crystallography and NMR, Yale University Press, New Haven, CT参照）などのソフトウェアプログラムを使用して行うことできる。
【００７９】
タンパク質構造及びメガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ相互作用ポテンシャルを決定することにより、酵素活性及び特異性に影響を与えるような変化を受けるアミノ酸について合理的な選択が可能になる。決定は、特定の塩基又はＤＮＡリン酸ジエステル骨格と相互作用するアミノ酸側鎖に関するいくつかの因子に基づいてなされる。適切なアミノ酸置換を決定するために使用される化学的相互作用には、それらに制限されないが、ファンデルワールス力、立体障害、イオン結合、水素結合及び疎水性相互作用が包含される。アミノ酸置換は、潜在的認識配列半部位内の特定の塩基とのメガヌクレアーゼの特異的な相互作用が、配列に対する特異性及び結合親和性及び活性全体をある程度まで上昇又は低下させるために、有利か不利かによって選択することができる。また、アミノ酸置換は、活性全体を上昇又は低下させ及び特異性をある程度まで低下又は上昇させるために、二本鎖ＤＮＡのリン酸ジエステル骨格に対する結合親和性を上昇又は低下させるかによって選択することができる。
【００８０】
従って、特定の実施形態において、メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造が決定され、「接触表面」がＤＮＡ認識配列半部位の各塩基対に対して定義される。ある実施形態においては、接触表面は、塩基対の一方の塩基上の主溝水素結合供与体又は受容体から９Å未満のβ炭素を有し、野生型メガヌクレアーゼ-ＤＮＡ複合体に塩基接触を形成する残基であるか否かにかかわりなく、ＤＮＡ志向性の側鎖を有する酵素内のアミノ酸からなる。他の実施形態では、野生型メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体に接触しない残基は除外することができ、また、検討される残基の数又は同一性を変化させるために設計者の自由裁量で残基を含有又は除外できる。一つの例として、後述するように、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩ半部位の−２、−７、−８及び−９塩基位置に対して、接触表面は野生型酵素‐ＤＮＡ複合体で実際に相互反応するアミノ酸位置に限定されたが、−１、−３、−４、−５及び−６位置に対しては、接触表面は、野生型接触に関与しないが、別のアミノ酸と置換された場合に塩基と接触する可能性のある別のアミノ酸位置を含有するように定義された。
【００８１】
注目すべきは、認識配列半部位は、通常、ＤＮＡの一方のストランドのみに関して表されるが、メガヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡの主溝に結合し、両ストランドの核酸塩基に接触するということである。更に、「センス」及び「アンチセンス」鎖の指定はメガヌクレアーゼの結合及び認識に関して完全に任意である。ある位置での配列特異性は、塩基対の１つのメンバーとの相互作用を介して、又は塩基対の両メンバーとの相互作用の組み合わせによって達成される。従って、例えば、Ｘ位置における、Ａ塩基が「センス」鎖、Ｔ塩基が「アンチセンス」鎖である、Ａ／Ｔ塩基対の存在が有利であるためには、残基はＸ位置のセンスに接触するために十分に近接し、Ａの存在を好むものが選択され、及び／又は、残基はＸ位置のアンチセンスに接触するために十分に近接し、Ｔの存在を好むものが選択される。本発明に従って、残基のβ炭素が関連する塩基の最も近い原子から９Å未満にある場合には、該残基は十分に近いと判断される。
【００８２】
従って、例えば、ＤＮＡセンス鎖の９Å未満にβ炭素を有するが、アンチセンサ鎖から９Åを超えるアミノ酸は、センス鎖のみと相互作用する可能性があると判断される。同様に、ＤＮＡアンチセンス鎖の９Å未満にβ炭素を有するが、センサ鎖から９Åを超えるアミノ酸は、アンチセンス鎖のみと相互作用する可能性があると判断される。ＤＮＡの両ストランドから９Å未満にβ炭素を有するアミノ酸は、両ストランドと相互作用する可能性があると判断される。
【００８３】
各接触表面に対して、潜在的アミノ酸置換は、４つのＤＮＡ塩基の１つ又は複数と有利に相互作用する能力の予測に基づいて選択される。選択工程は２つの主要な基準、（i）別の核酸塩基との立体的相互作用に影響するアミノ酸側鎖の大きさ、及び（ii）他の核酸塩基との静電気的及び結合相互作用に影響するアミノ酸側鎖の化学的特性、に基づく。
【００８４】
側鎖の大きさに関して、接触表面のアミノ酸β炭素が塩基から＜６Åである場合には、より短く及び／又はより小さい側鎖を有するアミノ酸を選択することができ、接触表面のアミノ酸β炭素が塩基から＞６Åである場合には、より長く及び／又はより大きい側鎖を有するアミノ酸を選択することができる。接触表面のアミノ酸β炭素が塩基から５〜８Åである場合には、中程度の大きさの側鎖を有するアミノ酸を選択することができる。
【００８５】
比較的短く、小さい側鎖を有するアミノ酸は１群に割り当てられ、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）およびプロリン（Ｐ）が含まれるが、プロリンは比較的柔軟性に乏しいので、使用されることは稀であると思われる。また、グリシンはペプチド骨格に望ましくない柔軟性を導入し、その非常に小さい大きさのために大きな残基を置換する際に有効な接触の可能性を下げてしまうので、使用されることは稀であると思われるが、一方で、グリシンは縮重位置を作っていく場合に使用することができる。比較的中程度の長さと大きさの側鎖を有するアミノ酸は２群に割り当てられ、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）及びグルタミン（Ｑ）が含まれる。比較的長く、大きな側鎖を有するアミノ酸は３群に割り当てられ、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）が含まれるが、トリプトファンは比較的柔軟性に乏しいので、使用されることは稀であると思われる。また、リジン、アルギニン及びメチオニンはその側鎖の柔軟性により長い又は中程度の距離から塩基接触するので、これらのアミノ酸は２及び３群の両群に包含される。これらの群を表形式で以下に示す。

【００８６】
側鎖の化学的特性に関して、異なる核酸塩基との相互作用ポテンシャルについて異なるアミノ酸を評価し（例えば、ファンデルワールス力、イオン結合、水素結合及び疎水性相互作用）、二本鎖ＤＮＡ認識配列半部位の特定の位置の特定の塩基とのメガヌクレアーゼの特異的な相互作用を好むか又は嫌う残基が選択される。ある場合には、１つ又は複数の完全又は部分的縮重位置を有する半部位を形成することが望ましい。そのような場合、２つ又はそれ以上の塩基の存在を好む残基を選んでもよく、又は１つ又は複数の塩基を嫌う残基を選んでもよい。例えば、部分的縮重塩基認識は、センス又はアンチセンス位置のピリミジンの立体障害により達成される。
【００８７】
グアニン（Ｇ）塩基は、塩基のＮ７及びＯ６への水素結合を形成する塩基側鎖を有するアミノ酸を使用して認識することができる。シトシン（Ｃ）の特異性は、Ｃ以外の全ての塩基に存在する主溝の電気陰性基と不利に相互作用する負荷電の側鎖により与えられる。チミン（Ｔ）認識は、塩基の疎水性側鎖と主溝メチル基との間の疎水性及びファンデルワールス相互作用を使用して合理的に設計される。最後に、アデニン（Ａ）塩基は、塩基のＮ７とＮ６に一対の水素結合を介して、カルボキサミド側鎖であるＡｓｎとＧｌｎ又はヒドロキシ側鎖であるＴｙｒを使用して認識される。最終的に、Ｈｉｓは、Ｎ７に水素結合を供与することによって、プリン塩基（Ａ又はＧ）に対する特異性を与えるために使用することができる。これらＤＮＡ認識に対する直接の法則は、特定の塩基対位置における塩基の１つ又は両者が合理的に設計された接触を介して認められる接触表面の予測に適用できる。
【００８８】
従って、異なる核酸塩基との結合相互作用及び接触が形成される位置において好まれる塩基に基づいて、各アミノ酸残基はそれが好む塩基（すなわち、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＡ）それぞれに対応して１つ又は複数の異なる群に割り当てることができる。従って、Ｇ群はアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）及びヒスチジン（Ｈ）を含み、Ｃ群はアスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）を含み、Ｔ群はアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）及びフェニルアラニン（Ｆ）を含み、Ａ群はアスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）及びヒスチジン（Ｈ）を含む。ここで留意すべきは、ヒスチジンはＧ群及びＡ群の両群に割り当てられ、セリン（Ｓ）はどの群にも含まれないが、縮重位置を支持するために使用されてもよく、更にプロリン、グリシン及びトリプトファンはその顕著な立体的理由によりどの特定の群にも含まれないことである。これらの群を表形式で以下に示す。

【００８９】
従って、本発明に従って、所定の位置Ｘにおいてメガヌクレアーゼの認識配列半部位に所望の変化をもたらすためには、（１）少なくとも野生型又は参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造に関連する箇所及び位置Ｘで接触表面を定義するアミノ酸残基側鎖を決め、（２）接触表面を有する少なくとも１つの残基のβ炭素と位置Ｘの塩基対の少なくとも１つの塩基との間の距離を決定し、（３）（ａ）塩基から＜６Åである残基に対しては、所望の変化を促進するためにＧ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の適切な１つのメンバーである１群及び／又は２群から残基を選択し、及び／又は（ｂ）塩基から＞６Åである残基に対しては、所望の変化を促進するためにＧ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の適切な１つのメンバーである２群及び／又は３群から残基を選択する。接触表面を有するそのような残基の１つ以上を分析のために選択し、改変することができ、ある実施形態では、その残基のそれぞれを分析し、複数の残基を改変する。同様に、接触表面に含まれる残基のβ炭素とＸ位置の塩基対の２つの塩基のそれぞれとの距離を測定することができ、残基が両塩基の９Å未満である場合には、塩基対の両塩基に影響を与える異なる置換が可能である（例えば、一方のストランド上の近位の塩基に影響を与えるための１群からの残基、又は他方のストランドの遠位の塩基に影響を与えるための３群からの塩基）。或いは、塩基対の両塩基と相互作用することができる残基置換の組み合わせは特異性に影響を与えることができる（例えば、Ｔ／Ａに対して選択するため、アンチセンス鎖に接触するＡ群からの残基と結合するセンス鎖に接触するＴ群からの残基）。最後に、残基の複数の代替改変は、経験的に（例えば、組換えメガヌクレアーゼの作製及びその配列認識の試験による）またはコンピュータにより（例えば、改変酵素のメガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体のコンピュータモデリングにより）実証して、代替から選択できる。
【００９０】
一旦、野生型又は参照メガヌクレアーゼの１つ又は複数の所望のアミノ酸改変が選択されると、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは本技術分野で周知の組換え方法及び技術により作製することができる。ある実施形態では、非ランダムな又は部位特異的な変異誘発技術により特異的な配列変異を作成する。非ランダムな変異誘発技術の非制限的な例として、重複プライマーＰＣＲ（例えば、Wangら, (2006), Nucleic Acids Res. 34(2): 517-527参照）、部位特異的変異誘発（例えば、米国特許第7,041,814号参照)、カセット変異誘発（例えば、米国特許第7,041,814参照）及びプロメガバイオサイエンス社（Promega Biosciences, Inc.）から入手可能なＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓキット（San Luis Obispo, カリフォルニア）の製造者プロトコールを挙げることができる。
【００９１】
合理的に設計されたメガヌクレアーゼによる特定のＤＮＡ配列の認識及び切断は、当業者に公知のいずれかの方法により測定できる（例えば、米国特許公開第2006/0078552号参照）。ある実施形態では、メガヌクレアーゼ切断の決定は、インビトロ切断アッセイにより測定される。そのような測定法は、測定されたメガヌクレアーゼの目的認識配列を含むポリヌクレオチド基質のインビトロ切断を利用し、ある実施形態では、半部位の一方又は両方の１つ又は複数の塩基が別の塩基に変化した目的の認識配列の変異を利用する。典型的には、ポリヌクレオチド基質は、合成しベクターにクローン化した標的部位を有する二本鎖ＤＮＡ分子である。ポリヌクレオチド基質は線状又は環状であり、典型的には１つの認識配列のみを有する。メガヌクレアーゼは適切な条件下にポリヌクレオチド基質とインキュベートし、得られたポリヌクレオチドを切断生成物を同定する既知の方法（例えば、電気泳動又はクロマトグラフィー）により分析する。線状の二本鎖ＤＮＡ基質が単一の認識配列を有する場合、メガヌクレアーゼ活性は２つのバンド（生成物）の出現と最初の全長基質バンドの消失により検出される。ひとつの実施形態において、メガヌクレアーゼ活性は、例えば、Wangら, (1997), Nucleic Acid Res., 25: 3767-3776に記載の方法により測定できる。
【００９２】
他の実施形態では、メガヌクレアーゼの切断パターンはインビトロ切断アッセイ（例えば、米国特許公開第2006/0078552号参照）を利用して決定される。特定の実施形態では、インビトロ試験は、一本鎖アニーリング組換試験（ＳＳＡ）である。この種の試験は当業者に公知である（Rudinら, (1989), Genetics 122: 519-534及びFishman-Lobellら, (1992), Science 258: 480-4）。
【００９３】
当業者に明らかなように、活性を完全に喪失することなく、ＤＮＡの認識及び結合に関与しているドメイン以外のヌクレアーゼ酵素のドメインに追加のアミノ酸置換、挿入、削除を行うことができる。置換は、構造的又は機能的に制約された位置に類似のアミノ酸残基を保存的に置換するか、構造的又は機能的な制約の低い位置に非保存的な置換を行う。そのような置換、挿入、削除は、当業者であれば努力することなく日常の実験により同定することができる。従って、ある実施形態では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、参照メガヌクレアーゼ配列に対していずれにしても８５％から９９％の配列相似性 （例えば、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９９％）を有するタンパク質を包含する。野生型Ｉ‐ＣｒｅＩ、Ｉ‐ＭｓｏＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩ及びＩ‐ＣｅｕＩタンパク質のそれぞれに関して、ほとんどのＮ末端およびＣ末端配列がＸ線結晶学研究ではっきりと分っていない。これはこれらの位置が構造的又は機能的な制約を受けていないことを示唆する。従って、これらの残基は配列相似性の計算から除外することができ、以下の参照メガヌクレアーゼ配列を使用することができる。すなわち、配列番号：１：Ｉ‐ＣｒｅＩの２〜１５３残基、配列番号：６：Ｉ‐ＭｓｏＩの６〜１６０残基、配列番号：９：Ｉ‐ＳｃｅＩの３〜１８６残基及び配列番号：１２：Ｉ‐ＣｅｕＩの５〜２１１残基。
【００９４】
２．２．ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーメガヌクレアーゼ
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼファミリーは、宿主生物の様々な系統発生的グループからの２００以上のメンバーからなる。このファミリーの全てのメンバーは、特定のＤＮＡ配列の切断に関与している他の構造モチーフに加えて、高保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを１つ又は２つ有している。このモチーフを２つ有する酵素（すなわち、ジ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ）は単量体として機能するのに対して、単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有する酵素（すなわち、モノ‐ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ）は二量体として機能する。
【００９５】
全てのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーメンバーは、比較的長い配列（＞１２ｐｂ）を認識し、４つのヌクレオチド３’突出部を残して切断する。これらの酵素はまた、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフに加え、タンパク質‐ＤＮＡ界面の逆平行βストランドの類似配列を含む多数の構造モチーフを共有する。これらの保存構造モチーフ内のアミノ酸は、ＤＮＡ塩基との相互作用に関与して認識配列の特異性を与える。ファミリーのメンバー間（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ及びＩ−ＣｅｕＩ）の全体的な構造相似性はＸ線結晶学により解明されている。従って、このファミリーのメンバーはこれら構造モチーフ内の特定のアミノ酸を改変して、酵素の全体としての活性又は配列特異性を変えることが可能であり、対応する改変は他のファミリーメンバーにも同様な結果を与えると合理的に期待できる。一般的に、Chevalierら, (2001), Nucleic Acid Res. 29(18): 3757-3774参照）。
【００９６】
２．２．１．Ｉ−ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼ
一つの態様において、本発明はコナミドリムシのＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づく又は由来の合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を配列番号：１に示す。これはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＰＯ５７２５に対応する。結晶構造ＰＤＢ番号１ＢＰ７から、下記の野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２つの認識配列半部位が知られている。
位置 -9-8-7-6-5-4-3-2-1
5'-G A A A C T G T C T C A C G A C G T T T T G-3' 配列番号：２
3'-C T T T G A C A G A G T G C T G C A A A A C-5' 配列番号：３
位置 -1-2-3-4-5-6-7-8-9
ここで留意すべきことは、中央の４塩基対以外でも、この天然の認識配列は完全な回文配列ではないことである。２つの認識配列半部位はそれぞれのセンス鎖上に太字で示されている。
【００９７】
野生型Ｉ‐ＣｒｅＩもまた、以下の（中央のＮ_１〜Ｎ_４塩基を除いて）完全な回文配列を認識し、切断する。
位置 -9-8-7-6-5-4-3-2-1
5'-C A A A C T G T C G T G A G A C A G T T T G-3' 配列番号：４
3'-G T T T G A C A G C A C T C T G T C A A A C-5' 配列番号：５
位置 -1-2-3-4-5-6-7-8-9
配列番号：４及び配列番号：５の回文配列は、この部位に酵素が高親和性で結合し、天然のＤＮＡ配列よりも効果的に切断するので、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩの基質としてより適していると考えられる。以下の開示の目的のために、また特に本明細書に記載の実験結果に関して、野生型Ｉ‐ＣｒｅＩにより切断されたこの回文配列は「ＷＴ」と称される（例えば、図２（Ａ）参照）。２つの認識配列半部位はそれぞれのセンス鎖内に太字で示されている。
【００９８】
図１（Ａ）は野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼホモ二量体と二本鎖ＤＮＡ認識配列との相互作用を表しており、図１（Ｂ）は野生型酵素の１つの半部位と野生型認識配列の−４位置における酵素のアミノ酸残基と塩基との間の特異的な相互作用を示し、図１（Ｃ）〜（Ｅ）は、半部位の−４位置で特異性が改変されている本発明の３つの合理的に設計されたメガヌクレアーゼについて、１つの半部位の−４位置での酵素のアミノ酸残基と塩基との特異的な相互作用を示している。
【００９９】
半部位のいずれかの特定の塩基位置での塩基の優先性は、本明細書に開示されている方法を使って他の３つの塩基対のそれぞれに対して合理的に変えることができる。まず、特定の塩基位置での野生型認識表面を（例えば、メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体共結晶構造の解析、又はメガヌクレアーゼ-ＤＮＡ複合体のコンピュータモデリングにより）決定する。次に、存在する及び潜在する接触残基を、アミノ酸位置の周りのβ炭素と特定の塩基位置での各ＤＮＡ鎖上の核酸塩基との間の距離に基づいて決定する。例えば、限定するものではないが、図１（Ａ）に示されるように、−４位置のＩ‐ＣｒｅＩ野生型メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ接触残基はアンチセンスＤＮＡ鎖上のＡに結合する位置２８にグルタミンを有する。残基７７はまた、センスＤＮＡ鎖の−４塩基に接触できる可能性を有するとして同定される。残基２６のβ炭素は、アンチセンスＤＮＡ鎖の塩基ＡのＮ７から５．９Å離れている。残基７７のβ炭素は、センス鎖上のＴのＣ５‐メチルから７．１５Å離れている。この距離と本明細書に記載されている化学的規定に従って、センス鎖のＣは７７位置でグルタミン酸と水素結合し、アンチセンス鎖のＧは２６位置で（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ結晶構造に見られるように、水分子に介在されて）グルタミンと結合できた（図１（Ｃ）参照）。センス鎖のＧは７７位置でアルギニンと水素結合し、アンチセンス鎖のＣは２６位置でグルタミン酸と水素結合できた（図１（Ｄ）参照）。センス鎖のＡは７７位置でグルタミンと水素結合し、アンチセンス鎖のＴは２６位置でアラニンと疎水性接触を形成できた（図１（Ｅ）参照）。塩基特異的接触が７７位置に形成されると、野生型接触Ｑ２６を（例えば、セリン残基に）置換してその特異性に対する影響を低下又は除くことができる。或いは、２６と７７位置で相補的変異を特定の塩基対を特定するために組み合わせることができる（例えば、Ａ２６はアンチセンス鎖上のＴを特定し、Ｑ７７はセンス鎖上のＡを特定する（図１（Ｅ））。これらの予測残基置換は全て実験的に確認された。
【０１００】
従って、本発明に従って、Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインへのアミノ酸改変の実質的な数が同定され、単独又は組み合わせて、これらの合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素と異なる半部位を有するように、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で変化させた特異性を有する組換えメガヌクレアーゼを得た。Ｉ‐ＣｒｅＩのアミノ酸の改変及び認識配列半部位の特異性における変化を表１に示す。
【０１０１】
【表１】

【０１０２】
２．２．２．Ｉ−ＭｓｏＩ由来のメガヌクレアーゼ
他の態様において、本発明はプラシノ藻のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼに基づく又は由来する合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関連する。Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を配列番号：６に示す。これはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３４３８７に対応する。結晶構造ＰＤＢ番号１Ｍ５Ｘから、下記の野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの２つの認識配列半部位が示される。
位置 -9-8-7-6-5-4-3-2-1
5'-C A G A A C G T C G T G A G A C A G T T C C-3' 配列番号：７
3'-G T C T T G C A G C A C T C T G T C A A G G-5' 配列番号：８
位置 -1-2-3-4-5-6-7-8-9
ここで留意すべきことは、中央の４塩基対以外でも、この認識配列は完全な回文配列ではないことである。２つの認識配列半部位はそれぞれのセンス鎖上に太字で示されている。
【０１０３】
本発明に従って、Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインへのアミノ酸改変の実質的な数が同定され、単独又は組み合わせて、これらの合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素と異なる認識配列を有するように、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で変化させた特異性を有する組換えメガヌクレアーゼを得た。Ｉ−ＭｓｏＩのアミノ酸の改変及び認識配列半部位の特異性における予測される変化を表２に示す。
【０１０４】
【表２】

【０１０５】
２．２．３．Ｉ−ＳｃｅＩ由来のメガヌクレアーゼ
他の態様において、本発明は出芽酵母のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼに基づく又は由来する合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関連する。Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を配列番号：９に示す。これはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ０９８４３に対応する。結晶構造ＰＤＢ番号１Ｒ７Ｍから、下記の野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識配列が示される。
センス 5'-T T A C C C T G T T A T C C C T A G-3' 配列番号：１０
アンチセンス 3'-A A T G G G A C A A T A G G G A T C-5' 配列番号：１１
位置 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
ここで留意すべきことは、認識配列は非回文配列であり、半部位を分離する４つの塩基対が存在しないことである。
【０１０６】
本発明に従って、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインへのアミノ酸改変の実質的な数が同定され、単独又は組み合わせて、これらの合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素と異なる認識配列を有するように、ＤＮＡ認識配列内の個々の塩基で変化させた特異性を有する組換えメガヌクレアーゼを得た。Ｉ−ＳｃｅＩのアミノ酸の改変及び認識配列の特異性における予測される変化を表３に示す。
【０１０７】
【表３】

【０１０８】
２．２．４．Ｉ−ＣｅｕＩ由来のメガヌクレアーゼ
他の態様において、本発明はクラミドモナスユーガメタスのＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼに基づく又は由来する合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関連する。Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を配列番号：１２に示す。これはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ３２７６１に対応する。結晶構造ＰＤＢ番号２ＥＸ５から、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの２つの認識配列半部位が示される。
位置 -9-8-7-6-5-4-3-2-1
5'-A T A A C G G T C C T A A G G T A G C G A A-3' 配列番号：１３
3'-T A T T G C C A G G A T T C C A T C G C T T-5' 配列番号：１４
位置 -1-2-3-4-5-6-7-8-9
ここで留意すべきことは、中央の４塩基対以外でも、Ｉ−ＣｅｕＩ認識界面における自然の縮重により、Ｉ−ＣｅｕＩがホモ二量体であるという事実にもかかわらず、認識配列が非回文配列であることである（Spiegelら, (2006), Structure 14: 869-80）。２つの認識配列半部位はそれぞれのセンス鎖上に太字で示されている。
【０１０９】
本発明に従って、Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインへのアミノ酸改変の実質的な数が同定され、単独又は組み合わせて、これらの合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素と異なる認識配列を有するように、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で変化させた特異性を有する組換えメガヌクレアーゼを得た。Ｉ−ＣｅｕＩのアミノ酸の改変及び認識配列の特異性における予測される変化を表４に示す。
【０１１０】
【表４】

【０１１１】
２．２．５．特異的に排除された組換えメガヌクレアーゼ
本発明は、先行技術に記載の組換えメガヌクレアーゼを包含するものではなく、別の方法により開発されたものである。これらの排除されるメガヌクレアーゼにはArnouldら, (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58、Sussmanら, (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41、Chamesら, (2005), Nucleic Acids Res. 33: el78、Seligmanら, (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9及びAshworthら, (2006), Nature 441(7093): 656-659に記載されるものが含まれ、それらの開示全体はここに引用することにより本明細書に取り込まれ、Ｃ３３、Ｒ３３、Ａ４４、Ｈ３３、Ｋ３２、Ｆ３３、Ｒ３２、Ａ２８、Ａ７０、Ｅ３３、Ｖ３３、Ａ２６及びＲ６６から選択される単一の置換を有するＩ−ＣｒｅＩに基づく組換えメガヌクレアーゼが排除されるメガヌクレアーゼに含まれる。更に、Ａ６８／Ｎ７０／Ｎ７５及びＤ４４／Ｄ７０／Ｎ７５から選択された３つの置換又はＫ４４／Ｔ６８／Ｇ６０／Ｎ７５及びＲ４４／Ａ６８／Ｔ７０／Ｎ７５から選択された４つの置換を有する組換えメガヌクレアーゼが排除される。最後に、一対のＬ２８及びＲ８３置換を有するＩ−ＭｓｏＩに基づく組換えメガヌクレアーゼも特異的に排除される。これらの置換又は置換の組み合わせは、本明細書において「排除された改変」と呼ばれる。
【０１１２】
２．２．６．認識配列半部位に多変化を有するメガヌクレアーゼ
他の態様において、本発明は、ＤＮＡ認識配列半部位の２つ以上の位置の半部位優先順位を変えるために、上記２．２．１．〜２．２．４．欄に記載されているように、２つ以上のアミノ酸の改変を組み合わせることにより作製される合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。例えば、限定するものではなく、また更に十分に後述するが、改変、（−７位置のＣを好む）Ｒ３０／Ｅ３８、（−６位置のＧを好む）Ｒ４０、（−５位置のＧを好む）Ｒ４２及び（−９位置の完全な縮重を好む）Ｎ３２を取り入れることによりＤＪｌ酵素がＩ−ＣｒｅＩから誘導された。合理的に設計されたＤＪｌメガヌクレアーゼは、Ａ_−７Ａ_−６Ｃ_−５に対して優先的な野生型と比較してＣ_−７Ｇ_−６Ｇ_−５を不変的に認識し、−９位置のＡに対する耐性が上昇されている。
【０１１３】
異なる塩基位置を影響する残基置換を組み合わせる能力は、一部にはＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのモジュラー特性による。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ認識相互作用の塩基接触のほとんどは、個々のアミノ酸側鎖により作られており、相互作用は比較的自由な相互連結であるか、隣接する塩基と相互作用する側鎖間の水素結合ネットワークである。これは、一般に、隣接する塩基での側鎖の相互作用に影響することなく、１つの塩基位置で相互作用する残基の操作を可能にする。上記２．２．１．〜２．２．４．欄で記載した変異の追加の特性はまた、これらの変異を同定するために使用された方法の必然的な結果である。該方法は、単一の塩基と直接相互作用する側鎖置換を予測する。相互連結又は側鎖間の水素結合ネットワークは、一般に、認識界面内の置換の独立性を保持するために回避される。
【０１１４】
側鎖置換の組み合わせには、完全に又は部分的に互いに適合しないものがある。適合しない対またはアミノ酸の一組が合理的に設計されたメガヌクレアーゼに組み込まれた場合、得られた酵素は触媒活性が低下又は消失する。代表的には、これらの不適合性は、導入されたアミノ酸の側鎖間の立体障害によるものであり、活性はこの相互作用を同定し、除去することによって復元することができる。具体的には、大きな側鎖を有する２つのアミノ酸（例えば、２又は３群のアミノ酸）をメガヌクレアーゼ構造内の互いに隣接するアミノ酸の位置（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼでは、３２と３３、２８と４０、２８と４２、４２と７７又は６８と７７）に導入する場合、これらの２つのアミノ酸は互いに作用し、酵素活性が低下すると思われる。この相互作用は、互いに適合しないアミノ酸の一方又は両方をより小さな側鎖を有するアミノ酸（例えば、１群又は２群）に置換することによって解消される。例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ由来の合理的に設計されたメガヌクレアーゼでは、Ｋ２８はＲ４０とＲ４２の両者と相互作用する。酵素活性を最大にするために、Ｒ４０とＲ４２を２８位置のセリン又はアスパラギン酸と結合することができる。
【０１１５】
本明細書に説明されているように同定されたアミノ酸置換の組み合わせは、野生型メガヌクレアーゼ（又は前もって改変したメガヌクレアーゼ）の特異性を元の認識配列から、目的の核酸（例えば、ゲノム）に存在するかもしれない所望の認識配列に合理的に変更するために使用することができる。図２Ａは、例えば、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列ＷＴ（配列番号：４）の「センス」鎖を、合理的に設計されたメガヌクレアーゼが有用である多数の他の配列と共に示す。ＷＴ認識配列と所望の認識配列の間の保存塩基は影を付けて示す。本発明に従って、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づく組換えメガヌクレアーゼをこれらの所望の認識配列のそれぞれに対して、他のものと同様に、本明細書に記載されているように適当なアミノ酸置換により、合理的に設計することができる。
【０１１６】
３．ＤＮＡ結合親和性が変更された合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
上述したように、本発明の組換えメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合親和性は、ＤＮＡのリン酸ジエステル骨格と接触表面を形成するいくつかのアミノ酸を変えることによって変異させることができる。接触表面は、残基が野生型メガヌクレアーゼ-ＤＮＡ複合体内のＤＮＡ骨格と接触するか否かにかかわりなく、ＤＮＡ骨格から９Å未満のβ炭素及びＤＮＡに向かう側鎖を有する酵素内のアミノ酸を有する。ＤＮＡ結合は酵素活性にとって必要な前駆体であるので、ＤＮＡ結合親和性の上昇又は低下は、それぞれ、酵素活性の上昇及び低下を引き起こすことが示されている。しかし、ＤＮＡ結合親和性の上昇又は低下はまた、メガヌクレアーゼ配列特異性を低下又は上昇させることが示されている。従って、活性と特異性はリン酸ジエステル骨格の接触を改変することによって調節することができる。
【０１１７】
具体的に、酵素活性を上昇させ、特異性を低下させるためには、
（i）酵素とＤＮＡ骨格との間の静電反発力を除去する。同定されたアミノ酸が負に荷電した側鎖を有している場合（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、負に荷電したＤＮＡ骨格と反発することが予想されるが、アミノ酸を荷電されていない又は正に荷電した側鎖を有するアミノ酸に置換することによって、立体相互作用の影響を受けることを条件として、反発力を除くことができる。実験的に検証した例では、Ｉ−ＣｒｅＩのグルタミン酸８０をグルタミンに変異させる。
【０１１８】
（ii）酵素とＤＮＡ骨格との間に静電気引力相互作用を導入する。接触表面のいずれかの位置に、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジンやアルギニン）を導入することにより、立体相互作用の影響を受けることを条件として、結合親和性の上昇が期待される。
【０１１９】
（iii）酵素とＤＮＡ骨格との間に水素結合を導入する。接触表面のアミノ酸が適当な水素結合機能性を欠いているか、ＤＮＡ骨格と相互作用するには短すぎる若しくは長すぎる及び／又は柔軟すぎる側鎖を有しているために、アミノ酸がＤＮＡ骨格と水素結合を形成できない場合には、水素結合を供与でき、適当な長さと柔軟性を有する極性アミノ酸（例えば、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン又はアルギニン)を、立体相互作用の影響を受けることを条件として、導入することができる。
【０１２０】
具体的に、酵素活性を低下させ、特異性を上昇させるためには、
（i）酵素とＤＮＡ骨格との間に静電反発力を導入する。接触表面のいずれかの位置に、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸やアスパラギン酸）を導入することにより、立体相互作用の影響を受けることを条件として、結合親和性の低下が期待される。
【０１２１】
（ii）酵素とＤＮＡとの間の静電気引力を除去する。接触表面のアミノ酸が負に荷電しているＤＮＡ骨格と相互作用する正に荷電した側鎖を有している場合（例えば、リジン又はアルギニン）、立体相互作用の影響を受けることを条件として、アミノ酸を荷電されていない又は負に荷電した側鎖を有するアミノ酸に置換することによって、この引き合う相互作用を除くことができる。実験的に検証した例では、Ｉ−ＣｒｅＩのリジン１１６をアスパラギン酸に変異させる。
【０１２２】
（iii）酵素とＤＮＡ骨格との間の水素結合を除去する。接触表面のアミノ酸がＤＮＡ骨格と水素結合を形成する場合、その側鎖が適当な官能基を有していないか、必要な長さ／柔軟性特徴を欠いているため同様の水素結合を形成しないことが期待されるアミノ酸に置換することができる。
【０１２３】
例えば、Ｉ−ＣｒｅＩに基づく組換えメガヌクレアーゼには、活性を上昇させるためにＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの８０位置のグルタミン酸をリジン又はグルタミンに変えたものがある。他の実施形態では、Ｉ−ＣｒｅＩの６６位置のチロシンをアルギニン又はリジンに変更し、メガヌクレアーゼの活性を上昇させている。更にまた別の実施形態では、Ｉ−ＣｒｅＩの３４位置のリジンをアスパラギン酸に、６６位置のチロシンをアスパラギン酸に及び／又は１６６位置のリジンをアスパラギン酸に変更し、酵素活性を低下させている。
【０１２４】
組換えメガヌクレアーゼの活性は、特定の認識配列に関して活性無しから非常に強い活性までの範囲で、その組み換え酵素の活性を調節することができる。例えば、ＤＪｌ組換えメガヌクレアーゼは、２６位置にグルタミン酸変異を有する場合、その活性を完全に失う。しかし、２６位置のグルタミン酸置換と８０位置のグルタミン置換との組み合わせは、認識配列半部位内の−４のグアニンに対して高い特異性及び活性を有する組換えメガヌクレアーゼを作成する（図１（Ｄ）参照）。
【０１２５】
本発明に従って、リン酸ジエステルＤＮＡ骨格に近接する種々の位置のアミノ酸を、メガヌクレアーゼの活性と特異性の両方に同時に影響を与えるように変化させることができる。この酵素の特異性及び活性の「同調」は、リン酸ジエステル骨格とのアミノ酸による接触の数を増やす又は減らすことによって達成される。リン酸ジエステル骨格との様々な接触はアミノ酸側鎖により促進することができる。実施態様によっては、リン酸ジエステル骨格とのアミノ酸側鎖の結合は、イオン結合、塩橋、水素結合及び立体障害により影響される。例えば、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに対して、１１６位置のリジンをアスパラギン酸に変更することによって−８と−９位置の核酸塩基対の塩橋を除去して、酵素切断率を低下させ、特異性を上昇させる。
【０１２６】
野生型Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号：１）、Ｉ−ＭｓｏＩ（配列番号：６）、Ｉ−ＳｃｅＩ（配列番号：９）及びＩ−ＣｅｕＩ（配列番号：１２）メガヌクレアーゼのそれぞれの骨格接触表面を形成する残基を同定し、表５に示す。
【０１２７】
【表５】

【０１２８】
酵素の親和性を上げ、それによって活性を更に上げ、特異性を更に下げるには、
（１）酵素に対応する、負に荷電（Ｄ又はＥ）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＹ）又は荷電されていない／極性（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ又はＴ）のいずれかであるアミノ酸を表５から選択する。
（２）アミノ酸が負に荷電又は疎水性である場合、非荷電／極性（低効果）又は正に荷電（Ｋ又はＲ、高効果）に変異させる。
（３）アミノ酸が非荷電／極性の場合、正に荷電されるように変異させる。
【０１２９】
酵素の親和性を下げ、それによって活性を更に下げ、特異性を更に上げるには、
（１）酵素に対応する、正に荷電（Ｋ又はＲ）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＹ）又は荷電されていない／極性（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ又はＴ）のいずれかであるアミノ酸を表５から選択する。
（２）アミノ酸が正に荷電している場合、非荷電／極性（低効果）又は負に荷電（高効果）に変異させる。
（３）アミノ酸が疎水性又は非荷電／極性の場合、負に荷電されるように変異させる。
【０１３０】
４．へテロ二量体メガヌクレアーゼ
他の態様では、本発明は、２つの単量体、その１つが野生型で１つが天然に存在しない又は組み換え体又は両者が天然に存在しない又は組み換え体、の結合により形成されるヘテロ二量体であるメガヌクレアーゼを提供する。例えば、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、本来は、偽回文認識配列の１つの半部位にそれぞれ結合する２つの単量体からなるホモ二量体である。ヘテロ二量体組換えメガヌクレアーゼは、異なる半部位を認識する２つのメガヌクレアーゼを結合することにより、例えば、２つのメガヌクレアーゼを細胞中で共発現させるか、２つのメガヌクレアーゼを溶液中で混合することにより作成することができる。二量体への結合に影響する２つの単量体それぞれのアミノ酸を変えることによって、ヘテロ二量体の形成をホモ二量体の形成をより優先させることができる。特定の実施形態においては、２つの単量体の界面にあるアミノ酸を、第１の単量体では負に荷電しているアミノ酸（Ｄ又はＥ）を正に荷電しているアミノ酸（Ｋ又はＲ）に変え、第２の単量体では正に荷電しているアミノ酸を負に荷電しているアミノ酸（Ｋ又はＲ）に変える（表６）。例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼでは、第１の単量体の７と５７の位置のリジンをグルタミン酸に変異させ、第２の単量体の８と６１の位置のグルタミン酸をリジンに変異させる。この工程の結果、第１の単量体は二量体界面において過剰の正に荷電した残基を有し、第２の単量体は二量体界面において過剰の負に荷電した残基を有する一対の単量体が得られる。従って、第１及び第２の単量体は、界面での置換されたアミノ酸間の静電相互作用により、同一の単量体対よりも優先的に結合する。
【０１３１】
【表６】

【０１３２】
これに代えて、又は、加えて、ホモ二量体の形成を立体的に阻害するように、２つの単量体の界面のアミノ酸を変えることができる。具体的には、１つの単量体の二量体界面のアミノ酸を、ホモ二量体を立体的に阻害するより大きな又はより嵩高い残基で置換する。第２の単量体の二量体界面のアミノ酸は、第１の単量体の残基の嵩高さを埋め合わせるためにより小さな残基で置換してもよく、又は改変しなくてもよい。
【０１３３】
更に、他の代替、又は、追加の実施形態では、イオン架橋又は水素結合をヘテロ二量体界面の疎水性コアに埋めることができる。具体的には、界面のコアでの１つの単量体の疎水性残基を正に荷電している残基で置換する。更に、野生型のホモ二量体では第１の単量体の置換された該疎水性残基と相互作用している、第２の単量体の疎水性残基を負に荷電した残基で置換する。これにより、２つの置換した残基はイオン架橋又は水素結合を形成することができる。同時に、疎水性界面に埋められた未充足荷電の静電反発力によりホモ二量体の形成は嫌われることになる。
【０１３４】
最後に、上述したように、ヘテロ二量体の各単量体では、それぞれが異なるＤＮＡ半部位を有し、結合した二量体ＤＮＡ認識配列が非回文であるように、ＤＮＡ認識領域に異なるアミノ酸が置換されていてもよい。
【０１３５】
５．組換え細胞及び生物の作製方法
本発明の態様は更に、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使用して組換え、形質転換又はその他の方法で遺伝子改変された細胞及び生物を作製する方法を提供する。従って、ある実施形態において、相同的組換えにより目的の配列の正確な挿入を行うために、細胞又は生物のゲノムＤＮＡの単一部位又は比較的少ない部位に二本鎖切断を特異的に起こす組換えメガヌクレアーゼを開発する。他の実施形態では、（ａ）非相同的末端結合により目的の配列の挿入がほとんど起こらないように、又は（ｂ）非相同的末端結合により標的配列を破壊するように、細胞又は生物のゲノムＤＮＡの単一部位又は比較的少ない部位に二本鎖切断を特異的に起こす組換えメガヌクレアーゼを開発する。本明細書において、目的の配列の相同的組換えまたは非相同的末端結合に関して、「挿入」とは、染色体に目的の配列が組み込まれるように、染色体に目的の配列を核酸連結することを意味する。相同的組換えの場合には、挿入された配列が内因性の配列に取って代わり、元のＤＮＡが同じ長さを有するが、ヌクレオチド配列が違っている外因性ＤＮＡにより置換される。或いは、挿入された配列が置換する配列より多い又はより少ない塩基を有することもできる。
【０１３６】
従って、本発明のこの態様に従って、組換え生物は、限定されるわけではないが、イネ、コムギ、トウモロコシ、ライムギなどの単子葉植物種、マメ科植物（例えば、インゲンマメ、ダイズ、レンズマメ、ピーナッツ、エンドウマメ）、アルファルファ、クローバー、タバコなどの双子葉植物種及びシロイヌナズナ種を包含する。また、組換え生物は、限定されるわけではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、魚などの動物及びショウジョウバエ種などの昆虫を包含する。他の実施形態では、生物はカンジダ、パンカビ、サッカロミセス種などの真菌である。
【０１３７】
ある実施形態においては、本発明の方法は、成熟組換え生物になることができる又は得られた遺伝子改変された生物がゲノム内に目的の挿入配列を有する子孫を発生させることができる胚細胞や肝細胞などの細胞に、目的の配列を導入することを有する。
【０１３８】
メガヌクレアーゼタンパク質は細胞に供給されてゲノムＤＮＡを切断し、本技術分野で公知の様々な異なるメカニズムにより切断部位を目的の配列で相同的組換え又は非相同的末端結合する。例えば、組換えメガヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入する方法には、これらに限定されるわけではないが、マイクロインジェクション法やリポソーム形質移入法（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ, Invitrogen Corp., Carlsbad, カリフォルニア参照）などがある。リポソームの形態は、脂質二重層と標的細胞との融合を促進させるために使用することができ、これによりリポソームの内容物又はその表面に使用されるタンパク質を細胞内に持ち込まれる。また、酵素は、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質から直接の細胞性取り込みに至るまで、適当な取り込みペプチドと融合することができる（例えば、Hudeczら, (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736参照）。
【０１３９】
或いは、メガヌクレアーゼタンパク質をコードする遺伝子配列をベクターに挿入し、本技術分野において公知の方法により真核細胞をトランスフェクトする（例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999参照）。目的の配列は、同じベクター、他のベクター又は本技術分野で公知の他の方法により導入することができる。
【０１４０】
ＤＮＡトランスフェクションのためのベクターの非限定的な例として、ウィルスベクター、プラスミド、コスミド及びＹＡＣベクターを挙げることができる。ＤＮＡ配列のトランスフェクションは、当業者に公知の様々な方法により達成することができる。例えば、ＤＮＡ配列を細胞に供給するためにリポソームやイムノリポソームが使用される（例えば、Lasicら, (1995), Science 267: 1275-76参照）。また、ウィルスを使用してベクターを細胞に導入することもできる（例えば、米国特許第7,037,492号参照）。或いは、ベクターを裸のＤＮＡとして導入するようなトランスフェクション法を利用することもできる（例えば、Ruiら, (2002), Life Sci. 71(15): 1771-8参照）。
【０１４１】
核酸を細胞内に供給する一般的な方法としては、（１）化学的方法（Grahamら, (1973), Virology 54(2): 536-539、Zatloukalら, (1992), Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 136-153）、（２）物理的方法、例えば、マイクロインジェクション（Capecchi (1980), Cell 22(2):479-488）、エレクトロポレーション（Wongら, (1982), Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2): 584-587、Frommら, (1985), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82(17): 5824-5828、米国特許第5,384,253号）及び弾道注入（Johnstonら, (1994), Methods Cell. Biol. 43(A): 353-365、Fynanら, (1993), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90(24): 11478-11482）、（３）ウィルスベクター（Clapp (1993), Clin. Perinatol. 20(1): 155-168、Luら, (1993), J. Exp. Med. 178(6): 2089-2096、Eglitisら, (1988), Avd. Exp. Med. Biol. 241: 19-27、Eglitisら, (1988), Biotechniques 6(7): 608-614）及び（４）受容体介在性機構（Curielら, (1991), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88(19): 8850-8854、Curielら, (1992), Hum. Gen. Ther. 3(2): 147-154、Wagnerら, (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89 (13): 6099-6103）を挙げることができる。
【０１４２】
実施形態によっては、ゲノムに挿入された目的の配列を有する、遺伝子改変された植物を作製する。また、実施形態によっては、メガヌクレアーゼ認識配列及び／又は標的配列に実質的に同一である配列が隣接していてもいなくてもよい、組換えメガヌクレアーゼ及び目的の配列に対応するＤＮＡ配列で植物細胞をトランスフェクトして遺伝子改変された植物を作製する。他の実施形態においては、切断が非相同的末端結合を促進し、認識配列を含有する標的配列を破壊するように、組換えメガヌクレアーゼにのみ対応するＤＮＡ配列で植物細胞をトランスフェクトして遺伝子改変された植物を作製する。そのような実施形態では、メガヌクレアーゼ配列は、宿主植物細胞内にメガヌクレアーゼを発現させる調節配列に制御される。これらの調節配列には、限定されるわけではないが、ＮＯＳプロモーターなどの構成的植物プロモーター、デキサメタゾン誘導性プロモーターなどの化学的誘導性遺伝子プロモーター（例えば、Gremillonら, (2004), Plant J. 37: 218-228参照）及びＬＧＣ１プロモーターなどの植物組織特異的プロモーター（例えば、Singhら, (2003), FEBS Lett. 542: 47-52参照）が包含される。
【０１４３】
ＤＮＡを植物細胞に導入する好適な方法は、実質上、細胞にＤＮＡが導入される方法であればいずれの方法でもよく、限定されるわけではないが、アグロバクテリウム感染、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Omirullehら, (1993), Plant Molecular Biology, 21: 415-428）、乾燥／阻害‐媒介ＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、弾道注入、マイクロプロジェクタイル高速注入などが包含される。
【０１４４】
他の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼを使用して遺伝子改変された動物を作製する。植物細胞と同様、核酸配列を胚細胞又は最終的に組換え生物になる細胞に導入する。ある実施形態では、該細胞は受精卵であり、外因性ＤＮＡ分子を受精卵の前核内に注入する。微量注入された卵を、偽妊娠を誘発した借腹親の卵管内に移植し育成する。組換えメガヌクレアーゼは受精卵内で（例えば、３−ホスホグリセンリン酸キナーゼなどの構成的プロモーターの制御下に）発現され、ゲノム内の１つ又は少数の不連続部位に目的の配列の相同的組換えを促進する。或いは、遺伝子改変された動物は、Gosslerら, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069に記載されているように、組換え作成のための組換え胚性幹（「ＥＳ」）細胞を利用して作製することもできる。
【０１４５】
ある実施形態においては、組換え哺乳類発現ベクターは、核酸の組織特異的発現を特定の細胞型において優先的に起こすことができる。組織特異的な調節エレメントは当業者に知られている。好適な組織特異的プロモーターの非限定的例には、アルブミンプロモーター（肝特異的：Pinkertら, (1987), Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ球特異的プロモーター（Calame及びEaton (1988), Adv. Immunol. 43: 235-275）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto及びBaltimore (1989), EMBO J. 8: 729-733）、及びイムノグロブリン（Banerjiら, (1983), Cell 33: 729-740、Queen及びBaltimore (1983), Cell 33: 741-748）、神経特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター：Byrne and Ruddle (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473- 5477）、膵特異的プロモーター（Edlundら, (1985), Science 230: 912-916）及び 乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター：米国特許第4,873,316号及び欧州特許出願公開第264,166号）が包含される。発生的に制御されるプロモーターも包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel及びGruss (1990), Science 249: 374- 379）及びα‐フェトプロテインプロモーター（Campes及びTilghman (1989), Genes Dev. 3: 537-546）が包含される。
【０１４６】
ある実施形態においては、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、発現量及び位置をモニターするためにペプチドエピトープ（例えば、ＨＡ、ＦＬＡＧまたはＭｙｃエピトープ）でタグ付けされてもよい。ある実施形態では、メガヌクレアーゼは、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０からの核局在化シグナル）又はクロロプラストないしはミトコンドリア局在化シグナルなどの細胞内局在に融合してもよい。他の実施形態では、メガヌクレアーゼは核外輸送シグナルに融合し、細胞質に局在化させてもよい。メガヌクレアーゼはまた、ＤＮＡ修復又は相同的組換え（例えば、ｒｅｃＡ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５７又はＢＲＣＡ２）を促進するタンパク質などの無関係なタンパク質やタンパク質ドメインに融合してもよい。
【０１４７】
６．遺伝子治療方法
本発明の態様において、組換えメガヌクレアーゼを遺伝子治療に使用することができる。本明細書において、「遺伝子治療」とは、患者に少なくと１つの遺伝子の機能的コピー又はその構造及び／又は機能に欠陥のある遺伝子又は遺伝子調節領域を置換するためのプロモーター、エンハンサー又はサイレンサーなどの遺伝子調節配列を導入することを包含する治療的処理を意味する。「遺伝子治療」はまた、有害な遺伝子又は調節エレメント（例えば、癌遺伝子）を改変して該遺伝子の発現を低減又は排除することを指すこともできる。遺伝子治療は、先天性症状、患者の生涯にわたる特定の遺伝子座の変異又は損傷による症状又は感染性生物による症状を処理するために行うことができる。
【０１４８】
本発明のある態様においては、遺伝子発現に作用するゲノムの領域に外因性の核酸配列を挿入して、機能不全の遺伝子を置換するか又は不能にする。ある実施形態においては、組換えメガヌクレアーゼは、症状を軽減するように改変する遺伝子の領域の特定の配列を標的とする。該配列は、遺伝子の発現不全の原因である、エクソン、イントロン、プロモーター内の領域又は他の調節領域であることができる。本明細書において、「不全発現」は、少なすぎる遺伝子生成物もしくは多すぎる遺伝子生成物を作製する、又は必要な機能が欠損しているもしくは必要以上の機能を有しているなどの異なる機能を有する遺伝子生成物を作製する細胞による遺伝子生成物の異常な発現を意味する。
【０１４９】
改変される領域に挿入される外因性核酸配列は、遺伝子を正常化した「修復された」配列を提供するために使用することができる。遺伝子修復は、適切な機能が再確立されるように遺伝子に適切な遺伝子配列を導入することにより行うことができる。これらの実施形態において、挿入される核酸配列はタンパク質のコード配列全体でもよく、また、ある実施形態においては、修復される領域のみからなる遺伝子のフラグメントでもよい。他の実施形態では、挿入される核酸配列は、異常な発現又は制御が修復されるようにプロモーター配列又は他の調節エレメントを包含する。他の実施形態においては、挿入される核酸配列は、変異遺伝子に欠けている適切な翻訳停止コドンを含有する。核酸配列はまた、適切な転写停止シグナルを欠損している組換え遺伝子に転写を停止するための配列を有することもできる。
【０１５０】
或いは、核酸配列は、遺伝子の調節配列を破壊又は遺伝子機能を消失させるサイレンサーを与えることによって遺伝子機能を完全に消失させることもできる。ある実施形態において、外因性核酸配列は、遺伝子生成物の発現を止めるための翻訳停止コドンを提供する。他の実施形態においては、外因性核酸配列は、全長ＲＮＡ分子の発現を止めるための翻訳停止エレメントを提供する。更に他の実施形態では、非相同的末端結合による塩基の挿入、塩基の欠失及び／又はフレームシフト変異を導入することによってメガヌクレアーゼにより遺伝子機能を直接破壊する。
【０１５１】
多くの例において、適切な遺伝子配列を疾病症状の原因である標的細胞又は細胞群に向かわせることが望ましい。このような標的療法は健康な細胞を治療の標的になることから守ることができ、健康な細胞に対する治療による副作用の可能性を下げながら、治療の効果を上げることができる。
【０１５２】
ゲノムに挿入される組換えメガヌクレアーゼ遺伝子と目的の配列は、様々なメカニズムにより目的細胞に供給される。ある実施形態では、ウィルスの繁殖が抑えられるように特定のウィルス遺伝子が不活性化されたウィルスを使って核酸を細胞に供給する。このように、ウィルスを標的細胞内への供給、保持のみが可能で、標的細胞又は組織内で複製できないように改変することができる。１つ又は複数のＤＮＡ配列をウィルスゲノムがベクターのように作用するようにウィルスゲノムに導入することができる。該ＤＮＡ配列は宿主ゲノムに挿入された後発現されてもされなくてもよい。より具体的には、ある実施形態では、限定されるわけではないが、ＭＧＦ又はｐＬＪベクターなどのレトロウィルスベクターを採用する。ＭＧＦベクターは単純化モロニーマウス白血病ウィルスベクター（Moloney murine leukemia virus vector：ＭｏＭＬＶ）であり、その複製能を欠損させるためにｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質をコードするＤＮＡ配列が削除されている。ｐＬＪレトロウィルスベクターもまたＭｏＭＬＶ形状である（例えば、Kormanら, (1987), Proc. Nat'l Acad. ScL, 84: 2150-2154参照）。他の実施形態では、組換えアデノウィルス又はアデノ関連ウィルスを送達ベクターとして使用することができる。
【０１５３】
他の実施形態において、組換えメガヌクレアーゼタンパク質及び／又は組換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列はリポソームを使って標的細胞に送達される。核酸及び／又はタンパク質カーゴを含有するリポソームの作製は本技術分野で公知である（例えば、Lasicら, (1995), Science 267: 1275-76参照）。イムノリポソームは細胞関連抗原に対する抗体をリポソーム内に取り込み、メガヌクレアーゼに対するＤＮＡ配列又はメガヌクレアーゼそれ自体を特定の細胞型に送達できる（例えば、Lasicら, (1995), Science 267: 1275-76、Youngら, (2005), J. Calif. Dent. Assoc. 33(12): 967-71、Pfeifferら, (2006), J. Vase. Surg. 43(5): 1021-7参照）。リポソーム形態の作製及び使用方法は、本技術分野で周知である（例えば、米国特許第6,316,024号、6,379,699号、6,387,397号、6,511,676号及び6,593,308号参照、及び本明細書に引用される）。ある実施形態では、リポソームを、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列と同様、目的の配列を送達するためにも使用する。
【０１５４】
７．病原体感染の処置方法
本発明の態様はまた、病原体による感染を処置する方法を提供する。病原体生物には、ウィルス、限定されるわけではないが、例えば、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、ヒト免疫不全ウィルス１、ヒト免疫不全ウィルス２、痘瘡ウイルス、ポリオウィルス、エプスタイン‐バーウィルス、ヒトパピローマウィルス及び微生物、限定されるわけではないが、例えば、バチルス・アントラシス、ヘモフィルス種、肺炎球菌種、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス種、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、マイコプラズマ・肺炎菌が包含される。病原体生物にはまた、真菌生物、限定されるわけではないが、例えば、カンジダ、クリプトコッカス及びヒストプラズマ種が包含される。
【０１５５】
ある実施形態においては、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、病原体ゲノム内の認識配列、例えば、発育、複製、病原体の毒性に不可欠な遺伝子又は調節エレメントを標的とする。ある実施形態においては、認識配列は細菌性プラスミドにあってもよい。病原体ゲノム内の認識配列をメガヌクレアーゼが関与して切断して非相同的末端結合を促進することにより、標的とされた不可欠な遺伝子の挿入、欠失又はフレームシフトの形での変異を促進する。或いは、細菌プラスミドを切断し、毒素遺伝子（例えば、炭疽菌致死因子遺伝子）や抗生物質耐性遺伝子など、プラスミドにコードされている遺伝子をプラスミドと一緒に消失させることもできる。上述したように、メガヌクレアーゼは、本技術分野の常法により、タンパク質又は核酸の形状で感染した患者、動物又は植物に送達されてもよい。ある実施形態においては、メガヌクレアーゼ遺伝子をバクテリオファージゲノムに取り入れて、病原性細菌に送達してもよい。
【０１５６】
本発明の態様はまた、ある種の癌の処置のための治療法を提供する。ヒトウィルスは腫瘍形成を伴うことが多いので（例えば、エプスタイン-バーウィルスと上咽頭癌、ヒトパピローマウィルスと子宮頸癌）、これらウィルス性病原体の不活化により癌の成長又は進行を防ぐことができる可能性がある。或いは、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使ってこれら癌関連ウィルスのゲノムを標的とした二本鎖切断を、ＤＮＡ損傷応答経路を介してアポトーシスを誘発するために使用してもよい。この場合、ウィルスゲノムを提供する腫瘍細胞にアポトーシスを選択的に誘導できる可能性がある。
【０１５７】
８．遺伝子型解析と病原体同定の方法
本発明の態様はまた、インビトロ分子生物学研究開発のための手段を提供する。真核及び原核生物からのプラスミド、ＰＣＲ生成物、ＢＡＣ配列、ＹＡＣ配列、ウィルス、ゲノム配列などの核酸を単離、クローニング、操作するために部位特異性エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用することは、本技術分野において一般的である（例えば、Ausubel ら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999参照）。従って、ある実施形態において、合理的に設計されたメガヌクレアーゼをインビトロで核酸配列を操作するために使用してもよい。例えば、同じＤＮＡ分子内の一対の認識配列を認識する合理的に設計されたメガヌクレアーゼを、細菌プラスミドであるＢＡＣ又はＹＡＣへのライゲーションなどの後の操作のために、介在ＤＮＡセグメントを単離するために使用することができる。
【０１５８】
他の態様では、本発明は、病原体遺伝子及び生物を同定する手段を提供する。一つの実施形態において、健常な対立遺伝子から疾患を引き起こす対立遺伝子を識別するために、疾患と相関する多型遺伝子領域に対応する部位を、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使用して切断することができる（例えば、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ−５０８対立遺伝子を認識する合理的に設計されたメガヌクレアーゼ、実施例４参照）。この実施形態において、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを、場合によっては、他の部位特異的ヌクレアーゼとともに使用して、ヒト又は他の生物から単離されたＤＮＡ配列を消化し、得られたＤＮＡフラグメントパターンを電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析またはその他の本技術分野で公知の方法により分析する。このフラグメントパターン、具体的には、合理的に設計されたメガヌクレアーゼによる切断の有無により、ゲノム内に認識配列が存在するか否かを明らかにして、生物の遺伝子型が示される。他の実施形態において、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、病原性ウィルス、真菌又は細菌のゲノム内の多型領域を標的として、生物を同定するために使用される。この実施形態では、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは病原体に特有の認識配列を切断し（例えば、細菌の１６Ｓと２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、例えば、van der Giessenら, (1994), Microbiology 140: 1103-1108参照）、ゲノムのエンドヌクレアーゼ消化及びその後の電気泳動、質量分析またはその他の本技術分野で公知の方法によるフラグメントパターンの分析により、病原体を他の密接に関係する生物から識別することができる。
【０１５９】
９．カスタムＤＮＡ結合ドメインの作製方法
他の態様において、本発明は、エンドヌクレアーゼ切断活性が欠如している、合理的に設計されたＤＮＡ結合タンパク質を提供する。合理的に設計されたメガヌクレアーゼの触媒活性は、触媒作用に関与するアミノ酸を変異することによって除去できる。（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩにおけるＱ４７のＥへの変異、Chevalierら, (2001), Biochemistry. 43: 14015-14026参照、Ｉ−ＳｃｅＩにおけるＤ４４又はＤ１４５のＮへの変異、Ｉ−ＣｅｕＩにおけるＥ６６のＱへの変異、Ｉ−ＭｓｏＩにおけるＤ２２のＮへの変異）。不活化されたメガヌクレアーゼは他のタンパク質のエフェクタードメインに融合されることができる。該他のタンパク質としては、制限されるものではないが、転写アクチベーター（例えば、ＧＡＬ４トランスアクチベーションドメイン又はＶＰ１６トランスアクチベーションドメイン）、転写抑制因子（例えば、クルッペルタンパク質のＫＲＡＢドメイン）、ＤＮＡメチラーゼドメイン（例えば、Ｍ．ＣｖｉＰＩ又はＭ．ＳｓｓＩ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン（例えば、ＨＤＡＣ１又はＨＤＡＣ２）を挙げることができる。操作されたＤＮＡ結合ドメイン、中でも操作されたジンクフィンガードメイン、からなるキメラタンパク質、及びエフェクタードメインが本技術分野において知られている（例えば、Papworthら, (2006), Gene 366: 27-38参照）。
【０１６０】
実施例
本発明を以下の実施例により更に説明するが、それによって限定されるものではない。当業者であれば、単に通常の実験により、本明細書に記載された特定の物質及び手段についての多数の均等物を認識、確認することができる。そのような均等物は以下の実施例に続く特許請求の範囲の包含されるものである。実施例１〜４は具体的にはＩ−ＣｒｅＩに基づいて合理的に設計されたメガヌクレアーゼに言及しているが、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ及び他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに基づいて合理的に設計されたメガヌクレアーゼも、本明細書で説明されるように、同様に作製、使用することができる。
【実施例１】
【０１６１】
ＨＩＶ−１のＴＡＴ遺伝子を認識するメガヌクレアーゼの合理的設計
１．メガヌクレアーゼの設計
ＨＩＶ−ＩのＴＡＴ遺伝子に見出されたＤＮＡ部位５’−ＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＣＡ−３’（配列番号：１５）を認識し、切断する一対のメガヌクレアーゼを設計した。表１に従って、２つのメガヌクレアーゼ、ＴＡＴ１及びＴＡＴ２、をそれぞれ半部位５’−ＧＡＡＧＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：１６）及び５’−ＴＧＡＣＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：１７）に結合するように、以下の塩基接触（非野生型接触は太線で記載）を使用して設計した。

【０１６２】
該２つの酵素をクローニングして、大腸菌中で発現させ、後述するように対応するＤＮＡ認識部位に対する酵素活性を測定した。両者において、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは不活性であった。ＤＮＡ骨格との接触を改良するためにＥ８０をＱに変異した第２代の酵素をそれぞれ作製した。第２代ＴＡＴ１酵素は不活性のままであったが、第２代ＴＡＴ２酵素は目的の認識配列に対して活性を示した。野生型Ｉ−ＣｒｅＩ共結晶構造の目視検査により、Ｒ４０とＫ２８との間の立体的衝突によりＴＡＴ１が不活性であることが示唆された。この衝突を軽減するために、Ｑ８０変異を保持したまま、Ｋ２８を小さな側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｓ、Ｔ又はＣ）に変異させたＴＡＴ１変異体を作製した。これらの酵素を大腸菌内で作製し測定したところ、−７位置の所望の参照塩基を保持したまま、Ｓ２８及びＴ２８を有するＴＡＴ１変異体はどちらも目的の認識配列に対して活性を示した。
【０１６３】
２．組換えメガヌクレアーゼの構築
重複ＰＣＲ手順において、変異プライマーを使用して再設計されたＩ−ＣｒｅＩ酵素のための変異を導入した。１次ＰＣＲにおいて作成されたＩ−ＣｒｅＩの組換えＤＮＡフラグメントを２次ＰＣＲに加え、全長組換え核酸を作製した。全ての組換えＩ−ＣｒｅＩ構築物を、精製のために遺伝子の３’末端に６ヒスチジンタグを融合させたｐＥＴ２１ａベクターにクローン化した（Novagen社、San Diego, カリフォルニア）。全ての核酸配列をサンガージデオキシヌクレオチドシークエンシングを使用して確認した（Sangerら, (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(12): 5463-7参照）。
【０１６４】
野生型Ｉ−ＣｒｅＩ及び全ての遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させ、以下の方法により精製した。ｐＥＴ２１ａベクターにクローン化された構築物を化学的にコンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、２００μｇ／ｍｌのカルバニシリンを含有する標準２ｘＹＴプレートに蒔いた。一晩培養した後、形質転換した細菌コロニーをプレートから剥がし、５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加した。細胞を波長６００ｎｍで光学密度が０．９に達するまで振盪しながら３７℃で培養した後、培養温度を３７℃から２２℃に下げた。１ｍＭのＩＰＴＧを加えてタンパク質発現を誘導し、細胞を撹拌しながら２．５時間インキュベートした。細胞を６０００ｇで１０分間遠心分離してペレットとし、ペレットを１ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール）にボルテックスして再懸濁させた。細胞を５０％パワーで１２パルス超音波処理により破砕し、細胞の破片を１４０００ｇで１５分間遠心分離してペレットとした。細胞上清を４ｍｌの結合緩衝液で希釈し、２００μｌのニッケル処理金属キレーティングセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に装填した。
【０１６５】
続いて、カラムを４ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム、６０ｍＭイミダゾール）、次いで０．２ｍｌの溶出緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム、４００ｍＭイミダゾール）で洗浄した。更に０．６ｍｌの溶出緩衝液でメガヌクレアーゼ酵素を溶出し、溶出液をビボスピン（Ｖｉｖｏｓｐｉｎ）使い捨て濃縮器（ＩＳＣ社、Kaysville, ユタ）を使用して５０〜１３０μｌに濃縮した。酵素をＳＡ緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＥＤＴＡ）に交換し、測定及びゼバスピン（Ｚｅｂａｓｐｉｎ）脱塩カラム（Pierce Biotechnology社, Rockford, イリノイ)での保存用とした。酵素濃度は吸光係数２３５９０Ｍ^−１ｃｍ^−１を使用して２８０ｎｍでの吸光度により決定し、酵素の純度及び分子量をＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析により確認した。
【０１６６】
ヘテロ二量体酵素は、２つのタンパク質を別々に精製しそれらをインビトロで混合するか、又は大腸菌に２つのタンパク質を縦列発現させるための人工オペロンを構築することによって作製した。前者の場合、精製したメガヌクレアーゼを溶液中で１：１の割合で混合し、ＤＮＡ基質の添加前に４２℃で２０分間プレインキュベートした。後者では、２つの遺伝子をＮｄｅＩ/ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ/ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＥＴ-２１ａ発現ベクターに連続してクローン化した。オペロンの第１の遺伝子は、転写での読み過しエラーを防ぐために２つの停止コドンで終了する。１２塩基対核酸スペーサー及びｐＥＴ-２１ベクターのシャイン・ダルガノ配列が人工オペロン内の第１及び第２遺伝子を分離した。
【０１６７】
３．切断アッセイ
上記のように精製した酵素全ての活性を、メガヌクレアーゼ認識配列を有する線状二本鎖ＤＮＡ基質とインキュベートすることにより測定した。認識配列のセンス及びアンチセンス両鎖に対応する人工オリゴヌクレオチドをアニールし、平滑末端ライゲーションによりｐＵＣ１９プラスミドのＳｍａｌ部位にクローン化した。クローン化された結合部位の配列をサンガージデオキシヌクレオチドシークエンシングにより確認した。全てのプラスミド基質をＸｍｎＩ、ＳｃａＩ又はＢｐｍＩでメガヌクレアーゼ消化により同時に直線化した。酵素消化物は０．０５μＭのＤＮＡ基質を５μｌ、５μＭの組換えＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを２．５μｌ、ＳＡ緩衝液を９．５μｌ及びＸｍｎＩ、ＳｃａＩ又はＢｐｍＩのいずれかを０．５μｌ含有していた。消化物を特定のメガヌクレアーゼ酵素と３７℃又は４０℃で４時間インキュベートした。０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び０．５％ＳＤＳを添加して消化を停止し、３７℃で１時間インキュベートした。消化産物を１．５％アガロース上で臭化エチジウム染色により可視化して分析した。
【０１６８】
メガヌクレアーゼ半部位の優先性を評価するために、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを半部位の２７の可能な各単一塩基対置換及び目的の半部位の完全な回文配列に対応するＤＮＡ基質のセットとインキュベートした。このようにして、目的の半部位からの逸脱に対する各酵素の耐性を決定することができた。
【０１６９】
４．認識配列‐特異性
精製した組換えＴＡＴ１及びＴＡＴ２メガヌクレアーゼは野生型メガヌクレアーゼの認識配列（図２（Ｂ））とは別のＤＮＡ配列を認識した。野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼはＷＴ認識配列を切断したが、ＴＡＴ１の目的配列もＴＡＴ２の目的配列も切断しない。同様に、ＴＡＴ１及びＴＡＴ２もそれぞれの目的認識配列を切断したが、野生型配列は切断しない。次いで、メガヌクレアーゼを半部位の優先性と全体的な特異性について評価した（図３）。野生型Ｉ−ＣｒｅＩは天然の半部位の単一塩基対置換に対して高い耐性を有することが分った。逆に、ＴＡＴ１及びＴＡＴ２の場合、ＴＡＴ１では−１、−２、−３、−６及び−８の位置の、ＴＡＴ２では−１、−２及び−６の位置の塩基置換に対して高特異性を有し全く耐性がないことが分った。
【実施例２】
【０１７０】
ＤＮＡ結合親和性が改変されたメガヌクレアーゼの合理的設計
１．親和性及び活性が高められたメガヌクレアーゼ
半部位５’−ＡＡＣＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号：１８）及び５’−ＣＴＣＣＧＧＧＴＣ−３’（配列番号：１９）をそれぞれ切断するメガヌクレアーゼＣＣＲ１及びＢＲＰ２を設計した。これらの酵素は実施例１と同様に表１に従って作製した。

【０１７１】
両酵素を実施例１と同様に大腸菌で発現させ、精製、測定に供した。第１代の酵素は共に、目的に認識配列を切断する速度が天然の認識配列を有する野生型Ｉ−ＣｒｅＩの速度に比べてかなり遅いことが分った。この活性の消失を軽減するために、両酵素のＥ８０をＱに変異させてＣＣＲ１及びＢＲＰ２のＤＮＡ結合親和性を上昇させた。これらの第２代ＣＣＲ１及びＢＲＰ２では目的の認識配列を切断する触媒反応速度が著しく増加していることが分った。
【０１７２】
２．ＤＮＡ結合親和性及び活性が低下しているが特異性が向上しているメガヌクレアーゼ
野生型Ｉ−ＣｒｅＩはその半部位への置換に対して高い耐性を有することが分った（図３（Ａ））。より特異性の高い酵素を作製するために、通常ＤＮＡ骨格のリン酸と塩橋を形成している酵素の１１６位置のリジンをアスパラギン酸に変異させ、ＤＮＡ結合親和性を低下させた。この合理的に設計された組換え酵素は、野生型の認識配列に対する切断活性が大幅に低下しているが、その特異性は野生型よりも非常に高いことが分った。Ｋ１１６Ｄ変異体の半部位の優先性を実施例１と同様に評価したところ、該酵素は、−１、−２及び−３の位置での天然の半部位からの逸脱に対して完全に耐性であり、半部位の残りの６つの位置では少なくとも部分的塩基優先性を示すことが分った。
【実施例３】
【０１７３】
合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
１．溶液中に形成されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体による非回文ＤＮＡ部位の切断
半部位５’−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：２０）及び５’−ＣＡＧＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号：２１）をそれぞれ切断する２つのメガヌクレアーゼ、ＬＡＭ１及びＬＡＭ２、を設計した。これら２つの酵素のヘテロ二量体はバクテリオファージλｐ０５遺伝子に見出されるＤＮＡ配列５’−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２２）を認識することが期待された。

【０１７４】
ＬＡＭ１及びＬＡＭ２を実施例１で説明したようにそれぞれ大腸菌で発現させ、精製した。２つの酵素を１：１の割合で混合し、４２℃で２０分間インキュベートしてサブユニットの交換及び再平衡化を行った。ＬＡＭ１のホモ二量体、ＬＡＭ２のホモ二量体及びＬＡＭ１／ＬＡＭ２のヘテロ二量体の混合物であることが期待される、得られた酵素溶液をバクテリオファージλゲノムに見出されるＬＡＭ１半部位の完全な回文配列、ＬＡＭ２半部位の完全な回文配列及び非回文ハイブリッド部位のそれぞれに対応する３つの異なる認識配列とインキュベートした。精製ＬＡＭ１酵素単独では、ＬＡＭ１回文部位を切断するが、ＬＡＭ２回文部位及びＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位は切断しない。同様に、精製ＬＡＭ２酵素単独では、ＬＡＭ２回文部位を切断するが、ＬＡＭ１回文部位及びＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位は切断しない。しかし、ＬＡＭ１とＬＡＭ２の１：１の混合物は３つのＤＮＡ部位全てを切断する。ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位の切断は、異なる２つの再設計されたメガヌクレアーゼを溶液中で混合することにより非回文ＤＮＡ部位を切断できるヘテロ二量体を形成することができることを意味する。
【０１７５】
２．共発現により形成されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体による非回文ＤＮＡ部位の切断
上述のＬＡＭ１及びＬＡＭ２酵素をコードする遺伝子を、実施例１で説明したように大腸菌で同時に発現するようにオペロンに配置した。共発現された酵素を実施例１と同様に精製し、酵素混合物を上述した認識配列として可能性のある３つの配列とインキュベートした。共発現した酵素混合物はＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位を含む、３つ全ての部位を切断することが分った。これは、異なる２つの合理的に設計されたメガヌクレアーゼが非回文ＤＮＡ部位を切断できるヘテロ二量体を形成する共発現が可能であることを意味する。
【０１７６】
３．改変されたタンパク質‐タンパク質界面を有するメガヌクレアーゼヘテロ二量体による非回文ＤＮＡ部位の優先的切断
非回文ＤＮＡ部位の切断に適用するためには、異なる（回文配列）ＤＮＡ部位を認識し、切断するホモ二量体の形成を最小限に抑えながら、酵素へテロ二量体の形成を促進することが望ましい。この目的を達成するために、７、５７及び９６位置のリジンをグルタミン酸に変えたＬＡＭ１酵素変異体を作製した。この酵素を、８及び６１位置のグルタミン酸をリジンに変えたＬＡＭ２変異体と上記のように共発現させ、精製した。この場合、ＬＡＭ１ホモ二量体の形成が、一方の単量体のＥ７、Ｅ５７及びＥ９６と他方の単量体のＥ８及びＥ６１との間の静電気反発力により低下することが期待された。同様に、ＬＡＭ２ホモ二量体の形成が、一方の単量体のＫ７、Ｋ５７及びＫ９６と他方の単量体のＫ８及びＫ６１との間の静電気反発力により低下することが期待された。逆に、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２へテロ二量体はＬＡＭ１のＥ７、Ｅ５７及びＥ９６とＬＡＭ２のＫ８及びＫ６１との間の静電気引力により有利に形成されると期待された。改変された界面を有する２つのメガヌクレアーゼを上述のように共発現させ検定したところ、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位が２つの回文部位に優先して切断されることが分った。これは、メガヌクレアーゼタンパク質‐タンパク質界面での置換がヘテロ二量体の優先的な形成を誘導することを示す。
【実施例４】
【０１７７】
生理的ＤＮＡ配列を切断するその他のメガヌクレアーゼヘテロ二量体
１．遺伝子治療に関与するＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼヘテロ二量体
軟骨形成不全症の原因である変異体であるヒトＦＧＦＲ３遺伝子の配列５’−ＣＴＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＡＣＨ１／ＡＣＨ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１７８】
ヒト成長ホルモン遺伝子のプロモーターの配列５’−ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣ−３’（配列番号：２４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＨＧＨ１／ＨＧＨ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１７９】
ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ５０８対立遺伝子の配列５’−ＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：２５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＣＦ１／ＣＦ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８０】
ヒトＣＣＲ５遺伝子（ＨＩＶ共受容体）の配列５’−ＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴ−３’（配列番号：２６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＣＣＲ１／ＣＣＲ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８１】
ヒトＤＭキナーゼ遺伝子の３’非翻訳領域の配列５’−ＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＧＡＣＴＣＧＣＴＧ−３’（配列番号：２７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＭＹＤ１／ＭＹＤ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８２】
２．病原体ゲノムのＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼヘテロ二量体
単純ヘルペスウィルス１及び単純ヘルペスウィルス２のＵＬ３６遺伝子の配列５’−ＣＴＣＧＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＡ−３’（配列番号：２８）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＨＳＶ１／ＨＳＶ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８３】
炭疽菌遺伝子の配列５’−ＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＴＡ−３’（配列番号：２９）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＡＮＴ１／ＡＮＴ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８４】
痘瘡（天然痘）ウィルスｇｐ００９遺伝子の配列５’−ＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＡ−３’（配列番号：３０）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＰＯＸ１／ＰＯＸ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８５】
エプスタイン-バーウィルスＢＡＬＦ２遺伝子の偽回文配列５’−ＣＧＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号：３１）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼホモ二量体(ＥＢＢ１／ＥＢＢ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８６】
３．植物ゲノムのＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼヘテロ二量体
シロイヌナズナＧＬ２遺伝子の配列５’−ＣＡＣＴＡＡＣＴＣＧＴＡＴＧＡＧＴＣＧＧＴＧ−３’（配列番号：３２）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＧＬＡ１／ＧＬＡ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８７】
シロイヌナズナＢＰ１遺伝子の配列５’−ＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号：３３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＢＲＰ１／ＢＲＰ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８８】
タバコマグネシウムケラターゼ遺伝子の配列５’−ＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＡ−３’（配列番号：３４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＭＧＣ１／ＭＧＣ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１８９】
タバコＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子の配列５’−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＴＡＡ−３’（配列番号：３５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＣＹＰ／ＨＧＨ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９０】
４．酵母遺伝子のＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼヘテロ二量体
出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子の配列５’−ＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＡＴ−３’（配列番号：３６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体(ＵＲＡ１／ＵＲＡ２)を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９１】
５．認識配列の特異性
上記の実施例で概要を示した合理的に設計されたメガヌクレアーゼを、実施例１のようにクローン化し、大腸菌で発現し、精製した。次いで、精製したメガヌクレアーゼの各々を対応するヘテロ二量化パートナーと１：１の割合で混合し（例えば、ＡＣＨ１とＡＣＨ２、ＨＧＨ１とＨＧＨ２など）、それぞれのメガヌクレアーゼヘテロ二量体に対する目的の非回文ＤＮＡ認識配列を含有する線状化したＤＮＡ基質とインキュベートした。図３に示したように、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体はそれぞれ、その目的ＤＮＡ部位を切断する。
【実施例５】
【０１９２】
ヒトゲノムのＤＮａｓｅ高感受性領域に見出されるＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼ
１．部位選択
合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼに感受性を有することが事前に分っているヒトゲノムの領域を標的とすることができる。ゲノムＤＮＡのヌクレアーゼに対する感受性の測定方法は、本技術分野において公知である。例えば、Crawfordら（Crawfordら, (2006), Genome Res. 1: 123-131）はヒトゲノムのＤＮａｓｅＩ高感受性領域の全ゲノム分析を提供している。これらの領域はメガヌクレアーゼによる切断を特に受けやすいことが期待されるので、ヒトゲノムを操作する位置として好ましい。具体的には、内因性遺伝子を欠いているゲノムのＤＮａｓｅＩ高感受性領域は、導入遺伝子の挿入により内因性遺伝子の発現又は機能を破壊することはないと思われるので、遺伝子治療に適用される導入遺伝子をヒトゲノムに挿入する位置として望ましい。
【０１９３】
Crawfordらに記載されているような既に知られているゲノムのヌクレアーゼ感受性領域を検索して、合理的に設計されたメガヌクレアーゼによる切断を受けやすいＤＮＡ配列を同定することができる。例えば、ＤＮＡ配列候補を表１〜４と比較して、同定されている変異がその部位を特異的に認識するメガヌクレアーゼの作製を可能とするかどうかを決定する。Ｉ−ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼの場合、認識半部位を分離する中央の４塩基対は、好ましくは、Ｙはピリミジン（Ｃ又はＴ）、Ｒはプリン（Ａ又はＧ）、Ｎは４つの塩基のいずれかであるセンス鎖のＧＹＲＮ群から選択される。
【０１９４】
２．ヒトゲノムのＤＮａｓｅＩ感受性領域を切断するメガヌクレアーゼホモ二量体
ヒト染色体４に見出される偽回文配列５’−ＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号：３７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼホモ二量体（Ｘ４．３）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９５】
ヒト染色体２１に見出される偽回文配列５’−ＣＡＣＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧ−３’（配列番号：３８）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼホモ二量体（Ｘ２１．１）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９６】
３．ヒトゲノムのＤＮａｓｅＩ感受性領域を切断するメガヌクレアーゼヘテロ二量体
ヒト染色体１に見出される非回文配列５’−ＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡ−３’（配列番号：３９）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１．１Ａ／Ｘ１．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９７】
ヒト染色体１に見出される非回文配列５’−ＡＧＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＣＧＡＣＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号：４０）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１．２Ａ／Ｘ１．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９８】
ヒト染色体１に見出される非回文配列５’−ＴＴＡＧＡＴＧＴＣＧＣＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号：４１）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１．３Ａ／Ｘ１．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０１９９】
ヒト染色体１に見出される非回文配列５’−ＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴＣＧＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号：４２）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１．４Ａ／Ｘ１．４Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２００】
ヒト染色体２に見出される非回文配列５’−ＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＧＴＴ−３’（配列番号：４３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２．１Ａ／Ｘ２．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０１】
ヒト染色体３に見出される非回文配列５’−ＣＧＧＡＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＴＣＧ−３’（配列番号：４４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ３．１Ａ／Ｘ３．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０２】
ヒト染色体４に見出される非回文配列５’−ＴＡＡＧＧＧＣＴＣＴＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＡＡ−３’（配列番号：４５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ４．１Ａ／Ｘ４．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０３】
ヒト染色体４に見出される非回文配列５’−ＧＧＡＧＣＧＣＴＣＧＴＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＧ−３’（配列番号：４６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ４．２Ａ／Ｘ４．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

注記：Ｘ４．２Ａ＃１とＸ４．２Ｂ＃１との組み合わせは、Ｘ４．２Ａ＃２とＸ４．２Ｂ＃２との組み合わせに比べて、より特異性の高い酵素となるが、後者の組み合わせはより活性が高い酵素となる。
【０２０４】
ヒト染色体５に見出される非回文配列５’−ＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧ−３’（配列番号：４７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ５．１Ａ／Ｘ５．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０５】
ヒト染色体７に見出される非回文配列５’−ＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：４８）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ７．１Ａ／Ｘ７．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０６】
ヒト染色体７に見出される非回文配列５’−ＧＧＧＡＡＴＣＴＣＧＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号：４９）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ７．２Ａ／Ｘ７．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０７】
ヒト染色体９に見出される非回文配列５’−ＴＧＣＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＣＣＣＣＧ−３’（配列番号：５０）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ９．１Ａ／Ｘ９．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０８】
ヒト染色体９に見出される非回文配列５’−ＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＡ−３’（配列番号：５１）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ９．２Ａ／Ｘ９．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２０９】
ヒト染色体９に見出される非回文配列５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号：５２）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ９．３Ａ／Ｘ９．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１０】
ヒト染色体１０に見出される非回文配列５’−ＣＧＧＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＴＴ−３’（配列番号：５３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１０．１Ａ／Ｘ１０．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１１】
ヒト染色体１２に見出される非回文配列５’−ＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号：５４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１２．１Ａ／Ｘ１２．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１２】
ヒト染色体１２に見出される非回文配列５’−ＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＴＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧ−３’（配列番号：５５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１２．２Ａ／Ｘ１２．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１３】
ヒト染色体１２に見出される非回文配列５’−ＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＴＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧ−３’（配列番号：５６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１２．３Ａ／Ｘ１２．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１４】
ヒト染色体１２に見出される非回文配列５’−ＡＧＣＧＧＣＣＴＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＴＴＡＣ−３’（配列番号：５７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１２．４Ａ／Ｘ１２．４Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１５】
ヒト染色体１３に見出される非回文配列５’−ＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：５８）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１３．１Ａ／Ｘ１３．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１６】
ヒト染色体１３に見出される非回文配列５’−ＴＧＡＧＣＧＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＴＴＧＴＡＧ−３’（配列番号：５９）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１３．２Ａ／Ｘ１３．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１７】
ヒト染色体１４に見出される非回文配列５’−ＡＡＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号：６０）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１４．１Ａ／Ｘ１４．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１８】
ヒト染色体１５に見出される非回文配列５’−ＧＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号：６１）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１５．１Ａ／Ｘ１５．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２１９】
ヒト染色体１６に見出される非回文配列５’−ＣＧＣＧＣＧＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＴＣＣＡ−３’（配列番号：６２）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１６．１Ａ／Ｘ１６．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２０】
ヒト染色体１６に見出される非回文配列５’−ＡＧＣＧＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧ−３’（配列番号：６３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１６．２Ａ／Ｘ１６．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２１】
ヒト染色体１６に見出される非回文配列５’−ＣＧＧＧＣＴＧＴＣＧＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号：６４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１６．３Ａ／Ｘ１６．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２２】
ヒト染色体１７に見出される非回文配列５’−ＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧ−３’（配列番号：６５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１７．１Ａ／Ｘ１７．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２３】
ヒト染色体１７に見出される非回文配列５’−ＡＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＧＣＣＣ−３’（配列番号：６６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１７．２Ａ／Ｘ１７．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２４】
ヒト染色体１７に見出される非回文配列５’−ＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣ−３’（配列番号：６７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１７．３Ａ／Ｘ１７．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２５】
ヒト染色体１７に見出される非回文配列５’−ＧＧＧＣＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号：６８）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１７．４Ａ／Ｘ１７．４Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２６】
ヒト染色体１７に見出される非回文配列５’−ＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号：６９）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１７．５Ａ／Ｘ１７．５Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２７】
ヒト染色体１８に見出される非回文配列５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＧＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号：７０）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１８．１Ａ／Ｘ１８．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２８】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号：７１）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．１Ａ／Ｘ１９．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２２９】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＣＧＡＧＧＡＣＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＧ−３’（配列番号：７２）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．２Ａ／Ｘ１９．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３０】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＣＧＣＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：７３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．３Ａ／Ｘ１９．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
Ｘ１９．３Ａ：

【０２３１】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＣＡＡＡＡＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＧ−３’（配列番号：７４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．４Ａ／Ｘ１９．４Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３２】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＡＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧ−３’（配列番号：７５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．５Ａ／Ｘ１９．５Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３３】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＴＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＧＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：７６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．６Ａ／Ｘ１９．６Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３４】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧ−３’（配列番号：７７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．７Ａ／Ｘ１９．７Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３５】
ヒト染色体１９に見出される非回文配列５’−ＧＡＣＧＧＴＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＴＣＴＴ−３’（配列番号：７８）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ１９．８Ａ／Ｘ１９．８Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３６】
ヒト染色体２０に見出される非回文配列５’−ＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＴＡ−３’（配列番号：７９）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２０．１Ａ／Ｘ２０．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。

【０２３７】
ヒト染色体２０に見出される非回文配列５’−ＡＡＣＣＡＴＧＴＣＧＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＴ−３’（配列番号：８０）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２０．２Ａ／Ｘ２０．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２３８】

【０２３９】
ヒト染色体２０に見出される非回文配列５’−ＧＧＣＡＣＴＧＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＧＣＧＣＧ−３’（配列番号：８１）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２０．３Ａ／Ｘ２０．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２４０】

【０２４１】
ヒト染色体２０に見出される非回文配列５’−ＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＡＣＣＣＧＴＡＣ−３’（配列番号：８２）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２０．４Ａ／Ｘ２０．４Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２４２】

【０２４３】
ヒト染色体２２に見出される非回文配列５’−ＣＡＣＣＣＣＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号：８３）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２２．１Ａ／Ｘ２２．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２４４】

【０２４５】
ヒト染色体２２に見出される非回文配列５’−ＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号：８４）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２２．２Ａ／Ｘ２２．２Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２４６】

【０２４７】
ヒト染色体２２に見出される非回文配列５’−ＧＡＣＣＡＡＣＴＣＴＣＧＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：８５）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２２．３Ａ／Ｘ２２．３Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２４８】

【０２４９】
ヒト染色体２２に見出される非回文配列５’−ＣＴＣＧＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣ−３’（配列番号：８６）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（Ｘ２２．４Ａ／Ｘ２２．４Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２５０】

【０２５１】
ヒトＸ染色体に見出される非回文配列５’−ＣＧＡＡＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＴＡＴ−３’（配列番号：８７）を切断する、合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＸＸ．１Ａ／ＸＸ．１Ｂ）を作製できる。例えば、下記の接触残基及び認識配列半部位を有するＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいて、上述のように、メガヌクレアーゼを設計した。
【０２５２】

【０２５３】
配列番号：１（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＰＯ５７２５）
1 MNTKYNKEFL LYLAGFVDGD GSIIAQIKPN QSYKFKHQLS LAFQVTQKTQ RRWFLDKLVD
61 EIGVGYVRDR GSVSDYILSE IKPLHNFLTQ LQPFLKLKQK QANLVLKIIW RLPSAKESPD
121 KFLEVCTWVD QIAALNDSKT RKTTSETVRA VLDSLSEKKK SSP
配列番号：２（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
1 GAAACTGTCT CACGACGTTT TG
配列番号：３（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
1 GAAAACGTCG TGAGACAGTT TC
配列番号：４（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
1 CAAACTGTCG TGAGACAGTT TG
配列番号：５（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
1 CAAACTGTCT CACGACAGTT TG
配列番号：６（野生型Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３４３８７）
1 MTTKNTLQPT EAAYIAGFLD GDGSIYAKLI PRPDYKDIKY QVSLAISFIQ RKDKFPYLQD
61 IYDQLGKRGN LRKDRGDGIA DYTIIGSTHL SIILPDLVPY LRIKKKQANR ILHIINLYPQ
121 AQKNPSKFLD LVKIVDDVQN LNKRADELKS TNYDRLLEEF LKAGKIESSP
配列番号：７（野生型Ｉ−ＭｓｏＩ、認識配列）
1 CAGAACGTCG TGAGACAGTT CC
配列番号：８（野生型Ｉ−ＭｓｏＩ、認識配列）
1 GGAACTGTCT CACGACGTTC TG
配列番号：９（野生型Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ０９８４３）
1 MKNIKKNQVM NLGPNSKLLK EYKSQLIELN IEQFEAGIGL ILGDAYIRSR DEGKTYCMQF
61 EWKNKAYMDH VCLLYDQWVL SPPHKKERVN HLGNLVITWG AQTFKHQAFN KLANLFIVNN
121 KKTIPNNLVE NYLTPMSLAY WFMDDGGKWD YNKNSTNKSI VLNTQSFTFE EVEYLVKGLR
181 NKFQLNCYVK INKNKPIIYI DSMSYLIFYN LIKPYLIPQM MYKLPNTISS ETFLK
配列番号：１０（野生型Ｉ−ＳｃｅＩ、認識配列）
1 TTACCCTGTT ATCCCTAG
配列番号：１１（野生型Ｉ−ＳｃｅＩ、認識配列）
1 CTAGGGATAA CAGGGTAA
配列番号：１２（野生型Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ３２７６１）
1 MSNFILKPGE KLPQDKLEEL KKINDAVKKT KNFSKYLIDL RKLFQIDEVQ VTSESKLFLA
61 GFLEGEASLN ISTKKLATSK FGLVVDPEFN VTQHVNGVKV LYLALEVFKT GRIRHKSGSN
121 ATLVLTIDNR QSLEEKVIPF YEQYVVAFSS PEKVKRVANF KALLELFNND AHQDLEQLVN
181 KILPIWDQMR KQQGQSNEGF PNLEAAQDFA RNYKKGIK
配列番号：１３（野生型Ｉ−ＣｅｕＩ、認識配列）
1 ATAACGGTCC TAAGGTAGCG AA
配列番号：１４（野生型Ｉ−ＣｅｕＩ、認識配列）
1 TTCGCTACCT TAGGACCGTT AT
配列番号：１５（ＨＩＶ−ＩのＴＡＴ遺伝子、部分配列）
1 GAAGAGCTCA TCAGAACAGT CA
配列番号：１６（合理的に設計されたＴＡＴ１認識配列半部位）
1 GAAGAGCTC
配列番号：１７（合理的に設計されたＴＡＴ２認識配列半部位）
1 TGACTGTTC
配列番号：１８（合理的に設計されたＣＣＲ１認識配列半部位）
1 AACCCTCTC
配列番号：１９（合理的に設計されたＢＲＰ２認識配列半部位）
1 CTCCGGGTC
配列番号：２０（合理的に設計されたＬＡＭ１認識配列半部位）
1 TGCGGTGTC
配列番号：２１（合理的に設計されたＬＡＭ２認識配列半部位）
1 CAGGCTGTC
配列番号：２２（バクテリオファージλｐ０５遺伝子のＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列）
1 TGCGGTGTCC GGCGACAGCC TG
配列番号：２３（ヒトＦＧＦＲ３遺伝子の潜在的認識配列）
1 CTGGGAGTCT CAGGACAGCC TG
配列番号：２４（ヒト成長ホルモンプロモーターの潜在的認識配列）
1 CCAGGTGTCT CTGGACTCCT CC
配列番号：２５（ヒトＣＦＴＲ遺伝子ΔＦ５０８対立遺伝子の潜在的認識配列）
1 GAAAATATCA TTGGTGTTTC CT
配列番号：２６（ヒトＣＣＲ５遺伝子の潜在的認識配列）
1 AACCCTCTCC AGTGAGATGC CT
配列番号：２７（ヒトＤＭキナーゼ遺伝子３’ＵＴＲの潜在的認識配列）
1 GACCTCGTCC TCCGACTCGC TG
配列番号：２８（単純ヘルペスウィルス１及び単純ヘルペスウィルス２ＵＬ３６遺伝子の潜在的認識配列）
1 CTCGATGTCG GACGACACGG CA
配列番号：２９（炭疽菌遺伝子の潜在的認識配列）
1 ACAAGTGTCT ATGGACAGTT TA
配列番号：３０（痘瘡（天然痘）ウィルスｇｐ００９遺伝子の潜在的認識配列）
1 AAAACTGTCA AATGACATCG CA
配列番号：３１（エプスタイン‐バーウィルスＢＡＬＦ２遺伝子の潜在的認識配列）
1 CGGGGTCTCG TGCGAGGCCT CC
配列番号：３２（シロイヌナズナＧＬ２遺伝子の潜在的認識配列）
1 CACTAACTCG TATGAGTCGG TG
配列番号：３３（シロイヌナズナＢＰ１遺伝子の潜在的認識配列）
1 TGCCTCCTCT AGAGACCCGG AG
配列番号：３４（タバコマグネシウムケラターゼ遺伝子の潜在的認識配列）
1 TAAAATCTCT AAGGTCTGTG CA
配列番号：３５（タバコＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子の潜在的認識配列）
1 CAAGAATTCA AGCGAGCATT AA
配列番号：３６（出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子の潜在的認識配列）
1 TTAGATGACA AGGGAGACGC AT
配列番号：３７（ヒト染色体４の潜在的認識配列）
1 GGCACTCTCT CGCAGAGGG CC
配列番号：３８（ヒト染色体２１の潜在的認識配列）
1 CACCCAGTCA CACGACAGGG TG
配列番号：３９（ヒト染色体１の潜在的認識配列）
1 GAAAGTCTCG CGAGAGCTGG AA
配列番号：４０（ヒト染色体１の潜在的認識配列）
1 AGCGCCCTCT TGCGACAGGG AG
配列番号：４１（ヒト染色体１の潜在的認識配列）
1 TTAGATGTCG CGAGAGGGTG AC
配列番号：４２（ヒト染色体１の潜在的認識配列）
1 GGAGCCGTCT CGCGACGGCC AC
配列番号：４３（ヒト染色体２の潜在的認識配列）
1 GGCAATGTCG CAAGACCCCG TT
配列番号：４４（ヒト染色体３の潜在的認識配列）
1 CGGAGCGTCT CGCGAGAGCT CG
配列番号：４５（ヒト染色体４の潜在的認識配列）
1 TAAGGGCTCT TACGAGAGGC AA
配列番号：４６（ヒト染色体４の潜在的認識配列）
1 GGAGCGCTCG TGCGACGGGG CG
配列番号：４７（ヒト染色体５の潜在的認識配列）
1 GGCCAAGTCT CGCGAGATCG TG
配列番号：４８（ヒト染色体７の潜在的認識配列）
1 CTCAGGGTCT CACGAGCTGC TG
配列番号：４９（ヒト染色体７の潜在的認識配列）
1 GGGAATCTCG CACGAGTTCG TC
配列番号：５０（ヒト染色体９の潜在的認識配列）
1 TGCCCCGTCT CGCGAGGCCC CG
配列番号：５１（ヒト染色体９の潜在的認識配列）
1 AAACAGCTCA CACGAGACCG CA
配列番号：５２（ヒト染色体９の潜在的認識配列）
1 AGGGAGCTCT CGCGAGATCG CC
配列番号：５３（ヒト染色体１０の潜在的認識配列）
1 CGGGGCGTCT CGCGAGCCCG TT
配列番号：５４（ヒト染色体１２の潜在的認識配列）
1 CGGGAGCTCT CGCGAGGCCT CA
配列番号：５５（ヒト染色体１２の潜在的認識配列）
1 GGAGGCGTCG TACGAGTCCG AG
配列番号：５６（ヒト染色体１２の潜在的認識配列）
1 GAAAAACTCG CGAGACTTTG CG
配列番号：５７（ヒト染色体１２の潜在的認識配列）
1 AGCGGCCTCT CGCGACCGTT AC
配列番号：５８（ヒト染色体１３の潜在的認識配列）
1 CAGCCTCTCT CGCGAGTCCC AG
配列番号：５９（ヒト染色体１３の潜在的認識配列）
1 TGAGCGGTCT CACGACTTGT AG
配列番号：６０（ヒト染色体１４の潜在的認識配列）
1 AAAGGCGTCG CGAGAGAGGG AG
配列番号：６１（ヒト染色体１５の潜在的認識配列）
1 GAAAATGTCG CGAGAGCTTT CC
配列番号：６２（ヒト染色体１６の潜在的認識配列）
1 CGCGCGCTCT CGCGAGAGTC CA
配列番号：６３（ヒト染色体１６の潜在的認識配列）
1 AGCGAAGTCT CGCGAGATCG CG
配列番号：６４（ヒト染色体１６の潜在的認識配列）
1 CGGGCTGTCG CGAGAGGCGG CC
配列番号：６５（ヒト染色体１７の潜在的認識配列）
1 TTGAAGGTCT CGCGAGATCG AG
配列番号：６６（ヒト染色体１７の潜在的認識配列）
1 AGCCGCCTCG CGCGAGCCGC CC
配列番号：６７（ヒト染色体１７の潜在的認識配列）
1 AACCCTGTCG CGAGAGCTCC TC
配列番号：６８（ヒト染色体１７の潜在的認識配列）
1 GGGCGGGTCT CGCGAGGGGC AG
配列番号：６９（ヒト染色体１７の潜在的認識配列）
1 GGAGGCGTCT CGCGAGAGTT AG
配列番号：７０（ヒト染色体１８の潜在的認識配列）
1 CAAACTCTCG TGAGAGTTTG AG
配列番号：７１（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 CAAGGTCTCG CACGACTTCC TG
配列番号：７２（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 CGAGGACTCG CGCGAGCGCG CG
配列番号：７３（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 CGCCCACTCG CACGAGCCGC AC
配列番号：７４（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 CAAAATCTCG CGAGACGTGG CG
配列番号：７５（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 AGGCGGGTCA CGCGAGCCCC TG
配列番号：７６（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 TTCCAGGTCT TGCGAGATTC AC
配列番号：７７（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 GGCCAAGTCT CGCGAGAGCG CG
配列番号：７８（ヒト染色体１９の潜在的認識配列）
1 GACGGTGTCT CGCGAGAGTC TT
配列番号：７９（ヒト染色体２０の潜在的認識配列）
1 CTGCCTGTCT CACGAGCCCC TA
配列番号：８０（ヒト染色体２０の潜在的認識配列）
1 AACCATGTCG CGAGAGGCGG AT
配列番号：８１（ヒト染色体２０の潜在的認識配列）
1 GGCACTGTCG CAAGACCGCG CG
配列番号：８２（ヒト染色体２０の潜在的認識配列）
1 AACAACCTCT CGCGACCCGT AC
配列番号：８３（ヒト染色体２２の潜在的認識配列）
1 CACCCCCTCA CACGAGGCTT CA
配列番号：８４（ヒト染色体２２の潜在的認識配列）
1 CTCAAACTCT CGCGAGGCTT CG
配列番号：８５（ヒト染色体２２の潜在的認識配列）
1 GACCAACTCT CGCGACAGCC AG
配列番号：８６（ヒト染色体２２の潜在的認識配列）
1 CTCGGCGTCA CGCGACAGCG AC
配列番号：８７（ヒトＸ染色体の潜在的認識配列）
1 CGAACTCTCG CGAGAGCGGT AT
【図１】

【図２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５からなる群から選択されるＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に対して特異性を有し、
該組換えメガヌクレアーゼが、削除改変ではない、表１に記載の改変の少なくとも一つを有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項２】
野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：７及び配列番号：８からなる群から選択されるＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に対して特異性を有し、
該組換えメガヌクレアーゼが、削除改変ではない、表２に記載の改変の少なくとも一つを有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項３】
野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと比較して認識配列に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：９のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの３〜１８６残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：１０及び配列番号：１１のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列の少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列に対して特異性を有し、
該組換えメガヌクレアーゼが、削除改変ではない、表３に記載の改変の少なくとも一つを有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項４】
野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１２の野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：１３及び配列番号：１４からなる群から選択されるＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に対して特異性を有し、
該組換えメガヌクレアーゼが、削除改変ではない、表４に記載の改変の少なくとも一つを有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項５】
野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５からなる群から選択されるＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に対して特異性を有し、
該特異性の変化が、
（１）−１位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＱ７０、Ｃ７０、Ｌ７０、Ｙ７５、Ｑ７５、Ｈ７５、Ｈ１３９、Ｑ４６及びＨ４６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＡに対するＹ７５、Ｌ７５、Ｃ７５、Ｙ１３９、Ｃ４６及びＡ４６からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ７０、Ｅ７０、Ｅ７５、Ｅ４６及びＤ４６からなる群から選択される改変
（ｄ）センス鎖上のＣに対するＨ７５、Ｒ７５、Ｈ４６、Ｋ４６及びＲ４６からなる群から選択される改変；又は
（ｅ）センス鎖上のいずれかの塩基に対するＧ７０、Ａ７０、Ｓ７０及びＧ４６からなる群から選択される改変；及び／又は
（２）−２位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＱ７０、Ｔ４４、Ａ４４、Ｖ４４、Ｉ４４、Ｌ４４及びＮ４４からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ７０、Ｄ７０、Ｋ４４及びＲ４４からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＨ７０、Ｄ４４及びＥ４４からなる群から選択される改変；又は
（ｄ）センス鎖上のＡ又はＴに対するＣ４４を有する改変；及び／又は
（３）−３位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＱ６８及びＣ２４からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ６８、Ｆ６８、Ｋ２４及びＲ２４からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＭ６８、Ｃ６８、Ｌ６８及びＦ６８からなる群から選択される改変；
（ｄ）センス鎖上のＡ又はＣに対するＨ６８を有する改変；
（ｅ）センス鎖上のＣ又はＴに対するＹ６８を有する改変；又は
（ｆ）センス鎖上のＧ又はＴに対するＫ６８を有する改変；及び／又は
（４）−４位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ７７及びＫ２６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＥ２６及びＲ７７からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＣ又はＴに対するＳ７７を有する改変；又は
（ｄ）センス鎖上のいずれかの塩基に対するＳ２６を有する改変；及び／又は
（５）−５位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ４２を有する改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＲ４２を有する改変；
（ｃ）センス鎖上のＡ又はＧに対するＣ２８及びＱ４２からなる群から選択される改変；又は
（ｄ）センス鎖上のいずれかの塩基に対するＭ６６及びＫ６６からなる群から選択される改変；及び／又は
（６）−６位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＣ４０、Ｉ４０、Ｖ４０、Ｃ７９、Ｉ７９、Ｖ７９及びＱ２８からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ４０及びＲ２８からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＲ４０を有する改変；及び／又は
（７）−７位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ３８、Ｋ３０及びＲ３０からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＫ３８、Ｒ３８及びＥ３０からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＩ３８及びＬ３８からなる群から選択される改変；又は
（ｄ）センス鎖上のＡ又はＧに対するＣ３８を有する改変；又は
（ｅ）センス鎖上のいずれかの塩基に対するＨ３８、Ｎ３８及びＱ３０からなる群から選択される改変；及び／又は
（８）−８位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＬ３３、Ｖ３３、Ｉ３３、Ｆ３３及びＣ３３からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ３３及びＤ３３からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ３３からなる改変；
（ｄ）センス鎖上のＡ又はＣに対するＲ３２を有する改変；又は
（ｅ）センス鎖上のＡ又はＧに対するＲ３３を有する改変；及び／又は
（９）−９位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ３２を有する改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＲ３２及びＫ３２からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＬ３２、Ｖ３２、Ａ３２及びＣ３２からなる群から選択される改変；
（ｄ）センス鎖上のＣ又はＴに対するＤ３２及びＩ３２からなる群から選択される改変；又は
（ｅ）センス鎖上のいずれかの塩基に対するＳ３２、Ｎ３２、Ｈ３２、Ｑ３２及びＴ３２からなる群から選択される改変であることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項６】
野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーセは、
配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：７及び配列番号：８からなる群から選択されるＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に対する特異性を有し、
該特異性の変化が、
（１）−１位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＫ７５、Ｑ７７、Ａ４９、Ｃ４９及びＫ７９からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＣ７７、Ｌ７７及びＱ７９からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ７７、Ｒ７７、Ｅ４９及びＥ７９からなる群から選択される改変；及び／又は
（２）−２位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＱ７５、Ｋ８１、Ｃ４７、Ｉ４７及びＬ４７からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ７５、Ｄ７５、Ｒ４７、Ｋ４７、Ｋ８１及びＲ８１からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ７５、Ｅ４７及びＥ８１からなる群から選択される改変；及び／又は
（３）−３位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＱ７２、Ｃ２６、Ｌ２６、Ｖ２６、Ａ２６及びＩ２６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ７２、Ｙ７２、Ｈ２６、Ｋ２６及びＲ２６からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＫ７２、Ｙ７２及びＨ２６からなる群から選択される改変；及び／又は
（４）−４位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＫ２８、Ｋ８３及びＱ２８からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＲ８３及びＫ８３からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＫ２８及びＱ８３からなる群から選択される改変；及び／又は
（５）−５位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＧに対するＲ４５及びＥ２８からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＱ２８を有する改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＣに対するＲ２８を有する改変；及び／又は
（６）−６位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＫ４３、Ｖ８５、Ｌ８５及びＱ３０からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ４３、Ｅ８５、Ｋ３０及びＲ３０からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＲ４３、Ｋ４３、Ｋ８５、Ｒ８５、Ｅ３０及びＤ３０からなる群から選択される改変；及び／又は
（７）−７位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ３２及びＥ４１からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＲ３２、Ｒ４１及びＫ４１からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＫ３２、Ｍ４１、Ｌ４１及びＩ４１からなる群から選択される改変；及び／又は
（８）−８位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＫ３２及びＫ３５からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ３２を有する改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ３２、Ｋ３５及びＲ３５からなる改変；及び／又は
（９）−９位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＮ３４及びＨ３４からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＳ３４、Ｃ３４、Ｖ３４、Ｔ３４及びＡ３４からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ３４、Ｒ３４及びＨ３４からなる群から選択される改変であることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項７】
野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと比較して認識配列に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：９のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの３〜１８６残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：１０及び配列番号：１１のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列の少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列に対して特異性を有し、
該特異性の変化が、
（１）４位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＫ５０を有する改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＫ５７、Ｍ５７及びＱ５０からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＥ５０、Ｒ５７及びＫ５７からなる群から選択される改変；及び／又は
（２）５位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＫ４８及びＱ１０２からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＥ４８、Ｋ１０２及びＲ１０２からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＱ４８、Ｃ１０２、Ｌ１０２及びＶ１０２からなる群から選択される改変；及び／又は
（３）６位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＫ５９を有する改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＲ５９及びＫ５９からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ８４及びＥ５９からなる群から選択される改変；及び／又は
（４）７位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＲ４６、Ｋ４６及びＥ８６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＫ８６、Ｒ８６及びＥ４６からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＣ４６、Ｌ４６及びＶ４６からなる群から選択される改変；及び／又は
（５）８位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ８８、Ｒ６１及びＨ６１からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＫ８８、Ｑ６１及びＨ６１からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＫ６１、Ｓ６１、Ｖ６１、Ａ６１及びＬ６１からなる群から選択される改変；及び／又は
（６）９位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＣ９８、Ｖ９８及びＬ９８からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＲ９８及びＫ９８からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＥ９８及びＤ９８からなる群から選択される改変；及び／又は
（７）１０位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＫ９６及びＲ９６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＤ９６及びＥ９６からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＣ９６及びＡ９６からなる群から選択される改変；及び／又は
（８）１１位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＱ９０を有する改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＫ９０及びＲ９０からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＥ９０を有する改変；及び／又は
（９）１２位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＱ１９３を有する改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＥ１６５、Ｅ１９３及びＤ１９３からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ１６５及びＲ１６５からなる群から選択される改変；及び／又は
（１０）１３位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＱ１９３、Ｃ１６３及びＬ１６３からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＥ１９３、Ｄ１９３、Ｋ１６３及びＲ１９２からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＣ１９３及びＬ１９３からなる群から選択される改変；及び／又は
（１１）１４位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＫ１６１及びＱ１９２からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＡに対するＬ１９２及びＣ１９２からなる群から選択される改変；
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ１４７、Ｋ１６１、Ｒ１６１、Ｒ１９７、Ｄ１９２及びＥ１９２からなる群から選択される改変；又は
（ｄ）センス鎖上のＴに対するＫ１６１及びＱ１９２からなる群から選択される改変；及び／又は
（１２）１５位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＣ１５１、Ｌ１５１及びＫ１５１からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＫ１５１を有する改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＣに対するＥ１５１を有する改変；及び／又は
（１３）１７位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＧ１５２及びＱ１５０からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＫ１５２及びＫ１５０からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＮ１５２、Ｓ１５２、Ｄ１５２、Ｄ１５０及びＥ１５０からなる群から選択される改変；及び／又は
（１４）１８位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＨ１５５及びＹ１５５からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＲ１５５及びＫ１５５からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＫ１５５及びＣ１５５からなる群から選択される改変であることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項８】
野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと比較して少なくとも一つの認識配列半部位に対する特異性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１２の野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、かつ
配列番号：１３及び配列番号：１４からなる群から選択されるＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半部位と少なくとも一つの塩基対が異なる認識配列半部位に対する特異性を有し、
該特異性の変化は、
（１）−１位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＣ９２、Ａ９２及びＶ９２からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＱ１１６及びＱ９２からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＥ１１６及びＥ９２からなる群から選択される改変；及び／又は
（２）−２位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＱ１１７、Ｃ９０、Ｌ９０及びＶ９０からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＫ１１７、Ｒ１２４、Ｋ１２４、Ｅ１２４、Ｅ９０及びＤ９０からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＣに対するＥ１１７、Ｄ１１７、Ｒ１７４、Ｋ１２４、Ｋ９０、Ｒ９０及びＫ６８からなる群から選択される改変；及び／又は
（３）−３位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＣ７０、Ｖ７０、Ｔ７０、Ｌ７０及びＫ７０からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＱ７０を有する改変；
（ｃ）センス鎖上のＣに対するＫ７０からなる改変；及び／又は
（４）−４位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＥ１２６、Ｄ１２６、Ｒ８８、Ｋ８８及びＫ７２からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＫ１２６、Ｌ１２６及びＱ８８からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＱ１２６、Ｎ１２６、Ｋ８８、Ｌ８８、Ｃ８８、Ｃ７２、Ｌ７２及びＶ７２からなる群から選択される改変；及び／又は
（５）−５位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＧに対するＥ７４、Ｋ１２８、Ｒ１２８及びＥ１２８からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＴに対するＣ１２８、Ｌ１２８、Ｖ１２８及びＴ１２８からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＡに対するＣ７４、Ｌ７４、Ｖ７４及びＴ７４からなる群から選択される改変；及び／又は
（６）−６位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＫ８６、Ｃ８６及びＬ８６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＤ８６、Ｅ８６、Ｒ８４及びＫ８４からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＫ１２８、Ｒ１２８、Ｒ８６、Ｋ８６及びＥ８４からなる群から選択される改変；及び／又は
（７）−７位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＣに対するＲ７６、Ｋ７６及びＨ７６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＧに対するＥ７６及びＲ８４からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＴに対するＨ７６及びＱ７６からなる改変；及び／又は
（８）−８位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＡに対するＹ７９、Ｒ７９及びＱ７６からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＤ７９、Ｅ７９、Ｄ７６及びＥ７６からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＲ７９、Ｋ７９、Ｋ７６及びＲ７６からなる群から選択される改変；及び／又は
（９）−９位置での特異性の改変が、
（ａ）センス鎖上のＴに対するＫ７８、Ｖ７８、Ｌ７８、Ｃ７８及びＴ７８からなる群から選択される改変；
（ｂ）センス鎖上のＣに対するＤ７８及びＥ７８からなる群から選択される改変；又は
（ｃ）センス鎖上のＧに対するＲ７８、Ｋ７８及びＨ７８からなる群から選択される改変であることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項９】
野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＥ８０、Ｄ１３７、Ｉ８１、Ｌｌ１２、Ｐ２９、Ｖ６４又はＹ６６の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＴ４６、Ｔ１４０又はＴ１４３の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇していることを特徴とする組換えＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ。
【請求項１０】
野生型Ｉ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化している組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋ１１６又はＫ１３９の置換；又は
（ｂ）Ｄ又はＥでのＩ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４６、Ｔ１４０又はＴ１４３の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下していることを特徴とする組換えＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ。
【請求項１１】
野生型Ｉ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＥ１４７、Ｉ８５、Ｇ８６又はＹ１１８の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＱ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０又はＮ１５２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１２】
野生型Ｉ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ３６、Ｒ５１、Ｋ１２３、Ｋ１４３又はＲ１４４の置換；又は
（ｂ）Ｄ又はＥでのＩ８５、Ｇ８６、Ｙ１１８、Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０又はＮ１５２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１３】
野生型Ｉ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：９のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの３〜１８６残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＤ２０１、Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９又はＹ２２２の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＮ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４又はＳ２０２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１４】
野生型Ｉ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：９のＩ‐ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの３〜１８６残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ２０、Ｋ２３、Ｋ６３、Ｋ１２２、Ｋ１４８、Ｋ１５３、Ｋ１９０、Ｋ１９３、Ｋ１９５又はＫ２２３の置換；又は
（ｂ）Ｄ又はＥでのＬ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９、Ｙ２２２、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４又はＳ２０２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１５】
野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲでのＤ２５又はＤ１２８の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９又はＨ１７２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により上昇していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１６】
野生型Ｉ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと比較して二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼであって、該組換えメガヌクレアーゼは、
配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥでのＫ２１、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ１１２、Ｒ１１４又はＲ１３０の置換；又は
（ｂ）Ｄ又はＥでのＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９又はＨ１７２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により低下していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１７】
参照メガヌクレアーゼ単量体との二量体形成に対する親和性が変化している組換えメガヌクレアーゼ単量体であって、該組換えメガヌクレアーゼ単量体は、
配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該二量体形成親和性が、
（ａ）Ｄ又はＥでのＫ７、Ｋ５７又はＫ９６の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ８又はＥ６１の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ単量体。
【請求項１８】
組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体であって、該ヘテロ二量体が、
二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＫ７、Ｋ５７又はＫ９６の置換からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化している、配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有する第１のポリペプチド；及び
二量体形成親和性が（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ８又はＥ６１の置換からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化している、配列番号：１のＩ‐ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２〜１５３残基に少なくとも８５％の配列相似性を有する第２のポリペプチド
を有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体。
【請求項１９】
参照メガヌクレアーゼ単量体との二量体形成に対する親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼ単量体であって、該組換えメガヌクレアーゼ単量体は、
配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
該二量体形成親和性が、
（ａ）Ｄ又はＥでのＲ３０２の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＤ２０、Ｅ１１又はＱ６４の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ単量体。
【請求項２０】
組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体であって、該ヘテロ二量体が、
二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＲ３０２の置換からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化している、配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有する第１のポリペプチド；及び
二量体形成親和性が（ｂ）Ｋ又はＲでのＤ２０、Ｅ１１又はＱ６４の置換からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化している、配列番号：６のＩ‐ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの６〜１６０残基に少なくとも８５％の配列相似性を有する第２のポリペプチド
を有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体。
【請求項２１】
参照メガヌクレアーゼ単量体との二量体形成に対する親和性が変化した組換えメガヌクレアーゼ単量体であって、該組換えメガヌクレアーゼ単量体は、
配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドを有し、
二量体形成親和性が、
（ａ）Ｄ又はＥでのＲ９３の置換；又は
（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ１５２の置換
からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化していることを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ単量体。
【請求項２２】
組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体であって、該ヘテロ二量体が、
二量体形成親和性が（ａ）Ｄ又はＥでのＲ９３の置換からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化している、配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有する第１のポリペプチド；及び
配列番号：１２のＩ‐ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの５〜２１１残基に少なくとも８５％の配列相似性を有するポリペプチドであって、二量体形成親和性が（ｂ）Ｋ又はＲでのＥ１５２の置換からなる群から選択される置換に対応する少なくとも一つの改変により変化している第２のポリペプチド
を有することを特徴とする組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体。
【請求項２３】
表１から選択される少なくとも一つの改変を更に有する請求項１７又は１８に記載の組換えメガヌクレアーゼ単量体又は二量体であって、該改変が削除改変ではないことを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ単量体又は二量体。
【請求項２４】
表２から選択される少なくとも一つの改変を更に有する請求項１９又は２０に記載の組換えメガヌクレアーゼ単量体又は二量体であって、該改変が削除改変ではないことを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ単量体又は二量体。
【請求項２５】
表４から選択される少なくとも一つの改変を更に有する請求項２１又は２２に記載の組換えメガヌクレアーゼ単量体又は二量体であって、該改変が削除改変ではないことを特徴とする組換えメガヌクレアーゼ単量体又は二量体。
【請求項２６】
真核細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を有する遺伝子改変された真核細胞を作製する方法であって、該方法は、
（i）メガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列、及び
（ii）該目的配列を有する第２の核酸配列
を含有する一つ又は複数の核酸で真核細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが染色体に切断部位を形成し、該目的配列が該切断部位で染色体に挿入され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項２７】
第２の核酸が該切断部位に隣接する配列に相同である配列を更に有し、目的配列が相同的組換えにより切断部位に挿入されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第２の核酸が該切断部位に対して実質的な相同性を有せず、目的配列が非相同的末端結合により染色体に挿入されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
真核細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を有する遺伝子改変された真核細胞を作製する方法であって、該方法は、
真核細胞にメガヌクレアーゼタンパク質を導入し、
該真核細胞を目的の配列を有する核酸でトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが染色体に切断部位を形成し、該目的配列が該切断部位で染色体に挿入され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
核酸が該切断部位に隣接する配列に相同である配列を更に有し、目的配列が相同的組換えにより切断部位に挿入されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸が該切断部位に対して実質的な相同性を有せず、目的配列が非相同的末端結合により染色体に挿入されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
真核細胞の染色体の標的配列を破壊することにより遺伝子改変された真核細胞を作製する方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが染色体に切断部位を形成し、該標的配列が該切断部位での非相同的末端結合により破壊され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項３３】
遺伝子改変された生物を作製する方法であって、該方法は、
請求項２６〜３２のいずれか一つに記載の方法に従って遺伝子改変された真核細胞を作製し、
該遺伝子改変された真核細胞を成長させて遺伝子改変された生物を作製することを含むことを特徴とする遺伝子改変された生物を作製する方法。
【請求項３４】
真核細胞が、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞及びプロトプラスト細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
真核生物における遺伝子治療による疾患の処置方法であって、該方法は、
（i）メガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列、及び
（ii）目的の配列を有する第２の核酸配列
を含有する１つ又は複数の核酸で真核生物の少なくとも１つの細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが染色体に切断部位を形成し、該目的配列が該切断部位で染色体に挿入され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該目的配列の挿入により疾患の遺伝子治療がなされることを特徴とする、疾患の処置方法。
【請求項３６】
第２の核酸配列が該切断部位に隣接する配列に相同である配列を更に有し、目的配列が相同的組換えにより切断部位に挿入されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第２の核酸配列が該切断部位に対して実質的な相同性を有せず、目的配列が非相同的末端結合により染色体に挿入されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
真核生物における遺伝子治療による疾患の処置方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼタンパク質を真核生物の少なくとも１つの細胞に導入し、
目的配列を有する核酸で該真核細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが染色体に切断部位を形成し、該目的配列が該切断部位で染色体に挿入され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該目的配列の挿入により疾患の遺伝子治療がなされることを特徴とする、疾患の処置方法。
【請求項３９】
核酸が該切断部位に隣接する配列に相同である配列を更に有し、目的配列が相同的組換えにより切断部位に挿入されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
核酸が該切断部位に対して実質的な相同性を有せず、目的配列が非相同的末端結合により染色体に挿入されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
真核細胞の染色体の標的配列を破壊することにより真核生物の遺伝子治療を行う疾患の処置方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼをコードする核酸で該真核生物の少なくとも１つの細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが染色体に切断部位を形成し、該標的配列が該切断部位での非相同的末端結合により破壊され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該標的配列の破壊により疾患の遺伝子治療がなされることを特徴とする、疾患の処置方法。
【請求項４２】
ウィルス病原体のゲノムの標的配列を破壊して真核生物宿主におけるウィルス病原体感染を処置する方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼをコードする核酸で該真核生物宿主の少なくとも１つの感染細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼがウィルスゲノムに切断部位を形成し、該標的配列が該切断部位での非相同的末端結合により破壊され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該標的配列の破壊により感染の治療がなされることを特徴とする、処置方法。
【請求項４３】
ウィルス病原体のゲノムの標的配列を破壊して真核生物宿主におけるウィルス病原体感染を処置する方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼをコードする第１の核酸と第２の核酸で該真核生物宿主の少なくとも１つの感染細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼがウィルスゲノムに切断部位を形成し、該切断部位での該ウィルスゲノム及び該第２の核酸の相同的組換えにより標的配列が破壊され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該第２の核酸が該切断部位に隣接する配列に相同である配列を有し、
該標的配列の破壊により感染の治療がなされることを特徴とする、処置方法。
【請求項４４】
原核生物病原体のゲノムの標的配列を破壊して真核生物宿主における原核生物病原体感染を処置する方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼをコードする核酸で少なくとも原核生物病原体が感染している真核宿主細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが原核生物ゲノムに切断部位を形成し、該標的配列が該切断部位での非相同的末端結合により破壊され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該標的配列の破壊により感染の治療がなされることを特徴とする、処置方法。
【請求項４５】
原核生物病原体のゲノムの標的配列を破壊して真核生物宿主における原核生物病原体感染を処置する方法であって、該方法は、
メガヌクレアーゼをコードする第１の核酸と第２の核酸で少なくとも原核生物病原体が感染している真核宿主細胞をトランスフェクトすることを含み、
該メガヌクレアーゼが原核生物ゲノムに切断部位を形成し、該切断部位での該原核生物ゲノム及び該第２の核酸の相同的組換えにより標的配列が破壊され、
該メガヌクレアーゼが請求項１〜２５のいずれか一つに記載の組換えメガヌクレアーゼであり、
該第２の核酸が該切断部位に隣接する配列に相同である配列を有し、
該標的配列の破壊により感染の治療がなされることを特徴とする、処置方法。
【請求項４６】
認識配列の少なくとも１つの塩基位置に対する特異性を変化させた組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法であって、該特異性の変化は少なくとも一つの所望の改変を有し、該方法は、
（１）参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し、
（２）該塩基位置の塩基接触面を形成するアミノ酸残基を同定し、
（３）該接触面を有する少なくとも第１の残基のβ‐炭素と該塩基位置の少なくとも第１の塩基との距離を決定し、
（４）（ａ）該第１の塩基から６Å未満である第１の残基に対しては、所望の改変を促進するためにＧ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の好適なメンバーの１つである１群及び／又は２群から置換を選択し；
（ｂ）該第１の塩基から６Åを超える第１の残基に対しては、所望の改変を促進するためにＧ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の好適なメンバーの１つである２群及び／又は３群から置換を選択することにより該所望の変化を促進するアミノ酸置換を同定することを含む、組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法。
【請求項４７】
ＤＮＡ結合親和性を高めた組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法であって、該方法は、
（１）参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し、
（２）骨格接触面を形成するアミノ酸接触残基を同定し、
（３）（ａ）負に荷電されているか又は疎水性の側鎖を有する接触残基に対しては、非荷電／極性又は正荷電の側鎖を有する置換を選択し；
（ｂ）非荷電／極性側鎖を有する接触残基に対しては、正荷電の側鎖を有する置換を選択することによりＤＮＡ結合親和性を高めるためのアミノ酸置換を同定することを含む、組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法。
【請求項４８】
ＤＮＡ結合親和性を低下させた組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法であって、該方法は、
（１）参照メガヌクレアーゼ‐ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し、
（２）骨格接触面を形成するアミノ酸接触残基を同定し、
（３）（ａ）正に荷電されている側鎖を有する接触残基に対しては、非荷電／極性又は負荷電の側鎖を有する置換を選択し；
（ｂ）疎水性又は非荷電／極性の側鎖を有する接触残基に対しては、負荷電の側鎖を有する置換を選択することによりＤＮＡ結合親和性を低下させるためのアミノ酸置換を同定することを含む、組換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法。
【請求項４９】
認識配列が配列番号：３７から配列番号：８７からなる群から選択される、請求項１〜２８のいずれかに記載の組換えメガヌクレアーゼ又は方法。

【図３】

【公表番号】特表２０１１−５０５８０９（Ｐ２０１１−５０５８０９Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７１４４（Ｐ２０１０−５３７１４４）
【出願日】平成２０年１２月８日（２００８．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８５８７８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６２９２
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０８１１７７２１）プレシジョン　バイオサイエンシズ，インク． (5)
【Ｆターム（参考）】