ヒト化抗CD70結合剤およびその使用
CD70発現細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示すヒト化抗CD70抗体及びフラグメント及び誘導体のようなCD70結合剤、並びに抗体、フラグメント又は誘導体を含む医薬組成物及びキットを開示する。更に又、CD70結合剤又は医薬組成物を対象に投与することを含むCD70発現癌及び免疫学的障害の治療のための方法を開示する。CD70結合剤は単独で又は治療薬と組み合わせた場合に、CD70発現細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願)
本出願は、米国仮特許出願第60/673,070号(2005年4月19日出願)の優先権を主張し、この米国出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【背景技術】
【0002】
(背景)
CD70は種々の正常及び悪性の細胞型により発現される細胞膜結合型及び分泌型の分子の腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのメンバーである。DC70の一次アミノ酸(AA)配列は、自身のカルボキシル末端を細胞の外側に露出させ、そしてアミノ末端を原形質膜のシトゾル側に存在させている膜貫通II型の蛋白を予測させるものである(非特許文献1;非特許文献2)。ヒトCD70は20AAの原形質ドメイン、18AAの膜貫通ドメイン及び155AAの原形質外ドメインを有し、2つの潜在的にN連結性のグリコシル化部位を有する(非特許文献1;非特許文献2)。抗CD70抗体を用いた放射性同位体標識CD70発現細胞の特異的免疫沈降では29および50kDaのポリペプチドが得られる(非特許文献2;非特許文献3)。特に構造的な鎖C、D、H及びIにおけるTNF−アルファ及びTNF−ベータのとのその相同性に基づけば、3量体構造がCD70について予測される(非特許文献4)。
【0003】
当初の免疫組織学的試験によれば、CD70は胚中心B細胞及び稀少なT細胞上で、扁桃、皮膚及び腸において発現されることがわかった(非特許文献5)。その後、CD70は最近抗原活性化されたT及びBリンパ球の細胞表面上に発現されることが報告され、そしてその発現は抗原刺激除去後には減衰する(非特許文献6;非特許文献7)。リンパ様の系内では、活性化されたナチュラルキラー細胞(非特許文献8)及びマウス成熟末梢樹状細胞(非特許文献9)も又CD70を発現する。非リンパ様系統においては、CD70は胸腺髄質上皮細胞上で検出されている(非特許文献5;非特許文献10)。
【0004】
CD70は正常な非造血細胞上に発現されない。CD70発現は生理学的条件下において最近活性化されたT及びB細胞に大部分が限定され、そしてその発現は抗原刺激が停止すればダウンレギュレートされる。動物実験から得られた証拠によれば、CD70は免疫学的障害、例えば慢性関節リウマチ(非特許文献11)、乾癬性関節炎(非特許文献11)及び狼瘡(非特許文献12)に寄与している可能性があることが示唆されている。炎症応答におけるその潜在的役割に加えて、CD70は種々の形質転換細胞、例えばリンパ腫B細胞、ホジキン及びリード−スターンバーグ細胞、神経起源の悪性細胞及び多くの癌においても発現されている。
【非特許文献1】Bowmanら,J.Immunol.,1994年,第152巻,p.1756−61
【非特許文献2】Goodwinら,Cell,1993年,第73巻,p.447−56
【非特許文献3】Hintzenら,J.Immunol.,1994年,第152巻,p.1762−73
【非特許文献4】Petschら,Mol.Immunol.,1995年,第32巻,p.761−72
【非特許文献5】Hintzenら,Int.Immunol.,1994年,第6巻,p.477−80
【非特許文献6】Lensら,Eur J.lmmunol.,1996年,第26巻,p.2964−71
【非特許文献7】Lensら,Immunology,1997年,第90巻,p.38−45
【非特許文献8】Orengoら,Clin. Exp. Immunol.,1997年,第107巻,p.608−13
【非特許文献9】Akibaら,J.Exp. Med.,2000年,第191巻,p.375−80
【非特許文献10】Hishimaら,,Am.J.Surg.Pathol.,2000年,第24巻,p.742−46
【非特許文献11】Brugnoniら,Immunol.Lett.,1997年,第55巻,p.99−104
【非特許文献12】Oelkeら,Arthritis Rheum.,2004年,第50巻,p.1850−60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従って、特に非CD70発現細胞に対して望ましくない作用を示すことなく、CD70発現細胞に対して臨床的に有用な細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示すことができる抗CD70抗体及び他のCD70結合剤が必要とされている。そのような化合物はCD70を発現する癌又はCD70発現細胞により媒介される免疫障害に対する有用な治療薬となりえる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
(簡潔な要旨)
本発明はCD70抗体及び関連するCD70結合剤、及び、CD70を発現する癌又はCD70発現細胞が存在する免疫障害の予防又は治療のためのこのような結合剤の使用に関する方法を提供する。CD70結合剤は単独又は治療薬と組み合わせた場合に、CD70発現細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を示す。
【0007】
1つの態様において、CD70結合剤が提供される。CD70結合剤は例えば抗体であることができる。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてADCC、ADCP又はCDC応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。抗体はCD70への結合についてモノクローナル抗体1F6又は2F2と競合することができる。
【0008】
別の態様において、対象におけるCD70発現癌を治療するための方法が提供される。方法は一般的にCD70結合剤の有効量を対象に投与することを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてADCC、ADCP又はCDC応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。
【0009】
CD70結合剤は例えば抗体であることができる。抗体は例えばヒトIgM又はIgG抗体のエフェクタードメインを包含することができる。IgG抗体は例えばヒトIgG1又はIgG3サブタイプであることができる。一部の実施形態においては、抗体はヒト定常領域を包含する。一部の実施形態においては、CD70結合剤はCD70への結合についてモノクローナル抗体1F6又は2F2と競合することができる。他の実施形態において、抗体はヒト化1F6である。他の実施形態において、抗体はヒト化2F2である。抗体は例えば1価、2価又は多価であることができる。
【0010】
CD70発現癌は腎臓腫瘍、B細胞リンパ腫、結腸癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、非ホジキンリンパ腫、外膜細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、鼻咽頭抗、脳腫瘍又は胸腺癌であることができる。腎臓腫瘍は例えば腎細胞癌であることができる。脳腫瘍は例えば神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫又は髄膜腫であることができる。対象は例えば哺乳類、例えばヒトであることができる。
【0011】
別の態様において、免疫学的障害を治療するための方法が提供される。方法は一般的にCD70結合剤の有効量を対象に投与することを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてADCC、ADCP又はCDC応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。CD70結合剤は例えば抗体であることができる。抗体は例えばヒトIgM又はIgG抗体のエフェクタードメインを包含することができる。IgG抗体は例えばヒトIgG1又はIgG3サブタイプであることができる。一部の実施形態においては、抗体はヒト定常領域を包含する。
【0012】
免疫学的障害は例えばT細胞媒介免疫学的障害であることができる。一部の実施形態においてはT細胞媒介免疫学的障害はCD70を発現する活性化T細胞を含む。一部の実施形態においては、休止期のT細胞は抗体薬剤コンジュゲートの投与により実質的に枯渇されない。T細胞媒介免疫学的障害は例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身エリテマトーデス(SLE)、I型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核又は対宿主性移植片病であることができる。他の実施形態においては、免疫学的障害は活性化Bリンパ球障害である。対象は例えば哺乳類、例えばヒトであることができる。
【0013】
関連する態様において、CD70発現癌又は免疫学的障害の治療のための医薬組成物が提供される。組成物はCD70結合剤及び少なくとも1つの薬学的に適合性のある成分を包含する。更に又、CD70結合剤が凍結乾燥されている薬剤を包含する容器、及び、製薬上許容しうる希釈剤を含む第2の容器を包含する薬学的キットも提供される。
【0014】
本発明は本発明の以下の詳細な説明、及び本発明の特定の実施形態の非限定的な例及び添付の図面及び配列表を参照することにより更に十分に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
(詳細な説明)
本発明はCD70結合剤及びCD70発現癌及び免疫学的障害の予防又は治療のためのこのような結合剤の使用のための方法を提供する。CD70結合剤はCD70(例えば細胞外ドメイン)に特異的に結合する。結合剤はADCC、ADCP及び/又はCDC応答を媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含してよい。結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下で細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示してよい。結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートしてよい。
【0016】
1つの態様において、組成物及び方法はCD70結合剤、例えば抗体及び抗体誘導体に関する。抗CD70抗体はモノクローナル、キメラ又はヒト化抗体、又はそのフラグメント又は誘導体であることができる。一部の実施形態において、抗CD70抗体は抗体定常領域又はドメインを包含する。抗体定常領域又はドメインは例えばIgGサブタイプのものであることができる。例示される実施形態において、抗CD70抗体、そのフラグメントはCD70への結合についてマウスモノクローナル抗体(mAb)1F6又は2F2と競合し、そしてヒト抗体定常領域配列を含む。別の例示される実施形態において、抗CD70抗体又はそのフラグメント又は誘導体は、エフェクター細胞又は補体と相互作用することによりCD70発現細胞の枯渇又は増殖抑制をもたらす細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を媒介することができるエフェクタードメイン(例えばFc部分)を有する。別の例示される実施形態において、抗CD70抗体はエフェクター機能を欠失している。別の例示される実施形態において、抗CD70抗体は治療薬にコンジュゲートされる。
【0017】
更に包含されるものは、CD70結合剤(例えばヒト化抗CD70抗体)を含むキット及び製造品である。
【0018】
開示の明確化の為に、そして限定することなく、本発明の詳細な説明を以下の通りサブセクションに分割する。
I.定義及び略記法
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び科学的な用語は記載した方法及び組成物に関連する当業者の一般的に理解するものと同様の意味を有する。商品名を本明細書において使用する場合は、出願人は商品名の製品の製剤、ジェネリック薬品、及び、商品名の製品の薬学的活性成分を独立して包含することを意図している。本明細書においては、以下の用語及び表現は特段の記載が無い限りそれらに割り付けられた意味を有するものとする。
【0019】
「CD70結合剤」及び「抗CD70結合剤」という用語は本明細書においては、抗CD70抗体、抗CD70抗体の誘導体又はフラグメント、又はCD70に結合しCD70結合抗体又はその誘導体の少なくとも1つのCDR又は可変領域を含む他の薬剤を意味する。
【0020】
「特異的に結合する」という用語は非抗、結合剤が高度に選択的な様態においてその相当する抗原とは反応するが、他の抗原(例えば非CD70分子)の多くとは反応しないことを意味する。
【0021】
本明細書においては、CD70結合剤に関する場合の「機能的」という用語は結合剤がCD70に結合することができることを意味する。
【0022】
「抑制する」又は「抑制」という用語は本明細書においては、測定可能な量まで低減すること、又は完全に防止することを意味する。
【0023】
「枯渇させる」という用語は、CD70発現細胞に対するCD70結合剤の作用に関する場合、CD70発現細胞の数の低減又はその消失を指す。
【0024】
「インタクトな抗体」及び「インタクトな免疫グロブリン」とは2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖よりなる典型的には約150,000ダルトンのヘテロ4量体糖蛋白として本明細書においては定義される。各軽鎖はジスルフィド結合により重鎖に連結してヘテロ2量体を形成する。ヘテロ4量体はこのようなヘテロ2量体の2つの同じ重鎖の間の共有結合ジスルフィド連結により形成される。軽鎖及び重鎖はジスルフィド結合により共に連結されているが、2つの重鎖の間のジスルフィド連結の数は免疫グロブリン(Ig)アイソタイプにより変動する。各重鎖及び軽鎖は又規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖はアミノ末端に可変ドメイン(VH)、それに続く3又は4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3及び/又はCH4)並びにCH1とCH2の間のヒンジ(J)領域を有する。各軽鎖は2つのドメイン、アミノ酸末端可変ドメイン(VL)及びカルボキシ末端定常ドメイン(CL)を有する。VLドメインはVHドメインと非共有結合的に会合しているのに対し、CLドメインは共通してCH1ドメインにジスルフィド結合を介して共有結合している。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると考えられている(Chothia et al.,1985,J.Mol.Biol.186:651−663)。
【0025】
「超可変」という用語は抗体間の配列において広範に異なっており、そして各特定の抗体のその特異的抗原決定基に対する結合及び特異性に直接関与する残基を含有する可変ドメイン内の特定の配列を指す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方における超可変性は相補性決定領域(CDR)又は超可変ループ(HVL)として知られている3セグメントに集中している。CDRはKabat et al.,1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MDにおける配列比較により定義され、一方、HVLはChothia and Lesk、1987、J.Mol.Biol.196:901〜917に記載される可変ドメインの3次元構造に従って構造的に定義される。これ等の2種の方法がCDRを僅かに異なって識別する場合は、構造的な定義のほうがこの抗しい。Kabatによる定義(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Pub.No.91−3242、US Dept.Health&Human Service,NIH,Bethesda,MD.,1991参照)によれば、CDR−L1は軽鎖可変ドメイン内の残基約24〜34、CDR−L2は残基約50〜56そしてCDR−L3は残基約89〜97に、そして重鎖の可変ドメインの約31〜35がCDR−H1に、約50〜65がCDR−H2に、そして約95〜102がCDR−H3に位置している。
【0026】
重鎖及び軽鎖の各々内の3つのCDRは低可変性の配列を含有するフレームワーク(FR)により分離されている。重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、FR及びCDRはFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4の順序に配置している。FRの概ねβシートの配置により、鎖の各々の内部のCDRは相互に、そして他の鎖のCDRに対し、極めて近接する。結果として生じるコンホーメーションは抗原結合部位に寄与している(Kabat et al.,1991,NIH Publ.No.91−3242,Vol.I,p.647−669参照)が、全てのCDR残基が必ずしも抗原結合に直接関与するわけではない。
【0027】
FR残基及びIg定常ドメインは典型的には抗原結合に直接関与しないが、抗原結合に寄与するか、又は、抗体エフェクター機能を媒介することができる。一部のFR残基は少なくとも3つの態様において、即ちエピトープに直接非共有結合的に結合することにより、CDR残基1つ以上と相互作用することにより、及び、重鎖及び軽鎖の間の界面に影響することにより、抗原結合に対する顕著な作用を有することができる。定常ドメインは種々のIgエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)、補体依存性細胞性細胞毒性(CDC)及び/又は抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)における抗体の関与を媒介する。
【0028】
脊椎動物の軽鎖を定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)及びラムダ(λ)と称される2つの明確に異なった片の1つに割り付けることができる。比較のために、哺乳類免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って以下の5種の主要なクラス、即ち、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMに割り付けられる。IgG及びIgAは更にサブクラス(アイソタイプ)例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に分割される。免疫グロブリンの種々のクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。ネイティブの免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。
【0029】
「抗体」、「抗CD70抗体」、「ヒト化抗CD70抗体」及び「改変体ヒト化抗CD70抗体」という用語は本明細書においては、最も広範な意味において使用され、そして特に完全長のネイティブの抗体、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)及び抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば可変ドメイン及び所望の生物学的活性、例えばCD70結合を示す抗体の他の部分を包含する。
【0030】
「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し;即ち、集団を構成する個々の抗体は僅かな量において存在するかもしれない天然に存在する突然変異を除き同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、エピトープとも称される一の抗原決定基に指向されている。修飾語「モノクローナル」とは同一のエピトープに指向された抗体の実質的に均質な集団を示すものであり、何れかの特定の方法による抗体の生産を要求するものではない。モノクローナル抗体は当該分野で知られた何れかの手法又は方法;例えばKohler et al.,1975,Nature 256:495により最初に報告されたハイブリドーマ法、又は当該分野で知られた組み換えDNA法(例えば米国特許4,816,567参照)により製造できる。別の例においては、モノクローナル抗体はClackson et al.,1991,Nature 352:624−628及びMarks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581−597に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【0031】
一方、ポリクローナル抗体の製造における抗体は典型的には免疫グロブリンのアイソタイプ及び/又はクラスの不均質な集団であり、そして種々のエピトープ特異性を示す。
【0032】
「キメラ」抗体という用語は本明細書においては、重鎖及び/又は軽鎖の領域又はドメインの1つ以上におけるアミノ酸配列の一部又は全体が別の種由来、又は別の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプに属するか、又はコンセンサス配列由来のモノクローナル抗体の中の相当する配列と同一、相同又はその改変体であるモノクローナル抗体の型である。キメラ抗体はそのような抗体のフラグメントを包含するが、ただし抗体フラグメントはその親抗体の望ましい生物学的活性、例えば同じエピトープへの結合を示さなければならない(例えば米国特許4,816,567;及びMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855参照)。キメラ抗体を製造するための方法は当業者の知る通りである。(例えばMorrison,1985,Science 229:1202;Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214;Gillies et al.,1989,J.Immunol.Methods 125:191−202;米国特許5,807,715;4,816,567;及び4,816,397参照)。
【0033】
「抗体フラグメント」、「抗CD70抗体フラグメント」、「ヒト化抗CD70抗体フラグメント」及び「改変体ヒト化抗CD70抗体フラグメント」という用語は可変領域又は機能的能力、例えば特異的CD70エピトープ結合が保持されている完全長抗CD70抗体の一部分を指す。抗体フラグメントの例は限定しないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv及びscFv−Fcフラグメント、ダイアボディ、トリアボディー、直鎖抗体、1本鎖抗体及び抗体フラグメントから形成される他の多重特異性抗体を包含する(Holliger and Hudson,2005,Nat.Biotechnol.23:1126−1136参照)。
【0034】
「1本鎖Fv」即ち「scFv」抗体フラグメントは抗体のVH及びVLドメインを含む1本鎖Fv改変体であり、この場合ドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在し、そしてこれは抗原を認識して結合することができる。scFvポリペプチドは場合により、scFvが抗原結合の為の望ましい三次元構造の形成を可能にするVH及びVLドメインの間に位置するポリペプチドリンカーを含有する(例えば、Pluckthun,1994,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315)。
【0035】
「ダイアボディ」という用語は2つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指す。各フラグメントは軽鎖可変ドメイン(VL)と連鎖状となった重鎖可変ドメイン(VH)を含有し、VH−VL又はVL−VHポリペプチドを形成している。同じ鎖上の2ドメインの間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、連結されたVH−VLドメインはもう一方の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させられ、これにより2つの抗原結合部位が生じる。ダイアボディは例えばEP404097;WO93/11161;及びHollinger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448により詳細に説明されている。
【0036】
「直鎖状抗体」という用語は抗原結合領域の対を形成する直列のFdセグメントの対(VH−CH1−VH−CH1)を含む抗体を指す。直鎖状抗体はZapata et al.,1995,Protein Eng.8(10):1057−1062に記載のように二重特異性又は単一特異性であることができる。
【0037】
「ヒト化抗体」とは所定の抗原に結合することができ、そして、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRを有する可変領域ポリペプチド鎖を含む免疫グロブリンアミノ酸配列改変体又はそのフラグメントを指す。
【0038】
一般的に、ヒト化抗体は非ヒトの原料からそこに導入されたアミノ酸残基1つ以上を有する。これ等の非ヒトアミノ酸残基は本明細書においては、「インポート」残基と称し、これは典型的には「インポート」抗体ドメイン、特に可変ドメインから取られる。インポート残基、配列又は抗体は所望の親和性及び/又は特異性、又は、本明細書において考察する他の所望の抗体生物学的活性を有する。
【0039】
一般的に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの全てを実質的に含むことになり、その場合、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当し、そして、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列、例えばコンセンサス又は生殖細胞系の配列由来のそれらとなる。ヒト化抗体は場合により典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンFcドメインの少なくとも一部分を含むことにもなる。例えば抗体は軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有してよい。抗体はまた適宜、重鎖のCH1、ヒンジ(J)、CH2、CH3及び/又はCH4領域を包含してよい。
【0040】
ヒト化抗体は何れかのクラスの免疫グロブリン、例えばIgM、IgG、IgD、IgA及びIgE、及び何れかのアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4から選択することができる。定常領域又はドメインは例えば、ヒト化抗体が細胞毒性活性を示すことが望ましい(例えばIgG1)補体固定定常ドメインを包含できる。そのような細胞毒性が望まれない場合は、定常ドメインは別のクラス(例えばIgG2)のものであってよい。ヒト化抗体は1つより多いクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでよく、そして所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは当業者の知る通りである。
【0041】
ヒト化抗体のFR及びCDR領域は親配列に厳密に相当している必要はなく、例えば、インポートCDR又はコンセンサスFRは少なくとも1つの残基の置換、挿入又は欠失により改変されていることによりその部位におけるCDR又はFR残基がコンセンサス又はインポート抗体の何れにも相当しなくなってもよい。このような突然変異は典型的には広範にならない。通常はヒト化抗体の残基の少なくとも75%、より頻繁には少なくとも90%、最も頻繁には95%超が親FR及びCDR配列のものに相当する。
【0042】
「抗体エフェクター機能」という用語は本明細書においては、IgのFcドメインにより寄与される機能を指す。このような機能は例えば抗体依存性細胞性細胞毒性、抗体依存性細胞性貪食作用又は補体依存生細胞毒性であることができる。このような機能は、例えば貪食又は細胞溶解活性を有する免疫細胞上のFc受容体へのFcエフェクタードメインの結合により、又は、補体系の成分へのFcドメインの結合により発揮されることができる。典型的には、Fc結合細胞又は補体成分により媒介される作用はCD70標的細胞の抑制及び/又は枯渇をもたらす。如何なる特定の理論にも制約されないが、抗体のFc領域はFc受容体(FcR)発現細胞をリクルートし、それらを抗体コーティング標的細胞と並置させることができる。FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD64)を包含するIgGに対する表面FcRを発現する細胞はIgGコーティング細胞の検出のためのエフェクター細胞として作用することができる。このようなエフェクター細胞は単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及び好酸球を包含する。IgGによるFcγRのエンゲージメントは抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)及び/又は抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)を活性化させる。ADCCは膜細孔形成蛋白及びプロテアーゼの分泌を介してCD16+エフェクター細胞により媒介され、貪食作用はCD32+及びCD64+エフェクター細胞により媒介される(Fundamental Immunology,4th ed.,Paul ed.,Lippincott−Raven,N.Y.,1997,Chapters 3,17,30;Uchida et al.,2004,J.Exp.Med.199:1659−69;Akewanlop et al.,2001,Cancer Res.61:4061−65;Watanabe et al.,1999,Breast Cancer Res.Treat.53:199−207参照)。ADCC及びADCPの他に、細胞結合抗体のFc領域はまた補体依存性細胞毒性(CDC)を示す補体の古典的な経路を活性化させることができる。補体系のC1qは、抗体が抗原と複合体形成する場合にそのFc領域に結合する。細胞結合抗体へのC1qの結合はC4及びC2の蛋白分解活性を包含する事象のカスケードを開始させ、C3コンバターゼを生成することができる。C3コンバターゼによるC3からC3bへの分解によりC5b、C6、C7、C8及びC9を包含する末端補体成分の活性化が可能になる。全体として、これ等の蛋白は抗体コーティング細胞上の膜攻撃複合体細孔を形成する。これ等の細孔が細胞膜の一体性をはかいし、標的細胞を殺傷する(Immunobiology,6th ed.,Janeway et al.,Garland Science,N.Y.,2005,Chapter 2)。
【0043】
「抗体依存性細胞性細胞毒性」即ちADCCという用語は細胞溶解活性を保有する免疫細胞(エフェクター細胞とも称する)との抗体コーティング標的細胞の相互作用に依存した細胞死を誘導するための機序である。そのようなエフェクター細胞はナチュラルキラー細胞、単球/マクロファージ及び好中球を包含する。エフェクター細胞は、標的細胞に結合したIgのFcエフェクタードメインに、それらの抗原複合化部位を介して結合する。抗体コーティング標的細胞の死滅はエフェクター細胞活性の結果として生じる。
【0044】
「抗体依存性細胞性貪食作用」即ちADCPという用語はIgのFcエフェクタードメインに結合する貪食性免疫細胞(例えばマクロファージ、好中球及び樹状細胞)により、抗体コーティング細胞が全体的又は部分的に内在化される過程を指す。
【0045】
「補体依存性細胞性細胞毒性」即ちCDCという用語は、標的結合抗体のFcエフェクタードメインが標的細胞膜内の孔部の形成を最終的にもたらす酵素反応のシリーズを活性化させる細胞死を誘導するための機序を指す。典型的には、抗体コーティング標的細胞上にあるもののような抗原−抗体複合体が補体成分C1qに結合して活性化し、次にこれが標的細胞死をもたらす補体カスケードを活性化する。補体の活性化は又、白血球上の補体受容体(例えばCR3)に結合することによりADCCを促進する標的細胞表面上への補体成分の付着ももたらす。
【0046】
「免疫細胞」とは本明細書においては、免疫応答の調節に関与している造血細胞系統の細胞を指す。典型的な実施形態においては、免疫細胞はTリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、単球/マクロファージ又は樹状細胞である。
【0047】
「エフェクター細胞」という用語は本明細書においては、免疫グロブリンのFcドメインに対する表面受容体(FcR)を発現する細胞を指す。例えば、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD64)を包含するIgGに対する表面FcRを発現する細胞がエフェクター細胞として作用できる。このようなエフェクター細胞は単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及び好酸球を包含する。
【0048】
「治療薬」とは癌細胞、活性化免疫細胞又は他の標的細胞集団に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を示す薬剤である。治療薬の例は細胞毒性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤及び免疫調節剤を包含する。
【0049】
「細胞毒性作用」とは標的細胞の枯渇、排除及び/又は殺傷を指す。細胞毒性剤とは細胞に対して細胞毒性作用を有する薬剤を指す。用語は放射性同位体(例えばI131、I125、Y90及びRe186)、化学療法剤及び毒素、例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素活性毒素及びこれ等のフラグメントを包含することを意図している。このような細胞毒性剤は、抗体、例えばヒト化抗CD70抗体とカップリングさせることができ、そして例えば治療の適応症患者を治療するために使用できる。1つの実施形態において、「細胞毒性剤はモノクローナル抗体、例えば本明細書に記載するヒト化抗体と組み合わせて使用される抗体を包含する。
【0050】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例はアルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANTM);アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ;エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミド及びトリメチロールメラミン;アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(例えば合成類縁体トポテカン);ブリオスタチン;カリスタチン;CC−1065(例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体)及びその誘導体;クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;オーリスタチン(例えば類似のモノメチルオーリスタチンE及びモノメチルオーリスタチンF(例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる2005年10月27日公開の米国特許出願2005−0238649参照));デュオカルマイシン(例えば合成類縁体、KW−2189及びCB1−TM1);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンジスタチン;窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムブシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン;抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えばカリケミシン、特にカリケミシンガンマ1I及びカリケミシンファイI1、例えばAgnew,Chem. Intl.Ed.Engl.,33:183−186参照;ジネマイシン、例えばジネマイシンA;ビスホスホネート、例えばクロドロネート;エスペラミシン;並びにネオカルイジノスタチン発色段及び関連の色素蛋白エネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン(AdriamycinTM)(例えばモルホリノススドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、マイコフェノール酸、ノガラマイシ、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU);葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類縁体、例えばフルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン、フロクスイジン;アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補給物、例えばフロリニック酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デホファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルホルニチン;エリプチニウムアセテート;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2毒素、ベラクリンA、ロリジンA及びアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer、Antony,France);クロランブシル;ゲムシタビン(GemzarTM);6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン(NavelbineTM);ノバントロン;テニポシド;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセロダ;イバンドロネート;CPT−11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えばレチン酸;カペシタビン;及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体を包含する。この定義に同様に包含されるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は抑制する作用を有する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、例えばタモキシフェン(例えばNolvadexTM)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びトレミフェン(FarestonTM);副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば4(5)−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート(MegaceTM)、エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール(RivisorTM)、レトロゾール(FemaraTM)及びアナストロゾール(ArimidexTM);及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン;及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体である。
【0051】
「プロドラッグ」という用語は本明細書においては、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対して低細胞毒性であるが酵素的に活性化されるか、又はより活性な親化合物型に変換されることができる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の型を指す。例えばWilman,,1986,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375−386,615th Meeting Belfast;及び、Stella et al.,1985,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.,),pp.247−267,Humana Pressを参照できる。有用なプロドラッグは限定しないが、より活性な細胞毒性の遊離の薬剤に変換されることができるホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ及び場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5−フルオロシトシン及び他の5−フルオロウリジンプロドラッグを包含する。プロドラッグ型に誘導できる細胞毒性剤の例は限定しないが上記した化学療法剤を包含する。
【0052】
「細胞毒性作用」とは細胞の増殖の抑制を指す。「細胞毒性剤」とは細胞に対して細胞毒性作用を有し、これにより細胞の特定のサブセットの成育及び/又は増殖を抑制する薬剤を指す。
【0053】
「免疫調節性作用」という用語は本明細書においては、免疫学的応答の発生又は維持の刺激(免疫刺激)又は抑制(免疫抑制)を指す。抑制は例えば免疫細胞(例えばT又はBリンパ球)の排除;他の細胞の機能的能力をモジュレート(例えばダウンレギュレート)することができる免疫細胞の誘導又は形成;免疫細胞における未応答状態(例えばアネルギー)の誘導;又は免疫細胞の活性又は機能を増大、低減又は変化させること、例えばこれ等の細胞により発現される蛋白のパターンを改変すること(例えば特定のクラスの分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、同時刺激分子又は他の細胞表面受容体等の改変された生成及び/又は分泌)により行うことができる。「免疫調節剤」とは細胞に対する免疫調節作用を有する薬剤を指す。一部の実施形態においては、免疫調節剤は免疫応答を促進する免疫細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を有する。
【0054】
「標識」という用語は抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能(例えば放射性同位体標識又は蛍光標識)であってよく、又は酵素標識の場合は検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。標識された抗CD70抗体を作成し、そして種々の用途、例えばインビトロ及びインビボの診断に使用することができる。
【0055】
「単離された」核酸分子は核酸の天然の原料中においてそれが通常会合している強z巣夾雑核酸分子少なくとも1つから識別され、分離されている核酸分子である。単離された核酸分子はそれが天然に存在する形態又は状況とは異なる。従って単離された核酸分子はそれが天然の細胞中に存在する場合の核酸分子とは区別されるものである。しかしながら、単離された核酸分子は、核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置にあるような、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子を包含する。
【0056】
「制御配列」という用語は特定の宿主生物において作動可能に連結下コーディング配列の発現の為に必要なポリヌクレオチド配列を指す。原核生物における使用に適する制御配列は例えばプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位の配列を包含する。真核生物の制御配列は限定しないが、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを包含する。これ等の制御配列は原核生物及び真核生物の宿主細胞における抗CD70結合剤の発現及び生成の為に使用することができる。
【0057】
核酸はそれが別の核酸配列との機能的関連性の内部におかれる場合に「作動可能に連結」されている。例えば核酸のプレ配列又は分泌リーダーは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白として発現される場合にはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結しており;プロモーター又はエンハンサーはそれが配列の転写に影響する場合にはコーディング配列に作動可能に連結しており;又は、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置付けられている場合にコーディング配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結した」とは、連結されるDNA配列が隣接しており、そして、分泌リーダーの場合は隣接し、そして読み込み期にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを用いてDNA配列を連結することができる。
【0058】
「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体及びその等価物を指し、そして生成物の特定の長さを指すわけではなく;即ち、「ペプチド」及び「蛋白」はポリペプチドの定義に包含される。ポリペプチドの定義に同様に包含されるものは本明細書に定義した「抗体」である。「ポリペプチド領域」とはポリペプチドのセグメントを指し、そのセグメントは例えばドメイン又はモチーフの1つ以上を含有してよい(例えば抗体のポリペプチド領域は例えば相補性決定領域(CDR)1つ以上を含有することができる)。「フラグメント」という用語は、典型的にはポリペプチドの少なくとも20隣接又は少なくとも50隣接アミノ酸を有するポリペプチドの一部分を指す。「誘導体」とは第2のポリペプチドと相対比較して非保存的又は保存的なアミノ酸置換1つ以上を有するポリペプチド又はそのフラグメント;又は、第2の分子の共有結合により、例えば非相同ポリペプチドの結合により、又はグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等により、修飾されたポリペプチド又はそのフラグメントである。「誘導体」の定義に更に包含されるものは、例えばアミノ酸の類縁体(例えば非天然アミノ酸等)1つ以上を含有するポリペプチド、未置換の連結部又は当該分野で知られた他の修飾を有するポリペプチドであって、天然及び非天然存在の両方のものである。
【0059】
「単離された」ポリペプチドとはその天然の環境の成分から識別及び分離及び/又は回収されているものである。その天然の環境の夾雑成分はポリペプチドの診断上又は治療上の使用を妨害する可能性のある物質であり、そして酵素、ホルモン及び他の蛋白性及び非蛋白性の溶質である。単離されたポリペプチドは単離された抗体、又はそのフラグメント又は誘導体を包含する。「抗体」は組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含するが、その理由は抗体の天然の環境の成分少なくとも1つが存在しないためである。
【0060】
特定の実施形態においては抗体は、(1)Lowry法により測定した場合に抗体95重量%超まで、他の態様においては99重量%超まで、(2)スピニングカップシーケネーターを用いてN末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度まで、又は、(3)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下のSDS−PAGEによる均質性となる程度まで精製される。
【0061】
「非相同」という用語は、ポリペプチドに関する場合、別のポリペプチドと比較した場合に異なる原料(例えば細胞、組織、生物又は種)由来であるために2つのポリペプチドが異なることを意味する。典型的には、非相同ポリペプチドは異なる種に由来する。
【0062】
免疫グロブリン又はそのフラグメントに関する場合、「保存的置換」とは、抗原への免疫グロブリンポリペプチド又はそのフラグメントの特異的結合(例えばKDにより測定した場合)を大きく低減しない1つ以上のアミノ酸の置換を意味する(即ち結合親和性を増大させる、結合親和性を大きく改変する、又は、結合親和性を、例えばELISAのような標準的な結合試験により測定した場合に約40%以下、典型的には約30%以下、より典型的には約20%以下、皿により典型的には約10%以下、又は最も典型的には約5%以下低減する置換)。
【0063】
「同一」又は「パーセント同一性」という用語は、核酸又はポリペプチド配列2つ以上に関する場合、同じであるか、又は、最大の相応性が得られるように比較してアラインした場合に同じである核酸又はアミノ酸残基の特定のパーセントを有する、2つ以上の配列又はサブ配列を指す。パーセント同一性を調べるためには、配列を最適な比較目的の為にアラインする(例えば第1のアミノ酸又は核酸配列の配列に、第2のアミノ酸又は核酸配列との最適なアライメントの為にギャップを導入することができる)。次に相当するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が第2の配列の相当する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されている場合、分子はその位置において同一である。2配列間のパーセント同一性は配列により共有される同一位置の数の関数である(即ち%同一性=同一位置数/位置総数(例えばオーバーラップ位置)x100)。一部の実施形態においては、2配列は同じ長さである。
【0064】
「実質的に同一」という用語は、2つの核酸又はポリペプチドに関する場合、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%又は少なくとも65%の同一性;典型的には少なくとも70%又は少なくとも75%の同一性;より典型的には少なくとも80%又は少なくとも85%の同一性;更により典型的には少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%の同一性を有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す(例えば後述する方法の1つにより測定した場合)。
【0065】
「同様性」又は「パーセント同様性」という用語は、ポリペプチド配列2つ以上に関する場合、後述する方法の1つを用いて測定した場合に、最大の相応性が得られるように比較してアラインした場合に同じか又は保存的に置換されているアミノ酸残基の特定のパーセントを有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す。例えば、第1のアミノ酸配列は、第1の配列に含有される数と等しいアミノ酸数と比較した場合に、又は、例えば後述する方法の1つによりアラインされているポリペプチドのアライメントと比較した場合に、第1のアミノ酸配列が第2のアミノ酸配列に少なくとも50%、60%、70%、80%、90%又は95%同一又であるか保存的に置換されている場合に、第2のアミノ酸配列と同様と考えることができる。
【0066】
「実質的同様性」又は「実質的に同様である」という用語は、ポリペプチド配列に関する場合、ポリペプチド領域が少なくとも70%、典型的には少なくとも80%、より典型的には少なくとも85%、又は少なくとも90又は少なくとも95%の比較対照配列との同様性を有することを示す。例えば、あるポリペプチドは、第2のポリペプチドに対し、例えば2つのペプチドが保存的置換1つ以上により異なる場合には、実質的に同様となる。
【0067】
抗CD70抗体又はその誘導体に関する場合、抗CD70抗体の抗原結合領域(例えば重鎖又は軽鎖の可変領域又は重鎖又は軽鎖のCDR)1つ以上と実質的に同一又は実質的に同様であるポリペプチド領域1つ以上を有する蛋白は、当該分野で知られた、又は本明細書で言及する種々の標準的な免疫学的検定試験のいずれかを用いて測定した場合に、抗CD70抗体により認識されるCD70のエピトープへの特異的結合を保持している。
【0068】
2つの配列の間のパーセント同一性又はパーセント同様性の測定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2つの配列の比較の為に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877に記載の通り変更されたKarlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはAltschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403−410のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラム、スコア=100、ワードレングス=12により実施することができ、これにより、目的の蛋白をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLAST蛋白検索はXBLASTプログラム、スコア=50、ワードレングス=3により実施することができ、これにより、目的の蛋白に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的の為にギャップのあるアライメントを得るためには、Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載の通りGappedBLASTを利用できる。或いは、PSI−Blastを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる(Id)。BLAST、GappedBLAST及びPSI−Blastプログラムを使用する場合は、対応するプログラム(例えばXBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用できる。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの他の非限定的な例はMyers and Miller,CABIOS(1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはGCG配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティー12及びギャップペナルティー4を使用できる。配列分析のための別のアルゴリズムは当業者の知る通りであり、そしてTorellis and Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3−5に記載されているADVANCE及びADAM;及びPearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444−8に記載されているFASTAを包含する。FASTA内では、ktupは検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ktup=2の場合、比較するべき2配列における同様の領域はアラインされた残基のペアを見ることにより発見され;ktup=1の場合、シングルのアラインされたアミノ酸が調べられる。ktupは蛋白配列の場合は2又は1に、又はDNA配列の場合は1〜6に設定できる。ktupが特定されない場合はデフォルトは蛋白の場合2、DNAの場合は6となる。或いは、蛋白配列アライメントはHiggins et al.,1996,Methods Enzymol.266:383−402に記載されているCLUSTALWアルゴリズムを用いて実施してよい。
【0069】
本明細書においては、「細胞」、「細胞系統」及び「細胞培養物」という表現は互換的に私用され、全てこのような標記はその子孫を包含するものとする。即ち、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は元の該当細胞及び形質転換回数とは無関係にそれから誘導された培養物を包含する。全ての子孫は、意図的又は天然に生じた突然変異により、DNA含量において厳密に同一である必要はない。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫は包含される。異なる標記を意図する場合は文脈より明確化される。
【0070】
治療の目的のためには「対象」という用語は何れかの動物、特に哺乳類に分類される動物、例えばヒト、家畜及び牧畜動物、及び、動物園、競技用又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を指す。好ましくは、対象はヒトである。
【0071】
本明細書における「障害」、及び「CD70関連障害」及び「CD70関連疾患」という用語は本明細書に記載した抗CD70結合剤を用いた治療から利益を被る何れかの状態を指す。「CD70関連障害」及び「CD70関連疾患」は典型的には細胞表面上出CD70又はそのフラグメントを発現する。これには問題となる障害に哺乳類を罹患しやすくする病理学的状態を包含する慢性及び急性の障害又は疾患が包含される。本発明において治療されるべき障害の非限定的な例は、癌、血液学的悪性疾患、良性及び悪性の腫瘍、白血病及びリンパ様悪性疾患、癌腫及び炎症性、血管形成性及び免疫学的な障害を包含する。障害の特定の例は後に開示する。
【0072】
「治療」及び「施療」等の用語は、本明細書においては、疾患の症状1つ以上の軽減又は緩解、後退、進行の緩徐化又は停止を包含するがこれ等に限定されない、何れかの臨床上望ましいか有益である作用をもたらす、疾患又は障害に対する治療的並びに予防的、又は抑制的な手段を包含する意味を有する。即ち、例えば治療という用語は疾患又は障害の症状の発生の前又は後に薬剤を投与することにより疾患又は障害の全ての兆候を防止又は除去することを包含する。別の例として、用語は疾患の症状に対抗するために疾患の臨床的顕在化の後に薬剤を投与することを包含する。更に又、治療が疾患の緩和をもたらすか否かに関わらず、組織傷害の程度又は転移の量又は範囲のような、疾患又は障害の臨床パラメーターに投与が影響する発症後及び臨床兆候発生後の薬剤投与も、本明細書においては「治療」又は「施療」に相当する。
【0073】
本明細書においては、「防止」又は「防止する」という用語は(a)CD70発現癌又は免疫学的障害又はその臨床上又は診断上の症状の1つ以上の出現又は発症をブロックするため、(b)CD70発現癌又は免疫学的障害の発症の重症度を抑制するため、又は(c)CD70発現癌又は免疫学的障害の発症の可能性を低下させるために、CD70発現癌又は免疫学的障害の臨床上又は診断上の症状の発症の前に対象に抗CD70結合剤を投与すること(例えばCD70発現癌又は免疫学的障害の獲得の素因を有するかハイリスクである個体への投与)を指す。
【0074】
「静脈内注入」という用語は薬剤、例えば治療薬を、約15分間、一般的に約30〜90分の時間に渡って動物又はヒト患者の静脈内に導入することを指す。
【0075】
「静脈内瞬時」又は「静脈内圧注」という用語は約15分以下、一般的に5分以下で薬剤を身体が受容するように動物又はヒトの静脈内に薬剤を投与することを指す。
【0076】
「皮下投与」という用語は比較的緩徐な、持続した薬剤からの送達により、典型的には皮膚と下部組織との間のポケット内において、動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤、例えば治療薬を導入することを指す。皮膚を摘んで下部組織から離れるように引き上げることによりポケットが形成される。
【0077】
「添付文書」という用語は治療用製品の市販用パッケージ内に慣用的に包含される説明書を指し、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与、禁忌及び/又は警告を含んでいる。
【0078】
「リポソーム」は哺乳類への薬剤(例えば抗体)の送達の為に有用な脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤の種々の型よりなる小胞である。リポソームの成分は生体膜の脂質配置と同様に一般的に二層形態に配置している。
【0079】
「皮下注入」という用語は例えば限定しないが30分以下、又は90分以下の時間、薬剤レセプタクルからの比較的緩徐な、持続した送達により、好ましくは皮膚と下部組織との間のポケット内において、動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤を導入することをさす。場合により、注入は動物又はヒト患者の皮膚下部にインプラント処置された薬剤送達ポンプの皮下移植により行ってよく、その場合、ポンプは所定期間、例えば30分間、90分間又は治療計画の長期に渡る期間、所定量の薬剤を送達する。
【0080】
「皮下ボーラス投与」という用語は動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤を投与することを指し、この場合ボーラス投与薬物送達は約15分以下;別の態様においては5分以下、そして更に別の態様においては60秒以下となる。更に別の態様においては、投与は皮膚と下部組織との間のポケット内において行い、その場合、ポケットは、皮膚を摘んで下部組織から離れるように引き上げることにより形成してよい。
【0081】
「有効量」という用語は対象におけるCD70発現癌又は免疫学的障害の臨床上又は診断上の症状1つ以上の出現の抑制又は緩和の為に十分な抗CD70結合剤(例えば抗体又は誘導体又は他の結合剤)の量を指す。薬剤の有効量は「有効用法」において本明細書で説明する方法に従って投与する。「有効用法」という用語はCD70発現癌又は免疫学的障害の治療又は防止を達成するために十分な薬剤の量と投薬頻度の組合せを指す。
【0082】
「治療有効量」という用語は有益な患者転帰、例えば細胞の成育停止作用又は枯渇を有する治療薬の量を指すために使用する。1つの態様において、治療有効量はアポトーシス活性を有するか、細胞死を誘導することができる。別の態様においては、治療有効量は例えば疾患の進行を緩徐化させる場合に有効なことが判っている標的血清中濃度を指す。薬効は治療すべき状態に応じて従来の方法において測定してよい。例えばCD70を発現する細胞を態様とする新生物形成性の疾患又は障害においては、薬効は疾患進行までの時間(TTP)を試験するか、又は、応答率(RR)を測定することにより調べることができる。
【0083】
「製薬上許容しうる」という用語は本明細書においては、連邦又は州政府の規制当局により認可されるか、又は、合衆国薬局方又は他の一般的に認知された動物、特にヒトにおける使用に関する薬局方に掲載されていることを意味する。「薬学的に適合性のある成分」という用語は、抗CD70結合剤が共に投与される製薬上許容しうる希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。
【0084】
「製薬上許容しうる塩」という表現は本明細書においては、抗CD70結合剤又は治療薬の製薬上許容しうる有機又は無機の塩を指す。抗CD70結合剤又は治療薬は少なくとも1つアミノ基をがんゆうし、従って、酸付加塩はこのアミノ基又は他の適当な基を用いて形成できる。例示される塩は限定しないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、集荷物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩(即ち1,1’−メチレンビス−(2−ヒドロキシ−3−ナフトエート))の塩類を包含する。製薬上許容しうる塩は酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンのような別の分子の包含も行ってよい。対イオンは親化合物上の電荷を安定化させる何れかの有機又は無機の部分であってよい。更に又、製薬上許容しうる塩はその構造中に荷電した原子1つより多くを有してよい。複数の荷電原子が製薬上許容しうる塩の部分である場合には複数の対イオンを有することができる。従って製薬上許容しうる塩は1つ以上の荷電原子及び/又は1つ以上の対イオンを有することができる。
【0085】
「製薬上許容しうる溶媒和物」又は「溶媒和物」とは溶媒分子1つ以上と抗CD70結合剤及び/又は治療薬の会合を指す。製薬上許容しうる溶媒和物を形成する溶媒の例は、限定しないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンを包含する。
【0086】
「AFP」という略記はジメチルバリン−バリン−ドライソロイシ−ドラプロリン−フェニルアラニン−p−フェニレンジアミンを指す。
【0087】
「MMAE」という略記はモノメチルオーリスタチンEを指す。
【0088】
「AEB」という略記はパラアセチル安息香酸にオーリスタチンEを反応させることにより生成するエステルを指す。
【0089】
「AEVB」という略記はベンゾイル吉草酸にオーリスタチンEを反応させることにより生成するエステルを指す。
【0090】
「MMAF」という略記はドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニンを指す。
【0091】
「fk」および「phe−lys」という略記はリンカーフェニルアラニン−リジンを指す。
II.抗CD70抗体及びその誘導体
本明細書に記載した組成物及び方法はCD70に特異的に結合するCD70結合剤の使用を包含する。CD70結合剤はCD70発現癌細胞、活性化免疫細胞又は他の標的細胞に対し、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を発揮する。CD70結合剤は例えば抗CD70抗体、抗CD70抗体の抗原結合フラグメント、その誘導体、又は、CD70結合抗体の相補性決定領域(CDR)少なくとも1つを含む他のCD70結合剤であることができる。
【0092】
1つの態様において、CD70結合剤はモノクローナル抗体1F6の相補性決定領域(CDR)1つ以上に同一、実質的に同一又は実質的に同様のCDR1つ以上を含む。(1F6の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ配列番号1及び配列番号2、及び、配列番号21及び配列番号22に示す通りであり、そして、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願WO04/073656に開示されている。)例えば、結合剤はmAb1F6の相当する重鎖CDR(H1、H2又はH3領域)又は相当する軽鎖CDR(L1、L2又はL3領域)と同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR及び/又は軽鎖CDRを包含できる。典型的な実施形態においては、抗CD70結合剤はmAb1F6の相当する重鎖及び/又は軽鎖のCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である2つ又は3つの重鎖CDR及び/又は2つ又は3つの軽鎖CDRを有する。
【0093】
例えば、一部の実施形態においては、抗CD70結合剤がmAb1F6の重鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR少なくとも1つを有する場合は、結合剤は更にmAb 1F6の軽鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である軽鎖CDR少なくとも1つを包含することができる。
【0094】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤は重鎖又は軽鎖の可変ドメインを包含し、可変ドメインは、(a)mAb 1F6の相当するCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である3つのCDRのセット、及び(b)ヒト免疫グロブリン由来の4つの可変領域フレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗CD70抗体は重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインを包含することができ、可変ドメインは(a)CDRのセットがモノクローナル抗体I6F由来である3つのCDRのセット、及び(b)ヒトIgGから誘導された4つのフレームワーク領域のセットを有する。抗体は場合によりヒンジ領域を包含できる。例示される実施形態においては抗CD70抗体は完全にヒト化された抗体である。
【0095】
別の態様において、CD70結合剤はモノクローナル抗体2F2の相補性決定領域(CDR)1つ以上に実質的に同一又は実質的に同様のCDR1つ以上を含む。(2F2の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ配列番号27及び配列番号28、及び、配列番号29及び配列番号30に示す通りであり、そして、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願WO04/073656に開示されている。)例えば、結合剤はmAb 2F2の相当する重鎖CDR(H1、H2又はH3領域)又は相当する軽鎖CDR(L1、L2又はL3領域)と同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR及び/又は軽鎖CDRを包含できる。典型的な実施形態においては、抗CD70結合剤はmAb 2F2の相当する重鎖及び/又は軽鎖のCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である2つ又は3つの重鎖CDR及び/又は2つ又は3つの軽鎖CDRを有する。
【0096】
例えば、一部の実施形態においては、抗CD70抗体がmAb 2F2の重鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR少なくとも1つを有する場合は、抗体又はその誘導体は更にmAb 2F2の軽鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である軽鎖CDR少なくとも1つを包含することができる。
【0097】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤は重鎖又は軽鎖の可変ドメインを包含し、可変ドメインは、(a)mAb 2F2の相当するCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である3つのCDRのセット、及び(b)ヒト免疫グロブリン由来の4つの可変領域フレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗CD70抗体は重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインを包含することができ、可変ドメインは(a)CDRのセットがモノクローナル抗体2F2由来である3つのCDRのセット、及び(b)ヒトIgGから誘導された4つのフレームワーク領域のセットを有する。抗体は場合によりヒンジ領域を包含できる。例示される実施形態においては抗CD70抗体は完全にヒト化された抗体である。
【0098】
一部の実施形態においては、フレームワーク領域はヒト生殖細胞系統のエキソンVH、JH、Vκ及びJκの配列から選択される。例えばc1F6VHドメインのFRのヒト化のためのアクセプター配列は生殖細胞系統のVHエキソンVH1−18(Matsuda et al.,1993,Nature Genetics 3:88−94)又はVH1−2(Shin et al.,1991,EMBO J.10:3641−3645)及びヒンジ領域(JH)についてはエキソンJH−6(Mattila et al.,1995,Eur,J.Immunol.25:2578−2582)から選択できる。他の実施形態においては生殖細胞系統VκエキソンB3(Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827−836)及びJκエキソンJκ−1(Hieter et al.,1982,J.Biol.Chem.257:1516−1522)をc1F6 VLドメインヒト化のためのアクセプター配列として選択できる。
【0099】
一部の実施形態においては、ヒト化抗CD70抗体のフレームワーク領域の配列は使用されるアクセプターヒト生殖細胞系エキソンの誘導体、例えばマウスドナー残基が再導入されている誘導体を包含する。これ等の残基はKabatのナンバリング規則に従えばVHドメインのH46、H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82、H82A及びH91位の1つ以上におけるマウスドナー残基の再導入を包含する。
【0100】
以下の表は各配列番号が相当するヒト化1F6の領域を示す。
【0101】
【化30】
【0102】
【化31】
【0103】
【化32】
一部の実施形態においては、CD70結合剤は抗体1F6又は2F2のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントであることができる。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を有するポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む。
【0104】
一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも80%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも85%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも90%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも95%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも99%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドは抗体1F6又は2F2の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有さない。
【0105】
一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも80%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも85%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも95%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも99%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドは抗体1F6又は2F2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有さない。
【0106】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤はヒトCD70への結合に関してモノクローナル抗体1F6または2F2と競合する。一部の実施形態においてはCD70結合剤はCD70への結合時にアゴニスト性又は拮抗性のシグナルを誘導しない(例えば増殖を刺激しない)。一部の実施形態においてはCD70結合剤はCD70へのCD27の結合を少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%ブロックする。
【0107】
CD70結合剤は場合によりCD70発現標的細胞に対抗したADCC、ADCP及び/又はCDC応答を媒介又は刺激する抗体エフェクタードメインを包含する。エフェクタードメインは例えばIg分子のFcドメインであることができる。このようなCD70結合剤は、CD70発現癌細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を示すか、又は、活性化されたリンパ球又は樹状細胞に対し、例えば、それぞれCD70発現癌又は免疫学的障害の治療において、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。典型的にはCD70結合剤は細胞毒性白血球(例えばナチュラルキラー(NK)細胞、貪食細胞(例えばマクロファージ)及び/又は血清補体成分)をリクルート及び/又は活性化する。
【0108】
抗CD70抗体はヒト化抗体、1本鎖抗体、scFv、ダイアボディ、Fab、ミニボディ、scFv−Fc、Fv等であることができる。一部の実施形態においては、CD70の抗原結合領域はエフェクタードメイン、例えば免疫グロブリンのヒンジ−CH2−CH3ドメイン、エフェクター機能を有するエフェクタードメインの部分又はフラグメントに連結することができる。抗原結合抗体フラグメント、例えば1本鎖抗体は、例えばエフェクタードメインの全体又は部分と組み合わせて可変領域を含むことができる(例えばCH2及び/又はCH3ドメイン単独又はCH1、ヒンジ及び/又はCLドメインと組み合わせたもの)。更に又、抗原結合フラグメントはエフェクタードメインの何れかの組合せを含むことができる。一部の実施形態においては、抗CD70抗体はヒンジ−CH2−CH3ドメインに連結されたCD70結合可変領域を含む1本鎖抗体であることができる。
【0109】
抗CD70抗体のエフェクタードメインは何れかの適当なヒト免疫グロブリンアイソタイプ由来であることができる。例えば、CDC及びADCC/ADCPを媒介するヒト免疫グロブリンの能力は一般的にそれぞれIgM≒IgG1≒IgG3>IgG2>IgG4及びIgG1≒IgG3>IgG2/IhM/IgG4である。CD70結合ポリペプチドは所望のエフェクター機能を得るために適切な定常ドメインよりなる組み換え融合蛋白として発現させることができる。標的細胞への結合時に、抗CD70抗体又は誘導体はADCC、CDC及びADCPのような抗体エフェクター機能を介してインビトロ及びインビボの標的細胞破壊をトリガーすることができる。
【0110】
CD70結合剤は場合により治療薬、例えば細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤にコンジュゲートすることができる。
【0111】
一部の実施形態においては、抗CD70抗体は、ヒト又は非ヒトのFc領域又はその部分を含むキメラであることができる。例えば、抗体は非ヒト機嫌、例えばげっ歯類(例えばマウス又はラット)、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はサル(例えばマカク、アカゲザル等)のFcドメイン又は部分を包含できる。
【0112】
抗CD70結合剤、例えば抗体は単一特異性、二重特異性、3重特異性又はより高度な多重特異性であることができる。多重特異性抗体はCD70の種々のエピトープに対して特異的であってよく、及び/又は、CD70及び非相同蛋白の両方に対して特異性であってよい。(例えばPCT出願WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360及びWO92/05793;Tutt et al.,1991,J.Immunol.147:60−69;米国特許4,474,893;4,714,681;4,925,648;5,573,920;及び5,601,819;Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547−1553参照。)本明細書に記載した方法を実施するために有用である多重特異性抗体、例えば二重特異性及び3重特異性抗体は、CD70(例えば限定していないがモノクローナル抗体2F2及び1F6のCDRを有する抗体)及びADCC、ADCP及び/又はCDCを媒介する第2の細胞表面受容体又は受容体複合体、例えばCD16/FcγRIII、CD64/FcγRI、キラー抑制又は活性化受容体又は補体制御蛋白CD59の両方に免疫特異的に結合する抗体である。一部の実施形態においては、多重特異性抗体の部分の第2の細胞表面分子又は受容体複合体への結合は抗CD70抗体又は他のCD70結合剤のエフェクター機能を増強する場合がある。
【0113】
抗CD70抗体及びその誘導体及び他の結合剤はまたCD70へのそれらの結合親和性に関して説明又は特定してよい。典型的な結合親和性は5x10−2M、10−2M、5x10−3M、10−3M、5x10−4M、10−4M、5x10−5M、10−4M、5x10−6M、10−6M、5x10−7M、10−7M、5x10−8M、10−8M、5x10−9M、10−9M、5x10−10M、10−10M、5x10−11M、10−11M、5x10−12M、10−12M、5x10−13M、10−13M、5x10−14M、10−14M、5x10−15M又は10−15M未満の解離定数即ちKdを有するものを包含する。
【0114】
抗体は当該分野で知られた方法により形成できる。例えばモノクローナル抗体は広範な種類の手法、例えばハイブリドーマ、組み換え体及びファージディスプレイの技術又はこれ等の組合せの使用により製造できる。ハイブリドーマ手法は一般的に例えばHarlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.,1988);及びHammerling et al.,Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas,pp.563−681(Elsevier,N.Y.,1981)に記載されている。抗CD70抗体を作成するために使用できるファージディスプレイ法の例は、例えば、Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381;Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581;Quan and Carter,2002,The rise of monoclonal antibodies as therapeutics in Anti−IgE and Allergic Disease,Jardieu and Fick Jr.,eds.,Marcel Dekker,New York,NY,Chapter 20,pp.427−469;Brinkman et al.,1995,J.Immunol.Methods 182:41−50;Ames et al.,1995,J.Immunol.Methods 184:177−186;Kettleborough et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:952−958;Persic et al.,1997,Gene 187:9−18;Burton et al.,1994,Advances in Immunology 57:191−280;PCT出願PCT/GB91/01134;PCT公開WO90/02809,WO91/10737,WO92/01047,WO92/18619,WO93/11236,WO95/15982,WO95/20401及び米国特許5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743及び5,969,108(すべて参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているものを包含する。
【0115】
1本鎖抗体を作成するために使用できる手法の例は、米国特許4,946,778及び5,258,498;Huston et al.,1991,Methods in Enzymology 203:46−88;Shu et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7995−7999;及びSkerra et al.,1988,Science240:1038−1040に記載されているものを包含する。
【0116】
二重特異性抗体を作成するための方法は当業者の知る通りである。完全長二重特異性抗体の伝統的製造は2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、その場合、2つの鎖は異なる特異性を有する(Milstein et al.,1983,Nature 305:537−39)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取合せの為に、これ等のハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、これ等のうちの一部は正しい二重特異性構造を有する。応用の操作法は国際特許出願WO93/08829及びTraunecker et al.,1991,EMBO J.10:3655−59に開示されている。
【0117】
異なる方法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体−抗原複合化部位)を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。融合は典型的にはヒンジ、CH2及びCH3領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを用いる。一部の実施形態においては、融合は、融合の少なくとも1つにおいて存在する軽鎖結合の為に必要な部位を含有する第1の重鎖定常ドメイン(CH1)を包含する。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードする配列を有する核酸を別個の発現ベクターに挿入し、そして適当な宿主生物内にトランスフェクトする。これは、構築において使用される等しくない比の3種のポリペプチド鎖が最適な収率をもたらす実施形態において3種のポリペプチドフラグメントの相互の比率を調節する場合に、多大な柔軟性をもたらす。しかしながら、等しい比の少なくとも2種のポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすか、又は、比が特に重要ではない場合には、1つの発現ベクター中に2種又は3種全てのポリペプチド鎖に対するコーディング配列を挿入することが可能である。
【0118】
この方法の1つの実施形態において、二重特異性抗体は1つのアームにおいて第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び、もう1つのアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対(第2の結合特異性を与える)を有する。この非対称の構造は、二重異性分子の僅か半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離方法が可能となることから、より望ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする(例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願WO94/04690参照)。
【0119】
二重特異性抗体に関する更に詳細な考察は、例えばSuresh et al.,1986,Methods in Enzymology 121:210;Rodrigues et al.,1993,J.Immunology 151:6954−61;Carter et al.,1992,Bio/Technology 10:163−67;Carter et al.,1995,J.Hematotherapy 4:463−70;Merchant et al.,1998,Nature Biotechnology 16:677−81を参照できる。このような手法を使用することにより、二重特異性抗体を製造して本明細書に定義する疾患の治療又は防止において使用することができる。
【0120】
二官能性抗体はまた欧州特許出願EPA0105360に記載のものである。この参考文献に記載の通り、ハイブリッド又は二官能性の抗体は、生物学的に、即ち細胞融合の手法により、又は化学的に、特に交差結合剤又はジスルフィド架橋形成試薬を用いて、誘導することができ、そして抗体全体、又はそのフラグメントを含んでよい。このようなハイブリッド抗体を得るための方法は例えば参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願WO83/03679及び欧州特許出願EPA0217577に開示されている。
【0121】
一部の実施形態においては、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は抗原結合を改変、好ましくは向上させるためにCDRドナー抗体由来の相当する残基で置換される。これ等のフレームワーク置換は当該分野で良く知られている方法により、例えばCDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合及び配列比較の為に重要なフレームワーク残基を発見することにより特定の位置における通常ではないフレームワーク残基を発見することにより、発見される。(例えば米国特許5,585,089;Riechmann et al.,1988,Nature 332:323参照)。抗体は当該分野で知られた種々の手法、例えばCDRグラフティング(例えばEP0239400;PCT公開WO 91/09967;米国特許5,225,539;5,530,101;及び5,585,089)、ベニアリング又はリサーフィシング(例えばEP0592 106;EP0519596;Padlan,1991,Molecular Immunology,1991,28(4/5):489−498;Studnicka et al.,1994,Protein Engineering 7(6):805−814;Roguska et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969−973参照)及び鎖シャフリング(米国特許5,565,332参照)を用いてヒト化できる(これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる)。
【0122】
ヒト化モノクローナル抗体は当該分野で知られた組み換えDNA手法により、例えば各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開WO 87/02671;欧州特許公開184,187;欧州特許公開171496;欧州特許公開173494;国際特許公開WO 86/01533;米国特許4,816,567;欧州特許公開12,023;Berter et al.,1988,Science 240:1041−43;Liu et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439−43;Liu et al.,1987,J.Immunol.139:3521−26;Sun et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214−18;Nishimura et al.,1987,Cancer.Res.47:999−1005;Wood et al.,1985,Nature 314:446−449;及びShaw et al.,1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553−59;Morrison,1985,Science 229:1202−07;Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214;U.S.Patent No.5225539;Jones et al.,1986,Nature 321:552−25;Verhoeyan et al.1988,Science 239:1534;及びBeidler et al.,1988,J.Immunol.141:4053−60に記載されている方法を用いて作成できる。
【0123】
上記した通り、CD70結合剤は抗CD70抗体の誘導体であることができる。一般的に抗CD70抗体誘導体は抗CD70抗体(例えば抗原結合フラグメント又は保存的に置換されたポリペプチドを含む)及び抗CD70抗体に対して非相同の少なくとも1つのポリペプチド領域又は他の部分を含む。例えば抗CD70抗体は例えば何れかの型の分子の共有結合により修飾できる。典型的な修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、PEG化、ホスホリル化、アミド化、知られた保護/ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、細胞リガンド(例えばアルブミン結合分子)又は他の蛋白への連結等を包含する。多くの化学的修飾のいずれかを知られた手法、例えば限定しないが特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により行ってよい。
【0124】
一部の実施形態においては、共有結合はエフェクター機能を妨害、例えば抗体誘導体が抗原結合領域又はそこから誘導された領域を介してCD70に特異的に結合することや、エフェクタードメインがFc受容体に特異的に結合することすることを妨げない。
【0125】
一部の実施形態においては、抗体誘導体は単量体1つ以上を含む多量体、例えば2量体であり、その場合、各単量体は(i)抗CD70抗体の抗原結合領域又はそこから誘導(例えばアミノ酸1つ以上の保存的置換により)されたポリペプチド領域;及び(ii)抗体誘導体がCD70に特異的に結合する多量体(例えばホモ2量体)を形成できるようにするための多量体化(例えば2量体化)ポリペプチド領域を包含する。典型的な実施形態においては、抗CD70抗体の抗原結合領域又はそこから誘導されたポリペプチド領域は非相同の蛋白に組み換えによるか化学的に融合され、その場合、非相同蛋白は2量体化又は多量体化ドメインを含む。免疫学的障害又はCD70発現癌を治療又は防止する目的の為に対象に抗体誘導体を投与する前に、誘導体はホモ2量体又はヘテロ2量体の形成を可能にする条件に付す。ヘテロ2量体は、本明細書においては、同一の2量体化ドメインと異なるCD70抗体結合領域、同一のCD70抗体結合領域と異なる2量体化ドメイン、又は、異なるCD70抗体結合領域と2量体化ドメインを含んでよい。
【0126】
典型的な2量体化ドメインは転写因子を起源とするものである。1つの実施形態において、2量体化ドメインは塩基性領域ロイシンジッパー(「bZIP」)のものである(Vinson et al.,1989,Science 246:911−916参照)。有用なロイシンジッパードメインは例えばコウボ転写因子GCN4、哺乳類転写因子CCAAT/エンハンサー結合蛋白C/EBP及び癌遺伝子産物Fos及びJun中の核形質転換体のものを包含する。(例えばLandschultz et al.,1988,Science 240:1759−64;Baxevanis and Vinson,1993,Curr.Op.Gen.Devel.3:278−285;O’Shea et al.,1989,Science 243:538−542参照。)別の実施形態においては、2量体化ドメインは塩基性領域ヘリックス−ループ−ヘリックス(「bHLH」)蛋白のものである。(例えばMurre et al.,1989,Cell 56:777−783参照。更にDavis et al.,1990,Cell 60:733−746;Voronova and Baltimore,1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4722−26参照。)得に有用なhHLH蛋白はmyc、max及びmacである。
【0127】
更に別の実施形態において、2量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域、例えば重鎖定常領域又はそのドメイン(例えばCH1ドメイン、CH2ドメイン及び/又はCH3ドメイン)である。(例えば米国特許5,155,027;5,336,603;5,359,046;及び5,349,053;EP0367166;WO96/04388参照。)
ヘテロ2量体はFosとJunとの間(Bohmann et al.,1987,Science 238:1386−1392),ATF/CREBファミリーのメンバーの間(Hai et al.,1989,Genes Dev.3:2083−2090),C/EBPファミリーのメンバーの間(Cao et al.,1991,Genes Dev.5:1538−52;Williams et al.,1991,Genes Dev.5:1553−67;Roman et al.,1990,Genes Dev.4:1404−15)及びATF/CREB及びFos/Junファミリーのメンバーの間(Hai and Curran,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3720−24)で形成されることが知られている。従って、CD70結合蛋白を種々の2量体化ドメインを含むヘテロ2量体として対象に投与する場合、上記の何れかの組合せを使用してよい。
【0128】
別の実施形態においては、抗CD70抗体誘導体は第2の抗体にコンジュゲートされた抗CD70抗体(「抗体ヘテロコンジュゲート」)である(例えば米国特許4,676,980参照)。本発明の方法を実施するために有用なヘテロコンジュゲートはCD70に結合する抗体(例えばモノクローナル抗体2F2又は1F6のCDR及び/又は重鎖を有する抗体)及びADCC、貪食作用及び/又はCDCを媒介する表面受容体又は受容体複合体、例えばCD16/FcgRIII、CD64/FcgRI、キラー細胞活性化又は抑制性の受容体、又は、補体制御蛋白CD59に結合する抗体を含む。典型的な実施形態においては、第2の細胞の表面分子又は受容体複合体への多重特異性抗体の部分の結合は、抗CD70抗体のエフェクター機能を増強する。他の実施形態においては、抗体は治療薬であることができる。適当な抗体治療薬は本明細書に記載する。
【0129】
一部の実施形態においては、抗CD70抗体又はその誘導体は競合的結合を測定するための当該分野で知られた何れかの方法(例えば本明細書に記載する免疫学的検定試験)により測定した場合に、CD70へのmAb1F6又は2F2の結合を競合的に抑制する。典型的な実施形態においては、抗体はCD70への1F6又は2F2の結合を少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%又は少なくとも75%競合的に抑制する。他の実施形態においては、抗体はCD70への1F6又は2F2の結合を少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%競合的に抑制する。
【0130】
抗体は種々の知られた方法のいずれかによりCD70への特異的結合について試験することができる。使用できる免疫学的検定試験は例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着試験)、「サンドイッチ」免疫学的検定試験、免疫沈降試験、プレシピチン反応、ゲル核酸プレシピチン反応、免疫拡散試験、凝集試験、補体個体試験、免疫放射計試験、蛍光免疫学的検定試験及びプロテインA免疫学的検定試験のような手法を用いる競合的及び非競合的な試験系を包含する。そのような試験は当該分野で良く知られている。(例えば、Ausubel et al.,eds.,Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,New York,4th ed.1999);Harlow&Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999参照)。
【0131】
更に又、CD70への抗体の結合親和性及び抗体CD70相互作用のオフレートを競合的結合試験により測定することができる。競合的結合試験の1つの例は漸増量の未標識CD70の存在下で目的の抗体と共に標識されたCD70(例えば3H又は125I)をインキュベートし、標識されたCD70に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。次にCD70に対する抗体の親和性及び結合オフレートをスカッチャードプロットの分析によりデータから求めることができる。第2の抗体(例えばmAb1F6又は2F2)との競合もまたラジオイムノアッセイを用いて測定できる。この場合、漸増量の未標識の第2の抗体の存在下、標識された化合物(例えば3H又は125I)にコンジュゲートした目的の抗体と共にCD70をインキュベートする。或いは、CD70への抗体の結合親和性及び抗体CD70相互作用のオン及びオフレートは表面プラズモン共鳴により測定できる。一部の実施形態においては、抗CD70抗体又はその誘導体はCD70発現細胞に向けてターゲティングし、その膜上に蓄積させることができる。
【0132】
抗CD70抗体及びその誘導体は、蛋白の合成に関する当該分野で知られた方法により、典型的には例えば組み換え発現の手法により、製造することができる。CD70に結合する抗体又はその誘導体の組み換え発現は典型的には、抗体又はその誘導体をコードする核酸を含有する発現ベクターの構築を包含する。蛋白分子の製造のためのベクターは当該分野で知られた手法を用いた組み換えDNA技術により製造してよい。標準的な手法、例えばSambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,3rd ed.,2001);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2nd ed.,1989);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,John Wiley&Sons,New York,4th ed.,1999);及びGlick&Pasternak,Molecular Biotechnology:Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press,Washington,D.C.,2nd ed.,1998)に記載のものを、組み換え核酸法、核酸合成、細胞培養、トランスジーン取り込み、及び、組み換え蛋白発現の為に使用することができる。
【0133】
例えば、抗CD70抗体の組み換え発現のためには、発現ベクターはプロモーターに作動可能に連結したその重鎖又は軽鎖、又は重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードしてよい。発現ベクターは例えば抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を包含してよく(例えばPCT公開WO 86/05807;PCT公開WO 89/01036;及び米国特許5,122,464参照)、そして抗体の可変ドメインは重鎖又は軽鎖全体の発現の為にベクターそのようなベクター内にクローニングしてよい。発現ベクターは従来の手法により宿主細胞に転移させ、そして次にトランスフェクトされた細胞を従来の手法により培養することにより抗CD70抗体を製造する。二重鎖の抗体の発現のための典型的な実施形態においては、重全免疫グロブリン分子の発現のために、鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞内で同時発現することができる。
【0134】
種々の原核生物及び真核生物の宿主発現ベクター系を利用して抗CD70抗体又はその誘導体を発現することができる。典型的には、真核生物の細胞、特に全組み換え抗CD70抗体分子用のものを、組み換え蛋白の発現の為に使用する。例えば、ヒトサイトメガロウィルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のような哺乳類細胞が抗CD70抗体及びその誘導体の製造のための有効な発現系である(例えばFoecking et al.,1986,Gene 45:101;Cockett et al.,1990,Bio/Technology 8:2参照)。
【0135】
他の宿主発現系は、例えば、細菌細胞中のプラスミド系の発現系(例えばRuther et al.,1983,EMBO 1,2:1791;Inouye&Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13:3101−3109;Van Heeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503−5509参照);昆虫系、例えばSpodoptera frugiperda細胞中のAutographa californica核粟粒熱ウィルス(AcNPV)発現ベクター;及び哺乳類細胞中のウィルス系発現系、例えばアデノウィルス系の系(例えばLogan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355−359;Bittner et al.,1987,Methods in Enzymol.153:51−544参照)を包含する。
【0136】
更に又、挿入された配列の発現をモジュレートするか、又は、特定の所望の態様において遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞系統を選択することもできる。適切な細胞系統又は宿主系は、発現される蛋白の正確な修飾及びプロセシング(例えばグリコシル化、ホスホリル化及び切断)が確保されるように選択することができる。この目的のためには、一次転写物及び遺伝子産物の適切なプロセシングのための細胞機序を保有している真核生物宿主細胞を使用できる。そのような哺乳類宿主細胞は例えば、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293,3T3及びW138を包含する。
【0137】
安定な発現系は典型的には、組み換え抗CD70抗体又はその誘導体又は他のCD70結合剤の長期の高収率の製造の為に使用される。例えば抗CD70抗体又はその誘導体を安定に発現する細胞系統は、適切な発現制御エレメント(例えばプロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位)で制御されたDNA及び選択可能なマーカーによる宿主細胞の形質転換、その後の選択培地中における形質転換細胞の成育により作成することができる。選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、そして細胞が安定にDNAをその染色体内に組み込んで細胞叢を形成できるようにし、それを次にクローニングして増殖させ、細胞系統とする。多くの選択系を使用でき、例えば単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられ、これはそれぞれtk−、hgprt−又はaprt−細胞内で使用できる。更に又、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子、即ちメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr;マイコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt;アミノグリコシオG−418に対する耐性を付与するneo;ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroに対する選択の基準として使用できる。組み換えDNA技術の当該分野で一般的に知られた方法を日常的に適用することにより所望の組み換えクローンを選択することができ、そしてそのような方法は例えばCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons,N.Y.,1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(Stockton Press,N.Y.,1990);Current Protocols in Human Genetics(Dracopoli et al.eds.,John Wiley&Sons,N.Y.,1994,Chapters 12 and 13);及びColberre−Garapin et al.,1981,J.Mol.Biol.150:1に記載されている。
【0138】
抗体又は誘導体の発現の水準はベクター増幅により増大させることができる。(一般的にBebbington&Hentschel,The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning,Vol.3(Academic Press,New York,1987)を参照できる)。抗CD70抗体又はその誘導体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合は、宿主細胞培養物中に存在する抑制剤の濃度を増大させることにより抑制剤に対する耐性を付与しているマーカー遺伝子の増大したコピー数を有する宿主細胞を選択できるようになる。関連する抗体遺伝子のコピー数もまた増大することができ、これにより抗体又はその誘導体の発現を増大させることができる(Crouse et al.,1983,Mol.Cell.Biol.3:257参照)。
【0139】
抗CD70抗体が重鎖及び軽鎖の両方又はその誘導体を含む場合、宿主細胞は2つの発現ベクター、即ち、重鎖蛋白をコードする第1のベクター及び軽鎖蛋白をコードする第2のベクターで同時トランスフェクトしてよい。2つのベクターは重鎖及び軽鎖の蛋白の等しい発現を可能とする同一の選択可能なマーカーを含有していてよい。或いは、重鎖及び軽鎖の蛋白の両方をコードしており、それらを発現することができる単一のベクターを使用してよい。そのような場合、軽鎖は典型的には重鎖の前に位置させることにより毒性の遊離の重鎖が過剰になることを回避する(Proudfoot,1986,Nature 322:52;Kohler,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197参照)。重鎖及び軽鎖に関するコーディング配列はcDNA又はゲノムDNAを含んでよい。
【0140】
抗CD70抗体又はその誘導体を製造(例えば動物、化学合成又は組み換え発現による)した後、それは何れかの適当な蛋白精製方法、例えばクロマトグラフィー(例えばイオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー(例えばインタクトなFc領域を有する抗体の精製のためにはプロテインAクロマトグラフィー))、遠心分離、溶解度の差によるか、又は、蛋白精製のための何れかの他の標準的な手法により精製することができる。抗CD70抗体又はその誘導体は例えばマーカー配列、例えばペプチドと融合させることによりアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にすることができる。適当なアミノ酸配列は、例えばヘキサヒスチジンペプチド、例えばpQEベクター(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA,91311)により与えられるタグ、及びインフルエンザヘマグルチニン蛋白から誘導されたエピトープに相当する「HA」タグ(Wilson et al.,1984,Cell 37:767)及び「flag」タグを包含する。
【0141】
抗CD70抗体又はその誘導体を製造した後、CD70発現癌細胞に対する細胞増殖抑制性又は細胞毒性作用又はCD70発現免疫細胞に対する免疫調節性の作用を発揮するその能力を後述する、又は、当該分野で知られた方法により測定する。
【0142】
活性化された免疫細胞又はCD70発現癌細胞の外部における抗CD70抗体の活性を最小限にするために、活性化された免疫細胞又はCD70発現癌細胞の細胞表面上に抗CD70抗体が濃縮されるように膜結合CD70には特異的に結合するが、可溶性CD70には結合しない抗体を用いることができる。
【0143】
典型的には、抗CD70抗体又は誘導体は、実質的に精製する(例えばその作用を制限するか望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に非含有とする)。一部の実施形態においては、抗CD70抗体又は誘導体は少なくとも約40%純粋、少なくとも約50%純粋、又は少なくとも約60%純粋である。一部の実施形態においては、抗CD70抗体又は誘導体は少なくとも約60〜65%、65〜70%、70〜75%、75〜80%、80〜85%、85〜90%、90〜95%又は95〜98%純粋である。一部の実施形態においては抗CD70抗体又は誘導体は約99%純粋である。
III.他のCD70結合剤
別のCD70結合剤は非相同蛋白(典型的には少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は少なくとも100アミノ酸)との融合蛋白(即ち組み換え融合された、又は共有結合及び非共有結合コンジュゲーションの両方を包含する化学的にコンジュゲートされた蛋白)を包含する。そのようなCD70結合剤はCD70及び免疫グロブリンエフェクタードメイン又はその機能的等価物に結合する部分を包含することができる。本明細書においては、免疫グロブリンエフェクタードメインの機能的等価物は、貪食作用又は細胞溶解活性を用いて、又は、補体系の成分へのFcエフェクタードメインの結合により、免疫細胞上のFc受容体に結合する。融合蛋白は必ずしも直接のものである必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。
【0144】
例えばCD70結合剤はCDRの1つ以上のコーディング領域又は抗CD70抗体の可変領域を非相同蛋白に対してコーディングしている配列とインフレームに融合することにより組み換えにより製造できる。非相同蛋白は例えばエフェクタードメイン、その機能的等価物、又は以下の特性、即ち、安定な発現を促進する;高収率の組み換え発現を容易にする手段を与える;細胞増殖抑制性、細胞毒性又は免疫調節性の活性を与える;及び/又は多量体化ドメインを与えることの1つ以上を与える他の機能的ドメインを包含することができる。
【0145】
一部の実施形態においてはCD70結合剤は、細胞毒性剤へのコンジュゲーションを伴うことなく単独で、CD70に結合し、CD70発現細胞を枯渇させるか、その増殖を抑制する抗体に由来するCDR1つ以上を包含してよい。
IV.抗CD70ターゲティング剤のエフェクター機能を向上させる方法
一部の実施形態においては、CD70結合剤のエフェクター機能は、当該分野で知られた抗体操作法1つ以上を用いてそのエフェクター機能を向上させることにより増強することができる。そのような方法の例示される非限定的な例を以下に記載する。
【0146】
ADCC及びADCPはエフェクター細胞上に発現されるFcγ受容体(FcγR)との細胞結合抗体の相互作用を介して媒介される。IgGFc領域のグリコシル化状態及び一次アミノ酸配列の両方がFcγ−FcγR相互作用に対して機能的作用を有している。より強力なFcγ−FcγR相互作用はエフェクター細胞によるより良好な標的細胞の殺傷に関連している。
【0147】
保存されたAsn297に共有結合したオリゴ糖がFcγRに結合するためのIgGのFc領域に関与している(Lund et al.,1996,J.Immunol.157:4963−69;Wright and Morrison,1997,Trends Biotechnol.15:26−31)。IgG上のこのグリコ型の操作はIgG媒介ADCCを顕著に向上させる。このグリコ型へのN−アセチルグルコサミン修飾の付加(Umana etal.,1999,Nat.Biotechnol.17:176−180;Davies et al.,2001,Biotech Bioeng.74:288−94)又はこのグリコ型からのフコースの除去(Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277:26733−40;Shinkawa et al.,2003,J.Biol.Chem.278:6591−604;Niwa et al.,2004,Cancer Res.64:2127−33)はIgGFcとFcγRとの間の結合を向上させることによりIg媒介ADCC活性を増強するIgGFc操作の2つの例である。
【0148】
ヒトIgG1Fc領域の溶媒曝露アミノ酸の系統的置換は改変されたFcγR結合親和性を有するIgG改変体を形成している(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604)。親IgG1と比較した場合、AlaへのThr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334又はSer298/Glu333/Lys334における置換を含むこれらの改変体のサブセットはFcγRに対する結合親和性及びADCC活性の両方における増大を示している(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604;Okazaki et al.,2004,J.Mol.Biol.336:1239−49)。
【0149】
抗体媒介CDCは細胞結合IgG分子へのC1qの結合と共に開始される。C1q結合に関与するヒトIgG1上の特定のアミノ酸残基及びC1q結合の種特異的な差が報告されている(Idusogie et al.,2000,J.Immunol.164:4178−4184)。Lys326及びGlu333における置換により抗体の補体固定活性が向上しており;例えばこのような置換はヒトIgG1抗体リツキシマブのC1q結合及びCDC活性の両方を向上させることができる(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166:2571−2575)。ヒトIgG2骨格上の同じ置換はC1qへの結合が乏しく、そして補体活性化活性において大きく欠損している抗体アイソタイプをC1qに結合して更にCDCを媒介することができるものに変換することができる(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166:2571−75)。幾つかの他の方法もまた抗体の補体固定活性の向上の為に適用されている。例えばIgGのカルボニル末端にIgMの18アミノ酸カルボキシ末端テール片をグラフとするとそのCDC活性は大きく増大する。これは通常は検出可能なCDC活性を有さないIgG4でも観察されている(Smith et al.,1995,J.Immunol.154:2226−36)。また、Cysと共にIgG1重鎖のカルボキシ末端に近接する位置にある置換Ser444は、単量体IgG1におけるCDC活性200倍での増加を伴いIgG1のtail−to−tail型の二量化誘発する(Shopes et al.,1992,J.Immunol.148:2918−22)。更に又、C1qに対する特異性を有する二重特異性のダイアボディコンストラクトもまたCDC活性を付与する(Kontermann et al.,1997,Nat.Biotech.15:629−31)。
【0150】
抗体のインビボ半減期も又そのエフェクター機能に対して影響する場合がある。一部の実施形態においては、抗体の半減期を増大又は減少させることによりその治療活性を変更することが望ましい。FcRnはβ2−ミクログロブリンと非共有結合的に会合するMHCクラスI抗原と構造的に同様の受容体である。FcRnはIgGの異化及びそのトランスサイトーシスを組織に渡って調節する(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739−766;Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25:97−113)。IgG−FcRnの相互作用はpH6.0(細胞内小胞のpH)では生じるが、pH7.4(血液のpH)では生じず;この相互作用はIgGを循環系にリサイクル可能とする(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739−766;Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25:97−113)。FcRn結合に関与するヒトIgG1上の領域はマッピングされている(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604)。ヒトIgG1のPro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382又はAsn434位におけるアラニン置換はFcRn結合を増強する(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604)。これ等の置換を保有しているIgG1分子はより長い血清中半減期を有することが予測される。その結果、これ等の修飾されたIgG1分子は、未修飾のIgG1と比較してより長い時間に渡り、そのエフェクター機能を実行することができ、そしてこれによりその治療効果を発揮することができる。
V.細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の活性に関する試験
抗体が標的細胞に対するエフェクター機能を媒介するかどうかを調べる方法は知られている。そのような方法の代表例を以下に記載する。
【0151】
抗CD70抗体又は誘導体が活性化免疫細胞又はCD70発現癌細胞に対して抗体依存性細胞性細胞毒性を媒介するかどうかを調べるためには、抗体及びエフェクター免疫細胞の存在下に標的細胞死を測定する試験を使用してよい。この種の細胞毒性を測定するために使用する試験はエフェクター細胞及び標的特異的抗体の存在下のインキュベーションの後の代謝的に標識された標的細胞からの51Crの放出の測定に基づいている(例えばPerussia and Loza,2000,Methods in Molecular Biology 121:179−92;及び”51Cr Release Assay of Antibody−Dependent Cell−Mediated Cytotoxicity(ADCC)”,Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,eds.,Wiley and Sons,1993参照)。例えば、Na251CrO4で標識され96穴プレートのウェル当たり5000個の細胞密度でプレーティングされた活性化免疫細胞(例えば活性化リンパ球)又はCD70発現癌細胞に種々の濃度の抗CD70抗体を30分間投与し、次に正常ヒト末梢血単核細胞(PBMC)と4時間混合することができる。標的細胞死に付随する膜破壊により51Crが培地上澄み中に放出され、これを採取し、そして細胞毒性活性の尺度として放射能を測定する。ADCCを測定する他の方法は、非放射標識を使用するか、又は、特定の酵素の誘導された放出に基づいてよい。例えば、時間分解蛍光分析に基づく非放射標識試験は市販されている(Delphia,Perkin Elmer)。この試験は細胞膜を貫通し、次いで加水分解して膜不透過性親水性リガンド(TDA)を形成する蛍光増強リガンド(BATDA)のアセトキシメチルエステルで標的細胞をローディングすることに基づいている。標的特異的抗体とPBMCエフェクター細胞を混合すると、TDAは溶解した細胞から放出され、そしてユーロピウムと混合された時点で高蛍光のキレートを形成するために使用可能となる。時間分解蛍光計を用いて測定されたシグナルは細胞溶解の量と相関している。
【0152】
抗CD70抗体又は誘導体が活性化免疫細胞又はCD70発現癌細胞に対して抗体依存性細胞性貪食作用を媒介するかどうかを調べるためには、エフェクター免疫細胞(例えば新鮮培養マクロファージ又は樹立されたマクロファージ様細胞系統)による標的細胞内在化を測定する試験を用いてよい(例えばMunn and Cheung,1990,J.Exp.Med.172:231−37;Keler et al.,2000,J.Immunol.164:5746−52;Akewanlop et al.,2001,Cancer Res.61:4061−65参照)。例えば、標的細胞を親油性膜染料、例えばPKH67(Sigma)で標識し、標的特異的抗体でコーティングし、そして4〜24時間エフェクター免疫細胞と混合してよい。次に貪食細胞表面マーカー(例えばCD14)に特異的な蛍光色素標識抗体で逆染色することによりエフェクター細胞を発見し、そして2色フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡により細胞を分析する。二重陽性細胞が内在化標的細胞を有しているエフェクター細胞である。これ等の試験のためには、エフェクター細胞はM−CSF又はGM−CSFと共に5〜10日間培養することによりマクロファージに分化しているPMBCから誘導された単球であることができる(例えば上出Munn and Cheung参照)。ATCCから入手可能なヒトマクロファージ様細胞系統U937(Larrick et al.,1980,J.Immunology 125:6−12)又はTHP−1(Tsuchiya et al.,1980,Int.J.Cancer 26:171−76)を代替の貪食細胞原料として使用してよい。
【0153】
標的細胞結合時に抗体が補体依存性細胞毒性を媒介するかどうかを調べる方法もまた知られている。同じ方法をCD70結合剤が活性化免疫細胞又はCD70発現癌細胞に対してCDCを媒介するかどうかを調べるためにも適用できる。そのような方法の代表例を以下に記載する。
【0154】
活性補体原料は正常ヒト血清であるか、又はウサギのような実験動物から精製したものであることができる。標準的な試験においては、CD70結合剤を補体の存在下、CD70発現活性化免疫細胞(例えば活性化リンパ球)又はCD70発現癌細胞と共にインキュベートする。このようなCD70結合剤が細胞溶解を媒介する能力を数種の読み取り値により調べることができる。一例においては、Na51CrO4放出試験を使用する。この試験においては、標的細胞をNa51CrO4で標識する。未取り込みのNa51CrO4を洗浄し、96穴プレート中、細胞を適当な密度、典型的には5000〜50000個/ウェルでプレーティングする。正常血清又は精製された補体の存在下、CD70結合剤と共に、典型的には2〜6時間37℃で5%CO2雰囲気下にインキュベートする。細胞溶解を示す放出された放射能は、ガンマ線計数により培養上澄み少量を用いて測定する。最大細胞溶解は洗剤(0.5〜1%NP−40又はTriton X−100)処理により取り込みNa51CrO4を放出させることにより測定する。自発的バックグラウンド細胞溶解は、CD70結合剤非存在下の補体のみが存在するウェルにおいて測定する。パーセント細胞溶解は(CD70結合剤誘導溶解−自発的溶解)/最大細胞溶解として計算する。第2の読み取り値は生細胞による代謝染料、例えばAlamar Blueの還元である。この試験においては、標的細胞を補体と共にCD70結合剤とインキュベートし、上記の通りインキュベートする。インキュベーション終了時、Alamar Blue(Biosource International,Camarillo,CA)の1/10容量を添加する。インキュベーションは16時間まで37℃5%CO2雰囲気下に継続する。代謝的に活性な生細胞の指標としてのAlamar Blueの還元は励起光530nm及び放射光590nmにおいて蛍光分析することにより測定する。第3の読み取り値はヨウ化プロピジウム(PI)に対する細胞膜の透過性である。補体活性化の結果としての原形質膜の細孔形成により細胞内へのPIの進入が促進され、細胞内では核内へ拡散してDNAに結合する。DNAへの結合により、600nmのPI蛍光が顕著に増大する。CD70結合剤及び補体の標的細胞への投与は上記の通り行う。インキュベーション終了時にPIを終濃度5μg/mLとなるように添加する。次に細胞懸濁液を励起のための488nmアルゴンレーザーを用いながらフローサイトメトリーにより調べる。溶解細胞は600nmにおける蛍光放射により検出される。
VI.免疫学的障害又はCD70発現癌の動物モデル
抗CD70結合剤、例えば抗体又は誘導体は、免疫学的障害又はCD70発現癌の動物モデルにおいて試験又は確認することができる。免疫学的障害又はCD70発現癌の樹立された動物モデル多数が当該分野で知られており、その何れも抗CD70抗体又は誘導体の薬効を試験するために使用できる。このようなモデルの非限定的な例を以下に記載する。
【0155】
全身性及び臓器特異的な自己免疫疾患、例えば糖尿病、狼瘡、全身硬化症、シェーグレン症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎(多発性硬化症)、甲状腺炎、重症筋無力症、関節炎、ブドウ膜炎及び炎症性腸疾患の動物モデルはBigazzi,“Animal Models of Autoimmunity:Spontaneous and Induced,”,The Autoimmune Diseases(Rose&Mackay eds.,Academic Press,1998)及び“Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease,”,Current Protocols in Immunology(Coligan et al.eds.,Wiley&Sons,1997)に記載されている。
【0156】
アレルギー症状、例えば、喘息及び皮膚炎もまたげっ歯類においてモデル化できる。気道過敏症は卵白アルブミン(Tomkinson et al.,2001,J.Immunol.166:5792−800)又はSchistosoma mansoni卵抗原(Tesciuba et al.,2001,J.Immunol.167:1996−2003)によりマウスにおいて誘導できる。マウスのNc/Nga系統は血清中IgEの顕著な上昇を示し、アトピー性皮膚炎様の患部を自発的に形成する(Vestergaard et al.,2000,Mol.Med.Today 6:209−10;Watanabe et al.,1997,Int.Immunol.9:461−66;Saskawa et al.,2001,Int.Arch.Allergy Immunol.126:239−47)。
【0157】
免疫コンピテントなドナーリンパ球の致死性放射線照射組織不適合成宿主への注射はマウスにおいてGVHDを誘導する古典的な方法である。或いは、親B6D2F1マウスモデルは急性及び慢性のGVHDの両方を誘導する系を与える。このモデルにおいて、B6D2F1マウスはC57BL/6及びDBA/2マウスの親系統の間の雑種に由来するF1子孫である。DBA/2リンパ様細胞を非照射B6D2F1マウスに転移させると慢性GVHDが生じるのに対し、C57BL/6、C57BL/10又はB10.D2リンパ様細胞の転移は急性GVHDが生じる(Slayback et al.,2000,Bone Marrow Transpl.26:931−938;Kataoka et al.,2001,Immunology 103:310−318)。
【0158】
更にまた、ヒト造血系肝細胞及び成熟末梢血リンパ様細胞は両方ともSCIDマウスに移植することができ、そしてこれ等のヒトリンパ造血系細胞はSCIDマウス内で機能性のまま存続する(McCune et al.,1988,Science 241:1632−1639;Kamel−Reid and Dick,1988,Science 242:1706−1709;Mosier et al.,1988,Nature 335:256−259)。これによりヒトリンパ様細胞に対する潜在的治療薬の直接の試験のための小型動物モデル系が得られている。(例えばTournoy et al.,2001,J.Immunol.166:6982−6991参照。)
更に又、抗CD70抗体又は誘導体のインビボの薬効を推定するための小型動物モデルは、適切な免疫不全のげっ歯類系統、例えば無胸腺ヌードマウス又はSCIDマウス内へのCD70発現ヒト腫瘍細胞系統の移植により作成することができる。CD70発現ヒトリンパ腫細胞系統の例は、例えば、Daudi(Ghetie et al.,1994,Blood 83:1329−36;Ghetie et al.,1990,Int JCancer 15:481−85;de Mont et al.,2001,Cancer Res. 61:7654−59),HS−Sultan(Cattan&Maung,1996,Cancer Chemother Pharmacol. 38:548−52;Cattan and Douglas,1994,Leuk.Res. 18:513−22),Raji(Ochakovskaya et al.,2001,Clin. Cancer Res. 7:1505−10;Breisto et al.,1999,Cancer Res. 59:2944−49),and CA46(Kreitman et al.,1999,Int. J. Cancer 81:148−55)を包含する。CD70発現ホジキンリンパ腫系統の非限定的な例はL428である(Drexler,1993,Leuk.Lymphoma 9:1−25;Dewan et al.,2005,Cancer Sci.96:466−473)。CD70発現ヒト腎細胞癌細胞系統の非限定的な例は786−O(Ananth et al.,1999,Cancer Res 59:2210−16;Datta et al.,2001,Cancer Res. 61:1768−75),ACHN(Hara et al.,2001,J Urol.166:2491−94;Miyake et al.,2002,J Urol.167:2203−08),Caki−1(Prewett et al.,1998,Clin.Cancer Res.4:2957−66;Shi and Siemann,2002,Br.J.Cancer 87:119−26)、及びCaki−2(Zellweger et al.,2001,Neoplasia 3:360−67)を包含する。CD70発現鼻咽頭癌細胞系統の非限定的な例はC15及びC17(Busson et al.,1988,Int.J.Cancer 42:599−606;Bernheim et al.,1993,Cancer Genet.Cytogenet.66:11−5)を包含する。CD70発現ヒト神経膠腫細胞系統の非限定的な例はU373(Palma et al.,2000,Br.J.Cancer 82:480−7)及びU87MG(Johns et al.,2002,Int.J.Cancer 98:398−408)を包含する。多発性骨髄腫細胞系統の非限定的な例はMM.1S(Greenstein et al.,2003,Experimental Hematology 31:271−282)及びL363(Diehl et al.,1978,Blut 36:331−338)を包含する。(Drexler and Matsuo,2000,Leukemia Research 24:681−703も参照できる。)これ等の腫瘍細胞系統は皮下注射による固形腫瘍として、又は、静脈内注射による播種性腫瘍として、免疫不全げっ歯類宿主中で樹立できる。宿主内で樹立された後、これ等の腫瘍モデルはインビボの腫瘍成育に関して本明細書において説明する通り、抗CD70抗体又は誘導体の治療効果を評価するために適用できる。
VII.CD70関連疾患
本明細書に記載した抗CD70結合剤(例えば抗体又は誘導体)は免疫細胞(例えばリンパ球又は樹状細胞)の不適切な活性化によるCD70の発現を態様とするCD70発現癌又は免疫学的障害を治療又は防止するために有用である。そのようなCD70発現は例えば細胞表面上の上昇したCD70蛋白水準及び/又は発現されたCD70の改変された抗原性によるものである可能性がある。本明細書に記載した方法による免疫学的障害の治療又は防止は、そのような治療又は防止を必要とする対象に抗CD70抗体又は誘導体の有用量を投与することにより、抗体又は誘導体が(i)CD70を発現し、そして失火状態に関連している活性化免疫細胞に結合し、そして(ii)活性化免疫細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を発揮することにより達成される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤へのコンジュゲーションを行うことなく発揮される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤へのコンジュゲーションにより発揮される。
【0159】
免疫細胞の不適切な活性化を態様とし、そして本明細書に記載した方法により治療又は防止できる免疫学的疾患は、例えば、障害に伏在する過敏性反応の型により分類することができる。これ等の反応は典型的には4種の型、即ちアナフィラキシー反応、細胞毒性(細胞溶解性)反応、免疫複合体反応、又は、細胞媒介免疫(CMI)反応(遅延型過敏症(DTH)反応とも称される)に分類される。(例えばFundamental Immunology(William E.Paul ed.,Raven Press,N.Y.,3rd ed.1993参照。)
このような免疫学的疾患の特定の例は以下のもの、即ち、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性脱髄疾患(例えば多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎)、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、全身エリテマトーデス、重症筋無力症、グレーブス病、糸球体腎炎、自己免疫性肝臓障害、炎症性腸疾患(例えばクローン病)、アナフィラキシー、アレルギー性反応、シェーグレン症候群、I型真性糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、線維性筋肉痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌障害、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、上皮小体機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑症、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、皮膚ヘルペス、円形脱毛症、類天疱瘡、硬皮症、進行性全身硬皮症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー減少、食道運動不全、手指硬化症及び毛細管拡張症)、雌雄の自己免疫性不妊、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、混合型結合組織疾患、結節性動脈周囲炎、全身壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺。毒性表皮壊死症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、繊維性肺胞炎、肝質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽製膿皮症、輸液反応、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼球陥没症、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックス毛様体炎、IgA腎症、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、対宿主性移植片病、移植拒絶、心筋症、イートン−ランバート症候群、回帰性多発性軟骨炎、クリオグロブリン症、ヴァルデンストレームマクログロブリン症、エバンス症候群及び自己免疫性生殖腺不全を包含する。
【0160】
従って、本明細書に記載する方法はBリンパ球(例えば全身エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ及びI型糖尿病)、Th1−リンパ球(例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核又は対宿主性移植片病)又はTh2−リンパ球(例えばアトピー性皮膚炎、全身エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症又は慢性対宿主性移植片病)の障害の治療を包含する。一般的に、樹状細胞の関与する障害はTh1−リンパ球又はTh2−リンパ球の障害が関与している。
【0161】
一部の実施形態においては、免疫学的障害はT細胞媒介免疫学的障害、例えば障害に関わっている活性化T細胞がCD70を発現するT細胞障害である。抗CD70結合剤(例えば抗体又は誘導体)はそのようなCD70発現活性化T細胞を枯渇させるために投与できる。特定の実施形態においては、抗CD70抗体又は誘導体の投与によりCD70発現活性化T細胞を枯渇させながら、休止期のT細胞は抗CD70又は誘導体により実質的に枯渇されない。この点に関し、「実質的に枯渇されない」とは、休止期の細胞の約60%未満、又は約70%未満、又は約80%未満が枯渇されないことを意味する。
【0162】
抗CD70結合剤(例えば抗体及び誘導体)は又、CD70発現癌の治療又は防止のためにも有用である。本明細書に記載した方法によるCD70発現癌の治療又は防止は、そのような治療又は防止を必要とする対象に対し、抗CD70抗体又は誘導体の有効量を投与することにより、抗体又は誘導体は(i)CD70発現癌細胞に結合し、そして(ii)CD70発現癌細胞を枯渇又は増殖を抑制するための細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を発揮することにより、達成される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤とのコンジュゲーションを伴うことなく発揮される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤とのコンジュゲーションにより発揮される。
【0163】
本明細書に記載した方法により治療又は防止できるCD70発現癌は例えば、種々のサブタイプの非ホジキンリンパ腫(無痛性NHL、濾胞性NHL、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性NHL、辺縁層NHL);ホジキン秒(例えばリード‐スターンバーグ細胞);B細胞系統の癌、例えば播種性B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ブルキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B細胞リンパ性白血病(例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病);エプスタイン−バーウィルス陽性B細胞リンパ腫;腎細胞癌(例えば明細胞及び乳頭);鼻咽頭癌;胸腺癌;神経膠腫;神経膠芽腫;神経芽腫;星状細胞腫;髄膜腫;ヴァルデンストレームマクログロブリン血症;多発性骨髄腫;及び結腸、胃及び直腸の癌を包含する。癌は例えば新規に診断されたもの、以前に治療されたもの、又は難治性又は回帰性であることができる。一部の実施形態においては、CD70発現癌は少なくとも約15000、少なくとも約10000、又は少なくとも約5000CD70分子/細胞を有する。
VIII.抗CD70抗体及び誘導体を含む医薬組成物及びその投与
CD70結合剤(例えば抗CD70抗体又は誘導体)を含む組成物は免疫学的障害又はCD70発現癌を有する、又は、有する危険性のある対象に投与できる。本発明は更に、CD70発現癌又は免疫学的障害の防止又は治療のための医薬の製造におけるCD70結合剤(例えば抗CD70抗体又は誘導体)の使用を提供する。「対象」という用語は本明細書においては、CD70結合剤を投与できる何れかの哺乳類患者、ヒト及び非ヒト哺乳類、例えば霊長類、げっ歯類及びイヌを意味する。本明細書に記載した方法を用いた治療の為に特に意図される対象はヒトを包含する。抗体又は誘導体は、免疫学的障害又はCD70発現癌の防止又は治療において、単独又は他の組成物と組み合わせて投与できる。
【0164】
種々の送達系が知られており、CD70結合剤を投与するために使用できる。導入方法は限定しないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜上及び経口の投与経路が包含される。CD70結合剤は例えば注入又は瞬時注射(例えば静脈内又は皮下)により、表皮又は粘膜ライニングを介した吸収(例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等)により投与することができ、そして、化学療法剤のような他の生物学的活性剤と共に投与することができる。投与は全身又は局所であることができる。
【0165】
特定の実施形態においては、CD70結合剤組成物は注射により、カテーテル使用により、坐剤使用により、又は、インプラント使用により投与さ、インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン性の材料、例えば膜、例えばシアラスチック膜又は線維性のものである。典型的には、組成物を投与する場合、抗CD70結合剤が吸収されない材料を使用する。
【0166】
別の実施形態においては、抗CD70結合剤は制御放出系において送達される。1つの実施形態において、ポンプを使用してよい(Langer,1990,Science 249:1527−1533;Sefton,1989,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507;Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574参照)。別の実施形態においては、重合体物質を使用できる。(Medical Applications of Controlled Release(Langer&Wise eds.,CRC Press,Boca Raton,Florida,1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen&Ball eds.,Wiley,New York,1984);Ranger&Peppas,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照できる。Levy et al.,1985,Science 228:190;During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105も参照できる。)他の制御放出系は、例えば上出Langerにおいて考察されている。
【0167】
CD70結合剤(例えば抗抗CD70抗体又は誘導体)は結合剤の治療有効量及び制約上適合性のある成分1つ以上を含む医薬組成物として投与できる。例えば、医薬組成物は典型的には製薬用の担体(例えば滅菌液体、例えば水及び油脂、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等)1つ以上を包含する。医薬組成物が静脈内に投与される場合は、水がより典型的な担体である。食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた液体担体として、特に注射溶液の為に使用できる。適当な製薬用賦形剤は例えば、澱粉、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を包含する。組成物は所望により、少量の水和剤又は乳化剤、又はpH緩衝剤を含有することもできる。これ等の組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、除放性製剤等の形態をとることができる。組成物は伝統的なバインダー及び担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として製剤できる。経口投与用製剤は標準的な担体、例えば医薬品等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を包含できる。適当な製薬用担体の例はE.W.Martinにより「Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。このような組成物は患者に適切な投与の形態がもたらされるような適当な量の担体と共に典型的には精製された形態で治療有効量の蛋白を含有することになる。製剤は投与様式に相当したものである。
【0168】
典型的な実施形態においては、医薬組成物は人間への静脈内投与に適合された医薬組成物としての日常的操作法に従って製剤される。典型的には、静脈内投与のための組成物は滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて医薬品は可溶化剤及びリグノカインのような局所麻酔剤を含むことにより注射部位の疼痛を軽減することができる。一般的に、成分は個別に又は混合されて単位剤型として、例えば凍結乾燥粉末又は水分非含有濃縮物として、密閉密封容器、例えばアンプル又は個包装中において、活性剤の品質を表示しながら供給される。医薬品を注入により投与する場合は、それは滅菌された医薬品用等級の水又は食塩水を含有する注入ボトルを用いて分注することができる。医薬品を注射により投与する場合は、滅菌注射用水又は食塩水のアンプルを提供し、成分を投与前に混合できるようにする。
【0169】
更にまた、医薬組成物は(a)CD70結合剤(抗CD70抗体又は誘導体)を凍結乾燥形態で含有する容器、及び(b)製薬上許容しうる注射用の希釈剤(例えば滅菌水)を含有する第2の容器を含む医薬品キットとして提供できる。製薬上許容しうる希釈剤は凍結乾燥した抗CD70抗体又は誘導体の復元又は希釈の為に使用できる。場合によりそのような容器に併設されているものは、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を管轄する政府当局により定められた注意書であり、その注意書はヒトへの投与に関する製造、使用又は販売の当局による認可を反映するものである。
【0170】
免疫学的障害又はCD70発現癌の治療又は防止において有効なCD70結合剤(例えば抗CD70抗体又は誘導体)の量は標準的な臨床手法により決定できる。更に、インビボの試験は場合により最適用量範囲の発見を容易にするために使用してよい。製剤中に使用する厳密な用量は投与経路及び免疫学的障害又はCD70発現癌の病期により変動し、そして、担当医師の判断及び各患者の状況に従って決定しなければならない。有効な用量はインビトロ又は動物モデルの試験系から誘導される用量応答曲線から推定してよい。
【0171】
例えば、抗CD70抗体又は誘導体の毒性及び治療効果は細胞培養物又は実験動物において、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)及びED50(集団の50%における治療有効量)を決定するための標準的な薬学的操作法により決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量の比は治療指数であり、比LD50/ED50で表すことができる。大きい治療指数を示すCD70結合剤(抗CD70抗体又は誘導体)が好ましい。CD70結合剤が毒性の副作用を示す場合、罹患組織の部位にCD70結合剤をターゲティングする送達系を使用することにより非CD70発現細胞の潜在的損傷を最小限にし、これにより副作用を低減することができる。
【0172】
細胞培養試験及び動物試験から得られたデータをヒトにおける使用の場合の用量範囲を設定する場合に使用できる。CD70結合剤の用量は典型的には、毒性が殆ど又は全く内ED50を含む循環系中濃度の範囲内に入るものである。用量は使用する剤型及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。方法においてCD70結合剤を使用するためには、治療有効用量はまず細胞培養試験から推定できる。用量は動物モデルにおいて設定することによりIC50(即ち症状の半最大抑制を達成する被験化合物の濃度)を含む循環系中の血漿中濃度を達成することができる。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中濃度は例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【0173】
一般的に免疫学的障害又はCD70発現癌を有する患者に投与されるべき抗CD70抗体又は誘導体の用量は約0.1mg/kg〜100mg/kg対象体重である。より典型的には、対象に投与されるべき用量は0.1mg/kg〜50mg/kg対象体重、更により典型的には1mg/kg〜30mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、1mg/kg〜15mg/kg、1mg/kg〜12mg/kg、1mg/kg〜10mg/kg又は1mg/kg〜7.5mg/kg対象体重である。一般的に、ヒト抗体は外来性蛋白への免疫応答のため、他の種由来の抗体よりもヒト身体内でより長い半減期を有する。即ち、ヒト化又はキメラ抗体を含む抗CD70抗体又は誘導体のより低用量及びより低頻度投与が可能な場合が多い。
【0174】
抗CD70結合剤の用量は例えば毎日、週1回(毎週)、週2回、週3回、週4回、週5回、隔週、月1回又はその他必要に応じて投与できる。
【0175】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤の用量は最適用量未満に相当する(即ち、抗CD70結合剤(例えば抗体薬剤コンジュゲート)のEC50より低値)。例えば、抗CD70結合剤の用量は治療ウインドウの最低25%、最低15%、最低10%又は最低5%から選択される用量を含むことができる。本明細書においては、「治療ウインドウ」という用語は安全で効果的な治療をもたらす薬剤の用量又は身体系内のその濃度の範囲を指す。
【0176】
一部の実施形態においては抗CD70結合剤(例えば抗体薬剤コンジュゲート)の用量は約0.05mg/kg〜約1mg/kg、又は約0.1mg/kg〜約0.9mg/kg、又は約0.15mg/kg〜約0.75mg/kg対象体重である。このような用量は週当たり1〜約15回投与できる。各用量は同じかまたは異なっていることができる。例えば、抗CD70結合剤約0.15mg/kgの用量を4日、5日、6日又は7日の期間当たり、1〜10回投与できる。
【0177】
一部の実施形態においては、CD70結合剤を含む医薬組成物は更に治療薬(例えば非コンジュゲートの細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば本明細書に記載のものの何れか)を含むことができる。抗CD70結合剤は又免疫学的障害又はCD70発現癌の治療又は防止の為に治療薬1つ以上と組み合わせて同時投与することができる。例えば、複合療法は治療薬(例えば細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば未コンジュゲートの細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば癌又は免疫学的障害の治療の為に従来使用されているもの)を含むことができる。複合療法はまた活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞の表面上のCD70以外の受容体又は受容体複合体をターゲティングする薬剤の投与を包含できる。このような薬剤の例は、活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞の表面において分子に結合する第2の非CD70抗体を包含する。別の例はこのような受容体又は受容体複合体をターゲティングするリガンドを包含する。典型的には、このような抗体又はリガンドは活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞の細胞表面受容体に結合し、そして、活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞に細胞増殖抑制性又は細胞毒性のシグナルを送達することにより、抗CD70抗体の細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を増強する。そのような組合せ投与は疾患パラメーター(例えば症状の重症度、症状数、又は回帰の頻度)に対して相加的又は相乗的な作用を有する。
【0178】
組合せ投与に関する治療用法に関しては、特定の実施形態において、抗CD70結合剤は治療薬と同時に投与する。別の特定の実施形態において、治療薬は抗CD70抗体又は誘導体の投与の少なくとも1時間〜数ヶ月前又は後、例えば、抗CD70抗体又は誘導体の投与の前又は後少なくとも1時間、5時間、12時間、1日、1週間、1ヶ月又は3ヶ月に投与する。一部の実施形態においては、対象は抗CD70結合剤及び場合により治療薬の投与後にモニタリングする。
【0179】
治療薬は例えば癌細胞又は活性化免疫細胞に対して治療効果を示す何れかの薬剤であることができる。典型的には、治療薬は細胞毒性又は免疫調節性の薬剤である。そのような組合せ投与は疾患パラメーター(例えば症状の重症度、症状数、又は回帰の頻度)に対して相加的又は相乗的な作用を有する。
【0180】
細胞毒性又は免疫調節性の薬剤の有用なクラスは例えば抗チューブリン剤、オーリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製抑制剤、アルキル化剤(例えば白金複合体、例えばシスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)及び3核系白金複合体及びカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸エステル剤、代謝拮抗剤、化学療法剤感作剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、前形成化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線感作剤、ステロイド、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等を包含する。
【0181】
個々の細胞毒性又は免疫調節性の薬剤は例えば、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン)BSNU)、CC−1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルチシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン(アクチノマイシン)、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、アンエストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、ミトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ラパマイシン(Sirolimus)、ストレプトゾトシン、テノポセイド、6−チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP−16およびVM−26を包含する。
【0182】
一部の典型的な実施形態においては、治療薬は細胞毒性剤である。適当な細胞毒性剤は、例えば、ドラスタチン(例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE)、DNA副溝結合剤(例えば、エネジインおよびレキシトロプシン)、ドゥオカルマイシン、タキサン(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、プロマイシン、ビンカアルカロイド、CC−1065、SN−38、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンAおよびB、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、ディスコデルモリド、エレウテロビンおよびミトキサントロンを包含する。
【0183】
一部の実施形態においては、細胞毒性剤は従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、マイトマイシンC又はエトポシドである。一部の実施形態においては、治療薬は複合療法、例えば、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニソロン及びビンクリスチン)、CHOP−R(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソロン及びリツキシマブ)又はABVD(ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン)であることができる。CC−1065類縁体、カリケアマイシン、マイタンシン、ドラスタチン10の類縁体、リゾキシン及びパリトキシンのような薬剤を抗CD70抗体又はその誘導体に連結することができる。
【0184】
特定の実施形態においては、細胞毒性又は細胞増殖抑制性の薬剤はオーリスタチンE(オラスタチン−10としても当該分野では知られている)又はその誘導体である。典型的にはオーリスタチンE誘導体は例えばオーリスタチンEとケト酸の間に形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンEをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させることによりAEB及びAEVBをそれぞれ生成することができる。他の型のオーリスタチン誘導体はAFP、MMAF及びMMAEを包含する。オーリスタチンE及びその誘導体の合成及び構造は米国特許出願公開20030083263及び20050009751)、国際特許出願PCT/US03/24209,国際特許出願PCT/US02/13435及び米国特許6,323,315;6,239,104;6,034,065;5,780,588;5,665,860;5,663,149;5,635,483;5,599,902;5,554,725;5,530,097;5,521,284;5,504,191;5,410,024;5,138,036;5,076,973;4,986,988;4,978,744;4,879,278;4,816,444;及び4,486,414に記載されている。
【0185】
特定の実施形態においては、細胞毒性剤はDNA副溝結合剤である(例えば米国特許6,130,237参照)。例えば、一部の実施形態においては、副溝結合剤はCBI化合物である。別の実施形態においては、副溝結合剤はエネジイン(例えばカリケアマイシン)である。
【0186】
抗チューブリン剤の例は、限定しないが、タキサン類(例えば、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、Taxotere(登録商標)(ドキセタキセル))、T67(ツラリク)、ビンカアルカロイド(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデジンおよびビノレルビン)及びドラスタチン(例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)を包含する。他の抗チューブリン剤は例えばバクカチン誘導体、タキサン類縁体(例えば、エポチロンA及びB)、ノコダゾール、コルチシンおよびコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリドおよびエレウテロビンを包含する。
【0187】
一部の実施形態においては、細胞毒性剤はマイタンシノイド、即ち別のグループの抗チューブリン剤である。例えば、特定の実施形態においては、マイタンシノイドはマイタンシン又はDM−1(ImmunoGen,Inc.;Chari etal.,1992,Cancer Res. 52: 127−131も参照)。
【0188】
一部の実施形態においては、治療薬は放射性同位体ではない。一部の実施形態においては、治療薬はリシン又はサポリンではない。
【0189】
特定の実施形態において、治療薬は抗VEGF剤、例えばAVASTIN(ベバシズマブ)又はNEXAVAR(ソラフェニブ);PDGFブロッカー、例えばSUTENT(スニチニブマレエート);又はキナーゼ阻害剤、例えばNEXAVAR(ソラフェニブトシレト)である。
【0190】
一部の実施形態においては、細胞毒性又は免疫調節性の薬剤は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は例えば、プリン拮抗剤(例えば、アゾチオプリン又はマイコフェノレートモフェチル)、ジヒドロフォレート還元酵素阻害剤(例えば、メトトレキセート)、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット又はトリフルリジンであることができる。
【0191】
他の実施形態においては、細胞毒性又は免疫調節性の薬剤はタクロリムス、シクロスポリン又はラパマイシンである。別の実施形態においては、細胞毒性剤はアルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アルセニックトリオキシド、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ゴセレリン、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブメシレート、インターフェロンアルファ−2a、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、メクロレタミン又は窒素マスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトクスサレン、ミトマイシンC、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオネート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン又はゾレドロネートである。
【0192】
別の実施形態において、治療薬は抗体、例えばヒト化抗HER2モノクローナル抗体、RITUXAN(リツキシマブ:Genentech;キメラ抗CD20モノクローナル抗体);OVAREX(AltaRex Corporation,MA);PANOREX(Glaxo Wellcome,NC;マウスIgG2a抗体);セツキシマブエルビツクス(Imclone Systems Inc.,NY;抗−EGFRIgGキメラ抗体);ビタキシン(MedImmune,Inc.,MD;Campath I/H(Leukosite,MA;ヒト化IgG1抗体);Smart MI95(Protein Design Labs,Inc.,CA;ヒト化抗−CD33IgG抗体);リムフォシド(Immunomedics,Inc.,NJ;ヒト化抗−CD22IgG抗体);Smart ID10(Protein Design Labs,Inc.,CA;ヒト化抗−HLA−DR抗体);オンコリム(Techniclone,Inc.,CA;放射線標識マウス抗−HLA−Drl 0 抗体);アロムン(BioTransplant,CA;ヒト化抗−CD2 mAb);アバスチン(Genentech,Inc.,CA;抗−VEGFヒト化抗体);エプラツザマブ(Immunomedics,Inc.,NJ及びAmgen,CA;抗−CD22抗体);及びCEAcide(hmnunomedics,NJ;ヒト化抗−CEA抗体);又は抗CD40抗体(例えば米国特許6,838,261に開示されているもの)である。
【0193】
他の適当な抗体は、限定しないが、以下の抗原、即ち、CA125、CA15−3、CA19−9、L6、Lewis Y、Lewis X、アルファフェトプロテイン、CA 242、プラセンタルアルカリフォスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸フォスフェターゼ、表皮性成長因子、MAGE−1、MAGE−2、MAGE−3、MAGE−4、抗トランスフェリン受容体、p97、MUC1−KLH、CEA、gp100、MART1、前立腺特異的抗原、IL−2受容体、CD20、CD52、CD30、CD33、CD22、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン、CD38、CD40、ムチン、P21、MPG、及びノイオンコゲン生成物に対する抗体を包含する。
【0194】
一部の実施形態においては、治療剤は免疫調節性の薬剤である。免疫調節性の薬剤は例えばガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、REVLIMID(レナリドマイド)、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコエノレートモフェチル又はメトトレキセートであることができる。或いは免疫調節性の薬剤は例えば糖質コルチコイド(例えばコルチゾール又はアルドステロン)又は糖質コルチコイド類縁体(例えばプレドニソン又はデキサメタゾン)であることができる。
【0195】
一部の典型的な実施形態においては、免疫調節性の薬剤は抗炎症剤、例えばアリールカルボン酸誘導体、ピラゾール含有誘導体、オキシカム誘導体及びニコチン酸誘導体である。抗炎症剤のクラスは例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、5−リポキシゲナーゼ阻害剤及びロイコトリエン受容体拮抗剤を包含する。一部の実施形態において、免疫調節性の薬剤はサイトカイン、例えばG−CSF、GM−CSF又はIL−2である。
【0196】
適当なシクロオキシゲナーゼ阻害剤はメクロフェナミン酸、メフェナミン酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサール、フェンブフェン、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダック、タノキシカム、トルメチン及びアセチルサリチル酸を包含する。
【0197】
適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は、酸化還元系阻害剤(例えばカテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン、インダゾリノン、ナファザトロム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシアミン)及び非酸化還元系阻害剤(例えばヒドロキシチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピラン及びその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウエリック酸及びボスウエリック酸のアセチル化誘導体、及び、シクロアルキル基で置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸)及び酸化還元系阻害剤の前駆体を包含する。
【0198】
他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は抗酸化剤(例えばフェノール、プロピルガレート、フラボノイド及び/又はフラボノイドを含有する天然に存在する基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール、カルコンの誘導体、4,2’,4’−トリヒドロキシカルコン、オルト−アミノフェノール、N−ヒドロキシ尿素、ベンゾフラノール、エブセレン及び還元性セレノ酵素の活性を増大させる物質種)、鉄キレート化剤(例えばヒドロキサム酸及びその誘導体、N−ヒドロキシ尿素、2−ベンジル−1−ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノソールトロックスC,カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジレウトン、5−ヒドロキシアントラニル酸及び4−(オメガ−アリールアルキル)フェニルアルカン酸)、イミダゾール含有化合物(例えばケトコナゾール及びイトラコナゾール)、フェノチアジン及びベンゾピラン誘導体を包含する。
【0199】
更に他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤はエイコサノイド(例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸及びドコサキサエン酸およびそれらのエステル、PGE1(プロスタグランジンE1),PGA2(プロスタグランジンA2),ビプロストール、15−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、15−モノヒドロキシ−エイコサトリエン酸及び15−モノヒドロキシエイキサペンタセン酸、及びロイコトリエンB5、C5及びD5)、カルシウム流動を妨害する化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フォスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、カフェイン酸、5,8,11,14−エイコサテトラエン酸(ETYA),ヒドロキシフェニルレチンアミド、イオナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリールスルフィド及びジ(1−プロペニル)スルフィドを包含する。
【0200】
ロイコトリエン受容体拮抗剤はカルシトリオール、オンタゾラスト、Bayer Bay−x−1005、Ciba−Geigy CGS−25019C、ebselen、Leo Denmark ETH−615、Lilly LY−293111、Ono ONO−4057、Terumo TMK−688、Boehringer Ingleheim BI−RM−270、Lilly LY 213024、Lilly LY 264086、Lilly LY 292728、Ono ONO LB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF 10042、Rhone−Poulenc Rorer RP 66153、SmithKline Beecham SB−201146、SmithKline Beecham SB−201993、SmithKline Beecham SB−209247、Searle SC−53228、Sumitamo SM 15178、American Home Products WAY 121006、Bayer Bay−o−8276、Warner−Lambert CI−987、Warner−Lambert CI−987BPC−15LY 223982、Lilly LY 233569、Lilly LY−255283、MacroNex MNX−160、Merck and Co. MK−591、Merck and Co. MK−886、Ono ONO−LB−448、Purdue Frederick PF−5901、Rhone−Poulenc Rorer RG 14893、Rhone−Poulenc Rorer RP 66364、Rhone−Poulenc Rorer RP 69698、Shionoogi S−2474、Searle SC−41930、Searle SC−50505、Searle SC−51146、Searle SC−52798、SmithKline Beecham SK&F−104493、Leo Denmark SR− 2566、Tanabe T−757及びTeijin TEI−1338を包含する。
【0201】
本発明は更に以下の実施例において説明するが、これ等は本発明の範囲を制限する意図はない。以下の実施例に記載する細胞系統はAmerican Type Culture Collection(ATCC)又はDeutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany(DMSZ)により特定された、又は他の知られた条件に従った培養において維持した。細胞培養試薬はInvitrogen Corp.,Carlsbad,CAより入手した。
【実施例】
【0202】
(実施例1):ヒト化抗CD70抗体改変体の製造
抗CD70マウスモノクローナル抗体である1F6、及び、1F6のキメラ改変体c1F6の重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号1、2,21及び22に示す通りである。(2005年1月19日出願の米国特許出願60/645,355も参照)。1F6のヒト化の為にヒトアクセプター配列はヒト生殖細胞エキソンVH、JH、Vκ及びJκの配列から選択した。c1F6VHドメインのヒト化のためのアクセプター配列は生殖細胞系統のVHエキソンVH1−18(Matsuda et al.,1993,Nature Genetics 3:88−94)又はVH1−2(Shin et al.,1991,EMBO J.10:3641−3645)及びJH−6(Mattila et al.,1995,Eur,J.Immunol.25:2578−2582)から選択した。生殖細胞系統VκエキソンB3(Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827−836)及びJκエキソンJκ−1(Hieter et al.,1982,J.Biol.Chem.257:1516−1522)を1F6VLドメインヒト化のためのアクセプター配列として選択した。Kabatの定義に従って決定した1F6マウスCDRは、選択されたヒト生殖細胞系統鋳型にグラフとした。慨すれば、ヒト化VH又はVLドメインに渡る合成のオーバーラップオリゴヌクレオチドを形成し、そしてPCRオーバーラップ伸長を用いて各ドメインを組み立てた。PCR産物に組み込んだ制限部位を用いてVH又はVLドメインをそれぞれヒトIgG1定常ドメイン又はカッパ定常ドメインにインフレームとなるようにpCMV発現ベクター内に指向性にクローニングした。
【0203】
幾つかのフレームワーク位置をマウスドナー残基再導入の為に選択した。それらはKabatのナンバリング規則に従えばVHドメインのH46、H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82、H82A及びH91位であった。L25及びL33位におけるマウスCDR1残基をその位置のヒトアクセプター残基の導入のために選択したが、VLドメインのフレームワーク位置は改変されなかった。
【0204】
VHドメインにおけるマウスフレームワークドナー残基又はVLドメインにオ稀有rヒトCDR残基の異なる組合せを組み込むことによりヒト化1F6の幾つかの改変体を形成した。これ等の改変体を以下の表2及び3に総括する。
【0205】
【化66】
【0206】
【化67】
マウス及びヒトVH配列を有するヒト化改変体の数種の間の相違を図1及び2に示す。1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−2及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VH改変体hVHE及びhVHJのアライメントを図1に示す。1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−18及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VH化改変体hVHH及びhVHMのアライメントを図2に示す。1F6mVL及びヒト生殖細胞系VKエキソンB3及びJKエキソンJK−1を有するヒト化1F6VL改変体hVLAのアライメントを図3に示す。
【0207】
(実施例2)ヒト化1F6改変体の結合親和性
ヒト化1F6改変体HDLA(hVHD及びhVLA)、HHLA(hVHH及びhVLA)及びHJLA(hVHJ及びhVLA)を結合親和性分析の為に選択した。各ヒト化抗体及びc1F6の1mgを293細胞において一過性に発現させ、そしてEu−N1ヨードアセトアミドキレート(Perkin Elmer)を用いてユーロピウムで標識した。CD70陽性細胞系統のパネルへの飽和結合を各標識抗体につき試験した。選択した細胞系統は、定量的フローサイトメトリー(又は蛍光活性化細胞ソーティング、即ちFACS)で調べた場合の抗原コピー/細胞がそれぞれ30,000、99,000,235,000及び252,000のACHN、Caki−2、Caki−1及び786−Oとした。
【0208】
ユーロピウム標識抗体は96穴プレート中ある範囲の濃度に渡って4℃において1時間細胞と共にインキュベートした。インキュベーションの後、をEnhancement Buffer(Perkin Elmer)中に細胞を再懸濁することによりユーロピウムを放出させた。蛍光はFusionHTプレートリーダーにおいて、トップディテクターフォーマット及び335nm励起及び620nm放射を用いて読み取った。データはGraphPad Prism 4を用いて1結合部位双曲線にフィットさせた。結果を表4において以下に示す。
【0209】
【化68】
ヒト化改変体に関するKD値は試験した細胞系統の全てにおいてc1F6に極めて類似しており、ヒト化の過程が抗原結合活性を大きく低減しないことを裏付けていた。
【0210】
(実施例3)ヒト化1F6のADCC活性
ヒト化1F6抗体改変体がCD70+細胞系統WIL2−S、786−O及び769−Pに対してADCCを媒介する能力を標準的な51Cr放出試験を用いて測定した。ヒト化1F6のHHLA、HJLA及びHELA改変体は等しく、そして用量依存的な態様においてWIL−2S標的細胞を溶解した。これとは対照的に、CD70結合マウス1F6(m1F6)又は非結合対照ヒトIg(hIg)を投与した腫瘍細胞は殺傷されなかった(図4A)。同様にヒト化1F6はキメラ1F6に匹敵する態様において2種の腎細胞癌標的の溶解を媒介した(図4B)。
【0211】
(実施例4)ヒト化1F6のCDC活性
CDCを媒介するヒト化1F6の能力を多発性骨髄腫細胞系統(LP−1)及び2種のリンパ腫細胞系統(MHHPreB−1及びWIL2−S)を用いて調べた。標的細胞に段階的な用量のキメラ1F6、ヒト化1F6HJLA又は非結合ヒトIg対照を正常ヒト血清存在下に投与した。2時間37℃でインキュベートした後、溶解した細胞をヨウ化プロピジウム(5μg/mL)添加後にフローサイトメトリーにより識別した。ヨウ化プロピジウムで染色された細胞は、抗体媒介補体活性化及び膜攻撃複合体の形成の結果として、原形質膜の一体性を消失していると考えられる。この試験を用いた場合、キメラ1F6及びヒト化1F6は等しい態様において各標的の用量依存的溶解を媒介した(図5)。
【0212】
(実施例5)ヒト化1F6のADCP活性
貪食作用を媒介するヒト化1F6の能力を赤色蛍光膜染料で予備標識したCD70+腎細胞癌系統786−Oを用いて調べた。標的細胞に段階的な用量のキメラ1F6、ヒト化1F6HJLA又は非結合ヒトIg対照を投与し、次にGM−CSF中で培養した付着末梢血単球から形成したマクロファージと混合した。1時間37℃でインキュベートした後、マクロファージ細胞表面マーカーCD11bに対する緑色蛍光抗体でマクロファージを検出した。腫瘍細胞を貪食したマクロファージはフローサイトメトリーで検出した場合に二重赤色緑色蛍光により識別した。二重陽性集団におけるマクロファージ内の腫瘍細胞の存在は蛍光顕微鏡観察により確認した。図6に示す通り、キメラ及びヒト化1F6は抗体用量依存的態様において、そして等しい程度まで標的細胞の貪食を促進した。これとは対照的に、非結合対照抗体と共にインキュベートした標的細胞は最小限しかマクロファージにより取り込まれなかった。
【0213】
(実施例6)ヒト化1F6改変体薬剤コンジュゲートのインビトロ細胞毒性活性
ヒト化1F6改変体HELA(hVHE及びhVLA)、HHLA,HJLA及びHMLA(hVHM及びhVLA)及びc1F6を293細胞において一過性に発現させ、抗体当たり平均8薬剤単位のローディング水準においてvcMMAF(2005年10月27日に米国特許公開2005−0238649として公開された米国特許出願10/983,340に記載)にコンジュゲートした。得られたコンジュゲート、h1F6HELA−F8、h1F6HHLA−F8、h1F6HJLA−F8、h1F6HMLA−F8およびc1F6−F8を2種のCD70発現細胞系統786−O及びCaki−1に対する細胞毒性について試験した。コンジュゲートは92時間細胞と共にインキュベートし、その後、50μMレサズリンを添加した。4時間のインキュベート時間の後、染料の還元をFusionHT蛍光プレートリーダー(Packard Instrument,Meriden,CT)を用いて測定した。3連のサンプリングの結果を表5において以下に示す。4種全てのヒト化改変体のIC50値は試験した両方の細胞系統においてc1F6の2倍内の活性を有し、力価の順位はc1F6−F8>h1F6HHLA−F8>h1F6HMLA−F8>h1F6HJLA−F8>h1F6HELA−F8であった。
【0214】
【化69】
【0215】
【化70】
(実施例7)ヒト化1F6薬剤コンジュゲートのインビボスクリーニング
ヒト化1F6改変体HDLA、HHLA,HJLA及びHELAを293細胞において一過性に発現させ、抗体当たり8薬剤単位のローディング水準においてvcMMAF(2005年10月27日に米国特許公開2005−0238649として公開された米国特許出願10/983,340に記載)にコンジュゲートした。3mg/kg又は10mg/kgの単回用量の薬効試験をヌードマウスにおいて786−O腎細胞癌固形腫瘍モデルにおいて実施した。腫瘍体積は腫瘍移植後80日間定期的に測定した。結果によれば、腫瘍の体積は未投与マウスと比較して全投与マウスにおいて大きく低減し、そしてmcMMAFにコンジュゲートした全てのヒト化1F6改変体はc1FmcMMAFに薬効において匹敵していた。
【0216】
(実施例8)播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫のSCIDマウス異種移植片モデルにおけるヒト化1F6のインビボの活性
ヒト化1F6(HJLA)のインビボの抗腫瘍活性を播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫の異種移植片マウスモデルにおいて調べた。播種性疾患を樹立するために1x105Raji又は1x107MM1.S又はL363細胞をC.B.−17SCIDマウスの外側尾静脈中に注射した。マウスにヒト化1F6(HJLA)又は対照非結合抗体を腹腔内(ip)注射により4日毎に合計6回(Raji)又は外側尾静脈への静脈内注射により週一回合計4週間(MM.1S及びL363)、細胞移植後1日目から投与した。安楽死を要する疾患は屈曲姿勢及びグルーミングの消失、体重減少、頭部浮腫及び後肢の麻痺により、そしてL363担持マウスにおいては、触診可能なリンパ様組織関連の腫瘍の形成により顕在化した。
【0217】
結果によれば、各腫瘍モデルにおいて(図7A、7B及び7C)、ヒト化1F6を投与したマウスの生存は未投与マウス又は非結合対照抗体投与マウスのものと比較して顕著に延長された。ヒト化1F6投与の作用は個々のマウスの血清中の腫瘍誘導モノクローナル蛋白(λ軽鎖)の濃度を測定することにより多発性骨髄腫異種移植片(L363及びMM.1S細胞)において更に評価した。図7B及び7C(右パネル)に示す通り、循環系中のλ軽鎖の濃度は未投与マウスと比較してヒト化1F6投与マウスにおいて顕著に低下していた。ヒト化1F6を投与されたL363担持マウスのλ軽鎖の平均血清中濃度は0.006μg/mLであったのに対し、未投与マウスの血清では0.10μg/mLであった。同様に、ヒト化1F6投与MM.1S担持マウスにおけるλ軽鎖濃度は0.03μg/mLであったのに対し、未投与マウスでは1.25μg/mLであった。これ等の結果はマウスにおける上昇した生存率と合致していた(図7B及び7C、右パネル)。
【0218】
(実施例9)ヒト化1F6抗体によるCD70+抗原特異的T細胞のインビトロの枯渇
抗原特異的活性化T細胞を枯渇させるヒト化1F6抗体の能力を試験するために、HLA−A0201を発現する正常ドナー由来のPBMCを種々の濃度のヒト化抗CD70抗体の存在下又は非存在下にM1ペプチドで刺激した。ヒト化1F6抗体(HJLA)は上記の通り製造した。PMBCはIL−2及びIL−5を添加した培地2mL中5μg/mLのM1ペプチドと共に、5x106個/mLの細胞密度で24穴プレート中に播種した。第5日において、培養上澄み半分を新しいサイトカイン含有培地と交換した。第9日に、抗原反応性細胞(CD8+/Vβ17+集団)のパーセントをFITCコンジュゲート抗Vβ17及びPE−Cy5コンジュゲート抗CD8抗体で染色した細胞のフローサイトメトリー分析により測定した。
【0219】
図8Aは抗原特異的CD8+/Vβ17+細胞が抗体非存在下培養物中全生細胞の33%となるまで増殖したことを示す。これとは対照的に、第0日に培地にヒト化1F6を添加した場合、抗体用量依存性態様において抗原反応性集団の増殖は顕著に制限された。これ等の結果はヒト化1F6が抗原活性化T細胞を選択的にターゲティングし、その増殖を防止することを示している。
【0220】
第2の試験(図8B)においては、M1ペプチド刺激培養物を未投与とするか、又は、ヒト化1F6の投与をFcγRIII(CD16)を特異的にブロックする抗体の非存在下又は存在下に行った。未投与の培養物においては、抗原特異的CD8+Vβ17+集団は培養物中の全生細胞の39%となるまで増殖した。ヒト化1F6の天下により反応性集団の増殖は顕著に減衰した。この活性はFcγRIII受容体が抗CD16特異的抗体によりブロックされた場合に大部分が温存され、ペプチド反応性細胞の欠失はFcgRIII担持エフェクター細胞とのヒト化1F6の相互作用を介して媒介されたことを示していた。
【0221】
(実施例10)抗CD70抗体は抗原陰性バイスタンダー細胞に影響しない。
【0222】
抗原陰性バイスタンダーT細胞に対する1F6媒介枯渇の作用を測定するために、CD4及びCD8リンパ球のTCRVβファミリー提示を、未投与又は1F6のキメラ改変体(c1F6)(ヒトIgG1アイソタイプ)投与のM1活性化培養物中において調べ、休止期の非抗原刺激PBMCと比較した。キメラ及びヒト化1F6改変体は結合親和性、エフェクター機能媒介能力及び活性化CD8+T細胞サブセットを枯渇させる能力において同等である。
【0223】
図9に示す通り、HLA−A0201+PBMCのM1ペプチドによる刺激はVβ17TCR担持CD8+細胞の増殖を約30倍としたのに対し、CD8+細胞において試験した全ての他のVβTCRファミリー及びCD4細胞集団において試験した全ファミリーは最小限の変化を示すのみであった。対照集団においては、細胞の増殖はVβ17+CD8+T細胞サブセットのみに限定され、これ等は<1%CD8+細胞〜27%に増大し;この観察結果はM1ペプチドの免疫応答の特異性を確認するものであった。CD70特異的抗体の非存在に刺激したT細胞とは異なり、M1ペプチド特異的CD8+細胞の増殖は培地へのc1F6抗体の添加により防止された。c1F6抗体の存在下において、パーセントVβ17+CD8+細胞は休止期の非ペプチド刺激細胞のものと同等であった。c1F6抗体投与は他のCD8+又はCD4+VβTCRファミリーの相対的提示を大きく変化させず;何れの群の排除も観察されなかった。これ等のデータはc1F6抗体への曝露は、バイスタンダーT細胞集団に検出可能な同時発生的損傷を生じさせること無く、CD70+活性化T細胞を選択的に枯渇させることを示している。
【0224】
(実施例11)腎細胞癌のマウス異種移植片モデル
786−O皮下異種移植片モデルを用いて種々の用量と日程により投与した抗CD70ADCの抗腫瘍活性を評価した。皮下786−O腫瘍は約30mm3の腫瘍フラグメント(群当たりN=5又は6)を移植することによりヌードマウス中に発癌開始させた。腫瘍を生育させ、平均腫瘍サイズが約100mm3となった時点で投与を開始した。腫瘍の寸法はカリパス計測により測定し、生育をモニタリングした。腫瘍サイズは(長さx幅2)/2の式を用いて計算した。何れの投与も行わない場合、平均腫瘍体積は腫瘍移植後40〜50日以内に約60mm3にまで増大する(図10参照)。腫瘍生育抑制における用量依存的作用はヒト化1F6−mcMMAF4(抗体当たり4薬剤単位の平均のローディング水準のHJLA)又はヒト化1F6−vcMMAF4(抗体当たり4薬剤単位の平均のローディング水準のHJLA)を投与されたマウスにおいて観察された。腫瘍生育の検出可能な遅延はそれぞれ0.5及び0.17mg/kgのh1F6−mcMMAF4及びh1F6−vcMMAF4においても観察された。
【0225】
腫瘍生育は又、腫瘍のサイズが4倍になるために必要な時間によっても評価した(図10B参照)。h1F6−mcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4のいずれかを0.17mg/kgで投与することにより腫瘍生育は顕著に遅延した。この遅延はADCをq4dx4又はq4dx10の日程で投与した場合に観察された。しかしながら、q4dx10の日程により例示される通り追加的投与はq4dx4日程と比較してより強力な生育抑制活性を有すると観察された。
【0226】
(実施例12)多発性骨髄腫細胞系統上のCD70の発現
細胞表面CD70発現を多発性骨髄腫細胞系統のパネルにおいて評価した(表6)。QIFIKit(登録商標)(Dako,Carpinteria,CA)を用いた定量的フローサイトメトリーにより各細胞系統により発現されたCD70分子のコピー数を測定した。これ等の細胞の抗CD70ADC媒介細胞毒性に対する応答を測定した。本モデルにおいては、キメラ抗CD70ADCの活性はヒト抗CD70ADCの活性に近似している。両方のキメラ1F6(c1F6)−vcMMAF4及びc1F6−mcMMAF4はCD70発現多発性骨髄腫細胞に対して細胞毒性であった。c1F6−vcMMAF4で得られたIC50値は1.2〜160ng/mLの範囲であり、c1F6−mcMMAF4で得られた値は1.7〜500ng/mLの範囲であった。
【0227】
(表6)
(多発性骨髄腫細胞系統に対するキメラ抗CD70ADCの細胞毒性活性)
【0228】
【化73】
【0229】
【化74】
(実施例13)多発性骨髄腫のマウス異種移植片モデル
多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおける抗CD70ADCのインビボ活性を更に調べた。ヒト多発性骨髄腫細胞系統MM−1S(図11A&11B)又はL363(図12A&12B)を10x106個/300μLの細胞濃度でRPMI−1640培地中に再懸濁した。腫瘍を樹立するために、細胞懸濁液300μLをSCIDマウスの尾部静脈から静脈内注射した。MM−1Sモデルにおいては、未投与のマウスは注射された腫瘍が蔓延し、腫瘍移植後約40日で後肢麻痺、屈曲姿勢、頭部浮腫及び/又は不良な表皮状態を包含する症状が顕在化した。これ等の症状の1つ以上を示したマウスは安楽死させた。h1F6(HJLA)−vcMMAF4及びh1F6(HJLA)−mcMMAF4の両方とも対照の非結合IgG−vcMMAF4及びIgG−mcMMAF4と比較して腫瘍担持マウスに顕著な生存の利益をもたらした(図11A参照)。MM−1Sモデルにおける腫瘍負荷はまたMM−1S細胞により発現される血漿細胞マーカーであるヒトCD138を発現している骨髄細胞の数を計数することによっても評価した。骨髄細胞は症状顕在化のため、又は、第122日の実験終了時に安楽死させたマウスから回収し、CD138発現MM−1S細胞の数をフローサイトメトリーにより測定した。未投与マウスと比較して、両方の対照IgG−vcMMAF4及びIgG−mcMMAF4は骨髄中のCD138発現細胞の数を顕著に低減しなかった。一方、h1F6−vcMMAF4及びh1F6−mcMMAF4は対照ADCと比較して、骨髄CD138発現細胞の遥かに低値の数により明らかにされる通り、腫瘍負荷を顕著に低減している(図11B参照)。
【0230】
L363モデルにおいては、播種性腫瘍塊は投与を受けないマウスでは複数個所に発生し、そして腫瘍塊は腫瘍注射後約40日には触診可能となり、その時点で腫瘍担持マウスを安楽死させる。MM−1Sモデルと同様、対照のIgG−vcMMAF4は生存利点を全くもたらさなかったのに対し、h1F6−vcMMAF4は生存を顕著に延長した(図12A参照)。L363細胞は免疫グロブリンラムダ軽鎖(λLC)を分泌するため、腫瘍負荷は腫瘍担持マウスの血漿中のヒトλLCの濃度をモニタリングすることにより測定できる。分泌されたλLCを検出するためにELISAを使用した。96穴平底イムノプレート(Nunc Maxisorp,#442404,Nalge Nunc International,Rochester,NY)を4℃で一夜0.1M炭酸/重炭酸ナトリウム中2μg/mLのヤギ抗ヒトIg(Southern Biotech#2010−01,Birmingham,AL)100μL/ウェルでコーティングした。ウェルを1xPBST(PBS、0.05%Tween−20)で5回洗浄し、そして室温で1時間1%BSA/PBST(0.05%Tween−20)200μL/ウェルでブロックした。1xPBSTで5回洗浄した後、連続希釈したヒトλLC含有マウス血清試料を添加した。精製したヒトλLC(Bethyl labs,#P80−127,Montgomery,TX)を標準物質として使用した。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを1xPBSTで5回洗浄した。1%BSA/PBST中1:4000希釈したHRP−ヤギ抗ヒトラムダ鎖特異的F(ab’)2(Southern Biotech,#2072−05)を添加した。室温で更に1時間インキュベートした後、ウェルを1xPBSTで5回洗浄した。TMB基質100μL/ウェル(Sigma,#T8665,St.Louis,MO)を用いて捕獲されたλLCを検出した。図12BはL363細胞移植後40日の血漿の結果を示す。λLC濃度は未投与マウスとIgG−vcMMAF4投与マウスの間で同等であった。一方、h1F6−vcMMAF4投与マウスの血清中λLC濃度は顕著に低値であり、多発性骨髄腫異種移植片担持マウスにおける腫瘍負荷を低減する抗CD70ADCの能力を裏付けていた。
【0231】
(実施例14)ホジキン及び神経膠芽腫細胞系統上のCD70の発現
細胞表面CD70発現はまたホジキン病(表7)及び神経膠芽腫細胞系統(表8)のパネルにおいても評価した。QIFIKit(登録商標)(Dako,Carpinteria,CA)を用いた定量的フローサイトメトリーにより各細胞系統により発現されたCD70分子のコピー数を測定した。これ等の細胞のキメラ抗CD70ADC媒介細胞毒性に対する応答を測定した。本モデルにおいては、キメラ抗CD70ADCの活性はヒト抗CD70ADCの活性に近似している。両方のキメラ1F6(c1F6)−vcMMAF4及びc1F6−mcMMAF4はCD70発現多発性骨髄腫細胞に対して細胞毒性であった。ホジキン病パネルにおいては、c1F6−vcMMAF4で得られたIC50値は0.41〜42ng/mLの範囲であり、c1F6−mcMMAF4で得られた値は5.2〜310ng/mLの範囲であった(表7)。神経膠芽腫パネルにおいては、h1F6−vcMMAF4で得られたIC50値は2.3〜27ng/mLの範囲であり、h1F6−mcMMAF4で得られた値は15〜110ng/mLの範囲であった(表8)。
【0232】
【化76】
本発明は本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されない。実際、本明細書に記載したものの他に本発明の種々の変更例が上記説明及び添付図面より当業者には明らかになる。このような変更例は添付請求項の範囲内に含まれることを意図している。
【0233】
特許出願、特許及び特定の出版物を包含する種々の参考文献が本明細書において引用されており、その各々の開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0234】
【図1】図1は1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−2及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VHヒト化改変体hVHE及びhVHJのアライメントである。アライメントにおいて、<・>はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。hVHjのH46におけるハイライトのリジン残基(K)はマウス残基への復帰突然変異を示す。下線を付されたアミノ酸残基はKabatの定義に従ったCDR1及びCDR2における位置を示し、一方、箱内の残基はChothiaの定義により識別される相当するCDRにおける位置を示す。37、39、45、47、95及び97位にあるような<^>はVH/VLインターフェイスに関与する残基を示す。
【図2】図2は1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−18及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VHヒト化改変体hVHH及びhVHMのアライメントである。アライメントにおいて、<・>はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。hVHMのH46、H67、H68、H69、H70及びH71におけるハイライトの残基はマウス残基への復帰突然変異を示す。同様にhVHHのH67、H68、H69、H70、H71、H80、H82及びH82Aにおけるハイライトの残基はマウス残基への復帰突然変異を示す。下線を付されたアミノ酸残基はKabatの定義に従ったCDR1、CDR2及びCDR3における位置を示し、一方、箱内の残基はChothiaの定義により識別される相当するCDRにおける位置を示す。37、39、45、47、98及び100位にあるような<^>はVH/VLインターフェイスに関与する残基を示す。
【図3】図3は1F6mVL及びヒト生殖細胞系VKエキソンB3及びJKエキソンJK−1を有するヒト化1F6VL改変体hVLAのアライメントである。アライメントにおいて、<・>はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。下線を付されたアミノ酸残基はKabatの定義に従ったCDR1、CDR2及びCDR3における位置を示し、一方、箱内の残基はChothiaの定義により識別される相当するCDRにおける位置を示す。42、44、50、52及び93位にあるような<^>はVH/VLインターフェイスに関与する残基を示す。
【図4A】図4Aはヒト化1F6抗CD70抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を媒介することを示す。Na251CrO4標識標的細胞(WIL2−SBリンパ芽様細胞、786−O腎癌細胞及び769−P腎細胞癌細胞)を抗体でコーティングし、末梢血単核細胞(PBMC)と共に、10CD16+(FcγIII受容体)細胞vs1標的細胞のエフェクターvs標的比においてインキュベートした。4時間後、溶解した細胞の上澄みをシンチレーションカウンター上で測定した。パーセント特異的溶解は{(被験試料cpm−自発的cpm)÷(総cpm−自発的cpm)}x100として計算した。点は3連の試料の平均±標準偏差を示す。図4Aは非結合抗体対照hIgG1及びマウス1F6抗体と比較した場合のヒト化1F6改変体HHLA、HJLA及びHELAにより媒介されるADCC活性を示す。
【図4B】図4Bはヒト化1F6抗CD70抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を媒介することを示す。Na251CrO4標識標的細胞(WIL2−SBリンパ芽様細胞、786−O腎癌細胞及び769−P腎細胞癌細胞)を抗体でコーティングし、末梢血単核細胞(PBMC)と共に、10CD16+(FcγIII受容体)細胞vs1標的細胞のエフェクターvs標的比においてインキュベートした。4時間後、溶解した細胞の上澄みをシンチレーションカウンター上で測定した。パーセント特異的溶解は{(被験試料cpm−自発的cpm)÷(総cpm−自発的cpm)}x100として計算した。点は3連の試料の平均±標準偏差を示す。図4Bはキメラ1F6及びヒト化1F6改変体HJLA及びhIgG1により媒介された腎細胞癌細胞系統の抗体指向性溶解を示す。
【図5】図5はヒト化1F6抗CD70改変体HJLAが補体依存性細胞性細胞毒性(CDC)を媒介することを示している。LP−1、MHHPreB−1及びWIL−S標的細胞を補体原料としてのヒト血清の存在下にキメラ1F6、ヒト化1F6(HJLA)又は非結合ヒトIgと混合した。37℃2時間の後、ヨウ化プロピジウムを添加し、フローサイトメトリーにより測定されるものとして細胞の生存性を調べ、そして溶解活性の量を計算した。バーは3連の試料の平均±標準偏差を示す。
【図6】図6はヒト化1F6抗CD70抗体が抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)を媒介することを示す。786−OCD70+腎細胞癌標的細胞を赤色蛍光細胞膜染料(PKH26、Sigma−Aldrich,Inc.,St.Louis,MO)で標識し、次に氷上30分間、キメラ1F6、ヒト化1F6(HJLA)又は非結合ヒトIgでコーティングした。標識された抗体投与標的細胞を37℃において、1マクロファージvs4標的細胞の比で単球誘導マクロファージと混合した。マクロファージはAlexaFluor(登録商標)488(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)抗CD11b抗体で染色し、そしてパーセント貪食活性はフローサイトメトリーで分析した場合に二重蛍光を示すマクロファージのパーセントにより求めた。
【図7】図7は播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおけるマウスの生存をヒト化1F6抗CD70抗体が延長することを示している。(A)Raji細胞を注射し、そしてヒト化1F6抗体又は対照非結合抗体を投与したマウスの生存性。投与は腫瘍細胞注射後1日に開始し、そして合計6投薬につき4日毎に腹腔内注射により投与した(群当たりn=10)。(B、C、左パネル)L363−又はMM.1S−細胞を注射し、そして細胞移植後1日からヒト化1F6投与を開始したマウスの生存性を示す。抗体は合計5投薬につき週一回の静脈内注射により投与した。マウスは週2回モニタリングし、疾患の顕在化の時点で安楽死させた(群当たりn=7)。(B、C、右パネル)L363−又はMM.1S−細胞を注射したマウスから採取した血清中のλ軽鎖濃度の分析。試料はそれぞれ腫瘍注射後35及び42日に採取した。全試験において、記載したp値はヒト化1F6投与群と未投与群の間のものである。
【図8】図8は抗原特異的CD8+/Vβ17+細胞の枯渇をヒト化1F6が媒介することを示している。正常HLA−A0201ドナー由来のPBMCをM1ペプチドで刺激した。(A)ペプチド刺激培養物は記載する通り、未投与とするか、又は、漸増用量のヒト化1F6抗体の同時添加により投与した。9日後のパーセントCD8+/Vβ17+細胞をフローサイトメトリーにより測定した。(B)ペプチド刺激培養物は、未投与、又は第0日において1μg/mLヒト化1F6投与を、FcγRIII(CD16)に対して特異的な10μg/mL抗体の非存在下(黒色バー)又は存在下(斜線バー)において行った。9日後のパーセントCD8+/Vβ17+細胞をフローサイトメトリーにより測定した。
【図9】図9はバイスタンダー休止期T細胞上の抗CD701F6抗体の最小限の影響を示す。正常HLA−A0201ドナー由来のPBMCを未投与、又はM1ペプチド刺激(ペプチドstim)を1μg/mLのclF6の存在下又は非存在下に行った。培養9日後、各群由来のCD4及びCD8の間のVβTCR提示をIOTest(登録商標)Beta Mark TCRVβレパートリーキットを用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【図10A】図10は腎細胞癌のマウス異種移植片モデルを示す。(A)皮下786−O腫瘍は約30mm3の腫瘍フラグメント(群当たりN=5又は6)を移植することによりヌードマウス中に発癌開始させた。腫瘍を生育させ各群における平均腫瘍サイズが約100mm3となった時点で投与を開始した。記載した用量のh1F6−mcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4は、矢印で示す通り、腫瘍移植後17日から開始してq4dx4の日程で投与した。1000mm3を超える腫瘍を有する動物を安楽死させた時点は交線で記載した。
【図10B】図10は腎細胞癌のマウス異種移植片モデルを示す。(B)786−O腫瘍移植及び投与開始は(A)の場合と同様とする。マウスの群(N=5〜7)に腫瘍移植後13日から開始してq4dx4又はq4dx10の日程でh1F6−mcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4を投与した。腫瘍の生育はKaplan−Meierプロットにより示した。腫瘍を有するマウスが投与開始の第13日と比較して4倍サイズとなった場合に事象を登録した。第43日の実験終了時にサイズが4倍とならなかった腫瘍を有するマウスは削除した。対数順位検定を用いて投与群及び未投与群の間のp値を求めた。
【図11A】図11は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(A)10百万個のMM−1S細胞を各SCIDマウスに静脈内注射した。マウスの群(N=8〜10)は未投与とするか、IgG−vcMMAF4、IgG−mcMMAF4、h1F6−vcMMAF4又はh1F6−mcMMAF4を所定の用量において、q7dx5の日程で矢印に示す通り投与した。後肢麻痺の症状、屈曲姿勢、頭部浮腫及び/又は不良な表皮状態を示したマウスは安楽死させ、各群のパーセント生存をプロットした。対数順位検定を用いて投与群及び対照群の間のp値を求めた。
【図11B】図11は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(B)骨髄細胞を上記疾患状態の為に、又は、実験終了時の腫瘍細胞移植後122日に、安楽死させたマウスの大腿から回収した。各マウスの大腿中のCD138発現MM−1S細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより測定した。Mann−Whitney検定を用いて所定群間のp値を求めた。
【図12A】図12は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(A)10百万個のL363細胞を各SCIDマウスに静脈内注射した。マウスの群(N=7)は未投与とするか、IgG−vcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4を所定の用量において、q7dx5の日程で矢印に示す通り投与した。触診可能な腫瘍の塊を示したマウスは安楽死させ、各群のパーセント生存をプロットした。対数順位検定を用いて投与群及び未投与群の間のp値を求めた。
【図12B】図12は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(B)血清試料は腫瘍移植後40日にマウスから採取した。各マウスの血清中のヒトλ軽鎖の濃度をELISAにより測定した。Mann−Whitney検定を用いて所定群間のp値を求めた。
【技術分野】
【0001】
(関連出願)
本出願は、米国仮特許出願第60/673,070号(2005年4月19日出願)の優先権を主張し、この米国出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【背景技術】
【0002】
(背景)
CD70は種々の正常及び悪性の細胞型により発現される細胞膜結合型及び分泌型の分子の腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのメンバーである。DC70の一次アミノ酸(AA)配列は、自身のカルボキシル末端を細胞の外側に露出させ、そしてアミノ末端を原形質膜のシトゾル側に存在させている膜貫通II型の蛋白を予測させるものである(非特許文献1;非特許文献2)。ヒトCD70は20AAの原形質ドメイン、18AAの膜貫通ドメイン及び155AAの原形質外ドメインを有し、2つの潜在的にN連結性のグリコシル化部位を有する(非特許文献1;非特許文献2)。抗CD70抗体を用いた放射性同位体標識CD70発現細胞の特異的免疫沈降では29および50kDaのポリペプチドが得られる(非特許文献2;非特許文献3)。特に構造的な鎖C、D、H及びIにおけるTNF−アルファ及びTNF−ベータのとのその相同性に基づけば、3量体構造がCD70について予測される(非特許文献4)。
【0003】
当初の免疫組織学的試験によれば、CD70は胚中心B細胞及び稀少なT細胞上で、扁桃、皮膚及び腸において発現されることがわかった(非特許文献5)。その後、CD70は最近抗原活性化されたT及びBリンパ球の細胞表面上に発現されることが報告され、そしてその発現は抗原刺激除去後には減衰する(非特許文献6;非特許文献7)。リンパ様の系内では、活性化されたナチュラルキラー細胞(非特許文献8)及びマウス成熟末梢樹状細胞(非特許文献9)も又CD70を発現する。非リンパ様系統においては、CD70は胸腺髄質上皮細胞上で検出されている(非特許文献5;非特許文献10)。
【0004】
CD70は正常な非造血細胞上に発現されない。CD70発現は生理学的条件下において最近活性化されたT及びB細胞に大部分が限定され、そしてその発現は抗原刺激が停止すればダウンレギュレートされる。動物実験から得られた証拠によれば、CD70は免疫学的障害、例えば慢性関節リウマチ(非特許文献11)、乾癬性関節炎(非特許文献11)及び狼瘡(非特許文献12)に寄与している可能性があることが示唆されている。炎症応答におけるその潜在的役割に加えて、CD70は種々の形質転換細胞、例えばリンパ腫B細胞、ホジキン及びリード−スターンバーグ細胞、神経起源の悪性細胞及び多くの癌においても発現されている。
【非特許文献1】Bowmanら,J.Immunol.,1994年,第152巻,p.1756−61
【非特許文献2】Goodwinら,Cell,1993年,第73巻,p.447−56
【非特許文献3】Hintzenら,J.Immunol.,1994年,第152巻,p.1762−73
【非特許文献4】Petschら,Mol.Immunol.,1995年,第32巻,p.761−72
【非特許文献5】Hintzenら,Int.Immunol.,1994年,第6巻,p.477−80
【非特許文献6】Lensら,Eur J.lmmunol.,1996年,第26巻,p.2964−71
【非特許文献7】Lensら,Immunology,1997年,第90巻,p.38−45
【非特許文献8】Orengoら,Clin. Exp. Immunol.,1997年,第107巻,p.608−13
【非特許文献9】Akibaら,J.Exp. Med.,2000年,第191巻,p.375−80
【非特許文献10】Hishimaら,,Am.J.Surg.Pathol.,2000年,第24巻,p.742−46
【非特許文献11】Brugnoniら,Immunol.Lett.,1997年,第55巻,p.99−104
【非特許文献12】Oelkeら,Arthritis Rheum.,2004年,第50巻,p.1850−60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従って、特に非CD70発現細胞に対して望ましくない作用を示すことなく、CD70発現細胞に対して臨床的に有用な細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示すことができる抗CD70抗体及び他のCD70結合剤が必要とされている。そのような化合物はCD70を発現する癌又はCD70発現細胞により媒介される免疫障害に対する有用な治療薬となりえる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
(簡潔な要旨)
本発明はCD70抗体及び関連するCD70結合剤、及び、CD70を発現する癌又はCD70発現細胞が存在する免疫障害の予防又は治療のためのこのような結合剤の使用に関する方法を提供する。CD70結合剤は単独又は治療薬と組み合わせた場合に、CD70発現細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を示す。
【0007】
1つの態様において、CD70結合剤が提供される。CD70結合剤は例えば抗体であることができる。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてADCC、ADCP又はCDC応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。抗体はCD70への結合についてモノクローナル抗体1F6又は2F2と競合することができる。
【0008】
別の態様において、対象におけるCD70発現癌を治療するための方法が提供される。方法は一般的にCD70結合剤の有効量を対象に投与することを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてADCC、ADCP又はCDC応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。
【0009】
CD70結合剤は例えば抗体であることができる。抗体は例えばヒトIgM又はIgG抗体のエフェクタードメインを包含することができる。IgG抗体は例えばヒトIgG1又はIgG3サブタイプであることができる。一部の実施形態においては、抗体はヒト定常領域を包含する。一部の実施形態においては、CD70結合剤はCD70への結合についてモノクローナル抗体1F6又は2F2と競合することができる。他の実施形態において、抗体はヒト化1F6である。他の実施形態において、抗体はヒト化2F2である。抗体は例えば1価、2価又は多価であることができる。
【0010】
CD70発現癌は腎臓腫瘍、B細胞リンパ腫、結腸癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、非ホジキンリンパ腫、外膜細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、鼻咽頭抗、脳腫瘍又は胸腺癌であることができる。腎臓腫瘍は例えば腎細胞癌であることができる。脳腫瘍は例えば神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫又は髄膜腫であることができる。対象は例えば哺乳類、例えばヒトであることができる。
【0011】
別の態様において、免疫学的障害を治療するための方法が提供される。方法は一般的にCD70結合剤の有効量を対象に投与することを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてADCC、ADCP又はCDC応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。CD70結合剤は例えば抗体であることができる。抗体は例えばヒトIgM又はIgG抗体のエフェクタードメインを包含することができる。IgG抗体は例えばヒトIgG1又はIgG3サブタイプであることができる。一部の実施形態においては、抗体はヒト定常領域を包含する。
【0012】
免疫学的障害は例えばT細胞媒介免疫学的障害であることができる。一部の実施形態においてはT細胞媒介免疫学的障害はCD70を発現する活性化T細胞を含む。一部の実施形態においては、休止期のT細胞は抗体薬剤コンジュゲートの投与により実質的に枯渇されない。T細胞媒介免疫学的障害は例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身エリテマトーデス(SLE)、I型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核又は対宿主性移植片病であることができる。他の実施形態においては、免疫学的障害は活性化Bリンパ球障害である。対象は例えば哺乳類、例えばヒトであることができる。
【0013】
関連する態様において、CD70発現癌又は免疫学的障害の治療のための医薬組成物が提供される。組成物はCD70結合剤及び少なくとも1つの薬学的に適合性のある成分を包含する。更に又、CD70結合剤が凍結乾燥されている薬剤を包含する容器、及び、製薬上許容しうる希釈剤を含む第2の容器を包含する薬学的キットも提供される。
【0014】
本発明は本発明の以下の詳細な説明、及び本発明の特定の実施形態の非限定的な例及び添付の図面及び配列表を参照することにより更に十分に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
(詳細な説明)
本発明はCD70結合剤及びCD70発現癌及び免疫学的障害の予防又は治療のためのこのような結合剤の使用のための方法を提供する。CD70結合剤はCD70(例えば細胞外ドメイン)に特異的に結合する。結合剤はADCC、ADCP及び/又はCDC応答を媒介するエフェクタードメイン少なくとも1つを包含してよい。結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下で細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示してよい。結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートしてよい。
【0016】
1つの態様において、組成物及び方法はCD70結合剤、例えば抗体及び抗体誘導体に関する。抗CD70抗体はモノクローナル、キメラ又はヒト化抗体、又はそのフラグメント又は誘導体であることができる。一部の実施形態において、抗CD70抗体は抗体定常領域又はドメインを包含する。抗体定常領域又はドメインは例えばIgGサブタイプのものであることができる。例示される実施形態において、抗CD70抗体、そのフラグメントはCD70への結合についてマウスモノクローナル抗体(mAb)1F6又は2F2と競合し、そしてヒト抗体定常領域配列を含む。別の例示される実施形態において、抗CD70抗体又はそのフラグメント又は誘導体は、エフェクター細胞又は補体と相互作用することによりCD70発現細胞の枯渇又は増殖抑制をもたらす細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を媒介することができるエフェクタードメイン(例えばFc部分)を有する。別の例示される実施形態において、抗CD70抗体はエフェクター機能を欠失している。別の例示される実施形態において、抗CD70抗体は治療薬にコンジュゲートされる。
【0017】
更に包含されるものは、CD70結合剤(例えばヒト化抗CD70抗体)を含むキット及び製造品である。
【0018】
開示の明確化の為に、そして限定することなく、本発明の詳細な説明を以下の通りサブセクションに分割する。
I.定義及び略記法
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び科学的な用語は記載した方法及び組成物に関連する当業者の一般的に理解するものと同様の意味を有する。商品名を本明細書において使用する場合は、出願人は商品名の製品の製剤、ジェネリック薬品、及び、商品名の製品の薬学的活性成分を独立して包含することを意図している。本明細書においては、以下の用語及び表現は特段の記載が無い限りそれらに割り付けられた意味を有するものとする。
【0019】
「CD70結合剤」及び「抗CD70結合剤」という用語は本明細書においては、抗CD70抗体、抗CD70抗体の誘導体又はフラグメント、又はCD70に結合しCD70結合抗体又はその誘導体の少なくとも1つのCDR又は可変領域を含む他の薬剤を意味する。
【0020】
「特異的に結合する」という用語は非抗、結合剤が高度に選択的な様態においてその相当する抗原とは反応するが、他の抗原(例えば非CD70分子)の多くとは反応しないことを意味する。
【0021】
本明細書においては、CD70結合剤に関する場合の「機能的」という用語は結合剤がCD70に結合することができることを意味する。
【0022】
「抑制する」又は「抑制」という用語は本明細書においては、測定可能な量まで低減すること、又は完全に防止することを意味する。
【0023】
「枯渇させる」という用語は、CD70発現細胞に対するCD70結合剤の作用に関する場合、CD70発現細胞の数の低減又はその消失を指す。
【0024】
「インタクトな抗体」及び「インタクトな免疫グロブリン」とは2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖よりなる典型的には約150,000ダルトンのヘテロ4量体糖蛋白として本明細書においては定義される。各軽鎖はジスルフィド結合により重鎖に連結してヘテロ2量体を形成する。ヘテロ4量体はこのようなヘテロ2量体の2つの同じ重鎖の間の共有結合ジスルフィド連結により形成される。軽鎖及び重鎖はジスルフィド結合により共に連結されているが、2つの重鎖の間のジスルフィド連結の数は免疫グロブリン(Ig)アイソタイプにより変動する。各重鎖及び軽鎖は又規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖はアミノ末端に可変ドメイン(VH)、それに続く3又は4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3及び/又はCH4)並びにCH1とCH2の間のヒンジ(J)領域を有する。各軽鎖は2つのドメイン、アミノ酸末端可変ドメイン(VL)及びカルボキシ末端定常ドメイン(CL)を有する。VLドメインはVHドメインと非共有結合的に会合しているのに対し、CLドメインは共通してCH1ドメインにジスルフィド結合を介して共有結合している。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると考えられている(Chothia et al.,1985,J.Mol.Biol.186:651−663)。
【0025】
「超可変」という用語は抗体間の配列において広範に異なっており、そして各特定の抗体のその特異的抗原決定基に対する結合及び特異性に直接関与する残基を含有する可変ドメイン内の特定の配列を指す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方における超可変性は相補性決定領域(CDR)又は超可変ループ(HVL)として知られている3セグメントに集中している。CDRはKabat et al.,1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MDにおける配列比較により定義され、一方、HVLはChothia and Lesk、1987、J.Mol.Biol.196:901〜917に記載される可変ドメインの3次元構造に従って構造的に定義される。これ等の2種の方法がCDRを僅かに異なって識別する場合は、構造的な定義のほうがこの抗しい。Kabatによる定義(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Pub.No.91−3242、US Dept.Health&Human Service,NIH,Bethesda,MD.,1991参照)によれば、CDR−L1は軽鎖可変ドメイン内の残基約24〜34、CDR−L2は残基約50〜56そしてCDR−L3は残基約89〜97に、そして重鎖の可変ドメインの約31〜35がCDR−H1に、約50〜65がCDR−H2に、そして約95〜102がCDR−H3に位置している。
【0026】
重鎖及び軽鎖の各々内の3つのCDRは低可変性の配列を含有するフレームワーク(FR)により分離されている。重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、FR及びCDRはFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4の順序に配置している。FRの概ねβシートの配置により、鎖の各々の内部のCDRは相互に、そして他の鎖のCDRに対し、極めて近接する。結果として生じるコンホーメーションは抗原結合部位に寄与している(Kabat et al.,1991,NIH Publ.No.91−3242,Vol.I,p.647−669参照)が、全てのCDR残基が必ずしも抗原結合に直接関与するわけではない。
【0027】
FR残基及びIg定常ドメインは典型的には抗原結合に直接関与しないが、抗原結合に寄与するか、又は、抗体エフェクター機能を媒介することができる。一部のFR残基は少なくとも3つの態様において、即ちエピトープに直接非共有結合的に結合することにより、CDR残基1つ以上と相互作用することにより、及び、重鎖及び軽鎖の間の界面に影響することにより、抗原結合に対する顕著な作用を有することができる。定常ドメインは種々のIgエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)、補体依存性細胞性細胞毒性(CDC)及び/又は抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)における抗体の関与を媒介する。
【0028】
脊椎動物の軽鎖を定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)及びラムダ(λ)と称される2つの明確に異なった片の1つに割り付けることができる。比較のために、哺乳類免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って以下の5種の主要なクラス、即ち、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMに割り付けられる。IgG及びIgAは更にサブクラス(アイソタイプ)例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に分割される。免疫グロブリンの種々のクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。ネイティブの免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。
【0029】
「抗体」、「抗CD70抗体」、「ヒト化抗CD70抗体」及び「改変体ヒト化抗CD70抗体」という用語は本明細書においては、最も広範な意味において使用され、そして特に完全長のネイティブの抗体、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)及び抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば可変ドメイン及び所望の生物学的活性、例えばCD70結合を示す抗体の他の部分を包含する。
【0030】
「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し;即ち、集団を構成する個々の抗体は僅かな量において存在するかもしれない天然に存在する突然変異を除き同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、エピトープとも称される一の抗原決定基に指向されている。修飾語「モノクローナル」とは同一のエピトープに指向された抗体の実質的に均質な集団を示すものであり、何れかの特定の方法による抗体の生産を要求するものではない。モノクローナル抗体は当該分野で知られた何れかの手法又は方法;例えばKohler et al.,1975,Nature 256:495により最初に報告されたハイブリドーマ法、又は当該分野で知られた組み換えDNA法(例えば米国特許4,816,567参照)により製造できる。別の例においては、モノクローナル抗体はClackson et al.,1991,Nature 352:624−628及びMarks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581−597に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【0031】
一方、ポリクローナル抗体の製造における抗体は典型的には免疫グロブリンのアイソタイプ及び/又はクラスの不均質な集団であり、そして種々のエピトープ特異性を示す。
【0032】
「キメラ」抗体という用語は本明細書においては、重鎖及び/又は軽鎖の領域又はドメインの1つ以上におけるアミノ酸配列の一部又は全体が別の種由来、又は別の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプに属するか、又はコンセンサス配列由来のモノクローナル抗体の中の相当する配列と同一、相同又はその改変体であるモノクローナル抗体の型である。キメラ抗体はそのような抗体のフラグメントを包含するが、ただし抗体フラグメントはその親抗体の望ましい生物学的活性、例えば同じエピトープへの結合を示さなければならない(例えば米国特許4,816,567;及びMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855参照)。キメラ抗体を製造するための方法は当業者の知る通りである。(例えばMorrison,1985,Science 229:1202;Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214;Gillies et al.,1989,J.Immunol.Methods 125:191−202;米国特許5,807,715;4,816,567;及び4,816,397参照)。
【0033】
「抗体フラグメント」、「抗CD70抗体フラグメント」、「ヒト化抗CD70抗体フラグメント」及び「改変体ヒト化抗CD70抗体フラグメント」という用語は可変領域又は機能的能力、例えば特異的CD70エピトープ結合が保持されている完全長抗CD70抗体の一部分を指す。抗体フラグメントの例は限定しないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv及びscFv−Fcフラグメント、ダイアボディ、トリアボディー、直鎖抗体、1本鎖抗体及び抗体フラグメントから形成される他の多重特異性抗体を包含する(Holliger and Hudson,2005,Nat.Biotechnol.23:1126−1136参照)。
【0034】
「1本鎖Fv」即ち「scFv」抗体フラグメントは抗体のVH及びVLドメインを含む1本鎖Fv改変体であり、この場合ドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在し、そしてこれは抗原を認識して結合することができる。scFvポリペプチドは場合により、scFvが抗原結合の為の望ましい三次元構造の形成を可能にするVH及びVLドメインの間に位置するポリペプチドリンカーを含有する(例えば、Pluckthun,1994,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315)。
【0035】
「ダイアボディ」という用語は2つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指す。各フラグメントは軽鎖可変ドメイン(VL)と連鎖状となった重鎖可変ドメイン(VH)を含有し、VH−VL又はVL−VHポリペプチドを形成している。同じ鎖上の2ドメインの間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、連結されたVH−VLドメインはもう一方の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させられ、これにより2つの抗原結合部位が生じる。ダイアボディは例えばEP404097;WO93/11161;及びHollinger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448により詳細に説明されている。
【0036】
「直鎖状抗体」という用語は抗原結合領域の対を形成する直列のFdセグメントの対(VH−CH1−VH−CH1)を含む抗体を指す。直鎖状抗体はZapata et al.,1995,Protein Eng.8(10):1057−1062に記載のように二重特異性又は単一特異性であることができる。
【0037】
「ヒト化抗体」とは所定の抗原に結合することができ、そして、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRを有する可変領域ポリペプチド鎖を含む免疫グロブリンアミノ酸配列改変体又はそのフラグメントを指す。
【0038】
一般的に、ヒト化抗体は非ヒトの原料からそこに導入されたアミノ酸残基1つ以上を有する。これ等の非ヒトアミノ酸残基は本明細書においては、「インポート」残基と称し、これは典型的には「インポート」抗体ドメイン、特に可変ドメインから取られる。インポート残基、配列又は抗体は所望の親和性及び/又は特異性、又は、本明細書において考察する他の所望の抗体生物学的活性を有する。
【0039】
一般的に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの全てを実質的に含むことになり、その場合、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当し、そして、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列、例えばコンセンサス又は生殖細胞系の配列由来のそれらとなる。ヒト化抗体は場合により典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンFcドメインの少なくとも一部分を含むことにもなる。例えば抗体は軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有してよい。抗体はまた適宜、重鎖のCH1、ヒンジ(J)、CH2、CH3及び/又はCH4領域を包含してよい。
【0040】
ヒト化抗体は何れかのクラスの免疫グロブリン、例えばIgM、IgG、IgD、IgA及びIgE、及び何れかのアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4から選択することができる。定常領域又はドメインは例えば、ヒト化抗体が細胞毒性活性を示すことが望ましい(例えばIgG1)補体固定定常ドメインを包含できる。そのような細胞毒性が望まれない場合は、定常ドメインは別のクラス(例えばIgG2)のものであってよい。ヒト化抗体は1つより多いクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでよく、そして所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは当業者の知る通りである。
【0041】
ヒト化抗体のFR及びCDR領域は親配列に厳密に相当している必要はなく、例えば、インポートCDR又はコンセンサスFRは少なくとも1つの残基の置換、挿入又は欠失により改変されていることによりその部位におけるCDR又はFR残基がコンセンサス又はインポート抗体の何れにも相当しなくなってもよい。このような突然変異は典型的には広範にならない。通常はヒト化抗体の残基の少なくとも75%、より頻繁には少なくとも90%、最も頻繁には95%超が親FR及びCDR配列のものに相当する。
【0042】
「抗体エフェクター機能」という用語は本明細書においては、IgのFcドメインにより寄与される機能を指す。このような機能は例えば抗体依存性細胞性細胞毒性、抗体依存性細胞性貪食作用又は補体依存生細胞毒性であることができる。このような機能は、例えば貪食又は細胞溶解活性を有する免疫細胞上のFc受容体へのFcエフェクタードメインの結合により、又は、補体系の成分へのFcドメインの結合により発揮されることができる。典型的には、Fc結合細胞又は補体成分により媒介される作用はCD70標的細胞の抑制及び/又は枯渇をもたらす。如何なる特定の理論にも制約されないが、抗体のFc領域はFc受容体(FcR)発現細胞をリクルートし、それらを抗体コーティング標的細胞と並置させることができる。FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD64)を包含するIgGに対する表面FcRを発現する細胞はIgGコーティング細胞の検出のためのエフェクター細胞として作用することができる。このようなエフェクター細胞は単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及び好酸球を包含する。IgGによるFcγRのエンゲージメントは抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)及び/又は抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)を活性化させる。ADCCは膜細孔形成蛋白及びプロテアーゼの分泌を介してCD16+エフェクター細胞により媒介され、貪食作用はCD32+及びCD64+エフェクター細胞により媒介される(Fundamental Immunology,4th ed.,Paul ed.,Lippincott−Raven,N.Y.,1997,Chapters 3,17,30;Uchida et al.,2004,J.Exp.Med.199:1659−69;Akewanlop et al.,2001,Cancer Res.61:4061−65;Watanabe et al.,1999,Breast Cancer Res.Treat.53:199−207参照)。ADCC及びADCPの他に、細胞結合抗体のFc領域はまた補体依存性細胞毒性(CDC)を示す補体の古典的な経路を活性化させることができる。補体系のC1qは、抗体が抗原と複合体形成する場合にそのFc領域に結合する。細胞結合抗体へのC1qの結合はC4及びC2の蛋白分解活性を包含する事象のカスケードを開始させ、C3コンバターゼを生成することができる。C3コンバターゼによるC3からC3bへの分解によりC5b、C6、C7、C8及びC9を包含する末端補体成分の活性化が可能になる。全体として、これ等の蛋白は抗体コーティング細胞上の膜攻撃複合体細孔を形成する。これ等の細孔が細胞膜の一体性をはかいし、標的細胞を殺傷する(Immunobiology,6th ed.,Janeway et al.,Garland Science,N.Y.,2005,Chapter 2)。
【0043】
「抗体依存性細胞性細胞毒性」即ちADCCという用語は細胞溶解活性を保有する免疫細胞(エフェクター細胞とも称する)との抗体コーティング標的細胞の相互作用に依存した細胞死を誘導するための機序である。そのようなエフェクター細胞はナチュラルキラー細胞、単球/マクロファージ及び好中球を包含する。エフェクター細胞は、標的細胞に結合したIgのFcエフェクタードメインに、それらの抗原複合化部位を介して結合する。抗体コーティング標的細胞の死滅はエフェクター細胞活性の結果として生じる。
【0044】
「抗体依存性細胞性貪食作用」即ちADCPという用語はIgのFcエフェクタードメインに結合する貪食性免疫細胞(例えばマクロファージ、好中球及び樹状細胞)により、抗体コーティング細胞が全体的又は部分的に内在化される過程を指す。
【0045】
「補体依存性細胞性細胞毒性」即ちCDCという用語は、標的結合抗体のFcエフェクタードメインが標的細胞膜内の孔部の形成を最終的にもたらす酵素反応のシリーズを活性化させる細胞死を誘導するための機序を指す。典型的には、抗体コーティング標的細胞上にあるもののような抗原−抗体複合体が補体成分C1qに結合して活性化し、次にこれが標的細胞死をもたらす補体カスケードを活性化する。補体の活性化は又、白血球上の補体受容体(例えばCR3)に結合することによりADCCを促進する標的細胞表面上への補体成分の付着ももたらす。
【0046】
「免疫細胞」とは本明細書においては、免疫応答の調節に関与している造血細胞系統の細胞を指す。典型的な実施形態においては、免疫細胞はTリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、単球/マクロファージ又は樹状細胞である。
【0047】
「エフェクター細胞」という用語は本明細書においては、免疫グロブリンのFcドメインに対する表面受容体(FcR)を発現する細胞を指す。例えば、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD64)を包含するIgGに対する表面FcRを発現する細胞がエフェクター細胞として作用できる。このようなエフェクター細胞は単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及び好酸球を包含する。
【0048】
「治療薬」とは癌細胞、活性化免疫細胞又は他の標的細胞集団に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び/又は免疫調節性の作用を示す薬剤である。治療薬の例は細胞毒性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤及び免疫調節剤を包含する。
【0049】
「細胞毒性作用」とは標的細胞の枯渇、排除及び/又は殺傷を指す。細胞毒性剤とは細胞に対して細胞毒性作用を有する薬剤を指す。用語は放射性同位体(例えばI131、I125、Y90及びRe186)、化学療法剤及び毒素、例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素活性毒素及びこれ等のフラグメントを包含することを意図している。このような細胞毒性剤は、抗体、例えばヒト化抗CD70抗体とカップリングさせることができ、そして例えば治療の適応症患者を治療するために使用できる。1つの実施形態において、「細胞毒性剤はモノクローナル抗体、例えば本明細書に記載するヒト化抗体と組み合わせて使用される抗体を包含する。
【0050】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例はアルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANTM);アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ;エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミド及びトリメチロールメラミン;アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(例えば合成類縁体トポテカン);ブリオスタチン;カリスタチン;CC−1065(例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体)及びその誘導体;クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;オーリスタチン(例えば類似のモノメチルオーリスタチンE及びモノメチルオーリスタチンF(例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる2005年10月27日公開の米国特許出願2005−0238649参照));デュオカルマイシン(例えば合成類縁体、KW−2189及びCB1−TM1);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンジスタチン;窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムブシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン;抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えばカリケミシン、特にカリケミシンガンマ1I及びカリケミシンファイI1、例えばAgnew,Chem. Intl.Ed.Engl.,33:183−186参照;ジネマイシン、例えばジネマイシンA;ビスホスホネート、例えばクロドロネート;エスペラミシン;並びにネオカルイジノスタチン発色段及び関連の色素蛋白エネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン(AdriamycinTM)(例えばモルホリノススドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、マイコフェノール酸、ノガラマイシ、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU);葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類縁体、例えばフルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン、フロクスイジン;アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補給物、例えばフロリニック酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デホファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルホルニチン;エリプチニウムアセテート;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2毒素、ベラクリンA、ロリジンA及びアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer、Antony,France);クロランブシル;ゲムシタビン(GemzarTM);6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン(NavelbineTM);ノバントロン;テニポシド;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセロダ;イバンドロネート;CPT−11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えばレチン酸;カペシタビン;及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体を包含する。この定義に同様に包含されるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は抑制する作用を有する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、例えばタモキシフェン(例えばNolvadexTM)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びトレミフェン(FarestonTM);副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば4(5)−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート(MegaceTM)、エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール(RivisorTM)、レトロゾール(FemaraTM)及びアナストロゾール(ArimidexTM);及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン;及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体である。
【0051】
「プロドラッグ」という用語は本明細書においては、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対して低細胞毒性であるが酵素的に活性化されるか、又はより活性な親化合物型に変換されることができる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の型を指す。例えばWilman,,1986,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375−386,615th Meeting Belfast;及び、Stella et al.,1985,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.,),pp.247−267,Humana Pressを参照できる。有用なプロドラッグは限定しないが、より活性な細胞毒性の遊離の薬剤に変換されることができるホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ及び場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5−フルオロシトシン及び他の5−フルオロウリジンプロドラッグを包含する。プロドラッグ型に誘導できる細胞毒性剤の例は限定しないが上記した化学療法剤を包含する。
【0052】
「細胞毒性作用」とは細胞の増殖の抑制を指す。「細胞毒性剤」とは細胞に対して細胞毒性作用を有し、これにより細胞の特定のサブセットの成育及び/又は増殖を抑制する薬剤を指す。
【0053】
「免疫調節性作用」という用語は本明細書においては、免疫学的応答の発生又は維持の刺激(免疫刺激)又は抑制(免疫抑制)を指す。抑制は例えば免疫細胞(例えばT又はBリンパ球)の排除;他の細胞の機能的能力をモジュレート(例えばダウンレギュレート)することができる免疫細胞の誘導又は形成;免疫細胞における未応答状態(例えばアネルギー)の誘導;又は免疫細胞の活性又は機能を増大、低減又は変化させること、例えばこれ等の細胞により発現される蛋白のパターンを改変すること(例えば特定のクラスの分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、同時刺激分子又は他の細胞表面受容体等の改変された生成及び/又は分泌)により行うことができる。「免疫調節剤」とは細胞に対する免疫調節作用を有する薬剤を指す。一部の実施形態においては、免疫調節剤は免疫応答を促進する免疫細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を有する。
【0054】
「標識」という用語は抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能(例えば放射性同位体標識又は蛍光標識)であってよく、又は酵素標識の場合は検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。標識された抗CD70抗体を作成し、そして種々の用途、例えばインビトロ及びインビボの診断に使用することができる。
【0055】
「単離された」核酸分子は核酸の天然の原料中においてそれが通常会合している強z巣夾雑核酸分子少なくとも1つから識別され、分離されている核酸分子である。単離された核酸分子はそれが天然に存在する形態又は状況とは異なる。従って単離された核酸分子はそれが天然の細胞中に存在する場合の核酸分子とは区別されるものである。しかしながら、単離された核酸分子は、核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置にあるような、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子を包含する。
【0056】
「制御配列」という用語は特定の宿主生物において作動可能に連結下コーディング配列の発現の為に必要なポリヌクレオチド配列を指す。原核生物における使用に適する制御配列は例えばプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位の配列を包含する。真核生物の制御配列は限定しないが、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを包含する。これ等の制御配列は原核生物及び真核生物の宿主細胞における抗CD70結合剤の発現及び生成の為に使用することができる。
【0057】
核酸はそれが別の核酸配列との機能的関連性の内部におかれる場合に「作動可能に連結」されている。例えば核酸のプレ配列又は分泌リーダーは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白として発現される場合にはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結しており;プロモーター又はエンハンサーはそれが配列の転写に影響する場合にはコーディング配列に作動可能に連結しており;又は、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置付けられている場合にコーディング配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結した」とは、連結されるDNA配列が隣接しており、そして、分泌リーダーの場合は隣接し、そして読み込み期にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを用いてDNA配列を連結することができる。
【0058】
「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体及びその等価物を指し、そして生成物の特定の長さを指すわけではなく;即ち、「ペプチド」及び「蛋白」はポリペプチドの定義に包含される。ポリペプチドの定義に同様に包含されるものは本明細書に定義した「抗体」である。「ポリペプチド領域」とはポリペプチドのセグメントを指し、そのセグメントは例えばドメイン又はモチーフの1つ以上を含有してよい(例えば抗体のポリペプチド領域は例えば相補性決定領域(CDR)1つ以上を含有することができる)。「フラグメント」という用語は、典型的にはポリペプチドの少なくとも20隣接又は少なくとも50隣接アミノ酸を有するポリペプチドの一部分を指す。「誘導体」とは第2のポリペプチドと相対比較して非保存的又は保存的なアミノ酸置換1つ以上を有するポリペプチド又はそのフラグメント;又は、第2の分子の共有結合により、例えば非相同ポリペプチドの結合により、又はグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等により、修飾されたポリペプチド又はそのフラグメントである。「誘導体」の定義に更に包含されるものは、例えばアミノ酸の類縁体(例えば非天然アミノ酸等)1つ以上を含有するポリペプチド、未置換の連結部又は当該分野で知られた他の修飾を有するポリペプチドであって、天然及び非天然存在の両方のものである。
【0059】
「単離された」ポリペプチドとはその天然の環境の成分から識別及び分離及び/又は回収されているものである。その天然の環境の夾雑成分はポリペプチドの診断上又は治療上の使用を妨害する可能性のある物質であり、そして酵素、ホルモン及び他の蛋白性及び非蛋白性の溶質である。単離されたポリペプチドは単離された抗体、又はそのフラグメント又は誘導体を包含する。「抗体」は組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含するが、その理由は抗体の天然の環境の成分少なくとも1つが存在しないためである。
【0060】
特定の実施形態においては抗体は、(1)Lowry法により測定した場合に抗体95重量%超まで、他の態様においては99重量%超まで、(2)スピニングカップシーケネーターを用いてN末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度まで、又は、(3)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下のSDS−PAGEによる均質性となる程度まで精製される。
【0061】
「非相同」という用語は、ポリペプチドに関する場合、別のポリペプチドと比較した場合に異なる原料(例えば細胞、組織、生物又は種)由来であるために2つのポリペプチドが異なることを意味する。典型的には、非相同ポリペプチドは異なる種に由来する。
【0062】
免疫グロブリン又はそのフラグメントに関する場合、「保存的置換」とは、抗原への免疫グロブリンポリペプチド又はそのフラグメントの特異的結合(例えばKDにより測定した場合)を大きく低減しない1つ以上のアミノ酸の置換を意味する(即ち結合親和性を増大させる、結合親和性を大きく改変する、又は、結合親和性を、例えばELISAのような標準的な結合試験により測定した場合に約40%以下、典型的には約30%以下、より典型的には約20%以下、皿により典型的には約10%以下、又は最も典型的には約5%以下低減する置換)。
【0063】
「同一」又は「パーセント同一性」という用語は、核酸又はポリペプチド配列2つ以上に関する場合、同じであるか、又は、最大の相応性が得られるように比較してアラインした場合に同じである核酸又はアミノ酸残基の特定のパーセントを有する、2つ以上の配列又はサブ配列を指す。パーセント同一性を調べるためには、配列を最適な比較目的の為にアラインする(例えば第1のアミノ酸又は核酸配列の配列に、第2のアミノ酸又は核酸配列との最適なアライメントの為にギャップを導入することができる)。次に相当するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が第2の配列の相当する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されている場合、分子はその位置において同一である。2配列間のパーセント同一性は配列により共有される同一位置の数の関数である(即ち%同一性=同一位置数/位置総数(例えばオーバーラップ位置)x100)。一部の実施形態においては、2配列は同じ長さである。
【0064】
「実質的に同一」という用語は、2つの核酸又はポリペプチドに関する場合、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%又は少なくとも65%の同一性;典型的には少なくとも70%又は少なくとも75%の同一性;より典型的には少なくとも80%又は少なくとも85%の同一性;更により典型的には少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%の同一性を有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す(例えば後述する方法の1つにより測定した場合)。
【0065】
「同様性」又は「パーセント同様性」という用語は、ポリペプチド配列2つ以上に関する場合、後述する方法の1つを用いて測定した場合に、最大の相応性が得られるように比較してアラインした場合に同じか又は保存的に置換されているアミノ酸残基の特定のパーセントを有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す。例えば、第1のアミノ酸配列は、第1の配列に含有される数と等しいアミノ酸数と比較した場合に、又は、例えば後述する方法の1つによりアラインされているポリペプチドのアライメントと比較した場合に、第1のアミノ酸配列が第2のアミノ酸配列に少なくとも50%、60%、70%、80%、90%又は95%同一又であるか保存的に置換されている場合に、第2のアミノ酸配列と同様と考えることができる。
【0066】
「実質的同様性」又は「実質的に同様である」という用語は、ポリペプチド配列に関する場合、ポリペプチド領域が少なくとも70%、典型的には少なくとも80%、より典型的には少なくとも85%、又は少なくとも90又は少なくとも95%の比較対照配列との同様性を有することを示す。例えば、あるポリペプチドは、第2のポリペプチドに対し、例えば2つのペプチドが保存的置換1つ以上により異なる場合には、実質的に同様となる。
【0067】
抗CD70抗体又はその誘導体に関する場合、抗CD70抗体の抗原結合領域(例えば重鎖又は軽鎖の可変領域又は重鎖又は軽鎖のCDR)1つ以上と実質的に同一又は実質的に同様であるポリペプチド領域1つ以上を有する蛋白は、当該分野で知られた、又は本明細書で言及する種々の標準的な免疫学的検定試験のいずれかを用いて測定した場合に、抗CD70抗体により認識されるCD70のエピトープへの特異的結合を保持している。
【0068】
2つの配列の間のパーセント同一性又はパーセント同様性の測定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2つの配列の比較の為に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877に記載の通り変更されたKarlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはAltschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403−410のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラム、スコア=100、ワードレングス=12により実施することができ、これにより、目的の蛋白をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLAST蛋白検索はXBLASTプログラム、スコア=50、ワードレングス=3により実施することができ、これにより、目的の蛋白に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的の為にギャップのあるアライメントを得るためには、Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載の通りGappedBLASTを利用できる。或いは、PSI−Blastを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる(Id)。BLAST、GappedBLAST及びPSI−Blastプログラムを使用する場合は、対応するプログラム(例えばXBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用できる。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの他の非限定的な例はMyers and Miller,CABIOS(1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはGCG配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティー12及びギャップペナルティー4を使用できる。配列分析のための別のアルゴリズムは当業者の知る通りであり、そしてTorellis and Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3−5に記載されているADVANCE及びADAM;及びPearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444−8に記載されているFASTAを包含する。FASTA内では、ktupは検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ktup=2の場合、比較するべき2配列における同様の領域はアラインされた残基のペアを見ることにより発見され;ktup=1の場合、シングルのアラインされたアミノ酸が調べられる。ktupは蛋白配列の場合は2又は1に、又はDNA配列の場合は1〜6に設定できる。ktupが特定されない場合はデフォルトは蛋白の場合2、DNAの場合は6となる。或いは、蛋白配列アライメントはHiggins et al.,1996,Methods Enzymol.266:383−402に記載されているCLUSTALWアルゴリズムを用いて実施してよい。
【0069】
本明細書においては、「細胞」、「細胞系統」及び「細胞培養物」という表現は互換的に私用され、全てこのような標記はその子孫を包含するものとする。即ち、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は元の該当細胞及び形質転換回数とは無関係にそれから誘導された培養物を包含する。全ての子孫は、意図的又は天然に生じた突然変異により、DNA含量において厳密に同一である必要はない。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫は包含される。異なる標記を意図する場合は文脈より明確化される。
【0070】
治療の目的のためには「対象」という用語は何れかの動物、特に哺乳類に分類される動物、例えばヒト、家畜及び牧畜動物、及び、動物園、競技用又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を指す。好ましくは、対象はヒトである。
【0071】
本明細書における「障害」、及び「CD70関連障害」及び「CD70関連疾患」という用語は本明細書に記載した抗CD70結合剤を用いた治療から利益を被る何れかの状態を指す。「CD70関連障害」及び「CD70関連疾患」は典型的には細胞表面上出CD70又はそのフラグメントを発現する。これには問題となる障害に哺乳類を罹患しやすくする病理学的状態を包含する慢性及び急性の障害又は疾患が包含される。本発明において治療されるべき障害の非限定的な例は、癌、血液学的悪性疾患、良性及び悪性の腫瘍、白血病及びリンパ様悪性疾患、癌腫及び炎症性、血管形成性及び免疫学的な障害を包含する。障害の特定の例は後に開示する。
【0072】
「治療」及び「施療」等の用語は、本明細書においては、疾患の症状1つ以上の軽減又は緩解、後退、進行の緩徐化又は停止を包含するがこれ等に限定されない、何れかの臨床上望ましいか有益である作用をもたらす、疾患又は障害に対する治療的並びに予防的、又は抑制的な手段を包含する意味を有する。即ち、例えば治療という用語は疾患又は障害の症状の発生の前又は後に薬剤を投与することにより疾患又は障害の全ての兆候を防止又は除去することを包含する。別の例として、用語は疾患の症状に対抗するために疾患の臨床的顕在化の後に薬剤を投与することを包含する。更に又、治療が疾患の緩和をもたらすか否かに関わらず、組織傷害の程度又は転移の量又は範囲のような、疾患又は障害の臨床パラメーターに投与が影響する発症後及び臨床兆候発生後の薬剤投与も、本明細書においては「治療」又は「施療」に相当する。
【0073】
本明細書においては、「防止」又は「防止する」という用語は(a)CD70発現癌又は免疫学的障害又はその臨床上又は診断上の症状の1つ以上の出現又は発症をブロックするため、(b)CD70発現癌又は免疫学的障害の発症の重症度を抑制するため、又は(c)CD70発現癌又は免疫学的障害の発症の可能性を低下させるために、CD70発現癌又は免疫学的障害の臨床上又は診断上の症状の発症の前に対象に抗CD70結合剤を投与すること(例えばCD70発現癌又は免疫学的障害の獲得の素因を有するかハイリスクである個体への投与)を指す。
【0074】
「静脈内注入」という用語は薬剤、例えば治療薬を、約15分間、一般的に約30〜90分の時間に渡って動物又はヒト患者の静脈内に導入することを指す。
【0075】
「静脈内瞬時」又は「静脈内圧注」という用語は約15分以下、一般的に5分以下で薬剤を身体が受容するように動物又はヒトの静脈内に薬剤を投与することを指す。
【0076】
「皮下投与」という用語は比較的緩徐な、持続した薬剤からの送達により、典型的には皮膚と下部組織との間のポケット内において、動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤、例えば治療薬を導入することを指す。皮膚を摘んで下部組織から離れるように引き上げることによりポケットが形成される。
【0077】
「添付文書」という用語は治療用製品の市販用パッケージ内に慣用的に包含される説明書を指し、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与、禁忌及び/又は警告を含んでいる。
【0078】
「リポソーム」は哺乳類への薬剤(例えば抗体)の送達の為に有用な脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤の種々の型よりなる小胞である。リポソームの成分は生体膜の脂質配置と同様に一般的に二層形態に配置している。
【0079】
「皮下注入」という用語は例えば限定しないが30分以下、又は90分以下の時間、薬剤レセプタクルからの比較的緩徐な、持続した送達により、好ましくは皮膚と下部組織との間のポケット内において、動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤を導入することをさす。場合により、注入は動物又はヒト患者の皮膚下部にインプラント処置された薬剤送達ポンプの皮下移植により行ってよく、その場合、ポンプは所定期間、例えば30分間、90分間又は治療計画の長期に渡る期間、所定量の薬剤を送達する。
【0080】
「皮下ボーラス投与」という用語は動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤を投与することを指し、この場合ボーラス投与薬物送達は約15分以下;別の態様においては5分以下、そして更に別の態様においては60秒以下となる。更に別の態様においては、投与は皮膚と下部組織との間のポケット内において行い、その場合、ポケットは、皮膚を摘んで下部組織から離れるように引き上げることにより形成してよい。
【0081】
「有効量」という用語は対象におけるCD70発現癌又は免疫学的障害の臨床上又は診断上の症状1つ以上の出現の抑制又は緩和の為に十分な抗CD70結合剤(例えば抗体又は誘導体又は他の結合剤)の量を指す。薬剤の有効量は「有効用法」において本明細書で説明する方法に従って投与する。「有効用法」という用語はCD70発現癌又は免疫学的障害の治療又は防止を達成するために十分な薬剤の量と投薬頻度の組合せを指す。
【0082】
「治療有効量」という用語は有益な患者転帰、例えば細胞の成育停止作用又は枯渇を有する治療薬の量を指すために使用する。1つの態様において、治療有効量はアポトーシス活性を有するか、細胞死を誘導することができる。別の態様においては、治療有効量は例えば疾患の進行を緩徐化させる場合に有効なことが判っている標的血清中濃度を指す。薬効は治療すべき状態に応じて従来の方法において測定してよい。例えばCD70を発現する細胞を態様とする新生物形成性の疾患又は障害においては、薬効は疾患進行までの時間(TTP)を試験するか、又は、応答率(RR)を測定することにより調べることができる。
【0083】
「製薬上許容しうる」という用語は本明細書においては、連邦又は州政府の規制当局により認可されるか、又は、合衆国薬局方又は他の一般的に認知された動物、特にヒトにおける使用に関する薬局方に掲載されていることを意味する。「薬学的に適合性のある成分」という用語は、抗CD70結合剤が共に投与される製薬上許容しうる希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。
【0084】
「製薬上許容しうる塩」という表現は本明細書においては、抗CD70結合剤又は治療薬の製薬上許容しうる有機又は無機の塩を指す。抗CD70結合剤又は治療薬は少なくとも1つアミノ基をがんゆうし、従って、酸付加塩はこのアミノ基又は他の適当な基を用いて形成できる。例示される塩は限定しないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、集荷物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩(即ち1,1’−メチレンビス−(2−ヒドロキシ−3−ナフトエート))の塩類を包含する。製薬上許容しうる塩は酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンのような別の分子の包含も行ってよい。対イオンは親化合物上の電荷を安定化させる何れかの有機又は無機の部分であってよい。更に又、製薬上許容しうる塩はその構造中に荷電した原子1つより多くを有してよい。複数の荷電原子が製薬上許容しうる塩の部分である場合には複数の対イオンを有することができる。従って製薬上許容しうる塩は1つ以上の荷電原子及び/又は1つ以上の対イオンを有することができる。
【0085】
「製薬上許容しうる溶媒和物」又は「溶媒和物」とは溶媒分子1つ以上と抗CD70結合剤及び/又は治療薬の会合を指す。製薬上許容しうる溶媒和物を形成する溶媒の例は、限定しないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンを包含する。
【0086】
「AFP」という略記はジメチルバリン−バリン−ドライソロイシ−ドラプロリン−フェニルアラニン−p−フェニレンジアミンを指す。
【0087】
「MMAE」という略記はモノメチルオーリスタチンEを指す。
【0088】
「AEB」という略記はパラアセチル安息香酸にオーリスタチンEを反応させることにより生成するエステルを指す。
【0089】
「AEVB」という略記はベンゾイル吉草酸にオーリスタチンEを反応させることにより生成するエステルを指す。
【0090】
「MMAF」という略記はドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニンを指す。
【0091】
「fk」および「phe−lys」という略記はリンカーフェニルアラニン−リジンを指す。
II.抗CD70抗体及びその誘導体
本明細書に記載した組成物及び方法はCD70に特異的に結合するCD70結合剤の使用を包含する。CD70結合剤はCD70発現癌細胞、活性化免疫細胞又は他の標的細胞に対し、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を発揮する。CD70結合剤は例えば抗CD70抗体、抗CD70抗体の抗原結合フラグメント、その誘導体、又は、CD70結合抗体の相補性決定領域(CDR)少なくとも1つを含む他のCD70結合剤であることができる。
【0092】
1つの態様において、CD70結合剤はモノクローナル抗体1F6の相補性決定領域(CDR)1つ以上に同一、実質的に同一又は実質的に同様のCDR1つ以上を含む。(1F6の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ配列番号1及び配列番号2、及び、配列番号21及び配列番号22に示す通りであり、そして、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願WO04/073656に開示されている。)例えば、結合剤はmAb1F6の相当する重鎖CDR(H1、H2又はH3領域)又は相当する軽鎖CDR(L1、L2又はL3領域)と同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR及び/又は軽鎖CDRを包含できる。典型的な実施形態においては、抗CD70結合剤はmAb1F6の相当する重鎖及び/又は軽鎖のCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である2つ又は3つの重鎖CDR及び/又は2つ又は3つの軽鎖CDRを有する。
【0093】
例えば、一部の実施形態においては、抗CD70結合剤がmAb1F6の重鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR少なくとも1つを有する場合は、結合剤は更にmAb 1F6の軽鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である軽鎖CDR少なくとも1つを包含することができる。
【0094】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤は重鎖又は軽鎖の可変ドメインを包含し、可変ドメインは、(a)mAb 1F6の相当するCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である3つのCDRのセット、及び(b)ヒト免疫グロブリン由来の4つの可変領域フレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗CD70抗体は重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインを包含することができ、可変ドメインは(a)CDRのセットがモノクローナル抗体I6F由来である3つのCDRのセット、及び(b)ヒトIgGから誘導された4つのフレームワーク領域のセットを有する。抗体は場合によりヒンジ領域を包含できる。例示される実施形態においては抗CD70抗体は完全にヒト化された抗体である。
【0095】
別の態様において、CD70結合剤はモノクローナル抗体2F2の相補性決定領域(CDR)1つ以上に実質的に同一又は実質的に同様のCDR1つ以上を含む。(2F2の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ配列番号27及び配列番号28、及び、配列番号29及び配列番号30に示す通りであり、そして、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願WO04/073656に開示されている。)例えば、結合剤はmAb 2F2の相当する重鎖CDR(H1、H2又はH3領域)又は相当する軽鎖CDR(L1、L2又はL3領域)と同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR及び/又は軽鎖CDRを包含できる。典型的な実施形態においては、抗CD70結合剤はmAb 2F2の相当する重鎖及び/又は軽鎖のCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である2つ又は3つの重鎖CDR及び/又は2つ又は3つの軽鎖CDRを有する。
【0096】
例えば、一部の実施形態においては、抗CD70抗体がmAb 2F2の重鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖CDR少なくとも1つを有する場合は、抗体又はその誘導体は更にmAb 2F2の軽鎖CDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である軽鎖CDR少なくとも1つを包含することができる。
【0097】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤は重鎖又は軽鎖の可変ドメインを包含し、可変ドメインは、(a)mAb 2F2の相当するCDRと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である3つのCDRのセット、及び(b)ヒト免疫グロブリン由来の4つの可変領域フレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗CD70抗体は重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインを包含することができ、可変ドメインは(a)CDRのセットがモノクローナル抗体2F2由来である3つのCDRのセット、及び(b)ヒトIgGから誘導された4つのフレームワーク領域のセットを有する。抗体は場合によりヒンジ領域を包含できる。例示される実施形態においては抗CD70抗体は完全にヒト化された抗体である。
【0098】
一部の実施形態においては、フレームワーク領域はヒト生殖細胞系統のエキソンVH、JH、Vκ及びJκの配列から選択される。例えばc1F6VHドメインのFRのヒト化のためのアクセプター配列は生殖細胞系統のVHエキソンVH1−18(Matsuda et al.,1993,Nature Genetics 3:88−94)又はVH1−2(Shin et al.,1991,EMBO J.10:3641−3645)及びヒンジ領域(JH)についてはエキソンJH−6(Mattila et al.,1995,Eur,J.Immunol.25:2578−2582)から選択できる。他の実施形態においては生殖細胞系統VκエキソンB3(Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827−836)及びJκエキソンJκ−1(Hieter et al.,1982,J.Biol.Chem.257:1516−1522)をc1F6 VLドメインヒト化のためのアクセプター配列として選択できる。
【0099】
一部の実施形態においては、ヒト化抗CD70抗体のフレームワーク領域の配列は使用されるアクセプターヒト生殖細胞系エキソンの誘導体、例えばマウスドナー残基が再導入されている誘導体を包含する。これ等の残基はKabatのナンバリング規則に従えばVHドメインのH46、H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82、H82A及びH91位の1つ以上におけるマウスドナー残基の再導入を包含する。
【0100】
以下の表は各配列番号が相当するヒト化1F6の領域を示す。
【0101】
【化30】
【0102】
【化31】
【0103】
【化32】
一部の実施形態においては、CD70結合剤は抗体1F6又は2F2のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントであることができる。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を有するポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む。
【0104】
一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも80%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも85%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも90%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも95%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも99%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドは抗体1F6又は2F2の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有さない。
【0105】
一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも80%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも85%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも95%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも99%同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドは抗体1F6又は2F2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有さない。
【0106】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤はヒトCD70への結合に関してモノクローナル抗体1F6または2F2と競合する。一部の実施形態においてはCD70結合剤はCD70への結合時にアゴニスト性又は拮抗性のシグナルを誘導しない(例えば増殖を刺激しない)。一部の実施形態においてはCD70結合剤はCD70へのCD27の結合を少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%ブロックする。
【0107】
CD70結合剤は場合によりCD70発現標的細胞に対抗したADCC、ADCP及び/又はCDC応答を媒介又は刺激する抗体エフェクタードメインを包含する。エフェクタードメインは例えばIg分子のFcドメインであることができる。このようなCD70結合剤は、CD70発現癌細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を示すか、又は、活性化されたリンパ球又は樹状細胞に対し、例えば、それぞれCD70発現癌又は免疫学的障害の治療において、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。典型的にはCD70結合剤は細胞毒性白血球(例えばナチュラルキラー(NK)細胞、貪食細胞(例えばマクロファージ)及び/又は血清補体成分)をリクルート及び/又は活性化する。
【0108】
抗CD70抗体はヒト化抗体、1本鎖抗体、scFv、ダイアボディ、Fab、ミニボディ、scFv−Fc、Fv等であることができる。一部の実施形態においては、CD70の抗原結合領域はエフェクタードメイン、例えば免疫グロブリンのヒンジ−CH2−CH3ドメイン、エフェクター機能を有するエフェクタードメインの部分又はフラグメントに連結することができる。抗原結合抗体フラグメント、例えば1本鎖抗体は、例えばエフェクタードメインの全体又は部分と組み合わせて可変領域を含むことができる(例えばCH2及び/又はCH3ドメイン単独又はCH1、ヒンジ及び/又はCLドメインと組み合わせたもの)。更に又、抗原結合フラグメントはエフェクタードメインの何れかの組合せを含むことができる。一部の実施形態においては、抗CD70抗体はヒンジ−CH2−CH3ドメインに連結されたCD70結合可変領域を含む1本鎖抗体であることができる。
【0109】
抗CD70抗体のエフェクタードメインは何れかの適当なヒト免疫グロブリンアイソタイプ由来であることができる。例えば、CDC及びADCC/ADCPを媒介するヒト免疫グロブリンの能力は一般的にそれぞれIgM≒IgG1≒IgG3>IgG2>IgG4及びIgG1≒IgG3>IgG2/IhM/IgG4である。CD70結合ポリペプチドは所望のエフェクター機能を得るために適切な定常ドメインよりなる組み換え融合蛋白として発現させることができる。標的細胞への結合時に、抗CD70抗体又は誘導体はADCC、CDC及びADCPのような抗体エフェクター機能を介してインビトロ及びインビボの標的細胞破壊をトリガーすることができる。
【0110】
CD70結合剤は場合により治療薬、例えば細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤にコンジュゲートすることができる。
【0111】
一部の実施形態においては、抗CD70抗体は、ヒト又は非ヒトのFc領域又はその部分を含むキメラであることができる。例えば、抗体は非ヒト機嫌、例えばげっ歯類(例えばマウス又はラット)、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はサル(例えばマカク、アカゲザル等)のFcドメイン又は部分を包含できる。
【0112】
抗CD70結合剤、例えば抗体は単一特異性、二重特異性、3重特異性又はより高度な多重特異性であることができる。多重特異性抗体はCD70の種々のエピトープに対して特異的であってよく、及び/又は、CD70及び非相同蛋白の両方に対して特異性であってよい。(例えばPCT出願WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360及びWO92/05793;Tutt et al.,1991,J.Immunol.147:60−69;米国特許4,474,893;4,714,681;4,925,648;5,573,920;及び5,601,819;Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547−1553参照。)本明細書に記載した方法を実施するために有用である多重特異性抗体、例えば二重特異性及び3重特異性抗体は、CD70(例えば限定していないがモノクローナル抗体2F2及び1F6のCDRを有する抗体)及びADCC、ADCP及び/又はCDCを媒介する第2の細胞表面受容体又は受容体複合体、例えばCD16/FcγRIII、CD64/FcγRI、キラー抑制又は活性化受容体又は補体制御蛋白CD59の両方に免疫特異的に結合する抗体である。一部の実施形態においては、多重特異性抗体の部分の第2の細胞表面分子又は受容体複合体への結合は抗CD70抗体又は他のCD70結合剤のエフェクター機能を増強する場合がある。
【0113】
抗CD70抗体及びその誘導体及び他の結合剤はまたCD70へのそれらの結合親和性に関して説明又は特定してよい。典型的な結合親和性は5x10−2M、10−2M、5x10−3M、10−3M、5x10−4M、10−4M、5x10−5M、10−4M、5x10−6M、10−6M、5x10−7M、10−7M、5x10−8M、10−8M、5x10−9M、10−9M、5x10−10M、10−10M、5x10−11M、10−11M、5x10−12M、10−12M、5x10−13M、10−13M、5x10−14M、10−14M、5x10−15M又は10−15M未満の解離定数即ちKdを有するものを包含する。
【0114】
抗体は当該分野で知られた方法により形成できる。例えばモノクローナル抗体は広範な種類の手法、例えばハイブリドーマ、組み換え体及びファージディスプレイの技術又はこれ等の組合せの使用により製造できる。ハイブリドーマ手法は一般的に例えばHarlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.,1988);及びHammerling et al.,Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas,pp.563−681(Elsevier,N.Y.,1981)に記載されている。抗CD70抗体を作成するために使用できるファージディスプレイ法の例は、例えば、Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381;Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581;Quan and Carter,2002,The rise of monoclonal antibodies as therapeutics in Anti−IgE and Allergic Disease,Jardieu and Fick Jr.,eds.,Marcel Dekker,New York,NY,Chapter 20,pp.427−469;Brinkman et al.,1995,J.Immunol.Methods 182:41−50;Ames et al.,1995,J.Immunol.Methods 184:177−186;Kettleborough et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:952−958;Persic et al.,1997,Gene 187:9−18;Burton et al.,1994,Advances in Immunology 57:191−280;PCT出願PCT/GB91/01134;PCT公開WO90/02809,WO91/10737,WO92/01047,WO92/18619,WO93/11236,WO95/15982,WO95/20401及び米国特許5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743及び5,969,108(すべて参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているものを包含する。
【0115】
1本鎖抗体を作成するために使用できる手法の例は、米国特許4,946,778及び5,258,498;Huston et al.,1991,Methods in Enzymology 203:46−88;Shu et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7995−7999;及びSkerra et al.,1988,Science240:1038−1040に記載されているものを包含する。
【0116】
二重特異性抗体を作成するための方法は当業者の知る通りである。完全長二重特異性抗体の伝統的製造は2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、その場合、2つの鎖は異なる特異性を有する(Milstein et al.,1983,Nature 305:537−39)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取合せの為に、これ等のハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、これ等のうちの一部は正しい二重特異性構造を有する。応用の操作法は国際特許出願WO93/08829及びTraunecker et al.,1991,EMBO J.10:3655−59に開示されている。
【0117】
異なる方法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体−抗原複合化部位)を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。融合は典型的にはヒンジ、CH2及びCH3領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを用いる。一部の実施形態においては、融合は、融合の少なくとも1つにおいて存在する軽鎖結合の為に必要な部位を含有する第1の重鎖定常ドメイン(CH1)を包含する。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードする配列を有する核酸を別個の発現ベクターに挿入し、そして適当な宿主生物内にトランスフェクトする。これは、構築において使用される等しくない比の3種のポリペプチド鎖が最適な収率をもたらす実施形態において3種のポリペプチドフラグメントの相互の比率を調節する場合に、多大な柔軟性をもたらす。しかしながら、等しい比の少なくとも2種のポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすか、又は、比が特に重要ではない場合には、1つの発現ベクター中に2種又は3種全てのポリペプチド鎖に対するコーディング配列を挿入することが可能である。
【0118】
この方法の1つの実施形態において、二重特異性抗体は1つのアームにおいて第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び、もう1つのアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対(第2の結合特異性を与える)を有する。この非対称の構造は、二重異性分子の僅か半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離方法が可能となることから、より望ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする(例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願WO94/04690参照)。
【0119】
二重特異性抗体に関する更に詳細な考察は、例えばSuresh et al.,1986,Methods in Enzymology 121:210;Rodrigues et al.,1993,J.Immunology 151:6954−61;Carter et al.,1992,Bio/Technology 10:163−67;Carter et al.,1995,J.Hematotherapy 4:463−70;Merchant et al.,1998,Nature Biotechnology 16:677−81を参照できる。このような手法を使用することにより、二重特異性抗体を製造して本明細書に定義する疾患の治療又は防止において使用することができる。
【0120】
二官能性抗体はまた欧州特許出願EPA0105360に記載のものである。この参考文献に記載の通り、ハイブリッド又は二官能性の抗体は、生物学的に、即ち細胞融合の手法により、又は化学的に、特に交差結合剤又はジスルフィド架橋形成試薬を用いて、誘導することができ、そして抗体全体、又はそのフラグメントを含んでよい。このようなハイブリッド抗体を得るための方法は例えば参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願WO83/03679及び欧州特許出願EPA0217577に開示されている。
【0121】
一部の実施形態においては、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は抗原結合を改変、好ましくは向上させるためにCDRドナー抗体由来の相当する残基で置換される。これ等のフレームワーク置換は当該分野で良く知られている方法により、例えばCDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合及び配列比較の為に重要なフレームワーク残基を発見することにより特定の位置における通常ではないフレームワーク残基を発見することにより、発見される。(例えば米国特許5,585,089;Riechmann et al.,1988,Nature 332:323参照)。抗体は当該分野で知られた種々の手法、例えばCDRグラフティング(例えばEP0239400;PCT公開WO 91/09967;米国特許5,225,539;5,530,101;及び5,585,089)、ベニアリング又はリサーフィシング(例えばEP0592 106;EP0519596;Padlan,1991,Molecular Immunology,1991,28(4/5):489−498;Studnicka et al.,1994,Protein Engineering 7(6):805−814;Roguska et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969−973参照)及び鎖シャフリング(米国特許5,565,332参照)を用いてヒト化できる(これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる)。
【0122】
ヒト化モノクローナル抗体は当該分野で知られた組み換えDNA手法により、例えば各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開WO 87/02671;欧州特許公開184,187;欧州特許公開171496;欧州特許公開173494;国際特許公開WO 86/01533;米国特許4,816,567;欧州特許公開12,023;Berter et al.,1988,Science 240:1041−43;Liu et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439−43;Liu et al.,1987,J.Immunol.139:3521−26;Sun et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214−18;Nishimura et al.,1987,Cancer.Res.47:999−1005;Wood et al.,1985,Nature 314:446−449;及びShaw et al.,1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553−59;Morrison,1985,Science 229:1202−07;Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214;U.S.Patent No.5225539;Jones et al.,1986,Nature 321:552−25;Verhoeyan et al.1988,Science 239:1534;及びBeidler et al.,1988,J.Immunol.141:4053−60に記載されている方法を用いて作成できる。
【0123】
上記した通り、CD70結合剤は抗CD70抗体の誘導体であることができる。一般的に抗CD70抗体誘導体は抗CD70抗体(例えば抗原結合フラグメント又は保存的に置換されたポリペプチドを含む)及び抗CD70抗体に対して非相同の少なくとも1つのポリペプチド領域又は他の部分を含む。例えば抗CD70抗体は例えば何れかの型の分子の共有結合により修飾できる。典型的な修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、PEG化、ホスホリル化、アミド化、知られた保護/ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、細胞リガンド(例えばアルブミン結合分子)又は他の蛋白への連結等を包含する。多くの化学的修飾のいずれかを知られた手法、例えば限定しないが特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により行ってよい。
【0124】
一部の実施形態においては、共有結合はエフェクター機能を妨害、例えば抗体誘導体が抗原結合領域又はそこから誘導された領域を介してCD70に特異的に結合することや、エフェクタードメインがFc受容体に特異的に結合することすることを妨げない。
【0125】
一部の実施形態においては、抗体誘導体は単量体1つ以上を含む多量体、例えば2量体であり、その場合、各単量体は(i)抗CD70抗体の抗原結合領域又はそこから誘導(例えばアミノ酸1つ以上の保存的置換により)されたポリペプチド領域;及び(ii)抗体誘導体がCD70に特異的に結合する多量体(例えばホモ2量体)を形成できるようにするための多量体化(例えば2量体化)ポリペプチド領域を包含する。典型的な実施形態においては、抗CD70抗体の抗原結合領域又はそこから誘導されたポリペプチド領域は非相同の蛋白に組み換えによるか化学的に融合され、その場合、非相同蛋白は2量体化又は多量体化ドメインを含む。免疫学的障害又はCD70発現癌を治療又は防止する目的の為に対象に抗体誘導体を投与する前に、誘導体はホモ2量体又はヘテロ2量体の形成を可能にする条件に付す。ヘテロ2量体は、本明細書においては、同一の2量体化ドメインと異なるCD70抗体結合領域、同一のCD70抗体結合領域と異なる2量体化ドメイン、又は、異なるCD70抗体結合領域と2量体化ドメインを含んでよい。
【0126】
典型的な2量体化ドメインは転写因子を起源とするものである。1つの実施形態において、2量体化ドメインは塩基性領域ロイシンジッパー(「bZIP」)のものである(Vinson et al.,1989,Science 246:911−916参照)。有用なロイシンジッパードメインは例えばコウボ転写因子GCN4、哺乳類転写因子CCAAT/エンハンサー結合蛋白C/EBP及び癌遺伝子産物Fos及びJun中の核形質転換体のものを包含する。(例えばLandschultz et al.,1988,Science 240:1759−64;Baxevanis and Vinson,1993,Curr.Op.Gen.Devel.3:278−285;O’Shea et al.,1989,Science 243:538−542参照。)別の実施形態においては、2量体化ドメインは塩基性領域ヘリックス−ループ−ヘリックス(「bHLH」)蛋白のものである。(例えばMurre et al.,1989,Cell 56:777−783参照。更にDavis et al.,1990,Cell 60:733−746;Voronova and Baltimore,1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4722−26参照。)得に有用なhHLH蛋白はmyc、max及びmacである。
【0127】
更に別の実施形態において、2量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域、例えば重鎖定常領域又はそのドメイン(例えばCH1ドメイン、CH2ドメイン及び/又はCH3ドメイン)である。(例えば米国特許5,155,027;5,336,603;5,359,046;及び5,349,053;EP0367166;WO96/04388参照。)
ヘテロ2量体はFosとJunとの間(Bohmann et al.,1987,Science 238:1386−1392),ATF/CREBファミリーのメンバーの間(Hai et al.,1989,Genes Dev.3:2083−2090),C/EBPファミリーのメンバーの間(Cao et al.,1991,Genes Dev.5:1538−52;Williams et al.,1991,Genes Dev.5:1553−67;Roman et al.,1990,Genes Dev.4:1404−15)及びATF/CREB及びFos/Junファミリーのメンバーの間(Hai and Curran,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3720−24)で形成されることが知られている。従って、CD70結合蛋白を種々の2量体化ドメインを含むヘテロ2量体として対象に投与する場合、上記の何れかの組合せを使用してよい。
【0128】
別の実施形態においては、抗CD70抗体誘導体は第2の抗体にコンジュゲートされた抗CD70抗体(「抗体ヘテロコンジュゲート」)である(例えば米国特許4,676,980参照)。本発明の方法を実施するために有用なヘテロコンジュゲートはCD70に結合する抗体(例えばモノクローナル抗体2F2又は1F6のCDR及び/又は重鎖を有する抗体)及びADCC、貪食作用及び/又はCDCを媒介する表面受容体又は受容体複合体、例えばCD16/FcgRIII、CD64/FcgRI、キラー細胞活性化又は抑制性の受容体、又は、補体制御蛋白CD59に結合する抗体を含む。典型的な実施形態においては、第2の細胞の表面分子又は受容体複合体への多重特異性抗体の部分の結合は、抗CD70抗体のエフェクター機能を増強する。他の実施形態においては、抗体は治療薬であることができる。適当な抗体治療薬は本明細書に記載する。
【0129】
一部の実施形態においては、抗CD70抗体又はその誘導体は競合的結合を測定するための当該分野で知られた何れかの方法(例えば本明細書に記載する免疫学的検定試験)により測定した場合に、CD70へのmAb1F6又は2F2の結合を競合的に抑制する。典型的な実施形態においては、抗体はCD70への1F6又は2F2の結合を少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%又は少なくとも75%競合的に抑制する。他の実施形態においては、抗体はCD70への1F6又は2F2の結合を少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%競合的に抑制する。
【0130】
抗体は種々の知られた方法のいずれかによりCD70への特異的結合について試験することができる。使用できる免疫学的検定試験は例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着試験)、「サンドイッチ」免疫学的検定試験、免疫沈降試験、プレシピチン反応、ゲル核酸プレシピチン反応、免疫拡散試験、凝集試験、補体個体試験、免疫放射計試験、蛍光免疫学的検定試験及びプロテインA免疫学的検定試験のような手法を用いる競合的及び非競合的な試験系を包含する。そのような試験は当該分野で良く知られている。(例えば、Ausubel et al.,eds.,Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,New York,4th ed.1999);Harlow&Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999参照)。
【0131】
更に又、CD70への抗体の結合親和性及び抗体CD70相互作用のオフレートを競合的結合試験により測定することができる。競合的結合試験の1つの例は漸増量の未標識CD70の存在下で目的の抗体と共に標識されたCD70(例えば3H又は125I)をインキュベートし、標識されたCD70に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。次にCD70に対する抗体の親和性及び結合オフレートをスカッチャードプロットの分析によりデータから求めることができる。第2の抗体(例えばmAb1F6又は2F2)との競合もまたラジオイムノアッセイを用いて測定できる。この場合、漸増量の未標識の第2の抗体の存在下、標識された化合物(例えば3H又は125I)にコンジュゲートした目的の抗体と共にCD70をインキュベートする。或いは、CD70への抗体の結合親和性及び抗体CD70相互作用のオン及びオフレートは表面プラズモン共鳴により測定できる。一部の実施形態においては、抗CD70抗体又はその誘導体はCD70発現細胞に向けてターゲティングし、その膜上に蓄積させることができる。
【0132】
抗CD70抗体及びその誘導体は、蛋白の合成に関する当該分野で知られた方法により、典型的には例えば組み換え発現の手法により、製造することができる。CD70に結合する抗体又はその誘導体の組み換え発現は典型的には、抗体又はその誘導体をコードする核酸を含有する発現ベクターの構築を包含する。蛋白分子の製造のためのベクターは当該分野で知られた手法を用いた組み換えDNA技術により製造してよい。標準的な手法、例えばSambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,3rd ed.,2001);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2nd ed.,1989);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,John Wiley&Sons,New York,4th ed.,1999);及びGlick&Pasternak,Molecular Biotechnology:Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press,Washington,D.C.,2nd ed.,1998)に記載のものを、組み換え核酸法、核酸合成、細胞培養、トランスジーン取り込み、及び、組み換え蛋白発現の為に使用することができる。
【0133】
例えば、抗CD70抗体の組み換え発現のためには、発現ベクターはプロモーターに作動可能に連結したその重鎖又は軽鎖、又は重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードしてよい。発現ベクターは例えば抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を包含してよく(例えばPCT公開WO 86/05807;PCT公開WO 89/01036;及び米国特許5,122,464参照)、そして抗体の可変ドメインは重鎖又は軽鎖全体の発現の為にベクターそのようなベクター内にクローニングしてよい。発現ベクターは従来の手法により宿主細胞に転移させ、そして次にトランスフェクトされた細胞を従来の手法により培養することにより抗CD70抗体を製造する。二重鎖の抗体の発現のための典型的な実施形態においては、重全免疫グロブリン分子の発現のために、鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞内で同時発現することができる。
【0134】
種々の原核生物及び真核生物の宿主発現ベクター系を利用して抗CD70抗体又はその誘導体を発現することができる。典型的には、真核生物の細胞、特に全組み換え抗CD70抗体分子用のものを、組み換え蛋白の発現の為に使用する。例えば、ヒトサイトメガロウィルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のような哺乳類細胞が抗CD70抗体及びその誘導体の製造のための有効な発現系である(例えばFoecking et al.,1986,Gene 45:101;Cockett et al.,1990,Bio/Technology 8:2参照)。
【0135】
他の宿主発現系は、例えば、細菌細胞中のプラスミド系の発現系(例えばRuther et al.,1983,EMBO 1,2:1791;Inouye&Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13:3101−3109;Van Heeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503−5509参照);昆虫系、例えばSpodoptera frugiperda細胞中のAutographa californica核粟粒熱ウィルス(AcNPV)発現ベクター;及び哺乳類細胞中のウィルス系発現系、例えばアデノウィルス系の系(例えばLogan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355−359;Bittner et al.,1987,Methods in Enzymol.153:51−544参照)を包含する。
【0136】
更に又、挿入された配列の発現をモジュレートするか、又は、特定の所望の態様において遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞系統を選択することもできる。適切な細胞系統又は宿主系は、発現される蛋白の正確な修飾及びプロセシング(例えばグリコシル化、ホスホリル化及び切断)が確保されるように選択することができる。この目的のためには、一次転写物及び遺伝子産物の適切なプロセシングのための細胞機序を保有している真核生物宿主細胞を使用できる。そのような哺乳類宿主細胞は例えば、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293,3T3及びW138を包含する。
【0137】
安定な発現系は典型的には、組み換え抗CD70抗体又はその誘導体又は他のCD70結合剤の長期の高収率の製造の為に使用される。例えば抗CD70抗体又はその誘導体を安定に発現する細胞系統は、適切な発現制御エレメント(例えばプロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位)で制御されたDNA及び選択可能なマーカーによる宿主細胞の形質転換、その後の選択培地中における形質転換細胞の成育により作成することができる。選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、そして細胞が安定にDNAをその染色体内に組み込んで細胞叢を形成できるようにし、それを次にクローニングして増殖させ、細胞系統とする。多くの選択系を使用でき、例えば単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられ、これはそれぞれtk−、hgprt−又はaprt−細胞内で使用できる。更に又、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子、即ちメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr;マイコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt;アミノグリコシオG−418に対する耐性を付与するneo;ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroに対する選択の基準として使用できる。組み換えDNA技術の当該分野で一般的に知られた方法を日常的に適用することにより所望の組み換えクローンを選択することができ、そしてそのような方法は例えばCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons,N.Y.,1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(Stockton Press,N.Y.,1990);Current Protocols in Human Genetics(Dracopoli et al.eds.,John Wiley&Sons,N.Y.,1994,Chapters 12 and 13);及びColberre−Garapin et al.,1981,J.Mol.Biol.150:1に記載されている。
【0138】
抗体又は誘導体の発現の水準はベクター増幅により増大させることができる。(一般的にBebbington&Hentschel,The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning,Vol.3(Academic Press,New York,1987)を参照できる)。抗CD70抗体又はその誘導体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合は、宿主細胞培養物中に存在する抑制剤の濃度を増大させることにより抑制剤に対する耐性を付与しているマーカー遺伝子の増大したコピー数を有する宿主細胞を選択できるようになる。関連する抗体遺伝子のコピー数もまた増大することができ、これにより抗体又はその誘導体の発現を増大させることができる(Crouse et al.,1983,Mol.Cell.Biol.3:257参照)。
【0139】
抗CD70抗体が重鎖及び軽鎖の両方又はその誘導体を含む場合、宿主細胞は2つの発現ベクター、即ち、重鎖蛋白をコードする第1のベクター及び軽鎖蛋白をコードする第2のベクターで同時トランスフェクトしてよい。2つのベクターは重鎖及び軽鎖の蛋白の等しい発現を可能とする同一の選択可能なマーカーを含有していてよい。或いは、重鎖及び軽鎖の蛋白の両方をコードしており、それらを発現することができる単一のベクターを使用してよい。そのような場合、軽鎖は典型的には重鎖の前に位置させることにより毒性の遊離の重鎖が過剰になることを回避する(Proudfoot,1986,Nature 322:52;Kohler,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197参照)。重鎖及び軽鎖に関するコーディング配列はcDNA又はゲノムDNAを含んでよい。
【0140】
抗CD70抗体又はその誘導体を製造(例えば動物、化学合成又は組み換え発現による)した後、それは何れかの適当な蛋白精製方法、例えばクロマトグラフィー(例えばイオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー(例えばインタクトなFc領域を有する抗体の精製のためにはプロテインAクロマトグラフィー))、遠心分離、溶解度の差によるか、又は、蛋白精製のための何れかの他の標準的な手法により精製することができる。抗CD70抗体又はその誘導体は例えばマーカー配列、例えばペプチドと融合させることによりアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にすることができる。適当なアミノ酸配列は、例えばヘキサヒスチジンペプチド、例えばpQEベクター(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA,91311)により与えられるタグ、及びインフルエンザヘマグルチニン蛋白から誘導されたエピトープに相当する「HA」タグ(Wilson et al.,1984,Cell 37:767)及び「flag」タグを包含する。
【0141】
抗CD70抗体又はその誘導体を製造した後、CD70発現癌細胞に対する細胞増殖抑制性又は細胞毒性作用又はCD70発現免疫細胞に対する免疫調節性の作用を発揮するその能力を後述する、又は、当該分野で知られた方法により測定する。
【0142】
活性化された免疫細胞又はCD70発現癌細胞の外部における抗CD70抗体の活性を最小限にするために、活性化された免疫細胞又はCD70発現癌細胞の細胞表面上に抗CD70抗体が濃縮されるように膜結合CD70には特異的に結合するが、可溶性CD70には結合しない抗体を用いることができる。
【0143】
典型的には、抗CD70抗体又は誘導体は、実質的に精製する(例えばその作用を制限するか望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に非含有とする)。一部の実施形態においては、抗CD70抗体又は誘導体は少なくとも約40%純粋、少なくとも約50%純粋、又は少なくとも約60%純粋である。一部の実施形態においては、抗CD70抗体又は誘導体は少なくとも約60〜65%、65〜70%、70〜75%、75〜80%、80〜85%、85〜90%、90〜95%又は95〜98%純粋である。一部の実施形態においては抗CD70抗体又は誘導体は約99%純粋である。
III.他のCD70結合剤
別のCD70結合剤は非相同蛋白(典型的には少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は少なくとも100アミノ酸)との融合蛋白(即ち組み換え融合された、又は共有結合及び非共有結合コンジュゲーションの両方を包含する化学的にコンジュゲートされた蛋白)を包含する。そのようなCD70結合剤はCD70及び免疫グロブリンエフェクタードメイン又はその機能的等価物に結合する部分を包含することができる。本明細書においては、免疫グロブリンエフェクタードメインの機能的等価物は、貪食作用又は細胞溶解活性を用いて、又は、補体系の成分へのFcエフェクタードメインの結合により、免疫細胞上のFc受容体に結合する。融合蛋白は必ずしも直接のものである必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。
【0144】
例えばCD70結合剤はCDRの1つ以上のコーディング領域又は抗CD70抗体の可変領域を非相同蛋白に対してコーディングしている配列とインフレームに融合することにより組み換えにより製造できる。非相同蛋白は例えばエフェクタードメイン、その機能的等価物、又は以下の特性、即ち、安定な発現を促進する;高収率の組み換え発現を容易にする手段を与える;細胞増殖抑制性、細胞毒性又は免疫調節性の活性を与える;及び/又は多量体化ドメインを与えることの1つ以上を与える他の機能的ドメインを包含することができる。
【0145】
一部の実施形態においてはCD70結合剤は、細胞毒性剤へのコンジュゲーションを伴うことなく単独で、CD70に結合し、CD70発現細胞を枯渇させるか、その増殖を抑制する抗体に由来するCDR1つ以上を包含してよい。
IV.抗CD70ターゲティング剤のエフェクター機能を向上させる方法
一部の実施形態においては、CD70結合剤のエフェクター機能は、当該分野で知られた抗体操作法1つ以上を用いてそのエフェクター機能を向上させることにより増強することができる。そのような方法の例示される非限定的な例を以下に記載する。
【0146】
ADCC及びADCPはエフェクター細胞上に発現されるFcγ受容体(FcγR)との細胞結合抗体の相互作用を介して媒介される。IgGFc領域のグリコシル化状態及び一次アミノ酸配列の両方がFcγ−FcγR相互作用に対して機能的作用を有している。より強力なFcγ−FcγR相互作用はエフェクター細胞によるより良好な標的細胞の殺傷に関連している。
【0147】
保存されたAsn297に共有結合したオリゴ糖がFcγRに結合するためのIgGのFc領域に関与している(Lund et al.,1996,J.Immunol.157:4963−69;Wright and Morrison,1997,Trends Biotechnol.15:26−31)。IgG上のこのグリコ型の操作はIgG媒介ADCCを顕著に向上させる。このグリコ型へのN−アセチルグルコサミン修飾の付加(Umana etal.,1999,Nat.Biotechnol.17:176−180;Davies et al.,2001,Biotech Bioeng.74:288−94)又はこのグリコ型からのフコースの除去(Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277:26733−40;Shinkawa et al.,2003,J.Biol.Chem.278:6591−604;Niwa et al.,2004,Cancer Res.64:2127−33)はIgGFcとFcγRとの間の結合を向上させることによりIg媒介ADCC活性を増強するIgGFc操作の2つの例である。
【0148】
ヒトIgG1Fc領域の溶媒曝露アミノ酸の系統的置換は改変されたFcγR結合親和性を有するIgG改変体を形成している(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604)。親IgG1と比較した場合、AlaへのThr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334又はSer298/Glu333/Lys334における置換を含むこれらの改変体のサブセットはFcγRに対する結合親和性及びADCC活性の両方における増大を示している(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604;Okazaki et al.,2004,J.Mol.Biol.336:1239−49)。
【0149】
抗体媒介CDCは細胞結合IgG分子へのC1qの結合と共に開始される。C1q結合に関与するヒトIgG1上の特定のアミノ酸残基及びC1q結合の種特異的な差が報告されている(Idusogie et al.,2000,J.Immunol.164:4178−4184)。Lys326及びGlu333における置換により抗体の補体固定活性が向上しており;例えばこのような置換はヒトIgG1抗体リツキシマブのC1q結合及びCDC活性の両方を向上させることができる(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166:2571−2575)。ヒトIgG2骨格上の同じ置換はC1qへの結合が乏しく、そして補体活性化活性において大きく欠損している抗体アイソタイプをC1qに結合して更にCDCを媒介することができるものに変換することができる(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166:2571−75)。幾つかの他の方法もまた抗体の補体固定活性の向上の為に適用されている。例えばIgGのカルボニル末端にIgMの18アミノ酸カルボキシ末端テール片をグラフとするとそのCDC活性は大きく増大する。これは通常は検出可能なCDC活性を有さないIgG4でも観察されている(Smith et al.,1995,J.Immunol.154:2226−36)。また、Cysと共にIgG1重鎖のカルボキシ末端に近接する位置にある置換Ser444は、単量体IgG1におけるCDC活性200倍での増加を伴いIgG1のtail−to−tail型の二量化誘発する(Shopes et al.,1992,J.Immunol.148:2918−22)。更に又、C1qに対する特異性を有する二重特異性のダイアボディコンストラクトもまたCDC活性を付与する(Kontermann et al.,1997,Nat.Biotech.15:629−31)。
【0150】
抗体のインビボ半減期も又そのエフェクター機能に対して影響する場合がある。一部の実施形態においては、抗体の半減期を増大又は減少させることによりその治療活性を変更することが望ましい。FcRnはβ2−ミクログロブリンと非共有結合的に会合するMHCクラスI抗原と構造的に同様の受容体である。FcRnはIgGの異化及びそのトランスサイトーシスを組織に渡って調節する(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739−766;Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25:97−113)。IgG−FcRnの相互作用はpH6.0(細胞内小胞のpH)では生じるが、pH7.4(血液のpH)では生じず;この相互作用はIgGを循環系にリサイクル可能とする(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739−766;Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25:97−113)。FcRn結合に関与するヒトIgG1上の領域はマッピングされている(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604)。ヒトIgG1のPro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382又はAsn434位におけるアラニン置換はFcRn結合を増強する(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591−604)。これ等の置換を保有しているIgG1分子はより長い血清中半減期を有することが予測される。その結果、これ等の修飾されたIgG1分子は、未修飾のIgG1と比較してより長い時間に渡り、そのエフェクター機能を実行することができ、そしてこれによりその治療効果を発揮することができる。
V.細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の活性に関する試験
抗体が標的細胞に対するエフェクター機能を媒介するかどうかを調べる方法は知られている。そのような方法の代表例を以下に記載する。
【0151】
抗CD70抗体又は誘導体が活性化免疫細胞又はCD70発現癌細胞に対して抗体依存性細胞性細胞毒性を媒介するかどうかを調べるためには、抗体及びエフェクター免疫細胞の存在下に標的細胞死を測定する試験を使用してよい。この種の細胞毒性を測定するために使用する試験はエフェクター細胞及び標的特異的抗体の存在下のインキュベーションの後の代謝的に標識された標的細胞からの51Crの放出の測定に基づいている(例えばPerussia and Loza,2000,Methods in Molecular Biology 121:179−92;及び”51Cr Release Assay of Antibody−Dependent Cell−Mediated Cytotoxicity(ADCC)”,Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,eds.,Wiley and Sons,1993参照)。例えば、Na251CrO4で標識され96穴プレートのウェル当たり5000個の細胞密度でプレーティングされた活性化免疫細胞(例えば活性化リンパ球)又はCD70発現癌細胞に種々の濃度の抗CD70抗体を30分間投与し、次に正常ヒト末梢血単核細胞(PBMC)と4時間混合することができる。標的細胞死に付随する膜破壊により51Crが培地上澄み中に放出され、これを採取し、そして細胞毒性活性の尺度として放射能を測定する。ADCCを測定する他の方法は、非放射標識を使用するか、又は、特定の酵素の誘導された放出に基づいてよい。例えば、時間分解蛍光分析に基づく非放射標識試験は市販されている(Delphia,Perkin Elmer)。この試験は細胞膜を貫通し、次いで加水分解して膜不透過性親水性リガンド(TDA)を形成する蛍光増強リガンド(BATDA)のアセトキシメチルエステルで標的細胞をローディングすることに基づいている。標的特異的抗体とPBMCエフェクター細胞を混合すると、TDAは溶解した細胞から放出され、そしてユーロピウムと混合された時点で高蛍光のキレートを形成するために使用可能となる。時間分解蛍光計を用いて測定されたシグナルは細胞溶解の量と相関している。
【0152】
抗CD70抗体又は誘導体が活性化免疫細胞又はCD70発現癌細胞に対して抗体依存性細胞性貪食作用を媒介するかどうかを調べるためには、エフェクター免疫細胞(例えば新鮮培養マクロファージ又は樹立されたマクロファージ様細胞系統)による標的細胞内在化を測定する試験を用いてよい(例えばMunn and Cheung,1990,J.Exp.Med.172:231−37;Keler et al.,2000,J.Immunol.164:5746−52;Akewanlop et al.,2001,Cancer Res.61:4061−65参照)。例えば、標的細胞を親油性膜染料、例えばPKH67(Sigma)で標識し、標的特異的抗体でコーティングし、そして4〜24時間エフェクター免疫細胞と混合してよい。次に貪食細胞表面マーカー(例えばCD14)に特異的な蛍光色素標識抗体で逆染色することによりエフェクター細胞を発見し、そして2色フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡により細胞を分析する。二重陽性細胞が内在化標的細胞を有しているエフェクター細胞である。これ等の試験のためには、エフェクター細胞はM−CSF又はGM−CSFと共に5〜10日間培養することによりマクロファージに分化しているPMBCから誘導された単球であることができる(例えば上出Munn and Cheung参照)。ATCCから入手可能なヒトマクロファージ様細胞系統U937(Larrick et al.,1980,J.Immunology 125:6−12)又はTHP−1(Tsuchiya et al.,1980,Int.J.Cancer 26:171−76)を代替の貪食細胞原料として使用してよい。
【0153】
標的細胞結合時に抗体が補体依存性細胞毒性を媒介するかどうかを調べる方法もまた知られている。同じ方法をCD70結合剤が活性化免疫細胞又はCD70発現癌細胞に対してCDCを媒介するかどうかを調べるためにも適用できる。そのような方法の代表例を以下に記載する。
【0154】
活性補体原料は正常ヒト血清であるか、又はウサギのような実験動物から精製したものであることができる。標準的な試験においては、CD70結合剤を補体の存在下、CD70発現活性化免疫細胞(例えば活性化リンパ球)又はCD70発現癌細胞と共にインキュベートする。このようなCD70結合剤が細胞溶解を媒介する能力を数種の読み取り値により調べることができる。一例においては、Na51CrO4放出試験を使用する。この試験においては、標的細胞をNa51CrO4で標識する。未取り込みのNa51CrO4を洗浄し、96穴プレート中、細胞を適当な密度、典型的には5000〜50000個/ウェルでプレーティングする。正常血清又は精製された補体の存在下、CD70結合剤と共に、典型的には2〜6時間37℃で5%CO2雰囲気下にインキュベートする。細胞溶解を示す放出された放射能は、ガンマ線計数により培養上澄み少量を用いて測定する。最大細胞溶解は洗剤(0.5〜1%NP−40又はTriton X−100)処理により取り込みNa51CrO4を放出させることにより測定する。自発的バックグラウンド細胞溶解は、CD70結合剤非存在下の補体のみが存在するウェルにおいて測定する。パーセント細胞溶解は(CD70結合剤誘導溶解−自発的溶解)/最大細胞溶解として計算する。第2の読み取り値は生細胞による代謝染料、例えばAlamar Blueの還元である。この試験においては、標的細胞を補体と共にCD70結合剤とインキュベートし、上記の通りインキュベートする。インキュベーション終了時、Alamar Blue(Biosource International,Camarillo,CA)の1/10容量を添加する。インキュベーションは16時間まで37℃5%CO2雰囲気下に継続する。代謝的に活性な生細胞の指標としてのAlamar Blueの還元は励起光530nm及び放射光590nmにおいて蛍光分析することにより測定する。第3の読み取り値はヨウ化プロピジウム(PI)に対する細胞膜の透過性である。補体活性化の結果としての原形質膜の細孔形成により細胞内へのPIの進入が促進され、細胞内では核内へ拡散してDNAに結合する。DNAへの結合により、600nmのPI蛍光が顕著に増大する。CD70結合剤及び補体の標的細胞への投与は上記の通り行う。インキュベーション終了時にPIを終濃度5μg/mLとなるように添加する。次に細胞懸濁液を励起のための488nmアルゴンレーザーを用いながらフローサイトメトリーにより調べる。溶解細胞は600nmにおける蛍光放射により検出される。
VI.免疫学的障害又はCD70発現癌の動物モデル
抗CD70結合剤、例えば抗体又は誘導体は、免疫学的障害又はCD70発現癌の動物モデルにおいて試験又は確認することができる。免疫学的障害又はCD70発現癌の樹立された動物モデル多数が当該分野で知られており、その何れも抗CD70抗体又は誘導体の薬効を試験するために使用できる。このようなモデルの非限定的な例を以下に記載する。
【0155】
全身性及び臓器特異的な自己免疫疾患、例えば糖尿病、狼瘡、全身硬化症、シェーグレン症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎(多発性硬化症)、甲状腺炎、重症筋無力症、関節炎、ブドウ膜炎及び炎症性腸疾患の動物モデルはBigazzi,“Animal Models of Autoimmunity:Spontaneous and Induced,”,The Autoimmune Diseases(Rose&Mackay eds.,Academic Press,1998)及び“Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease,”,Current Protocols in Immunology(Coligan et al.eds.,Wiley&Sons,1997)に記載されている。
【0156】
アレルギー症状、例えば、喘息及び皮膚炎もまたげっ歯類においてモデル化できる。気道過敏症は卵白アルブミン(Tomkinson et al.,2001,J.Immunol.166:5792−800)又はSchistosoma mansoni卵抗原(Tesciuba et al.,2001,J.Immunol.167:1996−2003)によりマウスにおいて誘導できる。マウスのNc/Nga系統は血清中IgEの顕著な上昇を示し、アトピー性皮膚炎様の患部を自発的に形成する(Vestergaard et al.,2000,Mol.Med.Today 6:209−10;Watanabe et al.,1997,Int.Immunol.9:461−66;Saskawa et al.,2001,Int.Arch.Allergy Immunol.126:239−47)。
【0157】
免疫コンピテントなドナーリンパ球の致死性放射線照射組織不適合成宿主への注射はマウスにおいてGVHDを誘導する古典的な方法である。或いは、親B6D2F1マウスモデルは急性及び慢性のGVHDの両方を誘導する系を与える。このモデルにおいて、B6D2F1マウスはC57BL/6及びDBA/2マウスの親系統の間の雑種に由来するF1子孫である。DBA/2リンパ様細胞を非照射B6D2F1マウスに転移させると慢性GVHDが生じるのに対し、C57BL/6、C57BL/10又はB10.D2リンパ様細胞の転移は急性GVHDが生じる(Slayback et al.,2000,Bone Marrow Transpl.26:931−938;Kataoka et al.,2001,Immunology 103:310−318)。
【0158】
更にまた、ヒト造血系肝細胞及び成熟末梢血リンパ様細胞は両方ともSCIDマウスに移植することができ、そしてこれ等のヒトリンパ造血系細胞はSCIDマウス内で機能性のまま存続する(McCune et al.,1988,Science 241:1632−1639;Kamel−Reid and Dick,1988,Science 242:1706−1709;Mosier et al.,1988,Nature 335:256−259)。これによりヒトリンパ様細胞に対する潜在的治療薬の直接の試験のための小型動物モデル系が得られている。(例えばTournoy et al.,2001,J.Immunol.166:6982−6991参照。)
更に又、抗CD70抗体又は誘導体のインビボの薬効を推定するための小型動物モデルは、適切な免疫不全のげっ歯類系統、例えば無胸腺ヌードマウス又はSCIDマウス内へのCD70発現ヒト腫瘍細胞系統の移植により作成することができる。CD70発現ヒトリンパ腫細胞系統の例は、例えば、Daudi(Ghetie et al.,1994,Blood 83:1329−36;Ghetie et al.,1990,Int JCancer 15:481−85;de Mont et al.,2001,Cancer Res. 61:7654−59),HS−Sultan(Cattan&Maung,1996,Cancer Chemother Pharmacol. 38:548−52;Cattan and Douglas,1994,Leuk.Res. 18:513−22),Raji(Ochakovskaya et al.,2001,Clin. Cancer Res. 7:1505−10;Breisto et al.,1999,Cancer Res. 59:2944−49),and CA46(Kreitman et al.,1999,Int. J. Cancer 81:148−55)を包含する。CD70発現ホジキンリンパ腫系統の非限定的な例はL428である(Drexler,1993,Leuk.Lymphoma 9:1−25;Dewan et al.,2005,Cancer Sci.96:466−473)。CD70発現ヒト腎細胞癌細胞系統の非限定的な例は786−O(Ananth et al.,1999,Cancer Res 59:2210−16;Datta et al.,2001,Cancer Res. 61:1768−75),ACHN(Hara et al.,2001,J Urol.166:2491−94;Miyake et al.,2002,J Urol.167:2203−08),Caki−1(Prewett et al.,1998,Clin.Cancer Res.4:2957−66;Shi and Siemann,2002,Br.J.Cancer 87:119−26)、及びCaki−2(Zellweger et al.,2001,Neoplasia 3:360−67)を包含する。CD70発現鼻咽頭癌細胞系統の非限定的な例はC15及びC17(Busson et al.,1988,Int.J.Cancer 42:599−606;Bernheim et al.,1993,Cancer Genet.Cytogenet.66:11−5)を包含する。CD70発現ヒト神経膠腫細胞系統の非限定的な例はU373(Palma et al.,2000,Br.J.Cancer 82:480−7)及びU87MG(Johns et al.,2002,Int.J.Cancer 98:398−408)を包含する。多発性骨髄腫細胞系統の非限定的な例はMM.1S(Greenstein et al.,2003,Experimental Hematology 31:271−282)及びL363(Diehl et al.,1978,Blut 36:331−338)を包含する。(Drexler and Matsuo,2000,Leukemia Research 24:681−703も参照できる。)これ等の腫瘍細胞系統は皮下注射による固形腫瘍として、又は、静脈内注射による播種性腫瘍として、免疫不全げっ歯類宿主中で樹立できる。宿主内で樹立された後、これ等の腫瘍モデルはインビボの腫瘍成育に関して本明細書において説明する通り、抗CD70抗体又は誘導体の治療効果を評価するために適用できる。
VII.CD70関連疾患
本明細書に記載した抗CD70結合剤(例えば抗体又は誘導体)は免疫細胞(例えばリンパ球又は樹状細胞)の不適切な活性化によるCD70の発現を態様とするCD70発現癌又は免疫学的障害を治療又は防止するために有用である。そのようなCD70発現は例えば細胞表面上の上昇したCD70蛋白水準及び/又は発現されたCD70の改変された抗原性によるものである可能性がある。本明細書に記載した方法による免疫学的障害の治療又は防止は、そのような治療又は防止を必要とする対象に抗CD70抗体又は誘導体の有用量を投与することにより、抗体又は誘導体が(i)CD70を発現し、そして失火状態に関連している活性化免疫細胞に結合し、そして(ii)活性化免疫細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を発揮することにより達成される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤へのコンジュゲーションを行うことなく発揮される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤へのコンジュゲーションにより発揮される。
【0159】
免疫細胞の不適切な活性化を態様とし、そして本明細書に記載した方法により治療又は防止できる免疫学的疾患は、例えば、障害に伏在する過敏性反応の型により分類することができる。これ等の反応は典型的には4種の型、即ちアナフィラキシー反応、細胞毒性(細胞溶解性)反応、免疫複合体反応、又は、細胞媒介免疫(CMI)反応(遅延型過敏症(DTH)反応とも称される)に分類される。(例えばFundamental Immunology(William E.Paul ed.,Raven Press,N.Y.,3rd ed.1993参照。)
このような免疫学的疾患の特定の例は以下のもの、即ち、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性脱髄疾患(例えば多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎)、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、全身エリテマトーデス、重症筋無力症、グレーブス病、糸球体腎炎、自己免疫性肝臓障害、炎症性腸疾患(例えばクローン病)、アナフィラキシー、アレルギー性反応、シェーグレン症候群、I型真性糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、線維性筋肉痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌障害、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、上皮小体機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑症、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、皮膚ヘルペス、円形脱毛症、類天疱瘡、硬皮症、進行性全身硬皮症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー減少、食道運動不全、手指硬化症及び毛細管拡張症)、雌雄の自己免疫性不妊、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、混合型結合組織疾患、結節性動脈周囲炎、全身壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺。毒性表皮壊死症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、繊維性肺胞炎、肝質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽製膿皮症、輸液反応、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼球陥没症、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックス毛様体炎、IgA腎症、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、対宿主性移植片病、移植拒絶、心筋症、イートン−ランバート症候群、回帰性多発性軟骨炎、クリオグロブリン症、ヴァルデンストレームマクログロブリン症、エバンス症候群及び自己免疫性生殖腺不全を包含する。
【0160】
従って、本明細書に記載する方法はBリンパ球(例えば全身エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ及びI型糖尿病)、Th1−リンパ球(例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核又は対宿主性移植片病)又はTh2−リンパ球(例えばアトピー性皮膚炎、全身エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症又は慢性対宿主性移植片病)の障害の治療を包含する。一般的に、樹状細胞の関与する障害はTh1−リンパ球又はTh2−リンパ球の障害が関与している。
【0161】
一部の実施形態においては、免疫学的障害はT細胞媒介免疫学的障害、例えば障害に関わっている活性化T細胞がCD70を発現するT細胞障害である。抗CD70結合剤(例えば抗体又は誘導体)はそのようなCD70発現活性化T細胞を枯渇させるために投与できる。特定の実施形態においては、抗CD70抗体又は誘導体の投与によりCD70発現活性化T細胞を枯渇させながら、休止期のT細胞は抗CD70又は誘導体により実質的に枯渇されない。この点に関し、「実質的に枯渇されない」とは、休止期の細胞の約60%未満、又は約70%未満、又は約80%未満が枯渇されないことを意味する。
【0162】
抗CD70結合剤(例えば抗体及び誘導体)は又、CD70発現癌の治療又は防止のためにも有用である。本明細書に記載した方法によるCD70発現癌の治療又は防止は、そのような治療又は防止を必要とする対象に対し、抗CD70抗体又は誘導体の有効量を投与することにより、抗体又は誘導体は(i)CD70発現癌細胞に結合し、そして(ii)CD70発現癌細胞を枯渇又は増殖を抑制するための細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を発揮することにより、達成される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤とのコンジュゲーションを伴うことなく発揮される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤とのコンジュゲーションにより発揮される。
【0163】
本明細書に記載した方法により治療又は防止できるCD70発現癌は例えば、種々のサブタイプの非ホジキンリンパ腫(無痛性NHL、濾胞性NHL、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性NHL、辺縁層NHL);ホジキン秒(例えばリード‐スターンバーグ細胞);B細胞系統の癌、例えば播種性B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ブルキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B細胞リンパ性白血病(例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病);エプスタイン−バーウィルス陽性B細胞リンパ腫;腎細胞癌(例えば明細胞及び乳頭);鼻咽頭癌;胸腺癌;神経膠腫;神経膠芽腫;神経芽腫;星状細胞腫;髄膜腫;ヴァルデンストレームマクログロブリン血症;多発性骨髄腫;及び結腸、胃及び直腸の癌を包含する。癌は例えば新規に診断されたもの、以前に治療されたもの、又は難治性又は回帰性であることができる。一部の実施形態においては、CD70発現癌は少なくとも約15000、少なくとも約10000、又は少なくとも約5000CD70分子/細胞を有する。
VIII.抗CD70抗体及び誘導体を含む医薬組成物及びその投与
CD70結合剤(例えば抗CD70抗体又は誘導体)を含む組成物は免疫学的障害又はCD70発現癌を有する、又は、有する危険性のある対象に投与できる。本発明は更に、CD70発現癌又は免疫学的障害の防止又は治療のための医薬の製造におけるCD70結合剤(例えば抗CD70抗体又は誘導体)の使用を提供する。「対象」という用語は本明細書においては、CD70結合剤を投与できる何れかの哺乳類患者、ヒト及び非ヒト哺乳類、例えば霊長類、げっ歯類及びイヌを意味する。本明細書に記載した方法を用いた治療の為に特に意図される対象はヒトを包含する。抗体又は誘導体は、免疫学的障害又はCD70発現癌の防止又は治療において、単独又は他の組成物と組み合わせて投与できる。
【0164】
種々の送達系が知られており、CD70結合剤を投与するために使用できる。導入方法は限定しないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜上及び経口の投与経路が包含される。CD70結合剤は例えば注入又は瞬時注射(例えば静脈内又は皮下)により、表皮又は粘膜ライニングを介した吸収(例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等)により投与することができ、そして、化学療法剤のような他の生物学的活性剤と共に投与することができる。投与は全身又は局所であることができる。
【0165】
特定の実施形態においては、CD70結合剤組成物は注射により、カテーテル使用により、坐剤使用により、又は、インプラント使用により投与さ、インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン性の材料、例えば膜、例えばシアラスチック膜又は線維性のものである。典型的には、組成物を投与する場合、抗CD70結合剤が吸収されない材料を使用する。
【0166】
別の実施形態においては、抗CD70結合剤は制御放出系において送達される。1つの実施形態において、ポンプを使用してよい(Langer,1990,Science 249:1527−1533;Sefton,1989,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507;Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574参照)。別の実施形態においては、重合体物質を使用できる。(Medical Applications of Controlled Release(Langer&Wise eds.,CRC Press,Boca Raton,Florida,1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen&Ball eds.,Wiley,New York,1984);Ranger&Peppas,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照できる。Levy et al.,1985,Science 228:190;During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105も参照できる。)他の制御放出系は、例えば上出Langerにおいて考察されている。
【0167】
CD70結合剤(例えば抗抗CD70抗体又は誘導体)は結合剤の治療有効量及び制約上適合性のある成分1つ以上を含む医薬組成物として投与できる。例えば、医薬組成物は典型的には製薬用の担体(例えば滅菌液体、例えば水及び油脂、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等)1つ以上を包含する。医薬組成物が静脈内に投与される場合は、水がより典型的な担体である。食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた液体担体として、特に注射溶液の為に使用できる。適当な製薬用賦形剤は例えば、澱粉、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を包含する。組成物は所望により、少量の水和剤又は乳化剤、又はpH緩衝剤を含有することもできる。これ等の組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、除放性製剤等の形態をとることができる。組成物は伝統的なバインダー及び担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として製剤できる。経口投与用製剤は標準的な担体、例えば医薬品等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を包含できる。適当な製薬用担体の例はE.W.Martinにより「Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。このような組成物は患者に適切な投与の形態がもたらされるような適当な量の担体と共に典型的には精製された形態で治療有効量の蛋白を含有することになる。製剤は投与様式に相当したものである。
【0168】
典型的な実施形態においては、医薬組成物は人間への静脈内投与に適合された医薬組成物としての日常的操作法に従って製剤される。典型的には、静脈内投与のための組成物は滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて医薬品は可溶化剤及びリグノカインのような局所麻酔剤を含むことにより注射部位の疼痛を軽減することができる。一般的に、成分は個別に又は混合されて単位剤型として、例えば凍結乾燥粉末又は水分非含有濃縮物として、密閉密封容器、例えばアンプル又は個包装中において、活性剤の品質を表示しながら供給される。医薬品を注入により投与する場合は、それは滅菌された医薬品用等級の水又は食塩水を含有する注入ボトルを用いて分注することができる。医薬品を注射により投与する場合は、滅菌注射用水又は食塩水のアンプルを提供し、成分を投与前に混合できるようにする。
【0169】
更にまた、医薬組成物は(a)CD70結合剤(抗CD70抗体又は誘導体)を凍結乾燥形態で含有する容器、及び(b)製薬上許容しうる注射用の希釈剤(例えば滅菌水)を含有する第2の容器を含む医薬品キットとして提供できる。製薬上許容しうる希釈剤は凍結乾燥した抗CD70抗体又は誘導体の復元又は希釈の為に使用できる。場合によりそのような容器に併設されているものは、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を管轄する政府当局により定められた注意書であり、その注意書はヒトへの投与に関する製造、使用又は販売の当局による認可を反映するものである。
【0170】
免疫学的障害又はCD70発現癌の治療又は防止において有効なCD70結合剤(例えば抗CD70抗体又は誘導体)の量は標準的な臨床手法により決定できる。更に、インビボの試験は場合により最適用量範囲の発見を容易にするために使用してよい。製剤中に使用する厳密な用量は投与経路及び免疫学的障害又はCD70発現癌の病期により変動し、そして、担当医師の判断及び各患者の状況に従って決定しなければならない。有効な用量はインビトロ又は動物モデルの試験系から誘導される用量応答曲線から推定してよい。
【0171】
例えば、抗CD70抗体又は誘導体の毒性及び治療効果は細胞培養物又は実験動物において、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)及びED50(集団の50%における治療有効量)を決定するための標準的な薬学的操作法により決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量の比は治療指数であり、比LD50/ED50で表すことができる。大きい治療指数を示すCD70結合剤(抗CD70抗体又は誘導体)が好ましい。CD70結合剤が毒性の副作用を示す場合、罹患組織の部位にCD70結合剤をターゲティングする送達系を使用することにより非CD70発現細胞の潜在的損傷を最小限にし、これにより副作用を低減することができる。
【0172】
細胞培養試験及び動物試験から得られたデータをヒトにおける使用の場合の用量範囲を設定する場合に使用できる。CD70結合剤の用量は典型的には、毒性が殆ど又は全く内ED50を含む循環系中濃度の範囲内に入るものである。用量は使用する剤型及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。方法においてCD70結合剤を使用するためには、治療有効用量はまず細胞培養試験から推定できる。用量は動物モデルにおいて設定することによりIC50(即ち症状の半最大抑制を達成する被験化合物の濃度)を含む循環系中の血漿中濃度を達成することができる。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中濃度は例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【0173】
一般的に免疫学的障害又はCD70発現癌を有する患者に投与されるべき抗CD70抗体又は誘導体の用量は約0.1mg/kg〜100mg/kg対象体重である。より典型的には、対象に投与されるべき用量は0.1mg/kg〜50mg/kg対象体重、更により典型的には1mg/kg〜30mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、1mg/kg〜15mg/kg、1mg/kg〜12mg/kg、1mg/kg〜10mg/kg又は1mg/kg〜7.5mg/kg対象体重である。一般的に、ヒト抗体は外来性蛋白への免疫応答のため、他の種由来の抗体よりもヒト身体内でより長い半減期を有する。即ち、ヒト化又はキメラ抗体を含む抗CD70抗体又は誘導体のより低用量及びより低頻度投与が可能な場合が多い。
【0174】
抗CD70結合剤の用量は例えば毎日、週1回(毎週)、週2回、週3回、週4回、週5回、隔週、月1回又はその他必要に応じて投与できる。
【0175】
一部の実施形態においては、抗CD70結合剤の用量は最適用量未満に相当する(即ち、抗CD70結合剤(例えば抗体薬剤コンジュゲート)のEC50より低値)。例えば、抗CD70結合剤の用量は治療ウインドウの最低25%、最低15%、最低10%又は最低5%から選択される用量を含むことができる。本明細書においては、「治療ウインドウ」という用語は安全で効果的な治療をもたらす薬剤の用量又は身体系内のその濃度の範囲を指す。
【0176】
一部の実施形態においては抗CD70結合剤(例えば抗体薬剤コンジュゲート)の用量は約0.05mg/kg〜約1mg/kg、又は約0.1mg/kg〜約0.9mg/kg、又は約0.15mg/kg〜約0.75mg/kg対象体重である。このような用量は週当たり1〜約15回投与できる。各用量は同じかまたは異なっていることができる。例えば、抗CD70結合剤約0.15mg/kgの用量を4日、5日、6日又は7日の期間当たり、1〜10回投与できる。
【0177】
一部の実施形態においては、CD70結合剤を含む医薬組成物は更に治療薬(例えば非コンジュゲートの細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば本明細書に記載のものの何れか)を含むことができる。抗CD70結合剤は又免疫学的障害又はCD70発現癌の治療又は防止の為に治療薬1つ以上と組み合わせて同時投与することができる。例えば、複合療法は治療薬(例えば細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば未コンジュゲートの細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば癌又は免疫学的障害の治療の為に従来使用されているもの)を含むことができる。複合療法はまた活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞の表面上のCD70以外の受容体又は受容体複合体をターゲティングする薬剤の投与を包含できる。このような薬剤の例は、活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞の表面において分子に結合する第2の非CD70抗体を包含する。別の例はこのような受容体又は受容体複合体をターゲティングするリガンドを包含する。典型的には、このような抗体又はリガンドは活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞の細胞表面受容体に結合し、そして、活性化されたリンパ球、樹状細胞又はCD70発現癌細胞に細胞増殖抑制性又は細胞毒性のシグナルを送達することにより、抗CD70抗体の細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を増強する。そのような組合せ投与は疾患パラメーター(例えば症状の重症度、症状数、又は回帰の頻度)に対して相加的又は相乗的な作用を有する。
【0178】
組合せ投与に関する治療用法に関しては、特定の実施形態において、抗CD70結合剤は治療薬と同時に投与する。別の特定の実施形態において、治療薬は抗CD70抗体又は誘導体の投与の少なくとも1時間〜数ヶ月前又は後、例えば、抗CD70抗体又は誘導体の投与の前又は後少なくとも1時間、5時間、12時間、1日、1週間、1ヶ月又は3ヶ月に投与する。一部の実施形態においては、対象は抗CD70結合剤及び場合により治療薬の投与後にモニタリングする。
【0179】
治療薬は例えば癌細胞又は活性化免疫細胞に対して治療効果を示す何れかの薬剤であることができる。典型的には、治療薬は細胞毒性又は免疫調節性の薬剤である。そのような組合せ投与は疾患パラメーター(例えば症状の重症度、症状数、又は回帰の頻度)に対して相加的又は相乗的な作用を有する。
【0180】
細胞毒性又は免疫調節性の薬剤の有用なクラスは例えば抗チューブリン剤、オーリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製抑制剤、アルキル化剤(例えば白金複合体、例えばシスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)及び3核系白金複合体及びカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸エステル剤、代謝拮抗剤、化学療法剤感作剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、前形成化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線感作剤、ステロイド、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等を包含する。
【0181】
個々の細胞毒性又は免疫調節性の薬剤は例えば、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン)BSNU)、CC−1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルチシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン(アクチノマイシン)、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、アンエストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、ミトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ラパマイシン(Sirolimus)、ストレプトゾトシン、テノポセイド、6−チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP−16およびVM−26を包含する。
【0182】
一部の典型的な実施形態においては、治療薬は細胞毒性剤である。適当な細胞毒性剤は、例えば、ドラスタチン(例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE)、DNA副溝結合剤(例えば、エネジインおよびレキシトロプシン)、ドゥオカルマイシン、タキサン(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、プロマイシン、ビンカアルカロイド、CC−1065、SN−38、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンAおよびB、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、ディスコデルモリド、エレウテロビンおよびミトキサントロンを包含する。
【0183】
一部の実施形態においては、細胞毒性剤は従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、マイトマイシンC又はエトポシドである。一部の実施形態においては、治療薬は複合療法、例えば、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニソロン及びビンクリスチン)、CHOP−R(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソロン及びリツキシマブ)又はABVD(ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン)であることができる。CC−1065類縁体、カリケアマイシン、マイタンシン、ドラスタチン10の類縁体、リゾキシン及びパリトキシンのような薬剤を抗CD70抗体又はその誘導体に連結することができる。
【0184】
特定の実施形態においては、細胞毒性又は細胞増殖抑制性の薬剤はオーリスタチンE(オラスタチン−10としても当該分野では知られている)又はその誘導体である。典型的にはオーリスタチンE誘導体は例えばオーリスタチンEとケト酸の間に形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンEをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させることによりAEB及びAEVBをそれぞれ生成することができる。他の型のオーリスタチン誘導体はAFP、MMAF及びMMAEを包含する。オーリスタチンE及びその誘導体の合成及び構造は米国特許出願公開20030083263及び20050009751)、国際特許出願PCT/US03/24209,国際特許出願PCT/US02/13435及び米国特許6,323,315;6,239,104;6,034,065;5,780,588;5,665,860;5,663,149;5,635,483;5,599,902;5,554,725;5,530,097;5,521,284;5,504,191;5,410,024;5,138,036;5,076,973;4,986,988;4,978,744;4,879,278;4,816,444;及び4,486,414に記載されている。
【0185】
特定の実施形態においては、細胞毒性剤はDNA副溝結合剤である(例えば米国特許6,130,237参照)。例えば、一部の実施形態においては、副溝結合剤はCBI化合物である。別の実施形態においては、副溝結合剤はエネジイン(例えばカリケアマイシン)である。
【0186】
抗チューブリン剤の例は、限定しないが、タキサン類(例えば、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、Taxotere(登録商標)(ドキセタキセル))、T67(ツラリク)、ビンカアルカロイド(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデジンおよびビノレルビン)及びドラスタチン(例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)を包含する。他の抗チューブリン剤は例えばバクカチン誘導体、タキサン類縁体(例えば、エポチロンA及びB)、ノコダゾール、コルチシンおよびコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリドおよびエレウテロビンを包含する。
【0187】
一部の実施形態においては、細胞毒性剤はマイタンシノイド、即ち別のグループの抗チューブリン剤である。例えば、特定の実施形態においては、マイタンシノイドはマイタンシン又はDM−1(ImmunoGen,Inc.;Chari etal.,1992,Cancer Res. 52: 127−131も参照)。
【0188】
一部の実施形態においては、治療薬は放射性同位体ではない。一部の実施形態においては、治療薬はリシン又はサポリンではない。
【0189】
特定の実施形態において、治療薬は抗VEGF剤、例えばAVASTIN(ベバシズマブ)又はNEXAVAR(ソラフェニブ);PDGFブロッカー、例えばSUTENT(スニチニブマレエート);又はキナーゼ阻害剤、例えばNEXAVAR(ソラフェニブトシレト)である。
【0190】
一部の実施形態においては、細胞毒性又は免疫調節性の薬剤は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は例えば、プリン拮抗剤(例えば、アゾチオプリン又はマイコフェノレートモフェチル)、ジヒドロフォレート還元酵素阻害剤(例えば、メトトレキセート)、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット又はトリフルリジンであることができる。
【0191】
他の実施形態においては、細胞毒性又は免疫調節性の薬剤はタクロリムス、シクロスポリン又はラパマイシンである。別の実施形態においては、細胞毒性剤はアルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アルセニックトリオキシド、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ゴセレリン、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブメシレート、インターフェロンアルファ−2a、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、メクロレタミン又は窒素マスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトクスサレン、ミトマイシンC、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオネート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン又はゾレドロネートである。
【0192】
別の実施形態において、治療薬は抗体、例えばヒト化抗HER2モノクローナル抗体、RITUXAN(リツキシマブ:Genentech;キメラ抗CD20モノクローナル抗体);OVAREX(AltaRex Corporation,MA);PANOREX(Glaxo Wellcome,NC;マウスIgG2a抗体);セツキシマブエルビツクス(Imclone Systems Inc.,NY;抗−EGFRIgGキメラ抗体);ビタキシン(MedImmune,Inc.,MD;Campath I/H(Leukosite,MA;ヒト化IgG1抗体);Smart MI95(Protein Design Labs,Inc.,CA;ヒト化抗−CD33IgG抗体);リムフォシド(Immunomedics,Inc.,NJ;ヒト化抗−CD22IgG抗体);Smart ID10(Protein Design Labs,Inc.,CA;ヒト化抗−HLA−DR抗体);オンコリム(Techniclone,Inc.,CA;放射線標識マウス抗−HLA−Drl 0 抗体);アロムン(BioTransplant,CA;ヒト化抗−CD2 mAb);アバスチン(Genentech,Inc.,CA;抗−VEGFヒト化抗体);エプラツザマブ(Immunomedics,Inc.,NJ及びAmgen,CA;抗−CD22抗体);及びCEAcide(hmnunomedics,NJ;ヒト化抗−CEA抗体);又は抗CD40抗体(例えば米国特許6,838,261に開示されているもの)である。
【0193】
他の適当な抗体は、限定しないが、以下の抗原、即ち、CA125、CA15−3、CA19−9、L6、Lewis Y、Lewis X、アルファフェトプロテイン、CA 242、プラセンタルアルカリフォスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸フォスフェターゼ、表皮性成長因子、MAGE−1、MAGE−2、MAGE−3、MAGE−4、抗トランスフェリン受容体、p97、MUC1−KLH、CEA、gp100、MART1、前立腺特異的抗原、IL−2受容体、CD20、CD52、CD30、CD33、CD22、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン、CD38、CD40、ムチン、P21、MPG、及びノイオンコゲン生成物に対する抗体を包含する。
【0194】
一部の実施形態においては、治療剤は免疫調節性の薬剤である。免疫調節性の薬剤は例えばガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、REVLIMID(レナリドマイド)、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコエノレートモフェチル又はメトトレキセートであることができる。或いは免疫調節性の薬剤は例えば糖質コルチコイド(例えばコルチゾール又はアルドステロン)又は糖質コルチコイド類縁体(例えばプレドニソン又はデキサメタゾン)であることができる。
【0195】
一部の典型的な実施形態においては、免疫調節性の薬剤は抗炎症剤、例えばアリールカルボン酸誘導体、ピラゾール含有誘導体、オキシカム誘導体及びニコチン酸誘導体である。抗炎症剤のクラスは例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、5−リポキシゲナーゼ阻害剤及びロイコトリエン受容体拮抗剤を包含する。一部の実施形態において、免疫調節性の薬剤はサイトカイン、例えばG−CSF、GM−CSF又はIL−2である。
【0196】
適当なシクロオキシゲナーゼ阻害剤はメクロフェナミン酸、メフェナミン酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサール、フェンブフェン、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダック、タノキシカム、トルメチン及びアセチルサリチル酸を包含する。
【0197】
適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は、酸化還元系阻害剤(例えばカテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン、インダゾリノン、ナファザトロム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシアミン)及び非酸化還元系阻害剤(例えばヒドロキシチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピラン及びその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウエリック酸及びボスウエリック酸のアセチル化誘導体、及び、シクロアルキル基で置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸)及び酸化還元系阻害剤の前駆体を包含する。
【0198】
他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は抗酸化剤(例えばフェノール、プロピルガレート、フラボノイド及び/又はフラボノイドを含有する天然に存在する基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール、カルコンの誘導体、4,2’,4’−トリヒドロキシカルコン、オルト−アミノフェノール、N−ヒドロキシ尿素、ベンゾフラノール、エブセレン及び還元性セレノ酵素の活性を増大させる物質種)、鉄キレート化剤(例えばヒドロキサム酸及びその誘導体、N−ヒドロキシ尿素、2−ベンジル−1−ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノソールトロックスC,カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジレウトン、5−ヒドロキシアントラニル酸及び4−(オメガ−アリールアルキル)フェニルアルカン酸)、イミダゾール含有化合物(例えばケトコナゾール及びイトラコナゾール)、フェノチアジン及びベンゾピラン誘導体を包含する。
【0199】
更に他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤はエイコサノイド(例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸及びドコサキサエン酸およびそれらのエステル、PGE1(プロスタグランジンE1),PGA2(プロスタグランジンA2),ビプロストール、15−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、15−モノヒドロキシ−エイコサトリエン酸及び15−モノヒドロキシエイキサペンタセン酸、及びロイコトリエンB5、C5及びD5)、カルシウム流動を妨害する化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フォスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、カフェイン酸、5,8,11,14−エイコサテトラエン酸(ETYA),ヒドロキシフェニルレチンアミド、イオナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリールスルフィド及びジ(1−プロペニル)スルフィドを包含する。
【0200】
ロイコトリエン受容体拮抗剤はカルシトリオール、オンタゾラスト、Bayer Bay−x−1005、Ciba−Geigy CGS−25019C、ebselen、Leo Denmark ETH−615、Lilly LY−293111、Ono ONO−4057、Terumo TMK−688、Boehringer Ingleheim BI−RM−270、Lilly LY 213024、Lilly LY 264086、Lilly LY 292728、Ono ONO LB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF 10042、Rhone−Poulenc Rorer RP 66153、SmithKline Beecham SB−201146、SmithKline Beecham SB−201993、SmithKline Beecham SB−209247、Searle SC−53228、Sumitamo SM 15178、American Home Products WAY 121006、Bayer Bay−o−8276、Warner−Lambert CI−987、Warner−Lambert CI−987BPC−15LY 223982、Lilly LY 233569、Lilly LY−255283、MacroNex MNX−160、Merck and Co. MK−591、Merck and Co. MK−886、Ono ONO−LB−448、Purdue Frederick PF−5901、Rhone−Poulenc Rorer RG 14893、Rhone−Poulenc Rorer RP 66364、Rhone−Poulenc Rorer RP 69698、Shionoogi S−2474、Searle SC−41930、Searle SC−50505、Searle SC−51146、Searle SC−52798、SmithKline Beecham SK&F−104493、Leo Denmark SR− 2566、Tanabe T−757及びTeijin TEI−1338を包含する。
【0201】
本発明は更に以下の実施例において説明するが、これ等は本発明の範囲を制限する意図はない。以下の実施例に記載する細胞系統はAmerican Type Culture Collection(ATCC)又はDeutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany(DMSZ)により特定された、又は他の知られた条件に従った培養において維持した。細胞培養試薬はInvitrogen Corp.,Carlsbad,CAより入手した。
【実施例】
【0202】
(実施例1):ヒト化抗CD70抗体改変体の製造
抗CD70マウスモノクローナル抗体である1F6、及び、1F6のキメラ改変体c1F6の重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号1、2,21及び22に示す通りである。(2005年1月19日出願の米国特許出願60/645,355も参照)。1F6のヒト化の為にヒトアクセプター配列はヒト生殖細胞エキソンVH、JH、Vκ及びJκの配列から選択した。c1F6VHドメインのヒト化のためのアクセプター配列は生殖細胞系統のVHエキソンVH1−18(Matsuda et al.,1993,Nature Genetics 3:88−94)又はVH1−2(Shin et al.,1991,EMBO J.10:3641−3645)及びJH−6(Mattila et al.,1995,Eur,J.Immunol.25:2578−2582)から選択した。生殖細胞系統VκエキソンB3(Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827−836)及びJκエキソンJκ−1(Hieter et al.,1982,J.Biol.Chem.257:1516−1522)を1F6VLドメインヒト化のためのアクセプター配列として選択した。Kabatの定義に従って決定した1F6マウスCDRは、選択されたヒト生殖細胞系統鋳型にグラフとした。慨すれば、ヒト化VH又はVLドメインに渡る合成のオーバーラップオリゴヌクレオチドを形成し、そしてPCRオーバーラップ伸長を用いて各ドメインを組み立てた。PCR産物に組み込んだ制限部位を用いてVH又はVLドメインをそれぞれヒトIgG1定常ドメイン又はカッパ定常ドメインにインフレームとなるようにpCMV発現ベクター内に指向性にクローニングした。
【0203】
幾つかのフレームワーク位置をマウスドナー残基再導入の為に選択した。それらはKabatのナンバリング規則に従えばVHドメインのH46、H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82、H82A及びH91位であった。L25及びL33位におけるマウスCDR1残基をその位置のヒトアクセプター残基の導入のために選択したが、VLドメインのフレームワーク位置は改変されなかった。
【0204】
VHドメインにおけるマウスフレームワークドナー残基又はVLドメインにオ稀有rヒトCDR残基の異なる組合せを組み込むことによりヒト化1F6の幾つかの改変体を形成した。これ等の改変体を以下の表2及び3に総括する。
【0205】
【化66】
【0206】
【化67】
マウス及びヒトVH配列を有するヒト化改変体の数種の間の相違を図1及び2に示す。1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−2及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VH改変体hVHE及びhVHJのアライメントを図1に示す。1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−18及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VH化改変体hVHH及びhVHMのアライメントを図2に示す。1F6mVL及びヒト生殖細胞系VKエキソンB3及びJKエキソンJK−1を有するヒト化1F6VL改変体hVLAのアライメントを図3に示す。
【0207】
(実施例2)ヒト化1F6改変体の結合親和性
ヒト化1F6改変体HDLA(hVHD及びhVLA)、HHLA(hVHH及びhVLA)及びHJLA(hVHJ及びhVLA)を結合親和性分析の為に選択した。各ヒト化抗体及びc1F6の1mgを293細胞において一過性に発現させ、そしてEu−N1ヨードアセトアミドキレート(Perkin Elmer)を用いてユーロピウムで標識した。CD70陽性細胞系統のパネルへの飽和結合を各標識抗体につき試験した。選択した細胞系統は、定量的フローサイトメトリー(又は蛍光活性化細胞ソーティング、即ちFACS)で調べた場合の抗原コピー/細胞がそれぞれ30,000、99,000,235,000及び252,000のACHN、Caki−2、Caki−1及び786−Oとした。
【0208】
ユーロピウム標識抗体は96穴プレート中ある範囲の濃度に渡って4℃において1時間細胞と共にインキュベートした。インキュベーションの後、をEnhancement Buffer(Perkin Elmer)中に細胞を再懸濁することによりユーロピウムを放出させた。蛍光はFusionHTプレートリーダーにおいて、トップディテクターフォーマット及び335nm励起及び620nm放射を用いて読み取った。データはGraphPad Prism 4を用いて1結合部位双曲線にフィットさせた。結果を表4において以下に示す。
【0209】
【化68】
ヒト化改変体に関するKD値は試験した細胞系統の全てにおいてc1F6に極めて類似しており、ヒト化の過程が抗原結合活性を大きく低減しないことを裏付けていた。
【0210】
(実施例3)ヒト化1F6のADCC活性
ヒト化1F6抗体改変体がCD70+細胞系統WIL2−S、786−O及び769−Pに対してADCCを媒介する能力を標準的な51Cr放出試験を用いて測定した。ヒト化1F6のHHLA、HJLA及びHELA改変体は等しく、そして用量依存的な態様においてWIL−2S標的細胞を溶解した。これとは対照的に、CD70結合マウス1F6(m1F6)又は非結合対照ヒトIg(hIg)を投与した腫瘍細胞は殺傷されなかった(図4A)。同様にヒト化1F6はキメラ1F6に匹敵する態様において2種の腎細胞癌標的の溶解を媒介した(図4B)。
【0211】
(実施例4)ヒト化1F6のCDC活性
CDCを媒介するヒト化1F6の能力を多発性骨髄腫細胞系統(LP−1)及び2種のリンパ腫細胞系統(MHHPreB−1及びWIL2−S)を用いて調べた。標的細胞に段階的な用量のキメラ1F6、ヒト化1F6HJLA又は非結合ヒトIg対照を正常ヒト血清存在下に投与した。2時間37℃でインキュベートした後、溶解した細胞をヨウ化プロピジウム(5μg/mL)添加後にフローサイトメトリーにより識別した。ヨウ化プロピジウムで染色された細胞は、抗体媒介補体活性化及び膜攻撃複合体の形成の結果として、原形質膜の一体性を消失していると考えられる。この試験を用いた場合、キメラ1F6及びヒト化1F6は等しい態様において各標的の用量依存的溶解を媒介した(図5)。
【0212】
(実施例5)ヒト化1F6のADCP活性
貪食作用を媒介するヒト化1F6の能力を赤色蛍光膜染料で予備標識したCD70+腎細胞癌系統786−Oを用いて調べた。標的細胞に段階的な用量のキメラ1F6、ヒト化1F6HJLA又は非結合ヒトIg対照を投与し、次にGM−CSF中で培養した付着末梢血単球から形成したマクロファージと混合した。1時間37℃でインキュベートした後、マクロファージ細胞表面マーカーCD11bに対する緑色蛍光抗体でマクロファージを検出した。腫瘍細胞を貪食したマクロファージはフローサイトメトリーで検出した場合に二重赤色緑色蛍光により識別した。二重陽性集団におけるマクロファージ内の腫瘍細胞の存在は蛍光顕微鏡観察により確認した。図6に示す通り、キメラ及びヒト化1F6は抗体用量依存的態様において、そして等しい程度まで標的細胞の貪食を促進した。これとは対照的に、非結合対照抗体と共にインキュベートした標的細胞は最小限しかマクロファージにより取り込まれなかった。
【0213】
(実施例6)ヒト化1F6改変体薬剤コンジュゲートのインビトロ細胞毒性活性
ヒト化1F6改変体HELA(hVHE及びhVLA)、HHLA,HJLA及びHMLA(hVHM及びhVLA)及びc1F6を293細胞において一過性に発現させ、抗体当たり平均8薬剤単位のローディング水準においてvcMMAF(2005年10月27日に米国特許公開2005−0238649として公開された米国特許出願10/983,340に記載)にコンジュゲートした。得られたコンジュゲート、h1F6HELA−F8、h1F6HHLA−F8、h1F6HJLA−F8、h1F6HMLA−F8およびc1F6−F8を2種のCD70発現細胞系統786−O及びCaki−1に対する細胞毒性について試験した。コンジュゲートは92時間細胞と共にインキュベートし、その後、50μMレサズリンを添加した。4時間のインキュベート時間の後、染料の還元をFusionHT蛍光プレートリーダー(Packard Instrument,Meriden,CT)を用いて測定した。3連のサンプリングの結果を表5において以下に示す。4種全てのヒト化改変体のIC50値は試験した両方の細胞系統においてc1F6の2倍内の活性を有し、力価の順位はc1F6−F8>h1F6HHLA−F8>h1F6HMLA−F8>h1F6HJLA−F8>h1F6HELA−F8であった。
【0214】
【化69】
【0215】
【化70】
(実施例7)ヒト化1F6薬剤コンジュゲートのインビボスクリーニング
ヒト化1F6改変体HDLA、HHLA,HJLA及びHELAを293細胞において一過性に発現させ、抗体当たり8薬剤単位のローディング水準においてvcMMAF(2005年10月27日に米国特許公開2005−0238649として公開された米国特許出願10/983,340に記載)にコンジュゲートした。3mg/kg又は10mg/kgの単回用量の薬効試験をヌードマウスにおいて786−O腎細胞癌固形腫瘍モデルにおいて実施した。腫瘍体積は腫瘍移植後80日間定期的に測定した。結果によれば、腫瘍の体積は未投与マウスと比較して全投与マウスにおいて大きく低減し、そしてmcMMAFにコンジュゲートした全てのヒト化1F6改変体はc1FmcMMAFに薬効において匹敵していた。
【0216】
(実施例8)播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫のSCIDマウス異種移植片モデルにおけるヒト化1F6のインビボの活性
ヒト化1F6(HJLA)のインビボの抗腫瘍活性を播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫の異種移植片マウスモデルにおいて調べた。播種性疾患を樹立するために1x105Raji又は1x107MM1.S又はL363細胞をC.B.−17SCIDマウスの外側尾静脈中に注射した。マウスにヒト化1F6(HJLA)又は対照非結合抗体を腹腔内(ip)注射により4日毎に合計6回(Raji)又は外側尾静脈への静脈内注射により週一回合計4週間(MM.1S及びL363)、細胞移植後1日目から投与した。安楽死を要する疾患は屈曲姿勢及びグルーミングの消失、体重減少、頭部浮腫及び後肢の麻痺により、そしてL363担持マウスにおいては、触診可能なリンパ様組織関連の腫瘍の形成により顕在化した。
【0217】
結果によれば、各腫瘍モデルにおいて(図7A、7B及び7C)、ヒト化1F6を投与したマウスの生存は未投与マウス又は非結合対照抗体投与マウスのものと比較して顕著に延長された。ヒト化1F6投与の作用は個々のマウスの血清中の腫瘍誘導モノクローナル蛋白(λ軽鎖)の濃度を測定することにより多発性骨髄腫異種移植片(L363及びMM.1S細胞)において更に評価した。図7B及び7C(右パネル)に示す通り、循環系中のλ軽鎖の濃度は未投与マウスと比較してヒト化1F6投与マウスにおいて顕著に低下していた。ヒト化1F6を投与されたL363担持マウスのλ軽鎖の平均血清中濃度は0.006μg/mLであったのに対し、未投与マウスの血清では0.10μg/mLであった。同様に、ヒト化1F6投与MM.1S担持マウスにおけるλ軽鎖濃度は0.03μg/mLであったのに対し、未投与マウスでは1.25μg/mLであった。これ等の結果はマウスにおける上昇した生存率と合致していた(図7B及び7C、右パネル)。
【0218】
(実施例9)ヒト化1F6抗体によるCD70+抗原特異的T細胞のインビトロの枯渇
抗原特異的活性化T細胞を枯渇させるヒト化1F6抗体の能力を試験するために、HLA−A0201を発現する正常ドナー由来のPBMCを種々の濃度のヒト化抗CD70抗体の存在下又は非存在下にM1ペプチドで刺激した。ヒト化1F6抗体(HJLA)は上記の通り製造した。PMBCはIL−2及びIL−5を添加した培地2mL中5μg/mLのM1ペプチドと共に、5x106個/mLの細胞密度で24穴プレート中に播種した。第5日において、培養上澄み半分を新しいサイトカイン含有培地と交換した。第9日に、抗原反応性細胞(CD8+/Vβ17+集団)のパーセントをFITCコンジュゲート抗Vβ17及びPE−Cy5コンジュゲート抗CD8抗体で染色した細胞のフローサイトメトリー分析により測定した。
【0219】
図8Aは抗原特異的CD8+/Vβ17+細胞が抗体非存在下培養物中全生細胞の33%となるまで増殖したことを示す。これとは対照的に、第0日に培地にヒト化1F6を添加した場合、抗体用量依存性態様において抗原反応性集団の増殖は顕著に制限された。これ等の結果はヒト化1F6が抗原活性化T細胞を選択的にターゲティングし、その増殖を防止することを示している。
【0220】
第2の試験(図8B)においては、M1ペプチド刺激培養物を未投与とするか、又は、ヒト化1F6の投与をFcγRIII(CD16)を特異的にブロックする抗体の非存在下又は存在下に行った。未投与の培養物においては、抗原特異的CD8+Vβ17+集団は培養物中の全生細胞の39%となるまで増殖した。ヒト化1F6の天下により反応性集団の増殖は顕著に減衰した。この活性はFcγRIII受容体が抗CD16特異的抗体によりブロックされた場合に大部分が温存され、ペプチド反応性細胞の欠失はFcgRIII担持エフェクター細胞とのヒト化1F6の相互作用を介して媒介されたことを示していた。
【0221】
(実施例10)抗CD70抗体は抗原陰性バイスタンダー細胞に影響しない。
【0222】
抗原陰性バイスタンダーT細胞に対する1F6媒介枯渇の作用を測定するために、CD4及びCD8リンパ球のTCRVβファミリー提示を、未投与又は1F6のキメラ改変体(c1F6)(ヒトIgG1アイソタイプ)投与のM1活性化培養物中において調べ、休止期の非抗原刺激PBMCと比較した。キメラ及びヒト化1F6改変体は結合親和性、エフェクター機能媒介能力及び活性化CD8+T細胞サブセットを枯渇させる能力において同等である。
【0223】
図9に示す通り、HLA−A0201+PBMCのM1ペプチドによる刺激はVβ17TCR担持CD8+細胞の増殖を約30倍としたのに対し、CD8+細胞において試験した全ての他のVβTCRファミリー及びCD4細胞集団において試験した全ファミリーは最小限の変化を示すのみであった。対照集団においては、細胞の増殖はVβ17+CD8+T細胞サブセットのみに限定され、これ等は<1%CD8+細胞〜27%に増大し;この観察結果はM1ペプチドの免疫応答の特異性を確認するものであった。CD70特異的抗体の非存在に刺激したT細胞とは異なり、M1ペプチド特異的CD8+細胞の増殖は培地へのc1F6抗体の添加により防止された。c1F6抗体の存在下において、パーセントVβ17+CD8+細胞は休止期の非ペプチド刺激細胞のものと同等であった。c1F6抗体投与は他のCD8+又はCD4+VβTCRファミリーの相対的提示を大きく変化させず;何れの群の排除も観察されなかった。これ等のデータはc1F6抗体への曝露は、バイスタンダーT細胞集団に検出可能な同時発生的損傷を生じさせること無く、CD70+活性化T細胞を選択的に枯渇させることを示している。
【0224】
(実施例11)腎細胞癌のマウス異種移植片モデル
786−O皮下異種移植片モデルを用いて種々の用量と日程により投与した抗CD70ADCの抗腫瘍活性を評価した。皮下786−O腫瘍は約30mm3の腫瘍フラグメント(群当たりN=5又は6)を移植することによりヌードマウス中に発癌開始させた。腫瘍を生育させ、平均腫瘍サイズが約100mm3となった時点で投与を開始した。腫瘍の寸法はカリパス計測により測定し、生育をモニタリングした。腫瘍サイズは(長さx幅2)/2の式を用いて計算した。何れの投与も行わない場合、平均腫瘍体積は腫瘍移植後40〜50日以内に約60mm3にまで増大する(図10参照)。腫瘍生育抑制における用量依存的作用はヒト化1F6−mcMMAF4(抗体当たり4薬剤単位の平均のローディング水準のHJLA)又はヒト化1F6−vcMMAF4(抗体当たり4薬剤単位の平均のローディング水準のHJLA)を投与されたマウスにおいて観察された。腫瘍生育の検出可能な遅延はそれぞれ0.5及び0.17mg/kgのh1F6−mcMMAF4及びh1F6−vcMMAF4においても観察された。
【0225】
腫瘍生育は又、腫瘍のサイズが4倍になるために必要な時間によっても評価した(図10B参照)。h1F6−mcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4のいずれかを0.17mg/kgで投与することにより腫瘍生育は顕著に遅延した。この遅延はADCをq4dx4又はq4dx10の日程で投与した場合に観察された。しかしながら、q4dx10の日程により例示される通り追加的投与はq4dx4日程と比較してより強力な生育抑制活性を有すると観察された。
【0226】
(実施例12)多発性骨髄腫細胞系統上のCD70の発現
細胞表面CD70発現を多発性骨髄腫細胞系統のパネルにおいて評価した(表6)。QIFIKit(登録商標)(Dako,Carpinteria,CA)を用いた定量的フローサイトメトリーにより各細胞系統により発現されたCD70分子のコピー数を測定した。これ等の細胞の抗CD70ADC媒介細胞毒性に対する応答を測定した。本モデルにおいては、キメラ抗CD70ADCの活性はヒト抗CD70ADCの活性に近似している。両方のキメラ1F6(c1F6)−vcMMAF4及びc1F6−mcMMAF4はCD70発現多発性骨髄腫細胞に対して細胞毒性であった。c1F6−vcMMAF4で得られたIC50値は1.2〜160ng/mLの範囲であり、c1F6−mcMMAF4で得られた値は1.7〜500ng/mLの範囲であった。
【0227】
(表6)
(多発性骨髄腫細胞系統に対するキメラ抗CD70ADCの細胞毒性活性)
【0228】
【化73】
【0229】
【化74】
(実施例13)多発性骨髄腫のマウス異種移植片モデル
多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおける抗CD70ADCのインビボ活性を更に調べた。ヒト多発性骨髄腫細胞系統MM−1S(図11A&11B)又はL363(図12A&12B)を10x106個/300μLの細胞濃度でRPMI−1640培地中に再懸濁した。腫瘍を樹立するために、細胞懸濁液300μLをSCIDマウスの尾部静脈から静脈内注射した。MM−1Sモデルにおいては、未投与のマウスは注射された腫瘍が蔓延し、腫瘍移植後約40日で後肢麻痺、屈曲姿勢、頭部浮腫及び/又は不良な表皮状態を包含する症状が顕在化した。これ等の症状の1つ以上を示したマウスは安楽死させた。h1F6(HJLA)−vcMMAF4及びh1F6(HJLA)−mcMMAF4の両方とも対照の非結合IgG−vcMMAF4及びIgG−mcMMAF4と比較して腫瘍担持マウスに顕著な生存の利益をもたらした(図11A参照)。MM−1Sモデルにおける腫瘍負荷はまたMM−1S細胞により発現される血漿細胞マーカーであるヒトCD138を発現している骨髄細胞の数を計数することによっても評価した。骨髄細胞は症状顕在化のため、又は、第122日の実験終了時に安楽死させたマウスから回収し、CD138発現MM−1S細胞の数をフローサイトメトリーにより測定した。未投与マウスと比較して、両方の対照IgG−vcMMAF4及びIgG−mcMMAF4は骨髄中のCD138発現細胞の数を顕著に低減しなかった。一方、h1F6−vcMMAF4及びh1F6−mcMMAF4は対照ADCと比較して、骨髄CD138発現細胞の遥かに低値の数により明らかにされる通り、腫瘍負荷を顕著に低減している(図11B参照)。
【0230】
L363モデルにおいては、播種性腫瘍塊は投与を受けないマウスでは複数個所に発生し、そして腫瘍塊は腫瘍注射後約40日には触診可能となり、その時点で腫瘍担持マウスを安楽死させる。MM−1Sモデルと同様、対照のIgG−vcMMAF4は生存利点を全くもたらさなかったのに対し、h1F6−vcMMAF4は生存を顕著に延長した(図12A参照)。L363細胞は免疫グロブリンラムダ軽鎖(λLC)を分泌するため、腫瘍負荷は腫瘍担持マウスの血漿中のヒトλLCの濃度をモニタリングすることにより測定できる。分泌されたλLCを検出するためにELISAを使用した。96穴平底イムノプレート(Nunc Maxisorp,#442404,Nalge Nunc International,Rochester,NY)を4℃で一夜0.1M炭酸/重炭酸ナトリウム中2μg/mLのヤギ抗ヒトIg(Southern Biotech#2010−01,Birmingham,AL)100μL/ウェルでコーティングした。ウェルを1xPBST(PBS、0.05%Tween−20)で5回洗浄し、そして室温で1時間1%BSA/PBST(0.05%Tween−20)200μL/ウェルでブロックした。1xPBSTで5回洗浄した後、連続希釈したヒトλLC含有マウス血清試料を添加した。精製したヒトλLC(Bethyl labs,#P80−127,Montgomery,TX)を標準物質として使用した。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを1xPBSTで5回洗浄した。1%BSA/PBST中1:4000希釈したHRP−ヤギ抗ヒトラムダ鎖特異的F(ab’)2(Southern Biotech,#2072−05)を添加した。室温で更に1時間インキュベートした後、ウェルを1xPBSTで5回洗浄した。TMB基質100μL/ウェル(Sigma,#T8665,St.Louis,MO)を用いて捕獲されたλLCを検出した。図12BはL363細胞移植後40日の血漿の結果を示す。λLC濃度は未投与マウスとIgG−vcMMAF4投与マウスの間で同等であった。一方、h1F6−vcMMAF4投与マウスの血清中λLC濃度は顕著に低値であり、多発性骨髄腫異種移植片担持マウスにおける腫瘍負荷を低減する抗CD70ADCの能力を裏付けていた。
【0231】
(実施例14)ホジキン及び神経膠芽腫細胞系統上のCD70の発現
細胞表面CD70発現はまたホジキン病(表7)及び神経膠芽腫細胞系統(表8)のパネルにおいても評価した。QIFIKit(登録商標)(Dako,Carpinteria,CA)を用いた定量的フローサイトメトリーにより各細胞系統により発現されたCD70分子のコピー数を測定した。これ等の細胞のキメラ抗CD70ADC媒介細胞毒性に対する応答を測定した。本モデルにおいては、キメラ抗CD70ADCの活性はヒト抗CD70ADCの活性に近似している。両方のキメラ1F6(c1F6)−vcMMAF4及びc1F6−mcMMAF4はCD70発現多発性骨髄腫細胞に対して細胞毒性であった。ホジキン病パネルにおいては、c1F6−vcMMAF4で得られたIC50値は0.41〜42ng/mLの範囲であり、c1F6−mcMMAF4で得られた値は5.2〜310ng/mLの範囲であった(表7)。神経膠芽腫パネルにおいては、h1F6−vcMMAF4で得られたIC50値は2.3〜27ng/mLの範囲であり、h1F6−mcMMAF4で得られた値は15〜110ng/mLの範囲であった(表8)。
【0232】
【化76】
本発明は本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されない。実際、本明細書に記載したものの他に本発明の種々の変更例が上記説明及び添付図面より当業者には明らかになる。このような変更例は添付請求項の範囲内に含まれることを意図している。
【0233】
特許出願、特許及び特定の出版物を包含する種々の参考文献が本明細書において引用されており、その各々の開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0234】
【図1】図1は1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−2及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VHヒト化改変体hVHE及びhVHJのアライメントである。アライメントにおいて、<・>はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。hVHjのH46におけるハイライトのリジン残基(K)はマウス残基への復帰突然変異を示す。下線を付されたアミノ酸残基はKabatの定義に従ったCDR1及びCDR2における位置を示し、一方、箱内の残基はChothiaの定義により識別される相当するCDRにおける位置を示す。37、39、45、47、95及び97位にあるような<^>はVH/VLインターフェイスに関与する残基を示す。
【図2】図2は1F6mVH及びヒト生殖細胞系VHエキソンVH1−18及びJHエキソンJH6を有するヒト化1F6VHヒト化改変体hVHH及びhVHMのアライメントである。アライメントにおいて、<・>はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。hVHMのH46、H67、H68、H69、H70及びH71におけるハイライトの残基はマウス残基への復帰突然変異を示す。同様にhVHHのH67、H68、H69、H70、H71、H80、H82及びH82Aにおけるハイライトの残基はマウス残基への復帰突然変異を示す。下線を付されたアミノ酸残基はKabatの定義に従ったCDR1、CDR2及びCDR3における位置を示し、一方、箱内の残基はChothiaの定義により識別される相当するCDRにおける位置を示す。37、39、45、47、98及び100位にあるような<^>はVH/VLインターフェイスに関与する残基を示す。
【図3】図3は1F6mVL及びヒト生殖細胞系VKエキソンB3及びJKエキソンJK−1を有するヒト化1F6VL改変体hVLAのアライメントである。アライメントにおいて、<・>はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。下線を付されたアミノ酸残基はKabatの定義に従ったCDR1、CDR2及びCDR3における位置を示し、一方、箱内の残基はChothiaの定義により識別される相当するCDRにおける位置を示す。42、44、50、52及び93位にあるような<^>はVH/VLインターフェイスに関与する残基を示す。
【図4A】図4Aはヒト化1F6抗CD70抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を媒介することを示す。Na251CrO4標識標的細胞(WIL2−SBリンパ芽様細胞、786−O腎癌細胞及び769−P腎細胞癌細胞)を抗体でコーティングし、末梢血単核細胞(PBMC)と共に、10CD16+(FcγIII受容体)細胞vs1標的細胞のエフェクターvs標的比においてインキュベートした。4時間後、溶解した細胞の上澄みをシンチレーションカウンター上で測定した。パーセント特異的溶解は{(被験試料cpm−自発的cpm)÷(総cpm−自発的cpm)}x100として計算した。点は3連の試料の平均±標準偏差を示す。図4Aは非結合抗体対照hIgG1及びマウス1F6抗体と比較した場合のヒト化1F6改変体HHLA、HJLA及びHELAにより媒介されるADCC活性を示す。
【図4B】図4Bはヒト化1F6抗CD70抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を媒介することを示す。Na251CrO4標識標的細胞(WIL2−SBリンパ芽様細胞、786−O腎癌細胞及び769−P腎細胞癌細胞)を抗体でコーティングし、末梢血単核細胞(PBMC)と共に、10CD16+(FcγIII受容体)細胞vs1標的細胞のエフェクターvs標的比においてインキュベートした。4時間後、溶解した細胞の上澄みをシンチレーションカウンター上で測定した。パーセント特異的溶解は{(被験試料cpm−自発的cpm)÷(総cpm−自発的cpm)}x100として計算した。点は3連の試料の平均±標準偏差を示す。図4Bはキメラ1F6及びヒト化1F6改変体HJLA及びhIgG1により媒介された腎細胞癌細胞系統の抗体指向性溶解を示す。
【図5】図5はヒト化1F6抗CD70改変体HJLAが補体依存性細胞性細胞毒性(CDC)を媒介することを示している。LP−1、MHHPreB−1及びWIL−S標的細胞を補体原料としてのヒト血清の存在下にキメラ1F6、ヒト化1F6(HJLA)又は非結合ヒトIgと混合した。37℃2時間の後、ヨウ化プロピジウムを添加し、フローサイトメトリーにより測定されるものとして細胞の生存性を調べ、そして溶解活性の量を計算した。バーは3連の試料の平均±標準偏差を示す。
【図6】図6はヒト化1F6抗CD70抗体が抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)を媒介することを示す。786−OCD70+腎細胞癌標的細胞を赤色蛍光細胞膜染料(PKH26、Sigma−Aldrich,Inc.,St.Louis,MO)で標識し、次に氷上30分間、キメラ1F6、ヒト化1F6(HJLA)又は非結合ヒトIgでコーティングした。標識された抗体投与標的細胞を37℃において、1マクロファージvs4標的細胞の比で単球誘導マクロファージと混合した。マクロファージはAlexaFluor(登録商標)488(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)抗CD11b抗体で染色し、そしてパーセント貪食活性はフローサイトメトリーで分析した場合に二重蛍光を示すマクロファージのパーセントにより求めた。
【図7】図7は播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおけるマウスの生存をヒト化1F6抗CD70抗体が延長することを示している。(A)Raji細胞を注射し、そしてヒト化1F6抗体又は対照非結合抗体を投与したマウスの生存性。投与は腫瘍細胞注射後1日に開始し、そして合計6投薬につき4日毎に腹腔内注射により投与した(群当たりn=10)。(B、C、左パネル)L363−又はMM.1S−細胞を注射し、そして細胞移植後1日からヒト化1F6投与を開始したマウスの生存性を示す。抗体は合計5投薬につき週一回の静脈内注射により投与した。マウスは週2回モニタリングし、疾患の顕在化の時点で安楽死させた(群当たりn=7)。(B、C、右パネル)L363−又はMM.1S−細胞を注射したマウスから採取した血清中のλ軽鎖濃度の分析。試料はそれぞれ腫瘍注射後35及び42日に採取した。全試験において、記載したp値はヒト化1F6投与群と未投与群の間のものである。
【図8】図8は抗原特異的CD8+/Vβ17+細胞の枯渇をヒト化1F6が媒介することを示している。正常HLA−A0201ドナー由来のPBMCをM1ペプチドで刺激した。(A)ペプチド刺激培養物は記載する通り、未投与とするか、又は、漸増用量のヒト化1F6抗体の同時添加により投与した。9日後のパーセントCD8+/Vβ17+細胞をフローサイトメトリーにより測定した。(B)ペプチド刺激培養物は、未投与、又は第0日において1μg/mLヒト化1F6投与を、FcγRIII(CD16)に対して特異的な10μg/mL抗体の非存在下(黒色バー)又は存在下(斜線バー)において行った。9日後のパーセントCD8+/Vβ17+細胞をフローサイトメトリーにより測定した。
【図9】図9はバイスタンダー休止期T細胞上の抗CD701F6抗体の最小限の影響を示す。正常HLA−A0201ドナー由来のPBMCを未投与、又はM1ペプチド刺激(ペプチドstim)を1μg/mLのclF6の存在下又は非存在下に行った。培養9日後、各群由来のCD4及びCD8の間のVβTCR提示をIOTest(登録商標)Beta Mark TCRVβレパートリーキットを用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【図10A】図10は腎細胞癌のマウス異種移植片モデルを示す。(A)皮下786−O腫瘍は約30mm3の腫瘍フラグメント(群当たりN=5又は6)を移植することによりヌードマウス中に発癌開始させた。腫瘍を生育させ各群における平均腫瘍サイズが約100mm3となった時点で投与を開始した。記載した用量のh1F6−mcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4は、矢印で示す通り、腫瘍移植後17日から開始してq4dx4の日程で投与した。1000mm3を超える腫瘍を有する動物を安楽死させた時点は交線で記載した。
【図10B】図10は腎細胞癌のマウス異種移植片モデルを示す。(B)786−O腫瘍移植及び投与開始は(A)の場合と同様とする。マウスの群(N=5〜7)に腫瘍移植後13日から開始してq4dx4又はq4dx10の日程でh1F6−mcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4を投与した。腫瘍の生育はKaplan−Meierプロットにより示した。腫瘍を有するマウスが投与開始の第13日と比較して4倍サイズとなった場合に事象を登録した。第43日の実験終了時にサイズが4倍とならなかった腫瘍を有するマウスは削除した。対数順位検定を用いて投与群及び未投与群の間のp値を求めた。
【図11A】図11は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(A)10百万個のMM−1S細胞を各SCIDマウスに静脈内注射した。マウスの群(N=8〜10)は未投与とするか、IgG−vcMMAF4、IgG−mcMMAF4、h1F6−vcMMAF4又はh1F6−mcMMAF4を所定の用量において、q7dx5の日程で矢印に示す通り投与した。後肢麻痺の症状、屈曲姿勢、頭部浮腫及び/又は不良な表皮状態を示したマウスは安楽死させ、各群のパーセント生存をプロットした。対数順位検定を用いて投与群及び対照群の間のp値を求めた。
【図11B】図11は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(B)骨髄細胞を上記疾患状態の為に、又は、実験終了時の腫瘍細胞移植後122日に、安楽死させたマウスの大腿から回収した。各マウスの大腿中のCD138発現MM−1S細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより測定した。Mann−Whitney検定を用いて所定群間のp値を求めた。
【図12A】図12は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(A)10百万個のL363細胞を各SCIDマウスに静脈内注射した。マウスの群(N=7)は未投与とするか、IgG−vcMMAF4又はh1F6−vcMMAF4を所定の用量において、q7dx5の日程で矢印に示す通り投与した。触診可能な腫瘍の塊を示したマウスは安楽死させ、各群のパーセント生存をプロットした。対数順位検定を用いて投与群及び未投与群の間のp値を求めた。
【図12B】図12は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。(B)血清試料は腫瘍移植後40日にマウスから採取した。各マウスの血清中のヒトλ軽鎖の濃度をELISAにより測定した。Mann−Whitney検定を用いて所定群間のp値を求めた。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト生殖細胞VH1−2又はVH1−18のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域を含むヒトCD70に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18に示すアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24を含む軽鎖可変領域を含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域を含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16又は配列番号20のアミノ酸配列を含む請求項5記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
配列番号26のアミノ酸配列を含む請求項7記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合フラグメントである請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項9記載の抗原結合フラグメント。
【請求項11】
配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16又は配列番号20のアミノ酸配列を含む請求項9又は10記載の抗原結合フラグメント。
【請求項12】
配列番号26のアミノ酸配列を含む請求項9又は10記載の抗原結合フラグメント。
【請求項13】
scFv、ダイアボディ、Fab、ミニボディ又はscFv−Fcである請求項9又は10記載の抗原結合フラグメント。
【請求項14】
抗体エフェクタードメインを含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項15】
ADCC、ADCP又はCDCを媒介する抗体エフェクタードメインを含む請求項14記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項16】
ADCPを媒介する抗体エフェクタードメインを含む請求項14記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項17】
抗体エフェクタードメインがヒト抗体エフェクタードメインである請求項14記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項18】
抗体又はその抗原結合フラグメントが治療薬にコンジュゲートされている請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項19】
前記治療薬が化学療法剤又は免疫調節剤である請求項18記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項20】
前記治療薬が化学療法剤である請求項19記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項21】
前記化学療法剤がMMAE又はMMAFである請求項20記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項22】
前記治療薬が免疫調節剤である請求項19記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項23】
CD−70発現癌又は免疫学的障害の治療のための医薬組成物であって、該組成物が請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体及び薬学的に適合性のある成分少なくとも1つを含む組成物。
【請求項24】
請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項25】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号23又は配列番号25の配列を含む請求項24記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該配列が抗体の重鎖又は軽鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項26】
前記ポリヌクレオチドが抗体重鎖又はそのフラグメントをコードし、そのポリヌクレオチドが配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号15又は配列番号19の配列を含む、請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項27】
前記ポリヌクレオチドが抗体軽鎖又はそのフラグメントをコードし、そのポリヌクレオチドが配列番号25の配列を含む、請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項28】
前記ポリヌクレオチドが配列番号3及び配列番号25;配列番号7及び配列番号25;配列番号11及び配列番号25;配列番号15及び配列番号25;又は配列番号19及び配列番号25の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項29】
ポリヌクレオチドが配列番号5、配列番号9、配列番号13;又は配列番号17の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項30】
前記ポリヌクレオチドが配列番号23の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項31】
前記ポリヌクレオチドが配列番号5及び配列番号23;配列番号9及び配列番号23;配列番号13及び配列番号23;又は配列番号17及び配列番号23の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項32】
ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインをコードする配列を更に含む請求項24記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項33】
請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント及び生物学的試料中のCD70蛋白を検出するために該抗体又はその抗原結合フラグメントを使用するための説明書を含むキット。
【請求項34】
CD70抗原を発現する細胞の成育を抑制するために請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの一定量を該細胞に投与することを含む、該細胞の成育を抑制するための方法。
【請求項35】
請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量をCD70抗原発現癌を有する対象に投与することを含む、ヒト対象における癌を治療するための方法。
【請求項36】
対象に治療薬を投与することを更に含む請求項35記載の方法。
【請求項37】
請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗CD70抗体又はその抗原結合フラグメントを末梢B細胞に投与することを含む、該細胞の枯渇を誘導するための方法。
【請求項38】
対象に治療薬を投与することを更に含む請求項37記載の方法。
【請求項1】
ヒト生殖細胞VH1−2又はVH1−18のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域を含むヒトCD70に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18に示すアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24を含む軽鎖可変領域を含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域を含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16又は配列番号20のアミノ酸配列を含む請求項5記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
配列番号26のアミノ酸配列を含む請求項7記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合フラグメントである請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸20〜137を含む重鎖可変領域、又は、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項9記載の抗原結合フラグメント。
【請求項11】
配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16又は配列番号20のアミノ酸配列を含む請求項9又は10記載の抗原結合フラグメント。
【請求項12】
配列番号26のアミノ酸配列を含む請求項9又は10記載の抗原結合フラグメント。
【請求項13】
scFv、ダイアボディ、Fab、ミニボディ又はscFv−Fcである請求項9又は10記載の抗原結合フラグメント。
【請求項14】
抗体エフェクタードメインを含む請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項15】
ADCC、ADCP又はCDCを媒介する抗体エフェクタードメインを含む請求項14記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項16】
ADCPを媒介する抗体エフェクタードメインを含む請求項14記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項17】
抗体エフェクタードメインがヒト抗体エフェクタードメインである請求項14記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項18】
抗体又はその抗原結合フラグメントが治療薬にコンジュゲートされている請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項19】
前記治療薬が化学療法剤又は免疫調節剤である請求項18記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項20】
前記治療薬が化学療法剤である請求項19記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項21】
前記化学療法剤がMMAE又はMMAFである請求項20記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項22】
前記治療薬が免疫調節剤である請求項19記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項23】
CD−70発現癌又は免疫学的障害の治療のための医薬組成物であって、該組成物が請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体及び薬学的に適合性のある成分少なくとも1つを含む組成物。
【請求項24】
請求項2記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項25】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号23又は配列番号25の配列を含む請求項24記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該配列が抗体の重鎖又は軽鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項26】
前記ポリヌクレオチドが抗体重鎖又はそのフラグメントをコードし、そのポリヌクレオチドが配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号15又は配列番号19の配列を含む、請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項27】
前記ポリヌクレオチドが抗体軽鎖又はそのフラグメントをコードし、そのポリヌクレオチドが配列番号25の配列を含む、請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項28】
前記ポリヌクレオチドが配列番号3及び配列番号25;配列番号7及び配列番号25;配列番号11及び配列番号25;配列番号15及び配列番号25;又は配列番号19及び配列番号25の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項29】
ポリヌクレオチドが配列番号5、配列番号9、配列番号13;又は配列番号17の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項30】
前記ポリヌクレオチドが配列番号23の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項31】
前記ポリヌクレオチドが配列番号5及び配列番号23;配列番号9及び配列番号23;配列番号13及び配列番号23;又は配列番号17及び配列番号23の配列を含む請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項32】
ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインをコードする配列を更に含む請求項24記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項33】
請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント及び生物学的試料中のCD70蛋白を検出するために該抗体又はその抗原結合フラグメントを使用するための説明書を含むキット。
【請求項34】
CD70抗原を発現する細胞の成育を抑制するために請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの一定量を該細胞に投与することを含む、該細胞の成育を抑制するための方法。
【請求項35】
請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量をCD70抗原発現癌を有する対象に投与することを含む、ヒト対象における癌を治療するための方法。
【請求項36】
対象に治療薬を投与することを更に含む請求項35記載の方法。
【請求項37】
請求項1〜10及び14〜22の何れか1項に記載の抗CD70抗体又はその抗原結合フラグメントを末梢B細胞に投与することを含む、該細胞の枯渇を誘導するための方法。
【請求項38】
対象に治療薬を投与することを更に含む請求項37記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【公表番号】特表2008−538292(P2008−538292A)
【公表日】平成20年10月23日(2008.10.23)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−507926(P2008−507926)
【出願日】平成18年4月19日(2006.4.19)
【国際出願番号】PCT/US2006/015145
【国際公開番号】WO2006/113909
【国際公開日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【出願人】(505314468)シアトル ジェネティックス, インコーポレイテッド (19)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成20年10月23日(2008.10.23)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年4月19日(2006.4.19)
【国際出願番号】PCT/US2006/015145
【国際公開番号】WO2006/113909
【国際公開日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【出願人】(505314468)シアトル ジェネティックス, インコーポレイテッド (19)
【Fターム(参考)】
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