ヒト成長ホルモンの結晶およびその調製方法
【課題】安定かつ長期に作用するｈＧＨが得られるヒト成長ホルモンの結晶を提供すること。
【解決手段】本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の安定な長期放出結晶およびこのような結晶を含む組成物または処方物に関する。本発明は、さらに、これらの結晶および組成物の生成方法を提供する。本発明は、さらに、これらの結晶および組成物または処方物を使用したヒト成長ホルモン欠損症に関連するかヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する個体の治療方法を提供する。ヒト成長ホルモンもしくはヒト成長ホルモン誘導体の結晶または結晶を含む組成物あるいは処方物は、いくつかの利点（１週間に１回の投与能力、即時使用できる結晶懸濁形態、安全性、有効性、純度、安定性、再懸濁可能性、および短時間でのシリンジ利用可能性が含まれる）を有する。
【解決手段】本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の安定な長期放出結晶およびこのような結晶を含む組成物または処方物に関する。本発明は、さらに、これらの結晶および組成物の生成方法を提供する。本発明は、さらに、これらの結晶および組成物または処方物を使用したヒト成長ホルモン欠損症に関連するかヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する個体の治療方法を提供する。ヒト成長ホルモンもしくはヒト成長ホルモン誘導体の結晶または結晶を含む組成物あるいは処方物は、いくつかの利点（１週間に１回の投与能力、即時使用できる結晶懸濁形態、安全性、有効性、純度、安定性、再懸濁可能性、および短時間でのシリンジ利用可能性が含まれる）を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶およびこれを含む組成物または処方物に関する。さらに、本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶の生成方法を提供する。本発明の結晶は、特に、ヒト成長ホルモン欠損症に関連するか、またはヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する哺乳動物の治療方法で有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ソマトトロピンすなわち、成長ホルモン（「ＧＨ」））は、内分泌系の主な腺（腺下垂体）によって脳内で合成および分泌される刺激ホルモンクラスを含む哺乳動物タンパク質である。腺下垂体によるＧＨおよび他の刺激ホルモンの分泌により、体内の他の内分泌腺および組織中の細胞の活動が制御される。詳細には、ＧＨは、下垂体前葉の成長ホルモン産生細胞によって分泌され、ＩＧＦ−１（細胞分裂を調節するタンパク質）を合成および分泌するように肝臓および他の組織を刺激するように機能し、代謝過程を制御し、遊離状態で存在するか、ＩＧＦＢＰ−１〜６と呼ばれる６つの他のタンパク質のうちの１つと結合する。それ自体の分泌過程は、ソマトリベリン（ＧＨ放出を促進する）およびソマトスタチン（ＧＨ放出を阻害する）の相反する作用によって調整される。
【０００３】
ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）は、細胞および器官の成長の制御および種々の加齢段階での生理学的機能において重要なホルモンとして作用するので、特に興味深い。例えば、ｈＧＨの過剰産生により、小児では巨人症を発症し、成人では先端巨大症を発症するのに対し、過小産生により、小児では、小人症（Ｍａｕｒａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８５（１０），３６５３−３６６０（２０００）；Ｆｒｉｎｄｉｋら、Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１），１５−１９（１９９９）；Ｌｅｇｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８３（１０），３５１２−３５１６（１９９８））Ｔｕｒｎｅｒ‘ｓ Ｓｙｍｄｒｏｍｅ（ｆｅｍａｌｅｓ ｏｎｌｙ）（Ｂｒａｍｓｗｉｇ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５（１），５−１３（２００１）；Ｐａｓｑｕｉｎｏら、Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（６），２６９−２７２（１９９６））、およびｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｃａｒｒｏｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１１（６），２３１−２３８（２０００）；Ｕｅｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８７（６），２７６０−２７６３（２００２）；Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ ＩＧＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１−３３（２００２））を発症する。成人では、ｈＧＨ欠損症は、タンパク質、炭水化物、脂質、無機質、および結合組織の代謝過程に影響を与え、筋肉、骨、または皮膚の萎縮症を発症させ得る（Ｍｅｈｌｓ ａｎｄ Ｈａａｓ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ＩＧＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ，Ｓ３１−Ｓ３７（２０００）；Ｆｉｎｅら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３６（３），３７６−３８２（２０００）；Ｍｏｔｏｙａｍａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２（２），１６２−１６５（１９９８））。成長不全によって特徴づけられる他のｈＧＨ欠損障害には、ＡＩＤＳ消耗症候群（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，２１５−２２１（１９９６）；Ｔｒｉｔｏｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０５（１），４４−５７（１９９８）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２３（６），Ｓ２０２−Ｓ２０９（１９９９）；Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｃａｄｍａｎ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１４（２），８３−９１（２０００））、およびＰｒａｄｅｒｗｉｌｌｉ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｒｉｔｚｅｎ，Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５−６），２０８（２００２）；Ｅｉｈｏｌｚｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１５７（５），３６８−３７７（１９９８））が含まれる。
【０００４】
今日まで、ヒトのｈＧＨ欠損症の治療計画は、主に、組換えＤＮＡテクノロジーによって作製された精製ｈＧＨの皮下注射にフォーカスしている。この治療薬は、カートリッジ中の溶液または使用時に再構成が必要な凍結乾燥粉末のいずれかとしてパッケージングされている。注射頻度は、治療をうける疾患および使用される市販の製品に依存して変化する。例えば、小人症は、組換えｈＧＨの毎日の皮下注射によって治療する。
【０００５】
溶液中でのタンパク質の固有の不安定性により、ｈＧＨの迅速な輸送経路として皮下投与を使用する必要がある。この不安定性は、タンパク質のアミノ酸配列内の特定の位置での重要な分子内架橋の切断、言い換えれば、患者の細胞表面によって認識および関連する不可欠な三次元構造の破壊に起因する。ｈＧＨの切断機構または分解機構は、主に、メチオニン残基の酸化または溶解時のアスパラギン酸残基の脱アミド化、それによるタンパク質の不活化によって調整される。この脆弱性により、安定かつ長期に作用し、かつ皮下だけでなく他の従来の投薬経路（経口経路、真皮経路、および静脈内経路など）によっても輸送することができるｈＧＨ組成物または処方物が当該分野で必要とされる。
【０００６】
この必要性に取り組むための多数の市販のｈＧＨ製品が開発されている。例えば、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）は、ポリラクチド−コグリコリド（ＰＬＧ）ミクロスフィア中に包埋した組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の注射用懸濁液である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｃｏｍを参照のこと）。ｒｈＧＨおよびＰＬＧに加えて、ミクロスフィアは、酢酸亜鉛および炭酸亜鉛成分も含む。投与前に、固体材料を、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ポリソルベート、塩化ナトリウム、および水を含む水溶液で再構成しなければならない。ほとんどがポリマーから構成されるこの懸濁液を、１ヶ月に１回または２回投与し、注射には２１ゲージのニードルが必要である。ミクロスフィアのサイズおよび製品の種々の性質により、注射部位に副作用を起こし、小節、紅斑、疼痛、紫斑、痒み、脂肪細胞萎縮症、および腫脹を生じ得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ／ｎｕｔｒｏｐｉｎ−ｄｅｐｏｔ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐを参照のこと）。
【０００７】
開発されたが、その後製造中止になった別のｈＧＨ製品はＡｌｂｕｔｒｏｐｉｎＴＭ（長時間作用型の遺伝的に産生されたヒトアルブミンとヒト成長ホルモンとの融合タンパク質）である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｉ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ．ｈｔｍｌを参照のこと）。この製品は、長期循環半減期を示し、可溶性の天然ｈＧＨの半減期よりもおよそ５０％長いといわれている。ＡｌｂｕｔｒｏｐｉｎＴＭは、典型的には、１週間を基本として注射によって輸送され、身体からのクリアランス後長期にわたりＩＧＦ−１レベルを刺激するといわれている。この製品の生物学的作用は、現在利用可能な成長ホルモン療法の生物学的作用と類似する。
【０００８】
開発された別の製品は、Ｉｎｆｉｔｒｏｐｉｎ ＣＲＴＭ（ポリエチレングリコール抱合ｈＧＨ分子から構成されるｈＧＨの処方物）であった。この抱合ｈＧＨは１週間に１回注射する必要があり、有意なバースト効果（ｂｕｒｓｔ ｅｆｆｅｃｔ）を起こすことなく連続的に放出されるといわれていた（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（３６），２１６９６−２１９７７（１９９６））。しかし、この製品は製造中止になった。
【０００９】
米国特許第５，９８１，４８５号および同第６，４４８，２２５号は、再構成工程を必要とせず、かつ毎日の注射によって投与されるといわれているｈＧＨの水性処方物を言及している。このような処方物は、典型的には、ｈＧＨ、緩衝液、非イオン性界面活性剤、および任意選択的に中性塩、マンニトール、または防腐剤を含む。
【００１０】
ヒドロゲル（Ｋａｔａｋａｍら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，４９（１），２１−２６（１９９７））、リポソーム、油性乳濁液、および生分解性ポリマーミクロスフィアなどの種々の他の薬物輸送テクノロジーがｈＧＨの薬物放出の目的で使用されている。しかし、得られた処方物は、薬物のバースト放出を示し、厳しい条件を使用し、製造が複雑なものもある。ミクロスフィアの生成に使用するプロセスは、高温、界面活性剤、有機溶媒、および水性溶媒／有機溶媒境界（これらは全てタンパク質を変性させる）などの条件を使用する傾向があるので、これは、特に、ＤＬ−乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ミクロスフィアテクノロジーに基づいたｈＧＨ処方物についても当てはまる（Ｈｅｒｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２３，８３５−８３６（１９９６）；Ｋｉｍら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２２９（１−２），１０７−１１６（２００１））。
【００１１】
いくつかの上記調製物は、ｈＧＨを凍結乾燥状態で保存する必要があり、これは時間がかかり、かつ高価なプロセスであり得る。米国特許第５，７８０，５９９号および同第６，１１７，９８４号は、ｈＧＨの２価のカチオン結晶および凍結乾燥工程を必要としないｈＧＨの２価のカチオン結晶の生成方法を言及している。
【００１２】
従来のｈＧＨ製品の欠点（保存および注射時の不安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の短さ、バースト効果、経口生物学的利用能の欠如、ならびに投与の困難さおよび頻度が含まれる）に取り組む努力にもかかわらず、改良されたｈＧＨ調製物が必要である。この必要性に取り組むために、本発明は、安定かつ長期に作用するｈＧＨが得られるヒト成長ホルモンの結晶を有利に提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の安定かつ長期に作用する便利で患者に優しい結晶に関する。本発明は、さらに、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶の組成物（その薬学的に許容可能な組成物が含まれる）を提供する。本発明は、さらに、このような結晶およびこのような結晶を含む組成物の調製方法を提供する。本発明の結晶および組成物は、ヒト成長ホルモン欠損症に関連するかヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する個体の治療方法で有利に使用される。
【００１４】
ヒト成長ホルモンもしくはヒト成長ホルモン誘導体の結晶または結晶を含む組成物あるいは処方物は、いくつかの利点（１週間に１回の投与能力、即時使用できる結晶懸濁形態、安全性、有効性、純度、安定性、再懸濁可能性、および短時間でのシリンジ利用可能性が含まれる）を有する。本発明の他の目的（従来のｈＧＨ調製物と比較したｈＧＨ結晶およびこれを含む組成物または処方物の改良が含まれる）は、本明細書中の開示を考慮して当業者に認識される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶。
（項目２）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の１価のカチオン結晶。
（項目３）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のプロタミン結晶。
（項目４）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のポリアルギニン結晶。
（項目５）
前記１価のカチオンが、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される、項目２に記載の１価のカチオン結晶。
（項目６）
前記１価のカチオンがナトリウムである、項目５に記載の１価のカチオン結晶。
（項目７）
前記結晶の哺乳動物への単回投与によって、
（ａ）約０．３ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、
（ｂ）約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、および
（ｃ）約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨからなる群から選択される該哺乳動物のｉｎ ｖｉｖｏでの血清ｈＧＨ濃度を、
（ｉ）投与後約０．５時間と約４０日間との間、
（ｉｉ）投与後約０．５時間と約１０日間との間、
（ｉｉｉ）投与後約０．５時間と約７日間との間、および
（ｉｖ）投与後約０．５時間と約１日間との間からなる群から選択される期間で得られる、項目１、項目２、項目３、または項目４のいずれか１項に記載の結晶。
（項目８）
前記結晶の哺乳動物への単回投与によって、
（ａ）約５ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ、および
（ｂ）約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌからなる群から選択される投与前の哺乳動物のベースラインＩＧＦ−１レベルを超えるｉｎ ｖｉｖｏでの血清ＩＧＦ−１上昇を、
（ｉ）投与後約０．５時間と約４０日間との間、および
（ｉｉ）投与後約０．５時間と約７日間との間からなる群から選択される期間で得られる、項目１、項目２、項目３、または項目４のいずれか１項に記載の結晶。
（項目９）
前記結晶の相対生物学的利用能が、同一の投与経路を介して輸送される同一用量の可溶性ｈＧＨと比較して少なくとも５０％またはそれ以上であり、該生物学的利用能を該可溶性ｈＧＨおよび該結晶についてのｉｎ ｖｉｖｏでの総血清ｈＧＨ濃度のＡＵＣによって測定された、項目１、項目２、項目３、または項目４のいずれか１項に記載の結晶。
（項目１０）
前記哺乳動物がヒトである、項目７または項目８に記載の結晶。
（項目１１）
前記結晶が、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体あたり約１個から約５００個までのカルシウム分子を含む、項目１に記載の結晶。
（項目１２）
前記結晶が、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体あたり約１個から約５００個までの１価のカチオンを含む、項目２に記載の結晶。
（項目１３）
前記結晶が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、およびグルコン酸カル
シウムからなる群から選択されるカルシウム塩を含む、項目１に記載の結晶。
（項目１４）
前記カルシウム塩が酢酸カルシウムである、項目１３に記載の結晶。
（項目１５）
前記結晶が、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択されるナトリウム塩を含む、項目６に記載の結晶。
（項目１６）
前記ナトリウム塩が酢酸ナトリウムである、項目１５に記載の結晶。
（項目１７）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶および賦形剤を含む組成物において、該結晶が、
（ａ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶、
（ｂ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の１価のカチオン結晶、
（ｃ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体プロタミン結晶、および
（ｄ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のポリアルギニン結晶からなる群から選択される、組成物
（項目１８）
前記結晶および前記賦形剤が前記組成物中にｈＧＨ：賦形剤のモル比が約１：１０〜約１：０．１２５で存在する、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記賦形剤が、アミノ酸、塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される、項目１７に記載の組成物。
（項目２０）
前記賦形剤が、プロタミン、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン、グルコン酸カルシウム、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、デンドリマー、ポリオルチニン、ポリエチレンイミン、キトサン、およびその混合物からなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記賦形剤が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリエチレングリコール、およびその混合物からなる群から選択される、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記組成物中のヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の濃度が、
（ａ）約０．１ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間、
（ｂ）約１ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間、および
（ｃ）約１０ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間、からなる群から選択される、項目１７に記載の組成物。
（項目２３）
ヒト成長ホルモン欠損症に関連するかヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する哺乳動物を治療するための方法であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量の項目１、項目２、項目３、もしくは項目４のいずれか１項に記載の結晶または項目１７に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
哺乳動物の体重増加を誘導する方法であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量の項目１、項目２、項目３、もしくは項目４のいずれか１項に記載の結晶または項目１７に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）
前記哺乳動物が下垂体摘出ラットであり、週１回の注射による前記結晶の投与後の該ラットで誘導された体重増加が５％と約４０％との間である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記障害が、成人成長ホルモン欠損症、小児成長ホルモン欠損症、プラダー・ウィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎機能不全、特発性低身長、小人症、下垂体性小人症、骨再生、女性不妊症、胎内発育遅延、ＡＩＤＳ関連悪液質、クローン病、および火傷からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記障害が小児成長ホルモン欠損症であり、前記方法により前記哺乳動物の年率換算の成長率が約７ｃｍと約１１ｃｍとの間になる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記結晶または組成物を、経口経路、非経口経路、皮下経路、または筋肉内経路によって前記哺乳動物に投与する、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記結晶または組成物を、２７またはそれ以上のゲージのニードルを使用した皮下経路によって前記哺乳動物に投与する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記結晶または組成物を、無針注射器またはメタ用量注入ポンプによって前記哺乳動物に投与する、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目３１）
前記結晶または組成物を、
（ａ）３日毎に約１回、
（ｂ）１週間に約１回、
（ｃ）２週間毎に約１回、および
（ｄ）１ヶ月毎に約１回からなる群から選択される時間治療計画によって前記哺乳動物に投与する、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目３２）
前記哺乳動物がヒトである、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目３３）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化溶液とを混合する工程であって、該結晶化溶液が、カルシウム塩または１価のカチオン塩およびイオン性ポリマーを含み、該イオン性ポリマーがプロタミンまたはポリアルギニンである、工程、
（ｂ）該結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶が生成されるまで約４℃と約３７℃との間の温度で約１２時間を超えてインキュベートする工程とを包含する、方法。
（項目３４）
前記イオン性ポリマーがポリリジンである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記イオン性ポリマーが、任意の２つまたはそれ以上のプロタミン、ポリアルギニン、およびポリリジンの混合物である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程、
（ｂ）該結晶化溶液に脱イオン水と添加する工程、
（ｃ）該結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程と、
（ｄ）該結晶化溶液にカルシウム塩または１価のカチオン塩を添加する工程と、
（ｅ）該結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間の温度で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程、
（ｆ）該ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶にイオン性ポリマーまたはイオン性小分子を添加する工程とを包含する、方法。
（項目３７）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程、
（ｂ）該結晶化溶液に脱イオン水を添加する工程、
（ｃ）該結晶化溶液にイオン性小分子またはイオン性ポリマーを添加する工程、
（ｄ）該結晶化溶液にカルシウム塩または１価のカチオン塩を添加する工程、
（ｅ）該結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間の温度で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程とを包含する、方法。
（項目３８）
前記方法が、工程（ｂ）の後かつ工程（ｃ）の前に、前記結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程を包含する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記カルシウム塩が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記カルシウム塩が酢酸カルシウムである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記１価のカチオンが、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記１価のカチオンがナトリウムである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記１価のカチオン塩が、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記１価のカチオン塩が酢酸ナトリウムである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記結晶化溶液がｐＨ緩衝液をさらに包含する、項目３３に記載の方法。
（項目４６）
前記ｐＨ緩衝液のｐＨが、
（ａ）約ｐＨ６と約ｐＨ１０との間、
（ｂ）約ｐＨ７．０と約ｐＨ１０との間、
（ｃ）約ｐＨ６と約ｐＨ９との間、および
（ｄ）約ｐＨ７．８と約ｐＨ８．９との間からなる群から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ｐＨ緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群か
ら選択される緩衝液である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記沈殿剤が、非イオン性小分子または非イオン性ポリマーである、項目３６または項目３８に記載の方法。
（項目４９）
前記非イオン性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリエチレングリコールの分子量が、
（ａ）約２００と約８０００との間の分子量、
（ｂ）約６０００の分子量、
（ｃ）約４０００の分子量、および
（ｄ）約３３５０の分子量からなる群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ポリエチレングリコールが、前記結晶化溶液中に、約０．５％と約２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度で存在する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記沈殿剤が、アミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３８に記載の方法。
（項目５３）
前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体が、前記結晶化溶液中に、
（ａ）約１ｍｇ／ｍｌと約１，０００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度、
（ｂ）約２ｍｇ／ｍｌと約５０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度、
（ｃ）約１０ｍｇ／ｍｌと約２５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度からなる群から選択される濃度で存在する、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記カルシウム塩または前記１価のカチオン塩が、前記結晶化溶液中に、
（ａ）約０．０１Ｍと約１Ｍとの間の濃度、および
（ｂ）約２５ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度からなる群から選択される濃度で存在する、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記結晶化溶液は、
（ａ）約３３℃で約０．２５日間と約２日間との間、
（ｂ）約２５℃で約０．２５日間と約２日間との間、および
（ｃ）約１５℃で約０．２５日間と約２日間との間からなる群から選択される時間および温度でインキュベートされる、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記イオン性小分子が、アミノ酸、ペプチド、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目５７）
前記イオン性ポリマーが、プロタミン、ポリサッカリド、ポリアミノ酸、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、デンドリマー、ポリオルチニン、ポリエチレンイミン、キトサン、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目５８）
前記イオン性ポリマーが、プロタミンまたはポリアルギニンである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記結晶化溶液は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶が形成されるまで、約４℃と約４０℃の間の温度で約４時間と約４８時間との間インキュベートされる、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６０）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体が、前記結晶化溶液中に、約２ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６１）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体が、前記結晶化溶液中に、約１４．５ｍｇ／ｍｌと約１５．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６２）
前記結晶化緩衝液が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＭＰ緩衝液、ＡＭＰＤ緩衝液、ＡＭＰＳＯ緩衝液、ビシン緩衝液、エタノールアミン緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、タウリン緩衝液、トリアン緩衝液、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６３）
項目３６に記載の工程（ａ）または項目３７に記載の工程（ａ）において、前記結晶化緩衝液が、前記結晶化溶液中に、約１０ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６４）
工程（ａ）において、前記結晶化緩衝液のｐＨが、
（ａ）約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間、
（ｂ）約ｐＨ６と約ｐＨ９との間、および
（ｃ）約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６５）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記結晶化溶液中の結晶化緩衝液のｐＨにより、前記溶液が、
（ａ）約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間、
（ｂ）約ｐＨ６と約ｐＨ９．５との間、および
（ｃ）約ｐＨ７．５と約ｐＨ９．５との間からなる群から選択されるｐＨとなる、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６６）
前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される、項目６４または項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記酢酸カルシウムが、
（ａ）約ｐＨ３．０と約ｐＨ９．０との間、および
（ｂ）約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間からなる群から選択されるｐＨを有する水溶液の形態である、項目４０に記載の方法。
（項目６８）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記酢酸カルシウムが、
（ａ）約０．１ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度、および
（ｂ）約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間の濃度からなる群から選択される濃度で前記結晶化溶液中に存在する、項目４０に記載の方法。
（項目６９）
前記酢酸ナトリウムが、
（ａ）約ｐＨ３．０と約ｐＨ９．０との間、および
（ｂ）約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間からなる群から選択されるｐＨを有する水溶液の形態である、項目４４に記載の方法。
（項目７０）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記酢酸ナトリウムが、
（ａ）約０．５ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度、および
（ｂ）約１００ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度からなる群から選択される濃度で前記溶液中に存在する、項目４５に記載の方法。
（項目７１）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記溶液は、約４℃と約３７℃との間の温度で約１日間と約２日間との間インキュベートされる、項目３６または項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、光学顕微鏡によって画像化した８６０ｍＭリン酸アンモニウム（ｐＨ８．９）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１を参照のこと。
【図２】図２は、光学顕微鏡によって画像化した３９０ｍＭクエン酸ナトリウムの存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例２を参照のこと。
【図３】図３は、光学顕微鏡によって画像化した６００ｍＭ第二リン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例３を参照のこと。
【図４】図４は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ酢酸カルシウムおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させ、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）で同時結晶化したｈＧＨ結晶を示す。実施例４を参照のこと。
【図５】図５は、時間の関数としておよび２８０ｎｍでモニタリングした、リン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、および酢酸カルシウム／プロタミン沈殿剤から作製したｈＧＨの溶解性を示す。実施例５を参照のこと。
【図６】図６は、光学顕微鏡によって画像化した１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、８５ｍＭ酢酸カルシウム、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例６を参照のこと。
【図７】図７は、光学顕微鏡によって画像化した５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、８５ｍＭ塩化カルシウム、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例７を参照のこと。
【図８】図８は、光学顕微鏡によって画像化した１０％（ｖ／ｖ）エタノール、１０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例８を参照のこと。
【図９】図９は、時間（分）の関数として２８０ｎｍでモニタリングした実施例６〜８にしたがって成長させたｈＧＨ結晶の溶解性を示す。実施例９を参照のこと。
【図１０】図１０は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ酢酸カルシウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１０を参照のこと。
【図１１】図１１は、光学顕微鏡によって画像化した５００ｍＭ酢酸ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１１を参照のこと。
【図１２】図１２は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ塩化カルシウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１２を参照のこと。
【図１３】図１３は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ酢酸カルシウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させ、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）で同時結晶化したｈＧＨ結晶を示す。実施例１３を参照のこと。
【図１４】図１４は、光学顕微鏡によって画像化した１２５ｍＭ酢酸カルシウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−ＭＭＥ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１４を参照のこと。
【図１５】図１５は、時間（分）の関数として２８０ｎｍでモニタリングした実施例１０〜１４にしたがって成長させたｈＧＨ結晶の溶解性を示す。実施例１５を参照のこと。
【図１６】図１６は、ラットあたり２．５ｍｇ／ｋｇの可溶性または結晶ｈＧＨの単回皮下投与から２４時間後にサンプリングした雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける市販のｈＧＨ（可溶性ｈＧＨ）および実施例１０にしたがって調製したｈＧＦＨ（結晶ｈＧＨ）の血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。ｔ＝０、０．５、１、２、４、６、８、１２、および２４時間で血清レベルを測定した。実施例１６を参照のこと。
【図１７】図１７は、種々の量の硫酸プロタミンの添加時のｈＧＨ結晶（８５ｍＭ酢酸カルシウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で形成）の溶解特性を示す。次いで、ｈＧＨ結晶のこれらの種々の処方物を、溶解緩衝液に添加し、１時間静置し、その後上清中の可溶性ｈＧＨの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣ法（Ａｒｅａ）によって測定した。実施例１７を参照のこと。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＴＥＭよって長手方向に画像化した５００ｍＭ酢酸ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１８を参照のこと。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＴＥＭよって断面を画像化した５００ｍＭ酢酸ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１８を参照のこと。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ラットあたり６．７ｍｇ／ｋｇのｈＧＨの７日間にわたる毎日の皮下投与または７日間にわたる単回投与のいずれかから１６８時間後（０〜７２時間を示す）にわたりサンプリングした雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの第３群〜第５群および第９群におけるｈＧＨの血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。実施例２２および表７〜１２を参照のこと。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ラットあたり６．７ｍｇ／ｋｇのｈＧＨの７日間にわたる毎日の皮下投与（第２群）または７日間の第１日目における単回皮下投与（第４群および第９群）のいずれかから８日後にわたる選択処方物（第２群、第４群、および第９群）の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの体重増加（ｇ）を示す。実施例２２および表１３を参照のこと。
【図２０Ａ】図２０Ａは、表１６にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、ポリアルギニンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第３群）を毎日皮下投与した雌幼若カニクイザルについての時間の関数としての血清ｈＧＨ濃度を示す。実施例２３を参照のこと。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、表１８にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、ポリアルギニンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第３群）を毎日皮下投与した雌幼若カニクイザルについての時間の関数としての血清ＩＧＦ−１濃度を示す。実施例２３を参照のこと。
【図２１Ａ】図２１Ａは、表２０にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、プロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝３：１）（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝２：１）（第３群）を毎日皮下投与した幼若雌カニクイザルについての時間の関数としての血清ｈＧＨ濃度を示す。実施例２４を参照のこと。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、表２２にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、プロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝３：１）（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝２：１）（第３群）を毎日皮下投与した雌幼若カニクイザルについての時間の関数としての血清ＩＧＦ−１濃度を示す。実施例２４を参照のこと。
【図２２】図２２は、表２５に従って、コントロール（第１群、７日間にわたり毎日１回）、可溶性ｈＧＨ（第４群および第５群、７日間にわたり毎日１回）、および結晶ｈＧＨ（第６群、第７群、第９群、および第１０群、７日間にわたり１回）を皮下投与した雄Ｗｉｓｔａｒラットの７日間の成長を示す。実施例２５を参照のこと。
【図２３】図２３は、表２６に従って、コントロール（第１群、７日間にわたり毎日１回）、可溶性ｈＧＨ（第４群および第５群、７日間にわたり毎日１回）、および結晶ｈＧＨ（第６群、第７群、第９群、および第１０群、７日間にわたり１回）皮下投与した雄Ｗｉｓｔａｒラットの７日間にわたる毎日の誘導体重増加（ｇ）を示す。実施例２５を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中の他で定義しない限り、本発明に関連して使用した科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するべきである。さらに、他の文脈で必要でない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるべきである。一般に、本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィ、光学顕微鏡法、ＵＶ−ＶＩＳ分光法、薬物動態学分析、組換えＤＮＡ法、ペプチドおよびタンパク質化学、核酸化学、および分子生物学と共におよびその技術で使用される用語は当該分野で周知であり、かつ一般的に使用されている用語である。
以下の用語は、他で示さない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
【００１７】
用語「成長ホルモン（ＧＨ）」は、一般に、哺乳動物下垂体によって分泌される成長ホルモンをいう。完全なリストではないが、哺乳動物の例には、ヒト、類人猿、サル、ラット、ブタ、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、およびヤギが含まれる。本発明の好ましい実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
【００１８】
「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」は、天然のヒト成長ホルモンに特徴的なアミノ酸配列、構造、および機能を有するタンパク質を示す。本明細書中で使用される、「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」には、天然のヒト成長ホルモンの任意のイソ型（分子量が５ｋＤａ、１７ｋＤａ、２０ｋＤａ、２２ｋＤａ、２４ｋＤａ、３６ｋＤａ、および４５ｋＤａのイソ型が含まれるが、これらに限定されない）も含まれる（Ｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８））。したがって、用語ｈＧＨには、天然のｈＧＨ（ソマトトロピン）の１９１個のアミノ酸配列およびＮ末端メチオニンを含む１９２個のアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）およびソマトレムが含まれる（米国特許第４，３４２，８３２号および同第５，６３３，３５２号）。生物源からの単離および精製または組換えＤＮＡ法によってｈＧＨを得るとことができる。組換えＤＮＡテクノロジーによって作製される場合、ｈＧＨは組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）と呼ぶ。Ｍｅｔ−ｈＧＨは、典型的には、組換えＤＮＡ法によって調製する。
【００１９】
用語「ヒト成長ホルモン誘導体」は、天然に存在するヒト成長ホルモンに類似のアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。用語「類似の」は、ｈＧＨの１９１個のアミノ酸配列またはＭｅｔ−ｈＧＨの１９２個のアミノ酸配列と２％と１００％との間で相同なアミノ酸配列をいう。本発明の種々の実施形態では、ヒト成長ホルモン誘導体は、ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨの有機カチオン、生物学的に合成されたｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質の置換、欠失、および挿入変異型、翻訳後修飾ｈＧＨおよびＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質（脱アミド化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、凝集、および酵素切断反応が含まれる）（Ｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８））、生物源由来の化学修飾ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質、ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨに類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドアナログおよび化学合成ペプチドを含む。
【００２０】
ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨを調製するために使用する方法には、生物源からの単離、組換えＤＮＡ法、合成化学経路、またはその組み合わせが含まれる。今日まで、ｈＧＨの異なるＤＮＡ配列をコードする遺伝子には、ｈＧＨ−ＮおよびｈＧＨ−Ｖが含まれる（Ｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８）；Ｂｅｎｎａｎｉ−Ｂａｉｔｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，６４７−６５２（１９９５））。
【００２１】
用語「原子価」は、他の元素と組み合わされて原子の最外殻の電子数によって予想され、その原子と結合する（または置換する）ことができる水素原子（または任意の他の標準的な１価の元素）の数として示される元素の能力と定義する（Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｄ．ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ Ｔ．Ｈ．，Ｅｄｓ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８）。用語「１価のカチオン」および「２価のカチオン」は、それぞれ１つまたは２つの原子価状態を有する正電荷のイオンをいう。異なる原子価状態を有するカチオンは、事実上有機または無機であり得る。１価の無機カチオンの例には、アンモニウム（ＮＨ４＋）および周期表の１族の元素（Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、およびＦｒ＋）が含まれ、２価の無機カチオンには、２族の元素（Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｍｏ２＋、およびＲａ２＋）が含まれる。
【００２２】
「ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶」は、２価のカルシウムイオンの存在下で結晶化されたヒト成長ホルモンまたはその誘導体をいう。２価のカルシウムイオンを、カルシウム塩として結晶化溶液に導入する。好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体または単量体鎖あたり約１個から約５００個までのカルシウム分子を含む。より好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体または単量体鎖あたり約１個から約１４０個までのカルシウム分子を含む。
【００２３】
用語「カルシウム塩」には、カルシウムイオンとイオン結合を形成する無機および有機の対イオンまたは分子の両方が含まれる。異なるカルシウム塩の例には、酢酸カルシウム水和物、酢酸カルシウム１水和物、カルシウムアセチルアセトン水和物、Ｌ−アスコルビン酸カルシウム２水和物、カルシウムビス（６，６，７，７，８，８，８−ヘプタフルオロ−２，２−ジメチル−３，５−オクタンジオネート）、カルシウムビス（２，２，６，６，−テトラメチル−３，５−ヘプタンジオネート）、臭化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化カルシウム２水和物、塩化カルシウム６水和物、塩化カルシウム水和物、クエン酸カルシウム４水和物、リン酸二水素カルシウム、２−エチルヘキサン酸カルシウム、フッ化カルシウム、グルコン酸カルシウム、水酸化カルシウム、次亜塩素酸カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ化カルシウム水和物、カルシウムイオノフォアＩ、モリブデン酸カルシウム、硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、シュウ酸カルシウム水和物、酸化カルシウム、パントテン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、および硫酸カルシウムが含まれる。本発明の好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、およびグルコン酸カルシウムからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウムである。
【００２４】
「ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の有機カチオン結晶」は、有機カチオンの存在下で結晶化したヒト成長ホルモンをいう。用語「有機カチオン」は、炭素を含む正電荷の原子または原子群をいう。有機カチオンの例には、第四級アンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、トリブチルメチルアンモニウム（ＴＢｕＭＡ）、臭化エチルプロカインアミド（ＰＡＥＢ）、メトヨウ化アジドプロカインアミド（ＡＰＭ）、ｄ−ツボクラリン、メトクリン、ベクロニウム、ロクロニウム、１−メチル−４−フェニルピリジニウム、コリン、およびＮ−（４，４−アキソ−ｎ−ペンチル）−２１−デオキシアジュマリニウム（ＡＰＤＡ）が含まれる。
【００２５】
ｈＧＨは凍結乾燥形態で市販されており、典型的には、組換えＤＮＡ法で製造されている。本発明によれば、ｈＧＨの結晶化は、一般に、ｈＧＨの緩衝化溶液の調製、精製および／または脱塩、溶液の透析および濃縮、ならびに溶液への１価または２価のカチオンもしくは塩の添加によって行われる。後者の工程により、ｈＧＨに結合した有機または無機カチオンが形成される。
【００２６】
本発明の１つの好ましい実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の１価のカチオン結晶に関する。より好ましい実施形態では、１価のカチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、１価のカチオンはナトリウムである。最も好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体または単量体鎖あたり約１個から約５００個までのカチオン分子を含む。
【００２７】
用語「１価のカチオン塩」には、１価のイオンとイオン結合を形成する無機および有機の対イオンまたは分子の両方が含まれる。好ましい実施形態では、１価のカチオン塩はナトリウム塩である。より好ましい実施形態では、ナトリウム塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、ナトリウム塩は酢酸ナトリウムである。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のプロタミン結晶に関する。同様に、さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のポリアルギニン結晶に関する。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施形態は、プロタミンまたはポリアルギニンと複合体化または同時結晶化したｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の１価または２価の結晶を含む。より好ましくは、結晶は、プロタミンまたはポリアルギニンと複合体化または同時結晶化したナトリウム結晶である。
【００３０】
ｈＧＨの可溶性形態を、種々の方法（逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、および疎水性クロマトグラフィ（ＨＩＣ）が含まれる）によって特徴づけることができる（Ｗｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５００，５９５−６０６（１９９０）；「Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｄｒｕｇｓ」，ＦＤＡ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，（１９８２））。他方では、ｈＧＨの結晶形態を、光学顕微鏡法およびＸ線回折によって特徴づけることができる。一般に、結晶化条件は、タンパク質結晶の形状（すなわち、球体、針状、棒状、平面（六方晶系および四角形）、長斜方形、立方体、両錐、および角柱からなる群から選択される形状）で決定される。
【００３１】
本発明のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、光学顕微鏡法を使用して画像化した場合、棒様形態または針様形態を形成している。１つの実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約０．１μｍと約２００μｍとの間の長さの棒形態または針形態を形成する。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約３μｍと約１００μｍとの間の長さの棒形態または針形態を形成する。より好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約１０μｍと約２５μｍとの間の長さの棒形態または針形態を形成する。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のカルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。さらに別の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤は、ｈＧＨ：賦形剤のモル比が約１：２５０〜約１：２０でこのような組成物中に存在する。別の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤は、ｈＧＨ：賦形剤のモル比が約３：１〜約１：１０で存在する。さらに別の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤は、ｈＧＨ：賦形剤のモル比が約１：１０〜約１：０．１２５で存在する。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、ポリアルギニンまたはプロタミンで結晶化またはコーティングすることができる酢酸ナトリウムで成長させる。
【００３３】
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶を、任意の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることができる。本発明によれば、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、薬学的組成物中で使用される充填剤または充填剤の組み合わせとして作用する賦形剤である。このカテゴリーに含まれる好ましい賦形剤は、以下である：１）グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリンなどのアミノ酸、２）炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボースなどのモノサッカライドなど）、３）ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースなどのジサッカリド、４）マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲンなどのポリサッカリド、５）マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトールなどのアルジトール、６）グルクロン酸、ガラクツロン酸、７）メチルシクロデキストリン、およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、８）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、ホウ酸、炭酸アンモニウム、ならびにリン酸アンモニウムなどの無機分子、９）酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩などの有機分子、１０）アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロクサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシルエチレン誘導体、ソルビタン誘導体などの乳化剤または可溶化剤／安定剤、ならびに１１）寒天、アルギン酸およびその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールなどの増粘剤。このような化合物の塩も使用することができる。さらに好ましい賦形剤群には、スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、マンニトール、イノシトール、ナトリウムおよびカリウム塩（酢酸、リン酸、クエン酸、およびホウ酸など）、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリリジン、およびポリアルギニンが含まれる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態では、賦形剤は、アミノ酸、塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、賦形剤は、プロタミン、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン、グルコン酸カルシウム、ポリアミノ酸（ポリアルギニン、ポリリジン、およびポリグルタミン酸など）、ポリエチレングリコール、デンドリマー、ポリオルチニン、ポリエチレンイミン、キトサン、およびその混合物からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、賦形剤は、プロタミン、ポリアルギニン、ポリエチレングリコール、およびその混合物からなる群から選択される。
【００３５】
本発明のヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶を、キャリアまたは賦形剤（治療薬に添加した場合にその作用を促進するか改良する物質）と組み合わせることもできる（Ｔｈｅ Ｏｎ− Ｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｗｅｂ．ｎｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｏｍｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。キャリアまたは賦形剤の例には、例えば、リン酸などの緩衝剤、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、または電解質（硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛片、コロイド状シリカ、マグネシウム、トリシリケート、セルロースベースの物質、およびポリエチレングリコールなど）が含まれる。ゲルベース形態のキャリアまたは賦形剤には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、およびウッドワックスアルコールが含まれ得る。
【００３６】
さらにより好ましい実施形態では、賦形剤はプロタミンである。さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体およびプロタミンの結晶は、ｈＧＨ：プロタミン比が約５：１〜約１：１０（ｗ／ｗ）で存在する。この比はまた、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。最も好ましくは、この比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は、約３：１と約１：１０との間（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、この比は、約５：１と約４０：１との間（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、この比は、約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００３７】
本発明の別の態様では、薬学的に許容可能な賦形剤は、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアルギニン、およびポリグルタミン酸が含まれる）からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態では、賦形剤はポリリジンである。より好ましい実施形態では、ポリリジンの分子量は、１，５００ｋＤと約８，０００ｋＤとの間である。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体およびポリリジンの結晶は、ｈＧＨ：ポリリジン比が約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）で存在する。この比はまた、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。より好ましくは、この比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は、約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、この比は、約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００３８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、賦形剤はポリアルギニンである。より好ましい実施形態では、ポリアルギニンの分子量は、約１５，０００ｋＤと約６０，０００ｋＤとの間である。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体およびポリアルギニンの結晶は、ｈＧＨ：ポリアルギニン比が約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）で存在する。この比はまた、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。より好ましくは、この比は、約１２：１〜約３：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は、約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、この比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、この比は、約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００３９】
本発明の１つの実施形態は、約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を含む注射用結晶懸濁液を含む。この懸濁液は、再懸濁の容易さ、ゆっくりとした沈殿、および約７日間の時間作用プロフィールによって特徴づけられる。これを、３０ゲージのシリンジを使用して１週間に１回注射することができ、８０％の有効負荷レベルが得られる。０．０２％の凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および２．３％の関連タンパク質（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のパラメーターを反映させたところ、この懸濁液は純粋である。この純度を、冷蔵条件下で少なくとも４ヶ月維持する。
【００４０】
本発明の１つの実施形態は、個体に導入した場合に従来の可溶性ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の処方物と比較して遅延した溶解挙動を示すことが特徴づけられたｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶に関する。本発明によれば、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の溶解を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ溶解パラメーターのいずれかによって特徴づける。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解は、１５分間あたりまたは連続的溶解プロセス中の洗浄工程あたりに得られる可溶性ｈＧＨの濃度（最初に存在する全ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶比率またはｍｇとして示す）と説明される（実施例５を参照のこと）。本発明の１つの実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、３７℃で溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、および０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）への曝露時の洗浄工程あたり約２％と約１６％との間の結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度によって特徴づけ、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、溶液中に約２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、連続的溶解プロセスにおける洗浄工程あたり約０．０４ｍｇ〜約０．３２ｍｇの前記結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度によって特徴づける（実施例５を参照のこと）。他方では、ｉｎ ｖｉｖｏ溶解を、哺乳動物へのｈＧＨの単回注射後の長期にわたる哺乳動物内での血清ｈＧＨレベルによって説明する。
【００４１】
哺乳動物では、ＧＨは、ＩＧＦ−１（言い換えると、細胞分裂および代謝過程で役割を果たすタンパク質）を合成および分泌するように組織を刺激する。当業者に認識されているように、血清ｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルは、多数の要因（生理学的および治療関連因子が含まれる）に依存する。このような要因には、以下が含まれるが、これらに限定されない：年齢および骨年齢、性別、体重、発達段階（例えば、思春期でのレベルの増加）などの生理学的要因ならびに用量、投与速度（速度）および投与経路などの治療関連要因。また、当業者は、安全性および有効性の両観点から、異なる患者集団には異なるｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルが有利であり得ることを認識する。
【００４２】
種々のｈＧＨ機能不全、病態、または症候群を罹患した成人または小児を、本発明のｈＧＨ結晶またはｈＧＨ誘導体結晶を使用した種々のｈＧＨの外因的輸送治療計画によって治療することができる。例えば、内分泌学者は、小児には、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週の用量、治療の数週間または数ヵ月後に約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に増加させた用量、思春期あたりで約０．７ｍｇ／ｋｇ／週にさらに増加させた用量を使用して治療を開始することができる。当業者に認識されるように、ｈＧＨ輸送を必要とする成人または小児に投与されたｈＧＨのこのような外因的輸送レベルはまた、ｈＧＨの既存の生理学的レベルまたは濃度に依存する。
【００４３】
成人または小児におけるｈＧＨの投薬計画は、通常ｍｇ／ｍｌまたは国際単位（ＩＵ／ｋｇ）で示される。このような治療計画を、一般に、日または週のいずれかについて計画する（すなわち、ｍｇ／ｋｇ／日またはｍｇ／ｋｇ／週）。これらを考慮して、本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与（例えば、３０ｋｇの小児あたり約９ｍｇの毎週の単回投与）により、ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与１日後および２日後に約１０ｎｇ／ｍｌを超え、投与３日後および４日後に約５ｎｇ／ｍｌを超え、投与５〜７日後に約０．３ｎｇ／ｍｌを超える。あるいは、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与約０．５時間後と約４０日後との間、好ましくは投与約０．５時間後と約１０日後、７日後、または１日後のいずれかとの間で約０．３ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、好ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨになる。同様に、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、前記哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与約０．５時間後と約４０日後との間、好ましくは投与約１０日後、７日後、または１日後のいずれかで約２ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、最も好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。本発明のより好ましい実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与約０．５時間後と約４０日後との間、好ましくは投与約１０日後、７日後、または１日後のいずれか任意の期間で約０．３ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の１週間に１回の投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与１日後および２日後では約１０ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、投与３日後および４日後では約５ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、投与５〜７日後では約０．３ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。さらなる実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与０．５時間後と１０日後との間で約０．３ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。
【００４４】
本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、上記投与前のベースラインＩＧＦ−１レベルを超えるｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約１０時間後から約７２時間後までに約５０ｎｇ／ｍｌを超え、投与７２時間後から約１５日後、好ましくは投与約１０日後に約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌになる。あるいは、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約０．５時間後〜約４０日後、好ましくは投与約７日後に約５ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌになる。あるいは、本発明によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約０．５時間後〜約４０日後まで、好ましくは投与約７日後に約５０ｎｇ／ｍｌ超え、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌを超え得る。本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、前記投与前のベースラインＩＧＦ−１レベルを超えるｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約１０時間後から約７２時間後までに約５０ｎｇ／ｍｌを超え、投与７２時間後から約１５日後または投与約７２時間後〜約１０日後に約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌになる。
【００４５】
本発明によれば、単回投与を、投与体積が０．１ｍｌと約１．５ｍｌとの間である、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週のｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはこのような結晶を含む組成物と定義する。例えば、小児成長ホルモン欠損症には、約０．３ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、３０ｋｇの小児あたり約９ｍｇ）のｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物を投与することができる。ターナー症候群には、約０．３７５ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、３０ｋｇの小児あたり約１１．２５ｍｇ）のｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはこのような結晶を含む組成物を投与することができる。さらに、成人成長ホルモン欠損症には、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、８０ｋｇの成人あたり約１６ｍｇ）のｈＧＨを投与することができる。ＡＩＤＳ消耗疾患には、６ｍｇ／日（例えば、４２ｍｇ／週）のｈＧＨを投与することができる。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物は、哺乳動物において可溶性ｈＧＨと同様の相対生物学的利用能を示す。可溶性ｈＧＨおよび前記結晶の総ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定した本発明の結晶の相対生物学的利用能は、同一経路（例えば、皮下または筋肉内注射）によって輸送された可溶性ｈＧＨと比較して少なくとも５０％またはそれ以上である。したがって、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、有利なｉｎ ｖｉｖｏ溶解速度によって特徴づける。
【００４７】
本発明は、さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶をヒト成長ホルモン欠損症に関連するかｈＧＨ治療によって改善する障害を有する哺乳動物に投与する方法を提供する。この方法は、哺乳動物に治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を投与する工程を含む。あるいは、この方法は、有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶のみを含むか賦形剤と組み合わせた組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。本発明のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の種々の実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のカルシウム結晶、１価の結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶である。このような結晶またはこれを含む組成物を、３日毎に約１回、１週間に約１回、２週間毎に約１回、または毎月約１回の時間投与計画によって投与することができる。
【００４８】
本発明によって治療することができるｈＧＨ機能不全に関連する障害には、成人成長ホルモン欠損症、小児成長ホルモン欠損症、プラダー・ウィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎機能不全、特発性低身長、小人症、下垂体性小人症、骨再生、女性不妊症、胎内発育遅延、ＡＩＤＳ関連悪液質、クローン病、火傷、ならびに他の遺伝子障害および代謝障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態では、障害は小児成長ホルモン欠損症であり、治療を受けた小児の年率換算の成長率が約７ｃｍと約１１ｃｍとの間になる。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のカルシウム結晶は、哺乳動物の骨治療およびヒト成長ホルモン欠損症治療の有用な補助薬として作用することができる。
【００５０】
本発明はまた、哺乳動物に治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を前記哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の体重増加を誘導する方法を提供する。あるいは、このような方法は、哺乳動物に治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む。このような方法の１つの実施形態では、週１回の注射による前記結晶投与後の下垂体摘出ラットで誘導された体重増加は、約５％と約４０％との間である。
【００５１】
ｈＧＨの結晶、ｈＧＨ誘導体の結晶、またはこれらのみまたは賦形剤と共に含む組成物を、単独または薬学的調製物、治療調製物、もしくは予防調製物の一部として投与することができる。これらを、任意の従来の投与経路（例えば、非経口、経口、肺、鼻腔、耳、肛門、真皮、眼、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、経皮、局所、口腔、または頭蓋内が含まれる）によって投与することができる。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、賦形剤を含むか含まないｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこれを含む組成物を、経口経路または非経口経路によって投与する。好ましい実施形態では、賦形剤を含むか含まないｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこれを含む組成物を、皮下経路または筋肉内経路によって投与する。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明の結晶または組成物を、２７またはそれ以上のゲージのニードルを使用した皮下経路によって投与する。本発明の１つの実施形態では、ニードルゲージは、３０であり得る。結晶または組成物を、プレフィルドシリンジまたはメタ用量注入ポンプから投与することができる。あるいは、無針注入器によってこれらを投与することができる。
【００５４】
本発明により、ｈＧＨを哺乳動物に有利に放出することが可能である。１つの実施形態では、本発明の結晶または組成物を、週に約１回投与する。別の実施形態では、本発明の結晶または組成物を、２週間毎に約１回投与する。さらに別の実施形態では、本発明の結晶または組成物を、毎月約１回投与する。特定の治療計画は、治療すべき疾患、治療すべき患者の年齢および体重、患者の全身的な身体状態、および治療を担当する医師の判断などの要因に依存することが当業者に認識される。
【００５５】
１つの実施形態によれば、本発明のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を含む組成物を、約０．１ｍｇ／ｍｌを超えるｈＧＨ濃度によって特徴づける。例えば、濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌとの間であり得る。あるいは、組成物を、約１ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間または１０ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間のｈＧＨ濃度によって特徴づけることができる。このような組成物には、以下の成分も含まれる：マンニトール−約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ；酢酸ナトリウム−約５ｍＭ〜約２５０ｍＭ（好ましくは、２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ）；Ｔｒｉｓ ＨＣｌ−約５ｍＭ〜約１００ｍＭ；約ｐＨ６．０〜約ｐＨ９．０（好ましくは、約６．５〜約８．５）；ＰＥＧ（ＭＷ８００〜８０００、好ましくは３３５０、４０００、６０００、または８０００）−０〜約２５％；プロタミン（好ましくは、ｈＧＨ：プロタミン＝３：１）；およびポリアルギニン（好ましくは、ｈＧＨ：ポリアルギニン＝５：１）。このような組成物は、任意選択的に、スクロース−０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ；アミノ酸（例えば、アルギニンおよびグリシン）−０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ；防腐剤（抗菌薬、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラベンゾエート（パラベン））−０％〜約５％（好ましくは０％〜約０．９％）；およびポリソルベート−０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌを含み得る。１つの実施形態によれば、本発明の組成物を、８０％有効負荷によって特徴づける。
【００５６】
本発明の好ましい処方賦形剤は、約１００ｍＭ酢酸ナトリウム、約５％ＰＥＧ６０００ＭＷ、および約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む。このような賦形剤を使用して調製したｈＧＨ組成物は、約９．３５ｍｇ／ｍｌ結晶ｈＧＨおよび約１．８１ｍｇ／ｍｌポリアルギニン（または約３．１２ｍｇ／ｍｌプロタミン）を含み得る。当業者に認識されるように、本発明の組成物のｈＧＨ濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌであり得る場合、ｒｈＧＨ：ポリアルギニン（ｗ／ｗ）比を５：１またはｈＧＨ：プロタミン比（ｗ／ｗ）を３：１に維持し、かつ約５ｎｇ／ｍｌのｈＧＨの低溶解性および放出の維持に十分なように、ポリアルギニン（またはプロタミン）濃度を適宜調製すべきである。例えば、上記処方物のために、所望の結晶ｈＧＨ濃度が約２０ｍｇ／ｍｌである場合、ポリアルギニン（またはプロタミン）濃度は、約４ｍｇ／ｍｌであるべきである。
【００５７】
本発明は、さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の調製方法を提供する。１つのこのような方法は、（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液を結晶化溶液と混合する工程と、前記結晶化溶液が塩およびイオン性ポリマーを含むことと、（ｂ）前記溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶が形成されるまで、約４℃と約３７℃との間の温度で約１２時間を超えてインキュベートする工程とを含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液を結晶化溶液と混合する工程であって、前記結晶化溶液が塩および賦形剤を含む、工程、（ｂ）前記溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶が形成されるまで、約４℃と約３７℃との間の温度で約１６時間を超えてインキュベートする工程とを含む。別の実施形態では、上記いずれかの方法の工程（ｂ）の溶液を、約１５℃の温度で約１週間を超えてインキュベートすることができる。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、カルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶であり、イオン性ポリマーはプロタミンまたはポリアルギニンである。別の実施形態では、イオン性ポリマーは、ポリリジンまたはポリオルチニンである。さらに別の実施形態では、イオン性ポリマーは、任意の２つまたはそれ以上のプロタミン、ポリアルギニン、およびポリリジンの混合物である。
【００５８】
上記方法の工程（ａ）の塩は、１価または２価および無機または有機のいずれかであり得る。２価の塩の好ましい実施形態は、カルシウム塩である。より好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。別の好ましい実施形態では、１価のカチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、１価のカチオンはナトリウムである。
【００５９】
本発明の別の好ましい実施形態では、１価のカチオン塩はナトリウム塩である。より好ましい実施形態では、ナトリウム塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ナトリウム塩は、酢酸ナトリウムである。
【００６０】
上記方法では、塩がカルシウム塩または１価のカチオン塩である場合、塩は、工程（ａ）の結晶化溶液中に、約０．０１ｍＭと約１Ｍとの間の濃度で存在する。好ましい実施形態では、この濃度は、約２５ｍＭと約２０５ｍＭとの間である。塩がカルシウム塩である場合、塩は、工程（ａ）の結晶化溶液中に、約０．０１ｍＭと約２３５ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００６１】
好ましい実施形態では、工程（ａ）の結晶化溶液はｐＨ緩衝剤をさらに含む。より好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ６と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ７．０と約ｐＨ１０との間である。さらにより好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ６と約ｐＨ９との間である。さらにより好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ７．８と約ｐＨ８．９との間である。
【００６２】
上記方法の別の態様では、工程（ａ）のｐＨ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される。上記方法の好ましい実施形態では、工程（ａ）のｐＨ緩衝液は、重炭酸緩衝液、イミダゾール−リンゴ酸緩衝液、グリシン緩衝液、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール（「ビス−ｔｒｉｓ」）緩衝液、炭酸緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、および（Ｎ−（１−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）からなる群から選択される。
【００６３】
上記方法の１つでは、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を調製するために使用される沈殿剤は、典型的には、高分子（低分子量ポリアルコールおよびプロタミンが含まれる）である。本発明の別の実施形態では、上記方法の１つの工程（ａ）の沈殿剤は非イオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、非イオン性ポリマーは、アルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポリビニルアルコール、またはエタノールからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、沈殿剤は、イソプロピルアルコールまたはエタノールである。さらにより好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２００と約８０００との間である。ＰＥＧの分子量は、３３５０、４０００、６０００、または８０００であり得る。より好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は約６０００である。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約０．５％ｗ／ｖと約１２％ｗ／ｖとの間の濃度で存在する。
【００６４】
上記方法の１つの別の実施形態では、工程（ａ）の沈殿剤はイオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、イオン性ポリマーは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびポリリジンからなる群から選択される。
【００６５】
上記方法の混合工程（ａ）は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の溶液を結晶化溶液と混合する工程を含む。この方法の１つの実施形態では、上記結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌと約１，０００ｍｇ／ｍｌとの間である。好ましい実施形態では、前記溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約５０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。さらなる態様では、前記溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約１０ｍｇ／ｍｌと約２５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。
【００６６】
上記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の調製方法の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体および結晶化溶液を含む溶液を、工程（ｂ）において、約３３℃で約０．２５日間と約２日間との間インキュベートする。あるいは、温度は、約３７℃であり得る。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体および結晶化溶液を含む溶液を、約２５℃で約０．２５日間と約２日間との間インキュベートする。さらに別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体および結晶化溶液を含む溶液を、約１５℃で約０．２５日間と約２日間の間インキュベートする。
【００６７】
本発明は、さらに、ｈＧＨの結晶、ｈＧＨ誘導体の結晶、またはこのような結晶および賦形剤を含む組成物の別の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程と、（ｂ）結晶化溶液に脱イオン水と添加する工程と、（ｃ）前記結晶化溶液にイオン性小分子またはイオン性ポリマーを添加する工程と、（ｄ）前記結晶化溶液に塩を添加する工程と、（ｅ）結晶化溶液を、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程とを含む。本発明のさらなる実施形態では、約４時間と約４８時間との間インキュベートする。別の好ましい実施例では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液を、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を形成するまで、約４℃と約４０℃との間で約４時間と約４８時間との間インキュベートする。別の実施形態によれば、工程（ｂ）の後に任意選択的な工程を使用して上記方法を行う。任意選択的工程は、結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程を含む。上記方法のさらなる実施形態では、工程（ｃ）は任意選択的である。これらの任意選択的工程の使用にかかわらず、好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約１５℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間インキュベートする。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約４℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間インキュベートする。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｄ）では、塩はカルシウム塩または１価のカチオン塩である。カルシウム結晶についての好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。好ましい実施形態では、酢酸カルシウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸カルシウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約０．１ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００６９】
より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｄ）における１価のカチオン塩はナトリウムである。同様に、より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は酢酸ナトリウムである。好ましい実施形態では、酢酸ナトリウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸ナトリウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６の間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の酢酸ナトリウムは、約０．５ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約１００ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度で存在する。この濃度はまた、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間であり得る。
【００７０】
さらに別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１７．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約１４．５ｍｇ／ｍｌと約１５．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。さらなる実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。
【００７１】
好ましい実施形態では、上記方法の工程（ａ）の結晶化緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される。あるいは、結晶化緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチルプロパノール）緩衝液、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（３−（［１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、ビシン緩衝液、エタノールアミン緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、タウリン緩衝液、トリアン緩衝液、およびその混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約１０ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００７２】
上記方法の別の実施形態では、工程（ａ）の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間で存在する。好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９との間で存在する。さらに別の好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間で存在する。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９．５との間である。なおさらに好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ９．５との間である。
【００７４】
結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程（ｂ）の後の任意の選択的工程を包含する、方法の好ましい実施形態では、沈殿剤は、非イオン性小分子または非イオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、非イオン性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２００と約８０００、約６０００、約４０００、および約３３５０との間からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約０．５％と約２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度で結晶化溶液中に存在する。上記方法の別の好ましい実施形態では、沈殿剤は、アミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）では、イオン性ポリマーは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびオクタルギニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）では、ポリアルギニンを、５：１と約１：２５との間のｈＧＨ：ポリアルギニン（ｍｇ：ｍｇ）比で添加する。得られた結晶化溶液を、約１５℃と約３７℃との間の範囲の温度で約１６時間〜約４８時間インキュベートする。
【００７６】
本発明は、ヒト成長ホルモンの結晶、ヒト成長ホルモン誘導体の結晶、またはこのような結晶を含む組成物、および賦形剤のさらに別の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程と、（ｂ）前記結晶化溶液に脱イオン水と添加する工程と、（ｃ）前記結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程と、（ｄ）前記結晶化溶液に塩を添加する工程と、（ｅ）結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程と、（ｆ）前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶にイオン性ポリマーを添加する工程とを含む。上記方法の１つの実施形態によれば、工程（ｆ）は任意選択的である。好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約１５℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間でインキュベートする。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約４℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間でインキュベートする。本発明のさらなる実施形態では、約２時間と約４８時間との間インキュベートする。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液を、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶が形成されるまで、約４℃と約４０℃との間で約４時間と約４８時間との間でインキュベートする。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｄ）において、塩はカルシウム塩または１価のカチオン塩である。より好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。好ましい実施形態では、酢酸カルシウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸カルシウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約０．１ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００７８】
より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、１価のカチオン塩はナトリウムである。同様に、より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は酢酸ナトリウムである。好ましい実施形態では、酢酸ナトリウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸ナトリウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６の間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の酢酸ナトリウムは、約０．５ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約１００ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度で存在する。あるいは、この濃度はまた、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間であり得る。
【００７９】
さらに別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１７．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約１４．５ｍｇ／ｍｌと約１５．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。さらなる実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。
【００８０】
好ましい実施形態では、上記方法の工程（ａ）の結晶化緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約１０ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００８１】
上記方法の別の実施形態では、工程（ａ）の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間で存在する。好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９との間で存在する。さらに別の好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間で存在する。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９．５との間である。なおさらに好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ９．５との間である。
【００８３】
好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）において、沈殿剤は、非イオン性小分子または非イオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、非イオン性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２００と約８０００、約６０００、約４０００、および約３３５０との間からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約０．５％と約２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度で結晶化溶液中に存在する。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）において、沈殿剤は、アミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される。
【００８４】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｆ）では、イオン性ポリマーは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびオクタルギニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｆ）では、ポリアルギニンを、約５：１と約１：２５との間のｈＧＨ：ポリアルギニン（ｍｇ：ｍｇ）比で添加する。別の実施形態では、ポリアルギニンを、約１：５と約１：２５との間のｈＧＨ：ポリアルギニン（ｍｇ：ｍｇ）比で添加する。工程（ｆ）で得られた溶液を、約１５℃と約３７℃との間の範囲の温度で約１６時間〜約４８時間インキュベートする。ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の溶解速度に対するポリマーの効果は、完全な溶解に必要な洗浄回数を反映する。コントロール結晶は、完全な溶解ために約７回〜約１３回の洗浄が必要であり、ポリアルギニンで調製した結晶は、完全な溶解のために同一の溶解緩衝液で約３０回〜９０回の洗浄が必要である。洗浄は、連続的溶解プロセス中の洗浄工程である（実施例５を参照のこと）。
【００８５】
任意の上記方法の別の実施形態では、カルシウム塩または１価のカチオン塩は、約０．０１Ｍと約１Ｍとの間または約２５ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度で結晶化溶液中に存在し得る。任意の上記方法の別の実施形態では、結晶化溶液を、約３３℃で約０．２５日間と約２日間との間；約２５℃で約０．２５日間と約２日間との間、および約１５℃で約０．２５日間と約２日間との間からなる群から選択される時間および温度でインキュベートする。
【００８６】
本発明はまた、治療薬の処方物で使用するためのｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶のスクリーニング方法を含む。このような方法の工程は、（１）前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を約３７℃の溶解緩衝液で洗浄する工程と（例えば、２ｍｇの結晶および１ｍｌの溶解緩衝液）、（２）前記溶解緩衝液中での１洗浄あたりの前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度を測定する工程と、前記結晶の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度が約１０分間と約１５００分間との間に結晶の約２％と約１６％との間であり、連続的溶解プロセスにおいて１洗浄あたり約２分間および３２分間であることとを含む（実施例５を参照のこと）。前記結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度はまた、１５分間にわたり前記結晶の約４％と約１０％との間または１５分間にわたり約０．０４ｍｇと約０．３２ｍｇとの間であり得る。
【００８７】
本発明をより深く理解することができるように、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を制限すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【００８８】
（実施例）
下記の実施例で以下の材料を使用した。
【００８９】
（材料）
市販の組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）をＢｒｅｓａＧｅｎ Ｌｔｄ．（Ｔｈｅｂａｒｔｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、平均分子量が４０００または６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００またはＰＥＧ−６０００）を、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、硫酸プロタミンをＦｉｓｈｅｒを介してＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。リン酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸亜鉛、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム、イソプロパノール（ＩＰＡ）、エタノール、およびポリエチレングリコールモノメチルエーテルを、それぞれＦｉｓｈｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）またはＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から入手した。ポリアルギニンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手した。
【００９０】
（分析技術およびアッセイ）
（逆相高速液体クロマトグラフィ）
逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、Ｃ５（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３μｍ）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を具備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を有する。サンプルを、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、および０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）に溶解し、注射前に濾過する（０．２μｍ）。溶媒ＡおよびＢの勾配法を使用して、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで溶離プロフィールをモニタリングした。溶媒Ａは、９９．９％脱イオン水／０．１％ＴＦＡからなる。溶媒Ｂは、９９．９％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡからなる。全てＦｉｓｈｅｒから入手したＨＰＬＣグレードの化学物質であった。４０〜５０％Ｂを０〜２分間、５０〜６０％Ｂを２〜１２分間、および６０〜８５％Ｂを１２〜１５分間の勾配デザインを使用して、１５分間溶離を行った。運転中、流速１ｍｌ／分およびカラム温度３５℃を維持した。ＡｇｉｌｅｎｔＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、データを分析した。
【００９１】
サンプル調製物中のプロタミンまたはポリアルギニンの濃度を、溶媒Ａ（９９．９％脱イオン水／０．１％ＴＦＡ）およびＢ（９９．９％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の勾配法を使用して測定した。９５：５（Ａ：Ｂ）で０〜２．５分間、６５：３５（Ａ：Ｂ）で２．５〜７．５分間、２５：７５（Ａ：Ｂ）で７．５〜１５．５分間、２５：７５（Ａ：Ｂ）で１５．５〜１７．０分間、９５：５（Ａ：Ｂ）で１７〜１７．１分間の勾配デザインを使用して、流速１ｍｌ／分で２０分間溶離した。６．２分でプロタミンまたはポリアルギニンが典型的に溶離され、１４分でインタクトなｈＧＨが溶離された。２１３ｎｍでのＡＵＣを計算した。プロタミンおよび／またはポリアルギニン（ｍｇ／ｍｌ）添加剤の含有率を、各添加物から作成した検量線から計算した。これと同一の方法を使用して、複合体から放出された賦形剤を分析することができる。
【００９２】
異なるが類似する逆相法を使用して、合せた分解ｈＧＨを決定した。例えば、運転中に３７℃のサーモスタット温度を維持しながら、Ｃ５ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅカラム（５ｃｍ×４．６ｍｍ、粒子サイズ３μｍ、孔サイズ３０ｎｍ）にて分析した。移動相Ａ（２０％ ＡＣＮ、８０％Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ）および移動相Ｂ（２０％ ＡＣＮ、８０％２−プロパノール、０．１％ＴＦＡ）を有する勾配法を使用して、溶離プロフィールをモニタリングした。Ｂを０〜５分間で２０％から４５％まで、５〜１５分間で４５％から５５％まで、１５〜１５．１分間で５５％から９０％まで変化させ、１７分までＢを９０％に保持し、本工程直後に２０分に達するまでＢを再度２０％にした。
【００９３】
（サイズ排除高速液体クロマトグラフィ）
サイズ排除クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）は、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（パーツ番号０８４５０，Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ ＬＬＣ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍ）およびＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＭＷＤ（ＵＶ）を具備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を有する。サンプルを、０．２ｍｌの溶解緩衝液に溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ温度制御オートサンプラーに注入する前に０．２μｍで濾過した。移動相を（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３（ｐＨ７．５））を使用して、溶離プロフィールを２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニタリングした。カラム温度を２５℃に保持し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ脱気装置を使用して、溶媒を脱気した。
【００９４】
（ＵＶ−ＶＩＳ吸収および光学顕微鏡法）
Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によってＵＶ−ＶＩＳスペクトロフォトグラムを得た。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５１顕微鏡を使用した明視野で画像化し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｌ．Ｐ．，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用したＳｏｎｙ ＤＸＣ−９７０ＭＤ ３ＣＣＤカラーデジタルビデオカメラでのキャプチャーによって、４０倍〜４００倍の光学顕微鏡写真を得た。
【００９５】
（透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ））
以下のようにＴＥＭ分析を行った。母液中のｈＧＨ結晶の懸濁液を水で２回洗浄して過剰な母液を除去し、その後０．５％酢酸ウラニルで１時間陰性染色を行った。染色されたｈＧＨ結晶懸濁液（１〜５μＬ）を、銅製ＴＥＭグリッド上に移した。過剰な液体を除去し、サンプルグリッドを短時間風乾した。ＴＥＭグリッドを、ＪＥＯＬ １２１０透過電子顕微鏡のサンプルステージに移し、８０ｋＶ電子ビームを使用して画像を収集した。結晶内に結晶プリズム軸と一直線上の方向で非常に組織化された格子構造が認められた。
【００９６】
（実施例１）
（リン酸アンモニウムでのｈＧＨの結晶化）
市販のｈＧＨ（５０ｍｇ）を、最初に１５ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））に溶解し、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１０，０００のＰｉｅｒｃｅ Ｄｉａｌｙｚｅｒカートリッジを使用して２×４０００ｍｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））に対して透析した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した４０００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって、タンパク質濃度を調整した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は、３０〜４５ｍｇ／ｍｌの範囲であることが見出された。溶液に脱イオン水を添加して、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得た。ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の最終濃度が８６０ｍＭとなるような溶液へのリン酸アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが約８〜１５μｍ、結晶収量が９０％を超えることが見出された。図１を参照のこと。
【００９７】
（実施例２）
（クエン酸ナトリウムでのｈＧＨの結晶）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。ｈＧＨの濃縮液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１７．５ｍｇ／ｍｌとした。クエン酸ナトリウム（Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ）の最終濃度が３９０ｍＭとなるような溶液にクエン酸ナトリウム（１．５Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。ｈＧＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ濃度がすでに１０ｍＭであることは別として、ｐＨを調整する必要はなかった。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが約８μｍ未満であり、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図２を参照のこと。
【００９８】
（実施例３）
（リン酸ナトリウムでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１２．５〜１７．５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。Ｎａ２ＨＰＯ４の最終濃度が６００ｍＭとなるような溶液への第二リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが５μｍと２５μｍとの間であり、結晶収量が７５％を超えることが見出された。図３を参照のこと。
【００９９】
（実施例４）
（酢酸カルシウムおよび硫酸プロタミンでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで硫酸プロタミンを添加した。Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液への酢酸カルシウム（Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅ）（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、３７℃で８時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２０μｍ未満であり、結晶収量が７５％を超えることが見出された。図４を参照のこと。
【０１００】
（実施例５）
（塩誘導結晶化によって調製されたｈＧＨ結晶の溶解性プロフィール）
実施例１〜４における結晶化溶液のインキュベーション後、結晶をペレット化し、残りの上清を除去した。３７℃で約１５分間平衡化する前のピペッティングまたはボルテックスのいずれかによって、結晶ペレット（０．４ｍｇ）を０．２００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、および０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）に再懸濁した。次いで、サンプルを、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＵＶ−ＶＩＳによって２８０ｎｍで測定するタンパク質濃度の決定のために上清を完全に除去した。結晶化ペレットを、０．２００ｍｌの溶解緩衝液にさらに再懸濁し、上清中に検出可能なタンパク質が測定されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。このプロセスを、連続希釈という。
【０１０１】
図５は、時間の関数（分）としての上記実施例１〜４において１価（ＮａまたはＮＨ４）または２価（Ｃａ）の塩を使用して調製した種々のｈＧＨ結晶の溶解性挙動を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ由来の累積放出率としてｈＧＨ溶解をプロットし、タンパク質サンプルのＡＵＣ値を、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使用してｍｇ／ｍｌで測定した。データは、３９０ｍＭ Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅの添加によって調製されたｈＧＨ結晶は６０分後に完全に溶解したことを示す。さらに、６００Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４または８６０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の添加によって調製されたｈＧＨ結晶は、それぞれ６０分後または７５分後に完全に溶解する。他方では、８５ｍＭ Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅおよび硫酸プロタミンの添加によって調製されたｈＧＨ結晶は、３９０分後に完全に溶解した（以下の表１を参照のこと）。
【０１０２】
【表１】
（実施例６）
（酢酸カルシウムおよび１０％イソプロパノールでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液へのＣａ−Ａｃｅｔａｔｅ（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。この溶液に、１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）を添加した。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。棒様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが１００μｍを超え、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図６を参照のこと。
【０１０３】
（実施例７）
（塩化カルシウムおよび５％イソプロパノールでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。ＣａＣｌ２の最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液への塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。この溶液に、５％（ｖ／ｖ）ＩＰＡを添加した。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。棒様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２００μｍを超え、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図７を参照のこと。
【０１０４】
（実施例８）
（１０％ＰＥＧ−６０００および１０％エタノールでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。溶液への１０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００および１０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥｔＯＨ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、３７℃で１６時間インキュベートした。棒様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍ未満であり、結晶収量が７０％を超えることが見出された。図８を参照のこと。
【０１０５】
（実施例９）
（アルコールによって調製されたｈＧＨ結晶の溶解性プロフィール）
実施例６〜８で調製された結晶化溶液のインキュベーション後、結晶をペレット化し、残りの上清を除去した。３７℃で約１５分間平衡化する前のピペッティングまたはボルテックスのいずれかによって、結晶ペレットを０．２００ｍｌの溶解緩衝液（実施例５を参照のこと）に再懸濁した。次いで、サンプルを、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＵＶ−ＶＩＳによって２８０ｎｍで測定するタンパク質濃度の決定のために上清を完全に除去した。ｈＧＨ溶解を、累積率として測定し、これはＡＵＶ値またはＵＶ−ＶＩＳのｍｇ／ｍｌ測定値から算出した。結晶化ペレットを、溶解緩衝液にさらに再懸濁し、上清中に検出可能なタンパク質が測定されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１０６】
図９および表２は、時間の関数（分）としての１０％ ＩＰＡ／８５ｍＭ Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅ、５％ ＩＰＡ／８５ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０％ ＥｔＯＨ／１０％ＰＥＧ−６０００で調製したｈＧＨ結晶の溶解性挙動を示す。結果は、１０％ ＩＰＡ／８５ｍＭ Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの添加によって調製したｈＧＨ結晶は１５０分後に完全に溶解するのに対して、５％ ＩＰＡ／８５ｍＭ ＣａＣｌ２および１０％ ＥｔＯＨ／１０％ＰＥＧ−６０００の添加によって調製したｈＧＨ結晶はそれぞれ１２０分および１３５分で完全に溶解することを示す。
【０１０７】
【表２】
（実施例１０）
（酢酸カルシウムおよび２％ＰＥＧ−６０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液へのＣａ−Ａｃｅｔａｔｅ（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍと約７５μｍとの間であり、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図１０を参照のこと。
【０１０８】
（実施例１１）
（酢酸ナトリウムおよび６％ＰＥＧ−６０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が５００ｍＭとなるような溶液への酢酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ）（２Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍと約７５μｍとの間であり、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図１１を参照のこと。
【０１０９】
（実施例１２）
（塩化カルシウムおよび６％ＰＥＧ−６０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。ＣａＣｌ２の最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液へのＣａＣｌ２（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが１００μｍを超え、結晶収量が９０％を超えることが見出された。図１２を参照のこと。
【０１１０】
（実施例１３）
（酢酸カルシウム、６％ＰＥＧ−６０００、および硫酸プロタミンでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）および６％ＰＥＧ−６０００（ｖ／ｖ）を添加した。酢酸カルシウムの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液への酢酸カルシウム（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、３７℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍ未満であり、結晶収量が７０％を超えることが見出された。図１３を参照のこと。
【０１１１】
（実施例１４）
（酢酸カルシウムおよび６％ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコールモノメチルエーテル−５０００（ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００）を添加した。酢酸カルシウムの最終濃度が１２５ｍＭとなるような溶液への酢酸カルシウム（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが５０μｍ未満であり、結晶収量が９０％を超えることが見出された。図１４を参照のこと。
【０１１２】
（実施例１５）
（ポリエチレングリコールを使用して調製されたｈＧＨ結晶の溶解性プロフィール）
実施例１０〜１４で調製された結晶化溶液のインキュベーション後、結晶をペレット化し、残りの上清を除去した。３７℃で約１５分間平衡化する前のピペッティングまたはボルテックスのいずれかによって、結晶ペレットを０．２ｍｌの溶解緩衝液（実施例５を参照のこと）に再懸濁した。次いで、サンプルを、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＵＶ−ＶＩＳによって２８０ｎｍで測定するタンパク質濃度の決定のために上清を除去した。結晶化ペレットを、溶解緩衝液にさらに再懸濁し、上清中に検出可能なタンパク質が測定されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１１３】
図１５および表３は、時間の関数（分）としての２％ ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ 酢酸カルシウム、６％ ＰＥＧ−６０００／５００ｍＭ 酢酸ナトリウム、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ ＣａＣｌ２、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ 酢酸カルシウム／プロタミン、および６％ ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００／１２５ｍＭ 酢酸カルシウムで調製したｈＧＨ結晶の溶解性挙動を示す。ｈＧＨ溶解を、蓄積率として測定し、ＡＵＣ値またはＵＶ−ＶＩＳｍｇ／ｍｌ測定値から算出した。結果は、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ 酢酸カルシウム／プロタミンの添加によって調製したｈＧＨ結晶は最も溶解が遅く、４９５分後に完全に溶解した。２％ ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ酢酸カルシウム結晶についての他の結晶は３００分で溶解するか、他のｈＧＨ結晶についてはより短かった。
【０１１４】
【表３−１】
【０１１５】
【表３−２】
（実施例１６）
（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した薬物動態学試験）
２．５ｍｇ／ｋｇの可溶性（市販）または結晶（８５ｍＭ 酢酸カルシウム／２％ ＰＥＧ−６０００）ｈＧＨを実施例１０に記載のように調製し、懸濁液を、２４匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに皮下投与した。各ラットの平均体重は２００ｇであった。２４匹のラットを、２つの群に分けた。各群は、３群のサブセットを含んでおり、それぞれ４匹のラットを含む。３回の特定の測定点で、各サブセット内の頸動脈インプラントを介して採血した。所与の時点で採取することができる血液量は限られているので、リープフロッグデザインを使用した。動物の安定性を維持するために、上記測定点で群内の動物サブセットから採血した。次いで、血清サンプルをコンパイルして、線形累進時系列を形成した。サブセットの平均からの所与の測定点でのサブセット内の血清レベルの分散によって標準偏差を決定した。表４〜６を参照のこと。表４〜５では、１〜１２と命名した動物に可溶性ｈＧＨを、動物１３〜２４に結晶化ｈＧＨを、各動物に対して５００μｇの用量で投与した。
【０１１６】
図１６は、可溶性および結晶化ｈＧＨについての時間の関数としての血清ｈＧＨレベルを示す。結晶化ｈＧＨの半減期は、可溶性ｈＧＨのほぼ１９倍であった。血清中で最大ｈＧＨが認められた時間は、結晶化ｈＧＨについては４時間であり、可溶性ｈＧＨについては０．５時間であった。ラットの群およびサブセットを５．５ｍｇ／ｍｌ（２．２ｍｇ．ｋｇに相当する用量）の濃度の可溶性ｈＧＨまたは結晶ｈＧＨで処置した場合、以下の表６で列挙したＣｍａｘ値は、結晶形態で輸送させた場合、ｈＧＨは、同一の可溶性の用量と比較した場合に最大血清濃度が有意に減少したことを示す。また、可溶性ｈＧＨと結晶ｈＧＨとの総血清レベルのＡＵＣは類似しており、結晶化によって生物学的利用能は有意に影響を受けないことを示した。可溶性および結晶の両結果についてＴ９０％値を計算した。このパラメーターは、総ＡＵＣの９０％が起こる時間を示す。Ｔ９０％値が高いほど、薬物がより長く血清中に留まることを示す。表６に含まれるＴ９０％の結果は、結晶形態により、可溶性形態よりもｈＧＨレベルの上昇が有意に長くなることを明白に示す。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
【表６】
（実施例１７）
（ｈＧＨ結晶の溶解特性に対する硫酸プロタミンの効果）
図１７は、既存のカルシウムｈＧＨ結晶溶液への所与の量の硫酸プロタミンの添加から１時間のインキュベーション後に３７℃の溶解緩衝液中に溶解する実施例１０にしたがって調製したｈＧＨ結晶（８５ｍＭ酢酸カルシウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６））の量を示す。ｈＧＨ：プロタミン（ｍｇ：ｍｇ）比を、図１７に示す。グラフは、プロタミンがｈＧＨ結晶の溶解に有意に影響を与えることを示す。
【０１２０】
（実施例１８）
（酢酸ナトリウムでのｈＧＨの結晶化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のストック溶液由来のｒｈＧＨの個別の分析によって、その供給源に関係なく同一の結晶化および溶解性を有するｒｈＧＨが得られた。約３．３ｍｌ（未知の緩衝液中で供給された１０〜２０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＨ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｍｌである全容液中での脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−６０００、および酢酸ナトリウムのそれぞれの最終濃度が１００ｍＭ、６％（ｖ／ｖ）、および５００ｍＭでの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。ニードルまたは棒様結晶が得られ、ＴＥＭで画像化した（図１８Ａおよび１８Ｂを参照のこと）。結晶の長さは、約２〜２５μｍの範囲であった。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、８５％を超える結晶収量が測定された。３３℃と１５℃の間の温度で結晶を形成させることもできるが、より長い結晶化時間を必要とし、おそらく収率が低い。
【０１２１】
（実施例１９）
（ナトリウムｈＧＨ結晶とイオン性ポリマー添加剤との複合体化）
結晶収量の決定後（実施例１８を参照のこと）、ナトリウムｒｈＧＨ結晶の最終濃度が２１ｍｇ／ｍｌとなるように、母液（２５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６％ＰＥＧ−６０００、および７ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンまたは４．２ｍｇ／ｍｌポリアルギニン）にナトリウムｒｈＧＨ結晶を再懸濁した。ｒｈＧＨ：硫酸プロタミンについてのタンパク質：添加剤の比は、約３：１（ｍｇ：ｍｇ）であり、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについては５：１（ｍｇ：ｍｇ）であった。これらの比は、ｒｈＧＨ：プロタミンについては約１：１．７１５、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについては約１：０．５８７のモル比であると計算される。上記ｒｈＧＨペレットを、適切な母液に均一に再懸濁し、遠心分離前に２〜８℃で一晩インキュベートして濃縮ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを同一の母液（イオン性ポリマー添加剤を含まない）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１２２】
母液の添加剤濃度（ｍｇ／ｍｌ）を変化させながら２１ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨを依然として再懸濁することによってさらなるｒｈＧＨ：イオン性ポリマー添加剤比を得ることができる。例えば、母液中の硫酸プロタミン濃度の増加（１０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して、再懸濁時のｒｈＧＨ：添加剤比を２：１にすることができる。
【０１２３】
（実施例２０）
（酢酸亜鉛でのｈＧＨの結晶化。酢酸亜鉛およびアセトンでのｒｈＧＨの結晶化）
約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（１０ｍＭ（ｐＨ６．１））での洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．１）を添加した。４．５ｍｌ量の脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで５〜１０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は１５ｍｇ／ｍｌの範囲であった。１５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含む１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．１）への脱イオン水、８．９１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．１）、０．８８ｍｇ／ｍｌ酢酸亜鉛、９．８９％アセトンを含む４００μｌの母液の添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、１５℃で２４〜４８時間インキュベートした。幅が約２〜２５μｍの六角形様結晶が得られた。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、結晶収量は約５５％と測定された。
【０１２４】
（実施例２１）
（酢酸カルシウムでのｈＧＨの結晶化およびカルシウムｈＧＨとイオン性ポリマー添加剤（ポリアルギニン）との複合体化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。約３．５ｍｌ（１２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＨを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終濃度が１５ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＨ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２％（ｖ／ｖ） ＰＥＧ−６０００、および８５ｍＭ 酢酸カルシウムであるようなｒｈＧＨ（３０ｍｇ／ｍｌストック調製物）への１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０％ ＰＥＧ−６０００、および１Ｍ 酢酸ナトリウムの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。ニードル様結晶の長さは、約２〜２５μｍの範囲であった。上清の抽出ならびに結晶の遠心分離およびペレット化後、結晶収量は８５％を超えていた。３３℃と１５℃の間の温度で結晶を形成させることもできるが、より長い結晶化時間を必要とし、収率が低い。結晶収量の決定後（実施例１８を参照のこと）、カルシウムｒｈＧＨ結晶の最終濃度が２１ｍｇ／ｍｌとなるように、処方賦形剤（５ｍＭ ＣａＯＡｃ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６％ＰＥＧ−６０００、および４．２ｍｇ／ｍｌポリアルギニン）にカルシウムｒｈＧＨ結晶を再懸濁した。ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについてのタンパク質：添加剤の比は、約５：１（ｍｇ：ｍｇ）であった。これらの比は、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについて約１：０．５８７のモル比であると計算される。上記ｒｈＧＨペレットを、適切な母液に均一に再懸濁し、遠心分離前に２〜８℃で一晩インキュベートして濃縮ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを同一の母液（イオン性添加剤を含まない）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１２５】
（実施例２２）
（Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットおよびｈＧＨの２価のカチオン結晶を使用した、皮下投与したｈＧＨの薬物動態学および薬力学試験）
本試験の目的は、下垂体摘出Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるｈＧＨ結晶懸濁液の皮下移植時のｈＧＨ結晶懸濁液からのｈＧＨの放出および体重増加の制御を評価することであった。試験デザインを以下に示した。
【０１２６】
【表７】
到着時に、体重が約１５０ｇ±２５ｇであり、かつ約４〜６週齢である８０匹の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、制御された条件下（約２１±３℃、相対湿度５０±２０％、それぞれ２４時間で１２時間の明所および１２時間の暗所、１時間あたり１０〜１５回の換気）で個別に飼育し、試験期間中、精製水および固形試料を自由に利用させた。ラットを、試験前に１週間環境に馴化させた。
【０１２７】
表７にしたがって、８０匹のラットのうち４８匹にｈＧＨ懸濁液を投与した。試験化合物を、背中への単回皮下ボーラス注射として、１日目に１回または７日間毎日１回投与した。注射を容易にするために必要な場合、注射部位の毛を剃り、投与前後３日までマークした。３００μｌシリンジに取りつけた３０ゲージ×８ｍｍニードルを使用して、試験化合物を投与した。シリンジへの取り出し前および投与前に気泡を形成することなく懸濁液または溶液を確実に均一にするために、試験化合物を慎重に逆にした。注射体積は、ラットあたり約０．１ｍｌであった。
【０１２８】
１日目の注射から４時間後、３２時間後、９６時間後、および１６８時間後に、第１群、第５群、第７群、および第８群（群あたりそれぞれ３匹のラットを有する）のラットから血液サンプルを採取した。第２群、第３群、第４群、および第９群（それぞれ群あたり９匹のラット有する）のラット由来の血液サンプルを、３匹のラットを有する３つの群にさらに分けた。ここでは、第１日目の注射から０．５時間後、２４時間後、７２時間後、および１６８時間後にラットの第１のサブセットから、４時間後、３２時間後、９６時間後、および１６８時間後に第２のサブセットから、および８時間後、４８時間後、１２０時間後、および１６８時間後に第３のサブセットから血液サンプルを採取した。一般的には、非麻酔ラットまたはＣＯ２／Ｏ２麻酔ラットの眼窩を介して採血し、血清分離器を使用してＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブに回収した。次いで、サンプルを、約４℃で遠心分離し、血清を回収し、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルの測定前に凍結保存した（約−８０℃）。
【０１２９】
次いで、血清サンプルをコンパイルし、第２群、第３群、第４群、および第９群の場合、線形累進時系列を形成した。サブセットの平均からの所与の測定点でのサブセット内の血清レベルの分散によって標準偏差を決定した。表８〜１４および図１９Ａを参照のこと。特定の結晶処方物を投与した場合、ｒｈＧＨの血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。試験プロトコールにしたがって、投与に関連する特定の測定点で動物を採血した。結果は、複合体化結晶材料（例えば、プロタミンおよびポリアルギニン）の吸収と非複合体化結晶処方物（例えば、ＣａＯＡＣおよびＺｎＯＡＣ）との間に差が存在することを明らかに示す。
【０１３０】
【表８】
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
【表１０】
【０１３３】
【表１１】
【０１３４】
【表１２】
【０１３５】
【表１３】
試験１日目の注射前および試験の翌朝の採血前に再度各ラットの重量を測定し、記録した。したがって、各群内の各ラットの体重の増減を、１日目の体重（注射前）から各翌日（注射前）を引くことによって計算した。群内の全ラットの平均体重を毎日計算した。これらの結果を、表１４に示す。
【０１３６】
【表１４】
表１４および図１９Ｂは、市販のｈＧＨの毎日用量の投与と比較した本発明の結晶の単回用量（１日目）の投与の７日間の効果を示す。例えば、図１９Ｂは、ポリアルギニンと複合体化したｈＧＨのカルシウム結晶により同一の期間にわたる１回のみの投薬する毎日の可溶性用量に匹敵する体重増加が得られることを示す。体重増加と血清中のｒｈＧＨの各放出プロフィールとの比較により、ポリアルギニン処方物のより長い放出は体重増加速度のさらなる持続と相関することが明らかである。
【０１３７】
（実施例２３）
（雌幼若カニクイザルにおける薬力学比較試験）
本試験の目的は、雌カニクイザルに皮下投与した場合の結晶組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学プロフィールを評価することであった。血清中の結晶ｒｈＧＨの制御放出および結晶ｒｈＧＨ放出の関数としての体重増加についてのモデルを確立するためにこれらのデータを得た。
【０１３８】
【表１５】
１２匹の雌幼若カニクイザルを、３つの群（群あたりそれぞれ４匹の動物を有する）に分け、可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびポリアルギニンとのナトリウム結晶（群２、実施例１８および１９による）、またはｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（群３、実施例１８および１９による）のいずれかを投与した。治療開始時に体重が２〜６ｋｇで４〜７歳の範囲のサルを、自動給水システムまたは水差しを備えたステンレススチール製ケージに個別に飼育した。動物の室内環境を制御し（約２１±３℃、湿度３０〜７０％、各２４時間周期で１２時間の明所および１２時間の暗所、および１時間あたり１２〜２０回の換気）、サルに標準的な認定された市販の霊長類固形試料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ＃２０５５Ｃ）を１日２回与えた。
【０１３９】
可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびポリアルギニンとのナトリウム結晶（群２）、またはｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（群３）の投与後のｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度を測定および比較するために、この霊長類試験を行った。上記表１５に示す移動時および投与前の全動物の体重を記録した。血液サンプル（約１ｍｌ）を、−２１６日目、−１２０日目、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、２４日目、４８日目、７２日目、９６日目、１２０日目、１４４日目、１６８日目、１９２日目、２１６日目、２４０日目、２６４日目、２８８日目、および３１２日目の朝に大腿部、上腕、または伏在静脈を介して各動物から採取した。血清分離チューブに採血し、凝血するまで室温で３０〜４５分間静置し、２〜８℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各血清サンプルを１００μｌ量に分注し、残りの量と両方を、分析前に−７０℃±１０℃で保存した。一般的には、ｒｈＧＨ決定にはより少量の１００μｌ量を使用し、ＩＧＦ−１決定にはより大きな量を使用した。必要な複製物の体積により、いくつかの例外が存在する。
【０１４０】
次いで、回収した血清サンプルを、ｈＧＨ濃度について分析した（表１６を参照のこと）。標準値の範囲外のｒｈＧＨ濃度を適切に希釈した。全値を使用して、霊長類ＧＨの動物平均バックグラウンドレベルあたりの個体を得ることができる。動物平均あたりの個体を、この試験化合物についての各測定点で測定した血清レベルから差し引いた。次いで、測定点あたりの修正値を、血清中のｒｈＧＨの修正平均を得るために平均化した。次いで、修正平均の標準偏差の使用およびＮ＝４の平方根で割ることによって標準誤差を計算した。
【０１４１】
【表１６】
図２０Ａは、ベースライン調整後の群１、２、および３についての時間（時間）の関数としての血清のｒｈＧＨレベルを示す。
【０１４２】
【表１７】
上記データは、血清中に認められる最大ｈＧＨ（Ｔｍａｘ）時の時間は、ポリアルギニン複合体化結晶ｈＧＨでは１０時間であり、プロタミン複合体化ナトリウム結晶ｈＧＨについては１０時間であり、可溶性ｈＧＨについては２時間であることを示す。可溶性ｈＧＨを１／７の用量の結晶投与で輸送する場合でさえ、上記表１７に列挙したＣｍａｘ値は、いずれかの複合体化結晶形態で輸送された場合、ｈＧＨは初期血清濃度の急上昇を有意に減少させることを示す。さらに、可溶性および結晶群のＴ９０％値を計算した。群１（可溶性形態）のＴ９０％は２０時間であり、群２および３（複合体化結晶形態）のＴ９０％は、それぞれ７４時間および７７時間であった。これらの結果は、複合体化結晶形態により可溶性形態よりも有意により長い期間ｈＧＨレベルを上昇させることを明白に示す。
【０１４３】
ｈＧＨの血清濃度の決定に加えて、時間の関数としてもＩＧＦ−１レベルを測定した。ＩＧＦ−１産生の測定により、ｒｈＧＨの有効性を確認した。以下の表１８は、群１〜３に動物についてのＩＧＦ−１濃度を報告する。図２０Ｂは、内因性ＩＧＦ−１レベルのベースラインを引いた後に、複合体化結晶処方物が毎日の可溶性投与に匹敵するＩＧＦ−１放出の刺激能力を示す。これらの結果は、非ヒト霊長類では、本発明の処方物を有利に使用してヒトにおいて類似の有効性を達成することができることを示す。
【０１４４】
【表１８−１】
【０１４５】
【表１８−２】
（実施例２４）
（異なるプロタミン比を使用した雌幼若カニクイザルにおける薬力学比較試験）
本試験の目的は、雌カニクイザルに皮下投与した場合の結晶組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学プロフィールを評価することであった。ナトリウムｈＧＨとプロタミンとの比が血清中の結晶ｒｈＧＨの制御放出および結晶ｒｈＧＨ放出の関数としての体重増加に効果があるかを試験するためにこれらのデータを得た。
【０１４６】
【表１９】
霊長類試験ＩＩでは、霊長類試験Ｉに記載の１２頭の雌幼若カニクイザルを、３つの群（群あたりそれぞれ４頭の動物を有する）に分け、可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝３：１）（群２）（実施例１８および１９）、またはｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝２：１）（群３）のいずれかを投与した（実施例１８および１９）。治療開始時に体重が２〜６ｋｇで４〜７歳の範囲のサルを、自動給水システムまたは水差しを備えたステンレススチール製ケージに個別に飼育した。動物の室内環境を制御し（約２１±３℃、湿度３０〜７０％、各２４時間周期で１２時間の明所および１２時間の暗所、および１時間あたり１２〜２０回の換気）、サルに標準的な認定された市販の霊長類固形試料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ＃２０５５Ｃ）を１日２回与えた。
【０１４７】
可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝３：１）（群２）、およびｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝２：１）（群３）の投与後のｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度を測定および比較するために、この霊長類試験を行った。上記表１９に示す移動時および投与前の全動物の体重を記録した。血液サンプル（約１ｍｌ）を、−１４４日目、−１２０日目、−９６日目、−７２日目、−４８日目、−２４日目、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、２４日目、４８日目、７２日目、９６日目、１２０日目、１４４日目、１６８日目、１９２日目、２１６日目、２４０日目、２６４日目、２８８日目、および３１２日目の朝に大腿部、上腕、または伏在静脈を介して各動物から採取した。血清分離チューブに採血し、凝血するまで室温で３０〜４５分間静置し、２〜８℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各血清サンプルを１００μｌ量に分注し、残りの量の両方を、分析前に−７０℃±１０℃で保存した。
【０１４８】
採取された血清サンプル中のｈＧＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を分析し、ベースライン修正を行った（表２０のデータを参照のこと）。標準値の範囲外のｒｈＧＨ濃度を適切に希釈することに留意のこと。全値を使用して、霊長類ｈＧＨの動物平均バックグラウンドレベルあたりの個体を得ることができる。動物平均あたりの個体を、この試験化合物についての各測定点で測定した血清レベルから差し引いた。次いで、測定点あたりの修正値を、血清中のｒｈＧＨの修正平均を得るために平均化した。次いで、修正平均の標準偏差の使用およびＮ＝４の平方根で割ることによって標準誤差を計算した。
【０１４９】
【表２０】
図２１Ａは、ベースライン調整後の群１、２、および３についての時間（時間）の関数としての血清ｒｈＧＨレベルを示す。
【０１５０】
【表２１】
これらのデータは、血清中に認められる最大ｈＧＨ時の時間は、プロタミン（３：１）複合体化結晶ｈＧＨでは１０時間であり、プロタミン（２：１）複合体化ナトリウム結晶ｈＧＨについては２４時間であり、可溶性ｈＧＨについては４時間であることを示す。可溶性ｈＧＨを１／７の用量の結晶投与で輸送する場合、上記表２２に列挙したＣｍａｘ値は、いずれかの複合体化結晶形態で輸送された場合、ｈＧＨは最大血清濃度を有意に減少させることを示す。群１（可溶性形態）のＴ９０％は２０時間であり、群２および３（複合体化結晶形態）のＴ９０％は、それぞれ１１９時間および７２時間であった。これらの結果は、複合体化結晶形態により可溶性形態よりも有意により長い期間ｈＧＨレベルを上昇させることを明白に示す。
【０１５１】
ｈＧＨの血清濃度の測定に加えて、時間の関数としてもＩＧＦ−１レベルを測定した。ＩＧＦ−１産生の測定により、ｒｈＧＨの有効性を確認した。以下の表２２は、群１〜３の動物についてのＩＧＦ−１濃度を報告する。図２１Ｂは、内因性ＩＧＦ−１レベルのベースラインを引いた後に、複合体化結晶処方物が毎日の可溶性投与に匹敵するＩＧＦ−１放出の刺激能力を示す。これらの非ヒト霊長類の結果は、本発明の処方物を有利に使用してヒトにおいて類似の有効性を達成することができることを示す。
【０１５２】
【表２２】
（実施例２５）
（下垂体摘出雌ラットへの単回または毎日の皮下注射によって投与したヒト成長ホルモンの薬力学試験）
本試験の目的は、下垂体摘出雄Ｗｉｓｔａｒラットに１回または７日間毎日皮下注射した場合にｈＧＨの異なる処方物の有効性を比較することであった。試験デザインを以下に示した。
【０１５３】
【表２３−１】
【０１５４】
【表２３−２】
【０１５５】
【表２４】
到着時に、体重が約９０〜１００ｇであり、かつ約２５〜３０日齢である１３８匹のＷｉｓｔａｒラットを、制御された条件下（約２３±３℃、相対湿度３０〜７０％、２４時間で１２時間の明所および１２時間の暗所、１時間あたり１０〜１５回の換気）で群毎に飼育し、試験中、精製水および固形試料を自由に摂取させた。ラットを、試験前に２週間環境に馴化させた。
【０１５６】
表２４に記載の濃度、体積、および投与計画にしたがって、１３８匹のラットにサンプルを投与した。試験化合物を、背中への単回皮下ボーラス注射として、１日目に１回または７日間毎日１回投与した。注射を容易にするために必要な場合、注射部位の毛を剃り、投与前後３日まで印をつけた。３００μｌシリンジに取りつけた３０ゲージ×８ｍｍニードルを使用して、試験化合物を投与した。シリンジへの取り出し前および投与前に気泡を形成することなく懸濁液または溶液を確実に均一にするために、試験化合物を慎重に逆にした。
【０１５７】
−３週目および−２週目で１週間に２回および−７日目から１４日目まで毎日体重増加を測定し、記録した。ラットの体重は、投与時に約１００ｇ±１０％であった。成長誘導発率の結果を図２２および２３に示し、表２５および２６にまとめる。表２５では、「高用量」は、５．６ｍｇ／ｋｇ／週を示す。データは、コントロール（群１、ｈＧＨなし）または可溶性ｈＧＨサンプル（群４および５）の７日間にわたる毎日の注射に対するｒｈＧＨ：ポリアルギニン（群７、実施例１８および１９）結晶またはｒｈＧＨ：プロタミン（群９および１０、実施例１８および１９）結晶の７日間にわたる単回注射を実施したラットの体重増加の比較を示す。群１（偽下垂体摘出ラット）は、７日間にわたり正常な成長を示す。さらに、７日間にわたる１回の注射でｒｈＧＨ：ポリアルギニンを投与したラット（群７）は、可溶性ｈＧＨを７日間毎日投与したラット（群５）よりも誘導成長率が高かった。これらの結果は、本発明のｈＧＨ結晶および処方物は１週間にわたる毎日の可溶性ｒｈＧＨ投与と同様に有効であることを示す。
【０１５８】
【表２５】
【０１５９】
【表２６】
（実施例２６）
（酢酸ナトリウムおよび硫酸プロタミンでのｈＧＨの結晶化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のストック溶液由来のｒｈＧＨの個別の分析によって、その供給源に関係なく同一の結晶化および溶解性を有するｒｈＧＨが得られた。約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｍｌである全容液中での脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、硫酸プロタミン、および酢酸ナトリウムのそれぞれの最終濃度が１００ｍＭ、６％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍｌ、および５００ｍＭでの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。長さが約２〜２５μｍのニードル様結晶が得られた。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、９０％を超える結晶収量が測定された。
【０１６０】
（実施例２７）
（酢酸ナトリウムおよびポリアルギニンＨＣｌのｈＧＨの結晶化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のストック溶液由来のｒｈＧＨの個別の分析によって、その供給源に関係なく同一の結晶化および溶解性を有するｒｈＧＨが得られた。約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｍｌである全容液中での脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、ポリアルギニンＨＣｌ、および酢酸ナトリウムのそれぞれの最終濃度が１００ｍＭ、２％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍｌ、および５００ｍＭでの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。長さが約２〜２５μｍのニードル様結晶が得られた。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、９０％を超える結晶収量が測定された。
【０１６１】
上記発明は、理解をより明確にする目的で例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、記載の実施形態を含む本明細書の開示の精神または範囲を逸脱する事なく一定の変更形態および修正形態を得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶およびこれを含む組成物または処方物に関する。さらに、本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶の生成方法を提供する。本発明の結晶は、特に、ヒト成長ホルモン欠損症に関連するか、またはヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する哺乳動物の治療方法で有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ソマトトロピンすなわち、成長ホルモン（「ＧＨ」））は、内分泌系の主な腺（腺下垂体）によって脳内で合成および分泌される刺激ホルモンクラスを含む哺乳動物タンパク質である。腺下垂体によるＧＨおよび他の刺激ホルモンの分泌により、体内の他の内分泌腺および組織中の細胞の活動が制御される。詳細には、ＧＨは、下垂体前葉の成長ホルモン産生細胞によって分泌され、ＩＧＦ−１（細胞分裂を調節するタンパク質）を合成および分泌するように肝臓および他の組織を刺激するように機能し、代謝過程を制御し、遊離状態で存在するか、ＩＧＦＢＰ−１〜６と呼ばれる６つの他のタンパク質のうちの１つと結合する。それ自体の分泌過程は、ソマトリベリン（ＧＨ放出を促進する）およびソマトスタチン（ＧＨ放出を阻害する）の相反する作用によって調整される。
【０００３】
ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）は、細胞および器官の成長の制御および種々の加齢段階での生理学的機能において重要なホルモンとして作用するので、特に興味深い。例えば、ｈＧＨの過剰産生により、小児では巨人症を発症し、成人では先端巨大症を発症するのに対し、過小産生により、小児では、小人症（Ｍａｕｒａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８５（１０），３６５３−３６６０（２０００）；Ｆｒｉｎｄｉｋら、Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１），１５−１９（１９９９）；Ｌｅｇｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８３（１０），３５１２−３５１６（１９９８））Ｔｕｒｎｅｒ‘ｓ Ｓｙｍｄｒｏｍｅ（ｆｅｍａｌｅｓ ｏｎｌｙ）（Ｂｒａｍｓｗｉｇ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５（１），５−１３（２００１）；Ｐａｓｑｕｉｎｏら、Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（６），２６９−２７２（１９９６））、およびｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｃａｒｒｏｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１１（６），２３１−２３８（２０００）；Ｕｅｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８７（６），２７６０−２７６３（２００２）；Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ ＩＧＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１−３３（２００２））を発症する。成人では、ｈＧＨ欠損症は、タンパク質、炭水化物、脂質、無機質、および結合組織の代謝過程に影響を与え、筋肉、骨、または皮膚の萎縮症を発症させ得る（Ｍｅｈｌｓ ａｎｄ Ｈａａｓ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ＩＧＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ，Ｓ３１−Ｓ３７（２０００）；Ｆｉｎｅら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３６（３），３７６−３８２（２０００）；Ｍｏｔｏｙａｍａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２（２），１６２−１６５（１９９８））。成長不全によって特徴づけられる他のｈＧＨ欠損障害には、ＡＩＤＳ消耗症候群（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，２１５−２２１（１９９６）；Ｔｒｉｔｏｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０５（１），４４−５７（１９９８）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２３（６），Ｓ２０２−Ｓ２０９（１９９９）；Ｔｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｃａｄｍａｎ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１４（２），８３−９１（２０００））、およびＰｒａｄｅｒｗｉｌｌｉ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｒｉｔｚｅｎ，Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５−６），２０８（２００２）；Ｅｉｈｏｌｚｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１５７（５），３６８−３７７（１９９８））が含まれる。
【０００４】
今日まで、ヒトのｈＧＨ欠損症の治療計画は、主に、組換えＤＮＡテクノロジーによって作製された精製ｈＧＨの皮下注射にフォーカスしている。この治療薬は、カートリッジ中の溶液または使用時に再構成が必要な凍結乾燥粉末のいずれかとしてパッケージングされている。注射頻度は、治療をうける疾患および使用される市販の製品に依存して変化する。例えば、小人症は、組換えｈＧＨの毎日の皮下注射によって治療する。
【０００５】
溶液中でのタンパク質の固有の不安定性により、ｈＧＨの迅速な輸送経路として皮下投与を使用する必要がある。この不安定性は、タンパク質のアミノ酸配列内の特定の位置での重要な分子内架橋の切断、言い換えれば、患者の細胞表面によって認識および関連する不可欠な三次元構造の破壊に起因する。ｈＧＨの切断機構または分解機構は、主に、メチオニン残基の酸化または溶解時のアスパラギン酸残基の脱アミド化、それによるタンパク質の不活化によって調整される。この脆弱性により、安定かつ長期に作用し、かつ皮下だけでなく他の従来の投薬経路（経口経路、真皮経路、および静脈内経路など）によっても輸送することができるｈＧＨ組成物または処方物が当該分野で必要とされる。
【０００６】
この必要性に取り組むための多数の市販のｈＧＨ製品が開発されている。例えば、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）は、ポリラクチド−コグリコリド（ＰＬＧ）ミクロスフィア中に包埋した組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の注射用懸濁液である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｃｏｍを参照のこと）。ｒｈＧＨおよびＰＬＧに加えて、ミクロスフィアは、酢酸亜鉛および炭酸亜鉛成分も含む。投与前に、固体材料を、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ポリソルベート、塩化ナトリウム、および水を含む水溶液で再構成しなければならない。ほとんどがポリマーから構成されるこの懸濁液を、１ヶ月に１回または２回投与し、注射には２１ゲージのニードルが必要である。ミクロスフィアのサイズおよび製品の種々の性質により、注射部位に副作用を起こし、小節、紅斑、疼痛、紫斑、痒み、脂肪細胞萎縮症、および腫脹を生じ得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ／ｎｕｔｒｏｐｉｎ−ｄｅｐｏｔ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐを参照のこと）。
【０００７】
開発されたが、その後製造中止になった別のｈＧＨ製品はＡｌｂｕｔｒｏｐｉｎＴＭ（長時間作用型の遺伝的に産生されたヒトアルブミンとヒト成長ホルモンとの融合タンパク質）である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｉ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ．ｈｔｍｌを参照のこと）。この製品は、長期循環半減期を示し、可溶性の天然ｈＧＨの半減期よりもおよそ５０％長いといわれている。ＡｌｂｕｔｒｏｐｉｎＴＭは、典型的には、１週間を基本として注射によって輸送され、身体からのクリアランス後長期にわたりＩＧＦ−１レベルを刺激するといわれている。この製品の生物学的作用は、現在利用可能な成長ホルモン療法の生物学的作用と類似する。
【０００８】
開発された別の製品は、Ｉｎｆｉｔｒｏｐｉｎ ＣＲＴＭ（ポリエチレングリコール抱合ｈＧＨ分子から構成されるｈＧＨの処方物）であった。この抱合ｈＧＨは１週間に１回注射する必要があり、有意なバースト効果（ｂｕｒｓｔ ｅｆｆｅｃｔ）を起こすことなく連続的に放出されるといわれていた（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（３６），２１６９６−２１９７７（１９９６））。しかし、この製品は製造中止になった。
【０００９】
米国特許第５，９８１，４８５号および同第６，４４８，２２５号は、再構成工程を必要とせず、かつ毎日の注射によって投与されるといわれているｈＧＨの水性処方物を言及している。このような処方物は、典型的には、ｈＧＨ、緩衝液、非イオン性界面活性剤、および任意選択的に中性塩、マンニトール、または防腐剤を含む。
【００１０】
ヒドロゲル（Ｋａｔａｋａｍら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，４９（１），２１−２６（１９９７））、リポソーム、油性乳濁液、および生分解性ポリマーミクロスフィアなどの種々の他の薬物輸送テクノロジーがｈＧＨの薬物放出の目的で使用されている。しかし、得られた処方物は、薬物のバースト放出を示し、厳しい条件を使用し、製造が複雑なものもある。ミクロスフィアの生成に使用するプロセスは、高温、界面活性剤、有機溶媒、および水性溶媒／有機溶媒境界（これらは全てタンパク質を変性させる）などの条件を使用する傾向があるので、これは、特に、ＤＬ−乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ミクロスフィアテクノロジーに基づいたｈＧＨ処方物についても当てはまる（Ｈｅｒｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２３，８３５−８３６（１９９６）；Ｋｉｍら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２２９（１−２），１０７−１１６（２００１））。
【００１１】
いくつかの上記調製物は、ｈＧＨを凍結乾燥状態で保存する必要があり、これは時間がかかり、かつ高価なプロセスであり得る。米国特許第５，７８０，５９９号および同第６，１１７，９８４号は、ｈＧＨの２価のカチオン結晶および凍結乾燥工程を必要としないｈＧＨの２価のカチオン結晶の生成方法を言及している。
【００１２】
従来のｈＧＨ製品の欠点（保存および注射時の不安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の短さ、バースト効果、経口生物学的利用能の欠如、ならびに投与の困難さおよび頻度が含まれる）に取り組む努力にもかかわらず、改良されたｈＧＨ調製物が必要である。この必要性に取り組むために、本発明は、安定かつ長期に作用するｈＧＨが得られるヒト成長ホルモンの結晶を有利に提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の安定かつ長期に作用する便利で患者に優しい結晶に関する。本発明は、さらに、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶の組成物（その薬学的に許容可能な組成物が含まれる）を提供する。本発明は、さらに、このような結晶およびこのような結晶を含む組成物の調製方法を提供する。本発明の結晶および組成物は、ヒト成長ホルモン欠損症に関連するかヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する個体の治療方法で有利に使用される。
【００１４】
ヒト成長ホルモンもしくはヒト成長ホルモン誘導体の結晶または結晶を含む組成物あるいは処方物は、いくつかの利点（１週間に１回の投与能力、即時使用できる結晶懸濁形態、安全性、有効性、純度、安定性、再懸濁可能性、および短時間でのシリンジ利用可能性が含まれる）を有する。本発明の他の目的（従来のｈＧＨ調製物と比較したｈＧＨ結晶およびこれを含む組成物または処方物の改良が含まれる）は、本明細書中の開示を考慮して当業者に認識される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶。
（項目２）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の１価のカチオン結晶。
（項目３）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のプロタミン結晶。
（項目４）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のポリアルギニン結晶。
（項目５）
前記１価のカチオンが、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される、項目２に記載の１価のカチオン結晶。
（項目６）
前記１価のカチオンがナトリウムである、項目５に記載の１価のカチオン結晶。
（項目７）
前記結晶の哺乳動物への単回投与によって、
（ａ）約０．３ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、
（ｂ）約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、および
（ｃ）約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨからなる群から選択される該哺乳動物のｉｎ ｖｉｖｏでの血清ｈＧＨ濃度を、
（ｉ）投与後約０．５時間と約４０日間との間、
（ｉｉ）投与後約０．５時間と約１０日間との間、
（ｉｉｉ）投与後約０．５時間と約７日間との間、および
（ｉｖ）投与後約０．５時間と約１日間との間からなる群から選択される期間で得られる、項目１、項目２、項目３、または項目４のいずれか１項に記載の結晶。
（項目８）
前記結晶の哺乳動物への単回投与によって、
（ａ）約５ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ、および
（ｂ）約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌからなる群から選択される投与前の哺乳動物のベースラインＩＧＦ−１レベルを超えるｉｎ ｖｉｖｏでの血清ＩＧＦ−１上昇を、
（ｉ）投与後約０．５時間と約４０日間との間、および
（ｉｉ）投与後約０．５時間と約７日間との間からなる群から選択される期間で得られる、項目１、項目２、項目３、または項目４のいずれか１項に記載の結晶。
（項目９）
前記結晶の相対生物学的利用能が、同一の投与経路を介して輸送される同一用量の可溶性ｈＧＨと比較して少なくとも５０％またはそれ以上であり、該生物学的利用能を該可溶性ｈＧＨおよび該結晶についてのｉｎ ｖｉｖｏでの総血清ｈＧＨ濃度のＡＵＣによって測定された、項目１、項目２、項目３、または項目４のいずれか１項に記載の結晶。
（項目１０）
前記哺乳動物がヒトである、項目７または項目８に記載の結晶。
（項目１１）
前記結晶が、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体あたり約１個から約５００個までのカルシウム分子を含む、項目１に記載の結晶。
（項目１２）
前記結晶が、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体あたり約１個から約５００個までの１価のカチオンを含む、項目２に記載の結晶。
（項目１３）
前記結晶が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、およびグルコン酸カル
シウムからなる群から選択されるカルシウム塩を含む、項目１に記載の結晶。
（項目１４）
前記カルシウム塩が酢酸カルシウムである、項目１３に記載の結晶。
（項目１５）
前記結晶が、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択されるナトリウム塩を含む、項目６に記載の結晶。
（項目１６）
前記ナトリウム塩が酢酸ナトリウムである、項目１５に記載の結晶。
（項目１７）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶および賦形剤を含む組成物において、該結晶が、
（ａ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶、
（ｂ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の１価のカチオン結晶、
（ｃ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体プロタミン結晶、および
（ｄ）ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のポリアルギニン結晶からなる群から選択される、組成物
（項目１８）
前記結晶および前記賦形剤が前記組成物中にｈＧＨ：賦形剤のモル比が約１：１０〜約１：０．１２５で存在する、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記賦形剤が、アミノ酸、塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される、項目１７に記載の組成物。
（項目２０）
前記賦形剤が、プロタミン、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン、グルコン酸カルシウム、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、デンドリマー、ポリオルチニン、ポリエチレンイミン、キトサン、およびその混合物からなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記賦形剤が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリエチレングリコール、およびその混合物からなる群から選択される、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記組成物中のヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の濃度が、
（ａ）約０．１ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間、
（ｂ）約１ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間、および
（ｃ）約１０ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間、からなる群から選択される、項目１７に記載の組成物。
（項目２３）
ヒト成長ホルモン欠損症に関連するかヒト成長ホルモン治療によって改善する障害を有する哺乳動物を治療するための方法であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量の項目１、項目２、項目３、もしくは項目４のいずれか１項に記載の結晶または項目１７に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
哺乳動物の体重増加を誘導する方法であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量の項目１、項目２、項目３、もしくは項目４のいずれか１項に記載の結晶または項目１７に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）
前記哺乳動物が下垂体摘出ラットであり、週１回の注射による前記結晶の投与後の該ラットで誘導された体重増加が５％と約４０％との間である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記障害が、成人成長ホルモン欠損症、小児成長ホルモン欠損症、プラダー・ウィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎機能不全、特発性低身長、小人症、下垂体性小人症、骨再生、女性不妊症、胎内発育遅延、ＡＩＤＳ関連悪液質、クローン病、および火傷からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記障害が小児成長ホルモン欠損症であり、前記方法により前記哺乳動物の年率換算の成長率が約７ｃｍと約１１ｃｍとの間になる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記結晶または組成物を、経口経路、非経口経路、皮下経路、または筋肉内経路によって前記哺乳動物に投与する、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記結晶または組成物を、２７またはそれ以上のゲージのニードルを使用した皮下経路によって前記哺乳動物に投与する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記結晶または組成物を、無針注射器またはメタ用量注入ポンプによって前記哺乳動物に投与する、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目３１）
前記結晶または組成物を、
（ａ）３日毎に約１回、
（ｂ）１週間に約１回、
（ｃ）２週間毎に約１回、および
（ｄ）１ヶ月毎に約１回からなる群から選択される時間治療計画によって前記哺乳動物に投与する、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目３２）
前記哺乳動物がヒトである、項目２３または項目２４に記載の方法。
（項目３３）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化溶液とを混合する工程であって、該結晶化溶液が、カルシウム塩または１価のカチオン塩およびイオン性ポリマーを含み、該イオン性ポリマーがプロタミンまたはポリアルギニンである、工程、
（ｂ）該結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶が生成されるまで約４℃と約３７℃との間の温度で約１２時間を超えてインキュベートする工程とを包含する、方法。
（項目３４）
前記イオン性ポリマーがポリリジンである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記イオン性ポリマーが、任意の２つまたはそれ以上のプロタミン、ポリアルギニン、およびポリリジンの混合物である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程、
（ｂ）該結晶化溶液に脱イオン水と添加する工程、
（ｃ）該結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程と、
（ｄ）該結晶化溶液にカルシウム塩または１価のカチオン塩を添加する工程と、
（ｅ）該結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間の温度で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程、
（ｆ）該ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶にイオン性ポリマーまたはイオン性小分子を添加する工程とを包含する、方法。
（項目３７）
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程、
（ｂ）該結晶化溶液に脱イオン水を添加する工程、
（ｃ）該結晶化溶液にイオン性小分子またはイオン性ポリマーを添加する工程、
（ｄ）該結晶化溶液にカルシウム塩または１価のカチオン塩を添加する工程、
（ｅ）該結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間の温度で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程とを包含する、方法。
（項目３８）
前記方法が、工程（ｂ）の後かつ工程（ｃ）の前に、前記結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程を包含する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記カルシウム塩が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記カルシウム塩が酢酸カルシウムである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記１価のカチオンが、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記１価のカチオンがナトリウムである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記１価のカチオン塩が、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記１価のカチオン塩が酢酸ナトリウムである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記結晶化溶液がｐＨ緩衝液をさらに包含する、項目３３に記載の方法。
（項目４６）
前記ｐＨ緩衝液のｐＨが、
（ａ）約ｐＨ６と約ｐＨ１０との間、
（ｂ）約ｐＨ７．０と約ｐＨ１０との間、
（ｃ）約ｐＨ６と約ｐＨ９との間、および
（ｄ）約ｐＨ７．８と約ｐＨ８．９との間からなる群から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ｐＨ緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群か
ら選択される緩衝液である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記沈殿剤が、非イオン性小分子または非イオン性ポリマーである、項目３６または項目３８に記載の方法。
（項目４９）
前記非イオン性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリエチレングリコールの分子量が、
（ａ）約２００と約８０００との間の分子量、
（ｂ）約６０００の分子量、
（ｃ）約４０００の分子量、および
（ｄ）約３３５０の分子量からなる群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ポリエチレングリコールが、前記結晶化溶液中に、約０．５％と約２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度で存在する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記沈殿剤が、アミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３８に記載の方法。
（項目５３）
前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体が、前記結晶化溶液中に、
（ａ）約１ｍｇ／ｍｌと約１，０００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度、
（ｂ）約２ｍｇ／ｍｌと約５０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度、
（ｃ）約１０ｍｇ／ｍｌと約２５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度からなる群から選択される濃度で存在する、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記カルシウム塩または前記１価のカチオン塩が、前記結晶化溶液中に、
（ａ）約０．０１Ｍと約１Ｍとの間の濃度、および
（ｂ）約２５ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度からなる群から選択される濃度で存在する、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記結晶化溶液は、
（ａ）約３３℃で約０．２５日間と約２日間との間、
（ｂ）約２５℃で約０．２５日間と約２日間との間、および
（ｃ）約１５℃で約０．２５日間と約２日間との間からなる群から選択される時間および温度でインキュベートされる、項目３３、項目３６、または項目３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記イオン性小分子が、アミノ酸、ペプチド、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目５７）
前記イオン性ポリマーが、プロタミン、ポリサッカリド、ポリアミノ酸、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリグルタミン酸塩、デンドリマー、ポリオルチニン、ポリエチレンイミン、キトサン、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目５８）
前記イオン性ポリマーが、プロタミンまたはポリアルギニンである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記結晶化溶液は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶または１価のカチオン結晶が形成されるまで、約４℃と約４０℃の間の温度で約４時間と約４８時間との間インキュベートされる、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６０）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体が、前記結晶化溶液中に、約２ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６１）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体が、前記結晶化溶液中に、約１４．５ｍｇ／ｍｌと約１５．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６２）
前記結晶化緩衝液が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＭＰ緩衝液、ＡＭＰＤ緩衝液、ＡＭＰＳＯ緩衝液、ビシン緩衝液、エタノールアミン緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、タウリン緩衝液、トリアン緩衝液、およびその混合物からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６３）
項目３６に記載の工程（ａ）または項目３７に記載の工程（ａ）において、前記結晶化緩衝液が、前記結晶化溶液中に、約１０ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６４）
工程（ａ）において、前記結晶化緩衝液のｐＨが、
（ａ）約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間、
（ｂ）約ｐＨ６と約ｐＨ９との間、および
（ｃ）約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間からなる群から選択される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６５）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記結晶化溶液中の結晶化緩衝液のｐＨにより、前記溶液が、
（ａ）約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間、
（ｂ）約ｐＨ６と約ｐＨ９．５との間、および
（ｃ）約ｐＨ７．５と約ｐＨ９．５との間からなる群から選択されるｐＨとなる、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目６６）
前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される、項目６４または項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記酢酸カルシウムが、
（ａ）約ｐＨ３．０と約ｐＨ９．０との間、および
（ｂ）約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間からなる群から選択されるｐＨを有する水溶液の形態である、項目４０に記載の方法。
（項目６８）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記酢酸カルシウムが、
（ａ）約０．１ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度、および
（ｂ）約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間の濃度からなる群から選択される濃度で前記結晶化溶液中に存在する、項目４０に記載の方法。
（項目６９）
前記酢酸ナトリウムが、
（ａ）約ｐＨ３．０と約ｐＨ９．０との間、および
（ｂ）約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間からなる群から選択されるｐＨを有する水溶液の形態である、項目４４に記載の方法。
（項目７０）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記酢酸ナトリウムが、
（ａ）約０．５ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度、および
（ｂ）約１００ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度からなる群から選択される濃度で前記溶液中に存在する、項目４５に記載の方法。
（項目７１）
項目３６に記載の工程（ｅ）または項目３７に記載の工程（ｅ）において、前記溶液は、約４℃と約３７℃との間の温度で約１日間と約２日間との間インキュベートされる、項目３６または項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、光学顕微鏡によって画像化した８６０ｍＭリン酸アンモニウム（ｐＨ８．９）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１を参照のこと。
【図２】図２は、光学顕微鏡によって画像化した３９０ｍＭクエン酸ナトリウムの存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例２を参照のこと。
【図３】図３は、光学顕微鏡によって画像化した６００ｍＭ第二リン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例３を参照のこと。
【図４】図４は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ酢酸カルシウムおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させ、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）で同時結晶化したｈＧＨ結晶を示す。実施例４を参照のこと。
【図５】図５は、時間の関数としておよび２８０ｎｍでモニタリングした、リン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、および酢酸カルシウム／プロタミン沈殿剤から作製したｈＧＨの溶解性を示す。実施例５を参照のこと。
【図６】図６は、光学顕微鏡によって画像化した１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、８５ｍＭ酢酸カルシウム、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例６を参照のこと。
【図７】図７は、光学顕微鏡によって画像化した５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、８５ｍＭ塩化カルシウム、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例７を参照のこと。
【図８】図８は、光学顕微鏡によって画像化した１０％（ｖ／ｖ）エタノール、１０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例８を参照のこと。
【図９】図９は、時間（分）の関数として２８０ｎｍでモニタリングした実施例６〜８にしたがって成長させたｈＧＨ結晶の溶解性を示す。実施例９を参照のこと。
【図１０】図１０は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ酢酸カルシウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１０を参照のこと。
【図１１】図１１は、光学顕微鏡によって画像化した５００ｍＭ酢酸ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１１を参照のこと。
【図１２】図１２は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ塩化カルシウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１２を参照のこと。
【図１３】図１３は、光学顕微鏡によって画像化した８５ｍＭ酢酸カルシウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させ、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）で同時結晶化したｈＧＨ結晶を示す。実施例１３を参照のこと。
【図１４】図１４は、光学顕微鏡によって画像化した１２５ｍＭ酢酸カルシウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−ＭＭＥ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１４を参照のこと。
【図１５】図１５は、時間（分）の関数として２８０ｎｍでモニタリングした実施例１０〜１４にしたがって成長させたｈＧＨ結晶の溶解性を示す。実施例１５を参照のこと。
【図１６】図１６は、ラットあたり２．５ｍｇ／ｋｇの可溶性または結晶ｈＧＨの単回皮下投与から２４時間後にサンプリングした雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける市販のｈＧＨ（可溶性ｈＧＨ）および実施例１０にしたがって調製したｈＧＦＨ（結晶ｈＧＨ）の血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。ｔ＝０、０．５、１、２、４、６、８、１２、および２４時間で血清レベルを測定した。実施例１６を参照のこと。
【図１７】図１７は、種々の量の硫酸プロタミンの添加時のｈＧＨ結晶（８５ｍＭ酢酸カルシウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で形成）の溶解特性を示す。次いで、ｈＧＨ結晶のこれらの種々の処方物を、溶解緩衝液に添加し、１時間静置し、その後上清中の可溶性ｈＧＨの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣ法（Ａｒｅａ）によって測定した。実施例１７を参照のこと。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＴＥＭよって長手方向に画像化した５００ｍＭ酢酸ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１８を参照のこと。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＴＥＭよって断面を画像化した５００ｍＭ酢酸ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下で成長させたｈＧＨ結晶を示す。実施例１８を参照のこと。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ラットあたり６．７ｍｇ／ｋｇのｈＧＨの７日間にわたる毎日の皮下投与または７日間にわたる単回投与のいずれかから１６８時間後（０〜７２時間を示す）にわたりサンプリングした雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの第３群〜第５群および第９群におけるｈＧＨの血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。実施例２２および表７〜１２を参照のこと。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ラットあたり６．７ｍｇ／ｋｇのｈＧＨの７日間にわたる毎日の皮下投与（第２群）または７日間の第１日目における単回皮下投与（第４群および第９群）のいずれかから８日後にわたる選択処方物（第２群、第４群、および第９群）の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの体重増加（ｇ）を示す。実施例２２および表１３を参照のこと。
【図２０Ａ】図２０Ａは、表１６にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、ポリアルギニンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第３群）を毎日皮下投与した雌幼若カニクイザルについての時間の関数としての血清ｈＧＨ濃度を示す。実施例２３を参照のこと。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、表１８にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、ポリアルギニンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（第３群）を毎日皮下投与した雌幼若カニクイザルについての時間の関数としての血清ＩＧＦ−１濃度を示す。実施例２３を参照のこと。
【図２１Ａ】図２１Ａは、表２０にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、プロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝３：１）（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝２：１）（第３群）を毎日皮下投与した幼若雌カニクイザルについての時間の関数としての血清ｈＧＨ濃度を示す。実施例２４を参照のこと。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、表２２にしたがって、可溶性ｈＧＨ（第１群）、プロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝３：１）（第２群）、およびプロタミンと複合体化したｈＧＨのナトリウム結晶（ｈＧＨ：プロタミン＝２：１）（第３群）を毎日皮下投与した雌幼若カニクイザルについての時間の関数としての血清ＩＧＦ−１濃度を示す。実施例２４を参照のこと。
【図２２】図２２は、表２５に従って、コントロール（第１群、７日間にわたり毎日１回）、可溶性ｈＧＨ（第４群および第５群、７日間にわたり毎日１回）、および結晶ｈＧＨ（第６群、第７群、第９群、および第１０群、７日間にわたり１回）を皮下投与した雄Ｗｉｓｔａｒラットの７日間の成長を示す。実施例２５を参照のこと。
【図２３】図２３は、表２６に従って、コントロール（第１群、７日間にわたり毎日１回）、可溶性ｈＧＨ（第４群および第５群、７日間にわたり毎日１回）、および結晶ｈＧＨ（第６群、第７群、第９群、および第１０群、７日間にわたり１回）皮下投与した雄Ｗｉｓｔａｒラットの７日間にわたる毎日の誘導体重増加（ｇ）を示す。実施例２５を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中の他で定義しない限り、本発明に関連して使用した科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するべきである。さらに、他の文脈で必要でない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるべきである。一般に、本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィ、光学顕微鏡法、ＵＶ−ＶＩＳ分光法、薬物動態学分析、組換えＤＮＡ法、ペプチドおよびタンパク質化学、核酸化学、および分子生物学と共におよびその技術で使用される用語は当該分野で周知であり、かつ一般的に使用されている用語である。
以下の用語は、他で示さない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
【００１７】
用語「成長ホルモン（ＧＨ）」は、一般に、哺乳動物下垂体によって分泌される成長ホルモンをいう。完全なリストではないが、哺乳動物の例には、ヒト、類人猿、サル、ラット、ブタ、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、およびヤギが含まれる。本発明の好ましい実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
【００１８】
「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」は、天然のヒト成長ホルモンに特徴的なアミノ酸配列、構造、および機能を有するタンパク質を示す。本明細書中で使用される、「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」には、天然のヒト成長ホルモンの任意のイソ型（分子量が５ｋＤａ、１７ｋＤａ、２０ｋＤａ、２２ｋＤａ、２４ｋＤａ、３６ｋＤａ、および４５ｋＤａのイソ型が含まれるが、これらに限定されない）も含まれる（Ｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８））。したがって、用語ｈＧＨには、天然のｈＧＨ（ソマトトロピン）の１９１個のアミノ酸配列およびＮ末端メチオニンを含む１９２個のアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）およびソマトレムが含まれる（米国特許第４，３４２，８３２号および同第５，６３３，３５２号）。生物源からの単離および精製または組換えＤＮＡ法によってｈＧＨを得るとことができる。組換えＤＮＡテクノロジーによって作製される場合、ｈＧＨは組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）と呼ぶ。Ｍｅｔ−ｈＧＨは、典型的には、組換えＤＮＡ法によって調製する。
【００１９】
用語「ヒト成長ホルモン誘導体」は、天然に存在するヒト成長ホルモンに類似のアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。用語「類似の」は、ｈＧＨの１９１個のアミノ酸配列またはＭｅｔ−ｈＧＨの１９２個のアミノ酸配列と２％と１００％との間で相同なアミノ酸配列をいう。本発明の種々の実施形態では、ヒト成長ホルモン誘導体は、ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨの有機カチオン、生物学的に合成されたｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質の置換、欠失、および挿入変異型、翻訳後修飾ｈＧＨおよびＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質（脱アミド化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、凝集、および酵素切断反応が含まれる）（Ｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８））、生物源由来の化学修飾ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質、ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨに類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドアナログおよび化学合成ペプチドを含む。
【００２０】
ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨを調製するために使用する方法には、生物源からの単離、組換えＤＮＡ法、合成化学経路、またはその組み合わせが含まれる。今日まで、ｈＧＨの異なるＤＮＡ配列をコードする遺伝子には、ｈＧＨ−ＮおよびｈＧＨ−Ｖが含まれる（Ｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８）；Ｂｅｎｎａｎｉ−Ｂａｉｔｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，６４７−６５２（１９９５））。
【００２１】
用語「原子価」は、他の元素と組み合わされて原子の最外殻の電子数によって予想され、その原子と結合する（または置換する）ことができる水素原子（または任意の他の標準的な１価の元素）の数として示される元素の能力と定義する（Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｄ．ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ Ｔ．Ｈ．，Ｅｄｓ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８）。用語「１価のカチオン」および「２価のカチオン」は、それぞれ１つまたは２つの原子価状態を有する正電荷のイオンをいう。異なる原子価状態を有するカチオンは、事実上有機または無機であり得る。１価の無機カチオンの例には、アンモニウム（ＮＨ４＋）および周期表の１族の元素（Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、およびＦｒ＋）が含まれ、２価の無機カチオンには、２族の元素（Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｍｏ２＋、およびＲａ２＋）が含まれる。
【００２２】
「ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶」は、２価のカルシウムイオンの存在下で結晶化されたヒト成長ホルモンまたはその誘導体をいう。２価のカルシウムイオンを、カルシウム塩として結晶化溶液に導入する。好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体または単量体鎖あたり約１個から約５００個までのカルシウム分子を含む。より好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のカルシウム結晶は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体または単量体鎖あたり約１個から約１４０個までのカルシウム分子を含む。
【００２３】
用語「カルシウム塩」には、カルシウムイオンとイオン結合を形成する無機および有機の対イオンまたは分子の両方が含まれる。異なるカルシウム塩の例には、酢酸カルシウム水和物、酢酸カルシウム１水和物、カルシウムアセチルアセトン水和物、Ｌ−アスコルビン酸カルシウム２水和物、カルシウムビス（６，６，７，７，８，８，８−ヘプタフルオロ−２，２−ジメチル−３，５−オクタンジオネート）、カルシウムビス（２，２，６，６，−テトラメチル−３，５−ヘプタンジオネート）、臭化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化カルシウム２水和物、塩化カルシウム６水和物、塩化カルシウム水和物、クエン酸カルシウム４水和物、リン酸二水素カルシウム、２−エチルヘキサン酸カルシウム、フッ化カルシウム、グルコン酸カルシウム、水酸化カルシウム、次亜塩素酸カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ化カルシウム水和物、カルシウムイオノフォアＩ、モリブデン酸カルシウム、硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、シュウ酸カルシウム水和物、酸化カルシウム、パントテン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、および硫酸カルシウムが含まれる。本発明の好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、およびグルコン酸カルシウムからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウムである。
【００２４】
「ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の有機カチオン結晶」は、有機カチオンの存在下で結晶化したヒト成長ホルモンをいう。用語「有機カチオン」は、炭素を含む正電荷の原子または原子群をいう。有機カチオンの例には、第四級アンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、トリブチルメチルアンモニウム（ＴＢｕＭＡ）、臭化エチルプロカインアミド（ＰＡＥＢ）、メトヨウ化アジドプロカインアミド（ＡＰＭ）、ｄ−ツボクラリン、メトクリン、ベクロニウム、ロクロニウム、１−メチル−４−フェニルピリジニウム、コリン、およびＮ−（４，４−アキソ−ｎ−ペンチル）−２１−デオキシアジュマリニウム（ＡＰＤＡ）が含まれる。
【００２５】
ｈＧＨは凍結乾燥形態で市販されており、典型的には、組換えＤＮＡ法で製造されている。本発明によれば、ｈＧＨの結晶化は、一般に、ｈＧＨの緩衝化溶液の調製、精製および／または脱塩、溶液の透析および濃縮、ならびに溶液への１価または２価のカチオンもしくは塩の添加によって行われる。後者の工程により、ｈＧＨに結合した有機または無機カチオンが形成される。
【００２６】
本発明の１つの好ましい実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の１価のカチオン結晶に関する。より好ましい実施形態では、１価のカチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、１価のカチオンはナトリウムである。最も好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の単量体または単量体鎖あたり約１個から約５００個までのカチオン分子を含む。
【００２７】
用語「１価のカチオン塩」には、１価のイオンとイオン結合を形成する無機および有機の対イオンまたは分子の両方が含まれる。好ましい実施形態では、１価のカチオン塩はナトリウム塩である。より好ましい実施形態では、ナトリウム塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、ナトリウム塩は酢酸ナトリウムである。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のプロタミン結晶に関する。同様に、さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のポリアルギニン結晶に関する。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施形態は、プロタミンまたはポリアルギニンと複合体化または同時結晶化したｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の１価または２価の結晶を含む。より好ましくは、結晶は、プロタミンまたはポリアルギニンと複合体化または同時結晶化したナトリウム結晶である。
【００３０】
ｈＧＨの可溶性形態を、種々の方法（逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、および疎水性クロマトグラフィ（ＨＩＣ）が含まれる）によって特徴づけることができる（Ｗｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５００，５９５−６０６（１９９０）；「Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｄｒｕｇｓ」，ＦＤＡ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，（１９８２））。他方では、ｈＧＨの結晶形態を、光学顕微鏡法およびＸ線回折によって特徴づけることができる。一般に、結晶化条件は、タンパク質結晶の形状（すなわち、球体、針状、棒状、平面（六方晶系および四角形）、長斜方形、立方体、両錐、および角柱からなる群から選択される形状）で決定される。
【００３１】
本発明のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、光学顕微鏡法を使用して画像化した場合、棒様形態または針様形態を形成している。１つの実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約０．１μｍと約２００μｍとの間の長さの棒形態または針形態を形成する。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約３μｍと約１００μｍとの間の長さの棒形態または針形態を形成する。より好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約１０μｍと約２５μｍとの間の長さの棒形態または針形態を形成する。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のカルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。さらに別の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤は、ｈＧＨ：賦形剤のモル比が約１：２５０〜約１：２０でこのような組成物中に存在する。別の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤は、ｈＧＨ：賦形剤のモル比が約３：１〜約１：１０で存在する。さらに別の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤は、ｈＧＨ：賦形剤のモル比が約１：１０〜約１：０．１２５で存在する。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、ポリアルギニンまたはプロタミンで結晶化またはコーティングすることができる酢酸ナトリウムで成長させる。
【００３３】
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶を、任意の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることができる。本発明によれば、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、薬学的組成物中で使用される充填剤または充填剤の組み合わせとして作用する賦形剤である。このカテゴリーに含まれる好ましい賦形剤は、以下である：１）グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリンなどのアミノ酸、２）炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボースなどのモノサッカライドなど）、３）ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースなどのジサッカリド、４）マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲンなどのポリサッカリド、５）マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトールなどのアルジトール、６）グルクロン酸、ガラクツロン酸、７）メチルシクロデキストリン、およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、８）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、ホウ酸、炭酸アンモニウム、ならびにリン酸アンモニウムなどの無機分子、９）酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩などの有機分子、１０）アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロクサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシルエチレン誘導体、ソルビタン誘導体などの乳化剤または可溶化剤／安定剤、ならびに１１）寒天、アルギン酸およびその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールなどの増粘剤。このような化合物の塩も使用することができる。さらに好ましい賦形剤群には、スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、マンニトール、イノシトール、ナトリウムおよびカリウム塩（酢酸、リン酸、クエン酸、およびホウ酸など）、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリリジン、およびポリアルギニンが含まれる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態では、賦形剤は、アミノ酸、塩、アルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、賦形剤は、プロタミン、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン、グルコン酸カルシウム、ポリアミノ酸（ポリアルギニン、ポリリジン、およびポリグルタミン酸など）、ポリエチレングリコール、デンドリマー、ポリオルチニン、ポリエチレンイミン、キトサン、およびその混合物からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、賦形剤は、プロタミン、ポリアルギニン、ポリエチレングリコール、およびその混合物からなる群から選択される。
【００３５】
本発明のヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶を、キャリアまたは賦形剤（治療薬に添加した場合にその作用を促進するか改良する物質）と組み合わせることもできる（Ｔｈｅ Ｏｎ− Ｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｗｅｂ．ｎｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｏｍｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。キャリアまたは賦形剤の例には、例えば、リン酸などの緩衝剤、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、または電解質（硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛片、コロイド状シリカ、マグネシウム、トリシリケート、セルロースベースの物質、およびポリエチレングリコールなど）が含まれる。ゲルベース形態のキャリアまたは賦形剤には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、およびウッドワックスアルコールが含まれ得る。
【００３６】
さらにより好ましい実施形態では、賦形剤はプロタミンである。さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体およびプロタミンの結晶は、ｈＧＨ：プロタミン比が約５：１〜約１：１０（ｗ／ｗ）で存在する。この比はまた、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。最も好ましくは、この比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は、約３：１と約１：１０との間（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、この比は、約５：１と約４０：１との間（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、この比は、約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００３７】
本発明の別の態様では、薬学的に許容可能な賦形剤は、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアルギニン、およびポリグルタミン酸が含まれる）からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態では、賦形剤はポリリジンである。より好ましい実施形態では、ポリリジンの分子量は、１，５００ｋＤと約８，０００ｋＤとの間である。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体およびポリリジンの結晶は、ｈＧＨ：ポリリジン比が約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）で存在する。この比はまた、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。より好ましくは、この比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は、約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、この比は、約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００３８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、賦形剤はポリアルギニンである。より好ましい実施形態では、ポリアルギニンの分子量は、約１５，０００ｋＤと約６０，０００ｋＤとの間である。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体およびポリアルギニンの結晶は、ｈＧＨ：ポリアルギニン比が約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）で存在する。この比はまた、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。より好ましくは、この比は、約１２：１〜約３：１（ｗ／ｗ）の範囲である。別の実施形態によれば、この比は、約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、この比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、この比は、約５：１（ｗ／ｗ）である。
【００３９】
本発明の１つの実施形態は、約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を含む注射用結晶懸濁液を含む。この懸濁液は、再懸濁の容易さ、ゆっくりとした沈殿、および約７日間の時間作用プロフィールによって特徴づけられる。これを、３０ゲージのシリンジを使用して１週間に１回注射することができ、８０％の有効負荷レベルが得られる。０．０２％の凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および２．３％の関連タンパク質（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のパラメーターを反映させたところ、この懸濁液は純粋である。この純度を、冷蔵条件下で少なくとも４ヶ月維持する。
【００４０】
本発明の１つの実施形態は、個体に導入した場合に従来の可溶性ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の処方物と比較して遅延した溶解挙動を示すことが特徴づけられたｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶に関する。本発明によれば、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の溶解を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ溶解パラメーターのいずれかによって特徴づける。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解は、１５分間あたりまたは連続的溶解プロセス中の洗浄工程あたりに得られる可溶性ｈＧＨの濃度（最初に存在する全ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶比率またはｍｇとして示す）と説明される（実施例５を参照のこと）。本発明の１つの実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、３７℃で溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、および０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）への曝露時の洗浄工程あたり約２％と約１６％との間の結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度によって特徴づけ、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、溶液中に約２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、連続的溶解プロセスにおける洗浄工程あたり約０．０４ｍｇ〜約０．３２ｍｇの前記結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度によって特徴づける（実施例５を参照のこと）。他方では、ｉｎ ｖｉｖｏ溶解を、哺乳動物へのｈＧＨの単回注射後の長期にわたる哺乳動物内での血清ｈＧＨレベルによって説明する。
【００４１】
哺乳動物では、ＧＨは、ＩＧＦ−１（言い換えると、細胞分裂および代謝過程で役割を果たすタンパク質）を合成および分泌するように組織を刺激する。当業者に認識されているように、血清ｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルは、多数の要因（生理学的および治療関連因子が含まれる）に依存する。このような要因には、以下が含まれるが、これらに限定されない：年齢および骨年齢、性別、体重、発達段階（例えば、思春期でのレベルの増加）などの生理学的要因ならびに用量、投与速度（速度）および投与経路などの治療関連要因。また、当業者は、安全性および有効性の両観点から、異なる患者集団には異なるｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルが有利であり得ることを認識する。
【００４２】
種々のｈＧＨ機能不全、病態、または症候群を罹患した成人または小児を、本発明のｈＧＨ結晶またはｈＧＨ誘導体結晶を使用した種々のｈＧＨの外因的輸送治療計画によって治療することができる。例えば、内分泌学者は、小児には、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週の用量、治療の数週間または数ヵ月後に約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に増加させた用量、思春期あたりで約０．７ｍｇ／ｋｇ／週にさらに増加させた用量を使用して治療を開始することができる。当業者に認識されるように、ｈＧＨ輸送を必要とする成人または小児に投与されたｈＧＨのこのような外因的輸送レベルはまた、ｈＧＨの既存の生理学的レベルまたは濃度に依存する。
【００４３】
成人または小児におけるｈＧＨの投薬計画は、通常ｍｇ／ｍｌまたは国際単位（ＩＵ／ｋｇ）で示される。このような治療計画を、一般に、日または週のいずれかについて計画する（すなわち、ｍｇ／ｋｇ／日またはｍｇ／ｋｇ／週）。これらを考慮して、本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与（例えば、３０ｋｇの小児あたり約９ｍｇの毎週の単回投与）により、ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与１日後および２日後に約１０ｎｇ／ｍｌを超え、投与３日後および４日後に約５ｎｇ／ｍｌを超え、投与５〜７日後に約０．３ｎｇ／ｍｌを超える。あるいは、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与約０．５時間後と約４０日後との間、好ましくは投与約０．５時間後と約１０日後、７日後、または１日後のいずれかとの間で約０．３ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、好ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨになる。同様に、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、前記哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与約０．５時間後と約４０日後との間、好ましくは投与約１０日後、７日後、または１日後のいずれかで約２ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、最も好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。本発明のより好ましい実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与約０．５時間後と約４０日後との間、好ましくは投与約１０日後、７日後、または１日後のいずれか任意の期間で約０．３ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の１週間に１回の投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与１日後および２日後では約１０ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、投与３日後および４日後では約５ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超え、投与５〜７日後では約０．３ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。さらなる実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度は、投与０．５時間後と１０日後との間で約０．３ｎｇ／ｍｌ ｈＧＨを超える。
【００４４】
本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、上記投与前のベースラインＩＧＦ−１レベルを超えるｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約１０時間後から約７２時間後までに約５０ｎｇ／ｍｌを超え、投与７２時間後から約１５日後、好ましくは投与約１０日後に約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌになる。あるいは、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約０．５時間後〜約４０日後、好ましくは投与約７日後に約５ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌになる。あるいは、本発明によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、ｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約０．５時間後〜約４０日後まで、好ましくは投与約７日後に約５０ｎｇ／ｍｌ超え、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌを超え得る。本発明の１つの実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物の単回投与により、前記投与前のベースラインＩＧＦ−１レベルを超えるｉｎ ｖｉｖｏ ＩＧＦ−１血清上昇は、投与約１０時間後から約７２時間後までに約５０ｎｇ／ｍｌを超え、投与７２時間後から約１５日後または投与約７２時間後〜約１０日後に約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌになる。
【００４５】
本発明によれば、単回投与を、投与体積が０．１ｍｌと約１．５ｍｌとの間である、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週のｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはこのような結晶を含む組成物と定義する。例えば、小児成長ホルモン欠損症には、約０．３ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、３０ｋｇの小児あたり約９ｍｇ）のｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物を投与することができる。ターナー症候群には、約０．３７５ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、３０ｋｇの小児あたり約１１．２５ｍｇ）のｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはこのような結晶を含む組成物を投与することができる。さらに、成人成長ホルモン欠損症には、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、８０ｋｇの成人あたり約１６ｍｇ）のｈＧＨを投与することができる。ＡＩＤＳ消耗疾患には、６ｍｇ／日（例えば、４２ｍｇ／週）のｈＧＨを投与することができる。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこのような結晶を含む組成物は、哺乳動物において可溶性ｈＧＨと同様の相対生物学的利用能を示す。可溶性ｈＧＨおよび前記結晶の総ｉｎ ｖｉｖｏ ｈＧＨ血清濃度の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定した本発明の結晶の相対生物学的利用能は、同一経路（例えば、皮下または筋肉内注射）によって輸送された可溶性ｈＧＨと比較して少なくとも５０％またはそれ以上である。したがって、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を、有利なｉｎ ｖｉｖｏ溶解速度によって特徴づける。
【００４７】
本発明は、さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶をヒト成長ホルモン欠損症に関連するかｈＧＨ治療によって改善する障害を有する哺乳動物に投与する方法を提供する。この方法は、哺乳動物に治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を投与する工程を含む。あるいは、この方法は、有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶のみを含むか賦形剤と組み合わせた組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。本発明のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の種々の実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のカルシウム結晶、１価の結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶である。このような結晶またはこれを含む組成物を、３日毎に約１回、１週間に約１回、２週間毎に約１回、または毎月約１回の時間投与計画によって投与することができる。
【００４８】
本発明によって治療することができるｈＧＨ機能不全に関連する障害には、成人成長ホルモン欠損症、小児成長ホルモン欠損症、プラダー・ウィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎機能不全、特発性低身長、小人症、下垂体性小人症、骨再生、女性不妊症、胎内発育遅延、ＡＩＤＳ関連悪液質、クローン病、火傷、ならびに他の遺伝子障害および代謝障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態では、障害は小児成長ホルモン欠損症であり、治療を受けた小児の年率換算の成長率が約７ｃｍと約１１ｃｍとの間になる。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のカルシウム結晶は、哺乳動物の骨治療およびヒト成長ホルモン欠損症治療の有用な補助薬として作用することができる。
【００５０】
本発明はまた、哺乳動物に治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を前記哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の体重増加を誘導する方法を提供する。あるいは、このような方法は、哺乳動物に治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤を含む組成物を投与する工程を含む。このような方法の１つの実施形態では、週１回の注射による前記結晶投与後の下垂体摘出ラットで誘導された体重増加は、約５％と約４０％との間である。
【００５１】
ｈＧＨの結晶、ｈＧＨ誘導体の結晶、またはこれらのみまたは賦形剤と共に含む組成物を、単独または薬学的調製物、治療調製物、もしくは予防調製物の一部として投与することができる。これらを、任意の従来の投与経路（例えば、非経口、経口、肺、鼻腔、耳、肛門、真皮、眼、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、経皮、局所、口腔、または頭蓋内が含まれる）によって投与することができる。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、賦形剤を含むか含まないｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこれを含む組成物を、経口経路または非経口経路によって投与する。好ましい実施形態では、賦形剤を含むか含まないｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはこれを含む組成物を、皮下経路または筋肉内経路によって投与する。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明の結晶または組成物を、２７またはそれ以上のゲージのニードルを使用した皮下経路によって投与する。本発明の１つの実施形態では、ニードルゲージは、３０であり得る。結晶または組成物を、プレフィルドシリンジまたはメタ用量注入ポンプから投与することができる。あるいは、無針注入器によってこれらを投与することができる。
【００５４】
本発明により、ｈＧＨを哺乳動物に有利に放出することが可能である。１つの実施形態では、本発明の結晶または組成物を、週に約１回投与する。別の実施形態では、本発明の結晶または組成物を、２週間毎に約１回投与する。さらに別の実施形態では、本発明の結晶または組成物を、毎月約１回投与する。特定の治療計画は、治療すべき疾患、治療すべき患者の年齢および体重、患者の全身的な身体状態、および治療を担当する医師の判断などの要因に依存することが当業者に認識される。
【００５５】
１つの実施形態によれば、本発明のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を含む組成物を、約０．１ｍｇ／ｍｌを超えるｈＧＨ濃度によって特徴づける。例えば、濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌとの間であり得る。あるいは、組成物を、約１ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間または１０ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間のｈＧＨ濃度によって特徴づけることができる。このような組成物には、以下の成分も含まれる：マンニトール−約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ；酢酸ナトリウム−約５ｍＭ〜約２５０ｍＭ（好ましくは、２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ）；Ｔｒｉｓ ＨＣｌ−約５ｍＭ〜約１００ｍＭ；約ｐＨ６．０〜約ｐＨ９．０（好ましくは、約６．５〜約８．５）；ＰＥＧ（ＭＷ８００〜８０００、好ましくは３３５０、４０００、６０００、または８０００）−０〜約２５％；プロタミン（好ましくは、ｈＧＨ：プロタミン＝３：１）；およびポリアルギニン（好ましくは、ｈＧＨ：ポリアルギニン＝５：１）。このような組成物は、任意選択的に、スクロース−０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ；アミノ酸（例えば、アルギニンおよびグリシン）−０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ；防腐剤（抗菌薬、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラベンゾエート（パラベン））−０％〜約５％（好ましくは０％〜約０．９％）；およびポリソルベート−０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌを含み得る。１つの実施形態によれば、本発明の組成物を、８０％有効負荷によって特徴づける。
【００５６】
本発明の好ましい処方賦形剤は、約１００ｍＭ酢酸ナトリウム、約５％ＰＥＧ６０００ＭＷ、および約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む。このような賦形剤を使用して調製したｈＧＨ組成物は、約９．３５ｍｇ／ｍｌ結晶ｈＧＨおよび約１．８１ｍｇ／ｍｌポリアルギニン（または約３．１２ｍｇ／ｍｌプロタミン）を含み得る。当業者に認識されるように、本発明の組成物のｈＧＨ濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌであり得る場合、ｒｈＧＨ：ポリアルギニン（ｗ／ｗ）比を５：１またはｈＧＨ：プロタミン比（ｗ／ｗ）を３：１に維持し、かつ約５ｎｇ／ｍｌのｈＧＨの低溶解性および放出の維持に十分なように、ポリアルギニン（またはプロタミン）濃度を適宜調製すべきである。例えば、上記処方物のために、所望の結晶ｈＧＨ濃度が約２０ｍｇ／ｍｌである場合、ポリアルギニン（またはプロタミン）濃度は、約４ｍｇ／ｍｌであるべきである。
【００５７】
本発明は、さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の調製方法を提供する。１つのこのような方法は、（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液を結晶化溶液と混合する工程と、前記結晶化溶液が塩およびイオン性ポリマーを含むことと、（ｂ）前記溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶が形成されるまで、約４℃と約３７℃との間の温度で約１２時間を超えてインキュベートする工程とを含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液を結晶化溶液と混合する工程であって、前記結晶化溶液が塩および賦形剤を含む、工程、（ｂ）前記溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶が形成されるまで、約４℃と約３７℃との間の温度で約１６時間を超えてインキュベートする工程とを含む。別の実施形態では、上記いずれかの方法の工程（ｂ）の溶液を、約１５℃の温度で約１週間を超えてインキュベートすることができる。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、カルシウム結晶、１価のカチオン結晶、プロタミン結晶、またはポリアルギニン結晶であり、イオン性ポリマーはプロタミンまたはポリアルギニンである。別の実施形態では、イオン性ポリマーは、ポリリジンまたはポリオルチニンである。さらに別の実施形態では、イオン性ポリマーは、任意の２つまたはそれ以上のプロタミン、ポリアルギニン、およびポリリジンの混合物である。
【００５８】
上記方法の工程（ａ）の塩は、１価または２価および無機または有機のいずれかであり得る。２価の塩の好ましい実施形態は、カルシウム塩である。より好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。別の好ましい実施形態では、１価のカチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、１価のカチオンはナトリウムである。
【００５９】
本発明の別の好ましい実施形態では、１価のカチオン塩はナトリウム塩である。より好ましい実施形態では、ナトリウム塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ナトリウム塩は、酢酸ナトリウムである。
【００６０】
上記方法では、塩がカルシウム塩または１価のカチオン塩である場合、塩は、工程（ａ）の結晶化溶液中に、約０．０１ｍＭと約１Ｍとの間の濃度で存在する。好ましい実施形態では、この濃度は、約２５ｍＭと約２０５ｍＭとの間である。塩がカルシウム塩である場合、塩は、工程（ａ）の結晶化溶液中に、約０．０１ｍＭと約２３５ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００６１】
好ましい実施形態では、工程（ａ）の結晶化溶液はｐＨ緩衝剤をさらに含む。より好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ６と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ７．０と約ｐＨ１０との間である。さらにより好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ６と約ｐＨ９との間である。さらにより好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ７．８と約ｐＨ８．９との間である。
【００６２】
上記方法の別の態様では、工程（ａ）のｐＨ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される。上記方法の好ましい実施形態では、工程（ａ）のｐＨ緩衝液は、重炭酸緩衝液、イミダゾール−リンゴ酸緩衝液、グリシン緩衝液、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール（「ビス−ｔｒｉｓ」）緩衝液、炭酸緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、および（Ｎ−（１−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）からなる群から選択される。
【００６３】
上記方法の１つでは、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を調製するために使用される沈殿剤は、典型的には、高分子（低分子量ポリアルコールおよびプロタミンが含まれる）である。本発明の別の実施形態では、上記方法の１つの工程（ａ）の沈殿剤は非イオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、非イオン性ポリマーは、アルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポリビニルアルコール、またはエタノールからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、沈殿剤は、イソプロピルアルコールまたはエタノールである。さらにより好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２００と約８０００との間である。ＰＥＧの分子量は、３３５０、４０００、６０００、または８０００であり得る。より好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は約６０００である。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約０．５％ｗ／ｖと約１２％ｗ／ｖとの間の濃度で存在する。
【００６４】
上記方法の１つの別の実施形態では、工程（ａ）の沈殿剤はイオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、イオン性ポリマーは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびポリリジンからなる群から選択される。
【００６５】
上記方法の混合工程（ａ）は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の溶液を結晶化溶液と混合する工程を含む。この方法の１つの実施形態では、上記結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌと約１，０００ｍｇ／ｍｌとの間である。好ましい実施形態では、前記溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約５０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。さらなる態様では、前記溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約１０ｍｇ／ｍｌと約２５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。
【００６６】
上記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の調製方法の好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体および結晶化溶液を含む溶液を、工程（ｂ）において、約３３℃で約０．２５日間と約２日間との間インキュベートする。あるいは、温度は、約３７℃であり得る。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体および結晶化溶液を含む溶液を、約２５℃で約０．２５日間と約２日間との間インキュベートする。さらに別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体および結晶化溶液を含む溶液を、約１５℃で約０．２５日間と約２日間の間インキュベートする。
【００６７】
本発明は、さらに、ｈＧＨの結晶、ｈＧＨ誘導体の結晶、またはこのような結晶および賦形剤を含む組成物の別の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程と、（ｂ）結晶化溶液に脱イオン水と添加する工程と、（ｃ）前記結晶化溶液にイオン性小分子またはイオン性ポリマーを添加する工程と、（ｄ）前記結晶化溶液に塩を添加する工程と、（ｅ）結晶化溶液を、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程とを含む。本発明のさらなる実施形態では、約４時間と約４８時間との間インキュベートする。別の好ましい実施例では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液を、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を形成するまで、約４℃と約４０℃との間で約４時間と約４８時間との間インキュベートする。別の実施形態によれば、工程（ｂ）の後に任意選択的な工程を使用して上記方法を行う。任意選択的工程は、結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程を含む。上記方法のさらなる実施形態では、工程（ｃ）は任意選択的である。これらの任意選択的工程の使用にかかわらず、好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約１５℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間インキュベートする。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約４℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間インキュベートする。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｄ）では、塩はカルシウム塩または１価のカチオン塩である。カルシウム結晶についての好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。好ましい実施形態では、酢酸カルシウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸カルシウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約０．１ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００６９】
より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｄ）における１価のカチオン塩はナトリウムである。同様に、より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は酢酸ナトリウムである。好ましい実施形態では、酢酸ナトリウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸ナトリウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６の間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の酢酸ナトリウムは、約０．５ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約１００ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度で存在する。この濃度はまた、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間であり得る。
【００７０】
さらに別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１７．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約１４．５ｍｇ／ｍｌと約１５．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。さらなる実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。
【００７１】
好ましい実施形態では、上記方法の工程（ａ）の結晶化緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される。あるいは、結晶化緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチルプロパノール）緩衝液、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（３−（［１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、ビシン緩衝液、エタノールアミン緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、タウリン緩衝液、トリアン緩衝液、およびその混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約１０ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００７２】
上記方法の別の実施形態では、工程（ａ）の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間で存在する。好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９との間で存在する。さらに別の好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間で存在する。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９．５との間である。なおさらに好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ９．５との間である。
【００７４】
結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程（ｂ）の後の任意の選択的工程を包含する、方法の好ましい実施形態では、沈殿剤は、非イオン性小分子または非イオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、非イオン性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２００と約８０００、約６０００、約４０００、および約３３５０との間からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約０．５％と約２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度で結晶化溶液中に存在する。上記方法の別の好ましい実施形態では、沈殿剤は、アミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）では、イオン性ポリマーは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびオクタルギニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）では、ポリアルギニンを、５：１と約１：２５との間のｈＧＨ：ポリアルギニン（ｍｇ：ｍｇ）比で添加する。得られた結晶化溶液を、約１５℃と約３７℃との間の範囲の温度で約１６時間〜約４８時間インキュベートする。
【００７６】
本発明は、ヒト成長ホルモンの結晶、ヒト成長ホルモン誘導体の結晶、またはこのような結晶を含む組成物、および賦形剤のさらに別の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）ヒト成長ホルモン溶液またはヒト成長ホルモン誘導体溶液と結晶化緩衝液とを混合して結晶化溶液を生成する工程と、（ｂ）前記結晶化溶液に脱イオン水と添加する工程と、（ｃ）前記結晶化溶液に沈殿剤を添加する工程と、（ｄ）前記結晶化溶液に塩を添加する工程と、（ｅ）結晶化溶液を、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶が形成されるまで、約１０℃と約４０℃の間で約２時間と約１６８時間との間インキュベートする工程と、（ｆ）前記ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶にイオン性ポリマーを添加する工程とを含む。上記方法の１つの実施形態によれば、工程（ｆ）は任意選択的である。好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約１５℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間でインキュベートする。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液を、約４℃と約３７℃との間で約１日間と約２日間との間でインキュベートする。本発明のさらなる実施形態では、約２時間と約４８時間との間インキュベートする。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液を、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶が形成されるまで、約４℃と約４０℃との間で約４時間と約４８時間との間でインキュベートする。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｄ）において、塩はカルシウム塩または１価のカチオン塩である。より好ましい実施形態では、カルシウム塩は、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、および硫酸カルシウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。好ましい実施形態では、酢酸カルシウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸カルシウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６との間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約０．１ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００７８】
より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、１価のカチオン塩はナトリウムである。同様に、より好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態では、１価のカチオン塩は酢酸ナトリウムである。好ましい実施形態では、酢酸ナトリウムは、約ｐＨ３と約ｐＨ９．０との間の水溶液の形態である。より好ましい実施形態では、酢酸ナトリウム水溶液は、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．６の間である。別の実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の酢酸ナトリウムは、約０．５ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。より好ましい実施形態では、工程（ｅ）の溶液中の結晶化溶液中の酢酸カルシウムは、約１００ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度で存在する。あるいは、この濃度はまた、約８５ｍＭと約１００ｍＭとの間であり得る。
【００７９】
さらに別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１７．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約１４．５ｍｇ／ｍｌと約１５．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。さらなる実施形態では、工程（ｅ）の結晶化溶液中のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、約２ｍｇ／ｍｌと約１００ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する。
【００８０】
好ましい実施形態では、上記方法の工程（ａ）の結晶化緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、工程（ａ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約１０ｍＭと約８００ｍＭとの間の濃度で存在する。
【００８１】
上記方法の別の実施形態では、工程（ａ）の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間で存在する。好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９との間で存在する。さらに別の好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ１０との間で存在する。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｅ）の溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ３と約ｐＨ１０との間である。より好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ６と約ｐＨ９．５との間である。なおさらに好ましい実施形態では、溶液中の結晶化緩衝液は、約ｐＨ７．５と約ｐＨ９．５との間である。
【００８３】
好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）において、沈殿剤は、非イオン性小分子または非イオン性ポリマーである。好ましい実施形態では、非イオン性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、およびその混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２００と約８０００、約６０００、約４０００、および約３３５０との間からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約０．５％と約２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度で結晶化溶液中に存在する。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｃ）において、沈殿剤は、アミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸、およびその混合物からなる群から選択される。
【００８４】
別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｆ）では、イオン性ポリマーは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびオクタルギニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法の工程（ｆ）では、ポリアルギニンを、約５：１と約１：２５との間のｈＧＨ：ポリアルギニン（ｍｇ：ｍｇ）比で添加する。別の実施形態では、ポリアルギニンを、約１：５と約１：２５との間のｈＧＨ：ポリアルギニン（ｍｇ：ｍｇ）比で添加する。工程（ｆ）で得られた溶液を、約１５℃と約３７℃との間の範囲の温度で約１６時間〜約４８時間インキュベートする。ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の溶解速度に対するポリマーの効果は、完全な溶解に必要な洗浄回数を反映する。コントロール結晶は、完全な溶解ために約７回〜約１３回の洗浄が必要であり、ポリアルギニンで調製した結晶は、完全な溶解のために同一の溶解緩衝液で約３０回〜９０回の洗浄が必要である。洗浄は、連続的溶解プロセス中の洗浄工程である（実施例５を参照のこと）。
【００８５】
任意の上記方法の別の実施形態では、カルシウム塩または１価のカチオン塩は、約０．０１Ｍと約１Ｍとの間または約２５ｍＭと約２０５ｍＭとの間の濃度で結晶化溶液中に存在し得る。任意の上記方法の別の実施形態では、結晶化溶液を、約３３℃で約０．２５日間と約２日間との間；約２５℃で約０．２５日間と約２日間との間、および約１５℃で約０．２５日間と約２日間との間からなる群から選択される時間および温度でインキュベートする。
【００８６】
本発明はまた、治療薬の処方物で使用するためのｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶のスクリーニング方法を含む。このような方法の工程は、（１）前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を約３７℃の溶解緩衝液で洗浄する工程と（例えば、２ｍｇの結晶および１ｍｌの溶解緩衝液）、（２）前記溶解緩衝液中での１洗浄あたりの前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度を測定する工程と、前記結晶の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度が約１０分間と約１５００分間との間に結晶の約２％と約１６％との間であり、連続的溶解プロセスにおいて１洗浄あたり約２分間および３２分間であることとを含む（実施例５を参照のこと）。前記結晶のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解速度はまた、１５分間にわたり前記結晶の約４％と約１０％との間または１５分間にわたり約０．０４ｍｇと約０．３２ｍｇとの間であり得る。
【００８７】
本発明をより深く理解することができるように、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を制限すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【００８８】
（実施例）
下記の実施例で以下の材料を使用した。
【００８９】
（材料）
市販の組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）をＢｒｅｓａＧｅｎ Ｌｔｄ．（Ｔｈｅｂａｒｔｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、平均分子量が４０００または６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００またはＰＥＧ−６０００）を、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、硫酸プロタミンをＦｉｓｈｅｒを介してＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。リン酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸亜鉛、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム、イソプロパノール（ＩＰＡ）、エタノール、およびポリエチレングリコールモノメチルエーテルを、それぞれＦｉｓｈｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）またはＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から入手した。ポリアルギニンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手した。
【００９０】
（分析技術およびアッセイ）
（逆相高速液体クロマトグラフィ）
逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、Ｃ５（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３μｍ）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を具備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を有する。サンプルを、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、および０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）に溶解し、注射前に濾過する（０．２μｍ）。溶媒ＡおよびＢの勾配法を使用して、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで溶離プロフィールをモニタリングした。溶媒Ａは、９９．９％脱イオン水／０．１％ＴＦＡからなる。溶媒Ｂは、９９．９％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡからなる。全てＦｉｓｈｅｒから入手したＨＰＬＣグレードの化学物質であった。４０〜５０％Ｂを０〜２分間、５０〜６０％Ｂを２〜１２分間、および６０〜８５％Ｂを１２〜１５分間の勾配デザインを使用して、１５分間溶離を行った。運転中、流速１ｍｌ／分およびカラム温度３５℃を維持した。ＡｇｉｌｅｎｔＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、データを分析した。
【００９１】
サンプル調製物中のプロタミンまたはポリアルギニンの濃度を、溶媒Ａ（９９．９％脱イオン水／０．１％ＴＦＡ）およびＢ（９９．９％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の勾配法を使用して測定した。９５：５（Ａ：Ｂ）で０〜２．５分間、６５：３５（Ａ：Ｂ）で２．５〜７．５分間、２５：７５（Ａ：Ｂ）で７．５〜１５．５分間、２５：７５（Ａ：Ｂ）で１５．５〜１７．０分間、９５：５（Ａ：Ｂ）で１７〜１７．１分間の勾配デザインを使用して、流速１ｍｌ／分で２０分間溶離した。６．２分でプロタミンまたはポリアルギニンが典型的に溶離され、１４分でインタクトなｈＧＨが溶離された。２１３ｎｍでのＡＵＣを計算した。プロタミンおよび／またはポリアルギニン（ｍｇ／ｍｌ）添加剤の含有率を、各添加物から作成した検量線から計算した。これと同一の方法を使用して、複合体から放出された賦形剤を分析することができる。
【００９２】
異なるが類似する逆相法を使用して、合せた分解ｈＧＨを決定した。例えば、運転中に３７℃のサーモスタット温度を維持しながら、Ｃ５ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅカラム（５ｃｍ×４．６ｍｍ、粒子サイズ３μｍ、孔サイズ３０ｎｍ）にて分析した。移動相Ａ（２０％ ＡＣＮ、８０％Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ）および移動相Ｂ（２０％ ＡＣＮ、８０％２−プロパノール、０．１％ＴＦＡ）を有する勾配法を使用して、溶離プロフィールをモニタリングした。Ｂを０〜５分間で２０％から４５％まで、５〜１５分間で４５％から５５％まで、１５〜１５．１分間で５５％から９０％まで変化させ、１７分までＢを９０％に保持し、本工程直後に２０分に達するまでＢを再度２０％にした。
【００９３】
（サイズ排除高速液体クロマトグラフィ）
サイズ排除クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）は、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（パーツ番号０８４５０，Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ ＬＬＣ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍ）およびＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＭＷＤ（ＵＶ）を具備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を有する。サンプルを、０．２ｍｌの溶解緩衝液に溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ温度制御オートサンプラーに注入する前に０．２μｍで濾過した。移動相を（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３（ｐＨ７．５））を使用して、溶離プロフィールを２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニタリングした。カラム温度を２５℃に保持し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ脱気装置を使用して、溶媒を脱気した。
【００９４】
（ＵＶ−ＶＩＳ吸収および光学顕微鏡法）
Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によってＵＶ−ＶＩＳスペクトロフォトグラムを得た。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５１顕微鏡を使用した明視野で画像化し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｌ．Ｐ．，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用したＳｏｎｙ ＤＸＣ−９７０ＭＤ ３ＣＣＤカラーデジタルビデオカメラでのキャプチャーによって、４０倍〜４００倍の光学顕微鏡写真を得た。
【００９５】
（透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ））
以下のようにＴＥＭ分析を行った。母液中のｈＧＨ結晶の懸濁液を水で２回洗浄して過剰な母液を除去し、その後０．５％酢酸ウラニルで１時間陰性染色を行った。染色されたｈＧＨ結晶懸濁液（１〜５μＬ）を、銅製ＴＥＭグリッド上に移した。過剰な液体を除去し、サンプルグリッドを短時間風乾した。ＴＥＭグリッドを、ＪＥＯＬ １２１０透過電子顕微鏡のサンプルステージに移し、８０ｋＶ電子ビームを使用して画像を収集した。結晶内に結晶プリズム軸と一直線上の方向で非常に組織化された格子構造が認められた。
【００９６】
（実施例１）
（リン酸アンモニウムでのｈＧＨの結晶化）
市販のｈＧＨ（５０ｍｇ）を、最初に１５ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））に溶解し、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１０，０００のＰｉｅｒｃｅ Ｄｉａｌｙｚｅｒカートリッジを使用して２×４０００ｍｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））に対して透析した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した４０００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって、タンパク質濃度を調整した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は、３０〜４５ｍｇ／ｍｌの範囲であることが見出された。溶液に脱イオン水を添加して、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得た。ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の最終濃度が８６０ｍＭとなるような溶液へのリン酸アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが約８〜１５μｍ、結晶収量が９０％を超えることが見出された。図１を参照のこと。
【００９７】
（実施例２）
（クエン酸ナトリウムでのｈＧＨの結晶）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。ｈＧＨの濃縮液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１７．５ｍｇ／ｍｌとした。クエン酸ナトリウム（Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ）の最終濃度が３９０ｍＭとなるような溶液にクエン酸ナトリウム（１．５Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。ｈＧＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ濃度がすでに１０ｍＭであることは別として、ｐＨを調整する必要はなかった。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが約８μｍ未満であり、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図２を参照のこと。
【００９８】
（実施例３）
（リン酸ナトリウムでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１２．５〜１７．５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。Ｎａ２ＨＰＯ４の最終濃度が６００ｍＭとなるような溶液への第二リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが５μｍと２５μｍとの間であり、結晶収量が７５％を超えることが見出された。図３を参照のこと。
【００９９】
（実施例４）
（酢酸カルシウムおよび硫酸プロタミンでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで硫酸プロタミンを添加した。Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液への酢酸カルシウム（Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅ）（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、３７℃で８時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２０μｍ未満であり、結晶収量が７５％を超えることが見出された。図４を参照のこと。
【０１００】
（実施例５）
（塩誘導結晶化によって調製されたｈＧＨ結晶の溶解性プロフィール）
実施例１〜４における結晶化溶液のインキュベーション後、結晶をペレット化し、残りの上清を除去した。３７℃で約１５分間平衡化する前のピペッティングまたはボルテックスのいずれかによって、結晶ペレット（０．４ｍｇ）を０．２００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、および０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）に再懸濁した。次いで、サンプルを、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＵＶ−ＶＩＳによって２８０ｎｍで測定するタンパク質濃度の決定のために上清を完全に除去した。結晶化ペレットを、０．２００ｍｌの溶解緩衝液にさらに再懸濁し、上清中に検出可能なタンパク質が測定されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。このプロセスを、連続希釈という。
【０１０１】
図５は、時間の関数（分）としての上記実施例１〜４において１価（ＮａまたはＮＨ４）または２価（Ｃａ）の塩を使用して調製した種々のｈＧＨ結晶の溶解性挙動を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ由来の累積放出率としてｈＧＨ溶解をプロットし、タンパク質サンプルのＡＵＣ値を、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使用してｍｇ／ｍｌで測定した。データは、３９０ｍＭ Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅの添加によって調製されたｈＧＨ結晶は６０分後に完全に溶解したことを示す。さらに、６００Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４または８６０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の添加によって調製されたｈＧＨ結晶は、それぞれ６０分後または７５分後に完全に溶解する。他方では、８５ｍＭ Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅおよび硫酸プロタミンの添加によって調製されたｈＧＨ結晶は、３９０分後に完全に溶解した（以下の表１を参照のこと）。
【０１０２】
【表１】
（実施例６）
（酢酸カルシウムおよび１０％イソプロパノールでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液へのＣａ−Ａｃｅｔａｔｅ（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。この溶液に、１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）を添加した。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。棒様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが１００μｍを超え、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図６を参照のこと。
【０１０３】
（実施例７）
（塩化カルシウムおよび５％イソプロパノールでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。ＣａＣｌ２の最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液への塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。この溶液に、５％（ｖ／ｖ）ＩＰＡを添加した。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。棒様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２００μｍを超え、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図７を参照のこと。
【０１０４】
（実施例８）
（１０％ＰＥＧ−６０００および１０％エタノールでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。溶液への１０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００および１０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥｔＯＨ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、３７℃で１６時間インキュベートした。棒様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍ未満であり、結晶収量が７０％を超えることが見出された。図８を参照のこと。
【０１０５】
（実施例９）
（アルコールによって調製されたｈＧＨ結晶の溶解性プロフィール）
実施例６〜８で調製された結晶化溶液のインキュベーション後、結晶をペレット化し、残りの上清を除去した。３７℃で約１５分間平衡化する前のピペッティングまたはボルテックスのいずれかによって、結晶ペレットを０．２００ｍｌの溶解緩衝液（実施例５を参照のこと）に再懸濁した。次いで、サンプルを、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＵＶ−ＶＩＳによって２８０ｎｍで測定するタンパク質濃度の決定のために上清を完全に除去した。ｈＧＨ溶解を、累積率として測定し、これはＡＵＶ値またはＵＶ−ＶＩＳのｍｇ／ｍｌ測定値から算出した。結晶化ペレットを、溶解緩衝液にさらに再懸濁し、上清中に検出可能なタンパク質が測定されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１０６】
図９および表２は、時間の関数（分）としての１０％ ＩＰＡ／８５ｍＭ Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅ、５％ ＩＰＡ／８５ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０％ ＥｔＯＨ／１０％ＰＥＧ−６０００で調製したｈＧＨ結晶の溶解性挙動を示す。結果は、１０％ ＩＰＡ／８５ｍＭ Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの添加によって調製したｈＧＨ結晶は１５０分後に完全に溶解するのに対して、５％ ＩＰＡ／８５ｍＭ ＣａＣｌ２および１０％ ＥｔＯＨ／１０％ＰＥＧ−６０００の添加によって調製したｈＧＨ結晶はそれぞれ１２０分および１３５分で完全に溶解することを示す。
【０１０７】
【表２】
（実施例１０）
（酢酸カルシウムおよび２％ＰＥＧ−６０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。Ｃａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液へのＣａ−Ａｃｅｔａｔｅ（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍと約７５μｍとの間であり、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図１０を参照のこと。
【０１０８】
（実施例１１）
（酢酸ナトリウムおよび６％ＰＥＧ−６０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅの最終濃度が５００ｍＭとなるような溶液への酢酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ）（２Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍと約７５μｍとの間であり、結晶収量が８５％を超えることが見出された。図１１を参照のこと。
【０１０９】
（実施例１２）
（塩化カルシウムおよび６％ＰＥＧ−６０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。ＣａＣｌ２の最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液へのＣａＣｌ２（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが１００μｍを超え、結晶収量が９０％を超えることが見出された。図１２を参照のこと。
【０１１０】
（実施例１３）
（酢酸カルシウム、６％ＰＥＧ−６０００、および硫酸プロタミンでのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）および６％ＰＥＧ−６０００（ｖ／ｖ）を添加した。酢酸カルシウムの最終濃度が８５ｍＭとなるような溶液への酢酸カルシウム（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、３７℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが２５μｍ未満であり、結晶収量が７０％を超えることが見出された。図１３を参照のこと。
【０１１１】
（実施例１４）
（酢酸カルシウムおよび６％ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００でのｈＧＨの結晶化）
実施例１に記載のように市販のｈＧＨを精製し、濃縮した。濃縮ｈＧＨ溶液に脱イオン水を添加して、タンパク質最終濃度を１５ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度１００ｍＭまで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ（ｐＨ８．６））を添加した。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコールモノメチルエーテル−５０００（ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００）を添加した。酢酸カルシウムの最終濃度が１２５ｍＭとなるような溶液への酢酸カルシウム（１Ｍ）の添加によってｈＧＨ結晶を成長させた。次いで、溶液を、２５℃で１６時間インキュベートした。ニードル様結晶が得られ、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さが５０μｍ未満であり、結晶収量が９０％を超えることが見出された。図１４を参照のこと。
【０１１２】
（実施例１５）
（ポリエチレングリコールを使用して調製されたｈＧＨ結晶の溶解性プロフィール）
実施例１０〜１４で調製された結晶化溶液のインキュベーション後、結晶をペレット化し、残りの上清を除去した。３７℃で約１５分間平衡化する前のピペッティングまたはボルテックスのいずれかによって、結晶ペレットを０．２ｍｌの溶解緩衝液（実施例５を参照のこと）に再懸濁した。次いで、サンプルを、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＵＶ−ＶＩＳによって２８０ｎｍで測定するタンパク質濃度の決定のために上清を除去した。結晶化ペレットを、溶解緩衝液にさらに再懸濁し、上清中に検出可能なタンパク質が測定されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１１３】
図１５および表３は、時間の関数（分）としての２％ ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ 酢酸カルシウム、６％ ＰＥＧ−６０００／５００ｍＭ 酢酸ナトリウム、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ ＣａＣｌ２、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ 酢酸カルシウム／プロタミン、および６％ ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００／１２５ｍＭ 酢酸カルシウムで調製したｈＧＨ結晶の溶解性挙動を示す。ｈＧＨ溶解を、蓄積率として測定し、ＡＵＣ値またはＵＶ−ＶＩＳｍｇ／ｍｌ測定値から算出した。結果は、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ 酢酸カルシウム／プロタミンの添加によって調製したｈＧＨ結晶は最も溶解が遅く、４９５分後に完全に溶解した。２％ ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ酢酸カルシウム結晶についての他の結晶は３００分で溶解するか、他のｈＧＨ結晶についてはより短かった。
【０１１４】
【表３−１】
【０１１５】
【表３−２】
（実施例１６）
（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した薬物動態学試験）
２．５ｍｇ／ｋｇの可溶性（市販）または結晶（８５ｍＭ 酢酸カルシウム／２％ ＰＥＧ−６０００）ｈＧＨを実施例１０に記載のように調製し、懸濁液を、２４匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに皮下投与した。各ラットの平均体重は２００ｇであった。２４匹のラットを、２つの群に分けた。各群は、３群のサブセットを含んでおり、それぞれ４匹のラットを含む。３回の特定の測定点で、各サブセット内の頸動脈インプラントを介して採血した。所与の時点で採取することができる血液量は限られているので、リープフロッグデザインを使用した。動物の安定性を維持するために、上記測定点で群内の動物サブセットから採血した。次いで、血清サンプルをコンパイルして、線形累進時系列を形成した。サブセットの平均からの所与の測定点でのサブセット内の血清レベルの分散によって標準偏差を決定した。表４〜６を参照のこと。表４〜５では、１〜１２と命名した動物に可溶性ｈＧＨを、動物１３〜２４に結晶化ｈＧＨを、各動物に対して５００μｇの用量で投与した。
【０１１６】
図１６は、可溶性および結晶化ｈＧＨについての時間の関数としての血清ｈＧＨレベルを示す。結晶化ｈＧＨの半減期は、可溶性ｈＧＨのほぼ１９倍であった。血清中で最大ｈＧＨが認められた時間は、結晶化ｈＧＨについては４時間であり、可溶性ｈＧＨについては０．５時間であった。ラットの群およびサブセットを５．５ｍｇ／ｍｌ（２．２ｍｇ．ｋｇに相当する用量）の濃度の可溶性ｈＧＨまたは結晶ｈＧＨで処置した場合、以下の表６で列挙したＣｍａｘ値は、結晶形態で輸送させた場合、ｈＧＨは、同一の可溶性の用量と比較した場合に最大血清濃度が有意に減少したことを示す。また、可溶性ｈＧＨと結晶ｈＧＨとの総血清レベルのＡＵＣは類似しており、結晶化によって生物学的利用能は有意に影響を受けないことを示した。可溶性および結晶の両結果についてＴ９０％値を計算した。このパラメーターは、総ＡＵＣの９０％が起こる時間を示す。Ｔ９０％値が高いほど、薬物がより長く血清中に留まることを示す。表６に含まれるＴ９０％の結果は、結晶形態により、可溶性形態よりもｈＧＨレベルの上昇が有意に長くなることを明白に示す。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
【表６】
（実施例１７）
（ｈＧＨ結晶の溶解特性に対する硫酸プロタミンの効果）
図１７は、既存のカルシウムｈＧＨ結晶溶液への所与の量の硫酸プロタミンの添加から１時間のインキュベーション後に３７℃の溶解緩衝液中に溶解する実施例１０にしたがって調製したｈＧＨ結晶（８５ｍＭ酢酸カルシウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６））の量を示す。ｈＧＨ：プロタミン（ｍｇ：ｍｇ）比を、図１７に示す。グラフは、プロタミンがｈＧＨ結晶の溶解に有意に影響を与えることを示す。
【０１２０】
（実施例１８）
（酢酸ナトリウムでのｈＧＨの結晶化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のストック溶液由来のｒｈＧＨの個別の分析によって、その供給源に関係なく同一の結晶化および溶解性を有するｒｈＧＨが得られた。約３．３ｍｌ（未知の緩衝液中で供給された１０〜２０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＨ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｍｌである全容液中での脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−６０００、および酢酸ナトリウムのそれぞれの最終濃度が１００ｍＭ、６％（ｖ／ｖ）、および５００ｍＭでの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。ニードルまたは棒様結晶が得られ、ＴＥＭで画像化した（図１８Ａおよび１８Ｂを参照のこと）。結晶の長さは、約２〜２５μｍの範囲であった。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、８５％を超える結晶収量が測定された。３３℃と１５℃の間の温度で結晶を形成させることもできるが、より長い結晶化時間を必要とし、おそらく収率が低い。
【０１２１】
（実施例１９）
（ナトリウムｈＧＨ結晶とイオン性ポリマー添加剤との複合体化）
結晶収量の決定後（実施例１８を参照のこと）、ナトリウムｒｈＧＨ結晶の最終濃度が２１ｍｇ／ｍｌとなるように、母液（２５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６％ＰＥＧ−６０００、および７ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンまたは４．２ｍｇ／ｍｌポリアルギニン）にナトリウムｒｈＧＨ結晶を再懸濁した。ｒｈＧＨ：硫酸プロタミンについてのタンパク質：添加剤の比は、約３：１（ｍｇ：ｍｇ）であり、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについては５：１（ｍｇ：ｍｇ）であった。これらの比は、ｒｈＧＨ：プロタミンについては約１：１．７１５、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについては約１：０．５８７のモル比であると計算される。上記ｒｈＧＨペレットを、適切な母液に均一に再懸濁し、遠心分離前に２〜８℃で一晩インキュベートして濃縮ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを同一の母液（イオン性ポリマー添加剤を含まない）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１２２】
母液の添加剤濃度（ｍｇ／ｍｌ）を変化させながら２１ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨを依然として再懸濁することによってさらなるｒｈＧＨ：イオン性ポリマー添加剤比を得ることができる。例えば、母液中の硫酸プロタミン濃度の増加（１０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して、再懸濁時のｒｈＧＨ：添加剤比を２：１にすることができる。
【０１２３】
（実施例２０）
（酢酸亜鉛でのｈＧＨの結晶化。酢酸亜鉛およびアセトンでのｒｈＧＨの結晶化）
約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（１０ｍＭ（ｐＨ６．１））での洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．１）を添加した。４．５ｍｌ量の脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで５〜１０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は１５ｍｇ／ｍｌの範囲であった。１５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含む１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．１）への脱イオン水、８．９１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．１）、０．８８ｍｇ／ｍｌ酢酸亜鉛、９．８９％アセトンを含む４００μｌの母液の添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、１５℃で２４〜４８時間インキュベートした。幅が約２〜２５μｍの六角形様結晶が得られた。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、結晶収量は約５５％と測定された。
【０１２４】
（実施例２１）
（酢酸カルシウムでのｈＧＨの結晶化およびカルシウムｈＧＨとイオン性ポリマー添加剤（ポリアルギニン）との複合体化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。約３．５ｍｌ（１２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＨを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終濃度が１５ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＨ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２％（ｖ／ｖ） ＰＥＧ−６０００、および８５ｍＭ 酢酸カルシウムであるようなｒｈＧＨ（３０ｍｇ／ｍｌストック調製物）への１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０％ ＰＥＧ−６０００、および１Ｍ 酢酸ナトリウムの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。ニードル様結晶の長さは、約２〜２５μｍの範囲であった。上清の抽出ならびに結晶の遠心分離およびペレット化後、結晶収量は８５％を超えていた。３３℃と１５℃の間の温度で結晶を形成させることもできるが、より長い結晶化時間を必要とし、収率が低い。結晶収量の決定後（実施例１８を参照のこと）、カルシウムｒｈＧＨ結晶の最終濃度が２１ｍｇ／ｍｌとなるように、処方賦形剤（５ｍＭ ＣａＯＡｃ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６％ＰＥＧ−６０００、および４．２ｍｇ／ｍｌポリアルギニン）にカルシウムｒｈＧＨ結晶を再懸濁した。ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについてのタンパク質：添加剤の比は、約５：１（ｍｇ：ｍｇ）であった。これらの比は、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンについて約１：０．５８７のモル比であると計算される。上記ｒｈＧＨペレットを、適切な母液に均一に再懸濁し、遠心分離前に２〜８℃で一晩インキュベートして濃縮ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを同一の母液（イオン性添加剤を含まない）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１２５】
（実施例２２）
（Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットおよびｈＧＨの２価のカチオン結晶を使用した、皮下投与したｈＧＨの薬物動態学および薬力学試験）
本試験の目的は、下垂体摘出Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるｈＧＨ結晶懸濁液の皮下移植時のｈＧＨ結晶懸濁液からのｈＧＨの放出および体重増加の制御を評価することであった。試験デザインを以下に示した。
【０１２６】
【表７】
到着時に、体重が約１５０ｇ±２５ｇであり、かつ約４〜６週齢である８０匹の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、制御された条件下（約２１±３℃、相対湿度５０±２０％、それぞれ２４時間で１２時間の明所および１２時間の暗所、１時間あたり１０〜１５回の換気）で個別に飼育し、試験期間中、精製水および固形試料を自由に利用させた。ラットを、試験前に１週間環境に馴化させた。
【０１２７】
表７にしたがって、８０匹のラットのうち４８匹にｈＧＨ懸濁液を投与した。試験化合物を、背中への単回皮下ボーラス注射として、１日目に１回または７日間毎日１回投与した。注射を容易にするために必要な場合、注射部位の毛を剃り、投与前後３日までマークした。３００μｌシリンジに取りつけた３０ゲージ×８ｍｍニードルを使用して、試験化合物を投与した。シリンジへの取り出し前および投与前に気泡を形成することなく懸濁液または溶液を確実に均一にするために、試験化合物を慎重に逆にした。注射体積は、ラットあたり約０．１ｍｌであった。
【０１２８】
１日目の注射から４時間後、３２時間後、９６時間後、および１６８時間後に、第１群、第５群、第７群、および第８群（群あたりそれぞれ３匹のラットを有する）のラットから血液サンプルを採取した。第２群、第３群、第４群、および第９群（それぞれ群あたり９匹のラット有する）のラット由来の血液サンプルを、３匹のラットを有する３つの群にさらに分けた。ここでは、第１日目の注射から０．５時間後、２４時間後、７２時間後、および１６８時間後にラットの第１のサブセットから、４時間後、３２時間後、９６時間後、および１６８時間後に第２のサブセットから、および８時間後、４８時間後、１２０時間後、および１６８時間後に第３のサブセットから血液サンプルを採取した。一般的には、非麻酔ラットまたはＣＯ２／Ｏ２麻酔ラットの眼窩を介して採血し、血清分離器を使用してＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブに回収した。次いで、サンプルを、約４℃で遠心分離し、血清を回収し、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルの測定前に凍結保存した（約−８０℃）。
【０１２９】
次いで、血清サンプルをコンパイルし、第２群、第３群、第４群、および第９群の場合、線形累進時系列を形成した。サブセットの平均からの所与の測定点でのサブセット内の血清レベルの分散によって標準偏差を決定した。表８〜１４および図１９Ａを参照のこと。特定の結晶処方物を投与した場合、ｒｈＧＨの血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。試験プロトコールにしたがって、投与に関連する特定の測定点で動物を採血した。結果は、複合体化結晶材料（例えば、プロタミンおよびポリアルギニン）の吸収と非複合体化結晶処方物（例えば、ＣａＯＡＣおよびＺｎＯＡＣ）との間に差が存在することを明らかに示す。
【０１３０】
【表８】
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
【表１０】
【０１３３】
【表１１】
【０１３４】
【表１２】
【０１３５】
【表１３】
試験１日目の注射前および試験の翌朝の採血前に再度各ラットの重量を測定し、記録した。したがって、各群内の各ラットの体重の増減を、１日目の体重（注射前）から各翌日（注射前）を引くことによって計算した。群内の全ラットの平均体重を毎日計算した。これらの結果を、表１４に示す。
【０１３６】
【表１４】
表１４および図１９Ｂは、市販のｈＧＨの毎日用量の投与と比較した本発明の結晶の単回用量（１日目）の投与の７日間の効果を示す。例えば、図１９Ｂは、ポリアルギニンと複合体化したｈＧＨのカルシウム結晶により同一の期間にわたる１回のみの投薬する毎日の可溶性用量に匹敵する体重増加が得られることを示す。体重増加と血清中のｒｈＧＨの各放出プロフィールとの比較により、ポリアルギニン処方物のより長い放出は体重増加速度のさらなる持続と相関することが明らかである。
【０１３７】
（実施例２３）
（雌幼若カニクイザルにおける薬力学比較試験）
本試験の目的は、雌カニクイザルに皮下投与した場合の結晶組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学プロフィールを評価することであった。血清中の結晶ｒｈＧＨの制御放出および結晶ｒｈＧＨ放出の関数としての体重増加についてのモデルを確立するためにこれらのデータを得た。
【０１３８】
【表１５】
１２匹の雌幼若カニクイザルを、３つの群（群あたりそれぞれ４匹の動物を有する）に分け、可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびポリアルギニンとのナトリウム結晶（群２、実施例１８および１９による）、またはｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（群３、実施例１８および１９による）のいずれかを投与した。治療開始時に体重が２〜６ｋｇで４〜７歳の範囲のサルを、自動給水システムまたは水差しを備えたステンレススチール製ケージに個別に飼育した。動物の室内環境を制御し（約２１±３℃、湿度３０〜７０％、各２４時間周期で１２時間の明所および１２時間の暗所、および１時間あたり１２〜２０回の換気）、サルに標準的な認定された市販の霊長類固形試料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ＃２０５５Ｃ）を１日２回与えた。
【０１３９】
可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびポリアルギニンとのナトリウム結晶（群２）、またはｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（群３）の投与後のｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度を測定および比較するために、この霊長類試験を行った。上記表１５に示す移動時および投与前の全動物の体重を記録した。血液サンプル（約１ｍｌ）を、−２１６日目、−１２０日目、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、２４日目、４８日目、７２日目、９６日目、１２０日目、１４４日目、１６８日目、１９２日目、２１６日目、２４０日目、２６４日目、２８８日目、および３１２日目の朝に大腿部、上腕、または伏在静脈を介して各動物から採取した。血清分離チューブに採血し、凝血するまで室温で３０〜４５分間静置し、２〜８℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各血清サンプルを１００μｌ量に分注し、残りの量と両方を、分析前に−７０℃±１０℃で保存した。一般的には、ｒｈＧＨ決定にはより少量の１００μｌ量を使用し、ＩＧＦ−１決定にはより大きな量を使用した。必要な複製物の体積により、いくつかの例外が存在する。
【０１４０】
次いで、回収した血清サンプルを、ｈＧＨ濃度について分析した（表１６を参照のこと）。標準値の範囲外のｒｈＧＨ濃度を適切に希釈した。全値を使用して、霊長類ＧＨの動物平均バックグラウンドレベルあたりの個体を得ることができる。動物平均あたりの個体を、この試験化合物についての各測定点で測定した血清レベルから差し引いた。次いで、測定点あたりの修正値を、血清中のｒｈＧＨの修正平均を得るために平均化した。次いで、修正平均の標準偏差の使用およびＮ＝４の平方根で割ることによって標準誤差を計算した。
【０１４１】
【表１６】
図２０Ａは、ベースライン調整後の群１、２、および３についての時間（時間）の関数としての血清のｒｈＧＨレベルを示す。
【０１４２】
【表１７】
上記データは、血清中に認められる最大ｈＧＨ（Ｔｍａｘ）時の時間は、ポリアルギニン複合体化結晶ｈＧＨでは１０時間であり、プロタミン複合体化ナトリウム結晶ｈＧＨについては１０時間であり、可溶性ｈＧＨについては２時間であることを示す。可溶性ｈＧＨを１／７の用量の結晶投与で輸送する場合でさえ、上記表１７に列挙したＣｍａｘ値は、いずれかの複合体化結晶形態で輸送された場合、ｈＧＨは初期血清濃度の急上昇を有意に減少させることを示す。さらに、可溶性および結晶群のＴ９０％値を計算した。群１（可溶性形態）のＴ９０％は２０時間であり、群２および３（複合体化結晶形態）のＴ９０％は、それぞれ７４時間および７７時間であった。これらの結果は、複合体化結晶形態により可溶性形態よりも有意により長い期間ｈＧＨレベルを上昇させることを明白に示す。
【０１４３】
ｈＧＨの血清濃度の決定に加えて、時間の関数としてもＩＧＦ−１レベルを測定した。ＩＧＦ−１産生の測定により、ｒｈＧＨの有効性を確認した。以下の表１８は、群１〜３に動物についてのＩＧＦ−１濃度を報告する。図２０Ｂは、内因性ＩＧＦ−１レベルのベースラインを引いた後に、複合体化結晶処方物が毎日の可溶性投与に匹敵するＩＧＦ−１放出の刺激能力を示す。これらの結果は、非ヒト霊長類では、本発明の処方物を有利に使用してヒトにおいて類似の有効性を達成することができることを示す。
【０１４４】
【表１８−１】
【０１４５】
【表１８−２】
（実施例２４）
（異なるプロタミン比を使用した雌幼若カニクイザルにおける薬力学比較試験）
本試験の目的は、雌カニクイザルに皮下投与した場合の結晶組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学プロフィールを評価することであった。ナトリウムｈＧＨとプロタミンとの比が血清中の結晶ｒｈＧＨの制御放出および結晶ｒｈＧＨ放出の関数としての体重増加に効果があるかを試験するためにこれらのデータを得た。
【０１４６】
【表１９】
霊長類試験ＩＩでは、霊長類試験Ｉに記載の１２頭の雌幼若カニクイザルを、３つの群（群あたりそれぞれ４頭の動物を有する）に分け、可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝３：１）（群２）（実施例１８および１９）、またはｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝２：１）（群３）のいずれかを投与した（実施例１８および１９）。治療開始時に体重が２〜６ｋｇで４〜７歳の範囲のサルを、自動給水システムまたは水差しを備えたステンレススチール製ケージに個別に飼育した。動物の室内環境を制御し（約２１±３℃、湿度３０〜７０％、各２４時間周期で１２時間の明所および１２時間の暗所、および１時間あたり１２〜２０回の換気）、サルに標準的な認定された市販の霊長類固形試料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ＃２０５５Ｃ）を１日２回与えた。
【０１４７】
可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝３：１）（群２）、およびｒｈＧＨとＰＥＧおよびプロタミンとのナトリウム結晶（ｒｈＧＨ：プロタミンン＝２：１）（群３）の投与後のｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度を測定および比較するために、この霊長類試験を行った。上記表１９に示す移動時および投与前の全動物の体重を記録した。血液サンプル（約１ｍｌ）を、−１４４日目、−１２０日目、−９６日目、−７２日目、−４８日目、−２４日目、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、２４日目、４８日目、７２日目、９６日目、１２０日目、１４４日目、１６８日目、１９２日目、２１６日目、２４０日目、２６４日目、２８８日目、および３１２日目の朝に大腿部、上腕、または伏在静脈を介して各動物から採取した。血清分離チューブに採血し、凝血するまで室温で３０〜４５分間静置し、２〜８℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各血清サンプルを１００μｌ量に分注し、残りの量の両方を、分析前に−７０℃±１０℃で保存した。
【０１４８】
採取された血清サンプル中のｈＧＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を分析し、ベースライン修正を行った（表２０のデータを参照のこと）。標準値の範囲外のｒｈＧＨ濃度を適切に希釈することに留意のこと。全値を使用して、霊長類ｈＧＨの動物平均バックグラウンドレベルあたりの個体を得ることができる。動物平均あたりの個体を、この試験化合物についての各測定点で測定した血清レベルから差し引いた。次いで、測定点あたりの修正値を、血清中のｒｈＧＨの修正平均を得るために平均化した。次いで、修正平均の標準偏差の使用およびＮ＝４の平方根で割ることによって標準誤差を計算した。
【０１４９】
【表２０】
図２１Ａは、ベースライン調整後の群１、２、および３についての時間（時間）の関数としての血清ｒｈＧＨレベルを示す。
【０１５０】
【表２１】
これらのデータは、血清中に認められる最大ｈＧＨ時の時間は、プロタミン（３：１）複合体化結晶ｈＧＨでは１０時間であり、プロタミン（２：１）複合体化ナトリウム結晶ｈＧＨについては２４時間であり、可溶性ｈＧＨについては４時間であることを示す。可溶性ｈＧＨを１／７の用量の結晶投与で輸送する場合、上記表２２に列挙したＣｍａｘ値は、いずれかの複合体化結晶形態で輸送された場合、ｈＧＨは最大血清濃度を有意に減少させることを示す。群１（可溶性形態）のＴ９０％は２０時間であり、群２および３（複合体化結晶形態）のＴ９０％は、それぞれ１１９時間および７２時間であった。これらの結果は、複合体化結晶形態により可溶性形態よりも有意により長い期間ｈＧＨレベルを上昇させることを明白に示す。
【０１５１】
ｈＧＨの血清濃度の測定に加えて、時間の関数としてもＩＧＦ−１レベルを測定した。ＩＧＦ−１産生の測定により、ｒｈＧＨの有効性を確認した。以下の表２２は、群１〜３の動物についてのＩＧＦ−１濃度を報告する。図２１Ｂは、内因性ＩＧＦ−１レベルのベースラインを引いた後に、複合体化結晶処方物が毎日の可溶性投与に匹敵するＩＧＦ−１放出の刺激能力を示す。これらの非ヒト霊長類の結果は、本発明の処方物を有利に使用してヒトにおいて類似の有効性を達成することができることを示す。
【０１５２】
【表２２】
（実施例２５）
（下垂体摘出雌ラットへの単回または毎日の皮下注射によって投与したヒト成長ホルモンの薬力学試験）
本試験の目的は、下垂体摘出雄Ｗｉｓｔａｒラットに１回または７日間毎日皮下注射した場合にｈＧＨの異なる処方物の有効性を比較することであった。試験デザインを以下に示した。
【０１５３】
【表２３−１】
【０１５４】
【表２３−２】
【０１５５】
【表２４】
到着時に、体重が約９０〜１００ｇであり、かつ約２５〜３０日齢である１３８匹のＷｉｓｔａｒラットを、制御された条件下（約２３±３℃、相対湿度３０〜７０％、２４時間で１２時間の明所および１２時間の暗所、１時間あたり１０〜１５回の換気）で群毎に飼育し、試験中、精製水および固形試料を自由に摂取させた。ラットを、試験前に２週間環境に馴化させた。
【０１５６】
表２４に記載の濃度、体積、および投与計画にしたがって、１３８匹のラットにサンプルを投与した。試験化合物を、背中への単回皮下ボーラス注射として、１日目に１回または７日間毎日１回投与した。注射を容易にするために必要な場合、注射部位の毛を剃り、投与前後３日まで印をつけた。３００μｌシリンジに取りつけた３０ゲージ×８ｍｍニードルを使用して、試験化合物を投与した。シリンジへの取り出し前および投与前に気泡を形成することなく懸濁液または溶液を確実に均一にするために、試験化合物を慎重に逆にした。
【０１５７】
−３週目および−２週目で１週間に２回および−７日目から１４日目まで毎日体重増加を測定し、記録した。ラットの体重は、投与時に約１００ｇ±１０％であった。成長誘導発率の結果を図２２および２３に示し、表２５および２６にまとめる。表２５では、「高用量」は、５．６ｍｇ／ｋｇ／週を示す。データは、コントロール（群１、ｈＧＨなし）または可溶性ｈＧＨサンプル（群４および５）の７日間にわたる毎日の注射に対するｒｈＧＨ：ポリアルギニン（群７、実施例１８および１９）結晶またはｒｈＧＨ：プロタミン（群９および１０、実施例１８および１９）結晶の７日間にわたる単回注射を実施したラットの体重増加の比較を示す。群１（偽下垂体摘出ラット）は、７日間にわたり正常な成長を示す。さらに、７日間にわたる１回の注射でｒｈＧＨ：ポリアルギニンを投与したラット（群７）は、可溶性ｈＧＨを７日間毎日投与したラット（群５）よりも誘導成長率が高かった。これらの結果は、本発明のｈＧＨ結晶および処方物は１週間にわたる毎日の可溶性ｒｈＧＨ投与と同様に有効であることを示す。
【０１５８】
【表２５】
【０１５９】
【表２６】
（実施例２６）
（酢酸ナトリウムおよび硫酸プロタミンでのｈＧＨの結晶化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のストック溶液由来のｒｈＧＨの個別の分析によって、その供給源に関係なく同一の結晶化および溶解性を有するｒｈＧＨが得られた。約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｍｌである全容液中での脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、硫酸プロタミン、および酢酸ナトリウムのそれぞれの最終濃度が１００ｍＭ、６％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍｌ、および５００ｍＭでの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。長さが約２〜２５μｍのニードル様結晶が得られた。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、９０％を超える結晶収量が測定された。
【０１６０】
（実施例２７）
（酢酸ナトリウムおよびポリアルギニンＨＣｌのｈＧＨの結晶化）
ここでは、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、２つのストック（一方はＥ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に由来し、他方は酵母（Ｌｕｃｋｙ Ｇｏｌｄ）に由来する）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のストック溶液由来のｒｈＧＨの個別の分析によって、その供給源に関係なく同一の結晶化および溶解性を有するｒｈＧＨが得られた。約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨフィード溶液を、ＢｉｏＲａｄから供給された１０ＤＧ脱塩カラムを使用して精製した。サンプルのローディング前に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ（ｐＨ８．０））でのカラムの洗浄によってカラムを馴化した。次いで、ｒｈＧＨサンプルをロードし、重力によってカラムに侵入させた。最初の３ｍｌの溶離液の破棄後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨを溶離および回収した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ １０，０００）を使用した３５００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離によって濃縮した。２８０ｎｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸光度によって測定したところ、ｈＧＨの濃度は３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最終タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｍｌである全容液中での脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、ポリアルギニンＨＣｌ、および酢酸ナトリウムのそれぞれの最終濃度が１００ｍＭ、２％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍｌ、および５００ｍＭでの添加によって結晶を成長させた。次いで、溶液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートした。長さが約２〜２５μｍのニードル様結晶が得られた。結晶の遠心分離およびペレット化後、上清を抽出し、９０％を超える結晶収量が測定された。
【０１６１】
上記発明は、理解をより明確にする目的で例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、記載の実施形態を含む本明細書の開示の精神または範囲を逸脱する事なく一定の変更形態および修正形態を得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはヒト成長ホルモン誘導体のポリアルギニン結晶。
【請求項１】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはヒト成長ホルモン誘導体のポリアルギニン結晶。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２０１０−２０９０７９（Ｐ２０１０−２０９０７９Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８７４０７（Ｐ２０１０−８７４０７）
【出願日】平成２２年４月５日（２０１０．４．５）
【分割の表示】特願２００５−５０８６３５（Ｐ２００５−５０８６３５）の分割
【原出願日】平成１５年１２月３１日（２００３．１２．３１）
【出願人】（５０５２４５４９４）アルタス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月５日（２０１０．４．５）
【分割の表示】特願２００５−５０８６３５（Ｐ２００５−５０８６３５）の分割
【原出願日】平成１５年１２月３１日（２００３．１２．３１）
【出願人】（５０５２４５４９４）アルタス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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