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ヒト第20染色体の20q13領域における新規アンプリコンおよびその使用
説明

ヒト第20染色体の20q13領域における新規アンプリコンおよびその使用

【課題】腫瘍表現型に関連する20q13中の核酸配列の明確な特徴付けを提供すること。
【解決手段】本発明は、癌遺伝学および細胞遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、癌に関連する、ヒト第20染色体上の新規なアンプリコンに関連する核酸配列の同定に関する。より詳細には、本発明は、種々の癌(特に、乳癌)に関連した、約20q13.2での増幅の領域における新規な「アンプリコン」またはゲノム核酸の同定に関する。本発明の新規なアンプリコンは、20q13.2のこの領域に特異的なプローブとして、ならびに種々の癌の診断および予後のために使用され得る。ヒト核酸を含むサンプル中の本発明の新規なアンプリコンの存在およびコピー数についてスクリーニングするためのキットもまた、提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、米国特許出願番号(「USSN」)第08/680,395号(1996年7月15日出願);およびUSSN 08/731,499号(1996年10月16日出願)に関連する。本出願はまた、上記出願の各々をそれら全体として、かつ全ての目的のために参考として援用する。
【0002】
本発明は、National Institutes of Healthによって与えられた助成金番号NIH/NCI 5P50CA−58207−06の下、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0003】
(発明の分野)
本発明は、癌遺伝学および細胞遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、癌に関連する、ヒト第20染色体上の新規なアンプリコンに関連する核酸配列の同定に関する。より詳細には、本発明は、約20q13でのゲノム核酸増幅の領域における、新規な「アンプリコン」の同定に関する。これらの核酸配列は、種々の癌の診断および予後におけるプローブとして使用され得る。
【背景技術】
【0004】
(発明の背景)
染色体異常は、しばしば、遺伝障害、変性疾患および癌に関連する。染色体全体の欠失または増殖、および染色体セグメントまたは特異的領域の欠失あるいは増幅は、癌における共通の出来事である(Smith(1991)Breast Cancer Res.Treat.18:Suppl.1:5−14;van de Vijer(1991)Biochim. Biophys.Acta.1072:33−50)。実際に、DNA配列の増幅および欠失は、癌の原因であり得る。例えば、プロトオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子はそれぞれ、頻繁に腫瘍形成の特徴である(Dutrillaux(1990)Cancer Genet.Cytogenet.49:203−217)。明らかに、癌に関連する特定のゲノム領域の同定およびクローニングは、腫瘍形成の研究に対して、ならびに診断および予後のより良好な手段を開発することにおいての、両方で重要である。
【0005】
比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)を使用する研究は、ヒト乳房腫瘍において約20倍増幅されたゲノム領域を明らかにした(Muleris(1994)Genes Chromosomes Cancer 10:160−170;Kalliioniemi(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2156−2160;Isola(1995)Am.J.Pathol.147:905−911)。これらの領域は、腫瘍進行または治療に対する応答において役割を果たし得る、優位に作用する遺伝子をコードすることが予測される。これらの増幅された領域のうち3つは、以下の確立されたオンコジーンに関連した:17q12のERBB2、8q24のMYCならびに11q13のCCND1およびEMS1。乳癌において、ERBB2およびCCND1/EMS1の増幅ならびに過剰発現は、平均与命の減少に関連する(Gaudray(1992)Mutat.Res.276:317−328;Borg(1991)Oncogene 6:137−143)。MYC増幅は、リンパ節関与、進行段階の癌および再発の危険性の増加に関連した(Borg(1992)Intern.J.Cancer 51:687−691;Berns(1995)gene 159:11−18)。明らかに、乳癌または他の腫瘍細胞に関連する、さらなる増幅されたゲノム領域の同定は、腫瘍形成の研究に対して、および癌診断を開発することにおいて重要である。
【0006】
CGH研究において見出された増幅された領域のうちの1つは、第20染色体、特に、20q13上に存在した。20q13の増幅は、その後、種々の腫瘍型において存在すること、および攻撃的な腫瘍挙動に関連することが見出された。20q13コピー数の増加は、乳癌細胞株の40%および原発性乳房腫瘍の18%において見出された(Kalliioniemi(1994)前出)。20q13でのコピー数増加はまた、以下の癌の25%より多くにおいて報告されている:卵巣(Iwabuchi(1995)Cancer Res.55:6172−6180)、結腸(Schlegel(1995)Cancer Res.55:6002−6005)、頭部および頸部(Bockmuhl(1996)Laryngor.75:408−414)、脳(Mohapatra(1995)Genes Chromosomes Cancer 13:86−93)、および膵臓(Solinas−Toldo(1996)Genes Chromosomes Cancer 20:399−407)。20q13領域は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を使用して、乳房腫瘍および乳房細胞株においてより高い分解能で分析された。20q13内の1.5メガベース(Mb)の広範に増幅された領域が、同定された(Stokke(1995)Genomics 26:134−137);Tanner(1994)Cancer Res.54:4257−4260)。間期FISHは、乳癌の29%および7%においてそれぞれ、低レベル(>1.5×)および高レベル(>3×)の20q13配列増幅を明らかにした(Tanner(1995)Clin.Cancer Res.1:1455−1461)。高レベルの増幅は、攻撃的な腫瘍表現型と関連した(Tanner(1995)前出;Courjal(1996)Br.J.Cancer 74:1984)。別の研究は、FISHを使用して146の未培養乳癌腫における染色体20qに沿った14の遺伝子座を分析し、以下を含む、3つの独立して増幅された領域を同定した:20q13.2のRMC20C001領域(この場合の9.6%において高度に増幅された)、PTPN1領域の3Mb近位(6.2%)、および20q11のAIB3領域(6.2%)(Tanner(1996)Cancer
Res.56:3441−3445)。明らかに、20q13内の増幅された領域の明確な特徴付けは、これらの癌の診断および予後における重要な工程である。
【0007】
培養細胞における染色体20qのコピー数の増加もまた、進行性腫瘍の表現型特徴(不死化およびゲノムの不安定性を含む)に関連した。例えば、20q11−qterでのコピー数の増加は、ヒトパピローマウイルス(HPV)16E7またはHPV16でそれぞれ感染させた後の、ヒト尿路上皮(uro−epithelial)細胞(HUC)(Reznikoff(1994)Genes Dev.8:2227−2240)およびケラチノサイト(Solinas−Toldo(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3854−3859)において頻繁に観察された。さらに、20q13.2でのコピー数の増加は、いくらかのHPV16 E7をトランスフェクトしたHUC株におけるp53非依存性のゲノム不安定性に関連した(Savelieva(1997)Oncogene 14:551−560)。これらの研究は、20q(特に、20q13.2)上の1以上の遺伝子の発現の増加が、乳癌および他の固形腫瘍の進化に寄与することを示唆する。いくつかの候補オンコジーンは、AIB1(Anzick(1997)Science 277:965−968)、BTAK(Sen(1997)Oncogene 14:2195−200)、CAS(Brinkmann(1996)Genome Res.6:187−194)およびTFAP2C(Williamson(1996)Genomics 35:262−264)を含む、20q上で増幅されるものとして同定されている。明らかに、腫瘍表現型に関連する20q13中の核酸配列の明確な特徴付けは、これらの癌の診断および予後における重要な工程である。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、癌および腫瘍形成に関連する核酸の新規領域の同定およびゲノムマッピングに関する。
【0009】
本発明は、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための新規な方法を提供する。この方法の第1の工程は、ヒト細胞由来の核酸のサンプルおよびプローブを提供する。ここで、このプローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。第2の工程は、このヒト核酸にプローブを接触させる工程を含み、ここで、このプローブは、プローブがヒトゲノム核酸にストリンジェント条件下で選択的に結合する条件下で、ヒトゲノム核酸と接触され、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。最後の工程は、このハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程である。1つの実施態様において、このヒト核酸は、ゲノムDNAであり得、このゲノムDNAは、乳房腫瘍細胞から単離され得る。この検出工程は、アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する。
【0010】
この方法において、このプローブはまた、D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。代替的な実施態様において、このプローブは、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTSマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。このプローブはまた、D20S211、D20S854、D20S876、D20S1044、D20S913、D20S720およびD20S120からなる群より選択されるGDB遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。あるいは、このプローブはまた、RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4018、RMC20P4069、RMC20B4121、RMC20B4087およびRMC20P4070からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。
【0011】
別の実施態様において、このプローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み得る。この検出工程は、このポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の形成を検出する工程を包含し得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTS PCRプライマー対であり得る。
【0012】
本発明の方法において、このプローブは、固体表面に結合され得、そしてこの結合されたプローブは、核酸アレイのメンバーであり得る。ヒト核酸は、検出可能な組成物で標識され得る。この検出可能な組成物は、フルオレセインまたはテキサスレッドであり得る。代替的な実施態様において、プローブが、検出可能な組成物で標識され得る。この方法はさらに、参照細胞由来の核酸を提供し、ここで、この参照細胞核酸は、ヒトゲノム核酸より前に、またはヒトゲノム核酸と同時に、このプローブと接触される。この方法はさらに、Cot−1 DNAを提供し得、ここでこのCot−1 DNAは、ヒトゲノム核酸にプローブを接触させる前に、ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされる。
【0013】
本発明はまた、ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブを提供し、このプローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。あるいは、このプローブは、以下のものに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る:D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸配列;または、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTSマーカー;または、D20S211、D20S854、D20S876、D20S1044、D20S913、D20S720およびD20S120からなる群より選択されるGDB遺伝子座核酸配列;または、RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4018、RMC20P4069、RMC20B4121、RMC20B4087およびRMC20P4070からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列。
【0014】
別の実施態様において、このプローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTS PCRプライマー対であり得る。
【0015】
本発明はまた、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのキットを提供し、このキットは、プローブを含む区画を含み、ここで、このプローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。あるいは、このプローブは、以下のものに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る:D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸配列;または、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTSマーカー;または、D20S211、D20S854、D20S876、D20S1044、D20S913、D20S720およびD20S120からなる群より選択されるGDB遺伝子座核酸配列;または、RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4018、RMC20P4069、RMC20B4121、RMC20B4087およびRMC20P4070からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列。
【0016】
別の実施態様において、このキットのプローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTS PCRプライマー対であり得る。このプローブは、クローン化されたヒト核酸であり得、そしてこのクローン化されたヒトゲノム核酸は、固体表面に結合され得る。この結合されたプローブは、核酸アレイのメンバーであり得る。このキットはさらに、細胞中の2より多いアンプリコンのコピーの検出が、癌または腫瘍形成の診断または予後であり得ることを示す、説明書をさらに含み得る。
【0017】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1) ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下:
ヒト細胞由来の核酸のサンプルおよびプローブを提供する工程であって、ここで、該プローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、工程;
該ヒト核酸に該プローブを接触させる工程であって、ここで、該プローブは、該プローブがヒトゲノム核酸にストリンジェント条件下で選択的に結合する条件下で、該ヒトゲノム核酸と接触され、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程;および
該ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程
を包含する、方法。
(項目2) 前記ヒト核酸が、ゲノムDNAである、項目1に記載の方法。
(項目3) 前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程が、前記アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目4) 前記ゲノム核酸が、乳房腫瘍細胞から単離される、項目1に記載の方法。
(項目5) 前記プローブが、D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目1に記載の方法。
(項目6) 前記プローブが、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTSマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目1に記載の方法。(項目7) 前記プローブが、D20S211、D20S854、D20S876、D20S1044、D20S913、D20S720およびD20S120からなる群より選択されるGDB遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目1に記載の方法。
(項目8) 前記プローブが、RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4018、RMC20P4069、RMC20B4121、RMC20B4087およびRMC20P4070からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目1に記載の方法。
(項目9) 前記プローブが、D20S211からD20S120までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み、そして前記検出工程が、該ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の形成を検出する工程を包含する、項目1に記載の方法。
(項目10) 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTS PCRプライマー対である、項目9に記載の方法。
(項目11) 前記プローブが、固体表面に結合される、項目1に記載の方法。
(項目12) 前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである、項目11に記載の方法。
(項目13) 前記ヒト核酸が、検出可能な組成物で標識される、項目1に記載の方法。(項目14) 前記検出可能な組成物が、フルオレセインまたはテキサスレッドである、項目13に記載の方法。
(項目15) 前記プローブが、検出可能な組成物で標識される、項目1に記載の方法。(項目16) 項目1に記載の方法であって、ここで、該方法はさらに、参照細胞由来の核酸を提供し、ここで、該参照細胞核酸は、前記ヒトゲノム核酸より前に、または該ヒトゲノム核酸と同時に、前記プローブと接触される、方法。
(項目17) 項目1に記載の方法であって、ここで該方法はさらに、Cot−1 DNAを提供し、ここで該Cot−1 DNAは、前記ヒトゲノム核酸に前記プローブを接触させる前に、該ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされる、方法。
(項目18) ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブであって、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、核酸プローブ。
(項目19) D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目18に記載のプローブ。
(項目20) AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTSマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目18に記載のプローブ。
(項目21) D20S211、D20S854、D20S876、D20S1044、D20S913、D20S720およびD20S120からなる群より選択されるGDB遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目18に記載のプローブ。
(項目22) RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4018、RMC20P4069、RMC20B4121、RMC20B4087およびRMC20P4070からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目18に記載のプローブ。
(項目23) D20S211からD20S120までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含む、項目18に記載のプローブ。
(項目24) 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTS PCRプライマー対である、項目23に記載のプローブ。
(項目25) ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのキットであって、該キットは、プローブを含む区画を含み、ここで、該プローブは、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、キット。
(項目26) 前記プローブが、D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸を含む、項目25に記載のキット。
(項目27) 前記プローブが、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTSマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目25に記載のキット。
(項目28) 前記プローブが、D20S211、D20S854、D20S876、D20S1044、D20S913、D20S720およびD20S120からなる群より選択されるGDB遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目25に記載のキット。
(項目29) 前記プローブが、RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4069、RMC20P4018、RMC20B4121、RMC20B4087およびRMC20P4070からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目25に記載のキット。
(項目30) 前記プローブが、D20S211からD20S120までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含む、項目25に記載のキット。
(項目31) 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227およびAFM276xh1からなる群より選択されるSTS PCRプライマー対である、項目30に記載のキット。
(項目32) 前記プローブが、クローン化されたヒト核酸である、項目25に記載のキット。
(項目33) 前記クローン化されたヒトゲノム核酸が、固体表面に結合される、項目25に記載のキット。
(項目34) 前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである、項目33に記載のキット。
(項目35) 細胞中の2より多いアンプリコンのコピーの検出が、癌または腫瘍形成の診断または予後であり得ることを示す、説明書をさらに含む、項目25に記載のキット。
【0018】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、詳細な説明の残りの部分、図面および特許請求の範囲を参照することによって明らかになり得る。
【0019】
本明細書中に引用される全ての刊行物、GenBank登録証書(配列)、特許および特許出願は、全ての目的のために参考として本明細書中に明確に援用される。
【0020】
【表1】

【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】図1は、ハイブリダイゼーション分析を使用する、腫瘍(「S21」)の20q13.2領域の分析の結果を示す。このグラフは、腫瘍S21において選択された20q13.2クローンについての比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)比を示し、これは、「G/R」、すなわち赤色蛍光(テキサスレッドdCTP)に対する緑色蛍光(フルオレセインdCTP)の比を、この20q13.2コンティグクローンに対するゲノム核酸ハイブリダイゼーションの量の関数として表す。
【図2】図2は、第20染色体の20q13.2領域における、選択されたマーカーおよびクローンの分布ならびに位置を示す。20q13ゲノム核酸インサートを含む3つの隣接したYAC(856a10、931h6、820f5)を、水平線として示す。
【図3】図3は、乳癌細胞株MCF7(上パネル)、ならびに2つの乳癌腫瘍、S21およびS50(下の2つのパネル)を使用する、20q13.2の高分解能アレイ分析の結果を示す。上パネルは、コンティグのアレイプローブの位置を示す。この上パネル中のプローブクローンを、表1に列挙する;クローン名は、最後の4桁の数で示した。
【発明を実施するための形態】
【0022】
(定義)
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。
【0023】
本明細書中で使用される場合、用語「アンプリコン」とは、変更されたコピー数で存在する場合に癌に関連するゲノム核酸の領域をいう。例えば、本発明は、異常なコピー数で存在する場合に癌に関連する、ヒト染色体20q13.2上の新規な核酸配列を提供する。代表的に、本発明の核酸配列は、癌(例えば、乳癌)に関連する場合、増加されたコピー数を有する。従って、用語「アンプリコン」とは、これらの新規な配列についてをいう。しかし、このコピー数はまた、いくつかの環境下で減少され得る。従って、本発明は、コピー数における変化を分析して、癌をスクリーニングおよび診断するためのプローブとして使用され得る核酸を提供する。高分解能アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(「アレイCGH」)を使用して、本発明のアンプリコン由来の配列を、核酸サンプル中の単一コピー数の変化決定するためのプローブとして使用され得る。コピー数の決定(定量)はまた、癌の予後において補助し得る。なぜなら、アンプリコンのコピー数の増加は、攻撃性の腫瘍表現型に関連するからである。特に、本発明のプローブは、特に20q13.2領域における、例えば、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。代替的な実施態様において、このプローブは、D20S120とD20S211との間の距離にわたる任意の核酸配列;20q13.2領域における任意のクローン、GDB遺伝子座またはSTSマーカー(例えば、表1に列挙される例示的クローン、GDB遺伝子座、STSおよび他のマーカー(例えば、WI−9227))に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。
【0024】
本明細書中で使用される場合(例えば、表1および図2において使用される場合)、用語「D20S120」、「D20S211」、「D20S193」および同様の「Dナンバー」とは、Genome Database(「GDB」)の命名であり、これらは、特定の染色体にマッピングされた特定のゲノム核酸配列をいう(例えば、Letovsky(1998)Nucleic Acids Res.26:94−99を参照のこと)。これらの遺伝子座およびSTSの命名の情報は、公共のデータベース上で利用可能であり、例えば、http://www.gdb.org/を参照のこと。表1は、本発明の新規なアンプリコンを同定するために使用される高密度アレイを含むクローンについての、GDB遺伝子座およびそれらに対応するSTS名を列挙する。これらのGDB遺伝子座は、ヒト第20染色体の20q13.2領域をマッピングする。遺伝子座「D20S120」、「D20S211」および「D20S193」は、以下でさらに詳細に記載される。
【0025】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」および「特異的なハイブリダイゼーション」および「選択的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェント条件下で特定のヌクレオチドに優先的な、核酸分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイズをいう。用語「ストリンジェント条件」とは、プローブがその標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして他の配列により少ない程度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件をいう。核酸ハイブリダイゼーションの状況下(例えば、アレイハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーション)での「ストリンジェントハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する例示的ガイドは、例えば、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−−Hybridization with Nucleic Acid Probes part I、第2章、「Overview of principle of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier,NY(「Tijssen」)に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定の配列についての熱融点(Tm)より約5℃低く選択さ
れる。Tmは、標的配列の50%が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度
(規定されたイオン強度およびpH下)である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのTmと等しく選択される。アレイ上あるいはサザンブロットまたはノーザンブロットのフィルター上に100を超える相補的残基を有する、相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液(例えば、Sambrookおよび以下の詳細な議論を参照のこと)を使用して42℃であり、このハイブリダイゼーションを一晩行う。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、0.15M NaClで、72℃、約15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃で約15分間の0.2×SSC洗浄である(SSC緩衝液の説明については、例えば、Sambrook(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NY(「Sambrook」)を参照のこと)。しばしば、低ストリンジェンシーの洗浄が、高ストリンジェンシーの洗浄に先立ち、バックグラウンドプローブシグナルを除去する。例えば、100ヌクレオチドをこえるヌクレオチドの二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、1×SSCで、45℃、15分間である。100ヌクレオチドをこえるヌクレオチドの二重鎖についての低ストリンジェンシーの洗浄の例は、4〜6×SSCで、40℃、15分間である。
【0026】
本明細書中で使用される場合、用語「検出可能な組成物で標識される」とは、検出可能な組成物(すなわち、標識)に結合された核酸をいう。検出は、例えば、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的または化学的手段により得る。例えば、有用な標識としては、以下が挙げられる:32P、35S、3H、14C、125I、131I;蛍光色素(例え
ば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体、テキサスレッド)、電子密度試薬(例えば、金)、酵素(例えば、ELISAにおいて一般に使用されるようなもの(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ))、比色標識(例えば、金コロイド)、磁気標識(例えば、DynabeadsTM)、ビオチン、ジオキシゲニン、またはハプテンおよび抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質。標識は、検出されるべき核酸、ペプチドまたは他の標的化合物中に直接組み込まれ得るか、あるいは標識は、その標的にハイブリダイズするかもしくは結合するプローブまたは抗体に結合され得る。ペプチドは、二次レポーターによって認識される、予め決定されたポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、転写アクチベーターポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ)を組み込むことによって検出可能にされ得る。標識は、種々の長さのスペーサーアームによって結合され、可能性のある立体障害を減少し得るか、または他の有用もしくは所望の特性に対して影響を与え得る。Mansfield(1995)Mol
Cell Probes 9:145−156を参照のこと。
【0027】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。この用語は、参照核酸として、所望される目的のために、類似のまたは改善された結合特性を有する天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む、核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを含む。この用語はまた、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で、または所望される目的のためにその上に改善された速度で代謝される核酸を含む。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を含む。本発明によって提供されるDNA骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイト、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3’−チオアセタール、メチレン(メチルイミノ)、3’−N−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸(PNA)が含まれる;Oligonucleotide and Analogues,a Practical Approach,F.Eckstein編、Oxford University PressにおけるIRL Press(1991);Antisense Strategies,Annals of the New York Academy of Sciences,第600巻、BasergaおよびDenhardt編(NYAS 1992)を参照のこと;Milligan(1993)J.Med.Chem.36:1923−1937;Antisense Research and Applications(1993,CRC Press)。PNAは、非イオン性骨格(例えば、N−(2−アミノエチル)グリシン単位)を含む。ホスホロチオエート結合は、WO 97/03211;WO 96/39154;Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189−197に記載されている。この用語に含まれる他の合成骨格には、メチルホスホネート結合、または交互のメチルホスホネートおよびホスホジエステル結合(Strauss−Soukup(1997)Biochemistry 36:8692−8698)ならびにベンジルホスホネート結合(Samtag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6:153−156)が含まれる。用語核酸は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、および増幅産物に交換可能に使用される。
【0028】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸アレイ」とは、複数の標的エレメントであり、各々の標的エレメントは、サンプル核酸がハイブリダイズする固体表面に固定化された1つ以上の核酸分子(プローブ)を含む。標的エレメントの核酸は、特異的な遺伝子またはクローン由来の配列(例えば、本明細書中に開示される本発明のプローブ)を含み得る。他の標的エレメントは、例えば、参照配列を含む。種々の寸法の標的エレメントが、本発明のアレイにおいて使用され得る。一般的に、より小さな標的エレメントが好ましい。代表的には、標的エレメントは、直径約1cmより小さい。一般的なエレメントサイズは、約1μm〜約3mm、好ましくは約5μmと約1mmとの間である。アレイの標的エレメントは、異なる密度で固体表面上に配置され得る。標的エレメントの密度は、多数の因子(例えば、標識の性質、固体支持体など)に依存する。当業者は、各々の標的エレメントが、異なる長さおよび配列のプローブ核酸の混合物を含み得ることを認識する。従って、例えば、標的エレメントは、1コピー以上のクローニングされたDNAの断片を含み得、そして各コピーは、異なる長さのフラグメントに分解され得る。標的エレメント上に固定されたプローブ核酸の長さおよび複雑さは、本発明にとって重要ではない。当業者は、これらの要因を調節して、所定のハイブリダイゼーション手順のために最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル産生を提供し得、そして異なる遺伝子またはゲノム位置間での必要とされる分解能を提供する。種々の実施態様において、プローブ配列は、約1kbと約1Mbとの間、約10kbと約500kbとの間、約200〜約500kbの間、および約50kb〜約150kbの複雑さを有する。
【0029】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「核酸プローブ」は、サンプルに対するハイブリダイゼーションが検出され得る1つ以上の核酸フラグメントのコレクションであると定義される。このプローブは、以下に記載されるように、標識されなくともまたは標識されてもよく、その結果、標的またはサンプルへのその結合が検出され得る。このプローブは、1つ以上の特定の(あらかじめ選択された)ゲノムの部分由来の核酸の供給源(例えば、1つ以上のクローン、単離された全体の染色体、または染色体フラグメント、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物のコレクション)から作製される。本発明のプローブは、本明細書中で記載される領域において見出される核酸から作製される。プローブまたはゲノム核酸サンプルは、いくつかの様式でプロセスされ得る(例えば、反復核酸のブロッキングもしくは除去、または独特な核酸での富化)。用語「サンプル」は、検出された核酸をいうだけではなく、標的に適用される形態にある(例えば、核酸のブロッキングなどを伴う)検出可能な核酸をいう。核酸のブロッキングはまた、別々に言及され得る。「プローブ」が特異的に表すことは、その用語が使用される文脈から明確である。プローブはまた、アレイ中にある場合、固体表面(例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、融合したシリカスライド)に固定化された、単離された核酸であり得る。いくつかの実施態様において、プローブは、例えば、WO 96/17958に記載されるように、核酸のアレイのメンバーであり得る。高密度アレイを作製し得る技術もまた、この目的のために使用され得る(例えば、Fodor(1991)Science 767−773(1991);Johnston(1998)Curr.Biol.8:R171−R174;Schummer(1997)Biotechniques 23;1087−1092;Kern(1997)Biotechniques 23:120−124;米国特許第5,143,854号を参照のこと)。当業者は、本明細書中に記載される特定のプローブの正確な配列がある程度まで改変されて、開示されたプローブに「実質的に同一」であるが、しかしそれが由来するプローブと同じ標的またはサンプルに特異的に結合する(すなわち、特異的にハイブリダイズする)能力を保持するプローブを作製し得ることを認識する(上記の議論を照のこと)。このような改変は、本明細書中に記載される個々のプローブに対する言及として詳細に網羅される。
【0030】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト核酸のサンプル」とは、本発明のプローブに対するハイブリダイゼーションのために適切な形態でヒトDNAまたはヒトRNAを含むサンプルをいう。核酸は、単離、クローニング、または増幅され得る;それは、特定の染色体、または本明細書で開示される特定のアンプリコンもしくは欠失中の選択された配列(例えば、特定のプロモーター、遺伝子、増幅フラグメントまたは制限フラグメント、cDNAなど)由来の、例えば、ゲノムDNA、mRNA、またはcDNAであり得る。核酸サンプルは、特定の細胞または組織から抽出され得る。核酸サンプルが調製される細胞または組織サンプルは、代表的には、アンプリコン増幅もしくは欠失または検出される転座と関連する癌を有すると疑われる患者から取られる。細胞サンプルおよび組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そして吸引、組織切片、針生検などを含むがこれらに限定されない。しばしばサンプルは、患者由来のサンプルである「臨床サンプル」である。これは、組織学的目的のために取られた組織の切片(例えば、凍結切片またはパラフィン切片)を含む。このサンプルはまた、細胞培養物からの(細胞の)上清または細胞自体に由来し得るか、組織培養物、および、染色体異常を検出することまたはアンプリコンコピー数を決定することが所望され得る他の培地からの細胞に由来し得る。いくつかの場合において、核酸は、ハイブリダイゼーションの前に、PCRのような標準的な技術を用いて増幅され得る。サンプルは、固体上に固定された単離された核酸であり得る。サンプルはまた、個々の核酸が実質的にインタクトで残って、そして含むように調製され得る。
【0031】
用語「配列タグ化部位」または「STS」とは、配列に基づく、クローニングしたDNAセグメント(例えば、コンティグのメンバー、異常な制限部位(制限マップのメンバー)を含むセグメント、遺伝的にマッピングされたDNA多型を検出するプローブ、または特定の細胞遺伝学的バンドにインサイチュでハイブリダイズする配列)を「タグ化する」かまたは同定する方法をいう。STS指定を割り当てるために、各々のクローニングされたDNAセグメントは、(少なくとも)約200〜500塩基対領域にわたって配列決定される。この配列データを用いて、PCRプライマーは設計され、そしてそれらがPCR増幅によるその特定の配列を同定するか、または「タグする」ために使用され得ることを確認するために試験される。セグメントおよびプライマー配列、ならびにPCRアッセイ条件の公的データベースへの提出は、誰でも迅速かつ都合よく、実質的にいかなるゲノムクローンまたはフラグメントをも同定−およびマッピング−することを可能にする。例えば、Olson(1989)「A common language for physical mapping of the human genome」、Science 245:1434−1435を参照のこと。
【0032】
(発明の詳細な説明)
本発明は、ヒトの癌の検出、診断、および診断のために有用な、ヒト染色体20の20q13.2領域中の、新規な、核酸の限定される領域を同定する。本明細書中で開示される核酸領域は、しばしば、ヒトの癌(特にヒトの乳癌)における染色体異常およびコピー数の変化と関連する。この新規な領域は、「アンプリコン」と呼ばれる。なぜなら、これらは代表的には、癌細胞におけるコピー数を増加するからである。従って、これらの新規な配列は、コピー数の変化を検出して、疾患(例えば癌、特に乳癌)の存在についてスクリーニングするためのプローブおよび方法において使用される。さらに、コピー数の決定は、特定の癌の予後において使用され得る。なぜなら、高コピー数は、しばしば、攻撃的な腫瘍のふるまいおよび治療に対する不良な応答に関連するからである。
【0033】
核酸領域、すなわちアンプリコンの増幅は、代表的には、増幅した表現型の原因である決定的な最小の「core」遺伝子配列によって駆動される。多くの例において、この決定的なコア遺伝子は、オンコジーンをコードする。従って、増幅を駆動する最小遺伝子配列の同定は、オンコジーンを同定するようである。さらに、非常に増幅された領域を有する腫瘍は、代表的には、非常に増幅された20q13.2領域を有する腫瘍を用いて観察されたように、より攻撃的な腫瘍であるようである。従って、最小の、または「増幅を駆動する」アンプリコン配列の定義および使用は、新規なかつ改善された診断的および予後的手順を生成する。癌細胞中での領域のコピー数を決定するための、より小さなまたは「最小の」アンプリコン遺伝子配列の使用は、より正確な結果(すなわち、より大きな遺伝子セグメントを使用して獲得された結果よりも、より良好な診断および予後)を生じる。本発明は、第20染色体の20q13.2領域中の、このようなより小さな、最小の「コア」領域、新規なアンプリコンを提供する。これは、以前に記載されたコア領域とは異なる。
【0034】
高分解能アレイに基づく比較的なゲノムハイブリダイゼーション(アレイCGH)は、特に癌細胞(例えば、乳癌細胞)中の第20染色体の20q13.2領域中のコピー数の変動を分析するために適用された。20q13.2配列の高分解能マッピングは、位置的に重複するクローンのアレイ(「コンティグ」と呼ばれる)を使用して達成された。コンティグを含むクローンの第20染色体インサートの大部分は、サイズが約1メガベース(Mb)未満で、約100〜200キロベース(kb)の範囲であった。このことは、このアレイが、核酸サンプル由来の区切られた領域(「アンプリコン」)を非常に高程度の分解能まで物理的にマッピングし、そして定量することを可能にした。このことは、本発明の新規な20q13.2アンプリコンの発見をもたらした。
【0035】
本発明の新規なアンプリコンを同定した高分解能アレイにおいて使用されるクローンは、図3の一番上のパネルにおいて示される。このアレイは、1.5Mbをカバーするクローンの重複するセットを含む。図3の一番上のパネルは、この高分解能アレイのコンティグを含むクローンの名称および相対位置を示す(図3において、プローブクローンの名称は、最後の4つの数字で省略されており、すなわち、クローンRMC20B4097は、「4097」と省略されている)。図3は、いかに高分解能アレイ(「CGH」)データが、増幅された領域中で、より小さな「決定的な」遺伝子セグメントを位置付けする際に補助し得るかを図示する(例えば、図示された重複するクローンのセットが、本発明の新規な20q13.2アンプリコンを発見するためにアレイ中で使用されたように)。図3は、乳癌細胞株MCF7(例えば、Benz(1989)J.Natl.Cancer Inst.81:1704−1709を参照のこと)(上のパネル)、および2つの腫瘍、S21およびS50(下の2つのパネル)(Bay Area Breast Cancer SPORE,UCSF Cancer Center,Univ.of Californiaより提供された)の高分解能分析の結果を示す。
【0036】
表1はさらに、このアレイの種々のクローン(「RMC」クローン名称、左側のカラム)および対応するGDB遺伝子座名(「D番号」)、STSマーカー表示、ならびに公的ドメインからの他の関連する名称を例証する。いくつかのクローンは、公的なデータベース由来のいくつかのSTSマーカー(例えば、RMC20P4030)を含む。多くのSTSマーカー(およびそれらの関連するPCRプライマー、上記のSTSの定義を参照のこと)は、「D番号」によって表示されたGDB遺伝子座を同定するために使用され得る。「D」遺伝子座(例えば、D20S902)はまた、別のクローンの表示(例えば、AFMc028zc5)と関連し得る。別の例は、クローンRMC20P4009であり、これはSGC31010およびWI−16697を含む。
【0037】
図3において、水平軸上のクローン的に関連する線の長さは、染色体に沿った距離に比例する。テロメアは右側にある。MCF7(上のパネル)、腫瘍S21(中間のパネル)、および乳房腫瘍S50(下のパネル)についての高分解能アレイCGHデータは、個々のクローン(プローブ)の長さおよび染色体に沿ったそれらのマッピングされた位置を表す、水平方向の黒い棒とともにプロットされる。それらは、それらのCGH比を示す垂直方向の高さでプロットされ、すなわち、より高い線がより多いコピー数を有する。測定の標準偏差は、約10%であると見積もられる。
【0038】
細胞株MCF7において、急激なコピー数の増加が存在する。上昇した比は、クローンRMC20B4097(「4097」)の遠位の部分に記録され、そして増加は、クローンRMC20B4103(「4103」)およびRMC20B4130(「4130」)を用いて検出され、これらは、より遠位にマッピングしている(表1を参照のこと、例えば、クローン4097はまた、STS表示AFMa233wg1、GDBマーカー名D20S211またはD20S854によって同定され得る)。このコピー数は、測定の不確実性の範囲内で、この増幅された領域から遠位で一定になる。これらのデータは、MCF7において、RMC20B4097の最も遠位部(「4097」の右側)にマッピングし、また部分的にRMC20B4103(「4103」)およびRMC20B4130(「4130」)に含まれ、そしてより遠位のクローンに全体的に含まれる高コピー数の領域が存在することを示す。従って、急激なコピー数の増加の位置(垂直方向の灰色線)は、重複クローン(RMC20B4097、RMC20B4103、およびRMC20B4130)上の比から非常に正確にマッピングされ得る。
【0039】
対照的に、腫瘍S21およびS50は、数百キロベース(kb)の距離にわたる、コピー数の比較的連続する変化を示す。腫瘍S50において、コピー数のピークは、クローンRMC20B4097(「4097」)の周辺に存在する。S50の増幅領域の遠位の境界(テロメアに向かって図3の右側)は、およそRMC20P4028(「4028」)からクローンRMC20P4018(「4018」)までにマッピングする。腫瘍S21について、増幅された領域の近位の境界(左側)は、(高分解能アレイ中で連続するクローンの適用範囲の領域内で)およそのクローン4097に位置付けされる。S21において、染色体に沿ってより遠位に(右側に)動くに従って、コピー数は増加し続ける。
【0040】
S21(および別の腫瘍S59、これらのデータは図3には示されていない)におけるコピー数の増加の大きさは著しい。これは、コンティグに対して遠位である(図3の右側)か、なおスキャニングアレイ上の次のマーカーD20S120に対して近位である染色体領域に注意を集める(D20S120は、マーカーRMC20B4087に対して遠位にマッピングする;D20S120は、RMC20P070中に含まれる;表1を参照のこと)。GDBマーカーD20S120を含むクローンは、コピー数が上昇していないか、またはそのコピー数は、これらの腫瘍中で非常に減少されている(データは示さず)。3つの他の腫瘍について、遠位の境界は、D20S120と次の最も遠位の標的クローン、D20S100との間にマッピングされた(データは示さず);これらはまた、他の20q13.2コンティグクローンと比較して、D20S120で非常に減少したコピー数を有した。従って、これらの観察は、この新規な20q13.2アンプリコンの遠位の境界が、一般的に、D20S120の近くに存在することを示す。さらに、それらは、最少の増幅された領域の遠位の境界が、この遺伝子座に対して近位にマッピングすることを確立する。従って、新規なアンプリコンは、(近位から遠位へ)RMC20B4097(「4097」またはD20S211、表1を参照のこと)とD20S120(RMC20P070)との間に同定された。
【0041】
この新規なアンプリコンはさらに、図1に示されるようにFISHを用いて特徴付けされた。クローンRMC20C001、RMC20B4097(「4097」)、WI−9227、D20S120、およびD20S100を、プローブとして使用した。増加したG/R比に基づいて、コピー数増幅の境界領域−アンプリコン−を検出した。新規な20q13.2アンプリコンの遠位の境界は、D20S120に対して近位であると決定された。この結論に到達するにおいて、腫瘍サンプルS21のコピー数分析が、最も情報量が多かった。図1に示されるように、S21では、上昇したコピー数の領域は、クローンRMC20B4097(「4097」)の近位で始まり、そしてコンティグの最も遠位の部分、WI−9227(RMC20B4087、表1を参照のこと)においてコピー数が最も高い。コピー数は、D20S120において上昇せず、これは、新規なアンプリコンの遠位の境界を、D20S120に対して近位に配置する。このハイブリダイゼーションデータは、新規なアンプリコンが(近位から遠位へ)RMC20B4097とD20S120(RMC20P070)との間に同定されたことを確証する。
【0042】
(アンプリコン、プローブ、およびアレイをコードする核酸の特徴付け、単離、および合成)
本発明は、ヒト染色体20q13.2由来の新規な核酸配列−新規なアンプリコン−の位置付け、クローニング、および発現を初めて提供した。本発明は、これらの配列を含むプローブを提供する。さらなる実施態様は、生物学的サンプル、特に、ヒトの癌におけるこれらのアンプリコン配列のコピー数の変化の存在をスクリーニングするための手段を提供する。アンプリコンのコピー数は一般に乳癌において変化するが、それらはまた、前立腺癌、子宮頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、頭頸部の癌、および結腸癌を含むがこれらに限定されない、他の癌に診断的および予後的であり得る。
【0043】
本発明は、科学文献および特許文献において十分に記載されている、当該分野で公知の任意の方法またはプロトコルと組み合わせて実施され得る。従って、本発明の新規な試薬および方法に対して特定の方法論および例を議論する前に、ほんのいくつかの一般的な技術を記載する。
【0044】
(一般技術)
本発明の核酸をコードする全DNAまたはRNAを単離する方法は、当業者に周知である。核酸の単離、精製、および操作のための技術、遺伝子、プローブ、およびアンプリコン配列、例えばライブラリーを産生させること、発現ベクターへのサブクローニング、プローブを標識すること、DNAハイブリダイゼーションなどは、例えばSambrook;Tijssen;「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」、Ausubel編、John Wiley&Sons,Inc.,New York(1997)(「Ausubel」)、に記載される。
【0045】
本発明の核酸は、RNA、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、または遺伝子組換えのハイブリッドに関わらず、種々の供給源から単離され得るか、またはインビトロで合成され得る。本発明の核酸は、例えば、トランスジェニック動物、形質転換された細胞、形質転換された細胞溶解物、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態において発現され得る。配列決定方法は、代表的には、ジデオキシ配列決定(Sequenqse,U.S.Biochemical)を使用するが、しかし、他のキットおよび方法が利用可能であり、そして当業者に周知である。
【0046】
核酸およびタンパク質は、当業者に周知である多数の一般手段のいずれかによって、本明細書中に記載の本発明の教示および方法に従って、検出および定量される。これらには、いくつか名前を挙げると、例えば、分析的生化学的方法(例えば、分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、および高速拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィー)、種々の免疫学的方法(例えば、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散(一重または二重)、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相酵素免疫測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイなど)、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動、RT−PCR、定量PCR、他の核酸もしくは標的もしくはシグナルの増幅方法、放射性標識、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【0047】
(合成核酸)
例えば、プローブ、アレイ、増幅のための鋳型などとしての使用のためのヌクレオチドは、以下に記載されるように、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、アンプリコンコード配列を含む合成核酸は、種々の溶液法または固相法によって調製され得る。ホスファイト−トリエステル化学、ホスホトリエステル化学、およびH−ホスホネート化学による核酸の固相合成のための手順の詳細な記載は、広範に利用可能である。例えば、自動合成機を使用するBeaucageおよびCarruthersの固相ホスホルアミダイトトリエステル法は、例えば、Itakura、米国特許第4,401,796号;Carruthers、米国特許第4,458,066号および同第4,500,707号に記載されている。Needham−VanDevanter(1984)Nucleic Acids Res.12:6159−6168;Beigelman(1995)Nucleic Acids Res 23:3989−3994;OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS:A PRACTICAL APPROACH,Gait(編)、IRL Press,Washington D.C.(1984)(Jones、第2章、Atkinson、第3章、およびSproat、第4章を参照のこと);Froehler(1986)Tetrahedron Lett.27:469−472;Froehler,Nucleic Acids Res.14:5399−5407(1986)もまた参照のこと。オリゴヌクレオチドを精製する方法には、Pearson(1983)J.Chrom.255:137−149に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、アニオン交換HPLCが含まれる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、任意の化学分解法(例えば、Maxam(1980)Mathod in Enzymology 65:499−560,Xiao(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:247−258、または固相化学分解手順については、Rosenthal(1987)Nucleic Acids Symp.Ser.18:249−252を参照のこと)を使用して確認され得る。
【0048】
(核酸の増幅)
種々の実施態様において、本発明のアンプリコン配列は、D20S211からD20S120までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸;D20S120とD20S211との間の距離にわたる核酸セグメントを含む。このアンプリコン領域中にマッピングされたクローン、GDB遺伝子座、STSマーカー、および他のクローニングされた核酸セグメントを表1に示し、そしてこれらには、例えば、WI−9227の核酸配列を含む。本発明の核酸は、当該分野で公知の任意の増幅方法論を用いて同定または生成され得る。
【0049】
本発明のアンプリコン核酸は、アンプリコン配列(例えば、表1に示されるクローン、GDB遺伝子座、およびSTSマーカー)の任意のセグメントを含むか、またはこれに隣接するプライマー対を用いて増幅され得る。STSマーカーは、マーカーを増幅するプライマー対によって部分的に規定される。Olson(1989)前出および上記の説明を参照のこと。1つの実施態様において、本発明のアンプリコンの存在および/またはコピー数は、PCRを用いて決定される。代替的な実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、以下からなる群から選択されるSTS PCRプライマー対である:AFMa233wg1、AFM080ya1、AFM069ya1、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zd12、WI−9227、およびAFM276xh1。本発明のアンプリコンのすべてもしくは一部の存在を検出するかまたはそのコピー数を定量するための他のPCRプライマー対は、当業者によって容易に設計され得る。
【0050】
本発明の核酸の増殖は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブの構築、配列決定、クローンなどのために使用され得る。増幅プライマー対は、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコン配列の存在についてスクリーニングするために使用され得る。プライマー対は、さらなるアンプリコン種(例えば、多型、対立遺伝子、および他の改変体など)を同定するために使用され得る。
【0051】
オリゴヌクレオチドは、種々のハイブリダイゼーション技術および条件を使用して、アンプリコン配列を同定、検出、および増幅するために使用され得る。適切なアンプリコン方法は、以下を含むがこれらに限定されない:ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR PROTOCOLS,A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS、Innis編、Academic Press,N.Y.(1990)およびPCR STRATEGIES(1995)、Innis編、Academic Press,Inc.,N.Y.(Innis))、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu(1989)Genomics 4:560;Landegren(1988)Science 241:1077;Barringer(1990)Gene 89:117);転写増幅(Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:1173);および自律的(self−sustained)配列複製(Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874);Qβレプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario);以下を参照のこと、Berger(1987)Methods Enzymol.152:307−316、Sambrook、およびAusubel、ならびにMullis(1987)米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号;Arnheim(1990)C&EN 36−47;Lomell J.Clin.Chem.,35:1826(1989);Van Brunt,Biotechnology 8:291−294(1990);Wu(1989)Gene 4:560;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:563−564。インビトロ増幅された核酸をクローニングするための方法は、Wallace、米国特許第5,426,039号に記載される。大きな核酸を増幅する方法は、例えば、Cheng(1994)Nature 369:684−685に要約される。
【0052】
本発明は、アンプリコン含有核酸をコードするDNAを調製するための上記の各々の方法からの生成物の増幅および操作または検出を提供する。PCR技術において、増幅されるDNA領域の2つの境界に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、合成されそして使用される(例えば、Innisを参照のこと)。PCRは、核酸を増幅、同定、定量、単離、および操作するための種々のプロトコルにおいて使用され得る。これらのプロトコルにおいて、増幅およびハイブリダイゼーションのためのプライマーおよびプローブが生成され、これらは本明細書中に列挙したDNA配列のすべてまたは任意の部分を含む。
【0053】
ゲノムDNAを増幅する際に、1つの好ましい技術は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(「DOP−PCR」)であり、これは例えば、Telenius(1992)Genes Chromosomes Cancer 4:257−263;Telenius(1992)Genomics 13:718−725;Xiao(1996)Cytogenet.Cell.Genet.75:57−62によって記載される。DOP−PCRは、部分的に縮重した配列のオリゴヌクレオチドを利用する。この縮重は、低い最初のアニーリング温度を利用するPCRプロトコルとともに、複数の、例えば、ヒトにおいて約106の、所定のゲノム中の均一に分散した部位
からのプライミングを確実にする。
【0054】
ゲノムDNAを増幅するための別の好ましい技術は、例えば、Lucito(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:4487−4492;Miyashita(1994)Cytogenet.Cell Genet.66:54−57;Vooijs(1993)Am.J.Hum.Genet.52:586−597に記載されるような、リンカー−アダプターPCRによる。この手順において、DNAは、分別された染色体から抽出され、しばしば切断する制限エンドヌクレアーゼ(例えば、Sau3A1)を使用することによって完全に消化され、そして各々の末端において、アダプターオリゴヌクレオチドに連結される。次いで、これらのフラグメントは、プライマーとしてアダプターオリゴヌクレオチドに対して相同な配列を使用して、PCRを用いて増幅される。腫瘍ゲノムおよび正常なゲノムの高度に再現可能な大量の「提示」が、オリゴヌクレオチドアダプターに連結された、ナノグラム量の、制限エンドヌクレアーゼ切断されたDNAからのPCRによって作製され得る。
【0055】
PCR−増幅された配列はまた、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとして、標識および使用され得る(しかし、本発明の核酸プローブは、本明細書中に記載されるように、当該分野において周知である任意の合成技術または他の技術を使用して生成され得る)。本発明の標識され増幅されたDNAまたは他のオリゴヌクレオチドもしくは核酸は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、ゲノムライブラリー、インサイチュ核酸などを含む、任意の核酸の供給源からのアンプリコン配列をさらに同定および単離するために、または同定および定量するために、プローブとして使用され得る。
【0056】
(クローン)
本発明の核酸を得るための別の有用な手段は、例えば、ゲノムクローンまたはcDNAクローンまたは完全なゲノムクローンから単離された(または増幅された)インサートをスクリーニングおよびクローニングすることである。これらには、例えば、哺乳動物の人工染色体(例えば、Ascenzioni(1997)Cancer Lett.118:135−142を参照のこと)(ヒトの人工染色体を含む、例えば、Warburton(1997)Nature 386:553−555;Roush(1997)Science 276:38−39;Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15:333−335を参照のこと);酵母の人工染色体(YAC);細菌の人工染色体(BAC);P1人工染色体(Woon(1998)Genomics 50:306−316;Boren(1996)Genome Res.6:1123−1130);PAC(バクテリオファージP1由来のベクター、例えば、Ioannou(1994)Nature Genet.6:84−89;Reid(1997)Genomics 43:366−375;Nothwang(1997)Genomics 41:370−378を参照のこと);コスミド、プラスミド、またはcDNAに含まれるゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーが含まれる。BACは、120+Kbインサートを含み得るベクターである。BACは、E.coli F因子プラスミド系に基づき、ミリグラム量で操作および精製するのに簡単である。なぜなら、BACプラスミドは、細胞当たり1〜2コピーに保たれているからであり、YAC(これもまた、本発明の方法において使用され得る)で観察される再配列の問題が除外されるからである。BACベクターは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン蛍光タンパク質遺伝子(Baker(1997)Nucleic Acids Res 25:1950−1956)のようなマーカー遺伝子を含み得る。YACSはまた、80〜700kbのサイズの範囲でインサートを使用および含有し得る。例えば、Tucker(1997)Gene 199:25−30;Adam(1997)Plant J.11:1349−1358を参照のこと。P1は、75〜100KbのDNAインサートを含み得る、E.coliに感染するバクテリオファージであり(Mejia(1997)Genome Res 7:179−186;Ioannou(1994)Nat Genet 6:84−89)、λライブラリーと非常によく似た方法でスクリーニングされる。
【0057】
(核酸の配列決定)
新規に単離されたDNAの配列決定は、本発明のアンプリコンをコードする核酸を同定および特徴付けする。単離されたアンプリコンをコードする核酸の配列決定はまた、その配列の可能な機能的特徴(例えば、オンコジーンポリペプチドについてのコード配列、転写制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー)など)を同定する。
【0058】
アンプリコンをコードする核酸配列は、ベクター中のインサートとして、ベクターから遊離および単離されたインサートとして、または種々の他の形態のいずれかにおいて(すなわち、増幅産物として)配列決定され得る。インサートは、制限酵素によってベクターから遊離され得るか、またはPCRによって増幅され得るか、またはポリメラーゼによって転写され得る。インサートの配列決定のために、N末端またはC末端に基づくプライマー、またはもともとのファージもしくは他のベクターにおける挿入点に基づくプライマーが使用され得る。さらなるプライマーは、重複する配列を提供するために合成され得る。種々の核酸配列決定技術が周知であり、そして科学文献および特許文献に記載される。例えば、Rosenthal(1987)前出;配列決定のためのバイオセンサーチップの使用について、Arlinghaus(1997)Anal.Chem.69:3747−3753;Pastinen(1996)Clin.Chem.42:1391−1397;Nyren(1993)Anal.Biochem.208:171−175を参照のこと。赤外線補助レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析もまた、大きな核酸セグメント(例えば、ゲノムクローン)を配列決定するために使用され得る;例えば、Berkenkamp(1998)Science 281:260−262を参照のこと。
【0059】
(核酸の標識)
核酸を標識する方法は、当業者に周知である(上記の「検出可能な組成物を用いて標識する」の定義を参照のこと)。好ましい標識は、アレイにおける使用およびインサイチュハイブリダイゼーションのために適切である標識である。1つの実施態様において、本発明の核酸プローブまたはサンプルは、ハイブリダイゼーション反応の前に検出可能に標識される、あるいは、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識が使用され得る。このような検出可能な標識には、例えば、イムノアッセイの分野における物質のような、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質が含まれる。使用される特定の標識は、それがプローブのアレイに基づくハイブリダイゼーションまたはインサイチュハイブリダイゼーションを妨害しない限り、本発明には決定的ではない。しかし、蛍光標識(例えば、フルオレセイン、Texas redなど)を用いて直接的に標識されたプローブは、染色体DNAハイブリダイゼーションのために好ましい。好ましい実施態様において、標識は、アッセイの感度を最大化するために可能なほどの低コピー数で検出可能であり、そしてなおいかなるバックグラウンドシグナルを上回って検出可能である。標識は、好ましくは高度に局在化したシグナルを有し、とりわけ、染色体(例えば、中期染色体として)に対して染色を物理的にマッピングする場合に高度の空間的な分解能を提供する。従って、特に好ましい蛍光標識は、フルオレセイン−12−dUTPおよびTexas Red−5−dUTPを含む(以下の実施例1を参照のこと)。
【0060】
種々の実施態様において、標識は、当業者に公知の種々の手段においてプローブに結合し得る。種々の実施態様において、核酸プローブは、ニックトランスレーション、PCR、またはランダムプライマー伸長を用いて標識される(例えば、Sambrookを参照のこと)。
【0061】
(アンプリコンプローブ)
本発明は、ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブを提供する。種々の実施態様において、プローブは、核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。この配列はD20S211からD20S120までを含み;そしてD20S120とD20S211との間の距離にわたる。これらのアンプリコン領域にハイブリダイズする任意のプローブが、サンプル中の対応する領域を検出する際の使用に適切である。表1を参照のこと。プローブを調製する方法は、当業者に周知である(例えば、SambrookまたはAusubelを参照のこと)。
【0062】
1つの実施態様において、本発明のプローブは、以下からなる群より選択されるSTSマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む:AFMa233wgl(Genbank登録番号Z52636)、AFM080ya1(Genbank登録番号Z27067)、AFM069yal、WI−16748(Genbank登録番号G24133)、WI−9939(Genbank登録番号G11766)、AFMa072zb9(Genbank登録番号Z51873)、WI−6578(Genbank登録番号G06115)、AFM224zd12(Genbank登録番号Z66824)、WI−9227(Genbank登録番号G07189)、およびAFM276xh1(Genbank登録番号Z17202)。
【0063】
別の実施態様は、以下からなる群から選択されるGDB遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含むプローブを提供する:D20S211(Genbank登録番号Z27067)、D20S854(Genbank登録番号Z52636)、D20S876(Genbank登録番号Z53258)、D20S1044、D20S913(Genbank登録番号Z51873)、D20S720、およびD20S120(Genbank登録番号Z17202)。
【0064】
さらに別の実施態様は、以下からなる群から選択される、クローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含むプローブを提供する:RMC20B4097、RMC20B4103、RMC20P4016、RMC20B4130、RMC20P4185、RMC20B4188、RMC20B4109、RMC20P4010、RMC20P4028、RMC20P4003、RMC20B4099、RMC20P4018、RMC20P4069、RMC20B4121、RMC20B4087、およびRMC20P4070。
【0065】
本発明はまた、D20S211〜D20S120を含む核酸配列のいくつかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含むサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのプローブを提供する。1つの実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、以下からなる群から選択されるSTS PCRプライマー対である:AFMa233wgl、AFM080yal、AFM069yal、WI−16748、WI−9939、AFMa072zb9、WI−6578、AFM224zdl2、WI−9227、およびAFM276xhl。
【0066】
プローブは、本明細書に開示されるように、1つ以上のアンプリコン核酸配列、またはこのような配列を含むクローンを組合せ、そして標識化することによって調製され得る。インサイチュハイブリダイゼーション方法論を使用してアンプリコン配列を検出する場合、この構築物は断片化されて、細胞へ容易に透過し、そして標的核酸にハイブリダイズする、より小さな核酸フラグメントを提供する。断片化は、当業者に周知の多くの方法のいずれかによってなされ得る。好ましい方法には、分子を選択的に切断するための制限酵素を用いる処理、またはあるいはMg2+の存在下で核酸を短時間加熱することが、挙げられる。多くの場合において、ニックトランスレーションのような標識化プロセスは,適切な長さのプローブを提供し得る。プローブは、好ましくは、約50塩基対(bp)〜約2000bp、より好ましくは約100bp〜約1000bp、そして最も好ましくは約150bp〜約500bpの範囲の平均フラグメント長に断片化される。
【0067】
(核酸ハイブリダイゼーション技術)
本明細書中に開示されるハイブリダイゼーション技術は、ヒト核酸のサンプルにおいてアンプリコンの存在についてスクリーニングするために、本発明の方法において使用され得る。本発明のアンプリコンを使用するハイブリダイゼーションはまた、20q13.2(これは、多数の癌の存在および/または予後の指標である)におけるコピー数の変化を検出し得る。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない:乳房、前立腺、子宮頸部、卵巣、膀胱、頭部および頸部、ならびに結腸。この方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(上記の定義を参照のこと)で、ヒト核酸をプローブ(アンプリコン配列を含む)と接触させる工程、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程、およびサンプル中のアンプリコンコピー数を定量する工程を包含する。ハイブリダイゼーション技術はまた、アンプリコン種、アイソフォーム、対立遺伝子ならびに多型性を含むアンプリコン遺伝子および遺伝子産物(すなわち、例えば、オンコジーンをコードするmRNA)を同定、単離、ならびに特徴付けるために利用され得る。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する特定のDNAおよびRNA測定のための種々の方法は、当業者に公知である。例えば、NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION,A PRACTICAL APPROACH、Hames,B.D.およびHiggins,S.J.編、IRL Press,1985;Sambrookを参照のこと。
【0068】
サンプル中のアンプリコンをコードする核酸の存在または非存在を評価するたための1つの方法は、サザン転写を含む。サザンブロットにおいて、ゲノムまたはcDNA(代表的に、電気泳動ゲル上で断片化および分離される)は、標的遺伝子に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと、正常なゲノムDNA(例えば、アンプリコン配列を含む腫瘍ゲノムの非増幅化部分)の分析からのコントロールプローブシグナルとのハイブリダイゼーションの強度の比較は、標的核酸の相対的コピー数の推定を提供する。
【0069】
同様に、ノーザン転写は、アンプリコン配列を含むRNAの検出のために使用され得る。例えば、RNAは、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出方法を使用して所定の細胞サンプルから単離される。次いで、RNAは電気泳動されて異なる種を分離し、そしてゲルからニトロセルロースメンブレンへ転写される。サザン転写でのように、標識化プローブまたはPCRを使用して、アンプリコン核酸の存在または非存在を同定し得る。
【0070】
サンドイッチアッセイは、タンパク質または核酸を検出または単離するための商業的に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。このようなアッセイは、しばしば、代表的には溶液中で、固体支持体および標的化「シグナル」核酸に共有結合的に固定化された「捕捉」核酸またはタンパク質を利用する。臨床的または他のサンプルは、標的核酸およびタンパク質を提供する。この「捕捉」核酸またはタンパク質および「シグナル」核酸またはタンパク質は、標的核酸またはタンパク質とハイブリダイズするか、または標的核酸またはタンパク質に結合して、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。有効にするために、シグナル核酸またはタンパク質は、実質的に捕捉核酸またはタンパク質とハイブリダイズまたは結合し得ない。
【0071】
代表的に、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションを検出するために使用される標識化シグナル核酸である。相補的なプローブ核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドの存在を検出するために代表的に使用されるいくつかの方法のいずれか1つによって標識化され得る。検出方法は、上記のような任意の標識を使用し得る。本発明の好ましい実施態様において、サンプル核酸は、テキサスレッドまたはフルオレセインで標識化される。他の標識には、標識化抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光薬剤、酵素、および標識化リガンドに特異的な結合対メンバーとして作用し得る抗体が挙げられ得る。
【0072】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的およびプローブのポリヌクレオチドまたは核酸の二重鎖に対して複合体を生成するシグナルの結合を必要とし得る。代表的に、このような結合は、リガンド結合体化プローブと、シグナルで結合体化した抗リガンドとの間のリガンドおよび抗リガンド相互作用(すなわち、抗体−抗原または相補的核酸結合)によって生じる。標識はまた、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出を可能にし得る。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、サンプルは、抗体を使用して検出され得る。これらの系において、シグナルは、抗体に対して蛍光標識もしくは放射性標識または酵素的分子を付着することによって生成される。ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸またはシグナルを倍増する、標的核酸またはシグナル増幅系の使用によって増強され得る。あるいは、配列は、一般に、非特異的PCRプライマーおよび変異の指標である特定の配列に対してプローブされた後に増幅された標的領域を使用して増幅され得る。
【0073】
(インサイチュハイブリダイゼーション)
アンプリコン配列のコピー数またはタンパク質をコードするアンプリコンの発現のレベルを決定するための代替の手段は、インサイチュハイブリダイゼーションである。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知である(例えば、Angerer(1987)Methods Enzymol 152:649)。一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の主要な工程を包含する:(1)分析される組織または生物学的構造の固定;(2)標的DNAの接近性を増大するため、および非特異的結合を減少するための、生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理;(3)生物学的構造または組織の核酸への、核酸の混合物のハイブリダイゼーション;(4)ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄および(5)ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。これらの工程の各々において使用される試薬および使用のためのこれらの条件は、特定の適用に依存して変化する。
【0074】
代表的なインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、細胞は、固体支持体、代表的にはガラススライドに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は,代表的に熱またはアルカリを用いて変性される。次いで、細胞は、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識化プローブのアニーリングを許容するために中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは、代表的には標識化される(すなわち、放射性同位体または蛍光レポーターを用いる)。いくつかの適用において、繰り返し配列のハイブリダイゼーション能力をブロックすることが必要である。この場合において、ヒトゲノムDNAまたはCot−1 DNAを使用して、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。好ましいサイズ範囲は、約200bp〜約100塩基、より好ましくは二本鎖のニックトランスレーション化核酸に対して約400と約800bpとの間である。本発明の方法を用いる使用に適切なハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Albertson(1984)EMBO J.3:1227〜1234;Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9138〜9142;EPO Pub.No.430,402;Methods in Molecular Biology,第33巻、In Situ Hybridization Protocols,Choo編,Humana Press,Totowa,NJ(1994)に記載される。特定の好ましい実施態様において、Kallioniemi (1992) Proc.Natl Acad Sci USA 89:5321〜5325(1992)のハイブリダイゼーションプロトコルが、使用される。
【0075】
(核酸アレイ)
アンプリコンを含む配列の検出、コピー数の定量、配列決定などのための核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、アレイに基づく形式で実施され得る。アレイは、サンプル核酸とハイブリダイズされる、複数の異なる「プローブ」または「標的」核酸(または他の化合物)である。アレイ形式において、多数の異なるハイブリダイゼーション反応が、本質的に「並行して」実行され得る。これによって、迅速に、本質的に同時に、多数の遺伝子座の評価が、提供される。アレイに基づく形式でハイブリダイゼーション反応を実施する方法はまた、例えば、Pastinen(1997)Genome Res.7:606〜614;(1997)Jackson(1996)Nature Biotechnology 14:1685;Chee(1995)Science 274:610;WO96/17958に、記載される。
【0076】
アレイ核酸プローブを、固体表面に固定化した。これらのプローブは、本発明の全てのアンプリコンの部分、ならびにゲノムのほかの部分由来のプローブを含む。アンプリコン核酸は、例えば、MAC、YAC、BAC、PAC、P1、コスミド、プラスミド(上記のような)、ゲノムクローンのインターAlu PCR産物、ゲノムクローンの制限消化物、cDNAクローン、増幅(例えば、PCR)産物などから得られ得る。種々の実施態様において、アレイ核酸は、以下に記載されるように、本発明のアンプリコン配列にわたるかまたは本発明のアンプリコン配列を含むクローンの、以前にマッピングされたライブラリー、ならびにゲノムの他の領域由来のクローンに由来する。アレイは、(試験サンプルおよび参照サンプルを用いて)サンプル核酸の単一集団とハイブリダイズされ得るか、または2つの示差的に標識化された収集物とともに使用され得る。
【0077】
核酸を種々の固体表面上に固定化するための多くの方法は、当該分野で公知である。広範に種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに他の材料(天然および合成の両方)は、固体表面のための材料として利用され得る。例示的な固体表面には、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化メンブレン(紙またはナイロン)、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、およびセルロースアセテートが挙げられる。さらに、プラスチック(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど)が、使用され得る。利用され得る他の材料には、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体材料、サーメットなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成し得る物質が、使用され得る。このような材料には、例えば、タンパク質(例えば、ゼラチン)、リポポリサッカリド、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミドが挙げられる。固体表面が多孔性である場合、種々の孔サイズが、系の性質に依存して利用され得る。
【0078】
表面を調製するために、多くの異なる材料が、特に積層板として利用されて、種々の特性を獲得し得る。例えば、タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)または高分子の混合物(例えば、デンハルト溶液)を利用して、非特異的結合を回避し得、共有結合を単純化し得、シグナル検出などを増強し得る。化合物と表面との間の共有結合が所望される場合、その表面は、通常、多官能性であるか、または多官能化され得る。表面上に存在し、そして連結に使用され得る官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられ得る。広範に種々の化合物の種々の表面への連結の様式は周知であり、そして文献に十分に例示されている。例えば、分子への種々の官能基の導入による核酸の固定化のための方法は、公知である(例えば、Bischoff(1987)Anal.Biochem.,164:336〜344;Kremsky(1987)Nucl.Acids Res.15:2891〜2910を参照のこと)。改変されたヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドを含むPCRプライマーを使用して、または改変されたヌクレオチドでの酵素的末端標識によって、標的上に配置され得る。本発明の核酸アレイのためのメンブレン支持体(例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリプロピレン)の使用は、比較的高いエレメント密度で標的を配列する手動およびロボット利用の方法を利用する十分に開発された技術のために、有利である。このようなメンブレンは、一般に利用可能であり、そしてメンブレンへのハイブリダイゼーションについてのプロトコルおよび機器は、周知である。
【0079】
所定のアッセイ形式を最適化するために、当業者は、メンブレンの型、蛍光色素、励起および放出バンド、スポットサイズなどの異なる組合せについての標識(例えば、蛍光)検出の感度を決定し得る。低い蛍光バックグラウンドのメンブレンが、使用され得る(例えば、Chu(1992)Electrophoresis 13:105〜114を参照のこと)。候補メンブレン上での種々の直径のスポット(「標的エレメント」)の検出についての感度は、例えば、蛍光的に末端標識されたDNAフラグメントの連続希釈のスポッティングによって、容易に決定され得る。次いで、これらのスポットは、従来の蛍光顕微鏡を使用して画像化される。従って、感度、線形性、ならびに蛍光色素および固体表面(例えば、メンブレン、ガラス、石英ガラス)の種々の組合せからの達成可能なダイナミックレンジが、決定され得る。公知の相対比における蛍光色素の連続希釈の対もまた、分析され得る。これは、蛍光の比が、プローブが固定化される基材の検出器および蛍光によって許容されるダイナミックレンジにわたって、実際の蛍光色素比を反映する精度を決定する。
【0080】
1mm直径〜1umの範囲である種々のサイズの標的エレメントが、これらの材料とともに使用され得る。少量の濃縮された固定化プローブDNAを含む、より小さな標的エレメントは、高度に複雑な比較ハイブリダイゼーションのために使用され得る。なぜなら、各標的エレメントに結合するために利用可能なサンプルの総量が制限されるからである。従って、少量の濃縮されたDNAを含む小さなアレイ標的エレメントを有することが有利であり、その結果、得られるシグナルが、高度に局在化されそして明るい。このような小さなアレイ標的エレメントは、代表的に、104/cm2よりも大きい密度を有するアレイにおいて使用される。1cm2面積の蛍光画像を定量し得る比較的単純なアプローチは、
単一の画像における多数の標的エレメントからのデータの獲得を可能にすることが記載されている(例えば、Wittrup(1994)Cytometry 16:206〜213を参照のこと)。
【0081】
メンブレンよりも十分に低い蛍光を有する固体表面基材(例えば、ガラス、石英、または小さなビーズ)上のアレイは、よりよい感度を達成し得る。ガラスまたは石英ガラスのような基材は、これらが非常に低い蛍光基材、および非常に効率的なハイブリダイゼーション環境を提供することにおいて有利である。標的核酸のガラスまたは合成石英ガラスへの共有的な付着は、多くの公知の技術に従って達成され得る(上記に記載される)。核酸は、市販の試薬を使用して、簡便にガラスに結合され得る。例えば、多くの官能基を有するシラン処理ガラス(silanized glass)の調製のための材料は、市販されているか、または標準的技術を使用して調製され得る(例えば、Gait(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press,Wash.,D.C.を参照のこと)。石英カバースリップ(これは、ガラスよりも少なくとも10倍低い自己蛍光を有する)もまた、シラン処理され得る。
【0082】
あるいは、プローブはまた、市販のコーティング化ビーズまたは他の表面上に固定化され得る。例えば、ビオチン末端標識化核酸は、市販のアビジンコーティング化ビーズに結合され得る。ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体はまた、例えば、プロテインAを使用するタンパク質媒介カップリング、続く標準的プロトコルによって、シラン処理ガラスに付着され得る(例えば、Smith(1992)Science 258:1122〜1126を参照のこと)。ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識化核酸は、標準的技術に従って調製され得る。ビーズに付着された核酸に対するハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション混合物においてそれらを懸濁すること、次いで、洗浄後の分析のためにガラス基材上にそれらを沈着させることによって達成される。あるいは、アビジンコーティングされているか、またはアビジンコーティングされていない、常磁性粒子(例えば、酸化鉄(III)粒子)が、使用され得る。
【0083】
1つの特定の好ましい実施態様において、プローブ核酸は、表面(例えば、ガラスまたは石英表面)上にスポットされる。核酸は、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびニトロセルロースの混合物中に溶解され、そしてアミノ−シランコーティング化ガラススライド上にスポットされる。小さな毛管を使用して、プローブ混合物を「スポット」し得る。
【0084】
(核酸アレイを使用する比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH))
比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)は、単回実験において、ゲノム全体を通じてDNA配列コピー数バリエーションを検出およびマッピングし得る。CGHの1つの改変において、ゲノムは、中期染色体の使用による細胞遺伝地図として提供される。好ましい実施態様において、中期染色体の代わりに、ハイブリダイゼーションプローブは、本発明のアンプリコン配列(ならびに実施例1で詳細に記載されるような、ゲノムの他の配列)を含むゲノム配列のアレイである。相対的なコピー数はまた、中期染色体に基づくCGHおよびアレイに基づくCGHの両方において、蛍光的に標識化された試験核酸および参照核酸のハイブリダイゼーションによって測定され得る。
【0085】
中期染色体に基づくCGHにおいて、総ゲノムDNAは、「試験」細胞集団および「参照」細胞集団から単離され、異なる蛍光色素で標識化され、そして正常な中期染色体に対してハイブリダイズされる。Cot−1 DNAを使用して、繰り返し配列のハイブリダイゼーションを抑制する。染色体上のある位置における2つの蛍光色素の蛍光強度の得られた比は、試験ゲノムおよび参照ゲノムにおける対応するDNA配列のコピー数の比にほぼ比例する。従って、CGHは、中期染色体によって提供される細胞遺伝地図に参照される全ゲノムのコピー数分析を提供する。しかし、中期染色体CGHの使用は、分解能を10〜20メガベース(Mb)に制限し、接近した空間の異常性の分解能を妨げ、そしてCGHの結果と細胞遺伝の精度を伴うゲノム情報および資源との関連性のみを可能にする。
【0086】
従って、好ましい実施態様において、同様のハイブリダイゼーション方法論が、アンプリコン配列を含む核酸(または、アンプリコン配列を位置的にマッピングする場合には、目的の領域に隣接するゲノム核酸)を含むマッピングされたクローンのアレイを用いて使用される。これは、クローンのサイズおよび/またはクローン間の地図間隔によって決定される分解能によって、アンプリコンコピー数の測定を可能にする。アレイに基づくCGHにおいて、分解能は、標的クローンのゲノム間隔によって決定される。プローブとしての連続的なクローン範囲の領域からの重複クローンの使用は、クローン長よりも短い(50Kb程度低い)ゲノム分解能を有するマッピングを可能にする。従って、ここで、ヒトゲノムの物理的地図に対するアンプリコンの程度をマッピングすることの両方が可能である。この方法論はまた、アンプリコンの増幅レベルおよびアンプリコン内の部分領域を定量的に測定する。さらに、その分析時間は、中期染色体に基づくCGHよりも非常に短いので、大量のサンプル(例えば、腫瘍または他の組織サンプル)上でこれらの分析を実施することが可能である。これは、速度および分解能の両方を増大し、これを用いて、反復性の異常領域(例えば、増幅、転座)が同定され得、そしてコピー数が確認された。
【0087】
アレイCGHは、いくつかの腫瘍が単一の領域にわたって均一の高いアンプリコンコピー数を有する一方、その他の腫瘍は、数百キロベースにわたって伸長するコピー数の連続的な変化を示したことを示してきた。増幅された領域内のコピー数におけるこれらの改変は、時々、薬物選択下におけるインビトロ系で観察されるように、コピー数が増加されるにつれ増幅されたセグメントの進行性の「トリミング」を含む増幅プロセスに起因し得る。従って、増幅を駆動する核酸配列、または「臨界配列」は、アンプリコン内の最も高いコピー数の位置で見出される。多くの増幅事象の後、この「臨界遺伝子」(最小アンプリコン配列)は、非駆動セグメントが「トリミング」された後に残存する。本発明は、第20染色体の20q13.2中の新規な臨界最小アンプリコン配列を同定する。
【0088】
高コピー数の本発明のアンプリコンはまた、転写された配列および/または翻訳された配列(例えば、オンコジーンコード配列)を同定するために使用され得る。増幅された領域から候補オンコジーンを評価する際の中心工程の1つは、それらの発現を評価することである。腫瘍は、本発明のプローブを用いてスクリーニングされて、可能性のあるオンコジーン転写産物(すなわち、mRNA)が同定され得る。パラフィンに包埋される腫瘍サンプルの本発明のプローブとのハイブリダイゼーションは、アンプリコン転写産物の迅速な同定を可能にする。さらに、mRNAに対するインサイチュハイブリダイゼーションは、1回のハイブリダイゼーションにおいて多くの異なる腫瘍における遺伝子発現の評価を可能にする。この胚スループット法は、候補オンコジーンから発現データを得るプロセスを、実質的に非常に加速させる。
【0089】
(ヒト第20染色体の20q13.2領域)
本発明は、ヒト染色体20q13.2における新規なアンプリコン配列を同定した。代替の実施態様において、例えば、プローブとして使用される本発明の単離されたアンプリコン配列は、D20S211からD20S120を含み、かつD20S120とD20S211との間の距離にかかる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸セグメントを含む。本発明のプローブは、D20S120とD20S211との間の距離にかかる任意の核酸配列、20q13.2領域における任意のクローン、GDB遺伝子座またはSTSマーカー(例えば、表1に列挙される例示的なクローン、GDB遺伝子座、STSおよび他のマーカー(例えば、WI−9227))に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。
【0090】
コピー数において改変される場合、本発明のアンプリコンは、癌(特に、ヒト乳癌)に関連する。より攻撃的な腫瘍は、高いアンプリコンコピー数を有する可能性が高い。従って、本発明は、癌を診断、予後および処置するための、これらのアンプリコンを含む新規なプローブを提供する。本発明の新規なアンプリコンを特徴付けるに有用ないくつかの例示的な遺伝子座およびマーカーを、以下に特徴付ける。本発明の新規なアンプリコンセグメントを特徴付けるために使用され得るさらなるクローン、GDB遺伝子座、STSおよび他のマーカーについては表Iを参照のこと。
【0091】
(D20S120)
D20S120は、例えば、Weissenbach(1992)「A second−generation linkage map of the human genome」、Nature 359:794−801;Gyapay(1994)「The
1993−94 Genethon human genetic linkage map」Nature Genet.7(2 Spec No):246−339によって記載されるように、ヒト第20染色体の20q13領域にマップされたGDBマーカーである。これはまた、クローンAFM276xh1またはRH361として参照されている。D20S120配列は寄託されている(Genbank登録番号第Z17202号)。そのSTSマーカーの命名はAFM276xh1である(表1を参照のこと)。
【0092】
(D20S211)
D20S211は、例えば、Gyapay(1994)(前出)によって記載されるように、ヒト第20染色体の20q13領域にマップされたGDBマーカーである。そのSTSマーカーは、AFM080ya1である(表1を参照のこと)。D20S211配列は寄託されている(Genbank登録番号第Z27067号)。
【0093】
(WI−9227)
WI−9277は、ヒト第20染色体の20q13領域にマップされた。1319塩基対のアンプリマー(amplimer)マーカーである。WI−9277は寄託されている(Genbank登録番号第G07189号)。
【0094】
(D20S913)
D20S913は、例えば、Dib(1996)「A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatelites」、Nature 380:152−154によって記載されるように、ヒト第20染色体の20q13領域にマップされたGDBマーカーである。そのSTSの命名は、AFMa072zb9である(表1を参照のこと)。D20S913配列は寄託されている(Genbank登録番号第Z51873号)。
【0095】
(プローブを含むキット)
本発明はまた、染色体異常および第20染色体上のアンプリコンコピー数における変更の検出のための診断用キットを提供する。好ましい実施態様において、このキットは、本発明のアンプリコンに対する1つ以上のプローブを含む。このキットはさらに、ブロッキング核酸(すなわち、Cot−1 DNA)およびキットの内容を使用する時および方法を記載する指示資料を含む。このキットはまた、以下の1つ以上を含み得る:プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識化剤、ハイブリダイゼーションのための試薬(緩衝液、分裂中期スプレッド(metaphase spread)、ウシ血清アルブミン(BSA)および他のブロッキング剤を含む)、tRNA、SDSサンプリングデバイス(微細な針、スワブ、吸引機などを含む)、陽性および陰性ハイブリダイゼーションコントロールなど。
【実施例】
【0096】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の例示するために提供されるが、限定するためではない。
【0097】
(実施例1:高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーション方法論)
本発明は、ヒト核酸のサンプル中の本発明のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、プローブがストリンジェントな条件下でアンプリコン配列に選択的に結合し得る条件下で、核酸をアンプリコン配列含有プローブと接触させる工程、およびハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程を包含する。以下の実施例は、好ましい方法論「高分解能の、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)」(これは、サンプル間の単一コピー数の差異を検出し得る)を詳述する。
【0098】
(高分解能の、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション装置)
本発明は、改良された性能に寄与する、高分解能アレイCGH方法論に対する新規な特徴を提供する。高密度のプローブDNAを、アレイ基板に結合させる。この基板は、代表的には、ガラスまたは石英の顕微鏡スライドである。石英スライドが好ましい。なぜなら、それらは、ガラスよりかなり低い固有の蛍光を有し、従って、蛍光測定を妨害し得るバックグラウンド光をあまり産生しないからである。ガラススライドもまた使用され得る。それらはあまり高価ではなく、そして適切な性能を提供する。
【0099】
アレイからの蛍光シグナルを、CCDカメラに装着したカスタムビルト大視野画像化システム(広視野画像化システム)を使用して獲得する。アレイを含む溶融シリカまたは溶融石英の基板を、後側からプリズムを通じる励起光によって照射する。コリメーティングレンズ(スライドの下の全て)を通じてアークランプによって供給される励起光は、アレイ標的エレメントを通過する(サンプル核酸は固定したプローブにハイブリダイズされている)。この光は、カバースリップの上部表面の全内部反射を受け、そしてアレイに戻す。鏡はこの光を反射してプリズムに戻る。従って、光学表面における不完全性によって散乱される励起光のみがカバースリップを通過し、そして検出レンズ(スライドの上)に入る。蛍光を、一対のカメラレンズによって収集(検出)する。第1のカメラレンズは、標的からの蛍光発光を収集し、そして平行光を出す。これは、画像化される蛍光色素の波長バンドを選択する発光フィルターを通過する。第2のレンズは、CCDチップ上に収集された光を収束させる。同じ焦点距離を有する一対のレンズの使用は、1倍率を生じる(Witrup(1994)前出)。
【0100】
アレイプリンティング技術を、プリンティングスピードを増加させてアレイ製造を容易にすること、およびアレイの物理的サイズを減少させてハイブリダイゼーションに必要な標本核酸の量を最小化させることに集中させる。基本的なアプローチは、複数のプリンティングチップを有するプリントヘッドを使用することであり、その結果、多くの異なる標的は、平行にプリントされ得る。このことは、アレイをプリントするのに必要な時間を減少させる。アレイロボットの簡単な該略として、このプリントヘッドを、マイクロタイタープレートフィーダーとプリンティング位置との間の高速オーバーヘッドガントリー上で行う。アレイ基板を、X−Yステージを有するプリントヘッドの下におく。プリンティングピンを、プレートフィーダーとステージの間に位置するステーションにて洗浄する。9ピンプリントヘッドを、864ウェルマイクロタイタープレートのプリントアウトのために、3mm中心上にキャピラリーチューブを取り付けた3×3アレイのスプリングの形態で使用する。各キャピラリーを、そこを通して真空または圧力が供給される可撓性チュービングによってマニホルドに接続する。プリンティングの間にわずかな圧力を適用しながら、真空を使用して、クリーニング溶液をチップを通じて排出し、そしてそのチップにプリンティング溶液をロードする。
【0101】
(アレイ分析のための核酸サンプルの調製)
任意の生物学的物質由来の核酸を使用して、分析のための標識サンプルを調製し得る。例えば、乳房組織の生検のために、疑われる原発性乳房腫瘍組織のスナップ凍結(snap−frozen)ブロックを、代表的には約4ミクロンにて凍結切断し(cryosect)、そして例えば、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色して、切片内の非悪性細胞に対する悪性細胞の比を決定し得る。ブロックトリミングによって除去可能な正常な管および小葉を含む領域を、スライド上にマークする。このブロックを、スライド上の切片と整列させて、そして冷却したカミソリ刃でトリミングする。トリミングしたブロックの次の10〜20の切片を、DNA抽出のために微量遠心管中に収集する。DNAを、例えば、QUIamp組織キット(#29304)を用いて、製造業者の指示に従って単離し得る。溶解時間を、必要ならば、組織の状態に依存して延長し得る。サンプルもまた、RNAaseAとともにインキュベートする。DNAを、70℃にて5分のインキュベーションの後に、水中のカラムから溶出させる。必要ならば、第2の溶出工程を使用して、収率を増加させ得る。
【0102】
このサンプル(すなわち試験)核酸を、フルオレセインで標識する。参照DNAを、別の試薬(代表的にはテキサスレッド)で標識する。標識を、標準的な手順および製造業者の指示に従って、ニックトランスレーションによって行う。
【0103】
(アレイプローブ)
プローブとして使用するためのクローン化ゲノムDNAを、上記のような当該分野で公知の任意のプロトコル(例えば、組換えまたはPCR増幅技術を含む)によって生成し得る。PCR増幅を、公のデータベースにおけるSTSプライマー対情報によって容易にする(例えば、Olson(1989)(前出)を参照のこと)。代表的な組換え技術もまた使用し得る。例えば、MAC、YAC、BAC、PAC、Pls、コスミド、プラスミドまたはcDNAを含有するプローブ配列を生成し得る。1つの例示的なプロトコルにおいて、プラスミドは、細菌の500ml培養物から、QIAGENマキシキット(#12162)を使用して、溶解緩衝液の量を約1.5倍〜2倍に増加させたことを除いて製造業者の指示に従って、単離する。DNAを、400μlのTE緩衝液(10mM Tris、1mM EDTA、pH8)中に再懸濁し、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール(25:24:1の比)で抽出する。次いで、エタノールで沈殿させる。TE緩衝液中に再懸濁した後、DNAの濃度を、蛍光測定器(例えば、Hoefer TKO
100)を用いて決定する。この手順により、代表的には、スライドに効率的に結合する核酸を生成するに十分な純度であり、かつ受容可能な低い自己蛍光を有する、40〜80μgのP1またはBAC DNAが得られる。
【0104】
以下に示す研究のためのアレイを、水、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびニトロセルロースの混合物中にプローブDNAを溶解させ、そして得られた溶液のナノリットル量を、ガラスまたは石英キャピラリーを有するアミノ−シランコートアレイ基板上に堆積させることによって、作製した。プローブ溶液を、エタノール中に10μgのDNAを沈殿させ、そして1μlの水中にペレットを溶解させ、続いて約0.4μg/μlのニトロセルロースを含む4μlのDMSOを添加することによって作製する。ニトロセルロース溶液を、DMSO中にニトロセルロースメンブレン(Gibco BRL#41051−012)を溶解させることによって調製する。このニトロセルロースは、標的において数キロベースより長い長さのハイブリダイズ可能なDNAフラグメントを保持する能力を実質的に改良したが、より小さなフラグメントには効率的には結合しない。
【0105】
ガラス、石英または溶融シリカスライドを、50%濃硫酸、50%過酸化水素中で一晩インキュベーションすることによってクリーニングする。次いで、これらを、蒸留水中で10回洗浄し、そして風乾し、そして15分間90℃まで加熱する。クリーニングしたスライドの表面を、0.1%アミノプロピルトリメトキシシランを含む95%アセトン中に室温にて2分間浸漬することによってコートし、その後、アセトン中で5回洗浄し、そして風乾する。
【0106】
得られたプローブ標的エレメントは一次DNAであり、質量で15%未満のニトロセルロースを含む。この標的エレメントからの自己蛍光は無視できた。プローブDNAのさらなる変性は、ハイブリダイゼーションの前には必要ではなかった。
【0107】
(ハイブリダイゼーション)
ハイブリダイゼーションのために、低い障壁を、ゴムセメントを用いてアレイの周りに形成した。得られたウェルは、約0.6〜1cm2の面積である。ハイブリダイゼーショ
ンミックスは、代表的には、試験DNAおよび参照DNAを各々を約400ナノグラム(ng)含む。試験DNAを、フルオレセインで標識し、そして参照DNAを、テキサスレッドで染色する(上記のとおり)。代表的なハイブリダイゼーション反応において、200〜400ngの標識試験DNA(ヒト核酸サンプル)および参照標識DNAを混合する。約35〜約50μgのCpt−1(Gibco BRL)DNAもまた、ハイブリダイゼーションミックスに含めて、反復配列をブロックする。次いで、この混合物を、エタノールで沈殿させる。蛍光測定手段(例えば、Hoeffer TKO 100蛍光測定器)によってCot−1の量を決定することが重要である。なぜなら、商業的供給業者によって使用される濃度の吸収測定は、頻繁に、ブロッキングDNAの存在の有効量を3〜6倍まで過剰評価するからである。少なすぎるブロッキングDNAを使用すると、小さな割合の変化を検出する能力は実質的に減少する。
【0108】
沈殿したDNAを、10μlのハイブリダイゼーションミックスに溶解させて、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、2×SSC、2%SDSおよび100μgのtRNAの最終組成を達成する。このウェルを、このハイブリダイゼーションミックスの10μlで満たす。カバースリップは使用しない。このハイブリダイゼーション溶液を、70℃まで5分間加熱して、DNAを変成させ、次いで、37℃にて約1時間インキュベートして、反復配列をブロックする。ハイブリダイゼーションを、ゆっくり揺れるテーブル上で37℃にて16〜72時間進行させて、ハイブリダイゼーションミックスを標的の上に能動的に輸送する。このスライドを、200μlのハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド/2×SSC)を含みプローブを含まない小さな密封スライドボックス中に置いて、ハイブリダイゼーションの間の蒸発を防ぐ。
【0109】
ハイブリダイゼーションの後、このスライドを、50%ホルムアミド、2×SSC(pH7)中で45℃にて15分間1回洗浄し、そして0.1%NP40を含む0.1Mリン酸ナトリウム中(pH8)で室温にて1回洗浄する。過剰な液体をスライドから排出させ、そしてアレイを1μg/mlのDAPIを含む抗消(antifade)溶液中にマウントし、DNAを対比染色する。ガラスカバーストリップを、その場所にシールする。上記のように、このスライドを、アレイ装置に置き、そして蛍光を読み取る。
【0110】
(分析データ)
スライド上の位置の関数としてのバックグラウンド蛍光を、プローブ蛍光色素画像(代表的には、フルオレセイン(サンプルDNA)およびテキサスレッド(参照DNA))について計算し、そしてバックグラウンド補正した全フルオレセインおよびテキサスレッドの強度を、セグメント化した標的の各々について計算する(蛍光シグナルを、画像分析プログラムを用いて分析した)。2つの蛍光色素の強度もまた、各標的について計算する。この分析には、約1分かかる。次いで、このデータを、保存および画像分析プログラムによる分析のために、データベースに移す。
【0111】
各画素の緑色強度と赤色強度との間のPearsonの「r」相関もまた、計算した。理想的には、標的における各画素の緑色および赤色強度は、互いに比例され、その結果、これらの測定のプロットを、直線にし、そしてその相関は、1.0であると予測する。実際には、「r」値は、ほぼ1.0から非常に低い値までの範囲であり、このことは、データにおける散乱を示す。それゆえ、本発明者らは、任意に決定した0.8の閾値未満の相関を有する全てのスポット上の測定を捨てる。従って、最終比は、有用なシグナルを与える標的の比の平均を示す。
【0112】
任意の画像分析プログラムを使用して上記の計算をなし得るが、これらの実験において、Chromosome CGH Analysis Program(Vysis,Inc.,Downers Grove,IL)のバリエーションを使用した。各標的クローンの4通りのスポットを、これらの実験において使用したように、代表的に、アレイにおいて使用する。この標的スポットの位置を、DAPI対比染色画像をセグメント化することによって決定した。
【0113】
このアレイCGH手順を、以下の点で評価した:(a)反復配列を含まないモデル系、(b)正常ヒト細胞、および(c)公知のコピー数変化を含む細胞株。反復配列の比存在下の性能を、変動量のλDNAでスパイクした200μgの全ヒトゲノムDNAからなる試験ゲノムおよび参照ゲノムを用いて評価した。λDNAはヒトゲノムの1.7×10-5の長さ(50kb対3×106kb)を有するので、約3pgのλDNAは、単一コピー
のヒト配列に等しい。試験ゲノムは、200ngのヒトゲノムDNA、ならびに1、2、20、200および2000pgのλDNAを含んだ。その比をハイブリダイゼーションに関して正規化した。参照ゲノムは、200ngのヒトゲノムDNAおよび20pgのλDNAを含んだ。20pgのλDNAを参照において使用した。なぜなら、ハイブリダイゼーションにおけるより高い試験ゲノム濃度(200および2000pgのλDNA)での二本鎖λ配列の再会合は、参照シグナルを抑制し、そして試験シグナルの対応するほぼ直線的な増加を生成するからである。しかし、試験蛍光シグナルおよび参照蛍光シグナルの比は、2つのゲノムにおけるλDNAの量の比に比例して増加した。
【0114】
単純な理論的検討は、蛍光色素がハイブリダイゼーションに示差的に影響しない場合は、蛍光比はコピー数比に正確に比例するはずであるという予想を導く。このような性能を、単一コピーの等価レベル未満から約103以上倍より高くまでの、全測定範囲にわたっ
て達成した。それゆえ、ヒトゲノムのコスミドサイズのセグメントまたはより大きいものに関与するコピー数の増加または減少は、単一コピーレベルで検出可能であるはずである。重要なことに、より高いレベルの変化もまた、正確に定量され得る(反復配列が影響しない場合)。
【0115】
(検出される単一コピー数の差異)
ヒト標本における測定を、約3Mbの間隔で第20染色体の長さに沿って分布するコスミド、P1およびBACクローン、ならびに染色体20q13.2の1.5Mb領域にわたるコンティグからのクローンから作製される標的を含むアレイを用いて行った。このアレイはまた、公知のオンコジーンcMYC、cERBB2、p53およびp16についてのゲノムクローン、ならびに第X染色体の領域からのクローンを含む。正常な女性DNAに対する正常な男性DNAの比較を使用して、2つのゲノムにおける相対的に同じコピー数で存在する標的間の比における変動、ならびに低レベルのコピー数変化を検出する能力を評価した。第20染色体標的の比(1.0の平均値を有するように正規化した)は、1.0+/−0.14の比であった(標準偏差)。第X染色体標的もまた含まれ、そしてその比(第20染色体に対して正規化した)は、0.63+/−0.04であった。それゆえ、この比は有意により低かった。従って、二倍体ゲノムにおける単一コピーの増加は、検出可能であった。0.5の期待値(一倍体コピー数についての)からの第X染色体比の偏差は、反復配列からのシグナルの不完全な抑制に起因する可能性が最も高い。
【0116】
上記の実施例は、本発明を例示するために提供され、その範囲を限定するものではない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に理解され、そして添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願を、本明細書中に参考として援用する。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明


【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2012−249638(P2012−249638A)
【公開日】平成24年12月20日(2012.12.20)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−204471(P2012−204471)
【出願日】平成24年9月18日(2012.9.18)
【分割の表示】特願2009−111495(P2009−111495)の分割
【原出願日】平成11年8月12日(1999.8.12)
【出願人】(506115514)ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (87)
【Fターム(参考)】