ヒトＦＰＰＳのＸ線構造およびＦＰＰＳ結合化合物を選択するための使用
本発明は、結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）、遊離ＦＰＰＳの三次元構造ならびに基質、例えばＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸）とのおよび／または阻害剤、例えばＺｏｍｅｔａ（登録商標）またはＡｒｅｄｉａ（登録商標）との複合体のＦＰＰＳの三次元構造に関する。さらに、ヒトＦＰＰＳの結晶を製造するための方法を記載する。本発明にしたがって、結晶は未知の構造のＦＰＰＳホモログ、変異体、リガンドとの複合体、ＦＰＰＳ結晶形および類似する分子の構造を決定するために使用できる。本発明はさらに例えばＸ線スクリーニングによる新規ＦＰＰＳリガンドを選択するため、およびＦＰＰＳに対する阻害剤を設計および／または同定するためのＦＰＰＳ結晶の使用に関する。さらに、本発明は新規治療剤に合成され得るＦＰＰＳへの新規低分子量の結合剤を選択および／または同定するためのＮＭＲ法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）、遊離ＦＰＰＳの三次元構造ならびにリガンド、例えばＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸）とのおよび／または阻害剤、例えばＺｏｍｅｔａ（登録商標）またはＡｒｅｄｉａ（登録商標）との複合体のＦＰＰＳの三次元構造に関する。さらに、ヒトＦＰＰＳの結晶を製造するための方法を記載する。本発明にしたがって、結晶は未知の構造のＦＰＰＳホモログ、変異体、リガンドとの複合体、ＦＰＰＳ結晶形および類似する分子の構造を決定するために使用できる。本発明はさらに例えばＸ線スクリーニングによる新規ＦＰＰＳリガンドを選択するため、およびＦＰＰＳに対する阻害剤を設計および／または同定するためのＦＰＰＳ結晶の使用に関する。さらに、本発明は新規治療剤に作り上げられ得るＦＰＰＳへの新規低分子量の結合剤を選択および／または同定するためのＮＭＲ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メバロン酸／イソプレン経路のホモ二量体酵素であるファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ、Ｅ．Ｃ．２．５．１．１０）は、ステロイド、ユビキノン、ドリコール、ヘムａ、およびプレニル化タンパク質の生合成のための前駆体であるファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の二段階合成を触媒する。ＦＰＰＳ反応はＭｇ２＋依存であり、ホモアリル二リン酸、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とアリル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）またはゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）間の“頭尾”縮合を含む。該反応はアリル型カルボニウムの形成を介して進行し、そしてアリル基質からピロリン酸（ＰＰｉ）の共放出を有する基質の次の高級同族体の形成に至る。
【０００３】
初期の生化学試験は、ＦＰＰＳが二価の金属イオン（Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）を必要とするアリル基質の結合で明瞭なアリルおよびホモアリル結合部位を有することを示した。反応は最初にアリル基質が酵素に結合することを有する定序メカニズムで起こる。さらに、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの縮合により形成されるＥ−ＧＰＰ−ＰＰｉ複合体は、ＦＰＰを製造するためにピロリン酸の解離およびＧＰＰの転移、次にＩＰＰとの第２の縮合反応をするために構造変化しなければならない。
【０００４】
鳥類のＦＰＰＳの結晶解析はＦＰＰＳの折りたたみを示し、そしてアリル基質結合についての情報を提供した。しかし、ＩＰＰ結合部位の位置および触媒サイクルをなす分子メカニズムはこれまでにしっかりと確立してはいない。最近、ＩＰＰおよび基質類似体またはビスホスホネートと複合した大腸菌ＦＰＰＳの構造が発表された(Hosfield et al., 2004, J Biol Chem, 279: 8526-8529)。大腸菌ＦＰＰＳの小さいサイズおよび低配列同一性のため、これらの結果がヒトＦＰＰＳにどこまで利用できるかはっきりしない。
【０００５】
ＦＰＰＳは最近、窒素含有ビスホスホネート剤、例えばＡｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート、ＣＧＰ０２３３３９Ａ）およびＺｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロネート、ＣＧＰ０４２４４６）の分子標的であることが示された。ビスホスホネートが破骨細胞による骨吸収を阻害する薬剤の非常に有効な種類であることは既知であり、したがって異常に増加した骨代謝回転、例えば骨粗鬆症、パジェット病、高カルシウム血症および骨転移が関与する状態の処置のために使用されている。したがって、現在ＦＰＰＳは重要な薬剤標的として認識されている。新規ＦＰＰＳ阻害剤は、上昇したコレステロール濃度の処置のために、骨疾患の処置だけでなく腫瘍学的にも治療的有効性を有し、抗感染薬として治療的有効性を有することが予期される。その医薬的関連性にもかかわらず、ヒトＦＰＰＳの構造情報はまだ欠乏している。阻害剤結合の構造モデルは利用できる鳥類のＦＰＰＳの結晶学的情報に大きく依存している。
【０００６】
構造に基づく方法、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法ならびにハイスループットスクリーニング技術を使用してヒトＦＰＰＳの阻害剤を選択および最適化し得るために、ヒトＦＰＰＳの三次元構造を決定することが必要である。本発明によって、この要求は結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）の提供により満たされる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、構造試験のための組み換えヒトＦＰＰＳの製造ならびにこの酵素の先頭を行く発見ならびに最初のＸ線分析を記載する。
【０００８】
本発明にしたがって、得られた結果が鳥類のＦＰＰＳで得られた以前の結果との相違があることを見いだした。したがって、本明細書で提供される結晶構造データは、この重要な薬剤標的の新規阻害剤の開発への新規構造情報を構成する。
【０００９】
本発明にしたがって、例えば大腸菌において発現され得るヒトＦＰＰＳ（ｈＦＰＰＳ）が均一に精製され、結晶化することができる。次いで、結晶の三次元構造をＸ線結晶学により決定できる。非リガンド結合状態の、およびリガンド、例えば基質、阻害剤および／または金属イオンと複合した両方のｈＦＰＰＳの結晶を得ることができる。特定の態様において、ｈＦＰＰＳの結晶はパミドロネート／Ｍｎ２＋、ゾレドロネート／Ｍｇ２＋およびイソペンテニル二リン酸／ゾレドロネート／Ｍｇ２＋との複合体である。
【００１０】
特定の態様において、結晶性ｈＦＰＰＳは開構造で、他の特定の態様において閉構造で存在する。開構造から閉構造への変化は主に、最後の１３０カルボキシ末端残基の剛体運動に付随する、活性部位を裏打ちする（lining）１つのループの大きな変化を含み、これは酵素の活性部位における２つの保存されたＤＤＸＸＤモチーフをお互いに近づける。
【００１１】
本発明にしたがって、さらに窒素含有ビスホスホネート阻害剤はアリル基質部位に結合し、三核金属中心を介して保存されたＤＤＸＸＤ配列モチーフ両方と相互作用することを見いだした。
【００１２】
本発明は、特に少なくとも１０μｍ、または、好ましくは少なくとも５０μｍ、または、好ましくは少なくとも１００μｍの辺の長さを有する単結晶形、特に大きな単結晶形である結晶性ヒトＦＰＰＳに関する。
【００１３】
本発明の結晶は、好ましくは空間群Ｐ４１２１２に属する。開構造である本発明の結晶（本明細書に結晶形ＩＩとしても記載されている）は、好ましくはａ＝ｂ＝１１１ű２０Å、ｃ＝７７ű２０Å、またはより好ましくは、ａ＝ｂ＝１１１ű１０Åおよびｃ＝７７ű１０Åの格子定数を有する。
【００１４】
閉構造である本発明の結晶（本明細書に結晶形Ｉとしても記載されている）は、好ましくはａ＝ｂ＝１１２ű２０Åおよびｃ＝６６ű２０Å、ならびにより好ましくは、ａ＝ｂ＝１１２ű１０Åおよびｃ＝６６ű１０Åの格子定数を有する。
【００１５】
本明細書に記載の精製方法の手段により、特に＜１０Å、より好ましくは＜５Å、さらにより好ましくは＜３Å、およびもっとも好ましくは＜２．６ÅのＸ線結晶学の解像度が達成できるこのような高純度の結晶を提供することを可能にする。
【００１６】
さらに、ｈＦＰＰＳ／リガンド複合体の構造決定はｈＦＰＰＳ結合部位を同定および決定でき、そしてそこからｈＦＰＰＳリガンド、特に阻害剤を決定できる。
【００１７】
本明細書で使用される“ヒトＦＰＰＳ”なる用語は、ファルネシル二リン酸合成酵素活性（FPPS, E.C. 2.5.1.10）を有する全てのヒト酵素に関する。特定の態様において、ヒトＦＰＰＳはＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４に合うアミノ酸配列、またはその配列の機能的フラグメントによりコードされている。好ましい態様において、最適アラインメントで行うとき、この配列の機能的フラグメントはＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のヒトＦＰＰＳの対応するフラグメント配列と少なくとも８０％の同一性、より好ましくは９０％、そしてさらにより好ましくは９５％の同一性を共有する。比較領域を決定するための配列の最適アラインメントはSmith and Waterman J. Theor. Biol., 91 (2) pgs. 370-380 (1981)の局部的相同アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Miol. Biol., 48(3) pgs. 443-453 (1972)の相同アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, PNAS, USA, 85(5) pgs. 2444-2448 (1988)の方法を介するのと同様の探索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化インプリメンテーションにより（GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin）または検査により実施され得る。
【００１８】
様々な方法により生成される最適アラインメント(すなわち、比較領域にわたってもっとも高い同一性比率を得られる)は、同一性比率を測定するために選択される。
【００１９】
本発明で使用する、ヒトＦＰＰＳ変異体は、最適アラインメントで行うときＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のヒトＦＰＰＳの対応するフラグメント配列と少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％の同一性を共有するヒトＦＰＰＳのアミノ酸配列を有するヒトＦＰＰＳである。好ましくは、ｈＦＰＰＳの変異体はヒトＦＰＰＳの単一の変異体、より好ましくは、不完全なまたは非機能的変異体である。本発明の特定の態様において、ヒトＦＰＰＳ変異体は下記に定義のとおりの結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するヒトＦＰＰＳである。
【００２０】
本明細書で使用される“リガンド”なる用語は、ヒトＦＰＰＳの１個またはそれ以上の特定の部位に、好ましくはヒトＦＰＰＳの結合ポケットに、もっとも好ましくはヒトＦＰＰＳの３個の特定の結合部位の１個に結合する分子または分子の群を意味する。本発明のリガンドは好ましくは低分子量分子である。
【００２１】
本明細書で使用される“低分子量化合物”なる用語は、好ましくは一般に分子量約１０００ダルトン未満、より好ましくは約６００ダルトン未満を有する有機化合物を意味する。もっとも好ましくは、該低分子量化合物またはリガンドはヒトＦＰＰＳ活性を阻害する。
【００２２】
本明細書で使用される“結合ポケット”なる用語は、その形および物理化学的特徴の結果として、好都合には他の化学物質または化合物と関連して、ヒトＦＰＰＳの領域を意味する。好ましくは、それは発明により同定される下記の３個の結合部位からなる結合ポケットを意味する：
【００２３】
１）少なくとも下記のアミノ酸Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０、Ｇｌｎ９６、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０およびＡｓｐ２４３が配置されている（lined by）、ホモアリル基質（ＩＰＰ）の結合部位、
２）アリル基質（ＤＭＡＰＰまたはＧＰＰ）およびビスホスホネートベース阻害剤の結合部位。この結合部位はＤＤＸＸＤモチーフ両方を含む三核金属中心が特徴である；それは少なくとも下記のアミノ酸：Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７、ならびに特に下記のアミノ酸：Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７が配置されている；
３）以下“新規結合部位”と記載し、少なくとも下記のアミノ酸：Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８が配置されている本発明において同定された新規結合部位。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、残基の番号付けはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録Ｐ１４３２４と同意である。
【００２５】
特に、ＩＰＰ／ゾレドロネート／Ｍｇ２＋／ｈＦＰＰＳ複合体の構造決定により、ホモアリル基質結合部位、すなわちＩＰＰ結合部位の位置が達成され、ＩＰＰ認識に関与する保存された残基が特定された。さらに、ビスホスホネート阻害剤ゾレドロネートは三核金属中心を介してアリル基質部位に結合することを見いだした。
【００２６】
本発明にしたがって、新規リガンド、特にヒトＦＰＰＳに対する新規阻害剤を選択および／または設計するために結合ポケットに関する情報を使用することが好ましく、それによってここでリガンドは、好ましくはＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する。より具体的に、それはＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する。より好ましくは、本発明において同定されるヒトＦＰＰＳの新規結合部位に関する情報を使用することが好ましく、該新規結合部位は少なくとも下記のアミノ酸Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８含む。したがって、本発明の目的は、新規リガンド、とりわけＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される新規結合部位を含む１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する非ビスホスホネートリガンドの設計および／または同定のための手段を提供することである。
【００２７】
他の特定の態様において、本発明のｈＦＰＰＳ結晶はＦＰＰＳモノマーあたり３個の金属陽イオン、特にＭｇ２＋または／およびＭｎ２＋を含む。
【００２８】
本発明はさらに
（ｉ）組み換えヒトＦＰＰＳを大腸菌で発現させ（ここで該組み換えヒトＦＰＰＳはアミノ酸断片６から３５３を含む）、
（ｉｉ）発現したヒトＦＰＰＳを精製し、そして
（ｉｉｉ）精製ヒトＦＰＰＳを結晶化する
段階を含む、結晶性ヒトＦＰＰＳ生成物の製造法に関する。
【００２９】
好ましくは、組み換え発現はＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のものと合う配列からのアミノ酸残基６から３５３をコードするプラスミドを使用することにより達成する。
【００３０】
特定の態様において、段階（ｉｉ）の精製は陰イオン交換カラムおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介する精製を含む。
【００３１】
他の態様において、段階（ｉｉｉ）の結晶化は蒸気拡散、自由界面拡散、微小透析または油のもとでのマイクロバッチによる結晶化を含む。
【００３２】
より好ましくは、ヒトＦＰＰＳを製造するための方法は明細書の下記の精製法１にしたがって行う。
【００３３】
本発明はまた上記方法により得られる結晶性ヒトＦＰＰＳに関する。
【００３４】
したがって本発明は、図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義されるヒトＦＰＰＳの結晶構造、およびその類似する構造を提供する。
【００３５】
“選択された部分”は図１４、１５、１６、１７および／または１８で示される少なくとも１０個のアミノ酸、および好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の構造座標を意味する。好ましい態様において、選択された部分は上記定義のとおりの結合ポケットの３個の結合部位の少なくとも１個を形成するアミノ酸の構造座標に対応する。
【００３６】
“類似する構造”は図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標と比較するとき、本実施例において行われる結晶構造のＸ線の解像度の範囲内、好ましくは＜１０Å、より好ましくは＜５Å、さらにより好ましくは＜３Åおよびもっとも好ましくは＜２．６ÅのＸ線結晶学の解像度の範囲内で変化を有する構造座標を有するヒトＦＰＰＳの構造を意味する。
【００３７】
ヒトＦＰＰＳが２つの構造、すなわち閉構造ならびに開構造で存在することを見いだした。
【００３８】
実際、構造の微調整中に、驚くべきことに、ヒト酵素が、鳥類のＦＰＰＳと比較して異なる構造状態であることを見いだし、それを閉環状態と呼ぶ（図１）。２つの構造状態間の構造の重なりで、最後の１３０個のカルボキシ末端残基のみがヘリックスＨ、Ｉ、Ｊならびにα−１、α−２およびα−３の剛体移動での、構造スイッチにより影響されることを見いだした（図３）。この構造変化はヘリックスＨをヘリックスＤに近づけ、それによって２個のＤＤＸＸＤモチーフ間の距離を短くし、活性部位を閉じる。開構造において、Ａｓｐ１０３とＡｓｐ２４３のＯδ２原子間は１２Åであり、閉状態においてこの距離は１０Åに減少する。この剛体移動は、閉状態の活性部位上を締め付けるようにふたとして働くＨ−Ｉループの大きな変化に付随する（図９）。Ｈ−Ｉループの先端のＧｌｙ２５６のＣα原子の位置は６．７Å移動する。酵素活性部位を裏打ちし、基質の結合に関連するいくつかの保存された残基はまた、構造スイッチ、特にＰｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ２５７およびＬｙｓ２６６により影響される。さらに、いくつかの構造成分が閉構造においてより秩序正しくなる。これは、開状態においてあまり明確でない電子密度および高いＢファクターを有するＨ−Ｉループ、ならびに開状態において無秩序であるが閉状態において結合した基質と相互作用するＦＰＰＳの最後の３個のカルボキシ末端残基、Ａｒｇ３５１、Ａｒｇ３５２およびＬｙｓ３５３について当てはまる。しかし二量体の中間面は構造スイッチにより影響されない。２つのＦＰＰＳサブユニットは固定されているままであり、二量体の２つ折りの軸を中心とする堅い核を構成している、ヘリックスＡ、Ｂ、ＤおよびＥを介して相互作用する。
【００３９】
さらにヒトＦＰＰＳの構造を研究するため、特にＦＰＰＳ／リガンド相互作用についての興味のある情報を得るために、リガンド分子または／および阻害剤分子と複合したヒトＦＰＰＳを含む結晶を製造できる。
【００４０】
本発明により提供されるｈＦＰＰＳ結晶および結晶構造データ、各々は特にｈＦＰＰＳの結合部位の同定ならびに新規ＦＰＰＳリガンドの選択、設計、同定および／または提供のために使用できる。
【００４１】
特に結晶構造データから始め、リガンド分子は容易にコンピュータ利用モデリングプログラムを使用して得ることができる。この目的のため、例えば、最初にＦＰＰＳおよび結合部位、各々の三次元表現を結晶構造データ、三次元表現、例えば電子密度図、ワイヤーフレームモデル、鶏羽軸モデル、球および棒モデル、空間充填モデル、骨格モデル、リボンモデル、スネークモデル、矢印および円柱モデル、分子表面モデルまたはそれらの組合せの手段により生成する。適当なリガンドはそれらの三次元構造の手段により選択し、それによって、該構造はＦＰＰＳの相互作用部位に相補的であるべきである。この目的のため、例えば、ＦＰＰＳの三次元表現および可能なリガンド化合物の三次元表現を製造し、次いでそれを可能な化合物の三次元表現がＦＰＰＳの三次元表現の結合ポケットに合うかどうかを所望によりコンピュータを利用して試験する。この手順は特に合理的な薬剤設計に対して適当である。
【００４２】
本発明の１つの態様において、コンピュータベースの方法は
ａ）ヒトＦＰＰＳの構造座標にしたがってヒトＦＰＰＳの三次元表現を提供し、
ｂ）候補化合物の三次元表現を提供し、
ｃ）三次元表現がヒトＦＰＰＳの結合ポケットに相補的である候補化合物を選択し、そして、
ｄ）所望により溶解性、親和性、特異性および／または有効性のような物理学的特徴を最大化するために段階ｃ）で選択される該化合物を修飾する
段階を含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドの選択、設計および／または同定のための方法を提供する。
【００４３】
リガンドは、化合物データベースまたはライブラリーをスクリーニングし、ヒトＦＰＰＳの結合ポケットの結合部位に合う操作を行うためコンピュータ手段を使用して、選択できる。図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される表の構造座標のすべてまたは一部の本発明で提供される結合ポケットの三次元構造は、様々な結合プログラムと一緒に使用できる。
【００４４】
ヒトＦＰＰＳの化合物の可能な阻害剤または結合効果は、その実際の合成を行う前に、コンピュータモデリング技術の使用により試験することにより分析し得る。得られる化学物質の理論構造がそれとヒトＦＰＰＳ間の相互作用および結合が不十分であることを示すとき、化合物の合成および試験の必要性が回避される。しかし、コンピュータモデリングが強い相互作用を示したとき、次いで分子を合成し、ヒトＦＰＰＳへの結合する能力を試験し得る。したがって、効力のない化合物の高価で、時間のかかる合成を避け得る。
【００４５】
ヒトＦＰＰＳの阻害剤または他の結合化合物は、化合物のヒトＦＰＰＳの個々の結合部位と結合する能力をスクリーニングし、選択する一連の段階の手段により、コンピュータ的に評価および設計され得る。したがって、当業者は化合物のヒトＦＰＰＳと結合する能力をスクリーニングするためにいくつかの方法の１つを使用し得る。この工程は、例えばすべてまたは一部の構造座標に基づくコンピュータスクリーン上の結合部位の目視検査により始め得る。次いで、選択された化合物をヒトＦＰＰＳのポケット結合部位内に様々な配置で置くか、または“ドッキング”し得る。ドッキングはソフトウェア、例えばＱｕａｎｔａおよびＳＹＢＹＬ、次いで標準分子力学力場に関するエネルギー最小化および分子動力学、例えばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲを使用して成し遂げ得る。特殊コンピュータプログラムが興味のある化合物を選択するために使用され得る。これらのプログラムは、例えばOxford University, Oxford, UKから入手できるＧＲＩＤ；Molecular Simulations, Burlington, MAから入手できるＭＣＳＳまたはＣＡＴＡＬＹＳＴ；Scripps Research Institute, La Jolla, CAから入手できるＡＵＴＯＤＯＣＫ；University of California, San Francisco, CAから入手できるＤＯＣＫおよびUniversity College of London, UKから入手できるＸＳＩＴＥを含む。
【００４６】
好ましい態様において、ヒトＦＰＰＳの閉構造の構造座標は上記コンピュータベースの方法で使用し得る。
【００４７】
好ましくは、該化合物はＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するものの中から選択される。より具体的に、それはＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する。
【００４８】
別の好ましい態様において、該化合物は新規結合部位に合うリガンドの中から選択される。好ましくは、該化合物はＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するものの中から選択される。
【００４９】
別の好ましい態様において、物理学的特徴、例えば溶解性、親和性、特異性および／または有効性を最大化するために、段階ｃ）で選択される該化合物を修飾することによるリガンドを設計する方法を提供する。
【００５０】
設計された化合物は結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と物理学的に相互作用できるはずである。この結合は、例えば共有結合もしくは非共有結合またはファンデルワールス力、疎水性または静電相互作用のような化学的結合であり得る。第２に、該化合物は、ヒトＦＰＰＳ、好ましくはヒトＦＰＰＳの結合ポケットと結合できる構造を取ることができなければならない。必ずしも化合物のすべての部分がヒトＦＰＰＳとの結合に関与するわけではないが、それでもこれらの結合しない部分は分子の全体的な構造に影響し得る。このような構造必要条件は、結合部位のすべてまたは一部と結合する化学物質の全体的な三次元構造および配置を含む。
【００５１】
図１４、１５、１６、１７および／または１８で示される構造座標はとりわけ好ましくはコンピュータ可読データを有するデータ記憶媒体を含むコンピュータ可読記憶媒体に保存される。コンピュータ可読記憶媒体はコンピュータシステムの一部であり得る。
【００５２】
本発明はさらに
ａ．候補化合物とヒトＦＰＰＳを共結晶化またはインキュベートし、
ｂ．Ｘ線またはＮＭＲ法により候補化合物と相互作用するヒトＦＰＰＳのアミノ酸を決定し、
ｃ．段階ｂの結果に基づいて、Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群、特にＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する化合物を選択する
ことを含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドを選択するための方法に関する。
【００５３】
段階ｂ）を行うため、リガンドの結合部位のマッピングは、通常、候補化合物と共にまたは無しでＮＭＲスペクトルの記録すること、そしてリガンド結合により影響されるタンパク質の共鳴を同定することにより行う。これは、分析する前のタンパク質共鳴の割り当て、または既知の結合部位とリガンドとの結合により起こる化学シフト変化のパターンとの比較が必要である。あるいは、該リガンドと既知の結合部位を使用する競合的実験が同等の情報を生じ得る。
【００５４】
したがって、本発明はまたＦＰＰＳへの改良された結合剤、特に低分子量結合剤を選択するためのＮＭＲ法に関する。この方法は、好ましくは間接的方法において選択される共鳴の割り当てに基づく。特に、１つのリガンド、例えばパミドロネートの他のリガンド、例えばゾレドロネートへの置換により化学シフト変化を受ける共鳴は、第２のリガンドの位置に非常に近接して位置し得る。したがって、これらの化学シフト変化はリガンド結合部位を示す。このアプローチは常磁性の金属イオン、例えばＭｎ２＋の反磁性の金属イオン、例えばＭｇ２＋での置換による常磁性緩和の増大によりさらに助けられ得る。このような常磁性緩和の増大の影響を受けない残基は常磁性中心から＞２ｎｍ離れており、一方このような常磁性緩和の増大の影響を受ける残基は金属イオンから１．０から１．５ｎｍの距離である。
【００５５】
好ましい態様において、段階ａ）の前に、該候補化合物は上記本発明のコンピュータベースの方法にしたがって選択される。
【００５６】
別の特定の態様において、本発明の方法はさらに
ｄ．物理学的特徴、例えば溶解性、親和性、特異性および／または有効性を最大化するために段階ｃ）で得られる化合物の類似体を設計し、
ｅ．ヒトＦＰＰＳに結合できる新規化合物を選択するために対応する類似体で上記の方法の段階ａ．からｃ．を繰り返す
段階を含む。
【００５７】
本発明はさらに、フラグメント関連アプローチを使用して、ヒトＦＰＰＳの新規リガンドを設計するための方法を提供する。各結合部位に結合する化合物がまず選択される。
【００５８】
次いで、設計される新規化合物が２つの結合部位内に納まるように、リガンドを空間的な配置に基づいて一緒に結合させる。
【００５９】
本発明はヒトＦＰＰＳへのリガンドを設計する方法であって、該方法が
ａ）ヒトＦＰＰＳの第１の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第１のリガンドを提供し、
ｂ）ヒトＦＰＰＳの第２の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第２のリガンドを提供し、
ｃ）ヒトＦＰＰＳの第１のおよび第２の結合部位に結合するリガンドを設計するために、該第１のリガンドと該第２のリガンドを連結する
段階を含む方法。
【００６０】
特定の態様において、該方法は第３の結合部位の１つまたはそれ以上の残基に結合するリガンドを提供し、そして第１の、第２のおよび第３の結合部位に結合するリガンドを形成するために段階ｃ）で得られるリガンドに該第３のリガンドを連結する段階を含む。
【００６１】
好ましくは、段階ａ）での第１のリガンドがヒトＦＰＰＳの新規結合部位内に納まるリガンドの中から選択される。好ましくは、該第１のリガンドがＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される。
【００６２】
適当な連結基の選択は、有機化学の分野において既知の結合角および結合長の情報の原則に基づきお互いにおよびヒトＦＰＰＳへのリガンドの空間的な配置を維持することにより作られる。
【００６３】
より好ましくは、段階ｂ）での第２のリガンドはホモアリル基質（ＩＰＰ）の結合部位および／またはアリル基質（ＤＭＡＰＰまたはＧＰＰ）の結合部位内に納まるリガンドの中から選択される。例えば、段階ｂ）での第２のリガンドがＧｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０、Ｇｌｎ９６、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０およびＡｓｐ２４３および／またはＰｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７、特にＬｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される。
【００６４】
最後に、本発明はまた、本明細書で得られる情報を使用して得られるヒトＦＰＰＳに対するリガンドに関する。これらのリガンドは好ましくは、ヒトＦＰＰＳの阻害剤である。このようなリガンドは、好ましくは医薬組成物、特に腫瘍誘発高カルシウム血症、骨のパジェット病、溶骨型転移、閉経後骨粗鬆症、低コレステロール血症および／または軟組織癌の処置および／または予防するための医薬組成物に使用される。
【００６５】
図の説明
図１：ヒトＦＰＰＳホモ二量体（閉構造）の全体的な構造
図２：ヒトＦＰＰＳの活性部位断面内、未知の内因性リガンドの存在を示す残りの電子密度（３σトレース）。電子密度は部分的にリン酸基と解釈され、球および棒表示（立体図）において示された。
図３：ヒトＦＰＰＳの閉状態（マゼンタ色のＣαトレース）および開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の重ね合わせ。最初の１５０アミノ−末端残基（ｒｍｓｄ＝０．３４Å）を使用して、２つの構造を重ね合わせた。重ね合わせは最後の１３０Ｃ末端残基のみが実は構造スイッチ、顕著にＨ−ＩループおよびＨ、α−１、α−２、α−３、ＩおよびＪヘリックスにより影響されることを示し、一方、最初の２２０残基はｒｍｓｄ０．４４Åのみを示す。
図４：ヒトＦＰＰＳ（マゼンタ色のＣαトレース）の開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の上に閉構造を重ね合わせたクローズアップ図。ＨヘリックスおよびＨ−Ｉループの大きな変化が、顕著に残基Ｆ２３９、Ｑ２４０、Ｄ２４３、Ｄ２４７、Ｇ２５６、Ｋ２５７およびＫ２６６の位置に影響することを示す。
図５：Ｍｎ２＋およびパミドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。パミドロネートは透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
図６：３つのＭｇ２＋イオンの配位圏（２つの異なる配置）。シアンブルー色の球は明確な水分子を示す。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）のヒドロキシル基を含む極性相互作用は波線で示される。
図７：Ｍｇ２＋およびＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）とのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
【００６６】
図８：リガンド、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）およびイソペンテニル二リン酸を結合している電子密度（σＡ−加重、（Ｆｏ−Ｆｃ、φｃａｌｃ）結合、電子密度図、４．０σ輪郭を除く）。緑色の球はＭｇ２＋陽イオンの位置を示し、シアンブルー色の球はマグネシウムイオンの配位圏に属する水分子の位置を示す。
図９：イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびヒトＦＰＰＳにおけるその結合部位との結合相互作用のクローズアップ図。可能な水素結合はオングストロームの長さを示す薄い黒色の線により示される。ＩＰＰはそのファンデルワールス力表面と一緒に球および棒表示で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は球および棒で示される。シアンブルー色の球は水分子を示し、緑色の球はマグネシウムイオンを示し、そしてマゼンタ色の球は暫定的にナトリウムイオンの残りの密度の位置であるとみなす。
図１０：ＦＰＰＳホモ二量体（８０ｋＤａ）：非リガンド結合ＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ；黒いスペクトル）およびパミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
図１１：パミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。パミドロネートをＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）により置き換えることにより摂動したいくつかの共鳴は赤い円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
図１２：ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）およびＩＰＰの添加後（４００μＭ；緑色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。ＩＰＰ添加により摂動したいくつかの共鳴は緑色の円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
図１３：ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：８００μＭ；黒いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｎ２＋へ複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｎ２＋濃度：４００μＭ；オレンジ色のスペクトル）の８００ＭＨｚの１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
【００６７】
図１４：閉形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１５：開形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１６：パミドロネートおよびＭｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１７：ゾレドロネート、ＩＰＰおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１８：ゾレドロネートおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１９：Ｚｎ２＋およびイバンドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。あり得る極性／静電相互作用は薄い黒い線により示される。イバンドロネートは球および棒表示で示される。三級窒素の反転から創作するイバンドロネートの２つの別の構造をモデル化し、精密化した。三核Ｚｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒に灰色の球として示される。
図２０：イバンドロネートおよびＺｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【実施例】
【００６８】
１．クローニングおよび大腸菌発現
ヒトファルネシル二リン酸合成酵素をコードするプラスミドはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ ｃＤＮＡクローンライブラリー（クローン ＭＧＣ：１５３５２、ＩＭＡＧＥ：４１３２０７１）由来であった。その配列はＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のものと合っていた。アミノ酸フラグメント６から３５１をコードするＤＮＡはオリゴヌクレオチドＭＧ１０５３（5'-ctggaagttctgttccaggggccaaattcagatgtttatgcccaagaa-3'）およびＭＧ１０５４（5'-gtcgacgtaggcctttgaattcactttctccgcttgtagattttg-3'）を使用してＰＣＲによりクローニングした。次いでＰＣＲフラグメントをGeiser et al. (Bio Techniques 31 (2001) 88-92)の方法にしたがってプラスミドｐＸＩ３４１に結合させた。得られるプラスミドはｐＸＩ４７８と呼ばれ、ヒトＦＰＰＳ（ヘキサヒスチジンタグ、次いでＮ末端でＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ開裂を有するアミノ酸残基６から３５１）に対応する。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｔｕｎｅｒ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＸＩ４７８プラスミドで形質転換し、発酵を開始させるまで液体窒素中で保存した。
【００６９】
２．発酵
２．１ バッチ１
組み換え大腸菌を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５リットルＴＢｍｏｄ培地中ＩＳＦ−１００発酵槽で、まず３７℃で１ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ＝３．７まで培養し、次いでさらに４時間２８℃でｐＨ＝７．０、ｐＯ２＝９７−９８％で培養した。回収した細胞（６８ｇの生重量）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（予想分子量４０ｋＤａでクマシー染色ゲルの顕著なバンド）により示されるとおり高レベルで、約５０％が可溶形のＦＰＰＳを発現した。
【００７０】
ヒトＦＰＰＳ（残基６から３５３）の高レベル発現（＞５０ｍｇ／ｌ）を大腸菌において成し遂げることができる。約１０から５０％のタンパク質は可溶形で製造された。精製された酵素の同一性および完全性はＮ末端シークエンシングおよび質量分析により立証された。天然条件下のエレクトロスプレイイオン化質量分析でヒトＦＰＰＳが８０ｋＤａのホモ二量体であることを確認した。タンパク質は十分に機能し、十分に可溶性であり（＞２０ｍｇ／ｍｌ）、安定であり、そして期待される酵素活性を示した。
【００７１】
２．２ バッチ２
組み換え大腸菌をＩＳＦ−１００発酵槽中で２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５．５リットルの自動誘導培地ＺＹＰ−５０５２中で培養し、１４時間２８℃でｐＨ＝７．１でｐＯ２＝１００−８９％で自動誘導および培養した。飢餓細胞（１１４ｇの生重量）は高レベルでＦＰＰＳを発現したが、約１０％だけが可溶形であった。
【００７２】
３．精製
３．１ 精製法１：バッチ１
６８ｇの大腸菌湿細胞ペレット（バッチ１）を５６０ｍｌのバッファーＡ（各５ｍＭのＤＴＴ、ベンズアミジンＨＣｌおよびＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で懸濁し、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ−５０マイクロフルイダイザーに２回通すことにより溶解させ、３０分間１５，０００ｒｐｍでＳＬＡ１５００ ｒｏｔｏｒ（Ｓｏｒｖａｌｌ）中で遠心した。得られた上清をバッファーＡで平衡にしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰのＸＫ２６／１０カラムに充填した。カラムをバッファーＡ（１５カラム用量；７５０ｍｌ）中のＮａＣｌの０から１Ｍの勾配により溶出した後、該カラムを基準値がゼロに戻るまでバッファーＡで洗浄した。１０ｍｌの画分を回収し、ピークを溜め、４−２０％のＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。勾配の最初の方に溶出する鋭いピークがＦＰＰＳであることをＬＣ−ＭＳにより確認した。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣに基づいて、このピークは１９３ｍｇのＦＰＰＳを含んだ。９６４単位のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを直接加え、混合物を一晩４℃でインキュベーションした。ＬＣ−ＭＳでＮ−末端Ｈｉｓタグの完全除去を確認した。消化画分を約１０ｍｌへ限外濾過し、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、２ｍＭのＤＴＴおよび２５ｍＭのＮａＣｌで平衡にされたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５のＸＫ２６／６０カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより濃縮した。（ＲＰ−ＨＰＬＣにより）１６８ｍｇのタンパク質を含む単一ピークを４０ｍｌの全量中に溶出した。
【００７３】
３．２ 精製法２：バッチ２
１１４ｇの大腸菌の湿細胞ペレット（バッチ２）を９４０ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解し、３４，０００ｇで遠心分離した。上清を滅菌濾過し、次いでバッファーＡで平衡にしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ陰イオン交換カラムに充填した。溶出を８カラム用量にわたって０から１．０ＭのＮａＣｌ勾配により実施した。ＦＰＰＳが勾配の最初の方の約１００−１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。該画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、溜め、グリセロール、硫化アンモニウムおよび塩化ナトリウムを各々最終濃度１０％（ｗ／ｖ）、１．５Ｍおよび１．０Ｍの濃度まで加えた。サンプルを次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、１．０ＭのＮａＣｌ、１．５Ｍの硫化アンモニウムで平衡にしたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムに充填し、８カラム用量にわたって０．０ＭのＮａＣｌおよび０．０Ｍの硫化アンモニウムまでの逆塩勾配により溶出した。ＦＰＰＳは勾配の最後の方で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、溜め、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、２．０ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＮａＣｌでＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除クロマトグラフィーに充填した。該画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にしたがって溜め、限外濾過により濃縮し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．２、０．３ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール（バッファーＢ）に対して透析した。サンプルを次いでバッファーＢで平衡にした金属キレート化カラム（ＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ）に充填し、１０ｍＭから１．０Ｍ勾配のイミダゾールにより溶出した。１５４単位のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを加え、反応混合物を一晩５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴに対して透析した。透析バッファーを次いでバッファーＢに変え、サンプルをその後金属キレート化カラムに充填した。流入物を回収し、限外濾過により約４ｍｌに濃縮し、バッファーＣ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＴＣＥＰ）で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ サイズ排除カラムに充填した（４つ実施）。主要なピークに対応する画分を溜め、限外濾過により１６ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、アリコートし、−８０℃で保存した。
【００７４】
４．分析
精製したタンパク質は、Ｎ末端に処理したＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ開裂部位から付加的なグリシンおよびプロリン残基を有するアスパラギン６からリシン３５３のヒトＦＰＰＳ配列に対応する、全３５０個のアミノ酸残基を有した。それは理論分子量４０，１４１Ｄａを有した。残基は変異されていなかった。ＬＣ−ＥＳＭＳ分析は予測される質量を示す。エドマン分解によるＮ末端シーケンシングは予測されるアミノ酸配列と一致した。
【００７５】
５．結晶化
結晶化は蒸気拡散法により行った。静滴（ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ ウェルプレート中）および懸滴（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ）技術（Ｌｉｎｂｒｏ ２４ ウェルプレート中）両方を使用した。この試験で使用した結晶は、ｐＨ５．３で他は同様の実験条件下で成長させたパミドロネート／Ｍｎ２＋複合体を除いて、１９℃で１．２Ｍのリン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ４．７、２５％（ｖ／ｖ）のグリセロールから成長させた。
【００７６】
ヒトＦＰＰＳの大きな単結晶は、様々な高塩条件下（１．０Ｍのクエン酸アンモニウムまたは１．２Ｍから１．８Ｍのリン酸Ｎａ／Ｋまたはリン酸アンモニウム）でｐＨ４．０から５．６（図３−１）で得ることができる。結晶はもろく、したがって好ましくは冷凍結晶学に直接適当な条件下（１．２Ｍのリン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ４．７から５．６で、２５％（ｖ／ｖ）のグリセロール）で成長させる。２つの結晶形は両方とも非対称単位あたり１つのＦＰＰＳサブユニットを有する空間群Ｐ４１２１２であることを観察できる。開構造の非リガンド結合のヒトＦＰＰＳの結晶はおおよその格子定数ａ＝ｂ＝１１１Å、ｃ＝７７Å（結晶形ＩＩ）を有し、一方、閉構造に対応するものは格子定数約ａ＝ｂ＝１１２Å、ｃ＝６６Å（結晶形Ｉ）を示す。後記の同形物結晶はパミドロネート、ゾレドロネート／ＩＰＰ、および５ｍＭのＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の存在下で同様の実験条件下で得ることができる。
【００７７】
開構造の非リガンド結合の酵素の結晶は精製法２にしたがって単離されるヒトＦＰＰＳで得られた。すべての他の結晶はバッチ１（精製法１）で製造した。両方の酵素バッチで、タンパク質貯蔵溶液は２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ中の１６ｍｇ／ｍｌのヒトＦＰＰＳ（６−３５３）であった。アポ結晶を当量の結晶化溶液およびタンパク質貯蔵溶液の混合により製造した。パミドロネート、ゾレドロネートおよびＩＰＰの複合体を５ｍＭのＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の存在下で減少したタンパク質濃度（４．２ｍｇ／ｍｌ）で共結晶化により製造した。パミドロネート（５０ｍＭ）およびゾレドロネート（１０ｍＭ）の貯蔵溶液を普通の水で２．５ｍＭおよび０．５ｍＭ各々の最終濃度に酵素を加え製造した。ＩＰＰを７０％のメタノール、３０％の１０ｍＭの水酸化アンモニウム中の１ｍｇ／ｍｌの溶液としてＳｉｇｍａから購入し、タンパク質（基質の３倍モル過剰）に対して１：５０に希釈した。
【００７８】
５ｂ．イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体の結晶化
イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体の結晶を静滴技術の蒸気拡散により１９℃で０．１Ｍの酢酸亜鉛、０．１Ｍの酢酸Ｎａ、１２％のＰＥＧ ４０００、ｐＨ４．４により成長させた。タンパク質貯蔵溶液は１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および１．０ｍＭのイバンドロネート中の１３．８ｍｇ／ｍｌのヒトＦＰＰＳ（６−３５３）であった。
【００７９】
６．Ｘ線データ収集
Ｘ線データをＭＡＲＣＣＤ １６５ｍｍ 検出器およびシンクロトロン放射（Swiss Light Source、ビームラインＸＳ０６Ａ）を使用し９５Ｋで収集した。結晶は冷凍ループ中に置き、冷窒素流中で直接急速冷凍した。回折データはＨＫＬプログラム一組のバージョン１．９６．６（Otwinowski and Minor、1997）またはＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥ（Kabsch、1993）で処理および概算した１．０°振動像として記録した。すべての結晶は非対称単位あたり１つのＦＰＰＳ単量体を有する空間群Ｐ４１２１２であった。結晶データおよびデータ収集統計値は表１で示される。
【００８０】
５つの完全なデータセットをＳｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで開構造（２．３Å）および閉構造（２．４Å）のアポ酵素、ならびにパミドロネート／ＭｎＣｌ２（２．６Å）およびゾレドロネート／ＭｇＣｌ２（２．２Å）との二元複合体ならびにＩＰＰおよびゾレドロネート／ＭｇＣｌ２（２．６Å）との三元複合体に対して収集した（図１４、１５、１６、１７および１８の表を参照）。
【００８１】
６ｂ．Ｘ線データ収集：イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体
Ｘ線データをＭＡＲＣＣＤ ２２５ｍｍ 検出器およびシンクロトロン放射（Swiss Light Source、ビームラインＰＸ−ＩＩ）を使用し１００Ｋで収集した。１つの単結晶は冷凍ループ中に置き、冷窒素流中で直接急速冷凍した。回折データはＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥ（Ｋａｂｓｃｈ、１９９３）で処理および概算した１．０°振動像として記録した。結晶は非対称単位あたり１つのＦＰＰＳ単量体を有する空間群Ｐ４１２１２であった。結晶データおよびデータ収集統計値は表１ｂで示される。
【００８２】
７．構造決定
非リガンド結合のヒトＦＰＰＳの構造を最初に１５．０から３．５Åの解像度のおよび探索モデルとして２．６Å構造の鳥類のＦＰＰＳ（ＰＤＢ登録１ＦＰＳ）のデータを使用し、プログラムＡＭｏＲｅ（Navaza, Acta Crystallogr. Sect A 50 (1994) 157-163）で分子置換することにより決定した。ヒトのおよび鳥類のＦＰＰＳは６９％（２４１／３４５）配列同一性である。閉形および開形両方に関して、はっきりとした分子置換解釈を見いだした。閉形に関して、６９．５％の相関係数および０．３１１のＲファクターを得た。開形に関して、５１．０％の相関係数および０．４１０のＲファクターを得た。次いで、両方の構造をねじれ角力学およびエネルギー最小化のいくつかのサイクルを使用してＣＮＸ ｖ２００２．０２で精密化し（Bruenger et al., Acta Crystallogr. Sect. D; Biol. Crystallogr. 54 (1998) 905-921）、プログラムＯでモデル再構築段階により散在させた（Jones et al., Acta Crystallogr. Sect A, 47 (1991) 110-119）。精密化中、protein_rep.param force field（Engh and Huber, Acta Crystallogr. Sect A, 47 (1991) 392-400）を使用した；マスク法に基づく大量の溶媒補正、および最初の異方性Ｂファクター補正を適用した。抑制異方性原子Ｂファクターを精密化した。精密化標的は振幅を使用する最大可能性標的であった。σカットオフは構造ファクター振幅に適用しなかった。クロス確認は１０％の反射を含む試験セットを使用して精密化中に使用した。水分子をCNX script water_pick.inpで同定し、異なるピーク高（３．０σより大きい）、水素結合および距離基準に基づいて選択した。６５Å２より大きい温度因子を有する水を拒絶した。
【００８３】
パミドロネートおよびゾレドロネートとの二元複合体ならびにＩＰＰおよびゾレドロネートとの三元複合体の構造は最初にアポ構造の剛体精密化を使用し、次いで上記定義のとおりの同じ手順を使用し完全に精密化し決定した。
【００８４】
すべての結晶学的モデルに対する最後の精密化統計値を表２に示す。
【００８５】
８．ｈＦＰＰＳの全体的な三次元構造
鳥類のＦＰＰＳのような、ヒトＦＰＰＳは２つの同じ活性部位を有するホモ二量体である。結晶において、２つのサブユニットは結晶学的に２回対称である。各サブユニットは１０個が核ヘリックス束を形成する１３個のαヘリックスからなる１つのドメインとして折りたたまれている。以下、我々は鳥類のＦＰＰＳに対して最初に提案された名称を採用し（Tarshis et al.,1994, Biochemistry; 33:10871-10877）、それによって、核束の１０個のヘリックスをＡからＪと名付け、ヘリックスＨからＩを当てはめた３個の短いヘリックスをα−１からα−３と名付ける。１０個の核ヘリックスを束ねることで、３層構造、ヘリックスＡおよびＢで第１の層を形成し、ヘリックスＣ、Ｄ、ＥおよびＪで第２の層を形成し、ヘリックスＦ、Ｇ、ＨおよびＩで第３の層を形成することが記載されている（上記Tarshis et al）。ヘリックスＧは、２つのねじれ、高度に保存されているＬｙｓ２００−Ｔｈｒ２０１配列で起こる第１のねじれ、Ｐｒｏ２０９の周りの第２のねじれを示す。
【００８６】
２個の保存されているＤＤＸＸＤモチーフはヘリックスＤおよびＨのＣ末端に位置する。２個のヘリックスは、ヘリックスＣ、Ｆ、ＧおよびＪと一緒にとても深い壁および大きなＦＰＰＳ活性部位を形成する。ヘリックスＢおよびＣ（“Ｂ−Ｃループ”）、ＤおよびＥ（“Ｄ−Ｅループ”）ならびにＨおよびＩ（“Ｈ−Ｉループ”）を接続している３個の顕著なループは酵素活性部位の入口に並んでいる。これらの３個のループは保存されているグリシン、リシンおよびアルギニン残基：Ｂ−Ｃループ／Ｃヘリックス中のＧｌｙ５６、Ｌｙｓ５７およびＡｒｇ６０、Ｄ−Ｅループ中のＡｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３およびＧｌｙ１１４、Ｈ−Ｉループ中のＧｌｙ２５６、Ｌｙｓ２５７およびＬｙｓ２６６を隠す。他の高度に保存されている残基はＦＰＰＳ活性部位の周りのプレニル合成酵素クラスターの中に位置する。
【００８７】
二量体の中間面は主に、すべての他のαヘリックスにほぼ直交する（図１）、最初の２つのＮ末端αヘリックス（ＡおよびＢ）により提供される、さらなるサブユニット相互作用を有するヘリックスＤおよびＥからなる。
【００８８】
９．ｈＦＰＰＳの閉構造（“アポ閉形”）
精製法１にしたがって製造されるヒトＦＰＰＳ結晶は、すべて結晶形Ｉ（閉構造）の典型であった。構造の精密化中に、ヒト酵素は鳥類のＦＰＰＳと比較して、異なる構造状態であることが明らかとなり、それを閉状態と呼ぶ（図１）。さらに、酵素活性部位内において、残存する異なる電子密度が部分的にリン酸基を含むと解釈される内因性リガンドに対応することを観察した（図２）。このリガンドの電子密度は約１５０−２００Ｄａのリン酸化（または硫酸化）化合物と一致した。この発見は、分子量２００Ｄａを有する思いがけないリガンドの存在を示す、非変性状態下で行われる“非リガンド結合”のＦＰＰＳの質量分析により確認した（Bitsch et al., Anal. Biochem. 373 (2000) 231-241）。
【００８９】
３つの保存されている塩基性側鎖はリガンド：Ｂ−Ｃループ／Ｃ−ヘリックスのＬｙｓ５７およびＡｒｇ６０ならびにＤ−ＥループのＡｒｇ１１３と相互作用した。その後、同じ残存する電子密度がまたパミドロネートまたはゾレドロネートとの二元複合体の結晶中に存在し、このリガンドはゾレドロネートとＩＰＰとの三元複合体のＩＰＰに置換されることを発見した。構造の重ね合わせは、残存する異なる電子密度がほぼＩＰＰの二リン酸基の大きさでありその結合部位を占めることを示した。
【００９０】
１０．開構造のｈＦＰＰＳ（“アポ開形”）
真にリガンド結合していないヒトＦＰＰＳの三次元構造を決定するために、酵素の第２のバッチを製造し、さらなるクロマトグラフおよび透析段階を使用して徹底的に精製した。得られた結晶は非対称単位あたり再び一つのＦＰＰＳサブユニットを有する同じ正方空間群であるが、ｃ軸の長さにおいて１０Åの増加を示した（結晶形ＩＩ）（開構造）。構造を探索モデルとして鳥類のＦＰＰＳを再び使用して分子置換により決定した。
【００９１】
Ｘ線分析は上記内因性リガンドが新規精製プロトコールによりうまく取り除かれることを確認した。それにもかかわらず、結晶化母液由来の明確なリン酸イオンが、以前はリガンドの推定されているリン酸基により占有されていた部位を占める。より重要なことに、鳥類のＦＰＰＳで当初に観察されたのと同様に、酵素が開構造を採用することを見いだした。ヒトＦＰＰＳの開構造および閉構造をすべてのＣα原子を使用して重ね合わせるとき、１．７Åの根平均二乗変位を得る。しかし、まず１５０のＮ末端Ｃα原子のみを使用して２つの構造を重ね合わせるとき、２つの構造状態間の構造の差が示された。
【００９２】
１１．パミドロネートおよびＭｎ２＋とのｈＦＰＰＳ複合体
１１ａ．金属結合部位
ＦＰＰＳにより触媒される酵素反応はＭｇ２＋またはＭｎ２＋のいずれかの存在が必要である。金属部位の数および位置を決定するために、ヒトＦＰＰＳをＭｎＣｌ２およびパミドロネートの存在下で結晶化した。Ｘ線試験において、Ｍｎ２＋イオン（２３個の電子）はＭｇ２＋（１０個の電子）よりも強いシグナルを与え、したがって金属結合部位の明確な同定を中程度の解像度でさえ可能にする。ｈＦＰＰＳ／パミドロネート／ＭｎＣｌ２データははっきりとＦＰＰＳ活性部位の空洞内に３個のＭｎ２＋陽イオンが存在することを立証した。３個の金属イオンは阻害剤のビスホスホネート単位および２つの保存されているＤＤＸＸＤ配列モチーフからの３個のアスパラギン酸側鎖：Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７およびＡｓｐ２４３により配位結合されている。３．３Åだけ離れて位置する２個のＭｎ２＋イオンは架橋リガンドとして作用するＡｓｐ１０３のカルボキシレート基および両方の金属イオンが配位結合しているＡｓｐ１０７のＯδ２を有する第１のＤＤＸＸＤモチーフ（ヘリックスＤ）に結合している。第３のＭｎ２＋イオンはＡｓｐ２４３のＯδ２を介して第２のＤＤＸＸＤモチーフ（ヘリックスＨ）に結合しており、他の２個の金属部位から各々４．９Åおよび６．２Å離れている。すべてのカルボキシレート酸素原子は、Ａｓｐ１０７のＯδ２を除いて共通して観察されるｓｙｎ配置を有する金属中心と配位結合しており、これをｓｙｎおよびａｎｔｉ配位構造両方で使用する。
【００９３】
１１ｂ．ｈＦＰＰＳへのパミドロネートの結合
さらに、Ｘ線分析はＮ含有ビスホスホネート阻害剤、例えばパミドロネートがＦＰＰＳのアリル基質部位に結合し、そして以前のモデルと逆に、三核金属中心を介してＤＤＸＸＤモチーフ両方と相互作用することを立証する。パミドロネートの側鎖アミノ基は明確な電子密度を有しておらず、この置換基が酵素活性部位と強い相互作用を作らないかまたは複合体において１つ以上の配置を有することを示す。それにもかかわらず、Ｔｙｒ２０４のフェノールヒドロキシル部分はパミドロネート一級アミノ基と水素結合相互作用を形成するために適当な位置である（図５）。加えて、３つの塩基性側鎖：Ｌｙｓ２００、Ａｒｇ１１２およびＬｙｓ２５７がパミドロネートのビスホスホネート単位との直接塩橋相互作用に関与する。注意する点は、Ｌｙｓ２５７は可動性のＨ−Ｉループの一部である。したがって、パミドロネート結合はＤＤＸＸＤモチーフとＨ−ＩループのＬｙｓ２５７両方での相互作用によりＦＰＰＳの閉構造を安定にする。さらに、この複合体において、ＩＰＰ結合部位は“アポ”ＦＰＰＳの閉形においてすでに観察されたリガンドにより占有される。この内因性リガンドの存在がさらに酵素の閉状態を安定にする。
【００９４】
１２．ゾレドロネートおよびＭｇ２＋とのｈＦＰＰＳ複合体
パミドロネートに対してゾレドロネートの高い阻害剤有効性の分子基盤を解明するために、ゾレドロネートとのＦＰＰＳ複合体をＭｇＣｌ２の存在下で共結晶化し、構造を２．２０Å解像度で決定した。酵素は再び上記リガンドにより占有されるＩＰＰ結合部位を有する閉構造を採用することが見いだされた。パミドロネート複合体においてマンガンイオンの位置と合う３つのＭｇ２＋部位を観察した。さらに、より良い解像度のｈＦＰＰＳ／ゾレドロネート／ＭｇＣｌ２データは３個のマグネシウムイオンの配位圏の詳細を示し、これらすべてはほぼ８面体配列の６個の配位リガンドを有した。さらに、電子密度は、イミダゾリウム環を含むゾレドロネート原子すべてに関して明確であった。プロトン化環窒素はヘリックスＧの第１のねじれに位置する２つの保存されているアミノ酸残基であるＬｙｓ２００の主鎖のカルボニル酸素とＴｈｒ２０１の側鎖のヒドロキシルの水素結合距離以内である。ビスホスホネート炭素原子のヒドロキシル置換基はＧｌｎ２４０のＯε１への水介在Ｈ結合、ならびにＡｓｐ２４３のＯδ２への直接極性接触を作るが、後者の相互作用の配置は良い水素結合のためにはあまり有望ではないように見える。
【００９５】
パミドロネートと比較して、ゾレドロネートの高い結合親和性はイミダゾール環の増加した剛性およびバルキネスおよび上記の極性相互作用に基づいているようである。さらに、窒素含有ビスホスホネートが酵素反応中に形成されると推定されているカルボカチオン中間体を模倣している遷移状態類似体として作用することが提案されている。したがって、ゾレドロネートの増加した有効性はまた、そのｓｐ２混成イミダゾリウム環がパミドロネートの一級アンモニウム基よりも良好な遷移状態模倣物であり、酵素活性部位の後方により位置するという事実に基づいている。
【００９６】
１３．ＩＰＰ、ゾレドロネートおよびＭｇ２＋とのｈＦＰＰＳ複合体
良質の完全回折データセット（Ｒｍｅｒｇｅ＝０．０７２）をＭｇ２＋、ＩＰＰおよびゾレドロネートとのｈＦＰＰＳの三元複合体について２．６Åまで回収した。良い密度差が基質および阻害剤両方に対して観察された（図１５）。このデータは内因性リガンドによりあらかじめ占有されたポケットへのＩＰＰ結合部位の配置を十分に確認し、ＩＰＰ結合相互作用の詳細を明らかにした。いくつかの保存されている塩基性残基（Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０およびＡｒｇ１１３）がＩＰＰ基質への直接相互作用を作り、３つの他の残基（Ａｒｇ１１２、Ｌｙｓ２５７およびＡｒｇ３５１）がＩＰＰの二リン酸単位の５．０Å以内にそれらの正電荷基を有する。注意する点は、これらの残基のいくつかは（Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｌｙｓ２５７およびＡｒｇ３５１）、ＦＰＰＳの構造スイッチによる影響を受ける二次的構造要素（Ｈヘリックス、Ｈ−ＩループおよびＣ末端尾部）の一部である。それゆえ、ＩＰＰ結合は酵素の閉形の安定性に寄与している。ＩＰＰの炭化水素部分は保存されているＰｈｅ２３９とゾレドロネートのイミダゾール環を結合している（図１６）。ゾレドロネート／Ｍｇ２＋三核クラスターの結合は上記リガンドを有する以前の構造と比較してＩＰＰ三元複合体内で変化していない。イミダゾリウム環の置換窒素原子が遷移状態のアリルカルボカチオンを模倣しているため、ＩＰＰの観察される結合はＦＰＰＳ縮合反応の確立している立体化学と一致する：ＩＰＰ二重結合のｓｉ面はアリル基質のＣ１’炭素原子との縮合反応と均衡のとれた状態にある。ＩＰＰのＣ４原子とゾレドロネートのイミダゾリウム環の置換窒素との観察される距離は３．８Åである。
【００９７】
１４．鳥類のＦＰＰＳとの比較
ヒトおよび鳥類のＦＰＰＳの結晶学的データの比較は、ヒトおよび鳥類のＦＰＰＳが６９％配列同一性であることを示す。期待どおり、両方の酵素は同じ三次元の折りたたみを示す。また、サブユニットの二量体の中間面および相対的配置が保存されている。しかし、構造比較は、鳥類のＦＰＰＳが開構造のみにで観察されることを示した。ヒトＦＰＰＳの開形は公開されている鳥類の構造と重ね合わせることができ、３３４の構造的に同等のＣα原子に対して約０．９５Åの根平均二乗変位を有する。鳥類のＦＰＰＳのＨ−Ｉループの構造はヒト酵素で観察される構造と異なる。また、鳥類のＦＰＰＳのカルボキシ末端残基は、酵素活性部位から離れて位置する異なる構造をとる。
【００９８】
アリル基質を有する複合体の鳥類のＦＰＰＳでの結晶学的試験が、２つのみのマグネシウム結合部位が存在することを示し、二リン酸分子がヘリックスＤに位置する第１のＤＤＸＸＤモチーフと相互作用することを示した（Tarshis, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93 (1996) 15018-15023）。これらの結果に基づいて、イソペンテニル二リン酸がヘリックスＨのＣ末端の最後に位置する第２のＤＤＸＸＤモチーフに結合するであろうことが提案された。際立った対照として、我々の結果はパミドロネートおよびゾレドロネートが３個の二価の陽イオンと一緒にＤＤＸＸＤモチーフに結合すること、ＩＰＰがＢ−Ｃ、Ｄ−ＥおよびＨ−Ｊループが配置されている塩基性部位中に結合していることを示す。
【００９９】
ここに存在するヒトＦＰＰＳのＸ線分析はこの重要な薬剤標的の開構造および閉構造両方の三次元構造を最初に提供し、ＦＰＰＳの基質、例えばＩＰＰならびにＦＰＰＳの阻害剤、例えば窒素含有ビスホスホネートクラスの２つの重要な市販薬剤であるパミドロネートおよびゾレドロネートの結合部位を示す。新規データは、ＩＰＰとビスホスホネート結合の以前の概念を明確にし、そして正し、ならびに金属中心の数および位置を明らかにする。
【０１００】
ＦＰＰＳの構造転換は最後の１３０カルボキシ末端残基の剛体運動、動的（無秩序な）立体配座の状態から閉形の秩序な、明確な立体配座への同時変化を有するＨ−Ｉループおよび最後３個のカルボキシ末端残基の変化を含む。第１の基質（ＤＭＡＰＰまたはＧＰＰ）が結合するまでＩＰＰ結合部位は形成しないため、このような構造スイッチは秩序立てられた反応メカニズムを指示する。また、酵素反応中に製造されるカルボニウムは閉じた酵素活性部位内で溶媒から保護される。基質結合に含まれる保存された塩基性残基が可動性ループ中に見いだされた。
【０１０１】
鳥類のＦＰＰＳ結晶構造に基づいて、ＩＰＰ結合はＮ末端ＤＤＸＸＤモチーフを含むと考えられ、これは結合がＭｇ依存ではないという観察と一致しなかった。ここで提示する構造は、ＩＰＰの二リン酸基が２つのＤＤＸＸＤモチーフのいずれかと相互作用しないことを示し、なぜＩＰＰ結合がＭｇ２＋を必要としないかの説明となる。
【０１０２】
我々のデータはパミドロネートおよびゾレドロネートがピロリン酸アリル類似体として作用することを示し、アレドロネート、他の窒素含有ビスホスホネート化合物によるＦＰＰＳ阻害がＩＰＰではなくアリル基質に対して拮抗的であるという観察に完全に一致する。さらに、ゾレドロネートとのＦＰＰＳ複合体の三次元構造は有効な構造活性データをうまく説明する。
【０１０３】
表１ Ｘ線データ収集統計値
【表１】
【０１０４】
表１ｂ：データ収集統計値：イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体：
【表２】
【０１０５】
表２ 精密化統計値
【表３】
【表４】
【０１０６】
表２ｂ：イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体の精密化統計値
【表５】
【０１０７】
１５．ＮＭＲ分光学
上記Ｘ線結晶学的結果はＮＭＲ分光学により完成させ、確認した。ＦＰＰＳはその高分子量８０ｋＤａのためＮＭＲ分析に対して難題を示す。事実、１５Ｎ−標識（非重水素化）ＦＰＰＳでの１５Ｎ，１Ｈ−ＨＳＱＣまたはＴＲＯＳＹスペクトルは本質的に非常に幅広のため説明できない。重水素化により、しかし、１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹスペクトルは適当な質であり個々の共鳴の分析を可能とする。
【０１０８】
１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹスペクトルはタンパク質の識別スペクトルとして見なすことができる。特異的ピークパターンをもたらす化学シフトはタンパク質構造ならびにリガンド結合により影響される。タンパク質の重要な構造変化を引き起こさずにリガンドが結合するとき、いくつかの共鳴のみが化学シフト、すなわちリガンドの直接近辺における化学シフトを変化させる。しかし、リガンド結合が大きな構造変化を起こすとき、多くのタンパク質の共鳴が化学シフト変化を起こし、識別ＴＲＯＳＹスペクトルは有意な差を表す。
【０１０９】
リガンドの結合部位のマッピングは通常リガンドあり、およびなしでのＮＭＲスペクトルを記録し、リガンド結合により影響されるこれらの共鳴を同定することで行う。これは分析前にタンパク質共鳴の割り当てを必要とする。共鳴の割り当ては小さいタンパク質に対しては容易であるが、ＦＰＰＳに対しては挑戦である。本発明にしたがって、選択される共鳴は、既知の結合部位を有する既知のリガンドによるそれらの摂動に基づいて、および（反磁性の）Ｍｇ２＋の（常磁性の）Ｍｎ２＋との置換により影響される常磁性緩和の増大を利用することにより間接的な方法で得られた。この手段でそれぞれの結合部位に対するプローブを同定することができる。
【０１１０】
パミドロネートおよびＭｇ２＋の添加により、１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹスペクトルは有意に変化する。事実、ほとんどすべての非重複共鳴は化学シフト変化する（図１０）。これは強く、パミドロネートの結合のＦＰＰＳ内で生じる大きな構造変化を示唆する。これはＸ線結晶学により観察されるアポＦＰＰＳの開構造とパミドロネート結合ＦＰＰＳの閉構造の変化に対応する。パミドロネートなしのＭｇ２＋だけの添加はＦＰＰＳのほんのわずかな化学シフト変化しか起こさず、ビスホスホネートの非存在下においてＦＰＰＳへのＭｇ２＋の結合が弱く、著しい構造変化をもたらさないことを示す。
【０１１１】
ゾレドロネートはパミドロネートよりＦＰＰＳにより強く結合し、したがってそれはビスホスホネート結合ポケットからパミドロネートを除くはずである。当モル濃度のゾレドロネートをパミドロネート／Ｍｇ２＋との複合体のＦＰＰＳのサンプルに添加した。さらに、より小さいが、化学シフト変化を観察した（図１１）。これらの化学シフト変化はパミドロネートがゾレドロネートにより置換されるためである。リガンドを交換すると、すでに閉状態であるためＦＰＰＳ構造は著しく変化しない。したがって、少しの化学シフト変化は直接に異なるビスホスホネート側鎖による部分的な摂動による：ゾレドロネートによるパミドロネート置換における化学シフト変化をする共鳴はゾレドロネート側鎖にとても近い位置である。したがって図１１において丸で囲むこれらの変化する共鳴は、ゾレドロネート側鎖結合部位のための標識である。
【０１１２】
ＩＰＰはゾレドロネート結合部位の外側に結合するＦＰＰＳ基質であり、ゾレドロネートの存在下でさえＦＰＰＳに結合する。ＩＰＰ結合部位の近くの共鳴はＦＰＰＳ／ゾレドロネート／Ｍｇ２＋サンプルへのＩＰＰの添加によりマッピングされた。再び、いくつかの共鳴のみが化学シフトを変化させ、ＦＰＰＳの大きな構造変化の欠如と一致する。再び、これらの共鳴はＩＰＰ結合部位近くの残基に属し、ＩＰＰ結合部位内に結合するプローブのための標識として使用することができる（図１２）。
【０１１３】
Ｍｇ２＋結合部位から個々の共鳴の距離は（反磁性の）Ｍｇ２＋の（常磁性の）Ｍｎ２＋による置換により探求することができる。スピン標識のような常磁性の金属は近くの核に距離依存緩和増大効果を発揮する。したがってＭｎ２＋による影響を受けないいくつかの残基は常磁性中心から少なくとも２ｎｍ離れており、一方Ｍｎ２＋による影響を強く受ける残基は金属イオンから１．０−１．５ｎｍの距離内である。図１３はＭｇ２＋またはＭｎ２＋によりライゲートされているときのＦＰＰＳ／ゾレドロネートの１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１１４】
ＮＭＲ試験で、Ｘ線結晶学により観察される“開”構造から“閉”構造変化に対応する大きな立体配座の転換がＦＰＰＳへのビスホスホネート結合後に起こることを確認した。さらに、共鳴がゾレドロネート側鎖結合部位およびＩＰＰ結合部位に特異的である共鳴が同定された。Ｘ線構造が解析できないときでさえフラグメントに対して結合部位のマッピングができるため、これはフラグメントベースリガンド設計による非ビスホスホネートＦＰＰＳ阻害剤の発見のための有用な情報である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ヒトＦＰＰＳホモ二量体（閉構造）の全体的な構造
【図２】ヒトＦＰＰＳの活性部位断面内、未知の内因性リガンドの存在を示す残りの電子密度（３σトレース）。電子密度は部分的にリン酸基と解釈され、球および棒表示（立体図）において示された。
【図３】ヒトＦＰＰＳの閉状態（マゼンタ色のＣαトレース）および開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の重ね合わせ。最初の１５０アミノ−末端残基（ｒｍｓｄ＝０．３４Å）を使用して、２つの構造を重ね合わせた。重ね合わせは最後の１３０Ｃ末端残基のみが実は構造スイッチ、顕著にＨ−ＩループおよびＨ、α−１、α−２、α−３、ＩおよびＪヘリックスにより影響されることを示し、一方、最初の２２０残基はｒｍｓｄ０．４４Åのみを示す。
【図４】ヒトＦＰＰＳ（マゼンタ色のＣαトレース）の開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の上に閉構造を重ね合わせたクローズアップ図。ＨヘリックスおよびＨ−Ｉループの大きな変化が、顕著に残基Ｆ２３９、Ｑ２４０、Ｄ２４３、Ｄ２４７、Ｇ２５６、Ｋ２５７およびＫ２６６の位置に影響することを示す。
【図５】Ｍｎ２＋およびパミドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。パミドロネートは透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
【図６】３つのＭｇ２＋イオンの配位圏（２つの異なる配置）。シアンブルー色の球は明確な水分子を示す。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）のヒドロキシル基を含む極性相互作用は波線で示される。
【図７】Ｍｇ２＋およびＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）とのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
【図８】リガンド、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）およびイソペンテニル二リン酸を結合している電子密度（σＡ−加重、（Ｆｏ−Ｆｃ、φｃａｌｃ）結合、電子密度図、４．０σ輪郭を除く）。緑色の球はＭｇ２＋陽イオンの位置を示し、シアンブルー色の球はマグネシウムイオンの配位圏に属する水分子の位置を示す。
【図９】イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびヒトＦＰＰＳにおけるその結合部位との結合相互作用のクローズアップ図。可能な水素結合はオングストロームの長さを示す薄い黒色の線により示される。ＩＰＰはそのファンデルワールス力表面と一緒に球および棒表示で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は球および棒で示される。シアンブルー色の球は水分子を示し、緑色の球はマグネシウムイオンを示し、そしてマゼンタ色の球は暫定的にナトリウムイオンの残りの密度の位置であるとみなす。
【図１０】ＦＰＰＳホモ二量体（８０ｋＤａ）：非リガンド結合ＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ；黒いスペクトル）およびパミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
【図１１】パミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。パミドロネートをＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）により置き換えることにより摂動したいくつかの共鳴は赤い円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
【図１２】ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）およびＩＰＰの添加後（４００μＭ；緑色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。ＩＰＰ添加により摂動したいくつかの共鳴は緑色の円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
【図１３】ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：８００μＭ；黒いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｎ２＋へ複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｎ２＋濃度：４００μＭ；オレンジ色のスペクトル）の８００ＭＨｚの１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
【図１４】閉形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１５】開形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１６】パミドロネートおよびＭｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１７】ゾレドロネート、ＩＰＰおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１８】ゾレドロネートおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１９】Ｚｎ２＋およびイバンドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。あり得る極性／静電相互作用は薄い黒い線により示される。イバンドロネートは球および棒表示で示される。三級窒素の反転から創作するイバンドロネートの２つの別の構造をモデル化し、精密化した。三核Ｚｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒に灰色の球として示される。
【図２０】イバンドロネートおよびＺｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）、遊離ＦＰＰＳの三次元構造ならびにリガンド、例えばＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸）とのおよび／または阻害剤、例えばＺｏｍｅｔａ（登録商標）またはＡｒｅｄｉａ（登録商標）との複合体のＦＰＰＳの三次元構造に関する。さらに、ヒトＦＰＰＳの結晶を製造するための方法を記載する。本発明にしたがって、結晶は未知の構造のＦＰＰＳホモログ、変異体、リガンドとの複合体、ＦＰＰＳ結晶形および類似する分子の構造を決定するために使用できる。本発明はさらに例えばＸ線スクリーニングによる新規ＦＰＰＳリガンドを選択するため、およびＦＰＰＳに対する阻害剤を設計および／または同定するためのＦＰＰＳ結晶の使用に関する。さらに、本発明は新規治療剤に作り上げられ得るＦＰＰＳへの新規低分子量の結合剤を選択および／または同定するためのＮＭＲ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メバロン酸／イソプレン経路のホモ二量体酵素であるファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ、Ｅ．Ｃ．２．５．１．１０）は、ステロイド、ユビキノン、ドリコール、ヘムａ、およびプレニル化タンパク質の生合成のための前駆体であるファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の二段階合成を触媒する。ＦＰＰＳ反応はＭｇ２＋依存であり、ホモアリル二リン酸、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とアリル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）またはゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）間の“頭尾”縮合を含む。該反応はアリル型カルボニウムの形成を介して進行し、そしてアリル基質からピロリン酸（ＰＰｉ）の共放出を有する基質の次の高級同族体の形成に至る。
【０００３】
初期の生化学試験は、ＦＰＰＳが二価の金属イオン（Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）を必要とするアリル基質の結合で明瞭なアリルおよびホモアリル結合部位を有することを示した。反応は最初にアリル基質が酵素に結合することを有する定序メカニズムで起こる。さらに、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの縮合により形成されるＥ−ＧＰＰ−ＰＰｉ複合体は、ＦＰＰを製造するためにピロリン酸の解離およびＧＰＰの転移、次にＩＰＰとの第２の縮合反応をするために構造変化しなければならない。
【０００４】
鳥類のＦＰＰＳの結晶解析はＦＰＰＳの折りたたみを示し、そしてアリル基質結合についての情報を提供した。しかし、ＩＰＰ結合部位の位置および触媒サイクルをなす分子メカニズムはこれまでにしっかりと確立してはいない。最近、ＩＰＰおよび基質類似体またはビスホスホネートと複合した大腸菌ＦＰＰＳの構造が発表された(Hosfield et al., 2004, J Biol Chem, 279: 8526-8529)。大腸菌ＦＰＰＳの小さいサイズおよび低配列同一性のため、これらの結果がヒトＦＰＰＳにどこまで利用できるかはっきりしない。
【０００５】
ＦＰＰＳは最近、窒素含有ビスホスホネート剤、例えばＡｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート、ＣＧＰ０２３３３９Ａ）およびＺｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロネート、ＣＧＰ０４２４４６）の分子標的であることが示された。ビスホスホネートが破骨細胞による骨吸収を阻害する薬剤の非常に有効な種類であることは既知であり、したがって異常に増加した骨代謝回転、例えば骨粗鬆症、パジェット病、高カルシウム血症および骨転移が関与する状態の処置のために使用されている。したがって、現在ＦＰＰＳは重要な薬剤標的として認識されている。新規ＦＰＰＳ阻害剤は、上昇したコレステロール濃度の処置のために、骨疾患の処置だけでなく腫瘍学的にも治療的有効性を有し、抗感染薬として治療的有効性を有することが予期される。その医薬的関連性にもかかわらず、ヒトＦＰＰＳの構造情報はまだ欠乏している。阻害剤結合の構造モデルは利用できる鳥類のＦＰＰＳの結晶学的情報に大きく依存している。
【０００６】
構造に基づく方法、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法ならびにハイスループットスクリーニング技術を使用してヒトＦＰＰＳの阻害剤を選択および最適化し得るために、ヒトＦＰＰＳの三次元構造を決定することが必要である。本発明によって、この要求は結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）の提供により満たされる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、構造試験のための組み換えヒトＦＰＰＳの製造ならびにこの酵素の先頭を行く発見ならびに最初のＸ線分析を記載する。
【０００８】
本発明にしたがって、得られた結果が鳥類のＦＰＰＳで得られた以前の結果との相違があることを見いだした。したがって、本明細書で提供される結晶構造データは、この重要な薬剤標的の新規阻害剤の開発への新規構造情報を構成する。
【０００９】
本発明にしたがって、例えば大腸菌において発現され得るヒトＦＰＰＳ（ｈＦＰＰＳ）が均一に精製され、結晶化することができる。次いで、結晶の三次元構造をＸ線結晶学により決定できる。非リガンド結合状態の、およびリガンド、例えば基質、阻害剤および／または金属イオンと複合した両方のｈＦＰＰＳの結晶を得ることができる。特定の態様において、ｈＦＰＰＳの結晶はパミドロネート／Ｍｎ２＋、ゾレドロネート／Ｍｇ２＋およびイソペンテニル二リン酸／ゾレドロネート／Ｍｇ２＋との複合体である。
【００１０】
特定の態様において、結晶性ｈＦＰＰＳは開構造で、他の特定の態様において閉構造で存在する。開構造から閉構造への変化は主に、最後の１３０カルボキシ末端残基の剛体運動に付随する、活性部位を裏打ちする（lining）１つのループの大きな変化を含み、これは酵素の活性部位における２つの保存されたＤＤＸＸＤモチーフをお互いに近づける。
【００１１】
本発明にしたがって、さらに窒素含有ビスホスホネート阻害剤はアリル基質部位に結合し、三核金属中心を介して保存されたＤＤＸＸＤ配列モチーフ両方と相互作用することを見いだした。
【００１２】
本発明は、特に少なくとも１０μｍ、または、好ましくは少なくとも５０μｍ、または、好ましくは少なくとも１００μｍの辺の長さを有する単結晶形、特に大きな単結晶形である結晶性ヒトＦＰＰＳに関する。
【００１３】
本発明の結晶は、好ましくは空間群Ｐ４１２１２に属する。開構造である本発明の結晶（本明細書に結晶形ＩＩとしても記載されている）は、好ましくはａ＝ｂ＝１１１ű２０Å、ｃ＝７７ű２０Å、またはより好ましくは、ａ＝ｂ＝１１１ű１０Åおよびｃ＝７７ű１０Åの格子定数を有する。
【００１４】
閉構造である本発明の結晶（本明細書に結晶形Ｉとしても記載されている）は、好ましくはａ＝ｂ＝１１２ű２０Åおよびｃ＝６６ű２０Å、ならびにより好ましくは、ａ＝ｂ＝１１２ű１０Åおよびｃ＝６６ű１０Åの格子定数を有する。
【００１５】
本明細書に記載の精製方法の手段により、特に＜１０Å、より好ましくは＜５Å、さらにより好ましくは＜３Å、およびもっとも好ましくは＜２．６ÅのＸ線結晶学の解像度が達成できるこのような高純度の結晶を提供することを可能にする。
【００１６】
さらに、ｈＦＰＰＳ／リガンド複合体の構造決定はｈＦＰＰＳ結合部位を同定および決定でき、そしてそこからｈＦＰＰＳリガンド、特に阻害剤を決定できる。
【００１７】
本明細書で使用される“ヒトＦＰＰＳ”なる用語は、ファルネシル二リン酸合成酵素活性（FPPS, E.C. 2.5.1.10）を有する全てのヒト酵素に関する。特定の態様において、ヒトＦＰＰＳはＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４に合うアミノ酸配列、またはその配列の機能的フラグメントによりコードされている。好ましい態様において、最適アラインメントで行うとき、この配列の機能的フラグメントはＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のヒトＦＰＰＳの対応するフラグメント配列と少なくとも８０％の同一性、より好ましくは９０％、そしてさらにより好ましくは９５％の同一性を共有する。比較領域を決定するための配列の最適アラインメントはSmith and Waterman J. Theor. Biol., 91 (2) pgs. 370-380 (1981)の局部的相同アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Miol. Biol., 48(3) pgs. 443-453 (1972)の相同アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, PNAS, USA, 85(5) pgs. 2444-2448 (1988)の方法を介するのと同様の探索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化インプリメンテーションにより（GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin）または検査により実施され得る。
【００１８】
様々な方法により生成される最適アラインメント(すなわち、比較領域にわたってもっとも高い同一性比率を得られる)は、同一性比率を測定するために選択される。
【００１９】
本発明で使用する、ヒトＦＰＰＳ変異体は、最適アラインメントで行うときＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のヒトＦＰＰＳの対応するフラグメント配列と少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％の同一性を共有するヒトＦＰＰＳのアミノ酸配列を有するヒトＦＰＰＳである。好ましくは、ｈＦＰＰＳの変異体はヒトＦＰＰＳの単一の変異体、より好ましくは、不完全なまたは非機能的変異体である。本発明の特定の態様において、ヒトＦＰＰＳ変異体は下記に定義のとおりの結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するヒトＦＰＰＳである。
【００２０】
本明細書で使用される“リガンド”なる用語は、ヒトＦＰＰＳの１個またはそれ以上の特定の部位に、好ましくはヒトＦＰＰＳの結合ポケットに、もっとも好ましくはヒトＦＰＰＳの３個の特定の結合部位の１個に結合する分子または分子の群を意味する。本発明のリガンドは好ましくは低分子量分子である。
【００２１】
本明細書で使用される“低分子量化合物”なる用語は、好ましくは一般に分子量約１０００ダルトン未満、より好ましくは約６００ダルトン未満を有する有機化合物を意味する。もっとも好ましくは、該低分子量化合物またはリガンドはヒトＦＰＰＳ活性を阻害する。
【００２２】
本明細書で使用される“結合ポケット”なる用語は、その形および物理化学的特徴の結果として、好都合には他の化学物質または化合物と関連して、ヒトＦＰＰＳの領域を意味する。好ましくは、それは発明により同定される下記の３個の結合部位からなる結合ポケットを意味する：
【００２３】
１）少なくとも下記のアミノ酸Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０、Ｇｌｎ９６、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０およびＡｓｐ２４３が配置されている（lined by）、ホモアリル基質（ＩＰＰ）の結合部位、
２）アリル基質（ＤＭＡＰＰまたはＧＰＰ）およびビスホスホネートベース阻害剤の結合部位。この結合部位はＤＤＸＸＤモチーフ両方を含む三核金属中心が特徴である；それは少なくとも下記のアミノ酸：Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７、ならびに特に下記のアミノ酸：Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７が配置されている；
３）以下“新規結合部位”と記載し、少なくとも下記のアミノ酸：Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８が配置されている本発明において同定された新規結合部位。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、残基の番号付けはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録Ｐ１４３２４と同意である。
【００２５】
特に、ＩＰＰ／ゾレドロネート／Ｍｇ２＋／ｈＦＰＰＳ複合体の構造決定により、ホモアリル基質結合部位、すなわちＩＰＰ結合部位の位置が達成され、ＩＰＰ認識に関与する保存された残基が特定された。さらに、ビスホスホネート阻害剤ゾレドロネートは三核金属中心を介してアリル基質部位に結合することを見いだした。
【００２６】
本発明にしたがって、新規リガンド、特にヒトＦＰＰＳに対する新規阻害剤を選択および／または設計するために結合ポケットに関する情報を使用することが好ましく、それによってここでリガンドは、好ましくはＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する。より具体的に、それはＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する。より好ましくは、本発明において同定されるヒトＦＰＰＳの新規結合部位に関する情報を使用することが好ましく、該新規結合部位は少なくとも下記のアミノ酸Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８含む。したがって、本発明の目的は、新規リガンド、とりわけＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される新規結合部位を含む１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する非ビスホスホネートリガンドの設計および／または同定のための手段を提供することである。
【００２７】
他の特定の態様において、本発明のｈＦＰＰＳ結晶はＦＰＰＳモノマーあたり３個の金属陽イオン、特にＭｇ２＋または／およびＭｎ２＋を含む。
【００２８】
本発明はさらに
（ｉ）組み換えヒトＦＰＰＳを大腸菌で発現させ（ここで該組み換えヒトＦＰＰＳはアミノ酸断片６から３５３を含む）、
（ｉｉ）発現したヒトＦＰＰＳを精製し、そして
（ｉｉｉ）精製ヒトＦＰＰＳを結晶化する
段階を含む、結晶性ヒトＦＰＰＳ生成物の製造法に関する。
【００２９】
好ましくは、組み換え発現はＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のものと合う配列からのアミノ酸残基６から３５３をコードするプラスミドを使用することにより達成する。
【００３０】
特定の態様において、段階（ｉｉ）の精製は陰イオン交換カラムおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介する精製を含む。
【００３１】
他の態様において、段階（ｉｉｉ）の結晶化は蒸気拡散、自由界面拡散、微小透析または油のもとでのマイクロバッチによる結晶化を含む。
【００３２】
より好ましくは、ヒトＦＰＰＳを製造するための方法は明細書の下記の精製法１にしたがって行う。
【００３３】
本発明はまた上記方法により得られる結晶性ヒトＦＰＰＳに関する。
【００３４】
したがって本発明は、図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義されるヒトＦＰＰＳの結晶構造、およびその類似する構造を提供する。
【００３５】
“選択された部分”は図１４、１５、１６、１７および／または１８で示される少なくとも１０個のアミノ酸、および好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の構造座標を意味する。好ましい態様において、選択された部分は上記定義のとおりの結合ポケットの３個の結合部位の少なくとも１個を形成するアミノ酸の構造座標に対応する。
【００３６】
“類似する構造”は図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標と比較するとき、本実施例において行われる結晶構造のＸ線の解像度の範囲内、好ましくは＜１０Å、より好ましくは＜５Å、さらにより好ましくは＜３Åおよびもっとも好ましくは＜２．６ÅのＸ線結晶学の解像度の範囲内で変化を有する構造座標を有するヒトＦＰＰＳの構造を意味する。
【００３７】
ヒトＦＰＰＳが２つの構造、すなわち閉構造ならびに開構造で存在することを見いだした。
【００３８】
実際、構造の微調整中に、驚くべきことに、ヒト酵素が、鳥類のＦＰＰＳと比較して異なる構造状態であることを見いだし、それを閉環状態と呼ぶ（図１）。２つの構造状態間の構造の重なりで、最後の１３０個のカルボキシ末端残基のみがヘリックスＨ、Ｉ、Ｊならびにα−１、α−２およびα−３の剛体移動での、構造スイッチにより影響されることを見いだした（図３）。この構造変化はヘリックスＨをヘリックスＤに近づけ、それによって２個のＤＤＸＸＤモチーフ間の距離を短くし、活性部位を閉じる。開構造において、Ａｓｐ１０３とＡｓｐ２４３のＯδ２原子間は１２Åであり、閉状態においてこの距離は１０Åに減少する。この剛体移動は、閉状態の活性部位上を締め付けるようにふたとして働くＨ−Ｉループの大きな変化に付随する（図９）。Ｈ−Ｉループの先端のＧｌｙ２５６のＣα原子の位置は６．７Å移動する。酵素活性部位を裏打ちし、基質の結合に関連するいくつかの保存された残基はまた、構造スイッチ、特にＰｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｌｅｕ１００、Ｌｙｓ２５７およびＬｙｓ２６６により影響される。さらに、いくつかの構造成分が閉構造においてより秩序正しくなる。これは、開状態においてあまり明確でない電子密度および高いＢファクターを有するＨ−Ｉループ、ならびに開状態において無秩序であるが閉状態において結合した基質と相互作用するＦＰＰＳの最後の３個のカルボキシ末端残基、Ａｒｇ３５１、Ａｒｇ３５２およびＬｙｓ３５３について当てはまる。しかし二量体の中間面は構造スイッチにより影響されない。２つのＦＰＰＳサブユニットは固定されているままであり、二量体の２つ折りの軸を中心とする堅い核を構成している、ヘリックスＡ、Ｂ、ＤおよびＥを介して相互作用する。
【００３９】
さらにヒトＦＰＰＳの構造を研究するため、特にＦＰＰＳ／リガンド相互作用についての興味のある情報を得るために、リガンド分子または／および阻害剤分子と複合したヒトＦＰＰＳを含む結晶を製造できる。
【００４０】
本発明により提供されるｈＦＰＰＳ結晶および結晶構造データ、各々は特にｈＦＰＰＳの結合部位の同定ならびに新規ＦＰＰＳリガンドの選択、設計、同定および／または提供のために使用できる。
【００４１】
特に結晶構造データから始め、リガンド分子は容易にコンピュータ利用モデリングプログラムを使用して得ることができる。この目的のため、例えば、最初にＦＰＰＳおよび結合部位、各々の三次元表現を結晶構造データ、三次元表現、例えば電子密度図、ワイヤーフレームモデル、鶏羽軸モデル、球および棒モデル、空間充填モデル、骨格モデル、リボンモデル、スネークモデル、矢印および円柱モデル、分子表面モデルまたはそれらの組合せの手段により生成する。適当なリガンドはそれらの三次元構造の手段により選択し、それによって、該構造はＦＰＰＳの相互作用部位に相補的であるべきである。この目的のため、例えば、ＦＰＰＳの三次元表現および可能なリガンド化合物の三次元表現を製造し、次いでそれを可能な化合物の三次元表現がＦＰＰＳの三次元表現の結合ポケットに合うかどうかを所望によりコンピュータを利用して試験する。この手順は特に合理的な薬剤設計に対して適当である。
【００４２】
本発明の１つの態様において、コンピュータベースの方法は
ａ）ヒトＦＰＰＳの構造座標にしたがってヒトＦＰＰＳの三次元表現を提供し、
ｂ）候補化合物の三次元表現を提供し、
ｃ）三次元表現がヒトＦＰＰＳの結合ポケットに相補的である候補化合物を選択し、そして、
ｄ）所望により溶解性、親和性、特異性および／または有効性のような物理学的特徴を最大化するために段階ｃ）で選択される該化合物を修飾する
段階を含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドの選択、設計および／または同定のための方法を提供する。
【００４３】
リガンドは、化合物データベースまたはライブラリーをスクリーニングし、ヒトＦＰＰＳの結合ポケットの結合部位に合う操作を行うためコンピュータ手段を使用して、選択できる。図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される表の構造座標のすべてまたは一部の本発明で提供される結合ポケットの三次元構造は、様々な結合プログラムと一緒に使用できる。
【００４４】
ヒトＦＰＰＳの化合物の可能な阻害剤または結合効果は、その実際の合成を行う前に、コンピュータモデリング技術の使用により試験することにより分析し得る。得られる化学物質の理論構造がそれとヒトＦＰＰＳ間の相互作用および結合が不十分であることを示すとき、化合物の合成および試験の必要性が回避される。しかし、コンピュータモデリングが強い相互作用を示したとき、次いで分子を合成し、ヒトＦＰＰＳへの結合する能力を試験し得る。したがって、効力のない化合物の高価で、時間のかかる合成を避け得る。
【００４５】
ヒトＦＰＰＳの阻害剤または他の結合化合物は、化合物のヒトＦＰＰＳの個々の結合部位と結合する能力をスクリーニングし、選択する一連の段階の手段により、コンピュータ的に評価および設計され得る。したがって、当業者は化合物のヒトＦＰＰＳと結合する能力をスクリーニングするためにいくつかの方法の１つを使用し得る。この工程は、例えばすべてまたは一部の構造座標に基づくコンピュータスクリーン上の結合部位の目視検査により始め得る。次いで、選択された化合物をヒトＦＰＰＳのポケット結合部位内に様々な配置で置くか、または“ドッキング”し得る。ドッキングはソフトウェア、例えばＱｕａｎｔａおよびＳＹＢＹＬ、次いで標準分子力学力場に関するエネルギー最小化および分子動力学、例えばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲを使用して成し遂げ得る。特殊コンピュータプログラムが興味のある化合物を選択するために使用され得る。これらのプログラムは、例えばOxford University, Oxford, UKから入手できるＧＲＩＤ；Molecular Simulations, Burlington, MAから入手できるＭＣＳＳまたはＣＡＴＡＬＹＳＴ；Scripps Research Institute, La Jolla, CAから入手できるＡＵＴＯＤＯＣＫ；University of California, San Francisco, CAから入手できるＤＯＣＫおよびUniversity College of London, UKから入手できるＸＳＩＴＥを含む。
【００４６】
好ましい態様において、ヒトＦＰＰＳの閉構造の構造座標は上記コンピュータベースの方法で使用し得る。
【００４７】
好ましくは、該化合物はＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するものの中から選択される。より具体的に、それはＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する。
【００４８】
別の好ましい態様において、該化合物は新規結合部位に合うリガンドの中から選択される。好ましくは、該化合物はＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するものの中から選択される。
【００４９】
別の好ましい態様において、物理学的特徴、例えば溶解性、親和性、特異性および／または有効性を最大化するために、段階ｃ）で選択される該化合物を修飾することによるリガンドを設計する方法を提供する。
【００５０】
設計された化合物は結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と物理学的に相互作用できるはずである。この結合は、例えば共有結合もしくは非共有結合またはファンデルワールス力、疎水性または静電相互作用のような化学的結合であり得る。第２に、該化合物は、ヒトＦＰＰＳ、好ましくはヒトＦＰＰＳの結合ポケットと結合できる構造を取ることができなければならない。必ずしも化合物のすべての部分がヒトＦＰＰＳとの結合に関与するわけではないが、それでもこれらの結合しない部分は分子の全体的な構造に影響し得る。このような構造必要条件は、結合部位のすべてまたは一部と結合する化学物質の全体的な三次元構造および配置を含む。
【００５１】
図１４、１５、１６、１７および／または１８で示される構造座標はとりわけ好ましくはコンピュータ可読データを有するデータ記憶媒体を含むコンピュータ可読記憶媒体に保存される。コンピュータ可読記憶媒体はコンピュータシステムの一部であり得る。
【００５２】
本発明はさらに
ａ．候補化合物とヒトＦＰＰＳを共結晶化またはインキュベートし、
ｂ．Ｘ線またはＮＭＲ法により候補化合物と相互作用するヒトＦＰＰＳのアミノ酸を決定し、
ｃ．段階ｂの結果に基づいて、Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群、特にＴｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する化合物を選択する
ことを含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドを選択するための方法に関する。
【００５３】
段階ｂ）を行うため、リガンドの結合部位のマッピングは、通常、候補化合物と共にまたは無しでＮＭＲスペクトルの記録すること、そしてリガンド結合により影響されるタンパク質の共鳴を同定することにより行う。これは、分析する前のタンパク質共鳴の割り当て、または既知の結合部位とリガンドとの結合により起こる化学シフト変化のパターンとの比較が必要である。あるいは、該リガンドと既知の結合部位を使用する競合的実験が同等の情報を生じ得る。
【００５４】
したがって、本発明はまたＦＰＰＳへの改良された結合剤、特に低分子量結合剤を選択するためのＮＭＲ法に関する。この方法は、好ましくは間接的方法において選択される共鳴の割り当てに基づく。特に、１つのリガンド、例えばパミドロネートの他のリガンド、例えばゾレドロネートへの置換により化学シフト変化を受ける共鳴は、第２のリガンドの位置に非常に近接して位置し得る。したがって、これらの化学シフト変化はリガンド結合部位を示す。このアプローチは常磁性の金属イオン、例えばＭｎ２＋の反磁性の金属イオン、例えばＭｇ２＋での置換による常磁性緩和の増大によりさらに助けられ得る。このような常磁性緩和の増大の影響を受けない残基は常磁性中心から＞２ｎｍ離れており、一方このような常磁性緩和の増大の影響を受ける残基は金属イオンから１．０から１．５ｎｍの距離である。
【００５５】
好ましい態様において、段階ａ）の前に、該候補化合物は上記本発明のコンピュータベースの方法にしたがって選択される。
【００５６】
別の特定の態様において、本発明の方法はさらに
ｄ．物理学的特徴、例えば溶解性、親和性、特異性および／または有効性を最大化するために段階ｃ）で得られる化合物の類似体を設計し、
ｅ．ヒトＦＰＰＳに結合できる新規化合物を選択するために対応する類似体で上記の方法の段階ａ．からｃ．を繰り返す
段階を含む。
【００５７】
本発明はさらに、フラグメント関連アプローチを使用して、ヒトＦＰＰＳの新規リガンドを設計するための方法を提供する。各結合部位に結合する化合物がまず選択される。
【００５８】
次いで、設計される新規化合物が２つの結合部位内に納まるように、リガンドを空間的な配置に基づいて一緒に結合させる。
【００５９】
本発明はヒトＦＰＰＳへのリガンドを設計する方法であって、該方法が
ａ）ヒトＦＰＰＳの第１の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第１のリガンドを提供し、
ｂ）ヒトＦＰＰＳの第２の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第２のリガンドを提供し、
ｃ）ヒトＦＰＰＳの第１のおよび第２の結合部位に結合するリガンドを設計するために、該第１のリガンドと該第２のリガンドを連結する
段階を含む方法。
【００６０】
特定の態様において、該方法は第３の結合部位の１つまたはそれ以上の残基に結合するリガンドを提供し、そして第１の、第２のおよび第３の結合部位に結合するリガンドを形成するために段階ｃ）で得られるリガンドに該第３のリガンドを連結する段階を含む。
【００６１】
好ましくは、段階ａ）での第１のリガンドがヒトＦＰＰＳの新規結合部位内に納まるリガンドの中から選択される。好ましくは、該第１のリガンドがＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される。
【００６２】
適当な連結基の選択は、有機化学の分野において既知の結合角および結合長の情報の原則に基づきお互いにおよびヒトＦＰＰＳへのリガンドの空間的な配置を維持することにより作られる。
【００６３】
より好ましくは、段階ｂ）での第２のリガンドはホモアリル基質（ＩＰＰ）の結合部位および／またはアリル基質（ＤＭＡＰＰまたはＧＰＰ）の結合部位内に納まるリガンドの中から選択される。例えば、段階ｂ）での第２のリガンドがＧｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０、Ｇｌｎ９６、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０およびＡｓｐ２４３および／またはＰｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７、特にＬｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される。
【００６４】
最後に、本発明はまた、本明細書で得られる情報を使用して得られるヒトＦＰＰＳに対するリガンドに関する。これらのリガンドは好ましくは、ヒトＦＰＰＳの阻害剤である。このようなリガンドは、好ましくは医薬組成物、特に腫瘍誘発高カルシウム血症、骨のパジェット病、溶骨型転移、閉経後骨粗鬆症、低コレステロール血症および／または軟組織癌の処置および／または予防するための医薬組成物に使用される。
【００６５】
図の説明
図１：ヒトＦＰＰＳホモ二量体（閉構造）の全体的な構造
図２：ヒトＦＰＰＳの活性部位断面内、未知の内因性リガンドの存在を示す残りの電子密度（３σトレース）。電子密度は部分的にリン酸基と解釈され、球および棒表示（立体図）において示された。
図３：ヒトＦＰＰＳの閉状態（マゼンタ色のＣαトレース）および開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の重ね合わせ。最初の１５０アミノ−末端残基（ｒｍｓｄ＝０．３４Å）を使用して、２つの構造を重ね合わせた。重ね合わせは最後の１３０Ｃ末端残基のみが実は構造スイッチ、顕著にＨ−ＩループおよびＨ、α−１、α−２、α−３、ＩおよびＪヘリックスにより影響されることを示し、一方、最初の２２０残基はｒｍｓｄ０．４４Åのみを示す。
図４：ヒトＦＰＰＳ（マゼンタ色のＣαトレース）の開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の上に閉構造を重ね合わせたクローズアップ図。ＨヘリックスおよびＨ−Ｉループの大きな変化が、顕著に残基Ｆ２３９、Ｑ２４０、Ｄ２４３、Ｄ２４７、Ｇ２５６、Ｋ２５７およびＫ２６６の位置に影響することを示す。
図５：Ｍｎ２＋およびパミドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。パミドロネートは透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
図６：３つのＭｇ２＋イオンの配位圏（２つの異なる配置）。シアンブルー色の球は明確な水分子を示す。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）のヒドロキシル基を含む極性相互作用は波線で示される。
図７：Ｍｇ２＋およびＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）とのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
【００６６】
図８：リガンド、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）およびイソペンテニル二リン酸を結合している電子密度（σＡ−加重、（Ｆｏ−Ｆｃ、φｃａｌｃ）結合、電子密度図、４．０σ輪郭を除く）。緑色の球はＭｇ２＋陽イオンの位置を示し、シアンブルー色の球はマグネシウムイオンの配位圏に属する水分子の位置を示す。
図９：イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびヒトＦＰＰＳにおけるその結合部位との結合相互作用のクローズアップ図。可能な水素結合はオングストロームの長さを示す薄い黒色の線により示される。ＩＰＰはそのファンデルワールス力表面と一緒に球および棒表示で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は球および棒で示される。シアンブルー色の球は水分子を示し、緑色の球はマグネシウムイオンを示し、そしてマゼンタ色の球は暫定的にナトリウムイオンの残りの密度の位置であるとみなす。
図１０：ＦＰＰＳホモ二量体（８０ｋＤａ）：非リガンド結合ＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ；黒いスペクトル）およびパミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
図１１：パミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。パミドロネートをＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）により置き換えることにより摂動したいくつかの共鳴は赤い円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
図１２：ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）およびＩＰＰの添加後（４００μＭ；緑色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。ＩＰＰ添加により摂動したいくつかの共鳴は緑色の円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
図１３：ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：８００μＭ；黒いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｎ２＋へ複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｎ２＋濃度：４００μＭ；オレンジ色のスペクトル）の８００ＭＨｚの１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
【００６７】
図１４：閉形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１５：開形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１６：パミドロネートおよびＭｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１７：ゾレドロネート、ＩＰＰおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１８：ゾレドロネートおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
図１９：Ｚｎ２＋およびイバンドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。あり得る極性／静電相互作用は薄い黒い線により示される。イバンドロネートは球および棒表示で示される。三級窒素の反転から創作するイバンドロネートの２つの別の構造をモデル化し、精密化した。三核Ｚｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒に灰色の球として示される。
図２０：イバンドロネートおよびＺｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【実施例】
【００６８】
１．クローニングおよび大腸菌発現
ヒトファルネシル二リン酸合成酵素をコードするプラスミドはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ ｃＤＮＡクローンライブラリー（クローン ＭＧＣ：１５３５２、ＩＭＡＧＥ：４１３２０７１）由来であった。その配列はＧｅｎｂａｎｋ登録ＢＣ０１０００４のものと合っていた。アミノ酸フラグメント６から３５１をコードするＤＮＡはオリゴヌクレオチドＭＧ１０５３（5'-ctggaagttctgttccaggggccaaattcagatgtttatgcccaagaa-3'）およびＭＧ１０５４（5'-gtcgacgtaggcctttgaattcactttctccgcttgtagattttg-3'）を使用してＰＣＲによりクローニングした。次いでＰＣＲフラグメントをGeiser et al. (Bio Techniques 31 (2001) 88-92)の方法にしたがってプラスミドｐＸＩ３４１に結合させた。得られるプラスミドはｐＸＩ４７８と呼ばれ、ヒトＦＰＰＳ（ヘキサヒスチジンタグ、次いでＮ末端でＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ開裂を有するアミノ酸残基６から３５１）に対応する。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｔｕｎｅｒ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＸＩ４７８プラスミドで形質転換し、発酵を開始させるまで液体窒素中で保存した。
【００６９】
２．発酵
２．１ バッチ１
組み換え大腸菌を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５リットルＴＢｍｏｄ培地中ＩＳＦ−１００発酵槽で、まず３７℃で１ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ＝３．７まで培養し、次いでさらに４時間２８℃でｐＨ＝７．０、ｐＯ２＝９７−９８％で培養した。回収した細胞（６８ｇの生重量）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（予想分子量４０ｋＤａでクマシー染色ゲルの顕著なバンド）により示されるとおり高レベルで、約５０％が可溶形のＦＰＰＳを発現した。
【００７０】
ヒトＦＰＰＳ（残基６から３５３）の高レベル発現（＞５０ｍｇ／ｌ）を大腸菌において成し遂げることができる。約１０から５０％のタンパク質は可溶形で製造された。精製された酵素の同一性および完全性はＮ末端シークエンシングおよび質量分析により立証された。天然条件下のエレクトロスプレイイオン化質量分析でヒトＦＰＰＳが８０ｋＤａのホモ二量体であることを確認した。タンパク質は十分に機能し、十分に可溶性であり（＞２０ｍｇ／ｍｌ）、安定であり、そして期待される酵素活性を示した。
【００７１】
２．２ バッチ２
組み換え大腸菌をＩＳＦ−１００発酵槽中で２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５．５リットルの自動誘導培地ＺＹＰ−５０５２中で培養し、１４時間２８℃でｐＨ＝７．１でｐＯ２＝１００−８９％で自動誘導および培養した。飢餓細胞（１１４ｇの生重量）は高レベルでＦＰＰＳを発現したが、約１０％だけが可溶形であった。
【００７２】
３．精製
３．１ 精製法１：バッチ１
６８ｇの大腸菌湿細胞ペレット（バッチ１）を５６０ｍｌのバッファーＡ（各５ｍＭのＤＴＴ、ベンズアミジンＨＣｌおよびＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で懸濁し、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ−５０マイクロフルイダイザーに２回通すことにより溶解させ、３０分間１５，０００ｒｐｍでＳＬＡ１５００ ｒｏｔｏｒ（Ｓｏｒｖａｌｌ）中で遠心した。得られた上清をバッファーＡで平衡にしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰのＸＫ２６／１０カラムに充填した。カラムをバッファーＡ（１５カラム用量；７５０ｍｌ）中のＮａＣｌの０から１Ｍの勾配により溶出した後、該カラムを基準値がゼロに戻るまでバッファーＡで洗浄した。１０ｍｌの画分を回収し、ピークを溜め、４−２０％のＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。勾配の最初の方に溶出する鋭いピークがＦＰＰＳであることをＬＣ−ＭＳにより確認した。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣに基づいて、このピークは１９３ｍｇのＦＰＰＳを含んだ。９６４単位のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを直接加え、混合物を一晩４℃でインキュベーションした。ＬＣ−ＭＳでＮ−末端Ｈｉｓタグの完全除去を確認した。消化画分を約１０ｍｌへ限外濾過し、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、２ｍＭのＤＴＴおよび２５ｍＭのＮａＣｌで平衡にされたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５のＸＫ２６／６０カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより濃縮した。（ＲＰ−ＨＰＬＣにより）１６８ｍｇのタンパク質を含む単一ピークを４０ｍｌの全量中に溶出した。
【００７３】
３．２ 精製法２：バッチ２
１１４ｇの大腸菌の湿細胞ペレット（バッチ２）を９４０ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解し、３４，０００ｇで遠心分離した。上清を滅菌濾過し、次いでバッファーＡで平衡にしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ陰イオン交換カラムに充填した。溶出を８カラム用量にわたって０から１．０ＭのＮａＣｌ勾配により実施した。ＦＰＰＳが勾配の最初の方の約１００−１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。該画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、溜め、グリセロール、硫化アンモニウムおよび塩化ナトリウムを各々最終濃度１０％（ｗ／ｖ）、１．５Ｍおよび１．０Ｍの濃度まで加えた。サンプルを次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、１．０ＭのＮａＣｌ、１．５Ｍの硫化アンモニウムで平衡にしたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムに充填し、８カラム用量にわたって０．０ＭのＮａＣｌおよび０．０Ｍの硫化アンモニウムまでの逆塩勾配により溶出した。ＦＰＰＳは勾配の最後の方で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、溜め、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、２．０ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＮａＣｌでＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除クロマトグラフィーに充填した。該画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にしたがって溜め、限外濾過により濃縮し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．２、０．３ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール（バッファーＢ）に対して透析した。サンプルを次いでバッファーＢで平衡にした金属キレート化カラム（ＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ）に充填し、１０ｍＭから１．０Ｍ勾配のイミダゾールにより溶出した。１５４単位のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを加え、反応混合物を一晩５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴに対して透析した。透析バッファーを次いでバッファーＢに変え、サンプルをその後金属キレート化カラムに充填した。流入物を回収し、限外濾過により約４ｍｌに濃縮し、バッファーＣ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＴＣＥＰ）で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ サイズ排除カラムに充填した（４つ実施）。主要なピークに対応する画分を溜め、限外濾過により１６ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、アリコートし、−８０℃で保存した。
【００７４】
４．分析
精製したタンパク質は、Ｎ末端に処理したＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ開裂部位から付加的なグリシンおよびプロリン残基を有するアスパラギン６からリシン３５３のヒトＦＰＰＳ配列に対応する、全３５０個のアミノ酸残基を有した。それは理論分子量４０，１４１Ｄａを有した。残基は変異されていなかった。ＬＣ−ＥＳＭＳ分析は予測される質量を示す。エドマン分解によるＮ末端シーケンシングは予測されるアミノ酸配列と一致した。
【００７５】
５．結晶化
結晶化は蒸気拡散法により行った。静滴（ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ ウェルプレート中）および懸滴（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ）技術（Ｌｉｎｂｒｏ ２４ ウェルプレート中）両方を使用した。この試験で使用した結晶は、ｐＨ５．３で他は同様の実験条件下で成長させたパミドロネート／Ｍｎ２＋複合体を除いて、１９℃で１．２Ｍのリン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ４．７、２５％（ｖ／ｖ）のグリセロールから成長させた。
【００７６】
ヒトＦＰＰＳの大きな単結晶は、様々な高塩条件下（１．０Ｍのクエン酸アンモニウムまたは１．２Ｍから１．８Ｍのリン酸Ｎａ／Ｋまたはリン酸アンモニウム）でｐＨ４．０から５．６（図３−１）で得ることができる。結晶はもろく、したがって好ましくは冷凍結晶学に直接適当な条件下（１．２Ｍのリン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ４．７から５．６で、２５％（ｖ／ｖ）のグリセロール）で成長させる。２つの結晶形は両方とも非対称単位あたり１つのＦＰＰＳサブユニットを有する空間群Ｐ４１２１２であることを観察できる。開構造の非リガンド結合のヒトＦＰＰＳの結晶はおおよその格子定数ａ＝ｂ＝１１１Å、ｃ＝７７Å（結晶形ＩＩ）を有し、一方、閉構造に対応するものは格子定数約ａ＝ｂ＝１１２Å、ｃ＝６６Å（結晶形Ｉ）を示す。後記の同形物結晶はパミドロネート、ゾレドロネート／ＩＰＰ、および５ｍＭのＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の存在下で同様の実験条件下で得ることができる。
【００７７】
開構造の非リガンド結合の酵素の結晶は精製法２にしたがって単離されるヒトＦＰＰＳで得られた。すべての他の結晶はバッチ１（精製法１）で製造した。両方の酵素バッチで、タンパク質貯蔵溶液は２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ中の１６ｍｇ／ｍｌのヒトＦＰＰＳ（６−３５３）であった。アポ結晶を当量の結晶化溶液およびタンパク質貯蔵溶液の混合により製造した。パミドロネート、ゾレドロネートおよびＩＰＰの複合体を５ｍＭのＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の存在下で減少したタンパク質濃度（４．２ｍｇ／ｍｌ）で共結晶化により製造した。パミドロネート（５０ｍＭ）およびゾレドロネート（１０ｍＭ）の貯蔵溶液を普通の水で２．５ｍＭおよび０．５ｍＭ各々の最終濃度に酵素を加え製造した。ＩＰＰを７０％のメタノール、３０％の１０ｍＭの水酸化アンモニウム中の１ｍｇ／ｍｌの溶液としてＳｉｇｍａから購入し、タンパク質（基質の３倍モル過剰）に対して１：５０に希釈した。
【００７８】
５ｂ．イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体の結晶化
イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体の結晶を静滴技術の蒸気拡散により１９℃で０．１Ｍの酢酸亜鉛、０．１Ｍの酢酸Ｎａ、１２％のＰＥＧ ４０００、ｐＨ４．４により成長させた。タンパク質貯蔵溶液は１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および１．０ｍＭのイバンドロネート中の１３．８ｍｇ／ｍｌのヒトＦＰＰＳ（６−３５３）であった。
【００７９】
６．Ｘ線データ収集
Ｘ線データをＭＡＲＣＣＤ １６５ｍｍ 検出器およびシンクロトロン放射（Swiss Light Source、ビームラインＸＳ０６Ａ）を使用し９５Ｋで収集した。結晶は冷凍ループ中に置き、冷窒素流中で直接急速冷凍した。回折データはＨＫＬプログラム一組のバージョン１．９６．６（Otwinowski and Minor、1997）またはＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥ（Kabsch、1993）で処理および概算した１．０°振動像として記録した。すべての結晶は非対称単位あたり１つのＦＰＰＳ単量体を有する空間群Ｐ４１２１２であった。結晶データおよびデータ収集統計値は表１で示される。
【００８０】
５つの完全なデータセットをＳｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで開構造（２．３Å）および閉構造（２．４Å）のアポ酵素、ならびにパミドロネート／ＭｎＣｌ２（２．６Å）およびゾレドロネート／ＭｇＣｌ２（２．２Å）との二元複合体ならびにＩＰＰおよびゾレドロネート／ＭｇＣｌ２（２．６Å）との三元複合体に対して収集した（図１４、１５、１６、１７および１８の表を参照）。
【００８１】
６ｂ．Ｘ線データ収集：イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体
Ｘ線データをＭＡＲＣＣＤ ２２５ｍｍ 検出器およびシンクロトロン放射（Swiss Light Source、ビームラインＰＸ−ＩＩ）を使用し１００Ｋで収集した。１つの単結晶は冷凍ループ中に置き、冷窒素流中で直接急速冷凍した。回折データはＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥ（Ｋａｂｓｃｈ、１９９３）で処理および概算した１．０°振動像として記録した。結晶は非対称単位あたり１つのＦＰＰＳ単量体を有する空間群Ｐ４１２１２であった。結晶データおよびデータ収集統計値は表１ｂで示される。
【００８２】
７．構造決定
非リガンド結合のヒトＦＰＰＳの構造を最初に１５．０から３．５Åの解像度のおよび探索モデルとして２．６Å構造の鳥類のＦＰＰＳ（ＰＤＢ登録１ＦＰＳ）のデータを使用し、プログラムＡＭｏＲｅ（Navaza, Acta Crystallogr. Sect A 50 (1994) 157-163）で分子置換することにより決定した。ヒトのおよび鳥類のＦＰＰＳは６９％（２４１／３４５）配列同一性である。閉形および開形両方に関して、はっきりとした分子置換解釈を見いだした。閉形に関して、６９．５％の相関係数および０．３１１のＲファクターを得た。開形に関して、５１．０％の相関係数および０．４１０のＲファクターを得た。次いで、両方の構造をねじれ角力学およびエネルギー最小化のいくつかのサイクルを使用してＣＮＸ ｖ２００２．０２で精密化し（Bruenger et al., Acta Crystallogr. Sect. D; Biol. Crystallogr. 54 (1998) 905-921）、プログラムＯでモデル再構築段階により散在させた（Jones et al., Acta Crystallogr. Sect A, 47 (1991) 110-119）。精密化中、protein_rep.param force field（Engh and Huber, Acta Crystallogr. Sect A, 47 (1991) 392-400）を使用した；マスク法に基づく大量の溶媒補正、および最初の異方性Ｂファクター補正を適用した。抑制異方性原子Ｂファクターを精密化した。精密化標的は振幅を使用する最大可能性標的であった。σカットオフは構造ファクター振幅に適用しなかった。クロス確認は１０％の反射を含む試験セットを使用して精密化中に使用した。水分子をCNX script water_pick.inpで同定し、異なるピーク高（３．０σより大きい）、水素結合および距離基準に基づいて選択した。６５Å２より大きい温度因子を有する水を拒絶した。
【００８３】
パミドロネートおよびゾレドロネートとの二元複合体ならびにＩＰＰおよびゾレドロネートとの三元複合体の構造は最初にアポ構造の剛体精密化を使用し、次いで上記定義のとおりの同じ手順を使用し完全に精密化し決定した。
【００８４】
すべての結晶学的モデルに対する最後の精密化統計値を表２に示す。
【００８５】
８．ｈＦＰＰＳの全体的な三次元構造
鳥類のＦＰＰＳのような、ヒトＦＰＰＳは２つの同じ活性部位を有するホモ二量体である。結晶において、２つのサブユニットは結晶学的に２回対称である。各サブユニットは１０個が核ヘリックス束を形成する１３個のαヘリックスからなる１つのドメインとして折りたたまれている。以下、我々は鳥類のＦＰＰＳに対して最初に提案された名称を採用し（Tarshis et al.,1994, Biochemistry; 33:10871-10877）、それによって、核束の１０個のヘリックスをＡからＪと名付け、ヘリックスＨからＩを当てはめた３個の短いヘリックスをα−１からα−３と名付ける。１０個の核ヘリックスを束ねることで、３層構造、ヘリックスＡおよびＢで第１の層を形成し、ヘリックスＣ、Ｄ、ＥおよびＪで第２の層を形成し、ヘリックスＦ、Ｇ、ＨおよびＩで第３の層を形成することが記載されている（上記Tarshis et al）。ヘリックスＧは、２つのねじれ、高度に保存されているＬｙｓ２００−Ｔｈｒ２０１配列で起こる第１のねじれ、Ｐｒｏ２０９の周りの第２のねじれを示す。
【００８６】
２個の保存されているＤＤＸＸＤモチーフはヘリックスＤおよびＨのＣ末端に位置する。２個のヘリックスは、ヘリックスＣ、Ｆ、ＧおよびＪと一緒にとても深い壁および大きなＦＰＰＳ活性部位を形成する。ヘリックスＢおよびＣ（“Ｂ−Ｃループ”）、ＤおよびＥ（“Ｄ−Ｅループ”）ならびにＨおよびＩ（“Ｈ−Ｉループ”）を接続している３個の顕著なループは酵素活性部位の入口に並んでいる。これらの３個のループは保存されているグリシン、リシンおよびアルギニン残基：Ｂ−Ｃループ／Ｃヘリックス中のＧｌｙ５６、Ｌｙｓ５７およびＡｒｇ６０、Ｄ−Ｅループ中のＡｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３およびＧｌｙ１１４、Ｈ−Ｉループ中のＧｌｙ２５６、Ｌｙｓ２５７およびＬｙｓ２６６を隠す。他の高度に保存されている残基はＦＰＰＳ活性部位の周りのプレニル合成酵素クラスターの中に位置する。
【００８７】
二量体の中間面は主に、すべての他のαヘリックスにほぼ直交する（図１）、最初の２つのＮ末端αヘリックス（ＡおよびＢ）により提供される、さらなるサブユニット相互作用を有するヘリックスＤおよびＥからなる。
【００８８】
９．ｈＦＰＰＳの閉構造（“アポ閉形”）
精製法１にしたがって製造されるヒトＦＰＰＳ結晶は、すべて結晶形Ｉ（閉構造）の典型であった。構造の精密化中に、ヒト酵素は鳥類のＦＰＰＳと比較して、異なる構造状態であることが明らかとなり、それを閉状態と呼ぶ（図１）。さらに、酵素活性部位内において、残存する異なる電子密度が部分的にリン酸基を含むと解釈される内因性リガンドに対応することを観察した（図２）。このリガンドの電子密度は約１５０−２００Ｄａのリン酸化（または硫酸化）化合物と一致した。この発見は、分子量２００Ｄａを有する思いがけないリガンドの存在を示す、非変性状態下で行われる“非リガンド結合”のＦＰＰＳの質量分析により確認した（Bitsch et al., Anal. Biochem. 373 (2000) 231-241）。
【００８９】
３つの保存されている塩基性側鎖はリガンド：Ｂ−Ｃループ／Ｃ−ヘリックスのＬｙｓ５７およびＡｒｇ６０ならびにＤ−ＥループのＡｒｇ１１３と相互作用した。その後、同じ残存する電子密度がまたパミドロネートまたはゾレドロネートとの二元複合体の結晶中に存在し、このリガンドはゾレドロネートとＩＰＰとの三元複合体のＩＰＰに置換されることを発見した。構造の重ね合わせは、残存する異なる電子密度がほぼＩＰＰの二リン酸基の大きさでありその結合部位を占めることを示した。
【００９０】
１０．開構造のｈＦＰＰＳ（“アポ開形”）
真にリガンド結合していないヒトＦＰＰＳの三次元構造を決定するために、酵素の第２のバッチを製造し、さらなるクロマトグラフおよび透析段階を使用して徹底的に精製した。得られた結晶は非対称単位あたり再び一つのＦＰＰＳサブユニットを有する同じ正方空間群であるが、ｃ軸の長さにおいて１０Åの増加を示した（結晶形ＩＩ）（開構造）。構造を探索モデルとして鳥類のＦＰＰＳを再び使用して分子置換により決定した。
【００９１】
Ｘ線分析は上記内因性リガンドが新規精製プロトコールによりうまく取り除かれることを確認した。それにもかかわらず、結晶化母液由来の明確なリン酸イオンが、以前はリガンドの推定されているリン酸基により占有されていた部位を占める。より重要なことに、鳥類のＦＰＰＳで当初に観察されたのと同様に、酵素が開構造を採用することを見いだした。ヒトＦＰＰＳの開構造および閉構造をすべてのＣα原子を使用して重ね合わせるとき、１．７Åの根平均二乗変位を得る。しかし、まず１５０のＮ末端Ｃα原子のみを使用して２つの構造を重ね合わせるとき、２つの構造状態間の構造の差が示された。
【００９２】
１１．パミドロネートおよびＭｎ２＋とのｈＦＰＰＳ複合体
１１ａ．金属結合部位
ＦＰＰＳにより触媒される酵素反応はＭｇ２＋またはＭｎ２＋のいずれかの存在が必要である。金属部位の数および位置を決定するために、ヒトＦＰＰＳをＭｎＣｌ２およびパミドロネートの存在下で結晶化した。Ｘ線試験において、Ｍｎ２＋イオン（２３個の電子）はＭｇ２＋（１０個の電子）よりも強いシグナルを与え、したがって金属結合部位の明確な同定を中程度の解像度でさえ可能にする。ｈＦＰＰＳ／パミドロネート／ＭｎＣｌ２データははっきりとＦＰＰＳ活性部位の空洞内に３個のＭｎ２＋陽イオンが存在することを立証した。３個の金属イオンは阻害剤のビスホスホネート単位および２つの保存されているＤＤＸＸＤ配列モチーフからの３個のアスパラギン酸側鎖：Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７およびＡｓｐ２４３により配位結合されている。３．３Åだけ離れて位置する２個のＭｎ２＋イオンは架橋リガンドとして作用するＡｓｐ１０３のカルボキシレート基および両方の金属イオンが配位結合しているＡｓｐ１０７のＯδ２を有する第１のＤＤＸＸＤモチーフ（ヘリックスＤ）に結合している。第３のＭｎ２＋イオンはＡｓｐ２４３のＯδ２を介して第２のＤＤＸＸＤモチーフ（ヘリックスＨ）に結合しており、他の２個の金属部位から各々４．９Åおよび６．２Å離れている。すべてのカルボキシレート酸素原子は、Ａｓｐ１０７のＯδ２を除いて共通して観察されるｓｙｎ配置を有する金属中心と配位結合しており、これをｓｙｎおよびａｎｔｉ配位構造両方で使用する。
【００９３】
１１ｂ．ｈＦＰＰＳへのパミドロネートの結合
さらに、Ｘ線分析はＮ含有ビスホスホネート阻害剤、例えばパミドロネートがＦＰＰＳのアリル基質部位に結合し、そして以前のモデルと逆に、三核金属中心を介してＤＤＸＸＤモチーフ両方と相互作用することを立証する。パミドロネートの側鎖アミノ基は明確な電子密度を有しておらず、この置換基が酵素活性部位と強い相互作用を作らないかまたは複合体において１つ以上の配置を有することを示す。それにもかかわらず、Ｔｙｒ２０４のフェノールヒドロキシル部分はパミドロネート一級アミノ基と水素結合相互作用を形成するために適当な位置である（図５）。加えて、３つの塩基性側鎖：Ｌｙｓ２００、Ａｒｇ１１２およびＬｙｓ２５７がパミドロネートのビスホスホネート単位との直接塩橋相互作用に関与する。注意する点は、Ｌｙｓ２５７は可動性のＨ−Ｉループの一部である。したがって、パミドロネート結合はＤＤＸＸＤモチーフとＨ−ＩループのＬｙｓ２５７両方での相互作用によりＦＰＰＳの閉構造を安定にする。さらに、この複合体において、ＩＰＰ結合部位は“アポ”ＦＰＰＳの閉形においてすでに観察されたリガンドにより占有される。この内因性リガンドの存在がさらに酵素の閉状態を安定にする。
【００９４】
１２．ゾレドロネートおよびＭｇ２＋とのｈＦＰＰＳ複合体
パミドロネートに対してゾレドロネートの高い阻害剤有効性の分子基盤を解明するために、ゾレドロネートとのＦＰＰＳ複合体をＭｇＣｌ２の存在下で共結晶化し、構造を２．２０Å解像度で決定した。酵素は再び上記リガンドにより占有されるＩＰＰ結合部位を有する閉構造を採用することが見いだされた。パミドロネート複合体においてマンガンイオンの位置と合う３つのＭｇ２＋部位を観察した。さらに、より良い解像度のｈＦＰＰＳ／ゾレドロネート／ＭｇＣｌ２データは３個のマグネシウムイオンの配位圏の詳細を示し、これらすべてはほぼ８面体配列の６個の配位リガンドを有した。さらに、電子密度は、イミダゾリウム環を含むゾレドロネート原子すべてに関して明確であった。プロトン化環窒素はヘリックスＧの第１のねじれに位置する２つの保存されているアミノ酸残基であるＬｙｓ２００の主鎖のカルボニル酸素とＴｈｒ２０１の側鎖のヒドロキシルの水素結合距離以内である。ビスホスホネート炭素原子のヒドロキシル置換基はＧｌｎ２４０のＯε１への水介在Ｈ結合、ならびにＡｓｐ２４３のＯδ２への直接極性接触を作るが、後者の相互作用の配置は良い水素結合のためにはあまり有望ではないように見える。
【００９５】
パミドロネートと比較して、ゾレドロネートの高い結合親和性はイミダゾール環の増加した剛性およびバルキネスおよび上記の極性相互作用に基づいているようである。さらに、窒素含有ビスホスホネートが酵素反応中に形成されると推定されているカルボカチオン中間体を模倣している遷移状態類似体として作用することが提案されている。したがって、ゾレドロネートの増加した有効性はまた、そのｓｐ２混成イミダゾリウム環がパミドロネートの一級アンモニウム基よりも良好な遷移状態模倣物であり、酵素活性部位の後方により位置するという事実に基づいている。
【００９６】
１３．ＩＰＰ、ゾレドロネートおよびＭｇ２＋とのｈＦＰＰＳ複合体
良質の完全回折データセット（Ｒｍｅｒｇｅ＝０．０７２）をＭｇ２＋、ＩＰＰおよびゾレドロネートとのｈＦＰＰＳの三元複合体について２．６Åまで回収した。良い密度差が基質および阻害剤両方に対して観察された（図１５）。このデータは内因性リガンドによりあらかじめ占有されたポケットへのＩＰＰ結合部位の配置を十分に確認し、ＩＰＰ結合相互作用の詳細を明らかにした。いくつかの保存されている塩基性残基（Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０およびＡｒｇ１１３）がＩＰＰ基質への直接相互作用を作り、３つの他の残基（Ａｒｇ１１２、Ｌｙｓ２５７およびＡｒｇ３５１）がＩＰＰの二リン酸単位の５．０Å以内にそれらの正電荷基を有する。注意する点は、これらの残基のいくつかは（Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｌｙｓ２５７およびＡｒｇ３５１）、ＦＰＰＳの構造スイッチによる影響を受ける二次的構造要素（Ｈヘリックス、Ｈ−ＩループおよびＣ末端尾部）の一部である。それゆえ、ＩＰＰ結合は酵素の閉形の安定性に寄与している。ＩＰＰの炭化水素部分は保存されているＰｈｅ２３９とゾレドロネートのイミダゾール環を結合している（図１６）。ゾレドロネート／Ｍｇ２＋三核クラスターの結合は上記リガンドを有する以前の構造と比較してＩＰＰ三元複合体内で変化していない。イミダゾリウム環の置換窒素原子が遷移状態のアリルカルボカチオンを模倣しているため、ＩＰＰの観察される結合はＦＰＰＳ縮合反応の確立している立体化学と一致する：ＩＰＰ二重結合のｓｉ面はアリル基質のＣ１’炭素原子との縮合反応と均衡のとれた状態にある。ＩＰＰのＣ４原子とゾレドロネートのイミダゾリウム環の置換窒素との観察される距離は３．８Åである。
【００９７】
１４．鳥類のＦＰＰＳとの比較
ヒトおよび鳥類のＦＰＰＳの結晶学的データの比較は、ヒトおよび鳥類のＦＰＰＳが６９％配列同一性であることを示す。期待どおり、両方の酵素は同じ三次元の折りたたみを示す。また、サブユニットの二量体の中間面および相対的配置が保存されている。しかし、構造比較は、鳥類のＦＰＰＳが開構造のみにで観察されることを示した。ヒトＦＰＰＳの開形は公開されている鳥類の構造と重ね合わせることができ、３３４の構造的に同等のＣα原子に対して約０．９５Åの根平均二乗変位を有する。鳥類のＦＰＰＳのＨ−Ｉループの構造はヒト酵素で観察される構造と異なる。また、鳥類のＦＰＰＳのカルボキシ末端残基は、酵素活性部位から離れて位置する異なる構造をとる。
【００９８】
アリル基質を有する複合体の鳥類のＦＰＰＳでの結晶学的試験が、２つのみのマグネシウム結合部位が存在することを示し、二リン酸分子がヘリックスＤに位置する第１のＤＤＸＸＤモチーフと相互作用することを示した（Tarshis, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93 (1996) 15018-15023）。これらの結果に基づいて、イソペンテニル二リン酸がヘリックスＨのＣ末端の最後に位置する第２のＤＤＸＸＤモチーフに結合するであろうことが提案された。際立った対照として、我々の結果はパミドロネートおよびゾレドロネートが３個の二価の陽イオンと一緒にＤＤＸＸＤモチーフに結合すること、ＩＰＰがＢ−Ｃ、Ｄ−ＥおよびＨ−Ｊループが配置されている塩基性部位中に結合していることを示す。
【００９９】
ここに存在するヒトＦＰＰＳのＸ線分析はこの重要な薬剤標的の開構造および閉構造両方の三次元構造を最初に提供し、ＦＰＰＳの基質、例えばＩＰＰならびにＦＰＰＳの阻害剤、例えば窒素含有ビスホスホネートクラスの２つの重要な市販薬剤であるパミドロネートおよびゾレドロネートの結合部位を示す。新規データは、ＩＰＰとビスホスホネート結合の以前の概念を明確にし、そして正し、ならびに金属中心の数および位置を明らかにする。
【０１００】
ＦＰＰＳの構造転換は最後の１３０カルボキシ末端残基の剛体運動、動的（無秩序な）立体配座の状態から閉形の秩序な、明確な立体配座への同時変化を有するＨ−Ｉループおよび最後３個のカルボキシ末端残基の変化を含む。第１の基質（ＤＭＡＰＰまたはＧＰＰ）が結合するまでＩＰＰ結合部位は形成しないため、このような構造スイッチは秩序立てられた反応メカニズムを指示する。また、酵素反応中に製造されるカルボニウムは閉じた酵素活性部位内で溶媒から保護される。基質結合に含まれる保存された塩基性残基が可動性ループ中に見いだされた。
【０１０１】
鳥類のＦＰＰＳ結晶構造に基づいて、ＩＰＰ結合はＮ末端ＤＤＸＸＤモチーフを含むと考えられ、これは結合がＭｇ依存ではないという観察と一致しなかった。ここで提示する構造は、ＩＰＰの二リン酸基が２つのＤＤＸＸＤモチーフのいずれかと相互作用しないことを示し、なぜＩＰＰ結合がＭｇ２＋を必要としないかの説明となる。
【０１０２】
我々のデータはパミドロネートおよびゾレドロネートがピロリン酸アリル類似体として作用することを示し、アレドロネート、他の窒素含有ビスホスホネート化合物によるＦＰＰＳ阻害がＩＰＰではなくアリル基質に対して拮抗的であるという観察に完全に一致する。さらに、ゾレドロネートとのＦＰＰＳ複合体の三次元構造は有効な構造活性データをうまく説明する。
【０１０３】
表１ Ｘ線データ収集統計値
【表１】
【０１０４】
表１ｂ：データ収集統計値：イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体：
【表２】
【０１０５】
表２ 精密化統計値
【表３】
【表４】
【０１０６】
表２ｂ：イバンドロネートとのＦＰＰＳ複合体の精密化統計値
【表５】
【０１０７】
１５．ＮＭＲ分光学
上記Ｘ線結晶学的結果はＮＭＲ分光学により完成させ、確認した。ＦＰＰＳはその高分子量８０ｋＤａのためＮＭＲ分析に対して難題を示す。事実、１５Ｎ−標識（非重水素化）ＦＰＰＳでの１５Ｎ，１Ｈ−ＨＳＱＣまたはＴＲＯＳＹスペクトルは本質的に非常に幅広のため説明できない。重水素化により、しかし、１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹスペクトルは適当な質であり個々の共鳴の分析を可能とする。
【０１０８】
１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹスペクトルはタンパク質の識別スペクトルとして見なすことができる。特異的ピークパターンをもたらす化学シフトはタンパク質構造ならびにリガンド結合により影響される。タンパク質の重要な構造変化を引き起こさずにリガンドが結合するとき、いくつかの共鳴のみが化学シフト、すなわちリガンドの直接近辺における化学シフトを変化させる。しかし、リガンド結合が大きな構造変化を起こすとき、多くのタンパク質の共鳴が化学シフト変化を起こし、識別ＴＲＯＳＹスペクトルは有意な差を表す。
【０１０９】
リガンドの結合部位のマッピングは通常リガンドあり、およびなしでのＮＭＲスペクトルを記録し、リガンド結合により影響されるこれらの共鳴を同定することで行う。これは分析前にタンパク質共鳴の割り当てを必要とする。共鳴の割り当ては小さいタンパク質に対しては容易であるが、ＦＰＰＳに対しては挑戦である。本発明にしたがって、選択される共鳴は、既知の結合部位を有する既知のリガンドによるそれらの摂動に基づいて、および（反磁性の）Ｍｇ２＋の（常磁性の）Ｍｎ２＋との置換により影響される常磁性緩和の増大を利用することにより間接的な方法で得られた。この手段でそれぞれの結合部位に対するプローブを同定することができる。
【０１１０】
パミドロネートおよびＭｇ２＋の添加により、１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹスペクトルは有意に変化する。事実、ほとんどすべての非重複共鳴は化学シフト変化する（図１０）。これは強く、パミドロネートの結合のＦＰＰＳ内で生じる大きな構造変化を示唆する。これはＸ線結晶学により観察されるアポＦＰＰＳの開構造とパミドロネート結合ＦＰＰＳの閉構造の変化に対応する。パミドロネートなしのＭｇ２＋だけの添加はＦＰＰＳのほんのわずかな化学シフト変化しか起こさず、ビスホスホネートの非存在下においてＦＰＰＳへのＭｇ２＋の結合が弱く、著しい構造変化をもたらさないことを示す。
【０１１１】
ゾレドロネートはパミドロネートよりＦＰＰＳにより強く結合し、したがってそれはビスホスホネート結合ポケットからパミドロネートを除くはずである。当モル濃度のゾレドロネートをパミドロネート／Ｍｇ２＋との複合体のＦＰＰＳのサンプルに添加した。さらに、より小さいが、化学シフト変化を観察した（図１１）。これらの化学シフト変化はパミドロネートがゾレドロネートにより置換されるためである。リガンドを交換すると、すでに閉状態であるためＦＰＰＳ構造は著しく変化しない。したがって、少しの化学シフト変化は直接に異なるビスホスホネート側鎖による部分的な摂動による：ゾレドロネートによるパミドロネート置換における化学シフト変化をする共鳴はゾレドロネート側鎖にとても近い位置である。したがって図１１において丸で囲むこれらの変化する共鳴は、ゾレドロネート側鎖結合部位のための標識である。
【０１１２】
ＩＰＰはゾレドロネート結合部位の外側に結合するＦＰＰＳ基質であり、ゾレドロネートの存在下でさえＦＰＰＳに結合する。ＩＰＰ結合部位の近くの共鳴はＦＰＰＳ／ゾレドロネート／Ｍｇ２＋サンプルへのＩＰＰの添加によりマッピングされた。再び、いくつかの共鳴のみが化学シフトを変化させ、ＦＰＰＳの大きな構造変化の欠如と一致する。再び、これらの共鳴はＩＰＰ結合部位近くの残基に属し、ＩＰＰ結合部位内に結合するプローブのための標識として使用することができる（図１２）。
【０１１３】
Ｍｇ２＋結合部位から個々の共鳴の距離は（反磁性の）Ｍｇ２＋の（常磁性の）Ｍｎ２＋による置換により探求することができる。スピン標識のような常磁性の金属は近くの核に距離依存緩和増大効果を発揮する。したがってＭｎ２＋による影響を受けないいくつかの残基は常磁性中心から少なくとも２ｎｍ離れており、一方Ｍｎ２＋による影響を強く受ける残基は金属イオンから１．０−１．５ｎｍの距離内である。図１３はＭｇ２＋またはＭｎ２＋によりライゲートされているときのＦＰＰＳ／ゾレドロネートの１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１１４】
ＮＭＲ試験で、Ｘ線結晶学により観察される“開”構造から“閉”構造変化に対応する大きな立体配座の転換がＦＰＰＳへのビスホスホネート結合後に起こることを確認した。さらに、共鳴がゾレドロネート側鎖結合部位およびＩＰＰ結合部位に特異的である共鳴が同定された。Ｘ線構造が解析できないときでさえフラグメントに対して結合部位のマッピングができるため、これはフラグメントベースリガンド設計による非ビスホスホネートＦＰＰＳ阻害剤の発見のための有用な情報である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ヒトＦＰＰＳホモ二量体（閉構造）の全体的な構造
【図２】ヒトＦＰＰＳの活性部位断面内、未知の内因性リガンドの存在を示す残りの電子密度（３σトレース）。電子密度は部分的にリン酸基と解釈され、球および棒表示（立体図）において示された。
【図３】ヒトＦＰＰＳの閉状態（マゼンタ色のＣαトレース）および開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の重ね合わせ。最初の１５０アミノ−末端残基（ｒｍｓｄ＝０．３４Å）を使用して、２つの構造を重ね合わせた。重ね合わせは最後の１３０Ｃ末端残基のみが実は構造スイッチ、顕著にＨ−ＩループおよびＨ、α−１、α−２、α−３、ＩおよびＪヘリックスにより影響されることを示し、一方、最初の２２０残基はｒｍｓｄ０．４４Åのみを示す。
【図４】ヒトＦＰＰＳ（マゼンタ色のＣαトレース）の開状態（シアンブルー色のＣαトレース）の上に閉構造を重ね合わせたクローズアップ図。ＨヘリックスおよびＨ−Ｉループの大きな変化が、顕著に残基Ｆ２３９、Ｑ２４０、Ｄ２４３、Ｄ２４７、Ｇ２５６、Ｋ２５７およびＫ２６６の位置に影響することを示す。
【図５】Ｍｎ２＋およびパミドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。パミドロネートは透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
【図６】３つのＭｇ２＋イオンの配位圏（２つの異なる配置）。シアンブルー色の球は明確な水分子を示す。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）のヒドロキシル基を含む極性相互作用は波線で示される。
【図７】Ｍｇ２＋およびＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）とのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。極性電位／静電相互作用は薄い黒色の線で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は透明なファンデルワールス力表面を有する球および棒表示で示される。三核Ｍｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒にすみれ色の球として示される。
【図８】リガンド、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）およびイソペンテニル二リン酸を結合している電子密度（σＡ−加重、（Ｆｏ−Ｆｃ、φｃａｌｃ）結合、電子密度図、４．０σ輪郭を除く）。緑色の球はＭｇ２＋陽イオンの位置を示し、シアンブルー色の球はマグネシウムイオンの配位圏に属する水分子の位置を示す。
【図９】イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびヒトＦＰＰＳにおけるその結合部位との結合相互作用のクローズアップ図。可能な水素結合はオングストロームの長さを示す薄い黒色の線により示される。ＩＰＰはそのファンデルワールス力表面と一緒に球および棒表示で示される。Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）は球および棒で示される。シアンブルー色の球は水分子を示し、緑色の球はマグネシウムイオンを示し、そしてマゼンタ色の球は暫定的にナトリウムイオンの残りの密度の位置であるとみなす。
【図１０】ＦＰＰＳホモ二量体（８０ｋＤａ）：非リガンド結合ＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ；黒いスペクトル）およびパミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
【図１１】パミドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、パミドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；青いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。パミドロネートをＺｏｍｅｔａ（ゾレドロネート）により置き換えることにより摂動したいくつかの共鳴は赤い円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
【図１２】ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：９００μＭ；赤いスペクトル）およびＩＰＰの添加後（４００μＭ；緑色のスペクトル）の１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。ＩＰＰ添加により摂動したいくつかの共鳴は緑色の円である。７．５から８．０ｐｐｍの“ランダムコイル領域”を示すさらなるピークは分解したＦＰＰＳに由来する。
【図１３】ゾレドロネート／Ｍｇ２＋と複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｇ２＋濃度：８００μＭ；黒いスペクトル）およびゾレドロネート／Ｍｎ２＋へ複合体化したＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ二量体濃度：６０μＭ、ゾレドロネート濃度：２７０μＭ、Ｍｎ２＋濃度：４００μＭ；オレンジ色のスペクトル）の８００ＭＨｚの１５Ｎ，１Ｈ−ＴＲＯＳＹ ＮＭＲスペクトル。
【図１４】閉形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１５】開形の非リガンド結合のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１６】パミドロネートおよびＭｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１７】ゾレドロネート、ＩＰＰおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１８】ゾレドロネートおよびＭｇ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【図１９】Ｚｎ２＋およびイバンドロネートとのヒトＦＰＰＳ複合体のクローズアップ図。あり得る極性／静電相互作用は薄い黒い線により示される。イバンドロネートは球および棒表示で示される。三級窒素の反転から創作するイバンドロネートの２つの別の構造をモデル化し、精密化した。三核Ｚｎ２＋中心は配位結合している水分子（小さいシアンブルー色の球）と一緒に灰色の球として示される。
【図２０】イバンドロネートおよびＺｎ２＋との複合体のｈＦＰＰＳのＸ線構造座標。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）およびその変異体。
【請求項２】
閉構造である請求項１に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項３】
ａ＝ｂ＝１１２ű２０Å、ｃ＝６６ű２０Å、または、より好ましくは、ａ＝ｂ＝１１２ű１０Åおよびｃ＝６６ű１０Åの単位格子定数を含む、請求項２に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項４】
開構造である請求項１に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項５】
ａ＝ｂ＝１１１ű２０Å、ｃ＝７７ű２０Å、または、より好ましくは、ａ＝ｂ＝１１１ű１０Åおよびｃ＝７７ű１０Åの単位格子定数を含む、請求項４に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項６】
リガンドとの複合体の請求項１から５のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項７】
リガンドがイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）および／またはゾレドロネートまたはパミドロネートから選択される請求項６に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項８】
下記三次元構造：
ａ）図１４で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義される閉構造の三次元構造、
ｂ）図１５で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義される開構造の三次元構造、
ｃ）図１６、１７もしくは１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義される三次元構造、または
ｄ）ａ）、ｂ）もしくはｃ）に類似する構造
の１つを有する請求項１から７のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項９】
（ｉ）組み換えヒトＦＰＰＳを大腸菌で発現させ（ここで該組み換えヒトＦＰＰＳはアミノ酸断片６から３５３に対応する）、
（ｉｉ）発現したヒトＦＰＰＳを精製し、
（ｉｉｉ）精製ヒトＦＰＰＳを結晶化する
段階を含む、結晶性ヒトＦＰＰＳ生成物の製造法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって得られる結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項１１】
ヒトＦＰＰＳの結晶構造データの作成のための、請求項１から８および１０のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳの使用。
【請求項１２】
ヒトＦＰＰＳリガンド複合体の結晶構造データの作成のための、請求項６から７のいずれかに記載のリガンドとの結晶性ヒトＦＰＰＳ複合体の使用。
【請求項１３】
それぞれの結合部位を決定するための請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義されるヒトＦＰＰＳの結晶構造。
【請求項１５】
ヒトＦＰＰＳ単独またはリガンドとの複合体の結晶構造。
【請求項１６】
ＦＰＰＳリガンドの設計、選択、同定および／または製造するための、請求項１−１０のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳおよび／または請求項１４または１５のいずれかに記載の結晶構造の使用。
【請求項１７】
コンピュータ利用モデリングプログラムをリガンド分子の選択および／または設計するために使用する請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
リガンドがヒトＦＰＰＳの結合ポケットに相補的である三次元構造を有する請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するようにリガンドが選択され、および／または設計される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するようにリガンドが選択され、および／または設計される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分を提供することを含むヒトＦＰＰＳの結晶構造の三次元表現を得、そして結晶構造の三次元表現を構築するために該構造座標を使用する方法。
【請求項２２】
ａ）請求項２１に記載のヒトＦＰＰＳの三次元表現を提供し、
ｂ）候補化合物の三次元表現を提供し、
ｃ）三次元表現がヒトＦＰＰＳの結合ポケットに相補的である候補化合物を選択し、そして、
ｄ）所望により溶解性、親和性、特異性および／または有効性のような物理学的特徴を最大化するために段階ｃ）で選択される該化合物を修飾する
段階を含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドの選択、設計および／または同定するためのコンピュータベースの方法。
【請求項２３】
Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する中から該化合物が選択される、請求項２２に記載のコンピュータベースの方法。
【請求項２４】
Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する中から該化合物が選択される、請求項２２に記載のコンピュータベースの方法。
【請求項２５】
図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分を提供することを含むタンパク質の結晶構造を決定し、そして該タンパク質に関する結晶構造を提供するために、分子置換するために該構造座標を使用する方法。
【請求項２６】
データ記憶媒体とコンピュータ可読データを含むコンピュータ可読記憶媒体であって、該データは図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分を含む媒体。
【請求項２７】
ａ．候補化合物とヒトＦＰＰＳを共結晶化またはインキュベートし、
ｂ．Ｘ線またはＮＭＲ法により候補化合物と相互作用するヒトＦＰＰＳのアミノ酸を決定し、
ｃ．段階ｂの結果に基づいて、Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８からなる群の中から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する化合物を選択する
ことを含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドを選択するための方法。
【請求項２８】
該候補化合物が請求項２２または２４に記載の方法により同定されるものの中から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに
ｄ．物理学的特徴、例えば溶解性、親和性、特異性および／または有効性を最大化するために段階ｃ）で得られる化合物の類似体を設計し、
ｅ．ヒトＦＰＰＳに結合できる新規化合物を選択するために対応する類似体で請求項２７に記載の段階ａ．からｃ．を繰り返す
段階を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトＦＰＰＳへのリガンドを設計する方法であって、該方法が
ａ）ヒトＦＰＰＳの第１の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第１のリガンドを提供し、
ｂ）ヒトＦＰＰＳの第２の結合部位の少なくとも１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第２のリガンドを提供し、そして
ｃ）ヒトＦＰＰＳの第１のおよび第２の結合部位に結合するリガンドを設計するために、該第１のリガンドと該第２のリガンドを連結する
段階を含む方法。
【請求項３１】
さらにヒトＦＰＰＳの第３の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合するリガンドを提供し、そして第１の、第２のおよび第３の結合部位に結合するリガンドを形成するために段階ｃ）で得られるリガンドに該第３のリガンドを連結する段階を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
段階ａ）での該第１のリガンドがＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
段階ｂ）での第２のリガンドがＧｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０、Ｇｌｎ９６、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０およびＡｓｐ２４３からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸および／またはＰｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項１−８のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ、請求項１４または１５に記載のヒトＦＰＰＳの結晶構造データを使用し、および／または請求項１６に記載の方法の使用により得られる、ヒトＦＰＰＳに対するリガンド。
【請求項３５】
ＦＰＰＳのリガンドまたは阻害剤である請求項３４に記載のリガンド。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載のリガンドを含む医薬組成物。
【請求項３７】
腫瘍誘発高カルシウム血症、骨のパジェット病、溶骨型転移、閉経後骨粗鬆症、低コレステロール血症および／または軟組織癌を処置および／または予防するための請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項１】
結晶性ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）およびその変異体。
【請求項２】
閉構造である請求項１に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項３】
ａ＝ｂ＝１１２ű２０Å、ｃ＝６６ű２０Å、または、より好ましくは、ａ＝ｂ＝１１２ű１０Åおよびｃ＝６６ű１０Åの単位格子定数を含む、請求項２に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項４】
開構造である請求項１に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項５】
ａ＝ｂ＝１１１ű２０Å、ｃ＝７７ű２０Å、または、より好ましくは、ａ＝ｂ＝１１１ű１０Åおよびｃ＝７７ű１０Åの単位格子定数を含む、請求項４に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項６】
リガンドとの複合体の請求項１から５のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項７】
リガンドがイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）および／またはゾレドロネートまたはパミドロネートから選択される請求項６に記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項８】
下記三次元構造：
ａ）図１４で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義される閉構造の三次元構造、
ｂ）図１５で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義される開構造の三次元構造、
ｃ）図１６、１７もしくは１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義される三次元構造、または
ｄ）ａ）、ｂ）もしくはｃ）に類似する構造
の１つを有する請求項１から７のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項９】
（ｉ）組み換えヒトＦＰＰＳを大腸菌で発現させ（ここで該組み換えヒトＦＰＰＳはアミノ酸断片６から３５３に対応する）、
（ｉｉ）発現したヒトＦＰＰＳを精製し、
（ｉｉｉ）精製ヒトＦＰＰＳを結晶化する
段階を含む、結晶性ヒトＦＰＰＳ生成物の製造法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって得られる結晶性ヒトＦＰＰＳ。
【請求項１１】
ヒトＦＰＰＳの結晶構造データの作成のための、請求項１から８および１０のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳの使用。
【請求項１２】
ヒトＦＰＰＳリガンド複合体の結晶構造データの作成のための、請求項６から７のいずれかに記載のリガンドとの結晶性ヒトＦＰＰＳ複合体の使用。
【請求項１３】
それぞれの結合部位を決定するための請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分により定義されるヒトＦＰＰＳの結晶構造。
【請求項１５】
ヒトＦＰＰＳ単独またはリガンドとの複合体の結晶構造。
【請求項１６】
ＦＰＰＳリガンドの設計、選択、同定および／または製造するための、請求項１−１０のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳおよび／または請求項１４または１５のいずれかに記載の結晶構造の使用。
【請求項１７】
コンピュータ利用モデリングプログラムをリガンド分子の選択および／または設計するために使用する請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
リガンドがヒトＦＰＰＳの結合ポケットに相補的である三次元構造を有する請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するようにリガンドが選択され、および／または設計される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するようにリガンドが選択され、および／または設計される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分を提供することを含むヒトＦＰＰＳの結晶構造の三次元表現を得、そして結晶構造の三次元表現を構築するために該構造座標を使用する方法。
【請求項２２】
ａ）請求項２１に記載のヒトＦＰＰＳの三次元表現を提供し、
ｂ）候補化合物の三次元表現を提供し、
ｃ）三次元表現がヒトＦＰＰＳの結合ポケットに相補的である候補化合物を選択し、そして、
ｄ）所望により溶解性、親和性、特異性および／または有効性のような物理学的特徴を最大化するために段階ｃ）で選択される該化合物を修飾する
段階を含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドの選択、設計および／または同定するためのコンピュータベースの方法。
【請求項２３】
Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８からなる群から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する中から該化合物が選択される、請求項２２に記載のコンピュータベースの方法。
【請求項２４】
Ｔｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する中から該化合物が選択される、請求項２２に記載のコンピュータベースの方法。
【請求項２５】
図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分を提供することを含むタンパク質の結晶構造を決定し、そして該タンパク質に関する結晶構造を提供するために、分子置換するために該構造座標を使用する方法。
【請求項２６】
データ記憶媒体とコンピュータ可読データを含むコンピュータ可読記憶媒体であって、該データは図１４、図１５、図１６、図１７および／または図１８で示される構造座標のすべての部分または選択された部分を含む媒体。
【請求項２７】
ａ．候補化合物とヒトＦＰＰＳを共結晶化またはインキュベートし、
ｂ．Ｘ線またはＮＭＲ法により候補化合物と相互作用するヒトＦＰＰＳのアミノ酸を決定し、
ｃ．段階ｂの結果に基づいて、Ｔｙｒ１０、Ｇｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｇｌｎ９６、Ｐｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０、Ｇｌｎ２４２、Ａｓｐ２４３、Ｌｅｕ２４６、Ｌｙｓ２５７、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７、Ｉｌｅ３４８からなる群の中から選択される結合ポケットの１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する化合物を選択する
ことを含む、ヒトＦＰＰＳに結合できるリガンドを選択するための方法。
【請求項２８】
該候補化合物が請求項２２または２４に記載の方法により同定されるものの中から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに
ｄ．物理学的特徴、例えば溶解性、親和性、特異性および／または有効性を最大化するために段階ｃ）で得られる化合物の類似体を設計し、
ｅ．ヒトＦＰＰＳに結合できる新規化合物を選択するために対応する類似体で請求項２７に記載の段階ａ．からｃ．を繰り返す
段階を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトＦＰＰＳへのリガンドを設計する方法であって、該方法が
ａ）ヒトＦＰＰＳの第１の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第１のリガンドを提供し、
ｂ）ヒトＦＰＰＳの第２の結合部位の少なくとも１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する第２のリガンドを提供し、そして
ｃ）ヒトＦＰＰＳの第１のおよび第２の結合部位に結合するリガンドを設計するために、該第１のリガンドと該第２のリガンドを連結する
段階を含む方法。
【請求項３１】
さらにヒトＦＰＰＳの第３の結合部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合するリガンドを提供し、そして第１の、第２のおよび第３の結合部位に結合するリガンドを形成するために段階ｃ）で得られるリガンドに該第３のリガンドを連結する段階を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
段階ａ）での該第１のリガンドがＴｙｒ１０、Ｌｙｓ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ６０、Ｔｈｒ６３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｈｅ２０６、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４２、Ｌｅｕ２４６、Ｌｅｕ３４４、Ｌｙｓ３４７およびＩｌｅ３４８からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
段階ｂ）での第２のリガンドがＧｌｙ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｒｇ６０、Ｇｌｎ９６、Ａｒｇ１１３、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｐｈｅ２３９、Ｇｌｎ２４０およびＡｓｐ２４３からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸および／またはＰｈｅ９９、Ｌｅｕ１００、Ａｓｐ１０３、Ａｓｐ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｈｒ１６７、Ｇｌｎ１７１、Ｌｙｓ２００、Ｔｈｒ２０１、Ｔｙｒ２０４、Ｇｌｕ２４０、Ａｓｐ２４３およびＬｙｓ２５７からなる群の中から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用するリガンドの中から選択される、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項１−８のいずれかに記載の結晶性ヒトＦＰＰＳ、請求項１４または１５に記載のヒトＦＰＰＳの結晶構造データを使用し、および／または請求項１６に記載の方法の使用により得られる、ヒトＦＰＰＳに対するリガンド。
【請求項３５】
ＦＰＰＳのリガンドまたは阻害剤である請求項３４に記載のリガンド。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載のリガンドを含む医薬組成物。
【請求項３７】
腫瘍誘発高カルシウム血症、骨のパジェット病、溶骨型転移、閉経後骨粗鬆症、低コレステロール血症および／または軟組織癌を処置および／または予防するための請求項３６に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１４−４】
【図１４−５】
【図１４−６】
【図１４−７】
【図１４−８】
【図１４−９】
【図１４−１０】
【図１４−１１】
【図１４−１２】
【図１４−１３】
【図１４−１４】
【図１４−１５】
【図１４−１６】
【図１４−１７】
【図１４−１８】
【図１４−１９】
【図１４−２０】
【図１４−２１】
【図１４−２２】
【図１４−２３】
【図１４−２４】
【図１４−２５】
【図１４−２６】
【図１４−２７】
【図１４−２８】
【図１４−２９】
【図１４−３０】
【図１４−３１】
【図１４−３２】
【図１４−３３】
【図１４−３４】
【図１４−３５】
【図１４−３６】
【図１４−３７】
【図１４−３８】
【図１４−３９】
【図１４−４０】
【図１４−４１】
【図１４−４２】
【図１４−４３】
【図１４−４４】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１５−３】
【図１５−４】
【図１５−５】
【図１５−６】
【図１５−７】
【図１５−８】
【図１５−９】
【図１５−１０】
【図１５−１１】
【図１５−１２】
【図１５−１３】
【図１５−１４】
【図１５−１５】
【図１５−１６】
【図１５−１７】
【図１５−１８】
【図１５−１９】
【図１５−２０】
【図１５−２１】
【図１５−２２】
【図１５−２３】
【図１５−２４】
【図１５−２５】
【図１５−２６】
【図１５−２７】
【図１５−２８】
【図１５−２９】
【図１５−３０】
【図１５−３１】
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【図１５−３３】
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【図１５−３５】
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【図１５−３７】
【図１５−３８】
【図１５−３９】
【図１５−４０】
【図１５−４１】
【図１５−４２】
【図１５−４３】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１６−４】
【図１６−５】
【図１６−６】
【図１６−７】
【図１６−８】
【図１６−９】
【図１６−１０】
【図１６−１１】
【図１６−１２】
【図１６−１３】
【図１６−１４】
【図１６−１５】
【図１６−１６】
【図１６−１７】
【図１６−１８】
【図１６−１９】
【図１６−２０】
【図１６−２１】
【図１６−２２】
【図１６−２３】
【図１６−２４】
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【図１６−２６】
【図１６−２７】
【図１６−２８】
【図１６−２９】
【図１６−３０】
【図１６−３１】
【図１６−３２】
【図１６−３３】
【図１６−３４】
【図１６−３５】
【図１６−３６】
【図１６−３７】
【図１６−３８】
【図１６−３９】
【図１６−４０】
【図１６−４１】
【図１６−４２】
【図１６−４３】
【図１６−４４】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１７−４】
【図１７−５】
【図１７−６】
【図１７−７】
【図１７−８】
【図１７−９】
【図１７−１０】
【図１７−１１】
【図１７−１２】
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【図１７−１４】
【図１７−１５】
【図１７−１６】
【図１７−１７】
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【図１７−２０】
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【図２０−１】
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【図２０−１０】
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【図２】
【図３】
【図４】
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【図８】
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【図１０】
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【図１４−１】
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【図１４−１０】
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【図１５−１】
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【図１５−４１】
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【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１６−４】
【図１６−５】
【図１６−６】
【図１６−７】
【図１６−８】
【図１６−９】
【図１６−１０】
【図１６−１１】
【図１６−１２】
【図１６−１３】
【図１６−１４】
【図１６−１５】
【図１６−１６】
【図１６−１７】
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【図１６−２０】
【図１６−２１】
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【図１６−２５】
【図１６−２６】
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【図１６−３０】
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【図１６−３２】
【図１６−３３】
【図１６−３４】
【図１６−３５】
【図１６−３６】
【図１６−３７】
【図１６−３８】
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【図１６−４０】
【図１６−４１】
【図１６−４２】
【図１６−４３】
【図１６−４４】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１７−４】
【図１７−５】
【図１７−６】
【図１７−７】
【図１７−８】
【図１７−９】
【図１７−１０】
【図１７−１１】
【図１７−１２】
【図１７−１３】
【図１７−１４】
【図１７−１５】
【図１７−１６】
【図１７−１７】
【図１７−１８】
【図１７−１９】
【図１７−２０】
【図１７−２１】
【図１７−２２】
【図１７−２３】
【図１７−２４】
【図１７−２５】
【図１７−２６】
【図１７−２７】
【図１７−２８】
【図１７−２９】
【図１７−３０】
【図１７−３１】
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【図１７−３４】
【図１７−３５】
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【図１７−３７】
【図１７−３８】
【図１７−３９】
【図１７−４０】
【図１７−４１】
【図１７−４２】
【図１７−４３】
【図１７−４４】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１８−４】
【図１８−５】
【図１８−６】
【図１８−７】
【図１８−８】
【図１８−９】
【図１８−１０】
【図１８−１１】
【図１８−１２】
【図１８−１３】
【図１８−１４】
【図１８−１５】
【図１８−１６】
【図１８−１７】
【図１８−１８】
【図１８−１９】
【図１８−２０】
【図１８−２１】
【図１８−２２】
【図１８−２３】
【図１８−２４】
【図１８−２５】
【図１８−２６】
【図１８−２７】
【図１８−２８】
【図１８−２９】
【図１８−３０】
【図１８−３１】
【図１８−３２】
【図１８−３３】
【図１８−３４】
【図１８−３５】
【図１８−３６】
【図１８−３７】
【図１８−３８】
【図１８−３９】
【図１８−４０】
【図１８−４１】
【図１８−４２】
【図１８−４３】
【図１８−４４】
【図１８−４５】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２０−３】
【図２０−４】
【図２０−５】
【図２０−６】
【図２０−７】
【図２０−８】
【図２０−９】
【図２０−１０】
【図２０−１１】
【図２０−１２】
【図２０−１３】
【図２０−１４】
【図２０−１５】
【図２０−１６】
【図２０−１７】
【図２０−１８】
【図２０−１９】
【図２０−２０】
【図２０−２１】
【図２０−２２】
【図２０−２３】
【図２０−２４】
【図２０−２５】
【図２０−２６】
【図２０−２７】
【図２０−２８】
【図２０−２９】
【図２０−３０】
【図２０−３１】
【図２０−３２】
【図２０−３３】
【図２０−３４】
【図２０−３５】
【図２０−３６】
【図２０−３７】
【図２０−３８】
【図２０−３９】
【図２０−４０】
【図２０−４１】
【図２０−４２】
【図２０−４３】
【図２０−４４】
【図２０−４５】
【図２０−４６】
【公表番号】特表２００８−５２６１８５（Ｐ２００８−５２６１８５Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８８３２（Ｐ２００７−５４８８３２）
【出願日】平成１８年１月２日（２００６．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００００２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７２５６１
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２日（２００６．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００００２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７２５６１
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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