ヒトＧタンパク質ケモカインレセプターＨＤＧＮＲ１０
【課題】免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態を処置および／または診断するための組成物および方法を提供すること。
【解決手段】新規の成熟レセプターポリペプチドならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体（ここで、本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である）、あるいは、本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単離された核酸分子（この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメントを含む）。
【解決手段】新規の成熟レセプターポリペプチドならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体（ここで、本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である）、あるいは、本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単離された核酸分子（この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメントを含む）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ケモカインレセプターとして推定的に同定されたヒトの７−膜貫通型レセプターであり、本明細書では、今後、ときには「Ｇタンパク質ケモカインレセプター」または「ＨＤＧＮＲ１０」という。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【背景技術】
【０００２】
医学的に重要な多数の生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは、十分に確立されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これらのタンパク質のいくつかの例は、ＧＰＣレセプター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミンに対するＧＰＣレセプター（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４６−５０（１９８７）；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：６５０−６５６（１９８７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７８３−７８７（１９８８）））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュエータータンパク質（ａｃｔｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８０２−８（１９９１））を含む。
【０００３】
例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴＰはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、ＧＴＰを結合ＧＤＰに変換することが示された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。
【０００４】
Ｇタンパク質共役レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定膜貫通ドメインを有するものとして特徴づけられている。このドメインは、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられる。Ｇタンパク質共役レセプターは、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経レセプターのような広範囲の生物学的に活性なレセプターを含む。
【０００５】
Ｇタンパク質共役レセプターは、少なくとも８つの開放性の親水性ループと結合する、約２０〜３０アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲を含むものとして特徴づけられている。共役レセプターのＧタンパク質ファミリーは、精神病および神経学的な疾病の治療に用いる神経弛緩薬に結合するドーパミンレセプターを含む。このファミリーの他の例は、カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、
ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子１レセプターおよびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルスレセプターなどを含む。
【０００６】
Ｇタンパク質共役レセプターは、ヘテロ三量体のＧタンパク質により種々の細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃ．，Ｒｅｖ．，１０：３１７−３３１（１９８９）を参照のこと）。異なるＧタンパク質のαサブユニットは好ましくは、細胞内で種々の生物学的機能を調節するための特定のエフェクターを刺激する。Ｇタンパク質共役レセプターの細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役レセプターのＧタンパク質共役の調整のための重要な機構として同定された。Ｇタンパク質共役レセプターは、哺乳動物宿主内において多くの部位で見出される。
【０００７】
ケモカインは、インタークリンサイトカイン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）としてもいわれるが、構造的および機能的に関連したサイトカインのサブファミリーである。これらの分子は８〜１０ｋｄのサイズである。一般的に、ケモカインは２０％〜７５％のアミノ酸レベルの相同性を示し、そして２つのジスフィルド結合を形成する４つの保存されたシステイン残基により特徴付けられる。最初の２つのシステイン残基の配置に基づいて、ケモカインは、αおよびβの２つのサブファミリーに分類される。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステインは１アミノ酸により分離され、そして今後「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーといわれる。βサブファミリーにおいて；この２つのシステインは連接した位置にあり、それゆえ、「Ｃ−Ｃ」サブファミリーといわれる。このように、このファミリーの少なくとも９つの異なったメンバーがヒトにおいて同定されている。
【０００８】
インタークリンサイトカインは、多岐にわたる種々の機能を示す。顕著な特徴は、単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および腺維芽細胞を含む、異なる細胞型の走化性移動を誘導する能力である。多くのサイトカインは前炎症性活性を有し、そして炎症性反応の間に複数の段階に関与する。これらの活性は、ヒスタミン放出の刺激、リソソーム酵素およびロイコトリエンの放出、標的免疫細胞の内皮細胞への接着性の増大、補体タンパク質の結合の増強、顆粒細胞接着分子および補体レセプターの発現誘導、および呼吸爆発を含む。炎症におけるそれらの関連に加えて、あるケモカインは他の活性を示すことが示唆されてきた。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ−１）は造血幹細胞の増殖を抑制し得、血小板因子４（ＰＦ−４）は内皮細胞増殖の潜在的阻害剤であり、インターロイキン８（ＩＬ−８）はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてＧＲＯはメラノーマ細胞のオートクリン増殖因子である。
【０００９】
広範な生物学的活性において、ケモカインが、リンパ球のさまよい（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、創傷治癒、造血調節ならびにアレルギー、喘息および関節炎のような免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態において、関与することは驚くべきことではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態を、診断および／または治療する組成物および方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの局面によれば、新規の成熟レセプターポリペプチドならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供さ
れる。本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメントを含む。
【００１３】
本発明のさらなる局面によれば、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核宿主細胞および／または組換え真核宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術により、このようなレセプターポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。
【００１４】
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供される。
【００１５】
本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そして活性化するが、または活性化を阻害する化合物のためのスクリーニング方法が提供される。
【００１６】
本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そして活性化する化合物を宿主に投与する工程が提供される。この化合物は、造血、創傷治癒、凝固、新脈管形成の刺激に有用であり、固体腫瘍、慢性感染、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染、乾癬を処置し、そして増殖因子活性を刺激する。
【００１７】
本発明の別の局面によれば、ポリペプチドの過少発現、またはレセプターポリペプチドのリガンドの過少発現に関連した状態を処置するための遺伝子治療を介した、本発明のレセプターポリペプチドを投与する方法が提供される。
【００１８】
本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、その活性化を阻害する化合物を宿主に投与する工程が提供される。この化合物は、アレルギー、アテローム発生、過敏症、悪性腫瘍、慢性および急性の炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性発熱、骨髄不全、珪肺症、類肉腫類、慢性関節リウマチ、ショックおよび好酸球増多症候群の予防および／または処置に有用である。
【００１９】
本発明のなお別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするために十分な長さの核酸分子を含有する核酸プローブが提供される。
【００２０】
本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関連する疾患を検出するため、ならびにこのレセプターポリペプチドの可溶型の変化したレベルを検出するための診断アッセイが提供される。
【００２１】
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロ目的のために利用するためのプロセスが提供される。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
【００２３】
添付の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして特許請求の範囲により包含されるように、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、広範な生物学的活性において、ケモカインが関与する、リンパ球のさまよい（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、創傷治癒、造血調節ならびにアレルギー、喘息および関節炎のような免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態を処置および／または診断するための組成物および方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の局面によれば、図１〜３の推定のアミノ酸配列（配列番号：２）を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年６月１日にＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ２０８５２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａに寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドはヒト単球由来のｃＤＮＡライブラリーで発見された。これは構造的にＧタンパク質共役レセプターファミリーに関連する。これは、３５２アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、３４７アミノ酸の範囲にわたり、ヒトＭＣＰ−１レセプターに対して７０．１％の同一性および８２．９％の類似性を有する最高度の相同性を示す。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包む）の形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１〜３（配列番号：１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１〜３（配列番号：１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【００２８】
図１〜３の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、ならびに膜貫通（ＴＭ）または細胞内ドメインのようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および任意のさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’非コード配列）。
【００２９】
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００３０】
本発明はさらに、図１〜３の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００３１】
従って、本発明は、図１〜３（配列番号：２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１〜３（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を包含する。
【００３２】
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１〜３（配列番号：１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００３３】
このポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのＴＭおよび細胞内ドメインから切断されたポリペプチドの細胞外の一部分であるＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの可溶型をコードし得る。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００３５】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（リーダーおよびトレイラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００３６】
本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長のｃＤＮＡを単離するための、およびこの遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、そして例えば、５０またはそれ以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、全長の転写産物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を使用することにより、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補する配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、このプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーニングするために使用される。
【００３７】
本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜３（配列番号：１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。
【００３８】
あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましくは５０塩基を有し得る。これらは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、本明細書上記のように、それに対する同一性を有し、そして活性を保持してもよいし、または保持しなくてもよい。例えば、このようなポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌクレオチドの回収のために配列番号：１のポリヌクレオチドのプローブとして、あるいは診断プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【００３９】
従って、本発明は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、配列番号：２のポリヌクレオチドならびにそのフラグメントをコードし、このフラグメントは少なくとも３０塩基、そして好ましくは５０塩基である。そして本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドに関する。
【００４０】
本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。
【００４１】
本発明はさらに、図１〜３（配列番号：２）の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの、アナログおよび誘導体に関する。
【００４２】
用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１〜３のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、Ｇタンパク質ケモカインレセプターとしての機能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがＧタンパク質ケモカインレセプター（例えば、このレセプターの可溶型）として機能しないとしても、リガンドまたはレセプターに結合する能力を保持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００４４】
図１〜３（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物
と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製のために成熟ポリペプチドに融合されているもの、あるいは（ｖ）ポリペプチドのフラグメントが可溶であり（すなわち膜結合でない）、なおさらに膜結合レセプターにリガンドを結合するものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
【００４５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、配列番号：２（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号：２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性（好ましくは７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと９０％の類似性（より好ましくは９０％の同一性）、そして、さらにより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと９５％の類似性（さらにより好ましくは９０％の同一性）有するポリペプチド、および一般的に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプチドの一部分に対するポリペプチドを含む。
【００４７】
当該分野に公知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列およびの保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。
【００４８】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。
【００４９】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（「リーダー」および「トレイラー」）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００５０】
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され得る。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、配列番号：２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号：２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、そしてさらにより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして、また一般的に少なくとも３０アミノ酸そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプチドの一部分を含む。
【００５２】
当該分野に公知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチド
の配列に対して、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。
【００５３】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。
【００５４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【００５５】
宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。
【００５７】
適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。
【００５８】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰＬプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。
【００５９】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
【００６０】
本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるた
めに用いられ得る。
【００６１】
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００６２】
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。
【００６３】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られた細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。
【００６４】
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。
【００６５】
宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
【００６６】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００６７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のｂｐ１００〜２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００６８】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間または細胞外の培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００６９】
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
【００７０】
代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。
【００７１】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【００７２】
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【００７３】
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。
【００７４】
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列を含有する。ＳＶ４０スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。
【００７５】
Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドは、以下を包含する方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得る。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るし、またはグリコシル化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として使用され得る。
【００７８】
本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターは、本発明のレセプターポリペプチドの活性化化合物（アゴニスト）または活性化阻害化合物（アンタゴニスト）のスクリーニングのためのプロセスにおいて使用され得る。
【００７９】
一般的に、このようなスクリーニング手法は、本発明のレセプターポリペプチドを細胞表面で発現する適切な細胞の提供を含む。このような細胞は、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、またはＥ．Ｃｏｌｉ由来の細胞を含む。特に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞をトランスフェクトし、それにより、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを発現する。次いで、この発現したレセプターを、結合、刺激または機能的応答の阻害を観察するために試験化合物と接触させる。
【００８０】
１つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターを発現するためにトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスクリーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０（１９９２年２月６日公開）に記載される。
【００８１】
従って、例えば、このようなアッセイは、スクリーニングされるべきレセプターリガンドおよび化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞とを接触することにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナルの阻害は、化合物がこのレセプター
の潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レセプターの活性化を阻害することを示す。
【００８２】
このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされる化合物とを接触させることによりレセプターを活性化する化合物を決定するために用いられ得、かつこのような化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、すなわち、このような化合物がレセプターを活性化するか否かを決定するために用いられ得る。
【００８３】
他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１８１〜２９６頁（１９８９年１０月）に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外のｐＨ変化を測定する系において、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を包含する。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）が、潜在的化合物がレセプターを活性化または阻害するか否かを決定するために測定され得る。
【００８４】
別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質ケモカインレセプターをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させることを包含する。レセプターの活性化を阻害すると思われる化合物をスクリーニングする場合、次いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスクリーニングされる化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出が行われる。
【００８５】
別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているＧタンパク質ケモカインレセプターの発現を包含する。このような細胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。スクリーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパーゼの２次シグナルによるレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得る。
【００８６】
別の方法は、標識リガンドの細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することによる、本発明のアンタゴニストのレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物のスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質ケモカインレセプターをコードするＤＮＡで真核細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射活性により標識され得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例えば、レセプターの放射活性の測定により測定される。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定されるように化合物がレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。
【００８７】
抗体は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプター、またはいくつかの場合は、Ｇタンパク質ケモカインレセプターに結合するが、Ｇタンパク質ケモカインレセプターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を惹起しないオリゴヌクレオチドを拮抗し得る。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合する独特の決定子を認識する抗イディオタイプ抗体を包含する。潜在的なアンタゴニスト化合物もまた、Ｇタンパク質ケモカインレセプターのリガンドに密接に関連するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機能を欠失しており、そしてＧタンパク質ケモカインレセプターに結合するときに応答を惹起しない。
【００８８】
アンチセンス技術の使用により調製されるアンチセンス構築物は、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介した遺伝子発現を制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに基づい
ている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的に設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質ケモカインレセプターの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＧタンパク質結合レセプターへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、Ｇタンパク質ケモカインレセプターの産生を阻害するためにインビボで発現され得る。
【００８９】
例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子のような、正常な生物学的活性を阻害するようなリガンドへの接近を不可能にするＧタンパク質ケモカインレセプターに結合する小分子もまた、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害するために用いられ得る。
【００９０】
Ｇタンパク質ケモカインレセプターの可溶性形態（例えば、レセプターのフラグメント）は、本発明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そして膜結合Ｇタンパク質ケモカインレセプターとの相互作用からリガンドを保護することによりレセプターの活性化を阻害するために用いられ得る。
【００９１】
本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターに結合し、かつそれを活性化する化合物は、造血（ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）、創傷癒合、凝固、血管形成を刺激するために、固形腫瘍、慢性感染、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染、乾癬を処置し、そして増殖因子の活性を刺激するために使用され得る。
【００９２】
本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターに結合し、かつそれを阻害する化合物は、アレルギー、アテローム発生、過敏性、悪性、慢性および急性炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性熱、骨髄不全、珪肺症、サルコイドーシス、慢性関節リウマチ、ショックおよび好酸球増他症候群を処置するために使用され得る。
【００９３】
化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。
【００９４】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、本発明の化合物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。
【００９５】
薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮
内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異症状の処置および／または予防に効果的な量で投与され得る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮される（ＣＯＮＦＩＲＭ ＤＯＳＡＧＥＳ）。
【００９６】
Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドおよびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらはポリペプチドである）はまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
【００９７】
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【００９８】
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。
【００９９】
本明細書中上記の、誘導され得るレトロウイルスプラスミドベクター由来のレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、脊髄増殖肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスより誘導される。
【０１００】
ベクターは、１またはそれ以上のプロモーターを含有する。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、９号、９８０−９９０（１９８９）に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを包含するが、これらに限定しない真核細胞プロモーターのような細胞プロモーター）を包含するが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる技術より当業者にとって明らかである。
【０１０１】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、以下を包含するが、これらに限定されない：アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロ
モーターのような誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；ヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中上記の修飾したレトロウイルスＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；およびヒト増殖ホルモンプロモーター。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。
【０１０２】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入するために使用され、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、および本明細書中で全体で参考として援用されるＭｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，第１巻、５−１４頁（１９９０）に記載されるＤＡＮ細胞株を包含するが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手法を通じてパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手法は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱を包含するが、これらに限定されない。１つの他の方法においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム内にカプセル化され得るか、または脂質と結合し、次いで宿主に投与され得る。
【０１０３】
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を包含する感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロ、またはインビボのいずれかにおいて真核細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞、および造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、ならびに気管支の上皮細胞を包含するが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明はまた、Ｇタンパク質ケモカインレセプターに結合し得ることが知られていないリガンドが、このようなレセプターに結合し得るかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、リガンドのＧタンパク質ケモカインレセプターへのリガンドの結合を許容する条件下でＧタンパク質ケモカインレセプターを発現する哺乳類細胞をリガンドと接触させる工程、レセプターに結合したリガンドの存在を検出する工程、およびこれにより、リガンドがＧタンパク質ケモカインレセプターに結合するかどうかを決定する工程を包含する。本明細書中に上記のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するためのシステムは、レセプターに結合するリガンドを決定するためにも使用され得る。
【０１０５】
本発明はまた、レセプターをコードするｍＲＮＡの存在を検出することにより、細胞の表面における本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの発現を検出する方法を提供し、この方法は、細胞から全ｍＲＮＡを獲得する工程、および獲得したｍＲＮＡを、レセプターをコードする核酸分子の配列に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１０ヌクレオチドの核酸分子を含有する核酸プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出する工程、およびそれによって細胞によるレセプターの発現を検出する工程を包含する。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに関連するレセプターを同定するための方法を提供する。これらの関連レセプターは、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドに対する相同性により、低ストリンジェンシーなクロスハイブリダイゼーションにより、または関連する天然あるいは合成のリガンドと相互作用するか、およびまたは本発明のケモカインレセプターポリペプチドの遺伝的あるいは薬学的遮断後に類似
の挙動を惹起するレセプターを同定することにより、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドに対する相同性により同定され得る。
【０１０７】
遺伝子のフラグメントは、本発明の遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、および最も好ましくは少なくとも５０塩基またはそれ以上である。プローブはまた、完全長の転写産物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを包含する本発明の完全な遺伝子を含有するゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。このタイプのスクリーンの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知のＤＮＡ配列を用いて遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして使用される。
【０１０８】
本発明はまた、診断薬としての本発明の遺伝子の使用を意図する。例えば、いくつかの疾患は、遺伝した欠損遺伝子により生じる。これらの遺伝子は、欠損遺伝子の配列を正常な遺伝子の配列と比較して検出され得る。結果的に、「変異」遺伝子は、異常なレセプター活性と関連することが証明され得る。さらに、変異を実証および同定するためのさらに別の手段として変異レセプター遺伝子を、機能的なアッセイシステム（例えば、ＨＥＫ２９３細胞のレセプター欠損株における、比色定量アッセイ、ＭａｃＣｏｎｋｅｙプレート上での発現、相補性試験）において発現させるために、適切なベクターに挿入し得る。一旦「変異」遺伝子が同定されると、次いで「変異」レセプター遺伝子のキャリアの集団がスクリーニングされ得る。
【０１０９】
本発明の遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検物質を包含する患者の細胞より得られ得るが、これらに限定されない。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用され得、または分析前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６ （１９８６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡもまた、また同じ目的のために使用され得る。例として、本発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、本発明の遺伝子の変異を同定および解析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、放射性標識された本発明のＲＮＡまたは、あるいは、放射性標識された本発明のアンチセンスＤＮＡ配列に、増幅させたＤＮＡをハイブリダイズさせることにより検出され得る。完全に対合した配列は、リボヌクレアーゼＡ消化または融解温度の差により、誤対合した二重らせんから区別され得る。このような診断は、出生前試験または新生児の試験のために特に有用である。
【０１１０】
関連遺伝子と「変異」遺伝子との間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは、特異的ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いられ得る。この方法の感受性は、ＰＣＲと組み合わせる場合に大きく増強される。例えば、配列プライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより生成された一本鎖テンプレート分子と共に用いられる。配列決定は、放射性標識されたヌクレオチドを用いた従来の方法により、または蛍光タグを用いた自動配列決定法により行われる。
【０１１１】
ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成され得る。特定
の位置で配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）））により明らかにされ得る。
【０１１２】
さらに、いくつかの疾患は、ｍＲＮＡにおける変化により検出され得る遺伝子発現における変化の結果であるか、またはこれにより特徴づけられる。あるいは、本発明の遺伝子は、このタイプのレセプターに関連する機能の低下を発現する個体を同定するための参考として用いられ得る。
【０１１３】
本発明はまた、種々の組織における本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出するために用いられるアッセイは、当業者において周知であり、そして放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析、および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイを包含する。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡアッセイは、最初に、Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの抗原に対して特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レセプター抗体は、モノクローナル抗体に対して調製される。レセプター抗体には、例えば放射活性、蛍光、または本実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような、検出可能な薬剤が付着される。サンプルは、次に宿主から除去され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体の支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、例えばウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質と共にインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体をこのディッシュ中でインキュベートし、その間、モノクローナル抗体が、ポリスチレンディッシュに付着した任意のＧタンパク質ケモカインレセプタータンパク質に結合する。全ての未結合モノクローナル抗体を緩衝液で洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したレセプター抗体は、次にディッシュ内に置かれ、Ｇタンパク質ケモカインレセプタータンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体に対するレセプター抗体の結合が生じる。次いで、未結合レセプター抗体は洗浄される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加され、そして所定の時間間隔で現れた色の量は、標準曲線と比較すると、所定容量の患者のサンプル中に存在するＧタンパク質ケモカインレセプタータンパク質の量の測定である。
【０１１５】
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。
【０１１６】
簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【０１１７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。
【０１１８】
ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５０または６０塩基という短いｃＤＮＡで使用され得る。この技術の総説としては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０１１９】
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎに見出される（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１２０】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１２１】
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、そして２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する。）
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。
【０１２２】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
【０１２３】
モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
【０１２４】
単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。
【０１２５】
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０１２６】
以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載される。
【０１２７】
「プラスミド」は、小文字のｐの前および／またはそれに続く大文字および／または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常明らかである。
【０１２８】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０１２９】
切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０１３０】
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【０１３１】
「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０１３２】
記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載のように実施され
た。
【実施例】
【０１３３】
（実施例１ ＨＤＧＮＲ１０の細菌発現および精製）
ＨＤＧＮＲ１０をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号）を、プロセスされたＨＤＧＮＲ１０タンパク質の５’配列（シグナルペプチド配列を除く）およびＨＤＧＮＲ１０遺伝子に対して３’のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。ＨＤＧＮＲ１０に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に添加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡ３’を有し、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位、それに続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まる１８ヌクレオチドのＨＤＧＮＲ１０コード配列を含む。３’配列、５’ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴ３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に相補的な配列を含み、そして続いてＨＤＧＮＲ１０のコード配列の１８ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ． ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。増幅配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を有するフレーム内に挿入した。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与するプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含む。形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の比で大きな培養物に接種する。細胞を、６００の光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４と０．６との間になるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にした。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏを解放（ｃｌｅａｒ）し遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収穫した。細胞ペレットをカオトロピズムの薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化した。澄明後、可溶化されたＨＤＧＮＲ１０を６−ヒスタグを含有するタンパク質により堅く結合させる条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８４）。ＨＤＧＮＲ１０を６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１２時間のインキュベーションの後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析した。
【０１３４】
（実施例２ ＣＯＳ細胞における組換えＨＤＧＮＲ１０の発現）
プラスミドの発現、ＨＤＧＮＲ１０ ＨＡを、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは以下を含有する：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンそしてポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーター
。完全なＨＤＧＮＲ１０前駆体、およびその３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーター下で支配される。ＨＡタグは、先に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，Ｃｅｌｌ ３７，７６７）。標的タンパク質へのＨＡタグの融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。
【０１３５】
プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する：
ＨＤＧＮＲ１０をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号）を、２つのプライマーを用いたＰＣＲにより構築した：５’プライマー５’ＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡ３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、それに続く開始コドンから始まるＨＤＧＮＲ１０コード配列の１８ヌクレオチドを含む；３’配列５’ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣ３’は、ＸｈｏＩ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およびＨＤＧＮＲ１０コード配列の最後の１８ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、インフレーム融合したＨＡタグが続くＨＤＧＮＲ１０コード配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびＸｈｏＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素により消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験した。組換えＨＤＧＮＲ１０の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により発現ベクターでトランスフェクトした（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。ＨＤＧＮＲ１０ ＨＡタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフェクションの２日後、３５Ｓ−システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上 ３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体により沈降させた。沈降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０１３６】
（実施例３ バキュロウイルス発現系を用いるＨＤＧＮＲ１０のクローニングおよび発現）
全長のＨＤＧＮＲ１０タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号）を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
【０１３７】
５’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡ３’を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４ヌクレオチド（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７
，１９６，９４７−９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、およびその直後の、ＨＤＧＮＲ１０遺伝子の最初の１８ヌクレオチド（翻訳開始コドンは「ＡＴＧ」である）を含む。
【０１３８】
３’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴ３’を有し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの切断部位およびＨＤＧＮＲ１０遺伝子の３’非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、そして上記のように精製した。このフラグメントを、Ｆ２と称する。
【０１３９】
ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるＨＤＧＮＲ１０タンパク質の発現のために用いる（総説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わりに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。
【０１４０】
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、上記のようにＤＮＡを１％アガロースゲルより単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と称する。
【０１４１】
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＨＤＧＮＲ１０遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃＨＤＧＮＲ１０）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４２】
５μｇのプラスミドｐＢａｃＨＤＧＮＲ１０を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．０μｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともにコトランスフェクトした。
【０１４３】
１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＨＤＧＮＲ１０を、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プ
レート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続けた。
【０１４４】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０１４５】
ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染するために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。
【０１４６】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱失活化ＦＢＳを補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＨＤＧＮＲ１０で感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１４７】
（実施例４ 遺伝子治療を介する発現）
線維芽細胞を、被験者から皮膚生検によって獲得した。得られた組織を組織培養培地中に入れ、そして小さい切片に分けた。組織の小さな切片は、組織培養フラスコの湿った表面上に置かれ、各フラスコ中に約１０切片を入れる。フラスコを上下に回転させ、しっかりと密閉し、室温に一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆転させ、そして組織切片をフラスコの底に固定したまま維持し、そして新鮮な培地（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）を添加する。次いで、これを３７℃で約１週間インキュベートする。このとき、新鮮な培地を添加し、そしてその後数日ごとに交換する。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単層が生じる。単層をトリプシン化し、そしてより大きなフラスコに大きく（ｓｃａｌｅ）する。
【０１４８】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そして次いで仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分離し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
【０１４９】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列の対応するＰＲＣプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有し、そして３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格、ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を、細菌ＨＢ１０１の形質転換のために使用し、次いで、これを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナマイシンを含むアガープレート上にプレートする。
【０１５０】
両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）における組織培養中で、集密的密度に増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターにより形質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を包含する感染性ウイルス粒子を産生する（この時点でパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。
【０１５１】
新鮮な培地を形質導入プロデューサー細胞に添加し、その後、集密的プロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む消費された培地を、ミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通してフィルター濾過し、分離したプロデューサー細胞を除去し、そして次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブ集密的プレートから除去し、そして迅速にプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、またはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。
【０１５２】
次いで、操作された線維芽細胞は、単独、あるいはサイトデックス３マイクロキャリアービーズ上で集密的に増殖させた後のいずれかで宿主に注入される。その後、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
【０１５３】
本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、従って、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】本発明のＧタンパク質共役レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列を示す図である。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターとヒトＭＣＰ−１レセプターとの間のアミノ酸配列のアライメントを例示する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ケモカインレセプターとして推定的に同定されたヒトの７−膜貫通型レセプターであり、本明細書では、今後、ときには「Ｇタンパク質ケモカインレセプター」または「ＨＤＧＮＲ１０」という。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【背景技術】
【０００２】
医学的に重要な多数の生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは、十分に確立されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これらのタンパク質のいくつかの例は、ＧＰＣレセプター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミンに対するＧＰＣレセプター（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４６−５０（１９８７）；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：６５０−６５６（１９８７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７８３−７８７（１９８８）））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュエータータンパク質（ａｃｔｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８０２−８（１９９１））を含む。
【０００３】
例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴＰはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、ＧＴＰを結合ＧＤＰに変換することが示された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。
【０００４】
Ｇタンパク質共役レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定膜貫通ドメインを有するものとして特徴づけられている。このドメインは、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられる。Ｇタンパク質共役レセプターは、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経レセプターのような広範囲の生物学的に活性なレセプターを含む。
【０００５】
Ｇタンパク質共役レセプターは、少なくとも８つの開放性の親水性ループと結合する、約２０〜３０アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲を含むものとして特徴づけられている。共役レセプターのＧタンパク質ファミリーは、精神病および神経学的な疾病の治療に用いる神経弛緩薬に結合するドーパミンレセプターを含む。このファミリーの他の例は、カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、
ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子１レセプターおよびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルスレセプターなどを含む。
【０００６】
Ｇタンパク質共役レセプターは、ヘテロ三量体のＧタンパク質により種々の細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃ．，Ｒｅｖ．，１０：３１７−３３１（１９８９）を参照のこと）。異なるＧタンパク質のαサブユニットは好ましくは、細胞内で種々の生物学的機能を調節するための特定のエフェクターを刺激する。Ｇタンパク質共役レセプターの細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役レセプターのＧタンパク質共役の調整のための重要な機構として同定された。Ｇタンパク質共役レセプターは、哺乳動物宿主内において多くの部位で見出される。
【０００７】
ケモカインは、インタークリンサイトカイン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）としてもいわれるが、構造的および機能的に関連したサイトカインのサブファミリーである。これらの分子は８〜１０ｋｄのサイズである。一般的に、ケモカインは２０％〜７５％のアミノ酸レベルの相同性を示し、そして２つのジスフィルド結合を形成する４つの保存されたシステイン残基により特徴付けられる。最初の２つのシステイン残基の配置に基づいて、ケモカインは、αおよびβの２つのサブファミリーに分類される。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステインは１アミノ酸により分離され、そして今後「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーといわれる。βサブファミリーにおいて；この２つのシステインは連接した位置にあり、それゆえ、「Ｃ−Ｃ」サブファミリーといわれる。このように、このファミリーの少なくとも９つの異なったメンバーがヒトにおいて同定されている。
【０００８】
インタークリンサイトカインは、多岐にわたる種々の機能を示す。顕著な特徴は、単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および腺維芽細胞を含む、異なる細胞型の走化性移動を誘導する能力である。多くのサイトカインは前炎症性活性を有し、そして炎症性反応の間に複数の段階に関与する。これらの活性は、ヒスタミン放出の刺激、リソソーム酵素およびロイコトリエンの放出、標的免疫細胞の内皮細胞への接着性の増大、補体タンパク質の結合の増強、顆粒細胞接着分子および補体レセプターの発現誘導、および呼吸爆発を含む。炎症におけるそれらの関連に加えて、あるケモカインは他の活性を示すことが示唆されてきた。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ−１）は造血幹細胞の増殖を抑制し得、血小板因子４（ＰＦ−４）は内皮細胞増殖の潜在的阻害剤であり、インターロイキン８（ＩＬ−８）はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてＧＲＯはメラノーマ細胞のオートクリン増殖因子である。
【０００９】
広範な生物学的活性において、ケモカインが、リンパ球のさまよい（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、創傷治癒、造血調節ならびにアレルギー、喘息および関節炎のような免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態において、関与することは驚くべきことではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態を、診断および／または治療する組成物および方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの局面によれば、新規の成熟レセプターポリペプチドならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供さ
れる。本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメントを含む。
【００１３】
本発明のさらなる局面によれば、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核宿主細胞および／または組換え真核宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術により、このようなレセプターポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。
【００１４】
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供される。
【００１５】
本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そして活性化するが、または活性化を阻害する化合物のためのスクリーニング方法が提供される。
【００１６】
本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そして活性化する化合物を宿主に投与する工程が提供される。この化合物は、造血、創傷治癒、凝固、新脈管形成の刺激に有用であり、固体腫瘍、慢性感染、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染、乾癬を処置し、そして増殖因子活性を刺激する。
【００１７】
本発明の別の局面によれば、ポリペプチドの過少発現、またはレセプターポリペプチドのリガンドの過少発現に関連した状態を処置するための遺伝子治療を介した、本発明のレセプターポリペプチドを投与する方法が提供される。
【００１８】
本発明のなお別の実施態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、その活性化を阻害する化合物を宿主に投与する工程が提供される。この化合物は、アレルギー、アテローム発生、過敏症、悪性腫瘍、慢性および急性の炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性発熱、骨髄不全、珪肺症、類肉腫類、慢性関節リウマチ、ショックおよび好酸球増多症候群の予防および／または処置に有用である。
【００１９】
本発明のなお別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするために十分な長さの核酸分子を含有する核酸プローブが提供される。
【００２０】
本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関連する疾患を検出するため、ならびにこのレセプターポリペプチドの可溶型の変化したレベルを検出するための診断アッセイが提供される。
【００２１】
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロ目的のために利用するためのプロセスが提供される。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
【００２３】
添付の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして特許請求の範囲により包含されるように、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、広範な生物学的活性において、ケモカインが関与する、リンパ球のさまよい（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、創傷治癒、造血調節ならびにアレルギー、喘息および関節炎のような免疫学的疾病を含む多数の生理学的および疾病状態を処置および／または診断するための組成物および方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の局面によれば、図１〜３の推定のアミノ酸配列（配列番号：２）を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年６月１日にＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ２０８５２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａに寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドはヒト単球由来のｃＤＮＡライブラリーで発見された。これは構造的にＧタンパク質共役レセプターファミリーに関連する。これは、３５２アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、３４７アミノ酸の範囲にわたり、ヒトＭＣＰ−１レセプターに対して７０．１％の同一性および８２．９％の類似性を有する最高度の相同性を示す。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包む）の形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１〜３（配列番号：１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１〜３（配列番号：１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【００２８】
図１〜３の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、ならびに膜貫通（ＴＭ）または細胞内ドメインのようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および任意のさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’非コード配列）。
【００２９】
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００３０】
本発明はさらに、図１〜３の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００３１】
従って、本発明は、図１〜３（配列番号：２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１〜３（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を包含する。
【００３２】
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１〜３（配列番号：１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００３３】
このポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのＴＭおよび細胞内ドメインから切断されたポリペプチドの細胞外の一部分であるＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの可溶型をコードし得る。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００３５】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（リーダーおよびトレイラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００３６】
本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長のｃＤＮＡを単離するための、およびこの遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、そして例えば、５０またはそれ以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、全長の転写産物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を使用することにより、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補する配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、このプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーニングするために使用される。
【００３７】
本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜３（配列番号：１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。
【００３８】
あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましくは５０塩基を有し得る。これらは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、本明細書上記のように、それに対する同一性を有し、そして活性を保持してもよいし、または保持しなくてもよい。例えば、このようなポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌクレオチドの回収のために配列番号：１のポリヌクレオチドのプローブとして、あるいは診断プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【００３９】
従って、本発明は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、配列番号：２のポリヌクレオチドならびにそのフラグメントをコードし、このフラグメントは少なくとも３０塩基、そして好ましくは５０塩基である。そして本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドに関する。
【００４０】
本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。
【００４１】
本発明はさらに、図１〜３（配列番号：２）の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの、アナログおよび誘導体に関する。
【００４２】
用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１〜３のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、Ｇタンパク質ケモカインレセプターとしての機能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがＧタンパク質ケモカインレセプター（例えば、このレセプターの可溶型）として機能しないとしても、リガンドまたはレセプターに結合する能力を保持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００４４】
図１〜３（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物
と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製のために成熟ポリペプチドに融合されているもの、あるいは（ｖ）ポリペプチドのフラグメントが可溶であり（すなわち膜結合でない）、なおさらに膜結合レセプターにリガンドを結合するものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
【００４５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、配列番号：２（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号：２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性（好ましくは７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと９０％の類似性（より好ましくは９０％の同一性）、そして、さらにより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと９５％の類似性（さらにより好ましくは９０％の同一性）有するポリペプチド、および一般的に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプチドの一部分に対するポリペプチドを含む。
【００４７】
当該分野に公知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列およびの保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。
【００４８】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。
【００４９】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（「リーダー」および「トレイラー」）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００５０】
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され得る。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、配列番号：２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号：２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、そしてさらにより好ましくは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして、また一般的に少なくとも３０アミノ酸そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプチドの一部分を含む。
【００５２】
当該分野に公知である、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチド
の配列に対して、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。
【００５３】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。
【００５４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【００５５】
宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。
【００５７】
適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。
【００５８】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰＬプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。
【００５９】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
【００６０】
本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるた
めに用いられ得る。
【００６１】
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００６２】
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。
【００６３】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られた細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。
【００６４】
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。
【００６５】
宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
【００６６】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００６７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のｂｐ１００〜２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００６８】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間または細胞外の培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００６９】
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
【００７０】
代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。
【００７１】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【００７２】
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【００７３】
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。
【００７４】
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列を含有する。ＳＶ４０スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。
【００７５】
Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドは、以下を包含する方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得る。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るし、またはグリコシル化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として使用され得る。
【００７８】
本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターは、本発明のレセプターポリペプチドの活性化化合物（アゴニスト）または活性化阻害化合物（アンタゴニスト）のスクリーニングのためのプロセスにおいて使用され得る。
【００７９】
一般的に、このようなスクリーニング手法は、本発明のレセプターポリペプチドを細胞表面で発現する適切な細胞の提供を含む。このような細胞は、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、またはＥ．Ｃｏｌｉ由来の細胞を含む。特に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞をトランスフェクトし、それにより、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを発現する。次いで、この発現したレセプターを、結合、刺激または機能的応答の阻害を観察するために試験化合物と接触させる。
【００８０】
１つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターを発現するためにトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスクリーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０（１９９２年２月６日公開）に記載される。
【００８１】
従って、例えば、このようなアッセイは、スクリーニングされるべきレセプターリガンドおよび化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞とを接触することにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナルの阻害は、化合物がこのレセプター
の潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レセプターの活性化を阻害することを示す。
【００８２】
このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされる化合物とを接触させることによりレセプターを活性化する化合物を決定するために用いられ得、かつこのような化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、すなわち、このような化合物がレセプターを活性化するか否かを決定するために用いられ得る。
【００８３】
他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１８１〜２９６頁（１９８９年１０月）に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外のｐＨ変化を測定する系において、Ｇタンパク質ケモカインレセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を包含する。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）が、潜在的化合物がレセプターを活性化または阻害するか否かを決定するために測定され得る。
【００８４】
別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質ケモカインレセプターをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させることを包含する。レセプターの活性化を阻害すると思われる化合物をスクリーニングする場合、次いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスクリーニングされる化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出が行われる。
【００８５】
別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているＧタンパク質ケモカインレセプターの発現を包含する。このような細胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。スクリーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパーゼの２次シグナルによるレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得る。
【００８６】
別の方法は、標識リガンドの細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することによる、本発明のアンタゴニストのレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物のスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質ケモカインレセプターをコードするＤＮＡで真核細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射活性により標識され得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例えば、レセプターの放射活性の測定により測定される。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定されるように化合物がレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。
【００８７】
抗体は、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプター、またはいくつかの場合は、Ｇタンパク質ケモカインレセプターに結合するが、Ｇタンパク質ケモカインレセプターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を惹起しないオリゴヌクレオチドを拮抗し得る。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合する独特の決定子を認識する抗イディオタイプ抗体を包含する。潜在的なアンタゴニスト化合物もまた、Ｇタンパク質ケモカインレセプターのリガンドに密接に関連するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機能を欠失しており、そしてＧタンパク質ケモカインレセプターに結合するときに応答を惹起しない。
【００８８】
アンチセンス技術の使用により調製されるアンチセンス構築物は、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介した遺伝子発現を制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに基づい
ている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的に設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質ケモカインレセプターの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＧタンパク質結合レセプターへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、Ｇタンパク質ケモカインレセプターの産生を阻害するためにインビボで発現され得る。
【００８９】
例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子のような、正常な生物学的活性を阻害するようなリガンドへの接近を不可能にするＧタンパク質ケモカインレセプターに結合する小分子もまた、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害するために用いられ得る。
【００９０】
Ｇタンパク質ケモカインレセプターの可溶性形態（例えば、レセプターのフラグメント）は、本発明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そして膜結合Ｇタンパク質ケモカインレセプターとの相互作用からリガンドを保護することによりレセプターの活性化を阻害するために用いられ得る。
【００９１】
本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターに結合し、かつそれを活性化する化合物は、造血（ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）、創傷癒合、凝固、血管形成を刺激するために、固形腫瘍、慢性感染、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染、乾癬を処置し、そして増殖因子の活性を刺激するために使用され得る。
【００９２】
本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターに結合し、かつそれを阻害する化合物は、アレルギー、アテローム発生、過敏性、悪性、慢性および急性炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性熱、骨髄不全、珪肺症、サルコイドーシス、慢性関節リウマチ、ショックおよび好酸球増他症候群を処置するために使用され得る。
【００９３】
化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。
【００９４】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、本発明の化合物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。
【００９５】
薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮
内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異症状の処置および／または予防に効果的な量で投与され得る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮される（ＣＯＮＦＩＲＭ ＤＯＳＡＧＥＳ）。
【００９６】
Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドおよびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらはポリペプチドである）はまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
【００９７】
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【００９８】
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。
【００９９】
本明細書中上記の、誘導され得るレトロウイルスプラスミドベクター由来のレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、脊髄増殖肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスより誘導される。
【０１００】
ベクターは、１またはそれ以上のプロモーターを含有する。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、９号、９８０−９９０（１９８９）に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを包含するが、これらに限定しない真核細胞プロモーターのような細胞プロモーター）を包含するが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる技術より当業者にとって明らかである。
【０１０１】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、以下を包含するが、これらに限定されない：アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロ
モーターのような誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；ヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中上記の修飾したレトロウイルスＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；およびヒト増殖ホルモンプロモーター。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。
【０１０２】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入するために使用され、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、および本明細書中で全体で参考として援用されるＭｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，第１巻、５−１４頁（１９９０）に記載されるＤＡＮ細胞株を包含するが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手法を通じてパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手法は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱を包含するが、これらに限定されない。１つの他の方法においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム内にカプセル化され得るか、または脂質と結合し、次いで宿主に投与され得る。
【０１０３】
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を包含する感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロ、またはインビボのいずれかにおいて真核細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞、および造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、ならびに気管支の上皮細胞を包含するが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明はまた、Ｇタンパク質ケモカインレセプターに結合し得ることが知られていないリガンドが、このようなレセプターに結合し得るかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、リガンドのＧタンパク質ケモカインレセプターへのリガンドの結合を許容する条件下でＧタンパク質ケモカインレセプターを発現する哺乳類細胞をリガンドと接触させる工程、レセプターに結合したリガンドの存在を検出する工程、およびこれにより、リガンドがＧタンパク質ケモカインレセプターに結合するかどうかを決定する工程を包含する。本明細書中に上記のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するためのシステムは、レセプターに結合するリガンドを決定するためにも使用され得る。
【０１０５】
本発明はまた、レセプターをコードするｍＲＮＡの存在を検出することにより、細胞の表面における本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの発現を検出する方法を提供し、この方法は、細胞から全ｍＲＮＡを獲得する工程、および獲得したｍＲＮＡを、レセプターをコードする核酸分子の配列に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１０ヌクレオチドの核酸分子を含有する核酸プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出する工程、およびそれによって細胞によるレセプターの発現を検出する工程を包含する。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに関連するレセプターを同定するための方法を提供する。これらの関連レセプターは、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドに対する相同性により、低ストリンジェンシーなクロスハイブリダイゼーションにより、または関連する天然あるいは合成のリガンドと相互作用するか、およびまたは本発明のケモカインレセプターポリペプチドの遺伝的あるいは薬学的遮断後に類似
の挙動を惹起するレセプターを同定することにより、本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドに対する相同性により同定され得る。
【０１０７】
遺伝子のフラグメントは、本発明の遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、および最も好ましくは少なくとも５０塩基またはそれ以上である。プローブはまた、完全長の転写産物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを包含する本発明の完全な遺伝子を含有するゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。このタイプのスクリーンの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知のＤＮＡ配列を用いて遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして使用される。
【０１０８】
本発明はまた、診断薬としての本発明の遺伝子の使用を意図する。例えば、いくつかの疾患は、遺伝した欠損遺伝子により生じる。これらの遺伝子は、欠損遺伝子の配列を正常な遺伝子の配列と比較して検出され得る。結果的に、「変異」遺伝子は、異常なレセプター活性と関連することが証明され得る。さらに、変異を実証および同定するためのさらに別の手段として変異レセプター遺伝子を、機能的なアッセイシステム（例えば、ＨＥＫ２９３細胞のレセプター欠損株における、比色定量アッセイ、ＭａｃＣｏｎｋｅｙプレート上での発現、相補性試験）において発現させるために、適切なベクターに挿入し得る。一旦「変異」遺伝子が同定されると、次いで「変異」レセプター遺伝子のキャリアの集団がスクリーニングされ得る。
【０１０９】
本発明の遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検物質を包含する患者の細胞より得られ得るが、これらに限定されない。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用され得、または分析前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６ （１９８６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡもまた、また同じ目的のために使用され得る。例として、本発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、本発明の遺伝子の変異を同定および解析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、放射性標識された本発明のＲＮＡまたは、あるいは、放射性標識された本発明のアンチセンスＤＮＡ配列に、増幅させたＤＮＡをハイブリダイズさせることにより検出され得る。完全に対合した配列は、リボヌクレアーゼＡ消化または融解温度の差により、誤対合した二重らせんから区別され得る。このような診断は、出生前試験または新生児の試験のために特に有用である。
【０１１０】
関連遺伝子と「変異」遺伝子との間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは、特異的ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いられ得る。この方法の感受性は、ＰＣＲと組み合わせる場合に大きく増強される。例えば、配列プライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより生成された一本鎖テンプレート分子と共に用いられる。配列決定は、放射性標識されたヌクレオチドを用いた従来の方法により、または蛍光タグを用いた自動配列決定法により行われる。
【０１１１】
ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成され得る。特定
の位置で配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）））により明らかにされ得る。
【０１１２】
さらに、いくつかの疾患は、ｍＲＮＡにおける変化により検出され得る遺伝子発現における変化の結果であるか、またはこれにより特徴づけられる。あるいは、本発明の遺伝子は、このタイプのレセプターに関連する機能の低下を発現する個体を同定するための参考として用いられ得る。
【０１１３】
本発明はまた、種々の組織における本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出するために用いられるアッセイは、当業者において周知であり、そして放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析、および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイを包含する。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡアッセイは、最初に、Ｇタンパク質ケモカインレセプターポリペプチドの抗原に対して特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レセプター抗体は、モノクローナル抗体に対して調製される。レセプター抗体には、例えば放射活性、蛍光、または本実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような、検出可能な薬剤が付着される。サンプルは、次に宿主から除去され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体の支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、例えばウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質と共にインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体をこのディッシュ中でインキュベートし、その間、モノクローナル抗体が、ポリスチレンディッシュに付着した任意のＧタンパク質ケモカインレセプタータンパク質に結合する。全ての未結合モノクローナル抗体を緩衝液で洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したレセプター抗体は、次にディッシュ内に置かれ、Ｇタンパク質ケモカインレセプタータンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体に対するレセプター抗体の結合が生じる。次いで、未結合レセプター抗体は洗浄される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加され、そして所定の時間間隔で現れた色の量は、標準曲線と比較すると、所定容量の患者のサンプル中に存在するＧタンパク質ケモカインレセプタータンパク質の量の測定である。
【０１１５】
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。
【０１１６】
簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【０１１７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。
【０１１８】
ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５０または６０塩基という短いｃＤＮＡで使用され得る。この技術の総説としては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０１１９】
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎに見出される（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１２０】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１２１】
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、そして２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する。）
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。
【０１２２】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
【０１２３】
モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
【０１２４】
単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。
【０１２５】
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０１２６】
以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載される。
【０１２７】
「プラスミド」は、小文字のｐの前および／またはそれに続く大文字および／または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常明らかである。
【０１２８】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０１２９】
切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０１３０】
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【０１３１】
「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０１３２】
記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載のように実施され
た。
【実施例】
【０１３３】
（実施例１ ＨＤＧＮＲ１０の細菌発現および精製）
ＨＤＧＮＲ１０をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号）を、プロセスされたＨＤＧＮＲ１０タンパク質の５’配列（シグナルペプチド配列を除く）およびＨＤＧＮＲ１０遺伝子に対して３’のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。ＨＤＧＮＲ１０に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に添加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡ３’を有し、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位、それに続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まる１８ヌクレオチドのＨＤＧＮＲ１０コード配列を含む。３’配列、５’ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴ３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に相補的な配列を含み、そして続いてＨＤＧＮＲ１０のコード配列の１８ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ． ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。増幅配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を有するフレーム内に挿入した。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与するプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含む。形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の比で大きな培養物に接種する。細胞を、６００の光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４と０．６との間になるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にした。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏを解放（ｃｌｅａｒ）し遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収穫した。細胞ペレットをカオトロピズムの薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化した。澄明後、可溶化されたＨＤＧＮＲ１０を６−ヒスタグを含有するタンパク質により堅く結合させる条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８４）。ＨＤＧＮＲ１０を６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１２時間のインキュベーションの後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析した。
【０１３４】
（実施例２ ＣＯＳ細胞における組換えＨＤＧＮＲ１０の発現）
プラスミドの発現、ＨＤＧＮＲ１０ ＨＡを、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは以下を含有する：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンそしてポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーター
。完全なＨＤＧＮＲ１０前駆体、およびその３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーター下で支配される。ＨＡタグは、先に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，Ｃｅｌｌ ３７，７６７）。標的タンパク質へのＨＡタグの融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。
【０１３５】
プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する：
ＨＤＧＮＲ１０をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号）を、２つのプライマーを用いたＰＣＲにより構築した：５’プライマー５’ＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡ３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、それに続く開始コドンから始まるＨＤＧＮＲ１０コード配列の１８ヌクレオチドを含む；３’配列５’ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣ３’は、ＸｈｏＩ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およびＨＤＧＮＲ１０コード配列の最後の１８ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、インフレーム融合したＨＡタグが続くＨＤＧＮＲ１０コード配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびＸｈｏＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素により消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験した。組換えＨＤＧＮＲ１０の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により発現ベクターでトランスフェクトした（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。ＨＤＧＮＲ１０ ＨＡタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフェクションの２日後、３５Ｓ−システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上 ３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体により沈降させた。沈降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０１３６】
（実施例３ バキュロウイルス発現系を用いるＨＤＧＮＲ１０のクローニングおよび発現）
全長のＨＤＧＮＲ１０タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１８３号）を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
【０１３７】
５’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡ３’を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４ヌクレオチド（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７
，１９６，９４７−９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、およびその直後の、ＨＤＧＮＲ１０遺伝子の最初の１８ヌクレオチド（翻訳開始コドンは「ＡＴＧ」である）を含む。
【０１３８】
３’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴ３’を有し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの切断部位およびＨＤＧＮＲ１０遺伝子の３’非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、そして上記のように精製した。このフラグメントを、Ｆ２と称する。
【０１３９】
ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるＨＤＧＮＲ１０タンパク質の発現のために用いる（総説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わりに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。
【０１４０】
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、上記のようにＤＮＡを１％アガロースゲルより単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と称する。
【０１４１】
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＨＤＧＮＲ１０遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃＨＤＧＮＲ１０）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４２】
５μｇのプラスミドｐＢａｃＨＤＧＮＲ１０を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．０μｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともにコトランスフェクトした。
【０１４３】
１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＨＤＧＮＲ１０を、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プ
レート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続けた。
【０１４４】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０１４５】
ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染するために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。
【０１４６】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱失活化ＦＢＳを補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＨＤＧＮＲ１０で感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１４７】
（実施例４ 遺伝子治療を介する発現）
線維芽細胞を、被験者から皮膚生検によって獲得した。得られた組織を組織培養培地中に入れ、そして小さい切片に分けた。組織の小さな切片は、組織培養フラスコの湿った表面上に置かれ、各フラスコ中に約１０切片を入れる。フラスコを上下に回転させ、しっかりと密閉し、室温に一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆転させ、そして組織切片をフラスコの底に固定したまま維持し、そして新鮮な培地（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）を添加する。次いで、これを３７℃で約１週間インキュベートする。このとき、新鮮な培地を添加し、そしてその後数日ごとに交換する。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単層が生じる。単層をトリプシン化し、そしてより大きなフラスコに大きく（ｓｃａｌｅ）する。
【０１４８】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そして次いで仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分離し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
【０１４９】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列の対応するＰＲＣプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有し、そして３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格、ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を、細菌ＨＢ１０１の形質転換のために使用し、次いで、これを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナマイシンを含むアガープレート上にプレートする。
【０１５０】
両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）における組織培養中で、集密的密度に増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターにより形質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を包含する感染性ウイルス粒子を産生する（この時点でパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。
【０１５１】
新鮮な培地を形質導入プロデューサー細胞に添加し、その後、集密的プロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む消費された培地を、ミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通してフィルター濾過し、分離したプロデューサー細胞を除去し、そして次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブ集密的プレートから除去し、そして迅速にプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、またはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。
【０１５２】
次いで、操作された線維芽細胞は、単独、あるいはサイトデックス３マイクロキャリアービーズ上で集密的に増殖させた後のいずれかで宿主に注入される。その後、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
【０１５３】
本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、従って、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】本発明のＧタンパク質共役レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列を示す図である。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】本発明のＧタンパク質ケモカインレセプターとヒトＭＣＰ−１レセプターとの間のアミノ酸配列のアライメントを例示する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択されたメンバーを含有する単離されたポリヌクレオチド：
(a)配列番号：２に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b)ATCC受託番号第97183号に含まれるDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド；
(c)該ポリヌクレオチド(a)または（b）とハイブリダイズし得、かつ少なくとも70％の同
一性であるポリヌクレオチド；および
(d)該ポリヌクレオチド(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１】
以下からなる群から選択されたメンバーを含有する単離されたポリヌクレオチド：
(a)配列番号：２に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b)ATCC受託番号第97183号に含まれるDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド；
(c)該ポリヌクレオチド(a)または（b）とハイブリダイズし得、かつ少なくとも70％の同
一性であるポリヌクレオチド；および
(d)該ポリヌクレオチド(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドフラグメント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−１３００２１（Ｐ２００７−１３００２１Ａ）
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３１２０７（Ｐ２００６−３３１２０７）
【出願日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【分割の表示】特願２００４−１１８４３９（Ｐ２００４−１１８４３９）の分割
【原出願日】平成７年６月６日（１９９５．６．６）
【出願人】（５９７０１８３８１）ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド (44)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９４１０ Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【分割の表示】特願２００４−１１８４３９（Ｐ２００４−１１８４３９）の分割
【原出願日】平成７年６月６日（１９９５．６．６）
【出願人】（５９７０１８３８１）ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド (44)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９４１０ Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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