ヒトＩｇＥに対する抗体酵素およびその利用
【課題】Ｉ型アレルギーの原因であるヒトＩｇＥを認識するとともに、ＩｇＥを分解してその機能を消失させることができ、Ｉ型アレルギーの予防や治療に利用できる抗体酵素を提供する。
【解決手段】ヒトＩｇＥを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、そのモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、塩基配列を決定した。続いて、このアミノ酸配列について分子モデリングを行ない、その３次元構造を推定し触媒三つ組残基構造を有しているか否かを確認した。そして、最終的に触媒三つ組残基構造を有するモノクローナル抗体５Ｈ５の重鎖および軽鎖の可変領域がヒトＩｇＥの抗体酵素として機能するということを見出した。
【解決手段】ヒトＩｇＥを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、そのモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、塩基配列を決定した。続いて、このアミノ酸配列について分子モデリングを行ない、その３次元構造を推定し触媒三つ組残基構造を有しているか否かを確認した。そして、最終的に触媒三つ組残基構造を有するモノクローナル抗体５Ｈ５の重鎖および軽鎖の可変領域がヒトＩｇＥの抗体酵素として機能するということを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩｇＥに対する抗体酵素およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは抗原と接触してから発症するまでの時間によって、即時型過敏症(immediate-type hypersensitivity)と遅延型過敏症(delayed-type hypersensitivity)との二つのグループに分類される。即時型過敏症は抗体により引き起こされる症状で、アレルギー発症の機構からＩ型乃至ＩＩＩ型に分類されている。
【０００３】
現在、アレルギー患者数は急激に増加しており、多くの人々が花粉症等のアレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息等の症状に苦しんでいる。これらの症状はＩ型アレルギーに属し、体内に侵入したアレルゲンに対し産生されたＩｇＥ抗体により引き起こされる。
【０００４】
ＩｇＥ抗体を介したアレルギーの発症機構はほぼ解明されている。まずアレルゲンが体内に侵入し、アレルゲンに特異的なＩｇＥが産生される。ＩｇＥ抗体値があるレベルまで上昇すると、ＩｇＥ抗体のＦｃ部分を結合するＦｃεレセプターを持つ肥満細胞(mast cell)と好塩基球(basophile)という特殊な細胞にＩｇＥ抗体が結合しはじめ、長期にそれらの細胞と結合したまま血中に存在する。再度アレルゲンが侵入した場合、抗原抗体反応が惹起され、この刺激で肥満細胞や好塩基球からヒスタミンなどの化学伝達物質の入った顆粒が細胞外に放出される（脱顆粒反応(degranulation reaction)）。
【０００５】
この脱顆粒反応により放出されたヒスタミン、ＳＲＳ−Ａ(slow reacting substance of anaphylaxis)や好酸球走化性因子等の化学伝達物質により血管の浸透性の増大、平滑筋の収縮、分泌液を分泌する機能の増大などが起こり、アレルギー症状を引き起こす。また、好酸球が反応局所に集積するので、アレルゲンが除去される。こうした機構からＩｇＥ抗体はアレルギーを引き起こすが、その障害反応を通じてアレルゲンの粘膜からの侵入や全身への拡散を防いだり、除去する為に働くと考えられている。
【０００６】
現在、Ｉ型アレルギーの治療法はいくつかあるが、その一つに脱感作療法がある。この方法は、アレルギーを誘発しない程の少量のアレルゲンを期間を置いて数回注射し、予めアレルゲンに対するＩｇＧ抗体を産生させておく。そして再度侵入したアレルゲンにこの抗体が結合することによって、ＩｇＥ抗体のアレルゲンへの結合が阻害され、アレルギーが抑制される。その他に、脱顆粒を阻害する医薬や、放出された化学伝達物質の作用を阻害する医薬の研究がすすめられている。また、ＩｇＥと結合する抗ＩｇＥ抗体をＩ型アレルギーの治療に用いることについても報告されている（例えば、特許文献１等参照。）。
【特許文献１】特表２００２−５１０２１１号公報（公開日：平成１４年（２００２）４月２日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、従来公知のヒトＩｇＥを認識しヒトＩｇＥの中和活性を有する抗ＩｇＥ抗体においては、抗ＩｇＥ抗体と抗原であるＩｇＥとは最大で１：２の分子の量論比でしか結合しないため、使用する抗ＩｇＥ抗体の量が必然的に多くならざるを得ないという問題があった。また、ヒトＩｇＥを破壊して完全にその機能を失わせることは不可能であった。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、血中ヒトＩｇＥあるいはその機能を低減するためにこれまでの方法に比べ、使用する抗ＩｇＥ抗体の量をかなり低減することが可能なヒトＩｇＥ抗体に対する抗体酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ヒトＩｇＥに対する抗体酵素を得るために鋭意検討した。その結果、ヒトＩｇＥを免疫抗原に用いて得られた抗体の中に、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを切断および／または分解することができる抗体酵素としての機能を発揮するものが存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明にかかる抗体酵素は、上記課題を解決するために、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明にかかる抗体酵素断片は、上記課題を解決するために、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する上記抗体酵素の可変領域を含むことを特徴としている。
【００１２】
また、本発明にかかる抗体酵素または抗体酵素断片においては、重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなっていてもよい。
【００１３】
また、本発明にかかる遺伝子は、上記抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片をコードすることを特徴としている。また、本発明にかかる形質転換体は、上記遺伝子が導入されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかる抗体酵素は、以上のように、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するという構成を備えているので、１分子で１つ（あるいは２つ）のヒトＩｇＥに結合する抗体に比べ、抗体酵素は１分子で次から次にヒトＩｇＥ分子を破壊することができる。それゆえ、かかる抗体酵素を得ることができればヒトＩｇＥが原因物質であるＩ型アレルギーの予防・治療に寄与することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００１６】
（１）本発明にかかる抗体酵素およびその利用
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する抗体酵素である。すなわち、本発明にかかる抗体酵素はヒトＩｇＥを特異的に認識する抗体としての性質と、認識したヒトＩｇＥを切断および／または分解する酵素としての性質を併せ持つ。
【００１７】
ここで、「抗体酵素」とは、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有する免疫グロブリンをいう。また、酵素活性は特に限定されるものではないが、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性であることが好ましい。
【００１８】
本発明の抗体酵素は、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性を有する。すなわち、本発明の抗体酵素は、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その抗原タンパク質を標的として分解活性を示すものである。それゆえ、本発明の抗体酵素は、１分子で１つ（あるいは２つ）のヒトＩｇＥ分子に結合する抗体に比べ、１分子で次から次にヒトＩｇＥ分子を破壊することができる。したがって、その効果は通常の抗体の数百倍あるいは数千倍に達する。それゆえ、かかる抗体酵素を得ることができればヒトＩｇＥを原因とするＩ型アレルギーの予防・治療に寄与することが期待できる。また、酵素であるため、酵素センサの構築が可能であり、抗体よりも応用範囲が広い。
【００１９】
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＩｇＥに対する抗体である。ここで、ヒトＩｇＥに対する抗体は、ヒトＩｇＥに対するポリクローナル抗体であってもよいが、ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体であることがより好ましい。これにより、特異性に優れた抗体を選択することが可能となる。
【００２０】
ここで、本発明の抗体酵素の由来は特に限定されるものではない。したがって、上記抗体酵素は、細胞融合によって得られたマウス等のモノクローナル抗体に由来する抗体酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌、動物細胞等で生産される抗体であってもよいし、本発明の抗体酵素の可変領域をヒトその他の動物の抗体に移植したヒト化抗体等のキメラ抗体であってもよい。あるいは、ファージディスプレイ法を用いて作製した抗体であってもよい。
【００２１】
本発明の抗体酵素は、ヒトＩｇＥを認識するものであればよく、ヒトＩｇＥに対するあらゆる抗体が含まれるが、ヒトＩｇＥの定常領域に存在するアミノ酸配列を認識するものであることが好ましい。定常領域に存在するアミノ酸配列を認識するものであることによって、種々の可変領域を有するＩｇＥに対し、抗体酵素としての作用を及ぼすことができる。
【００２２】
また、上記本発明にかかる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。ここで上記「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことをいう。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（例えば特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とのＣα（α炭素）間の距離が、少なくとも３〜２０×１０−１０ｍの範囲内、好ましくは、３〜１０×１０−１０ｍの範囲内にあることを意味する。
【００２３】
本発明の抗体酵素は、上述した抗体酵素であれば特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、重鎖可変領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素を挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、後述する実施例に示す本発明の抗体酵素である抗ＩｇＥモノクローナル抗体５Ｈ５（以下、５Ｈ５抗体と称する。）の重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号３に示すアミノ酸配列は、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。図１に５Ｈ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）を、図２に５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。図１に示すように、５Ｈ５抗体の重鎖可変領域は、下線を付して示す、相補性決定領域（ＣＤＲ領域）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち５Ｈ５抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列の３１番目から３５番目（カバットの分類による番号で３１番目から３５番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０番目から６６番目（カバットの分類による番号で５０番目から６５番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１に示すアミノ酸配列の９７番目から１０５番目（カバットの分類による番号で９３番目から１０２番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。また、図２に示すように、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域は、下線を付して示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列の２４番目から３３番目（カバットの分類による番号で２４番目から３４番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３に示すアミノ酸配列の４９番目から５５番目（カバットの分類による番号で５０番目から５６番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列の８８番目から９６番目（カバットの分類による番号で８９番目から９７番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。なお、図１および図２においてアミノ酸に付した番号は、カバットの分類による番号であり、各配列番号に示すアミノ酸配列において何番目のアミノ酸であるかを示す番号とは異なっている。
【００２４】
図３（ａ）には、５Ｈ５抗体軽鎖の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。また、図３（ｂ）および（ｃ）には、５Ｈ５抗体重鎖の可変領域の立体構造モデリングを行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図３（ａ）に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列において、カバットの分類による番号で第３４番目のヒスチジン、カバットの分類による番号で第５２番目のセリン、カバットの分類による番号で第５０番目のアスパラギン酸が触媒三つ組残基を構成していると推測される。また、５Ｈ５抗体重鎖では、図３（ｂ）に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列においてカバットの分類による番号で第１番目のグルタミン酸、カバットの分類による番号で第２５番目のセリン、カバットの分類による番号で第１０１番目のアスパラギン酸が触媒三つ組残基を構成している場合と、図３（ｃ）に示すように、カバットの分類による番号で第４０番目または第８４番目のセリン、カバットの分類による番号で第６１番目または８６番目のアスパラギン酸、カバットの分類による番号で第８５番目のグルタミン酸が触媒三つ組残基を構成している場合とが考えられる。このように、５Ｈ５抗体軽鎖では、ヒスチジン、セリンおよびアスパラギン酸が三つ組み残基として機能し、５Ｈ５抗体重鎖では、グルタミン酸、セリンおよびアスパラギン酸が触媒三つ組残基として機能していると考えられる。
【００２５】
また、本発明にかかる抗体酵素は、重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、および／または、軽鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもので、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものであってもよい。かかる抗体酵素は、５Ｈ５抗体の変異体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものである。なお、上記の「配列番号１（３）に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。好ましい変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加である。より好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００２６】
また、本発明には、本発明の抗体酵素の断片であって、上記抗体酵素の可変領域を含む抗体酵素断片も含まれる。かかる抗体酵素断片としては、上記抗体酵素の可変領域含む抗体酵素断片であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する抗体酵素断片であれば特に限定されるものではない。かかる抗体酵素断片は、上記抗体酵素の重鎖（Ｈ鎖）であってもよく、上記抗体酵素の軽鎖（Ｌ鎖）であってもよく、上記抗体酵素の重鎖の可変領域であってもよく、上記抗体酵素の軽鎖の可変領域であってもよく、上記抗体酵素の重鎖または軽鎖の可変領域を含むいかなる抗体酵素断片であってもよい。かかる抗体酵素断片は、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するので、１分子で１つ（あるいは２つ）のヒトＩｇＥに結合する抗体に比べ、抗体酵素は１分子で次から次にヒトＩｇＥ分子を破壊することができる。それゆえ、かかる抗体酵素断片を得ることができればヒトＩｇＥが原因物質であるＩ型アレルギーの予防・治療に寄与することができる。また、上記抗体酵素の重鎖または軽鎖の可変領域或いはそのＣＤＲ領域は、かかる可変領域またはＣＤＲ領域をヒトその他の動物の抗体に移植してキメラ抗体酵素を作製するために好適に用いることができる。
【００２７】
かかる抗体酵素断片としては、例えば、配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素断片やこれらのアミノ酸配列を含む抗体酵素断片を挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、５Ｈ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号３に示すアミノ酸配列は、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２８】
また、上記抗体酵素断片は、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素断片やかかるアミノ酸配列を含む抗体酵素断片であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものであってもよい。かかる抗体酵素断片は、それぞれ、５Ｈ５抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の変異体またはかかる変異体を含む抗体酵素断片であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものである。
【００２９】
また、本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子、上記抗体酵素の断片であって上記抗体酵素の可変領域を含む抗体酵素断片をコードする遺伝子、または、上記抗体酵素の断片であって上記抗体酵素の各ＣＤＲ領域をコードする遺伝子も含まれる。かかる遺伝子を適当な宿主に発現可能に導入することにより、本発明の抗体酵素または抗体酵素断片を宿主内で発現させることができる。また、可変領域の抗体酵素断片をコードする遺伝子は、そのまま発現させてもよいが、例えばヒト免疫グロブリン等、由来の異なる免疫グロブリンの定常領域、あるいは可変領域内のフレームワークをコードする遺伝子と連結してキメラ遺伝子として発現させ、キメラ抗体酵素を製造することもできる。また、上記可変領域のＣＤＲをコードする遺伝子を、由来の異なる免疫グロブリンの可変領域に組み込んでキメラ遺伝子として発現させ、キメラ抗体酵素を製造することもできる。
【００３０】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった一本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素、またはその断片をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む。）等の配列を含むものであってもよい。
【００３１】
本発明の遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号２または４に示す塩基配列からなる遺伝子、またはこれらを含む遺伝子を挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子は、５Ｈ５抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の一例であり、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子は、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の一例である。
【００３２】
また、上記遺伝子は、配列番号２または４に示される塩基配列と必ずしも同一である必要はなく、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子であれば、その変異体も含まれる。このような変異体としては、上記抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。また、かかる変異体は、配列番号２または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
【００３３】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（すなわち、ハイブリダイズし難くなる）。
【００３４】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。この形質転換体は、上記遺伝子が適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入されたものであり、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内で発現させることができ、当該抗体酵素の製造に利用することができる。また、上記形質転換体は、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内に蓄積しているため、Ｉ型アレルギーを予防または治療するための薬剤として利用することができる。
【００３５】
また、これまでに、ＩｇＥの働きを抑制する作用をもつ抗ＩｇＥ薬剤は開発されているが、本発明にかかる抗体酵素は、これらの抗ＩｇＥ薬剤とは全く異なる手法に基づいて、ヒトＩｇＥを直接攻撃してその機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗ＩｇＥ薬剤として利用することができる。
【００３６】
上記本発明にかかる抗体酵素またはその可変領域を含む抗体酵素断片を含む抗ＩｇＥ薬剤は、本発明にかかる抗体酵素のみによって構成してもよいが、薬理学的に許容される担体などと混合して構成してもよい。医薬組成物の製造法として公知の手段に従って、上記抗ＩｇＥ薬剤を製造することができる。
【００３７】
ここで、薬理学的に許容される担体には、製剤素材として使用可能な各種有機または無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。
【００３８】
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００３９】
また、上記結合剤としては、例えばα化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００４０】
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００４１】
上記溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。
【００４２】
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４３】
上記懸濁剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。
【００４４】
上記等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００４５】
上記無痛化剤としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００４６】
上記防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００４７】
抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００４８】
上記抗ＩｇＥ薬剤は、製剤技術分野において慣用の方法により製造することができる。抗ＩｇＥ薬剤の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤のほか、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等の非経口剤が挙げられ、これらは毒性も低く、それぞれ経口的または非経口的に投与できる。
【００４９】
また、上記抗ＩｇＥ薬剤の投与量は、投与対象、投与ルート、症状などによっても異なる。したがって、上記投与量は、最適な条件を適宜検討の上、採用すればよい。
【００５０】
（２）本発明にかかる抗体酵素の製造方法
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ヒトＩｇＥで免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。重鎖、軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖に分離すればよい。また、本発明の抗体酵素断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体酵素断片が得られるように切断すればよい。
【００５１】
モノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)）、ファージディスプレイ法等により行なわれる。
【００５２】
マウス等に免疫する抗原として用いるヒトＩｇＥは特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。市販のヒトＩｇＥを用いてもよい。
【００５３】
また、アミノ酸配列が明らかになっている抗体酵素または抗体酵素断片については、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いて本発明の抗体酵素を製造することができる。この場合、上記抗体酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現可能な適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたポリペプチドを精製する等の方法を用いることができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく製造することができる。
【００５４】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、先ずモノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００５５】
また、本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、モノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行い、該当する領域を増幅させることで本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、配列番号２または４に示す塩基配列からなる遺伝子に適当な変異を導入すれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体が発現産物としてそれぞれ得られる。
【実施例１】
【００５６】
〔実施例１：抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の作製〕
免疫用の抗原として市販のヒトＩｇＥ（Chemicon International, CA. USA）をBalb/cマウス（雌６週齢）に免疫し、ポリエチレングリコールによる通常の細胞融合法により、抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を作製した。
【００５７】
＜マウスへの免疫＞
完全フロイントアジュバント（Freund’s complete adjuvant:以下「ＦＣＡ」と略称することがある、DIFCO, Detroit Michigan USA）と抗原であるヒトＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ）とを、ルアーロック式のシリンジ ２本のそれぞれにセットし、ウオーターインオイルの要領でＦＣＡと抗原とを白い乳液状になるまで混合した。次に、この混合物を、マウスの腹部皮下の２箇所に１００μlずつ投与した。
【００５８】
免疫注射から１０日後にマウスの採血を行い、通常のＥＬＩＳＡ法で力価の測定を行った。以下に力価の測定方法を示す。
【００５９】
ヒトＩｇＥをＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬになるように調製した。このヒトＩｇＥを９６穴ウェルプレートにそれぞれ別系列で５０μＬずつ注入した。４℃で一晩放置してコーティングした後、イムノウォッシャーを用いて０．０５％のTween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを３回洗浄した。続いてすべてのウェルに２％ゼラチンを含むＰＢＳを１５０μｌずつ加えた。室温で１時間インキュベーションし、ブロッキングを完了した。
【００６０】
採取した抗血清をＰＢＳで１／１００希釈し、１／１００から４倍連続希釈を７回繰り返し、１サンプルにつき抗血清希釈液を８種類用意した。また未処理マウスの血清も抗血清と同様に希釈を行いコントロールとして用いた。ブロッキングが終了した各ウェルに、連続希釈した抗血清を５０μｌずつ加え、室温で１時間静置した(一次反応)。洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで希釈調整したアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識ウサギ抗マウス血清を各ウェルに５０μＬずつ加えた。室温で１時間静置した(二次反応)。プレートを洗浄後、ＡＬＰ基質(p-nitrophenyl phosphate)を各ウェルに１００μＬずつ加え、３０分後にイムノリーダー（波長４０５ｎｍ）で吸光度を測定した。
【００６１】
初回免疫から約２週間後に追加免疫を行った。２回目からはＦＣＡの代わりに不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いた。免疫の方法は初回免疫と同様に行い、マウス１匹あたり５０μｇの抗原を投与した。
【００６２】
１０日後眼窩静脈叢より採血を行い、ＥＬＩＳＡ法により再度力価測定を行った。追加免疫後、力価が十分上がったマウスに最終免疫を行った。最終免疫はアジュバントは使用せずに滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を抗原と混合してマウス尾静脈に投与した。このときマウス１匹あたり抗原を５０μｇ投与した。
【００６３】
＜細胞融合＞
最終免疫の３日後にマウスから脾臓を摘出し、マウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合を行った。この細胞融合はポリエチレングリコールを使って行う通常の方法で行った。その後、スクリーニング、クローニングを繰り返し、表１に示す１１個の抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体産生細胞を確立した。
【００６４】
【表１】
＜アイソタイプの決定＞
確立した抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のアイソタイプ決定を、Iso StripTM マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて行った。アイソタイプの決定は添付のマニュアルに従って行った。その結果を表１に併記する。
【００６５】
〔実施例２：抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のタンパク質との交差反応試験〕
得られた抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の培養上清を用いて、実施例１で抗原として用いたヒトＩｇＥおよび他の種々のタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。他のタンパク質としては、ＩｇＧ、Human-γ-globlin(ヒトγ−グロブリン)、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびHuman-hemoglobin（ヒトヘモグロビン）を用いた。
【００６６】
交差反応試験は以下のようにして行った。ヒトＩｇＥ、ＩｇＧ、Human-γ-globlin、ＨＳＡ、ＫＬＨ、ＢＳＡおよびHuman-hemoglobinはそれぞれＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴のウェルプレートに２００μｌずつ入れコーティングを行った。培養上清はＰＢＳ−Ｔで１／２希釈し、一次反応に用いた。その他の操作は上述した力価測定と同様に行った。
【００６７】
図１４および図１５に交差反応試験の結果を示す。図１４および図１５に示すように、実施例１で確立した抗体産生細胞によって産生される抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体はいずれもヒトＩｇＥと特異的に反応し、他のタンパク質とは反応しなかった。ただし、３Ｅ８および４Ｃ５はヒトＩｇＧとも交差反応した。また、それぞれの抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のヒトＩｇＥとの反応性を表１に併記する。
【００６８】
〔実施例３：５Ｈ５抗体可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列の決定〕
得られた５Ｈ５抗体可変領域の塩基配列を以下に示す方法で決定し、アミノ酸配列を推測した。
【００６９】
＜抗体産生細胞の培養＞
５Ｈ５抗体を産生する抗体産生細胞は、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５．５％の条件下、２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中で１×１０７〜５×１０７細胞が得られるまで培養した。培養液を、５０ｍｌ遠心チューブに移し、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行って細胞を回収した。培地をアスピレーターにて除去後、１０ｍｌのＰＢＳで懸濁し、１つのチューブにまとめて再度１４００ｒｐｍで６分遠心分離を行った。上清を吸引除去後再度１０ｍｌのＰＢＳで懸濁して血球計算盤を使用し細胞数をカウントした。
【００７０】
カウント後１×１０７〜５×１０７細胞分の細胞懸濁液を取り、再度１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行って上清を除去した。さらに、ペーパータオル上で逆さにし完全に液を切った。アスピレートが不十分であれば、再度遠心分離を行いマイクロピペットで残ったＰＢＳを除去した。
【００７１】
＜ｍＲＮＡの抽出と精製＞
ｍＲＮＡの抽出はQuickPrepＴＭ mRNA purification Kit (アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製)を用いて、当該キットの推奨プロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
【００７２】
上記で回収した細胞のペレットに、予め３７℃のインキュベーターに約３０分静置して結晶を完全に溶解させた１．５ｍｌのExtraction bufferを添加した。この細胞を、２１Ｇの針に数回通すことにより破砕した。その細胞破砕溶液に３ｍｌのElution bufferを加え更に細胞を破砕した。得られた細胞破砕溶液をＲＮアーゼフリーの１．５ｍｌマイクロチューブ４本に分注し、室温（２５℃）、１８０００×ｇで２０分間遠心分離を行い、その上清を後述のoligo(dT)-cellulose spin columnに添加するサンプルとした。
【００７３】
続いてｍＲＮＡを単離した。まず、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁し、上下のキャップを外して１５ｍｌの遠心チューブにセットし、１３００ｒｐｍで１分４５秒間遠心分離を行ってカラム内の保存液の除去を行った。その後、下キャップを装着し、除タンパク・除ＤＮＡした上記サンプル（上清）を４ｍｌ添加し上キャップを取り付けた。カラムの樹脂を懸濁した後、１０〜１５分間転倒混和し樹脂にｍＲＮＡを吸着させた。そして、上下のキャップを装着したまま１４００ｒｐｍで１〜２分間遠心分離を行った後、上キャップをはずし、上清をＲＮアーゼフリーのマイクロピペットを使用し、上清を除去した。そこに、３ｍｌのHigh-salt bufferを添加し、２分間ほど緩やかに混和した後、上キャップを装着し、１４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上清を除去した。この操作をさらに２回繰り返した。
【００７４】
続いて３ｍｌのLow-salt bufferをカラムに添加して１〜２分間緩やかに懸濁した後、上キャップを装着し１５ｍｌチューブに入れた。１４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行って上清を除去した。その後、下キャップも取り外し、３ｍｌのLow-salt bufferを、樹脂表面が平らになるように壁に添わせながら回し入れた。続いて１５ｍｌチューブにカラムを設置し１３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
【００７５】
次に新しい１５ｍｌ遠心チューブを用意し、ｍＲＮＡ回収用の１．５ｍｌマイクロチューブ２個の蓋をハサミで切断後、１５ｍｌ遠心チューブに重ねて入れ溶出用チューブとした。溶出用チューブにカラムを入れ、そこに６５℃に加熱した０．２５ｍｌのElution bufferを添加し１３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。この操作を２回繰り返し、溶出液をｍＲＮＡ画分として１．５ｍｌマイクロチューブ２本に回収し氷上に静置した。別に定量用のマイクロチューブを準備し、１０μｌのｍＲＮＡ画分を取り、７０μｌのElution bufferを加えて希釈し(１／８希釈)、吸光度ブランクをElution BufferとしてＡ２６０、Ａ２８０を測定した。測定においては、予め、塩酸：メタノール＝１：１の溶液に約１時間浸しＲＮアーゼフリーにした後、ＤＥＰＣ処理水（Diethyl Pyrocarbonate 処理水）で洗浄したセルを用いた。またＲＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）はＡ２６０×希釈率×４０で算出した。
【００７６】
また、２等分され氷上に静置しておいたｍＲＮＡ画分（ｍＲＮＡ抽出溶液）に１／１０量の２．５Ｍ酢酸カリウム、１／５０量のグリコーゲン、２倍量の９５％エタノールを加えて攪拌し混合液を得た。この混合液を、−３０℃に約４０分置き、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った後、−８０℃で保存した。
【００７７】
なお、ｍＲＮＡの抽出と精製においては、ガラス、金属類（実験器具）は２４０℃で２時間乾熱滅菌したものを、プラスチック類の実験器具はＲＮアーゼ・ＤＮアーゼフリーの物を使用した。
【００７８】
＜ｍＲＮＡからのFirst strand ｃＤＮＡの合成＞
−８０℃でエタノール沈殿の状態で保存していたｍＲＮＡを取り出し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行いマイクロピペットで上清を除去した。
【００７９】
その後、１ｍｌの氷冷した７５％エタノール（予めＤＥＰＣ処理水で調製し、−３０℃で保存したもの）を、マイクロチューブに、ペレットのない方からそっと加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離を行い、マイクロピペットで上清を除去した。そして、１５分間真空乾燥を行い、０．２μｇ／μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水を添加し１時間静置して溶解した。溶解後、確認の為にｍＲＮＡ溶液をＤＥＰＣ処理水でＡ２６０＝１前後になるように希釈し吸光度を測定した。
【００８０】
ｃＤＮＡの合成はAMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit （Takara製）を用い、そのプロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。ＲＮアーゼフリーの０．２ｍｌマイクロチューブにｍＲＮＡ ２μｇ分のｍＲＮＡ溶液を添加した。そのマイクロチューブにpd(T)１２〜１８プライマー（０．５μｇ／ｍｌ）２μｌおよびＤＥＰＣ処理水を、ｍＲＮＡ溶液と合わせて１７μｌとなるように添加して混合した。その後、７０℃で１０分間アニーリング処理を行った。アニーリング処理後のマイクロチューブを氷上に置き、０．２５Ｍ ＤＴＴ１μｌ、Rnase inhibitor １μｌ、および５×Reaction buffer ５μｌを添加しよく混合した。更にAMV-RTを１μｌ添加して緩やかに攪拌し、４１℃で６０分間伸長反応を行った。６０分経過後、氷上にマイクロチューブを置いて伸長反応を停止し、マイクロチューブを−３０℃で保存した。
【００８１】
＜ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅＞
Mouse Ig primer Kit（Novagen）、NovaTaqTMHot Start DNA Polymerase Kit(Novagen)を使用し、上記＜ｍＲＮＡからのFirst strand ｃＤＮＡの合成＞で得られたｃＤＮＡから、抗体遺伝子可変領域の増幅を行った。
【００８２】
抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、Master mix(３７．２５μｌの滅菌超純水、０．５μｌの3’-プライマー（最終濃度５ｐｍｏｌ）、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（最終濃度 ０．２ｍＭ）、５μｌの１０×NovaTaq Hot Start Buffer（最終濃度１×）、および０．２５μｌのNovaTaq Hot Start DNA Polymerase（最終濃度１．２５Ｕ）を混合した。)を準備した。このMaster mixを、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、およびプライマーの本数分準備したＰＣＲチューブに４７μｌずつ分注した。そこに、１μｌの5’-プライマー(最終濃度５ｐｍｏｌ)および２μｌ ｃＤＮＡ溶液を添加した。なお、ポジティブコントロールは Mouse Ig primer Kitに付属のものを使用し、ネガティブコントロールには滅菌超純水を使用した。
【００８３】
ＰＣＲチューブ内のMaster mix、5’-プライマーおよびｃＤＮＡ溶液をよく混合し、Biometra社T-GRADIENT、TaKaRa社PCR Thermal cycler PERSONALを使用しＰＣＲを行った。反応条件として、Ｌ鎖は９５℃で７分間のプレヒート後、熱変性を９８℃で１５秒間、伸長反応を７４℃で１５秒間に固定し、アニーリング温度を７０℃、６６℃、６２℃、５８℃、５４℃、および５０℃と６段階に４℃ずつ下げるStep Down法を行った。なお、アニーリング時間は、１５秒間に固定した。上記の３ステップを５段階まで３サイクルずつ行い、６段階目を１０サイクル行った。Ｈ鎖は９５℃で１０分間のプレヒート後、熱変性を９４℃で１分間、アニーリング温度５０℃で２分間、伸長反応を７２℃で２分間の３ステップを４０サイクル行った後、７２℃の伸長反応を１０分間行った。ＰＣＲ終了後、アガロース電気泳動により、抗体可変領域遺伝子の増幅を確認した。
【００８４】
＜抗体可変領域遺伝子のクローニング＞
クローニングは、TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社製）を用いて、以下のようにして行った。
【００８５】
アガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測されるＤＮＡの増幅を確認したＰＣＲ産物２μｌ、salt Solution １μｌ、および滅菌水２μｌを、氷上にてＰＣＲチューブに分注し攪拌した。さらに、このＰＣＲチューブに、TOPO ベクター１μｌを添加して緩やかに攪拌後、室温で３０分間ライゲーション反応させた。３０分後、直ちにＰＣＲチューブを氷上に置き反応を停止させた。このようにして調製された反応液を以下「ライゲーション反応液」と称する。
【００８６】
使用直前に−８０℃のフリーザーからOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（インビトロジェン社製）を取り出し氷上で溶解した。溶解したOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli に、氷上に置いていたライゲーション反応液２μｌを加え、氷上で３０分間インキュベーションを行い、コンピテント細胞間にＤＮＡを拡散させた。反応終了後、４２℃で４５秒間ヒートショックを与えてＤＮＡを取り込ませた後、氷上に戻し２分間静置した。そこに予め、室温に戻しておいた２５０μｌのＳＯＣ培地をクリーンベンチ内で加え、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間培養した。
【００８７】
１時間の培養中に、予め準備しておいたアンピシリンを含むＬＢプレート培地１枚に対し、１００μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧストックと、２０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを塗り広げ、１５〜３０分間乾燥させた。
【００８８】
培養終了後、アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地に、培養後の大腸菌液を５０μｌ、および１００μｌの２種類の濃度で塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
【００８９】
形質転換後の青／白判定によりＤＮＡ断片がインサートされていると考えられる白コロニーを１２コロニー選択し、偽陽性を除く為、更に画線培養を行った。画線培養では、形質転換後の大腸菌を培養したのと同様にアンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地を使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーにおける白コロニーの割合は、Ｈ鎖で９０％、Ｌ鎖で４６％であった。
【００９０】
＜プラスミドＤＮＡの調製＞
上記＜抗体可変領域遺伝子のクローニング＞で得られた大腸菌をアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。大腸菌培養液から０．７５ｍｌを取り、０．２ｍｌの８０％グリセロールと混合し、大腸菌のグリセロールストックとして−８０℃で保存した。プラスミドＤＮＡは残りの培養液を用いてアルカリＳＤＳ法により調製した。
【００９１】
残りの約５．２５ｍｌの培養液を１．５ｍｌマイクロチューブ６本に移し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離して集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。このマイクロチューブに、Solution Ｉ（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１００μｌ加えてボルテックスミキサーにかけよく懸濁した。
【００９２】
次にこのマイクロチューブに、Solution ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を２００μｌ加えて転倒混和後、当該マイクロチューブを氷中に５分間置き、Solution ＩＩＩ（３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＫ、２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＫ）を１５０μｌ加え緩やかに撹拌した後、当該マイクロチューブを氷上に５分間置いた。
【００９３】
そして、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、沈殿が入らない様に注意しながら上清を採り、新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移し、等量のフェノール・クロロフォルムを加えて攪拌した後、４℃、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。更に同じ作業を繰り返し、２回のフェノール・クロロホルム処理を行った後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移し、２．５等量の氷冷エタノール１ｍｌを加えて上下に振って攪拌し−７０℃で５分間静置した。そして、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を除去した。その後氷冷７０％エタノールを１ｍｌ加え、ペレットをリンスし４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を除去し、１５分間真空乾燥した。
【００９４】
乾燥終了後、ＴＥ（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液４５μｌでマイクロチューブ内のペレットを溶解し、さらにRNaseA溶液（５ｍｇ／ｍｌ RnaseA、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）５μｌ溶液を加えた(終濃度：５０μｇ／ｍｌ)。２本のマイクロチューブの溶液を１本のマイクロチューブにまとめ、３７℃で１時間反応させた。
【００９５】
反応終了後、２／３等量のＰＥＧ（１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．８Ｍ ＮａＣｌ）を加え、当該マイクロチューブを氷上に１時間以上置いた。その後、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した。当該マイクロチューブに、７０％エタノールを１ｍｌ加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。上清を除去後、真空乾燥を行った。真空乾燥後、１サンプルにつき５０μｌの滅菌水に溶解し、一本のチューブにまとめプラスミド溶液とした。そして、アガロース電気泳動によるバンド比較にてサンプルのＤＮＡ濃度を推測した。
【００９６】
＜塩基配列の決定＞
Thermo SequenaseＴＭCyＴＭ5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia社製) を用いて、塩基配列の決定を行った。アデニン（Ａ）用、シトシン（Ｃ）用、グアニン（Ｇ）用、およびチミン（Ｔ）用の４種類のＰＣＲチューブを用意し、各ＰＣＲチューブに、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分１μｌずつ分注した。
【００９７】
次にDNA/primer mixの調製を行った。＜プラスミドＤＮＡの調製＞で調製したＤＮＡ１．５μｇ、Reaction Buffer３．５μｌ、TOPO13 Reverse（４ｐｍｏｌ／μｌ）(Invitrrogen)１μｌ、およびThermo Sequenase（１０unit／μｌ）２μｌを混合し、滅菌超純水を添加し全量が３１．５μｌとなるようにした。これを上記ＰＣＲチューブに７μｌづつ分注し、すみやかにBiometoraサーマルサイクラーにセットし、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１２０秒間の反応サイクルを３０サイクル行い、４℃で冷却し反応を停止させた。
【００９８】
反応終了後、サンプルをＰＣＲチューブから１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２μｌ、および９８％エタノールを３０μｌ添加しよく混合した。このマイクロチューブを１０分間氷上で静置し、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。その後、キムワイプ上でデカンテーションして上清を除去し、７０％エタノールを２００μｌ添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、マイクロピペットを使用して上清を丁寧に除去した。そして遮光してペレットを乾燥させ、６μｌ Loading Dyeで溶解し、７２℃で、３分間熱処理を行い、LONG-READ TOWERTM System (Amersham Pharmacia Biotech.)に各２μｌずつローディングし、解析を行った。得られた塩基配列は、ＤＮＡＳＩＳソフトウェア（日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社製）を使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
【００９９】
〔実施例４：５Ｈ５抗体可変領域の立体構造予測〕
実施例３によって決定した塩基配列から推測した５Ｈ５抗体可変領域のアミノ酸配列をもとに、ソフトウエアAbM (Oxford Molecular社製、Oxford、UK)を用いて、目的抗体のＣＤＲ領域のループ構造およびＦＲ領域の立体構造を予測した。AbMで予測された立体構造をもとに、ソフトウエアInsightＩＩ/Discover3（Molecular Simulation社製、USA）により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１００】
さらに、ソフトウエアPPC Protein Adviser(富士通九州システムエンジニアリング社製)を用いて、立体構造中のセリンプロテアーゼ三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果、５Ｈ５抗体のＬ鎖にセリンプロテアーゼ三つ組み残基の存在が確認された。図３（ａ）に、５Ｈ５抗体のＬ鎖におけるＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群探索結果を示す。図３（ａ）に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列において、カバットの分類による番号で第３４番目のヒスチジン、カバットの分類による番号で第５２番目のセリン、カバットの分類による番号で第５０番目のアスパラギン酸が、Ｈｉｓ３３−Ｓｅｒ５１のＣα間は９．３３×１０−１０ｍ、Ｈｉｓ３３−Ａｓｐ４９のＣα間は６．１０×１０−１０ｍと空間的に近い位置で存在すると予測され、触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、Ｈｉｓ３４（カバットの分類による）、Ｓｅｒ５２（カバットの分類による）およびＡｓｐ５０（カバットの分類による）はいずれもＣＤＲ領域に存在していた。
【０１０１】
また、同様にして、立体構造中のセリンプロテアーゼ三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＧｌｕおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果、５Ｈ５抗体のＨ鎖にセリンプロテアーゼ三つ組み残基の存在が確認された。図３（ｂ）および（ｃ）に、５Ｈ５抗体のＬ鎖におけるＳｅｒ、ＧｌｕおよびＡｓｐの残基群探索結果を示す。図３（ｂ）に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において、カバットの分類による番号で第１番目のグルタミン酸、カバットの分類による番号で第２５番目のセリン、カバットの分類による番号で第１０１番目のアスパラギン酸が空間的に近い位置で存在すると予測され触媒三つ組残基を構成していると推測される。また、図３（ｃ）に示すように、カバットの分類による番号で第４０番目または第８４番目のセリン、カバットの分類による番号で第６１番目または８６番目のアスパラギン酸、カバットの分類による番号で第８５番目のグルタミン酸が空間的に近い位置で存在すると予測され触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、図中、５Ｈ５抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれのＣＤＲ１〜３をリボンで表現している。
【０１０２】
セリンプロテアーゼ三つ組み残基の存在が確認されたことより、これまでの発明者らによる多くの研究（Appl. Biochem. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immunol. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003); 化学工業、54, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004); 科学、75(11), 1254-1259(2005)）から、５Ｈ５抗体は抗体酵素である可能性が示唆された。そこで、５Ｈ５抗体におけるＨ鎖およびＬ鎖の抗原分解能の有無について検討を行うこととした。
【０１０３】
〔実施例５：５Ｈ５抗体の大量取得と精製〕
＜５Ｈ５抗体の大量取得＞
あらかじめプリスタン（2,6,10,14-tetramethylpentadecane、MP Biochemicals コード195455,Ohio,USA）を投与したBalb/cマウスの腹腔に５Ｈ５抗体を産生する抗体産生細胞０．５×１０６個を投与後、腹水を採取することにより５Ｈ５抗体を大量に取得した。このようにして取得した５Ｈ５抗体は以下の方法で精製し目的の実験に用いた。
【０１０４】
＜塩析＞
腹水約７ｍｌは濾過してフィブリンを除去し、同量のＰＢＳで希釈した。これを２本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で３０分間静置し、その後、４℃、１００００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して塩析し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。これを、１本のチューブに合わせ、ＰＢＳに対して２回透析した。
【０１０５】
＜カラム精製＞
透析終了後、MAPS-IIキット（BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット）を用いて５Ｈ５抗体の精製を行なった。操作はMAPS-IIキットに付属のマニュアルに従い、４℃で行なった。
【０１０６】
使用する試薬として、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、Elution buffer、および２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を以下のようにして調製した。０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳは、０．１ｇのＮａＮ３を２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。Binding bufferは、４７．１ｇのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、１５０ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが９±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。Elution bufferは２．３ｇのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが３±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１２．１１ｇのＴｒｉｓを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整した後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした。
【０１０７】
透析終了後、上記の塩析済みの腹水（約７ｍｌ）を濾過し脱気した。脱気後の腹水を、腹水: Binding buffer＝１:１．２になるように希釈した。また、精製操作前に、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、およびElution bufferを脱気した。
【０１０８】
アフィゲルプロテインＡを充填し、カラムを上記Binding bufferで洗浄した。ＵＶ ２８０ｎｍの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記Binding bufferでゲルを洗浄した。流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに調節し、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
【０１０９】
次に、５０ｍｌ以上のBinding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースラインが落ち着いたら、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、４５ｍｌのElution bufferを添加し、アフィゲルプロテインＡに結合した抗体を溶出させ、ピーク部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上記抗体画分（抗体液）は、ＰＢＳに対して２回透析した後、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer （ｐＨ８．０）に対して２回透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し、ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でタンパク濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度（１ｍｇ／ｍｌ未満の場合は濃縮して）で凍結保存した。
【０１１０】
〔実施例６：抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体重鎖(Ｈ鎖)および軽鎖（Ｌ鎖）の分離精製〕
＜限外濾過＞
実施例５で５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer （ｐＨ８．０）に対して２回透析した後の抗体溶液５ｍｇ分を、セントリプレップ−１０を用いて、４℃、２８００ｒｐｍで遠心分離し、約１ｍｌになるまで限外濾過により濃縮した。さらに、５ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、約１ｍｌになるまで再び遠心分離した。この操作を再度行い、限外濾過による濃縮後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で抗体溶液を２．７ｍｌに調整し、褐色瓶に入れ以下の実験に使用するまで低温で保存した。
【０１１１】
＜重鎖・軽鎖の分離＞
抗体溶液２．７ｍｌ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）、および１Ｍ Tris ／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）をそれぞれ脱気した。抗体溶液２．７ｍｌに２Ｍ ２−ＭＥ(メルカプトエタノール)３００μｌを加えて撹拌した後、１Ｍ Tris ／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）でｐＨ８に調整し、反応容器内に窒素を封入して、１５℃で３時間撹拌し還元反応を行った。この反応液に３ｍｌの０．６Ｍヨードアセトアミド／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）を添加し、反応容器内に窒素を封入して、１Ｍ Tris ／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）でｐＨ８に調整した後、１５℃で１５分間撹拌しながらアシル化反応を行なった。
【０１１２】
続いてディスクフィルター（ミリポア製サンプレップLCR13-LH、０．５μｍ）で反応液を濾過し粒子を除去した。この粒子除去後の反応液を、セントリプレップ−１０を用いて、液量が約０．５ｍｌ以下になるまで濃縮し、ウルトラフリー（０．２μｍ）で濾過した。
【０１１３】
＜サイズ排除ＨＰＬＣによる５Ｈ５抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の精製＞
５Ｈ５抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の精製は、上記のようにして得られた抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより行った。
【０１１４】
サイズ排除クロマトグラフィーシステムとして、ＰＵ−２０８０ Ｐｌｕｓ（ＪＡＳＣＯ社製）を用いた。また、カラムには、Protein-PakTM300SW（φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ；Waters製）を用いた。上記カラムの平衡化は、移動相に用いる６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ６．５）を、０．１５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、約２時間流すことにより行った。サンプル（上記アシル化処理後の抗体溶液）は、２〜３回に分けて供した。Ｈ鎖およびＬ鎖に相当する分画を分取した。分取後の各画分はＰＢＳに対して透析を行い、Ｈ鎖およびＬ鎖をRefoldingした。１５ｍＭ ＰＢに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でＨ鎖およびＬ鎖の濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認して４℃で保存した。このようにして調製したＨ鎖およびＬ鎖の液量と濃度を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
〔実施例７：５Ｈ５抗体重鎖および軽鎖によるペプチダーゼ活性の検討〕
天然型抗体酵素は、タンパク質を基質として用いる場合には標的タンパク質を特異的に分解するという特徴を持つ。しかし、ペプチド基質においては、非特異的に分解することが分かっている。そこでこれまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性試験で基質として用いてきたＴＰ４１−１ペプチド（H２N-TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD-COOH : 21mer、配列番号５）を使用して５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖が該ペプチドに対する分解能を有するか検討した。なお上記ＴＰ４１−１ペプチドは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の膜貫通タンパク質ｇｐ４１の保持領域ペプチドである。また、５Ｈ５抗体重鎖としては、〔実施例６〕で分離精製したＨ鎖であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を用い、５Ｈ５抗体軽鎖としては、〔実施例６〕で分離精製したＬ鎖であるＬ１、Ｌ２およびＬ３を用いた。
【０１１６】
実験操作は全てクリーンベンチ内で行い、使用する試験管、緩衝液などは、すべて滅菌処理を行った後、使用した。
【０１１７】
＜ＴＰ４１−１ペプチドを用いたペプチダーゼ活性試験＞
クリーンベンチ内で、ＴＰ４１−１ペプチド１．７ｍｇをはかり取り、１ｍｌの１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で溶解した後、γ線照射済みのウルトラフリーでろ過滅菌した。この１．７ｍｇ／ｍｌのＴＰ４１−１ペプチドを１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で６００μＭ、３６０μＭ、２４０μＭに調整した。次に〔実施例６〕で分離精製した５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１およびＨ３を１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で４０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に、５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１およびＬ３を４０μｇ／ｍｌ（１．６μＭ）に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２を１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で４０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２を１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で４０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に調整した。上記２４０μＭ ＴＰ４１−１ペプチドと、Ｈ１、Ｈ３、Ｌ１、およびＬ３をそれぞれ１：１で混合した。また３６０μＭ ＴＰ４１−１ペプチドと５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２とを１：２、６００μＭ ＴＰ４１−１ペプチドと５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ２とを１：４で混合した。下表３に、調整したＴＰ４１−１ペプチドおよび５Ｈ５抗体Ｈ鎖またはＬ鎖を含む反応液を示す。
【０１１８】
【表３】
調製直後の反応液を逆相ＨＰＬＣで分析したときを０時間とし、２５℃でインキュベートを開始した。その後逆相ＨＰＬＣでＴＰ４１−１ペプチドを経時的に追跡した。逆相ＨＰＬＣの分析には、puresil C18カラム（Waters製）を使用した。
【０１１９】
なお、ＨＰＬＣの測定条件として、カラムオーブンは４０℃、溶離液は０．０８％ ＴＦＡ、１３％アセトニトリル、超純水を使用し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、モニター波長２１４ｎｍとした。各反応液をクリーンベンチ内で３０μｌ回収し、当該反応液を０．４５μｍのフィルターに通し、除粒子したものをサンプルとしてＨＰＬＣに供した(サンプルのインジェクション量２０μl)。
【０１２０】
図４に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１、Ｈ３または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１、Ｌ３を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図５に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ２を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示す。また、図１０に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図中矢印で示す経時時間で採取したサンプルのＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムとともに示す。また、図１１に、５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図中矢印で示す経時時間で採取したサンプルのＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムとともに示す。図１０および図１１中、丸はそれぞれＨ１およびＬ１を用いたときの結果を、四角はＴＰ４１−１ペプチドのみを反応液としたときの結果を示している。また、クロマトグラム中の矢印は、反応基質のピークを示す。
【０１２１】
また、図４において、白丸はＨ１を、グレーの丸はＨ３を、白三角はＬ１を、グレーの三角はＬ３を用いたときの結果を示している。また、図５において、グレーの丸はＨ２を、グレーの三角はＬ２を用いたときの結果を示している。また、図４および図５において、グレーの四角はＴＰ４１−１ペプチドのみを反応液としたときの結果を示している。
【０１２２】
図４に示すように、Ｈ１を用いた場合に、約４０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、約１１４時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。また、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ３を用いた場合に、約４０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、９０〜１２０時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。
【０１２３】
また、図５に示すように、Ｈ２を用いた場合に、約７０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、約９６時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。そして、Ｌ２を用いた場合に、約７０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、約１１０時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。
【０１２４】
以上のように、全ての反応液において、これまで多くの抗体酵素で見られたと同様、誘導期、活性期の２相性を示しながらペプチドである反応基質が分解されたことが確認された。
【０１２５】
＜ＴＰ４１−１ペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性試験＞
次に、５Ｈ５抗体のＨ鎖およびＬ鎖によりペプチド（ＴＰ４１−１ペプチド）が消失した上記ペプチダーゼ活性試験後の反応液に再度ペプチド（ＴＰ４１−１ペプチド）を添加し、分解産物が観察できるかを検討した。
【０１２６】
ウルトラフリーでろ過滅菌し、４℃で保存していた１．７ｍｇ／ｍｌのＴＰ４１−１ペプチドを１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で２４０μＭに調整した。次に、上記ペプチダーゼ活性試験後の各反応液と１：１で混合し、本ペプチダーゼ活性試験の反応液とした。また、ＴＰ４１−１ペプチドのみを含む反応液をコントロールとして準備した。下表４に、調整した反応液を示す。
【０１２７】
【表４】
調整した反応液について、上記ペプチダーゼ活性試験と同様にして、ＨＰＬＣでＴＰ４１−１ペプチド濃度を追跡した。
【０１２８】
図６、７に、ＴＰ４１−１ペプチド再添加後の反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、ＴＰ４１−１ペプチドを再添加する前に行った上記ペプチダーゼ活性試験における反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化と併せて示す。図６は、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１、Ｈ３または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１、Ｌ３を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図７に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ２を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示す。
【０１２９】
なお、図６において、白丸はＨ１を、グレーの丸はＨ３を、白三角はＬ１を、グレーの三角はＬ３を用いたときの結果を示している。また、図７において、グレーの丸はＨ２を、グレーの三角はＬ２を用いたときの結果を示している。
【０１３０】
また、図８および９は、同じデータを抗体鎖別に表したグラフであって、ＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示すものである。図８は、５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図９は、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示す。また、図８および図９において、グレーの四角はＴＰ４１−１ペプチドのみを反応液としたときの結果を示している。
【０１３１】
図６〜９に示すように、ＴＰ４１−１ペプチドを再添加した結果、Ｈ鎖およびＬ鎖ともに若干の誘導期が存在したものの、再添加してから、２４時間乃至４０時間以内にペプチドは完全に消失した。またＨＰＬＣにおいて分解産物のピークはＴＰ４１−１ペプチドよりも前に出現していた。
【０１３２】
〔実施例８：５Ｈ５抗体重鎖および軽鎖によるＩｇＥの分解実験〕
実施例７に示すように、５Ｈ５抗体のＨ鎖およびＬ鎖はペプチダーゼ活性を有することが明らかとなった。そこで、次に５Ｈ５抗体のＬ鎖が、抗原タンパクであるＩｇＥを分解する能力を有するか否かの検討を行った。
【０１３３】
抗原タンパクには、実施例１で用いたヒトＩｇＥを用いた。これをまず１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に交換し、濾過滅菌して用いた。
【０１３４】
次に〔実施例６〕で分離精製した５Ｈ５抗体Ｌ鎖を２０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に調整した。上記ヒトＩｇＥ（６０μｇ／ｍｌ（０．３０μＭ））と、５Ｈ５抗体Ｌ鎖とをそれぞれ１：１で混合し、全量を４００μｌとした。分解実験における反応液の濃度は、５Ｈ５抗体Ｌ鎖が０．４μＭ（１０μｇ／ｍｌ）、ヒトＩｇＥが０．１５μＭ（３０μｇ／ｍｌ）であった。また、コントロールとして、０．４μＭ（１０μｇ／ｍｌ）の５Ｈ５抗体Ｌ鎖のみの反応液４００μｌ、および０．１５μＭ（３０μｇ／ｍｌ）のヒトＩｇＥのみの反応液４００μｌを用いた。
【０１３５】
反応時間４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１４４時間において、各タンパク質の反応液の一部をクリーンベンチ内で分取し、各タンパク質の経時変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥで追跡した。その結果を、図１２に示す。図１２中（ａ）は、ヒトＩｇＥと、５Ｈ５抗体Ｌ鎖とを含む反応液における結果を、（ｂ）は、ネガティブコントロールであるヒトＩｇＥのみの反応液における結果を（ｃ）は５Ｈ５抗体Ｌ鎖のみの反応液における結果を示す。なお、図中Ｍはマーカー（Low range marker Bio-Rad）を示し、１ないし９は、それぞれ、０、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１４４時間後の結果を示す。また、図１３には、反応開始後に出現したバンドの濃さの経時変化を示す。なお、バンドの濃さは、ＮＩＨイメージにより測定した相対値である。
【０１３６】
図１２（ａ）および図１３に示すように、反応開始２４時間付近でヒトＩｇＥの重鎖において分解断片である３つのバンド（４３ｋＤａ（図１２（ａ）中、上から２番目の矢印で示す。）、３９ｋＤａ（図１２（ａ）中、上から３番目の矢印で示す。）、３７ｋＤａ（図１２（ａ）中、上から４番目の矢印で示す。）が出現し、だんだんと濃くなっていった。３９ｋＤａのバンドは反応時間１４４時間で減少傾向を示し、このバンドに対応する断片はさらに分解が進んで３７ｋＤａあるいはもっと小さい断片に逐次分解されていると思われる。一方、ヒトＩｇＥの軽鎖は全く分解を受けていない。
【０１３７】
また、図１２（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールであるヒトＩｇＥのみの反応液では、８３ｋＤａおよび８０ｋＤａにヒトＩｇＥのＨ鎖を示す太いバンド、並びに、２９ｋＤａにヒトＩｇＥのＬ鎖を示す太いバンドが検出され、これらのバンドは１４４時間経過後も全く変化が見られなかった。このことから５Ｈ５抗体のＬ鎖はヒトＩｇＥの重鎖を特異的に認識し分解する抗体酵素であることが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明にかかる抗体酵素は、上述のようにヒトＩｇＥに対して特異的に作用し、これを分解して機能を消失させることができるため、Ｉ型アレルギーの予防や治療のために有用である。また、酵素であるため、酵素センサの構築が可能であり、抗体よりも応用範囲が広い。
【０１３９】
したがって、本発明は、医療、医薬品産業、試薬産業、等に利用することができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本発明の抗体酵素の一例である５Ｈ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ領域を示す図である。
【図２】本発明の抗体酵素の一例である５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ領域を示す図である。
【図３】５Ｈ５抗体の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図であり、（ａ）は５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域の推定された立体構造を模式的に示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は５Ｈ５抗体の重鎖可変領域の推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図４】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図５】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図６】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図７】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図８】５Ｈ５抗体の軽鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図９】５Ｈ５抗体の重鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図１０】５Ｈ５抗体の重鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図１１】５Ｈ５抗体の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図１２】５Ｈ５抗体Ｌ鎖によるヒトＩｇＥの分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により追跡した結果を示す図であり、（ａ）は、５Ｈ５抗体Ｌ鎖によるヒトＩｇＥの分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により追跡した結果を、（ｂ）は、ネガティブコントロールであるヒトＩｇＥのみの反応液における結果を（ｃ）は５Ｈ５抗体Ｌ鎖のみの反応液における結果を示す図である。
【図１３】５Ｈ５抗体Ｌ鎖によるヒトＩｇＥの分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により追跡した結果、反応開始後に出現したバンドの濃さの経時変化を示すグラフである。
【図１４】実施例において得られた抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図１５】実施例において得られた抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩｇＥに対する抗体酵素およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは抗原と接触してから発症するまでの時間によって、即時型過敏症(immediate-type hypersensitivity)と遅延型過敏症(delayed-type hypersensitivity)との二つのグループに分類される。即時型過敏症は抗体により引き起こされる症状で、アレルギー発症の機構からＩ型乃至ＩＩＩ型に分類されている。
【０００３】
現在、アレルギー患者数は急激に増加しており、多くの人々が花粉症等のアレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息等の症状に苦しんでいる。これらの症状はＩ型アレルギーに属し、体内に侵入したアレルゲンに対し産生されたＩｇＥ抗体により引き起こされる。
【０００４】
ＩｇＥ抗体を介したアレルギーの発症機構はほぼ解明されている。まずアレルゲンが体内に侵入し、アレルゲンに特異的なＩｇＥが産生される。ＩｇＥ抗体値があるレベルまで上昇すると、ＩｇＥ抗体のＦｃ部分を結合するＦｃεレセプターを持つ肥満細胞(mast cell)と好塩基球(basophile)という特殊な細胞にＩｇＥ抗体が結合しはじめ、長期にそれらの細胞と結合したまま血中に存在する。再度アレルゲンが侵入した場合、抗原抗体反応が惹起され、この刺激で肥満細胞や好塩基球からヒスタミンなどの化学伝達物質の入った顆粒が細胞外に放出される（脱顆粒反応(degranulation reaction)）。
【０００５】
この脱顆粒反応により放出されたヒスタミン、ＳＲＳ−Ａ(slow reacting substance of anaphylaxis)や好酸球走化性因子等の化学伝達物質により血管の浸透性の増大、平滑筋の収縮、分泌液を分泌する機能の増大などが起こり、アレルギー症状を引き起こす。また、好酸球が反応局所に集積するので、アレルゲンが除去される。こうした機構からＩｇＥ抗体はアレルギーを引き起こすが、その障害反応を通じてアレルゲンの粘膜からの侵入や全身への拡散を防いだり、除去する為に働くと考えられている。
【０００６】
現在、Ｉ型アレルギーの治療法はいくつかあるが、その一つに脱感作療法がある。この方法は、アレルギーを誘発しない程の少量のアレルゲンを期間を置いて数回注射し、予めアレルゲンに対するＩｇＧ抗体を産生させておく。そして再度侵入したアレルゲンにこの抗体が結合することによって、ＩｇＥ抗体のアレルゲンへの結合が阻害され、アレルギーが抑制される。その他に、脱顆粒を阻害する医薬や、放出された化学伝達物質の作用を阻害する医薬の研究がすすめられている。また、ＩｇＥと結合する抗ＩｇＥ抗体をＩ型アレルギーの治療に用いることについても報告されている（例えば、特許文献１等参照。）。
【特許文献１】特表２００２−５１０２１１号公報（公開日：平成１４年（２００２）４月２日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、従来公知のヒトＩｇＥを認識しヒトＩｇＥの中和活性を有する抗ＩｇＥ抗体においては、抗ＩｇＥ抗体と抗原であるＩｇＥとは最大で１：２の分子の量論比でしか結合しないため、使用する抗ＩｇＥ抗体の量が必然的に多くならざるを得ないという問題があった。また、ヒトＩｇＥを破壊して完全にその機能を失わせることは不可能であった。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、血中ヒトＩｇＥあるいはその機能を低減するためにこれまでの方法に比べ、使用する抗ＩｇＥ抗体の量をかなり低減することが可能なヒトＩｇＥ抗体に対する抗体酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ヒトＩｇＥに対する抗体酵素を得るために鋭意検討した。その結果、ヒトＩｇＥを免疫抗原に用いて得られた抗体の中に、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを切断および／または分解することができる抗体酵素としての機能を発揮するものが存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明にかかる抗体酵素は、上記課題を解決するために、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明にかかる抗体酵素断片は、上記課題を解決するために、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する上記抗体酵素の可変領域を含むことを特徴としている。
【００１２】
また、本発明にかかる抗体酵素または抗体酵素断片においては、重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなっていてもよい。
【００１３】
また、本発明にかかる遺伝子は、上記抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片をコードすることを特徴としている。また、本発明にかかる形質転換体は、上記遺伝子が導入されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかる抗体酵素は、以上のように、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するという構成を備えているので、１分子で１つ（あるいは２つ）のヒトＩｇＥに結合する抗体に比べ、抗体酵素は１分子で次から次にヒトＩｇＥ分子を破壊することができる。それゆえ、かかる抗体酵素を得ることができればヒトＩｇＥが原因物質であるＩ型アレルギーの予防・治療に寄与することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００１６】
（１）本発明にかかる抗体酵素およびその利用
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する抗体酵素である。すなわち、本発明にかかる抗体酵素はヒトＩｇＥを特異的に認識する抗体としての性質と、認識したヒトＩｇＥを切断および／または分解する酵素としての性質を併せ持つ。
【００１７】
ここで、「抗体酵素」とは、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有する免疫グロブリンをいう。また、酵素活性は特に限定されるものではないが、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性であることが好ましい。
【００１８】
本発明の抗体酵素は、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性を有する。すなわち、本発明の抗体酵素は、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その抗原タンパク質を標的として分解活性を示すものである。それゆえ、本発明の抗体酵素は、１分子で１つ（あるいは２つ）のヒトＩｇＥ分子に結合する抗体に比べ、１分子で次から次にヒトＩｇＥ分子を破壊することができる。したがって、その効果は通常の抗体の数百倍あるいは数千倍に達する。それゆえ、かかる抗体酵素を得ることができればヒトＩｇＥを原因とするＩ型アレルギーの予防・治療に寄与することが期待できる。また、酵素であるため、酵素センサの構築が可能であり、抗体よりも応用範囲が広い。
【００１９】
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＩｇＥに対する抗体である。ここで、ヒトＩｇＥに対する抗体は、ヒトＩｇＥに対するポリクローナル抗体であってもよいが、ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体であることがより好ましい。これにより、特異性に優れた抗体を選択することが可能となる。
【００２０】
ここで、本発明の抗体酵素の由来は特に限定されるものではない。したがって、上記抗体酵素は、細胞融合によって得られたマウス等のモノクローナル抗体に由来する抗体酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌、動物細胞等で生産される抗体であってもよいし、本発明の抗体酵素の可変領域をヒトその他の動物の抗体に移植したヒト化抗体等のキメラ抗体であってもよい。あるいは、ファージディスプレイ法を用いて作製した抗体であってもよい。
【００２１】
本発明の抗体酵素は、ヒトＩｇＥを認識するものであればよく、ヒトＩｇＥに対するあらゆる抗体が含まれるが、ヒトＩｇＥの定常領域に存在するアミノ酸配列を認識するものであることが好ましい。定常領域に存在するアミノ酸配列を認識するものであることによって、種々の可変領域を有するＩｇＥに対し、抗体酵素としての作用を及ぼすことができる。
【００２２】
また、上記本発明にかかる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。ここで上記「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことをいう。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（例えば特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とのＣα（α炭素）間の距離が、少なくとも３〜２０×１０−１０ｍの範囲内、好ましくは、３〜１０×１０−１０ｍの範囲内にあることを意味する。
【００２３】
本発明の抗体酵素は、上述した抗体酵素であれば特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、重鎖可変領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素を挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、後述する実施例に示す本発明の抗体酵素である抗ＩｇＥモノクローナル抗体５Ｈ５（以下、５Ｈ５抗体と称する。）の重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号３に示すアミノ酸配列は、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。図１に５Ｈ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）を、図２に５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。図１に示すように、５Ｈ５抗体の重鎖可変領域は、下線を付して示す、相補性決定領域（ＣＤＲ領域）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち５Ｈ５抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列の３１番目から３５番目（カバットの分類による番号で３１番目から３５番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０番目から６６番目（カバットの分類による番号で５０番目から６５番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１に示すアミノ酸配列の９７番目から１０５番目（カバットの分類による番号で９３番目から１０２番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。また、図２に示すように、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域は、下線を付して示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列の２４番目から３３番目（カバットの分類による番号で２４番目から３４番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３に示すアミノ酸配列の４９番目から５５番目（カバットの分類による番号で５０番目から５６番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号３に示すアミノ酸配列の８８番目から９６番目（カバットの分類による番号で８９番目から９７番目）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。なお、図１および図２においてアミノ酸に付した番号は、カバットの分類による番号であり、各配列番号に示すアミノ酸配列において何番目のアミノ酸であるかを示す番号とは異なっている。
【００２４】
図３（ａ）には、５Ｈ５抗体軽鎖の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。また、図３（ｂ）および（ｃ）には、５Ｈ５抗体重鎖の可変領域の立体構造モデリングを行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す。図３（ａ）に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列において、カバットの分類による番号で第３４番目のヒスチジン、カバットの分類による番号で第５２番目のセリン、カバットの分類による番号で第５０番目のアスパラギン酸が触媒三つ組残基を構成していると推測される。また、５Ｈ５抗体重鎖では、図３（ｂ）に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列においてカバットの分類による番号で第１番目のグルタミン酸、カバットの分類による番号で第２５番目のセリン、カバットの分類による番号で第１０１番目のアスパラギン酸が触媒三つ組残基を構成している場合と、図３（ｃ）に示すように、カバットの分類による番号で第４０番目または第８４番目のセリン、カバットの分類による番号で第６１番目または８６番目のアスパラギン酸、カバットの分類による番号で第８５番目のグルタミン酸が触媒三つ組残基を構成している場合とが考えられる。このように、５Ｈ５抗体軽鎖では、ヒスチジン、セリンおよびアスパラギン酸が三つ組み残基として機能し、５Ｈ５抗体重鎖では、グルタミン酸、セリンおよびアスパラギン酸が触媒三つ組残基として機能していると考えられる。
【００２５】
また、本発明にかかる抗体酵素は、重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、および／または、軽鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもので、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものであってもよい。かかる抗体酵素は、５Ｈ５抗体の変異体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものである。なお、上記の「配列番号１（３）に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。好ましい変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加である。より好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００２６】
また、本発明には、本発明の抗体酵素の断片であって、上記抗体酵素の可変領域を含む抗体酵素断片も含まれる。かかる抗体酵素断片としては、上記抗体酵素の可変領域含む抗体酵素断片であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する抗体酵素断片であれば特に限定されるものではない。かかる抗体酵素断片は、上記抗体酵素の重鎖（Ｈ鎖）であってもよく、上記抗体酵素の軽鎖（Ｌ鎖）であってもよく、上記抗体酵素の重鎖の可変領域であってもよく、上記抗体酵素の軽鎖の可変領域であってもよく、上記抗体酵素の重鎖または軽鎖の可変領域を含むいかなる抗体酵素断片であってもよい。かかる抗体酵素断片は、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するので、１分子で１つ（あるいは２つ）のヒトＩｇＥに結合する抗体に比べ、抗体酵素は１分子で次から次にヒトＩｇＥ分子を破壊することができる。それゆえ、かかる抗体酵素断片を得ることができればヒトＩｇＥが原因物質であるＩ型アレルギーの予防・治療に寄与することができる。また、上記抗体酵素の重鎖または軽鎖の可変領域或いはそのＣＤＲ領域は、かかる可変領域またはＣＤＲ領域をヒトその他の動物の抗体に移植してキメラ抗体酵素を作製するために好適に用いることができる。
【００２７】
かかる抗体酵素断片としては、例えば、配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素断片やこれらのアミノ酸配列を含む抗体酵素断片を挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、５Ｈ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号３に示すアミノ酸配列は、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２８】
また、上記抗体酵素断片は、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素断片やかかるアミノ酸配列を含む抗体酵素断片であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものであってもよい。かかる抗体酵素断片は、それぞれ、５Ｈ５抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の変異体またはかかる変異体を含む抗体酵素断片であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有するものである。
【００２９】
また、本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子、上記抗体酵素の断片であって上記抗体酵素の可変領域を含む抗体酵素断片をコードする遺伝子、または、上記抗体酵素の断片であって上記抗体酵素の各ＣＤＲ領域をコードする遺伝子も含まれる。かかる遺伝子を適当な宿主に発現可能に導入することにより、本発明の抗体酵素または抗体酵素断片を宿主内で発現させることができる。また、可変領域の抗体酵素断片をコードする遺伝子は、そのまま発現させてもよいが、例えばヒト免疫グロブリン等、由来の異なる免疫グロブリンの定常領域、あるいは可変領域内のフレームワークをコードする遺伝子と連結してキメラ遺伝子として発現させ、キメラ抗体酵素を製造することもできる。また、上記可変領域のＣＤＲをコードする遺伝子を、由来の異なる免疫グロブリンの可変領域に組み込んでキメラ遺伝子として発現させ、キメラ抗体酵素を製造することもできる。
【００３０】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった一本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素、またはその断片をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む。）等の配列を含むものであってもよい。
【００３１】
本発明の遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号２または４に示す塩基配列からなる遺伝子、またはこれらを含む遺伝子を挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子は、５Ｈ５抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の一例であり、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子は、５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の一例である。
【００３２】
また、上記遺伝子は、配列番号２または４に示される塩基配列と必ずしも同一である必要はなく、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有する抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子であれば、その変異体も含まれる。このような変異体としては、上記抗体酵素またはその断片をコードする遺伝子の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。また、かかる変異体は、配列番号２または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
【００３３】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（すなわち、ハイブリダイズし難くなる）。
【００３４】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。この形質転換体は、上記遺伝子が適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入されたものであり、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内で発現させることができ、当該抗体酵素の製造に利用することができる。また、上記形質転換体は、本発明にかかる抗体酵素を自身の体内に蓄積しているため、Ｉ型アレルギーを予防または治療するための薬剤として利用することができる。
【００３５】
また、これまでに、ＩｇＥの働きを抑制する作用をもつ抗ＩｇＥ薬剤は開発されているが、本発明にかかる抗体酵素は、これらの抗ＩｇＥ薬剤とは全く異なる手法に基づいて、ヒトＩｇＥを直接攻撃してその機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗ＩｇＥ薬剤として利用することができる。
【００３６】
上記本発明にかかる抗体酵素またはその可変領域を含む抗体酵素断片を含む抗ＩｇＥ薬剤は、本発明にかかる抗体酵素のみによって構成してもよいが、薬理学的に許容される担体などと混合して構成してもよい。医薬組成物の製造法として公知の手段に従って、上記抗ＩｇＥ薬剤を製造することができる。
【００３７】
ここで、薬理学的に許容される担体には、製剤素材として使用可能な各種有機または無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。
【００３８】
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００３９】
また、上記結合剤としては、例えばα化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００４０】
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００４１】
上記溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。
【００４２】
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４３】
上記懸濁剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。
【００４４】
上記等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００４５】
上記無痛化剤としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００４６】
上記防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００４７】
抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００４８】
上記抗ＩｇＥ薬剤は、製剤技術分野において慣用の方法により製造することができる。抗ＩｇＥ薬剤の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤のほか、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等の非経口剤が挙げられ、これらは毒性も低く、それぞれ経口的または非経口的に投与できる。
【００４９】
また、上記抗ＩｇＥ薬剤の投与量は、投与対象、投与ルート、症状などによっても異なる。したがって、上記投与量は、最適な条件を適宜検討の上、採用すればよい。
【００５０】
（２）本発明にかかる抗体酵素の製造方法
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ヒトＩｇＥで免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。重鎖、軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖に分離すればよい。また、本発明の抗体酵素断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体酵素断片が得られるように切断すればよい。
【００５１】
モノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)）、ファージディスプレイ法等により行なわれる。
【００５２】
マウス等に免疫する抗原として用いるヒトＩｇＥは特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。市販のヒトＩｇＥを用いてもよい。
【００５３】
また、アミノ酸配列が明らかになっている抗体酵素または抗体酵素断片については、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いて本発明の抗体酵素を製造することができる。この場合、上記抗体酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現可能な適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたポリペプチドを精製する等の方法を用いることができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく製造することができる。
【００５４】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、先ずモノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００５５】
また、本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、モノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行い、該当する領域を増幅させることで本発明にかかる抗体酵素をコードする遺伝子取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、配列番号２または４に示す塩基配列からなる遺伝子に適当な変異を導入すれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体が発現産物としてそれぞれ得られる。
【実施例１】
【００５６】
〔実施例１：抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の作製〕
免疫用の抗原として市販のヒトＩｇＥ（Chemicon International, CA. USA）をBalb/cマウス（雌６週齢）に免疫し、ポリエチレングリコールによる通常の細胞融合法により、抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を作製した。
【００５７】
＜マウスへの免疫＞
完全フロイントアジュバント（Freund’s complete adjuvant:以下「ＦＣＡ」と略称することがある、DIFCO, Detroit Michigan USA）と抗原であるヒトＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ）とを、ルアーロック式のシリンジ ２本のそれぞれにセットし、ウオーターインオイルの要領でＦＣＡと抗原とを白い乳液状になるまで混合した。次に、この混合物を、マウスの腹部皮下の２箇所に１００μlずつ投与した。
【００５８】
免疫注射から１０日後にマウスの採血を行い、通常のＥＬＩＳＡ法で力価の測定を行った。以下に力価の測定方法を示す。
【００５９】
ヒトＩｇＥをＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬになるように調製した。このヒトＩｇＥを９６穴ウェルプレートにそれぞれ別系列で５０μＬずつ注入した。４℃で一晩放置してコーティングした後、イムノウォッシャーを用いて０．０５％のTween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを３回洗浄した。続いてすべてのウェルに２％ゼラチンを含むＰＢＳを１５０μｌずつ加えた。室温で１時間インキュベーションし、ブロッキングを完了した。
【００６０】
採取した抗血清をＰＢＳで１／１００希釈し、１／１００から４倍連続希釈を７回繰り返し、１サンプルにつき抗血清希釈液を８種類用意した。また未処理マウスの血清も抗血清と同様に希釈を行いコントロールとして用いた。ブロッキングが終了した各ウェルに、連続希釈した抗血清を５０μｌずつ加え、室温で１時間静置した(一次反応)。洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで希釈調整したアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識ウサギ抗マウス血清を各ウェルに５０μＬずつ加えた。室温で１時間静置した(二次反応)。プレートを洗浄後、ＡＬＰ基質(p-nitrophenyl phosphate)を各ウェルに１００μＬずつ加え、３０分後にイムノリーダー（波長４０５ｎｍ）で吸光度を測定した。
【００６１】
初回免疫から約２週間後に追加免疫を行った。２回目からはＦＣＡの代わりに不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いた。免疫の方法は初回免疫と同様に行い、マウス１匹あたり５０μｇの抗原を投与した。
【００６２】
１０日後眼窩静脈叢より採血を行い、ＥＬＩＳＡ法により再度力価測定を行った。追加免疫後、力価が十分上がったマウスに最終免疫を行った。最終免疫はアジュバントは使用せずに滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を抗原と混合してマウス尾静脈に投与した。このときマウス１匹あたり抗原を５０μｇ投与した。
【００６３】
＜細胞融合＞
最終免疫の３日後にマウスから脾臓を摘出し、マウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合を行った。この細胞融合はポリエチレングリコールを使って行う通常の方法で行った。その後、スクリーニング、クローニングを繰り返し、表１に示す１１個の抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体産生細胞を確立した。
【００６４】
【表１】
＜アイソタイプの決定＞
確立した抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のアイソタイプ決定を、Iso StripTM マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて行った。アイソタイプの決定は添付のマニュアルに従って行った。その結果を表１に併記する。
【００６５】
〔実施例２：抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のタンパク質との交差反応試験〕
得られた抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の培養上清を用いて、実施例１で抗原として用いたヒトＩｇＥおよび他の種々のタンパク質との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。他のタンパク質としては、ＩｇＧ、Human-γ-globlin(ヒトγ−グロブリン)、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびHuman-hemoglobin（ヒトヘモグロビン）を用いた。
【００６６】
交差反応試験は以下のようにして行った。ヒトＩｇＥ、ＩｇＧ、Human-γ-globlin、ＨＳＡ、ＫＬＨ、ＢＳＡおよびHuman-hemoglobinはそれぞれＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴のウェルプレートに２００μｌずつ入れコーティングを行った。培養上清はＰＢＳ−Ｔで１／２希釈し、一次反応に用いた。その他の操作は上述した力価測定と同様に行った。
【００６７】
図１４および図１５に交差反応試験の結果を示す。図１４および図１５に示すように、実施例１で確立した抗体産生細胞によって産生される抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体はいずれもヒトＩｇＥと特異的に反応し、他のタンパク質とは反応しなかった。ただし、３Ｅ８および４Ｃ５はヒトＩｇＧとも交差反応した。また、それぞれの抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のヒトＩｇＥとの反応性を表１に併記する。
【００６８】
〔実施例３：５Ｈ５抗体可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列の決定〕
得られた５Ｈ５抗体可変領域の塩基配列を以下に示す方法で決定し、アミノ酸配列を推測した。
【００６９】
＜抗体産生細胞の培養＞
５Ｈ５抗体を産生する抗体産生細胞は、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５．５％の条件下、２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中で１×１０７〜５×１０７細胞が得られるまで培養した。培養液を、５０ｍｌ遠心チューブに移し、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行って細胞を回収した。培地をアスピレーターにて除去後、１０ｍｌのＰＢＳで懸濁し、１つのチューブにまとめて再度１４００ｒｐｍで６分遠心分離を行った。上清を吸引除去後再度１０ｍｌのＰＢＳで懸濁して血球計算盤を使用し細胞数をカウントした。
【００７０】
カウント後１×１０７〜５×１０７細胞分の細胞懸濁液を取り、再度１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行って上清を除去した。さらに、ペーパータオル上で逆さにし完全に液を切った。アスピレートが不十分であれば、再度遠心分離を行いマイクロピペットで残ったＰＢＳを除去した。
【００７１】
＜ｍＲＮＡの抽出と精製＞
ｍＲＮＡの抽出はQuickPrepＴＭ mRNA purification Kit (アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製)を用いて、当該キットの推奨プロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
【００７２】
上記で回収した細胞のペレットに、予め３７℃のインキュベーターに約３０分静置して結晶を完全に溶解させた１．５ｍｌのExtraction bufferを添加した。この細胞を、２１Ｇの針に数回通すことにより破砕した。その細胞破砕溶液に３ｍｌのElution bufferを加え更に細胞を破砕した。得られた細胞破砕溶液をＲＮアーゼフリーの１．５ｍｌマイクロチューブ４本に分注し、室温（２５℃）、１８０００×ｇで２０分間遠心分離を行い、その上清を後述のoligo(dT)-cellulose spin columnに添加するサンプルとした。
【００７３】
続いてｍＲＮＡを単離した。まず、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁し、上下のキャップを外して１５ｍｌの遠心チューブにセットし、１３００ｒｐｍで１分４５秒間遠心分離を行ってカラム内の保存液の除去を行った。その後、下キャップを装着し、除タンパク・除ＤＮＡした上記サンプル（上清）を４ｍｌ添加し上キャップを取り付けた。カラムの樹脂を懸濁した後、１０〜１５分間転倒混和し樹脂にｍＲＮＡを吸着させた。そして、上下のキャップを装着したまま１４００ｒｐｍで１〜２分間遠心分離を行った後、上キャップをはずし、上清をＲＮアーゼフリーのマイクロピペットを使用し、上清を除去した。そこに、３ｍｌのHigh-salt bufferを添加し、２分間ほど緩やかに混和した後、上キャップを装着し、１４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上清を除去した。この操作をさらに２回繰り返した。
【００７４】
続いて３ｍｌのLow-salt bufferをカラムに添加して１〜２分間緩やかに懸濁した後、上キャップを装着し１５ｍｌチューブに入れた。１４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行って上清を除去した。その後、下キャップも取り外し、３ｍｌのLow-salt bufferを、樹脂表面が平らになるように壁に添わせながら回し入れた。続いて１５ｍｌチューブにカラムを設置し１３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
【００７５】
次に新しい１５ｍｌ遠心チューブを用意し、ｍＲＮＡ回収用の１．５ｍｌマイクロチューブ２個の蓋をハサミで切断後、１５ｍｌ遠心チューブに重ねて入れ溶出用チューブとした。溶出用チューブにカラムを入れ、そこに６５℃に加熱した０．２５ｍｌのElution bufferを添加し１３００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。この操作を２回繰り返し、溶出液をｍＲＮＡ画分として１．５ｍｌマイクロチューブ２本に回収し氷上に静置した。別に定量用のマイクロチューブを準備し、１０μｌのｍＲＮＡ画分を取り、７０μｌのElution bufferを加えて希釈し(１／８希釈)、吸光度ブランクをElution BufferとしてＡ２６０、Ａ２８０を測定した。測定においては、予め、塩酸：メタノール＝１：１の溶液に約１時間浸しＲＮアーゼフリーにした後、ＤＥＰＣ処理水（Diethyl Pyrocarbonate 処理水）で洗浄したセルを用いた。またＲＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）はＡ２６０×希釈率×４０で算出した。
【００７６】
また、２等分され氷上に静置しておいたｍＲＮＡ画分（ｍＲＮＡ抽出溶液）に１／１０量の２．５Ｍ酢酸カリウム、１／５０量のグリコーゲン、２倍量の９５％エタノールを加えて攪拌し混合液を得た。この混合液を、−３０℃に約４０分置き、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った後、−８０℃で保存した。
【００７７】
なお、ｍＲＮＡの抽出と精製においては、ガラス、金属類（実験器具）は２４０℃で２時間乾熱滅菌したものを、プラスチック類の実験器具はＲＮアーゼ・ＤＮアーゼフリーの物を使用した。
【００７８】
＜ｍＲＮＡからのFirst strand ｃＤＮＡの合成＞
−８０℃でエタノール沈殿の状態で保存していたｍＲＮＡを取り出し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行いマイクロピペットで上清を除去した。
【００７９】
その後、１ｍｌの氷冷した７５％エタノール（予めＤＥＰＣ処理水で調製し、−３０℃で保存したもの）を、マイクロチューブに、ペレットのない方からそっと加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離を行い、マイクロピペットで上清を除去した。そして、１５分間真空乾燥を行い、０．２μｇ／μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水を添加し１時間静置して溶解した。溶解後、確認の為にｍＲＮＡ溶液をＤＥＰＣ処理水でＡ２６０＝１前後になるように希釈し吸光度を測定した。
【００８０】
ｃＤＮＡの合成はAMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit （Takara製）を用い、そのプロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。ＲＮアーゼフリーの０．２ｍｌマイクロチューブにｍＲＮＡ ２μｇ分のｍＲＮＡ溶液を添加した。そのマイクロチューブにpd(T)１２〜１８プライマー（０．５μｇ／ｍｌ）２μｌおよびＤＥＰＣ処理水を、ｍＲＮＡ溶液と合わせて１７μｌとなるように添加して混合した。その後、７０℃で１０分間アニーリング処理を行った。アニーリング処理後のマイクロチューブを氷上に置き、０．２５Ｍ ＤＴＴ１μｌ、Rnase inhibitor １μｌ、および５×Reaction buffer ５μｌを添加しよく混合した。更にAMV-RTを１μｌ添加して緩やかに攪拌し、４１℃で６０分間伸長反応を行った。６０分経過後、氷上にマイクロチューブを置いて伸長反応を停止し、マイクロチューブを−３０℃で保存した。
【００８１】
＜ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅＞
Mouse Ig primer Kit（Novagen）、NovaTaqTMHot Start DNA Polymerase Kit(Novagen)を使用し、上記＜ｍＲＮＡからのFirst strand ｃＤＮＡの合成＞で得られたｃＤＮＡから、抗体遺伝子可変領域の増幅を行った。
【００８２】
抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、Master mix(３７．２５μｌの滅菌超純水、０．５μｌの3’-プライマー（最終濃度５ｐｍｏｌ）、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（最終濃度 ０．２ｍＭ）、５μｌの１０×NovaTaq Hot Start Buffer（最終濃度１×）、および０．２５μｌのNovaTaq Hot Start DNA Polymerase（最終濃度１．２５Ｕ）を混合した。)を準備した。このMaster mixを、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、およびプライマーの本数分準備したＰＣＲチューブに４７μｌずつ分注した。そこに、１μｌの5’-プライマー(最終濃度５ｐｍｏｌ)および２μｌ ｃＤＮＡ溶液を添加した。なお、ポジティブコントロールは Mouse Ig primer Kitに付属のものを使用し、ネガティブコントロールには滅菌超純水を使用した。
【００８３】
ＰＣＲチューブ内のMaster mix、5’-プライマーおよびｃＤＮＡ溶液をよく混合し、Biometra社T-GRADIENT、TaKaRa社PCR Thermal cycler PERSONALを使用しＰＣＲを行った。反応条件として、Ｌ鎖は９５℃で７分間のプレヒート後、熱変性を９８℃で１５秒間、伸長反応を７４℃で１５秒間に固定し、アニーリング温度を７０℃、６６℃、６２℃、５８℃、５４℃、および５０℃と６段階に４℃ずつ下げるStep Down法を行った。なお、アニーリング時間は、１５秒間に固定した。上記の３ステップを５段階まで３サイクルずつ行い、６段階目を１０サイクル行った。Ｈ鎖は９５℃で１０分間のプレヒート後、熱変性を９４℃で１分間、アニーリング温度５０℃で２分間、伸長反応を７２℃で２分間の３ステップを４０サイクル行った後、７２℃の伸長反応を１０分間行った。ＰＣＲ終了後、アガロース電気泳動により、抗体可変領域遺伝子の増幅を確認した。
【００８４】
＜抗体可変領域遺伝子のクローニング＞
クローニングは、TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社製）を用いて、以下のようにして行った。
【００８５】
アガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測されるＤＮＡの増幅を確認したＰＣＲ産物２μｌ、salt Solution １μｌ、および滅菌水２μｌを、氷上にてＰＣＲチューブに分注し攪拌した。さらに、このＰＣＲチューブに、TOPO ベクター１μｌを添加して緩やかに攪拌後、室温で３０分間ライゲーション反応させた。３０分後、直ちにＰＣＲチューブを氷上に置き反応を停止させた。このようにして調製された反応液を以下「ライゲーション反応液」と称する。
【００８６】
使用直前に−８０℃のフリーザーからOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（インビトロジェン社製）を取り出し氷上で溶解した。溶解したOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli に、氷上に置いていたライゲーション反応液２μｌを加え、氷上で３０分間インキュベーションを行い、コンピテント細胞間にＤＮＡを拡散させた。反応終了後、４２℃で４５秒間ヒートショックを与えてＤＮＡを取り込ませた後、氷上に戻し２分間静置した。そこに予め、室温に戻しておいた２５０μｌのＳＯＣ培地をクリーンベンチ内で加え、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間培養した。
【００８７】
１時間の培養中に、予め準備しておいたアンピシリンを含むＬＢプレート培地１枚に対し、１００μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧストックと、２０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを塗り広げ、１５〜３０分間乾燥させた。
【００８８】
培養終了後、アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地に、培養後の大腸菌液を５０μｌ、および１００μｌの２種類の濃度で塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
【００８９】
形質転換後の青／白判定によりＤＮＡ断片がインサートされていると考えられる白コロニーを１２コロニー選択し、偽陽性を除く為、更に画線培養を行った。画線培養では、形質転換後の大腸菌を培養したのと同様にアンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地を使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーにおける白コロニーの割合は、Ｈ鎖で９０％、Ｌ鎖で４６％であった。
【００９０】
＜プラスミドＤＮＡの調製＞
上記＜抗体可変領域遺伝子のクローニング＞で得られた大腸菌をアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。大腸菌培養液から０．７５ｍｌを取り、０．２ｍｌの８０％グリセロールと混合し、大腸菌のグリセロールストックとして−８０℃で保存した。プラスミドＤＮＡは残りの培養液を用いてアルカリＳＤＳ法により調製した。
【００９１】
残りの約５．２５ｍｌの培養液を１．５ｍｌマイクロチューブ６本に移し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離して集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。このマイクロチューブに、Solution Ｉ（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１００μｌ加えてボルテックスミキサーにかけよく懸濁した。
【００９２】
次にこのマイクロチューブに、Solution ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を２００μｌ加えて転倒混和後、当該マイクロチューブを氷中に５分間置き、Solution ＩＩＩ（３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＫ、２Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＫ）を１５０μｌ加え緩やかに撹拌した後、当該マイクロチューブを氷上に５分間置いた。
【００９３】
そして、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、沈殿が入らない様に注意しながら上清を採り、新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移し、等量のフェノール・クロロフォルムを加えて攪拌した後、４℃、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。更に同じ作業を繰り返し、２回のフェノール・クロロホルム処理を行った後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移し、２．５等量の氷冷エタノール１ｍｌを加えて上下に振って攪拌し−７０℃で５分間静置した。そして、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を除去した。その後氷冷７０％エタノールを１ｍｌ加え、ペレットをリンスし４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を除去し、１５分間真空乾燥した。
【００９４】
乾燥終了後、ＴＥ（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液４５μｌでマイクロチューブ内のペレットを溶解し、さらにRNaseA溶液（５ｍｇ／ｍｌ RnaseA、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）５μｌ溶液を加えた(終濃度：５０μｇ／ｍｌ)。２本のマイクロチューブの溶液を１本のマイクロチューブにまとめ、３７℃で１時間反応させた。
【００９５】
反応終了後、２／３等量のＰＥＧ（１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．８Ｍ ＮａＣｌ）を加え、当該マイクロチューブを氷上に１時間以上置いた。その後、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した。当該マイクロチューブに、７０％エタノールを１ｍｌ加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。上清を除去後、真空乾燥を行った。真空乾燥後、１サンプルにつき５０μｌの滅菌水に溶解し、一本のチューブにまとめプラスミド溶液とした。そして、アガロース電気泳動によるバンド比較にてサンプルのＤＮＡ濃度を推測した。
【００９６】
＜塩基配列の決定＞
Thermo SequenaseＴＭCyＴＭ5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia社製) を用いて、塩基配列の決定を行った。アデニン（Ａ）用、シトシン（Ｃ）用、グアニン（Ｇ）用、およびチミン（Ｔ）用の４種類のＰＣＲチューブを用意し、各ＰＣＲチューブに、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分１μｌずつ分注した。
【００９７】
次にDNA/primer mixの調製を行った。＜プラスミドＤＮＡの調製＞で調製したＤＮＡ１．５μｇ、Reaction Buffer３．５μｌ、TOPO13 Reverse（４ｐｍｏｌ／μｌ）(Invitrrogen)１μｌ、およびThermo Sequenase（１０unit／μｌ）２μｌを混合し、滅菌超純水を添加し全量が３１．５μｌとなるようにした。これを上記ＰＣＲチューブに７μｌづつ分注し、すみやかにBiometoraサーマルサイクラーにセットし、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１２０秒間の反応サイクルを３０サイクル行い、４℃で冷却し反応を停止させた。
【００９８】
反応終了後、サンプルをＰＣＲチューブから１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２μｌ、および９８％エタノールを３０μｌ添加しよく混合した。このマイクロチューブを１０分間氷上で静置し、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。その後、キムワイプ上でデカンテーションして上清を除去し、７０％エタノールを２００μｌ添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、マイクロピペットを使用して上清を丁寧に除去した。そして遮光してペレットを乾燥させ、６μｌ Loading Dyeで溶解し、７２℃で、３分間熱処理を行い、LONG-READ TOWERTM System (Amersham Pharmacia Biotech.)に各２μｌずつローディングし、解析を行った。得られた塩基配列は、ＤＮＡＳＩＳソフトウェア（日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社製）を使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
【００９９】
〔実施例４：５Ｈ５抗体可変領域の立体構造予測〕
実施例３によって決定した塩基配列から推測した５Ｈ５抗体可変領域のアミノ酸配列をもとに、ソフトウエアAbM (Oxford Molecular社製、Oxford、UK)を用いて、目的抗体のＣＤＲ領域のループ構造およびＦＲ領域の立体構造を予測した。AbMで予測された立体構造をもとに、ソフトウエアInsightＩＩ/Discover3（Molecular Simulation社製、USA）により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１００】
さらに、ソフトウエアPPC Protein Adviser(富士通九州システムエンジニアリング社製)を用いて、立体構造中のセリンプロテアーゼ三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果、５Ｈ５抗体のＬ鎖にセリンプロテアーゼ三つ組み残基の存在が確認された。図３（ａ）に、５Ｈ５抗体のＬ鎖におけるＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群探索結果を示す。図３（ａ）に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列において、カバットの分類による番号で第３４番目のヒスチジン、カバットの分類による番号で第５２番目のセリン、カバットの分類による番号で第５０番目のアスパラギン酸が、Ｈｉｓ３３−Ｓｅｒ５１のＣα間は９．３３×１０−１０ｍ、Ｈｉｓ３３−Ａｓｐ４９のＣα間は６．１０×１０−１０ｍと空間的に近い位置で存在すると予測され、触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、Ｈｉｓ３４（カバットの分類による）、Ｓｅｒ５２（カバットの分類による）およびＡｓｐ５０（カバットの分類による）はいずれもＣＤＲ領域に存在していた。
【０１０１】
また、同様にして、立体構造中のセリンプロテアーゼ三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＧｌｕおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果、５Ｈ５抗体のＨ鎖にセリンプロテアーゼ三つ組み残基の存在が確認された。図３（ｂ）および（ｃ）に、５Ｈ５抗体のＬ鎖におけるＳｅｒ、ＧｌｕおよびＡｓｐの残基群探索結果を示す。図３（ｂ）に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において、カバットの分類による番号で第１番目のグルタミン酸、カバットの分類による番号で第２５番目のセリン、カバットの分類による番号で第１０１番目のアスパラギン酸が空間的に近い位置で存在すると予測され触媒三つ組残基を構成していると推測される。また、図３（ｃ）に示すように、カバットの分類による番号で第４０番目または第８４番目のセリン、カバットの分類による番号で第６１番目または８６番目のアスパラギン酸、カバットの分類による番号で第８５番目のグルタミン酸が空間的に近い位置で存在すると予測され触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、図中、５Ｈ５抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれのＣＤＲ１〜３をリボンで表現している。
【０１０２】
セリンプロテアーゼ三つ組み残基の存在が確認されたことより、これまでの発明者らによる多くの研究（Appl. Biochem. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immunol. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003); 化学工業、54, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004); 科学、75(11), 1254-1259(2005)）から、５Ｈ５抗体は抗体酵素である可能性が示唆された。そこで、５Ｈ５抗体におけるＨ鎖およびＬ鎖の抗原分解能の有無について検討を行うこととした。
【０１０３】
〔実施例５：５Ｈ５抗体の大量取得と精製〕
＜５Ｈ５抗体の大量取得＞
あらかじめプリスタン（2,6,10,14-tetramethylpentadecane、MP Biochemicals コード195455,Ohio,USA）を投与したBalb/cマウスの腹腔に５Ｈ５抗体を産生する抗体産生細胞０．５×１０６個を投与後、腹水を採取することにより５Ｈ５抗体を大量に取得した。このようにして取得した５Ｈ５抗体は以下の方法で精製し目的の実験に用いた。
【０１０４】
＜塩析＞
腹水約７ｍｌは濾過してフィブリンを除去し、同量のＰＢＳで希釈した。これを２本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で３０分間静置し、その後、４℃、１００００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して塩析し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。これを、１本のチューブに合わせ、ＰＢＳに対して２回透析した。
【０１０５】
＜カラム精製＞
透析終了後、MAPS-IIキット（BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット）を用いて５Ｈ５抗体の精製を行なった。操作はMAPS-IIキットに付属のマニュアルに従い、４℃で行なった。
【０１０６】
使用する試薬として、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、Elution buffer、および２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を以下のようにして調製した。０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳは、０．１ｇのＮａＮ３を２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。Binding bufferは、４７．１ｇのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、１５０ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが９±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。Elution bufferは２．３ｇのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが３±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１２．１１ｇのＴｒｉｓを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整した後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした。
【０１０７】
透析終了後、上記の塩析済みの腹水（約７ｍｌ）を濾過し脱気した。脱気後の腹水を、腹水: Binding buffer＝１:１．２になるように希釈した。また、精製操作前に、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、およびElution bufferを脱気した。
【０１０８】
アフィゲルプロテインＡを充填し、カラムを上記Binding bufferで洗浄した。ＵＶ ２８０ｎｍの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記Binding bufferでゲルを洗浄した。流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに調節し、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
【０１０９】
次に、５０ｍｌ以上のBinding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースラインが落ち着いたら、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、４５ｍｌのElution bufferを添加し、アフィゲルプロテインＡに結合した抗体を溶出させ、ピーク部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上記抗体画分（抗体液）は、ＰＢＳに対して２回透析した後、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer （ｐＨ８．０）に対して２回透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し、ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でタンパク濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度（１ｍｇ／ｍｌ未満の場合は濃縮して）で凍結保存した。
【０１１０】
〔実施例６：抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体重鎖(Ｈ鎖)および軽鎖（Ｌ鎖）の分離精製〕
＜限外濾過＞
実施例５で５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer （ｐＨ８．０）に対して２回透析した後の抗体溶液５ｍｇ分を、セントリプレップ−１０を用いて、４℃、２８００ｒｐｍで遠心分離し、約１ｍｌになるまで限外濾過により濃縮した。さらに、５ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、約１ｍｌになるまで再び遠心分離した。この操作を再度行い、限外濾過による濃縮後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で抗体溶液を２．７ｍｌに調整し、褐色瓶に入れ以下の実験に使用するまで低温で保存した。
【０１１１】
＜重鎖・軽鎖の分離＞
抗体溶液２．７ｍｌ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）、および１Ｍ Tris ／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）をそれぞれ脱気した。抗体溶液２．７ｍｌに２Ｍ ２−ＭＥ(メルカプトエタノール)３００μｌを加えて撹拌した後、１Ｍ Tris ／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）でｐＨ８に調整し、反応容器内に窒素を封入して、１５℃で３時間撹拌し還元反応を行った。この反応液に３ｍｌの０．６Ｍヨードアセトアミド／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）を添加し、反応容器内に窒素を封入して、１Ｍ Tris ／５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ buffer（ｐＨ８．０）でｐＨ８に調整した後、１５℃で１５分間撹拌しながらアシル化反応を行なった。
【０１１２】
続いてディスクフィルター（ミリポア製サンプレップLCR13-LH、０．５μｍ）で反応液を濾過し粒子を除去した。この粒子除去後の反応液を、セントリプレップ−１０を用いて、液量が約０．５ｍｌ以下になるまで濃縮し、ウルトラフリー（０．２μｍ）で濾過した。
【０１１３】
＜サイズ排除ＨＰＬＣによる５Ｈ５抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の精製＞
５Ｈ５抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の精製は、上記のようにして得られた抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより行った。
【０１１４】
サイズ排除クロマトグラフィーシステムとして、ＰＵ−２０８０ Ｐｌｕｓ（ＪＡＳＣＯ社製）を用いた。また、カラムには、Protein-PakTM300SW（φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ；Waters製）を用いた。上記カラムの平衡化は、移動相に用いる６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ６．５）を、０．１５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、約２時間流すことにより行った。サンプル（上記アシル化処理後の抗体溶液）は、２〜３回に分けて供した。Ｈ鎖およびＬ鎖に相当する分画を分取した。分取後の各画分はＰＢＳに対して透析を行い、Ｈ鎖およびＬ鎖をRefoldingした。１５ｍＭ ＰＢに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でＨ鎖およびＬ鎖の濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認して４℃で保存した。このようにして調製したＨ鎖およびＬ鎖の液量と濃度を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
〔実施例７：５Ｈ５抗体重鎖および軽鎖によるペプチダーゼ活性の検討〕
天然型抗体酵素は、タンパク質を基質として用いる場合には標的タンパク質を特異的に分解するという特徴を持つ。しかし、ペプチド基質においては、非特異的に分解することが分かっている。そこでこれまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性試験で基質として用いてきたＴＰ４１−１ペプチド（H２N-TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD-COOH : 21mer、配列番号５）を使用して５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖が該ペプチドに対する分解能を有するか検討した。なお上記ＴＰ４１−１ペプチドは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の膜貫通タンパク質ｇｐ４１の保持領域ペプチドである。また、５Ｈ５抗体重鎖としては、〔実施例６〕で分離精製したＨ鎖であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を用い、５Ｈ５抗体軽鎖としては、〔実施例６〕で分離精製したＬ鎖であるＬ１、Ｌ２およびＬ３を用いた。
【０１１６】
実験操作は全てクリーンベンチ内で行い、使用する試験管、緩衝液などは、すべて滅菌処理を行った後、使用した。
【０１１７】
＜ＴＰ４１−１ペプチドを用いたペプチダーゼ活性試験＞
クリーンベンチ内で、ＴＰ４１−１ペプチド１．７ｍｇをはかり取り、１ｍｌの１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で溶解した後、γ線照射済みのウルトラフリーでろ過滅菌した。この１．７ｍｇ／ｍｌのＴＰ４１−１ペプチドを１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で６００μＭ、３６０μＭ、２４０μＭに調整した。次に〔実施例６〕で分離精製した５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１およびＨ３を１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で４０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に、５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１およびＬ３を４０μｇ／ｍｌ（１．６μＭ）に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２を１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で４０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２を１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で４０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に調整した。上記２４０μＭ ＴＰ４１−１ペプチドと、Ｈ１、Ｈ３、Ｌ１、およびＬ３をそれぞれ１：１で混合した。また３６０μＭ ＴＰ４１−１ペプチドと５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２とを１：２、６００μＭ ＴＰ４１−１ペプチドと５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ２とを１：４で混合した。下表３に、調整したＴＰ４１−１ペプチドおよび５Ｈ５抗体Ｈ鎖またはＬ鎖を含む反応液を示す。
【０１１８】
【表３】
調製直後の反応液を逆相ＨＰＬＣで分析したときを０時間とし、２５℃でインキュベートを開始した。その後逆相ＨＰＬＣでＴＰ４１−１ペプチドを経時的に追跡した。逆相ＨＰＬＣの分析には、puresil C18カラム（Waters製）を使用した。
【０１１９】
なお、ＨＰＬＣの測定条件として、カラムオーブンは４０℃、溶離液は０．０８％ ＴＦＡ、１３％アセトニトリル、超純水を使用し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、モニター波長２１４ｎｍとした。各反応液をクリーンベンチ内で３０μｌ回収し、当該反応液を０．４５μｍのフィルターに通し、除粒子したものをサンプルとしてＨＰＬＣに供した(サンプルのインジェクション量２０μl)。
【０１２０】
図４に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１、Ｈ３または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１、Ｌ３を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図５に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ２を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示す。また、図１０に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図中矢印で示す経時時間で採取したサンプルのＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムとともに示す。また、図１１に、５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１を用いたときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図中矢印で示す経時時間で採取したサンプルのＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムとともに示す。図１０および図１１中、丸はそれぞれＨ１およびＬ１を用いたときの結果を、四角はＴＰ４１−１ペプチドのみを反応液としたときの結果を示している。また、クロマトグラム中の矢印は、反応基質のピークを示す。
【０１２１】
また、図４において、白丸はＨ１を、グレーの丸はＨ３を、白三角はＬ１を、グレーの三角はＬ３を用いたときの結果を示している。また、図５において、グレーの丸はＨ２を、グレーの三角はＬ２を用いたときの結果を示している。また、図４および図５において、グレーの四角はＴＰ４１−１ペプチドのみを反応液としたときの結果を示している。
【０１２２】
図４に示すように、Ｈ１を用いた場合に、約４０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、約１１４時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。また、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ３を用いた場合に、約４０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、９０〜１２０時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。
【０１２３】
また、図５に示すように、Ｈ２を用いた場合に、約７０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、約９６時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。そして、Ｌ２を用いた場合に、約７０時間の誘導期を経た後にＴＰ４１−１ペプチドの分解が確認され、約１１０時間後にＴＰ４１−１ペプチドの完全分解が確認された。
【０１２４】
以上のように、全ての反応液において、これまで多くの抗体酵素で見られたと同様、誘導期、活性期の２相性を示しながらペプチドである反応基質が分解されたことが確認された。
【０１２５】
＜ＴＰ４１−１ペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性試験＞
次に、５Ｈ５抗体のＨ鎖およびＬ鎖によりペプチド（ＴＰ４１−１ペプチド）が消失した上記ペプチダーゼ活性試験後の反応液に再度ペプチド（ＴＰ４１−１ペプチド）を添加し、分解産物が観察できるかを検討した。
【０１２６】
ウルトラフリーでろ過滅菌し、４℃で保存していた１．７ｍｇ／ｍｌのＴＰ４１−１ペプチドを１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）で２４０μＭに調整した。次に、上記ペプチダーゼ活性試験後の各反応液と１：１で混合し、本ペプチダーゼ活性試験の反応液とした。また、ＴＰ４１−１ペプチドのみを含む反応液をコントロールとして準備した。下表４に、調整した反応液を示す。
【０１２７】
【表４】
調整した反応液について、上記ペプチダーゼ活性試験と同様にして、ＨＰＬＣでＴＰ４１−１ペプチド濃度を追跡した。
【０１２８】
図６、７に、ＴＰ４１−１ペプチド再添加後の反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、ＴＰ４１−１ペプチドを再添加する前に行った上記ペプチダーゼ活性試験における反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化と併せて示す。図６は、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１、Ｈ３または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１、Ｌ３を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図７に、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ２または５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ２を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示す。
【０１２９】
なお、図６において、白丸はＨ１を、グレーの丸はＨ３を、白三角はＬ１を、グレーの三角はＬ３を用いたときの結果を示している。また、図７において、グレーの丸はＨ２を、グレーの三角はＬ２を用いたときの結果を示している。
【０１３０】
また、図８および９は、同じデータを抗体鎖別に表したグラフであって、ＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示すものである。図８は、５Ｈ５抗体Ｌ鎖 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を、図９は、５Ｈ５抗体Ｈ鎖 Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３を含む反応液にＴＰ４１−１ペプチドを再添加したときの反応基質（ＴＰ４１−１ペプチド）の経時変化を示す。また、図８および図９において、グレーの四角はＴＰ４１−１ペプチドのみを反応液としたときの結果を示している。
【０１３１】
図６〜９に示すように、ＴＰ４１−１ペプチドを再添加した結果、Ｈ鎖およびＬ鎖ともに若干の誘導期が存在したものの、再添加してから、２４時間乃至４０時間以内にペプチドは完全に消失した。またＨＰＬＣにおいて分解産物のピークはＴＰ４１−１ペプチドよりも前に出現していた。
【０１３２】
〔実施例８：５Ｈ５抗体重鎖および軽鎖によるＩｇＥの分解実験〕
実施例７に示すように、５Ｈ５抗体のＨ鎖およびＬ鎖はペプチダーゼ活性を有することが明らかとなった。そこで、次に５Ｈ５抗体のＬ鎖が、抗原タンパクであるＩｇＥを分解する能力を有するか否かの検討を行った。
【０１３３】
抗原タンパクには、実施例１で用いたヒトＩｇＥを用いた。これをまず１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に交換し、濾過滅菌して用いた。
【０１３４】
次に〔実施例６〕で分離精製した５Ｈ５抗体Ｌ鎖を２０μｇ／ｍｌ（０．８μＭ）に調整した。上記ヒトＩｇＥ（６０μｇ／ｍｌ（０．３０μＭ））と、５Ｈ５抗体Ｌ鎖とをそれぞれ１：１で混合し、全量を４００μｌとした。分解実験における反応液の濃度は、５Ｈ５抗体Ｌ鎖が０．４μＭ（１０μｇ／ｍｌ）、ヒトＩｇＥが０．１５μＭ（３０μｇ／ｍｌ）であった。また、コントロールとして、０．４μＭ（１０μｇ／ｍｌ）の５Ｈ５抗体Ｌ鎖のみの反応液４００μｌ、および０．１５μＭ（３０μｇ／ｍｌ）のヒトＩｇＥのみの反応液４００μｌを用いた。
【０１３５】
反応時間４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１４４時間において、各タンパク質の反応液の一部をクリーンベンチ内で分取し、各タンパク質の経時変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥで追跡した。その結果を、図１２に示す。図１２中（ａ）は、ヒトＩｇＥと、５Ｈ５抗体Ｌ鎖とを含む反応液における結果を、（ｂ）は、ネガティブコントロールであるヒトＩｇＥのみの反応液における結果を（ｃ）は５Ｈ５抗体Ｌ鎖のみの反応液における結果を示す。なお、図中Ｍはマーカー（Low range marker Bio-Rad）を示し、１ないし９は、それぞれ、０、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１４４時間後の結果を示す。また、図１３には、反応開始後に出現したバンドの濃さの経時変化を示す。なお、バンドの濃さは、ＮＩＨイメージにより測定した相対値である。
【０１３６】
図１２（ａ）および図１３に示すように、反応開始２４時間付近でヒトＩｇＥの重鎖において分解断片である３つのバンド（４３ｋＤａ（図１２（ａ）中、上から２番目の矢印で示す。）、３９ｋＤａ（図１２（ａ）中、上から３番目の矢印で示す。）、３７ｋＤａ（図１２（ａ）中、上から４番目の矢印で示す。）が出現し、だんだんと濃くなっていった。３９ｋＤａのバンドは反応時間１４４時間で減少傾向を示し、このバンドに対応する断片はさらに分解が進んで３７ｋＤａあるいはもっと小さい断片に逐次分解されていると思われる。一方、ヒトＩｇＥの軽鎖は全く分解を受けていない。
【０１３７】
また、図１２（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールであるヒトＩｇＥのみの反応液では、８３ｋＤａおよび８０ｋＤａにヒトＩｇＥのＨ鎖を示す太いバンド、並びに、２９ｋＤａにヒトＩｇＥのＬ鎖を示す太いバンドが検出され、これらのバンドは１４４時間経過後も全く変化が見られなかった。このことから５Ｈ５抗体のＬ鎖はヒトＩｇＥの重鎖を特異的に認識し分解する抗体酵素であることが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明にかかる抗体酵素は、上述のようにヒトＩｇＥに対して特異的に作用し、これを分解して機能を消失させることができるため、Ｉ型アレルギーの予防や治療のために有用である。また、酵素であるため、酵素センサの構築が可能であり、抗体よりも応用範囲が広い。
【０１３９】
したがって、本発明は、医療、医薬品産業、試薬産業、等に利用することができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本発明の抗体酵素の一例である５Ｈ５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ領域を示す図である。
【図２】本発明の抗体酵素の一例である５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ領域を示す図である。
【図３】５Ｈ５抗体の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行なった結果、推定された立体構造を模式的に示す図であり、（ａ）は５Ｈ５抗体の軽鎖可変領域の推定された立体構造を模式的に示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は５Ｈ５抗体の重鎖可変領域の推定された立体構造を模式的に示す図である。
【図４】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図５】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図６】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図７】５Ｈ５抗体の重鎖および軽鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図８】５Ｈ５抗体の軽鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図９】５Ｈ５抗体の重鎖のペプチドの再添加によるペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図１０】５Ｈ５抗体の重鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図１１】５Ｈ５抗体の軽鎖のペプチダーゼ活性の検討を行なった結果を示すグラフである。
【図１２】５Ｈ５抗体Ｌ鎖によるヒトＩｇＥの分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により追跡した結果を示す図であり、（ａ）は、５Ｈ５抗体Ｌ鎖によるヒトＩｇＥの分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により追跡した結果を、（ｂ）は、ネガティブコントロールであるヒトＩｇＥのみの反応液における結果を（ｃ）は５Ｈ５抗体Ｌ鎖のみの反応液における結果を示す図である。
【図１３】５Ｈ５抗体Ｌ鎖によるヒトＩｇＥの分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により追跡した結果、反応開始後に出現したバンドの濃さの経時変化を示すグラフである。
【図１４】実施例において得られた抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図１５】実施例において得られた抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有することを特徴とする抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片。
【請求項２】
重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、
軽鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１】
ヒトＩｇＥに対する抗体であって、ヒトＩｇＥを認識し、且つ、当該ヒトＩｇＥを分解する活性を有することを特徴とする抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片。
【請求項２】
重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、
軽鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体酵素、またはその可変領域を含む抗体酵素断片をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００７−２０２４４５（Ｐ２００７−２０２４４５Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３６７７（Ｐ２００６−２３６７７）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（５９１０７９４８７）広島県 (101)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（５９１０７９４８７）広島県 (101)
【Ｆターム（参考）】
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