ヒドロキシケト化合物のエナンチオ選択的酵素的還元の方法
一般式Ｉ：
【化７】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化８】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法において，ヒドロキシケトンは，補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でオキシドレダクターゼで還元され，ここで，
ａ） ヒドロキシケトンは反応中に５０ｇ／ｌ以上の濃度で提供され；
ｂ） 形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキルを表し，Ｃの合計は３以上である）の２級アルコールの酸化により連続的に再生され，および
ｃ） ヒドロキシケトンの還元と２級アルコールの酸化とは同じオキシドレダクターゼにより触媒される，
ことを特徴とする方法。
【化７】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化８】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法において，ヒドロキシケトンは，補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でオキシドレダクターゼで還元され，ここで，
ａ） ヒドロキシケトンは反応中に５０ｇ／ｌ以上の濃度で提供され；
ｂ） 形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキルを表し，Ｃの合計は３以上である）の２級アルコールの酸化により連続的に再生され，および
ｃ） ヒドロキシケトンの還元と２級アルコールの酸化とは同じオキシドレダクターゼにより触媒される，
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，一般式Ｉ：
【化５】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化６】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法であって，ここで，ヒドロキシケトンは，補因子の存在下でオキシドレダクターゼにより還元される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般式ＩＩのキラルジオールは，医薬製品の製造，特にＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の製造における重要な中間体である。このようなキラルジオールは，例えば，（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ，３Ｒ）−３，５，６−トリヒドロキシ−ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルである。
【０００３】
この種のジオールは，特に，対応する式Ｉのヒドロキシケトン，例えば（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのエナンチオ選択的還元により製造される。この反応を行うにあたっては，化学的に触媒される還元は，一方では厳しい反応条件のために副生成物が生じ，他方では，不十分なエナンチオマーおよびジアスレオマー過剰しか得られないという欠点を有し，非常に大きな努力があって初めて技術的に実用可能となる。
【０００４】
この理由のため，相当長い間，上述のヒドロキシケトンのエナンチオ選択的還元を行うことができる生物触媒プロセスの開発に努力が払われてきた。生物触媒プロセスは，通常は穏和な条件下で行われ，このことにより，いずれにせよ幾分不安定である５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸エステル誘導体をさらなる副生成物を形成することなく還元することが可能であると予測されてきた。しかし，これまでのところ，効率的な様式で，単離された酵素を用いて，上述の５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸エステル誘導体の酵素的還元を実現しうる適当な生物触媒を見いだすことはできていない。
【０００５】
例えば，米国特許６，００１，６１５および国際公開ＷＯ０１／８５９７５Ａ１は，Ｂｅａｕｖａｒｉａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｃａｎｄｉｄａ，ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属の種々の酵母を用いて，それぞれ（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを還元することを記載する。しかし，変換は野生型株の全細胞を用いた場合にのみ生じ，したがって，５％をはるかに下回る非常に低い濃度でしか実施することができない。これまでのところ，変換を担う酵素およびＤＮＡ配列は同定することができていない。
【０００６】
さらに，構造的に類似する化合物の微生物変換がＥＰ０５６９９９８Ｂ１に記載されている。ここでは，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３３０５からのＮＡＤＨ依存性酵素を精製することが可能であり，これを単離された状態で補酵素再生用にグルコースデヒドロゲナーゼと一緒に用いることができることが記載される。このプロセスにおいては，基質を１％の濃度で使用して，わずかに１０のＮＡＤＨの"総ターンオーバー数"が達成されている。工業的に適用しうるプロセスはまだ存在しない。
【０００７】
米国特許６，６４５，７４６Ｂ１においては，Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅのアミノ酸配列が開示されており，これをＮＡＤＰＨとともに用いて，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得ることができる。この明細書においては，酵素は好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのグルコースデヒドロゲナーゼとともに発現させた状態で使用し，グルコースデヒドロゲナーゼおよび補基質としてグルコースを用いて補因子ＮＡＤＰＨの再生を行う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は，一般式ＩＩのエナンチオマー的に純粋なジオールを，高収率でかつ高いエナンチオマー純度で，副生成物なしに経済的に製造することを可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にしたがえば，この目的は，補因子としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でオキシドレダクターゼを還元する上記の方法により達成され，この方法は，
ａ） ヒドロキシケトンを反応中に５０ｇ／ｌ以上の濃度で提供し，
ｂ） 形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキルを表し，Ｃの合計は３以上である）の２級アルコールの酸化により連続的に再生され，および
ｃ） ヒドロキシケトンの還元と２級アルコールの酸化とは同じオキシドレダクターゼにより触媒される，
ことを特徴とする。
【００１０】
本発明の方法の好ましい態様は，オキシドレダクターゼが，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ことを特徴とする。
【００１１】
本発明にしたがえば，上述の目的は，最初に記載された方法において，オキシドレダクターゼが，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ことによっても達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明においては，配列番号１，配列番号８および配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドがオキシドレダクターゼ活性を示し，これを用いて（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを還元して，９９％を超えるジアステレオマー過剰で（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得ることができることが見いだされた。一般式Ｉの他のヒドロキシケトンも，配列番号１，配列番号８および配列番号１１のアミノ酸配列を用いて，同じ方法により還元することができる。
【００１３】
さらに，上述のオキシドレダクターゼは，２級アルコールを還元することにより，還元の間に形成される酸化された補因子を再生しうるという利点を有する。すなわち，前記オキシドレダクターゼの特に経済的な利点は，従来技術の方法（ＵＳ６，６４５，７４６ＢおよびＥＰ０５６９９９８Ｂ）とは対照的に，補因子の再生にさらに別の酵素を必要としない点にもある。
【００１４】
配列番号２のＤＮＡ配列は，配列番号１を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１のゲノムから得ることができる。さらに，配列番号３のＤＮＡ配列を用いて，配列番号１のポリペプチドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａにおいて発現させることができることが見いだされた。
【００１５】
配列番号９のＤＮＡ配列は，配列番号８を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５のゲノムから得ることができる。さらに，配列番号１０のＤＮＡ配列を用いて，配列番号８のポリペプチドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａで発現させることができることが見いだされた。
【００１６】
配列番号１２のＤＮＡ配列は，配列番号１１を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＤＳＭ６３５のゲノムから得ることができる。
【００１７】
配列番号１５のＤＮＡ配列は，配列番号１４を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＣＢＳ６３９６から得ることができる。
【００１８】
すなわち，本発明はまた，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いて，または配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド，すなわち，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４の少なくとも１つのアミノ酸の置換，挿入，欠失または付加により誘導しうるポリペプチドを用いて，または配列番号２，配列番号９，配列番号１２または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または配列番号２，配列番号９，配列番号１２または配列番号１５にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチドを用いて，一般式Ｉのヒドロキシケトンを還元して，一般式ＩＩのジオールとする方法に関する。
【００１９】
例えば配列番号２にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列とは，配列番号２をＤＮＡプローブとして用いて，コロニーハイブリダイゼーション法，プラークハイブリダイゼーション法，サザンハイブリダイゼーション法またはこれらと同等の方法により同定することができるポリヌクレオチドであると理解される。
【００２０】
この目的のためには，フィルター上に固定化されたポリヌクレオチドを，０．７−１ＭＮａＣｌ溶液中で６０℃で，例えば配列番号２とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）または同様の刊行物に記載されるようにして実施する。次に，フィルターを０．１から２倍のＳＳＣ溶液で６５℃で洗浄し，ここで，１倍のＳＳＣ溶液とは，１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウムから構成される混合物であることが理解される。
【００２１】
本発明にしたがう方法においては，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４の配列を含むポリペプチド，および前記ポリペプチドからそれぞれ誘導されるポリペプチドは，完全に精製された状態で用いてもよく，部分的に精製された状態で用いてもよく，あるいは，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のポリペプチドを含有する細胞として用いてもよい。用いられる細胞は，天然の状態で提供してもよく，または透過性にしたもしくは溶解した状態で提供してもよい。好ましくは，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４の配列を含むポリペプチド，およびこれらからそれぞれ得られる誘導体を，適当な宿主生物，例えば，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで過剰発現させ，組換えポリペプチドを用いて一般式Ｉのヒドロキシケトンを還元する。
【００２２】
配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のオキシドレダクターゼまたはこれらの誘導体は，反応させるべき式Ｉの化合物１ｋｇあたり５．０００−１０ＭｉｏＵで用いる（上限なし）。本明細書においては，酵素ユニットの１Ｕは，１分間に１μｍｏｌの式Ｉのヒドロキシケトンを反応させるために必要な酵素の量に対応する。
【００２３】
本発明にしたがう酵素的還元は，穏和な条件下で進行するため，しばしば不安定であるヒドロキシケトンの分解，およびそれに伴う望ましくない副生成物の形成を大きく回避することができる。本発明にしたがう方法は，高い耐用年数をもち，かつ通常は生成するキラルジオールの９９％を超えるジアステレオマー純度を有する。
【００２４】
本発明の好ましい態様は，この方法において用いられる補因子が補基質により連続的に還元されることを特徴とする。好ましくは，ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補因子として用い，還元において形成されたＮＡＤ（Ｐ）は補基質の作用により再びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元される。
【００２５】
好ましくは，２級アルコール，例えば，２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，３−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノール，２−オクタノールまたはシクロヘキサノールを補基質として用いる。特に好ましい態様にしたがえば，２−プロパノールを補酵素再生に用いる。再生用の補基質の量は，総容量に対して５−９５容量％の範囲内でありうる。
【００２６】
補酵素の再生は，例えば，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４を含むポリペプチドにより同様にして行う。
【００２７】
本発明にしたがう方法においては，一般式Ｉのヒドロキシケトンは，好ましくは総容量に基づいて，５−５０重量％（５０ｇ／ｌ−５００ｇ／ｌ）で，好ましくは８−４０重量％，特に好ましくは１０−２５重量％の量で用いる。
【００２８】
特に好ましい態様は，一般式（Ｉ）のヒドロキシケトンとして，（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを用いることを特徴とする。
【００２９】
好ましくは，本発明にしたがう方法は，水性有機２相系で実施する。
【００３０】
酵素的還元が進行する反応混合物中の水性部分は，好ましくは緩衝液，例えば，ｐＨ５−１０，好ましくはｐＨ６−９のリン酸カリウム，ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたはトリエタノールアミン緩衝液を含む。さらに，緩衝液は，酵素を安定化または活性化させるイオン，例えば，亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンを含むことができる。
【００３１】
本発明にしたがう方法を実施する間，温度は約１０℃から７０℃，好ましくは２０℃から４５℃の範囲であることが適当である。
【００３２】
本発明にしたがう方法のさらに別の好ましい態様においては，酵素的変換は，水と混和性ではないか，または限定された程度でしか水と混和性ではない有機溶媒の存在下で実施する。前記溶媒は，例えば，対称性のまたは非対称性のジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルエーテル，直鎖または分枝鎖のアルカンまたはシクロアルカン，または水不溶性２級アルコールであり，これは同時に補基質である。好ましい有機溶媒は，ジエチルエーテル，３級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサン，２−オクタノール，２−ヘプタノール，４−メチル−２−ペンタノールおよびシクロヘキサノールである。最後に挙げた２級アルコールの場合には，溶媒は，同時に補因子再生用の補基質としても作用することができる。
【００３３】
それぞれ水不溶性の溶媒および補基質を用いる場合には，反応バッチは水性相および有機相から構成される。ヒドロキシケトンは，その溶解度にしたがって，有機相と水性相との間に分配される。一般に，有機相は，総反応容量に基づいて５−９５％，好ましくは１０−９０％の割合である。２液相は，好ましくは機械的に混合し，このことによりこれらの間に大きな表面積が生ずる。また，この態様においては，酵素的還元において形成されるＮＡＤは，例えば，上述したもの等の補基質を用いて，再び還元してＮＡＤＨとすることができる。
【００３４】
水性相における補因子，特にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのそれぞれの濃度は，一般に０．００１ｍＭ−１０ｍＭの範囲，特に０．０１ｍＭ−１ｍＭの範囲内である。
【００３５】
本発明にしたがう方法においては，オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼの安定剤を用いてもよい。適当な安定剤は，例えば，グリセロール，ソルビトール，１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００３６】
本発明にしたがう方法は，例えば，ガラスまたは金属製の密封反応容器中で行うことができる。この目的のためには，成分を別々に反応容器に入れ，窒素または空気の雰囲気下で撹拌する。
【００３７】
本発明の別の可能な態様にしたがえば，反応の平衡を反応生成物（一般式ＩＩのジオール）側にシフトさせるために，酸化された補基質（例えばアセトン）を連続的に除去してもよく，および／または，補基質（例えば２−プロパノール）を新たに連続的に加えてもよい。
【００３８】
さらに別の態様においては，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４にしたがうオキシドレダクターゼ，および／または補基質の添加は，プロセスの経過中に徐々に行ってもよい。
【００３９】
還元が完了した後，反応混合物を処理する。この目的のためには，任意に水性相を有機相から分離し，生成物を含む有機相を濾過する。任意に，水性層を抽出し，さらに有機相と同様に処理してもよい。次に，有機相から溶媒を蒸発させ，一般式ＩＩのジオールを粗生成物として得る。次に粗生成物をさらに精製してもよく，または次の生成物の合成に直接使用してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下に，実施例により本発明をさらに説明する。
【００４１】
実施例１
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１からのオキシドレダクターゼのクローニング
Ａ）Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１の培養
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１の細胞は，以下の培地で５０℃で（ｐＨ７．２），細菌用振盪器で１４０ｒｐｍで培養した：０．１％酵母エキス，０．１％トリプトン，０．００４％ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ，０．０２％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．０１％ニトリロ三酢酸，１００ｍｌのリン酸バッファ［５．４４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４，４３ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ］，５００μｌ／ｌの０．０１Ｍクエン酸Ｆｅ，５００μｌ／ｌの微量元素［５００μｌ／ｌのＨ２ＳＯ４，２．２８ｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，５００ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５００ｍｇのＨ３ＢＯ３，２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，２５ｍｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，４５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］。培養第６日に，遠心分離により細胞を培養液から分離し，−８０℃で保存した。
【００４２】
Ｂ）選択的オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の増幅
ゲノムＤＮＡは，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｍａｎｎｉａｔｉｓ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される方法にしたがって抽出した。得られた核酸をテンプレートとして用いて，ＮＣＢＩデータベースで４６１０６８１７の番号で公表されている遺伝子配列に基づいて作成した特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。これを行うためには，次に発現ベクター中にクローニングするために，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩの制限部位をもつ５’末端位置のプライマー（配列番号４，配列番号５，配列番号７）を用意した。増幅は，ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ；２０ｐＭｏｌのプライマーおよび２．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび以下の温度サイクルを用いて実施した。
サイクル１： ９４°Ｃ，２分間
サイクル２ｘ３０： ９４°Ｃ，１５秒間
５４°Ｃ，３０秒間
６８°Ｃ，６０秒間
サイクル３： ６８°Ｃ，７分間
４°Ｃ，∞
【００４３】
得られた約７５０ｂｐのサイズを有するＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製した後，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素消化し，同じエンドヌクレアーゼで処理したｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＱＥ７０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）の主鎖にそれぞれライゲーションした。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限分析により，７５０ｂｐのサイズを有する挿入物の存在について調べた。フラグメントについて陽性のクローンからのプラスミド調製物を配列分析し，次にそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＢ７９１（ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ）にトランスフォームした。
【００４４】
実施例２
配列番号１のポリペプチドのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における効率的な発現
配列番号１のポリペプチドのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における効率的な発現を得るために，発現ベクターへのクローニング用に，配列番号３のコーディングＤＮＡをＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いた。
【００４５】
このＤＮＡ配列は，最初の１６０塩基対の領域において，これまでに知られているＤＮＡ配列（配列番号２）と５１塩基相違した。この変更は保存的であり，アミノ酸配列は変化しない。
【００４６】
増幅は，ＰＣＲバッファ［１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ；２０ｐＭｏｌのプライマー（配列番号６，配列番号５）および２，５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５０ｎｇの配列番号３のＤＮＡをテンプレートとして用い，以下の温度サイクルで実施した。
サイクル１： ９４°Ｃ，２分間
サイクル２ｘ３０： ９４°Ｃ，４０秒間
５６°Ｃ，３０秒間
６８°Ｃ，６０秒間
サイクル３： ６８°Ｃ，７分間
４°Ｃ，∞
【００４７】
得られた約７５０ｂｐのサイズを有するＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製した後，エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて，同じエンドヌクレアーゼで処理したｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の主鎖にライゲーションした。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限分析により７５０ｂｐのサイズを有する挿入物の存在について調べた。フラグメントが陽性であるクローンからのプラスミド調製物を配列分析し，次にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした。
【００４８】
実施例３
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１からのオキシドレダクターゼの調製
発現コンストラクトでトランスフォームしたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＲＢ７９１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ，ＵＳＡ）をそれぞれ，アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を加えた培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）中で５５０ｎｍの光学密度が０．５に達するまで培養した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの濃度で加えることにより，組換え蛋白質の発現を誘導した。２５℃および２２０ｒｐｍで誘導した１６時間後，細胞を回収し，−２０℃で凍結した。
【００４９】
酵素を回収するためには，３０ｇの細胞を１５０ｍｌのトリエタノールアミンバッファ（１００ｍＭ，ｐＨ＝７，２ｍＭＭｇＣｌ２，１０％グリセロール）に懸濁し，高圧ホモジナイザーにより破壊した。次に，酵素溶液を１５０ｍｌのグリセロールと混合し，−２０℃で保存した。
【００５０】
このようにして得られた酵素溶液を，（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成に用いた。
【００５１】
得られた酵素溶液は，希釈した状態で，対応する酵素測定にも用いた。すなわち，活性試験は以下のものから構成された：８７０μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ緩衝液，ｐＨ７．０，１６０μｇのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，１０μｌの希釈細胞溶解物。１００μｌの１００ｍＭの基質溶液（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを反応混合物に加えることにより反応を開始した。
【００５２】
実施例４
オキシドレダクターゼ（配列番号１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルへの変換
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，９００μｌの緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７，１ｍＭ ＭｇＣｌ２），１００μｌの２−プロパノール，１０μｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），０．１ｍｇのＮＡＤおよび１００μｌの酵素懸濁液（実施例３を参照）の混合物を，エッペンドルフ反応容器中で室温で，連続的に混合しながら２４時間インキュベーションした。２４時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの９６％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５３】
変換ならびにジアステレオマー過剰の判定は，キラルガスクロマトグラフィーにより行った。この目的のためには，キラル分離カラムＣＰ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ ＣＢ（Ｖａｒｉａｎ Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフィーＧＣ−１７Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用い，キャリアガスとしてヘリウムを用いた。
【００５４】
６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの分離は，０．７２ｂａｒで，５０℃で１０分間，５℃／分で昇温，２００℃で１０分間で行った。保持時間は次のとおりであった：（Ｒ−ＢＣＨ）４．４分間；（Ｒ，Ｒ−ＢＣＨ）４７．１分間および（Ｒ，Ｓ−ＢＣＨ）４８．２分間。
【００５５】
実施例５
オキシドレダクターゼ（配列番号１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをさらに変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，５５０μｌのバッファ（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７，１ｍＭ ＭｇＣｌ２），１５０μｌの２−プロパノール，２００μｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），０．１ｍｇのＮＡＤおよび２００μｌの酵素懸濁液（実施例３を参照）の混合物を，エッペンドルフ反応容器中でインキュベーションした。反応の過程では，窒素を導入することにより，形成されたアセトン／２−プロパノール混合物を繰り返し蒸発させ，新たな２−プロパノールおよび５０μｌの酵素を加えた。２４時間間隔で２−３回繰り返した後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞９０％が還元されて（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとなった。ジアステレオマー過剰量＞９９％であった。
【００５６】
実施例６
オキシドレダクターゼ（配列番号１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをさらに変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，６．７ｍｌのバッファ（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝９），１，７ｍｌの２−プロパノール，２ｍｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），１．０ｍｇのＮＡＤおよび１５０ｍｇのオキシドレダクターゼ（配列番号１）を含む凍結細胞Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１Ｓｔａｒ（実施例３を参照）の混合物を反応容器中で４５℃でインキュベーションした。２４時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞９０％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５７】
実施例７
オキシドレダクターゼ（配列番号８）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをさらに変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，５．０ｍｌのバッファ（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７．５），２．０ｍｌの２−プロパノール，４．０ｍｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），１．０ｍｇのＮＡＤａｎｄおよび，配列番号８のオキシドレダクターゼ（実施例２および３に対応）を含む２５０ｍｇの凍結細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＢ７９１の混合物を，反応容器中で４０℃でインキュベーションした。２４時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞９０％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５８】
実施例８
オキシドレダクターゼ（配列番号１１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，３５０μｌのバッファ（１００ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ＝７），１５０μｌの２−プロパノール，５０μｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），０．０２５ｍｇのＮＡＤおよび１５μｌの酵素懸濁液（配列番号１１）（実施例３を参照）の混合物を，エッペンドルフ反応容器中で室温で，連続的に混合しながら４８時間インキュベーションした。４８時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞８０％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５９】
配列のリスト
配列番号１
1 mlegkvavit gagsgigrat alrfaregar vvvaelderr
41 geevvreile sggeavfvrt dvsefeqvea averaveeyg
81 tldvmfnnag ighyaplleh dpehydrvvr vnqygvyygi
121 laagrkmael enpgviinta svyaflaspg vigyhaskga
161 vkmmtqaaal elaphgirvv aiapggvdtp iiqgykdmgl
201 gerlargqmr rrlqtpeqia gavvllatee adaingsvvm
241 tddgyaefk
【００６０】
配列番号２
1 atgctcgaggggaaggtcgcggtcatcacgggggccggca
41 gcggcataggccgggccaccgcgctcaggttcgcccgcga
81 aggggcccgggtggtcgtggcggagctcgacgagcggagg
121 ggggaggaggtcgtccgggagatcctcgagtccggcgggg
161 aggccgtcttcgtgaggacggacgtctcggagttcgagca
201 ggttgaggccgccgtcgagcgcgccgtcgaggagtacggg
241 acgctggacgtcatgttcaacaacgccggcatcgggcact
281 acgcccccctgctggagcacgacccggagcactacgaccg
321 ggtggtccgggtgaaccagtacggcgtctactacgggata
361 ctcgccgccggcaggaagatggccgagctggagaaccccg
401 gcgtgatcatcaacaccgcctcggtctacgctttcctggc
441 ctcccccggtgtgatcggctatcacgcttccaagggggcg
481 gtgaagatgatgacccaggccgcagccctggagctcgccc
521 cccacggcatacgggtcgtcgccatcgccccgggcggggt
561 ggacaccccgatcatccagggctacaaggacatgggcctc
601 ggtgagcggctggcccgcggccagatgcgtcgcaggctcc
641 agacccccgagcagatcgccggcgccgtcgtcctgctcgc
681 caccgaggaggcagacgccataaacggctcggtggtgatg
721 accgacgacggctacgcggagttcaagtaa
【００６１】
配列番号３
1 atgctggaag gtaaagtggc agtcatcacc ggtgcaggca
41 gcggcattgg gcgtgccact gcgctgcgtt ttgcgcgtga
81 aggcgctcgc gtcgttgtgg ccgagctgga tgaacgtcgc
121 ggtgaggaag ttgtacgtga gattctggaa tctggcgggg
161 gggaggccgt cttcgtgagg acggacgtct cggagttcga
201 gcaggttgag gccgccgtcg agcgcgccgt cgaggagtac
241 gggacgctgg acgtcatgtt caacaacgcc ggcatcgggc
281 actacgcccc cctgctggag cacgacccgg agcactacga
321 ccgggtggtc cgggtgaacc agtacggcgt ctactacggg
361 atactcgccg ccggcaggaa gatggccgag ctggagaacc
401 ccggcgtgat catcaacacc gcctcggtct acgctttcct
441 ggcctccccc ggtgtgatcg gctatcacgc ttccaagggg
481 gcggtgaaga tgatgaccca ggccgcagcc ctggagctcg
521 ccccccacgg catacgggtc gtcgccatcg ccccgggcgg
561 ggtggacacc ccgatcatcc agggctacaa ggacatgggc
601 ctcggtgagc ggctggcccg cggccagatg cgtcgcaggc
641 tccagacccc cgagcagatc gccggcgccg tcgtcctgct
681 cgccaccgag gaggcagacg ccataaacgg ctcggtggtg
721 atgaccgacg acggctacgc ggagttcaag taa
【００６２】
配列番号４
GGGAATTCCATATGATGCTCGAGGGGAAGGTCG
【００６３】
配列番号５
CCCAAGCTTATTACTTGAACTCCGCGTAGCCGTC
【００６４】
配列番号６
CCTAGCTAGCATGCTGGAAGGTAAAGTGGC
【００６５】
配列番号７
CACATGCATGCGAATGCTCGAGGGGAAGGTC
【００６６】
配列番号８
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５ 蛋白質配列 カルボニルレダクターゼ
1 mrlkgkaaiv tggasgigra tairfaeega kvavsdinee ggeetvrlir ekggeaifvq
61 tdvadskqvs rlvqtavdaf gglhilfnna gighsevrst dlseeewdrv invnlkgvfl
121 gikyavpvmk qcgggaivnt ssllgikgkk yesaynaska gvilltknaa leygkfnirv
181 naiapgvidt niitpwkqde rkwpiiskan algrigtpee vanavlflas deasfitgat
241 lsvdgggltf
【００６７】
配列番号９
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５ 核酸配列 カルボニルレダクターゼ
1 atgaggctaa aaggaaaagc ggcgattgtc accggcggcg cgagcggcat cggccgggcg
61 acggcgattc gctttgcgga agaaggcgcc aaagtggcgg tgagcgacat caatgaggaa
121 ggaggggaag aaacggtccg cctgattcgg gaaaaaggag gggaggcgat ttttgtccaa
181 acggacgtag ccgattccaa gcaagtgagc cgccttgtcc aaacggcggt tgatgccttt
241 ggcggcctac atattctctt taacaatgcc ggcatcggcc attcggaagt gcggagcacc
301 gacttgtctg aagaagagtg ggaccgggtc atcaacgtta atttgaaagg agtgttcctt
361 ggcatcaaat acgcggtgcc cgtgatgaag caatgcggtg gcggggccat tgtcaacaca
421 tcgagcctgc ttggaatcaa agggaaaaag tacgaatcgg cctacaacgc ctcgaaggcc
481 ggggtgattt tgttgacgaa aaatgcagca ttggaatatg ggaagtttaa cattcgcgtc
541 aatgccattg caccgggggt cattgatacg aacatcatca cgccgtggaa acaagatgag
601 cgcaaatggc cgatcatttc gaaagcgaac gccctcggcc gcatcgggac gccagaggaa
661 gtggcgaacg cggtgttgtt tttggcgtcc gatgaagcgt cgtttatcac cggcgcgaca
721 ttgtcggtcg acggcggcgg gctgacgttt tag
【００６８】
配列番号１０
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５ 核酸配列 合成遺伝子
1 atgcgcctga aagggaaagc ggcaattgtg acgggtggcg ccagcggcat cgggcgcgcg
61 actgcgatcc gttttgcaga agagggtgcg aaagttgccg ttagcgacat taacgaggaa
121 ggcggtgagg aaaccgttcg cctgatccgt gaaaaaggcg gtgaggcaat cttcgtgcag
181 acggatgtgg ccgactcaaa acaggtatct cgtctggttc agaccgcggt cgacgcgttt
241 ggtggcctgc acatcctgtt caataacgcc ggcattggcc atagcgaagt gcgtagtact
301 gatctgagcg aggaagagtg ggatcgcgtg attaacgtga acctgaaagg tgtgtttctg
361 ggtattaagt atgcagtccc tgttatgaaa cagtgtggcg gtggtgcgat tgtgaatacc
421 tctagtctgt tgggaatcaa agggaaaaag tatgaatcgg cctacaacgc atcgaaagcc
481 ggcgtcatcc tgctgaccaa aaatgcggcc ctggagtatg gcaagttcaa tattcgtgtc
541 aacgcgatcg ctccaggcgt tatcgatacc aacatcatta caccgtggaa gcaagatgaa
601 cgcaagtggc cgattatctc caaagctaat gcgctgggcc gtatcggtac gccggaagaa
661 gtggctaatg cggttctgtt tctggcaagc gacgaagcga gctttattac gggtgcaacc
721 ctctccgtag atgggggcgg gttaaccttc taa
【００６９】
配列番号１１
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｔｉａｃｕｓ ＤＳＭＺ６３５ 蛋白質配列 カルボニルレダクターゼ
1 meppfigkva lvtgaaagig rasalafare gakvvvadvn veggeetial cralntdamf
61 vrcdvsqrde verlialavd tfgridfahn nagiegvqam ladypeevwd rvieinlkgv
121 wlcmkyeirh mlkqgggaiv ntssvaglag srgvsayvas khgivgitka aaleyarngi
181 rvnaicpgti htamidrftq gdpqllaqfa egepigrlgs peevanaviw lcsdkasfvt
241 gatlavdggr la
【００７０】
配列番号１２
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｔｉａｃｕｓ ＤＳＭＺ６３５ 核酸配列 カルボニルレダクターゼ
1 atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt
61 cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat
121 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc
181 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac
241 acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg
301 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc
361 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg
421 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc
481 aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt
541 cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag
601 ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg
661 cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc
721 ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa
【００７１】
配列番号１３
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｔｉａｃｕｓ ＤＳＭＺ６３５ 核酸配列 合成遺伝子
1 atggagcccc catttatcgg gaaagttgcg ttagttacgg gggcagcggc agggatcggc
61 agggcgagtg ccctggcgtt tgctagagaa ggggccaagg tcgttgtggc agacgttaac
121 gtagagggtg gcgaagagac aattgcttta tgcagagctc tcaacactga tgccatgttc
181 gtccgctgtg atgtgtcaca gcgagacgaa gtcgaaaggc taatcgccct agcggtagac
241 acattcggcc gtattgactt tgctcataat aacgcgggca tagagggagt acaagcaatg
301 ttggctgact atcctgagga agtatgggat cgagtaattg aaatcaatct caagggggtt
361 tggctgtgta tgaagtacga aataaggcac atgctcaagc aaggtggcgg agcgatcgta
421 aacactagct ctgtcgccgg tctagcagga tctcgggggg tttccgcata cgtcgcctcg
481 aaacacggca ttgtagggat taccaaagct gcagcccttg agtatgcccg aaatggaata
541 agagtgaatg ctatctgccc aggcacaata catactgcaa tgatagatcg gtttacgcag
601 ggtgatccgc aacttttggc gcagttcgcc gaaggtgagc ctataggtcg ccttggtagc
661 ccggaagagg tcgctaatgc ggtgatttgg ttgtgttcag acaaagcaag tttcgtgacg
721 ggagctaccc tggcagtgga tggaggacgt ttagct
【００７２】
配列番号１４
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＣＢＳ６３９６ 蛋白質配列 カルボニルレダクターゼ
1 msatsnalit gasrgmgeat aiklalegys vtlasrgieq lnaikeklpi vkkgqqhyvw
61 qldlsdieaa stfkgaplpa ssydvffsna gvvdfapfad qsetaqkdlf tvnllspval
121 tktivkaiad kpretpahii ftssivgirg vpnvavysat kgaidsfars larefgpkni
181 hvncvnpgtt rtemtkgvdl aafgdvpikg wievdaiada vlflikskni tgqslvvdng
241 fgv
【００７３】
配列番号１５
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＣＢＳ６３９６ 核酸配列 合成遺伝子
1 atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca
61 gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag
121 ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg
181 cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc
241 agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac
301 caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg
361 accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc
421 ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc
481 aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc
541 cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc
601 gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct
661 gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga
721 ttcggtgttt aa
【技術分野】
【０００１】
本発明は，一般式Ｉ：
【化５】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化６】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法であって，ここで，ヒドロキシケトンは，補因子の存在下でオキシドレダクターゼにより還元される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般式ＩＩのキラルジオールは，医薬製品の製造，特にＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の製造における重要な中間体である。このようなキラルジオールは，例えば，（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ，３Ｒ）−３，５，６−トリヒドロキシ−ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルである。
【０００３】
この種のジオールは，特に，対応する式Ｉのヒドロキシケトン，例えば（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのエナンチオ選択的還元により製造される。この反応を行うにあたっては，化学的に触媒される還元は，一方では厳しい反応条件のために副生成物が生じ，他方では，不十分なエナンチオマーおよびジアスレオマー過剰しか得られないという欠点を有し，非常に大きな努力があって初めて技術的に実用可能となる。
【０００４】
この理由のため，相当長い間，上述のヒドロキシケトンのエナンチオ選択的還元を行うことができる生物触媒プロセスの開発に努力が払われてきた。生物触媒プロセスは，通常は穏和な条件下で行われ，このことにより，いずれにせよ幾分不安定である５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸エステル誘導体をさらなる副生成物を形成することなく還元することが可能であると予測されてきた。しかし，これまでのところ，効率的な様式で，単離された酵素を用いて，上述の５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸エステル誘導体の酵素的還元を実現しうる適当な生物触媒を見いだすことはできていない。
【０００５】
例えば，米国特許６，００１，６１５および国際公開ＷＯ０１／８５９７５Ａ１は，Ｂｅａｕｖａｒｉａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｃａｎｄｉｄａ，ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属の種々の酵母を用いて，それぞれ（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを還元することを記載する。しかし，変換は野生型株の全細胞を用いた場合にのみ生じ，したがって，５％をはるかに下回る非常に低い濃度でしか実施することができない。これまでのところ，変換を担う酵素およびＤＮＡ配列は同定することができていない。
【０００６】
さらに，構造的に類似する化合物の微生物変換がＥＰ０５６９９９８Ｂ１に記載されている。ここでは，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３３０５からのＮＡＤＨ依存性酵素を精製することが可能であり，これを単離された状態で補酵素再生用にグルコースデヒドロゲナーゼと一緒に用いることができることが記載される。このプロセスにおいては，基質を１％の濃度で使用して，わずかに１０のＮＡＤＨの"総ターンオーバー数"が達成されている。工業的に適用しうるプロセスはまだ存在しない。
【０００７】
米国特許６，６４５，７４６Ｂ１においては，Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅのアミノ酸配列が開示されており，これをＮＡＤＰＨとともに用いて，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得ることができる。この明細書においては，酵素は好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのグルコースデヒドロゲナーゼとともに発現させた状態で使用し，グルコースデヒドロゲナーゼおよび補基質としてグルコースを用いて補因子ＮＡＤＰＨの再生を行う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は，一般式ＩＩのエナンチオマー的に純粋なジオールを，高収率でかつ高いエナンチオマー純度で，副生成物なしに経済的に製造することを可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にしたがえば，この目的は，補因子としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でオキシドレダクターゼを還元する上記の方法により達成され，この方法は，
ａ） ヒドロキシケトンを反応中に５０ｇ／ｌ以上の濃度で提供し，
ｂ） 形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキルを表し，Ｃの合計は３以上である）の２級アルコールの酸化により連続的に再生され，および
ｃ） ヒドロキシケトンの還元と２級アルコールの酸化とは同じオキシドレダクターゼにより触媒される，
ことを特徴とする。
【００１０】
本発明の方法の好ましい態様は，オキシドレダクターゼが，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ことを特徴とする。
【００１１】
本発明にしたがえば，上述の目的は，最初に記載された方法において，オキシドレダクターゼが，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ことによっても達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明においては，配列番号１，配列番号８および配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドがオキシドレダクターゼ活性を示し，これを用いて（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを還元して，９９％を超えるジアステレオマー過剰で（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得ることができることが見いだされた。一般式Ｉの他のヒドロキシケトンも，配列番号１，配列番号８および配列番号１１のアミノ酸配列を用いて，同じ方法により還元することができる。
【００１３】
さらに，上述のオキシドレダクターゼは，２級アルコールを還元することにより，還元の間に形成される酸化された補因子を再生しうるという利点を有する。すなわち，前記オキシドレダクターゼの特に経済的な利点は，従来技術の方法（ＵＳ６，６４５，７４６ＢおよびＥＰ０５６９９９８Ｂ）とは対照的に，補因子の再生にさらに別の酵素を必要としない点にもある。
【００１４】
配列番号２のＤＮＡ配列は，配列番号１を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１のゲノムから得ることができる。さらに，配列番号３のＤＮＡ配列を用いて，配列番号１のポリペプチドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａにおいて発現させることができることが見いだされた。
【００１５】
配列番号９のＤＮＡ配列は，配列番号８を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５のゲノムから得ることができる。さらに，配列番号１０のＤＮＡ配列を用いて，配列番号８のポリペプチドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａで発現させることができることが見いだされた。
【００１６】
配列番号１２のＤＮＡ配列は，配列番号１１を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＤＳＭ６３５のゲノムから得ることができる。
【００１７】
配列番号１５のＤＮＡ配列は，配列番号１４を含むポリペプチドをコードし，例えば，生物Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＣＢＳ６３９６から得ることができる。
【００１８】
すなわち，本発明はまた，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いて，または配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド，すなわち，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４の少なくとも１つのアミノ酸の置換，挿入，欠失または付加により誘導しうるポリペプチドを用いて，または配列番号２，配列番号９，配列番号１２または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または配列番号２，配列番号９，配列番号１２または配列番号１５にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチドを用いて，一般式Ｉのヒドロキシケトンを還元して，一般式ＩＩのジオールとする方法に関する。
【００１９】
例えば配列番号２にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列とは，配列番号２をＤＮＡプローブとして用いて，コロニーハイブリダイゼーション法，プラークハイブリダイゼーション法，サザンハイブリダイゼーション法またはこれらと同等の方法により同定することができるポリヌクレオチドであると理解される。
【００２０】
この目的のためには，フィルター上に固定化されたポリヌクレオチドを，０．７−１ＭＮａＣｌ溶液中で６０℃で，例えば配列番号２とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）または同様の刊行物に記載されるようにして実施する。次に，フィルターを０．１から２倍のＳＳＣ溶液で６５℃で洗浄し，ここで，１倍のＳＳＣ溶液とは，１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウムから構成される混合物であることが理解される。
【００２１】
本発明にしたがう方法においては，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４の配列を含むポリペプチド，および前記ポリペプチドからそれぞれ誘導されるポリペプチドは，完全に精製された状態で用いてもよく，部分的に精製された状態で用いてもよく，あるいは，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のポリペプチドを含有する細胞として用いてもよい。用いられる細胞は，天然の状態で提供してもよく，または透過性にしたもしくは溶解した状態で提供してもよい。好ましくは，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４の配列を含むポリペプチド，およびこれらからそれぞれ得られる誘導体を，適当な宿主生物，例えば，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで過剰発現させ，組換えポリペプチドを用いて一般式Ｉのヒドロキシケトンを還元する。
【００２２】
配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のオキシドレダクターゼまたはこれらの誘導体は，反応させるべき式Ｉの化合物１ｋｇあたり５．０００−１０ＭｉｏＵで用いる（上限なし）。本明細書においては，酵素ユニットの１Ｕは，１分間に１μｍｏｌの式Ｉのヒドロキシケトンを反応させるために必要な酵素の量に対応する。
【００２３】
本発明にしたがう酵素的還元は，穏和な条件下で進行するため，しばしば不安定であるヒドロキシケトンの分解，およびそれに伴う望ましくない副生成物の形成を大きく回避することができる。本発明にしたがう方法は，高い耐用年数をもち，かつ通常は生成するキラルジオールの９９％を超えるジアステレオマー純度を有する。
【００２４】
本発明の好ましい態様は，この方法において用いられる補因子が補基質により連続的に還元されることを特徴とする。好ましくは，ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補因子として用い，還元において形成されたＮＡＤ（Ｐ）は補基質の作用により再びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元される。
【００２５】
好ましくは，２級アルコール，例えば，２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，３−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノール，２−オクタノールまたはシクロヘキサノールを補基質として用いる。特に好ましい態様にしたがえば，２−プロパノールを補酵素再生に用いる。再生用の補基質の量は，総容量に対して５−９５容量％の範囲内でありうる。
【００２６】
補酵素の再生は，例えば，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４を含むポリペプチドにより同様にして行う。
【００２７】
本発明にしたがう方法においては，一般式Ｉのヒドロキシケトンは，好ましくは総容量に基づいて，５−５０重量％（５０ｇ／ｌ−５００ｇ／ｌ）で，好ましくは８−４０重量％，特に好ましくは１０−２５重量％の量で用いる。
【００２８】
特に好ましい態様は，一般式（Ｉ）のヒドロキシケトンとして，（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを用いることを特徴とする。
【００２９】
好ましくは，本発明にしたがう方法は，水性有機２相系で実施する。
【００３０】
酵素的還元が進行する反応混合物中の水性部分は，好ましくは緩衝液，例えば，ｐＨ５−１０，好ましくはｐＨ６−９のリン酸カリウム，ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたはトリエタノールアミン緩衝液を含む。さらに，緩衝液は，酵素を安定化または活性化させるイオン，例えば，亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンを含むことができる。
【００３１】
本発明にしたがう方法を実施する間，温度は約１０℃から７０℃，好ましくは２０℃から４５℃の範囲であることが適当である。
【００３２】
本発明にしたがう方法のさらに別の好ましい態様においては，酵素的変換は，水と混和性ではないか，または限定された程度でしか水と混和性ではない有機溶媒の存在下で実施する。前記溶媒は，例えば，対称性のまたは非対称性のジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルエーテル，直鎖または分枝鎖のアルカンまたはシクロアルカン，または水不溶性２級アルコールであり，これは同時に補基質である。好ましい有機溶媒は，ジエチルエーテル，３級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサン，２−オクタノール，２−ヘプタノール，４−メチル−２−ペンタノールおよびシクロヘキサノールである。最後に挙げた２級アルコールの場合には，溶媒は，同時に補因子再生用の補基質としても作用することができる。
【００３３】
それぞれ水不溶性の溶媒および補基質を用いる場合には，反応バッチは水性相および有機相から構成される。ヒドロキシケトンは，その溶解度にしたがって，有機相と水性相との間に分配される。一般に，有機相は，総反応容量に基づいて５−９５％，好ましくは１０−９０％の割合である。２液相は，好ましくは機械的に混合し，このことによりこれらの間に大きな表面積が生ずる。また，この態様においては，酵素的還元において形成されるＮＡＤは，例えば，上述したもの等の補基質を用いて，再び還元してＮＡＤＨとすることができる。
【００３４】
水性相における補因子，特にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのそれぞれの濃度は，一般に０．００１ｍＭ−１０ｍＭの範囲，特に０．０１ｍＭ−１ｍＭの範囲内である。
【００３５】
本発明にしたがう方法においては，オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼの安定剤を用いてもよい。適当な安定剤は，例えば，グリセロール，ソルビトール，１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００３６】
本発明にしたがう方法は，例えば，ガラスまたは金属製の密封反応容器中で行うことができる。この目的のためには，成分を別々に反応容器に入れ，窒素または空気の雰囲気下で撹拌する。
【００３７】
本発明の別の可能な態様にしたがえば，反応の平衡を反応生成物（一般式ＩＩのジオール）側にシフトさせるために，酸化された補基質（例えばアセトン）を連続的に除去してもよく，および／または，補基質（例えば２−プロパノール）を新たに連続的に加えてもよい。
【００３８】
さらに別の態様においては，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４にしたがうオキシドレダクターゼ，および／または補基質の添加は，プロセスの経過中に徐々に行ってもよい。
【００３９】
還元が完了した後，反応混合物を処理する。この目的のためには，任意に水性相を有機相から分離し，生成物を含む有機相を濾過する。任意に，水性層を抽出し，さらに有機相と同様に処理してもよい。次に，有機相から溶媒を蒸発させ，一般式ＩＩのジオールを粗生成物として得る。次に粗生成物をさらに精製してもよく，または次の生成物の合成に直接使用してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下に，実施例により本発明をさらに説明する。
【００４１】
実施例１
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１からのオキシドレダクターゼのクローニング
Ａ）Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１の培養
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１の細胞は，以下の培地で５０℃で（ｐＨ７．２），細菌用振盪器で１４０ｒｐｍで培養した：０．１％酵母エキス，０．１％トリプトン，０．００４％ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ，０．０２％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．０１％ニトリロ三酢酸，１００ｍｌのリン酸バッファ［５．４４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４，４３ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ］，５００μｌ／ｌの０．０１Ｍクエン酸Ｆｅ，５００μｌ／ｌの微量元素［５００μｌ／ｌのＨ２ＳＯ４，２．２８ｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，５００ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５００ｍｇのＨ３ＢＯ３，２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，２５ｍｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，４５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］。培養第６日に，遠心分離により細胞を培養液から分離し，−８０℃で保存した。
【００４２】
Ｂ）選択的オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の増幅
ゲノムＤＮＡは，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｍａｎｎｉａｔｉｓ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される方法にしたがって抽出した。得られた核酸をテンプレートとして用いて，ＮＣＢＩデータベースで４６１０６８１７の番号で公表されている遺伝子配列に基づいて作成した特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。これを行うためには，次に発現ベクター中にクローニングするために，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩの制限部位をもつ５’末端位置のプライマー（配列番号４，配列番号５，配列番号７）を用意した。増幅は，ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ；２０ｐＭｏｌのプライマーおよび２．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび以下の温度サイクルを用いて実施した。
サイクル１： ９４°Ｃ，２分間
サイクル２ｘ３０： ９４°Ｃ，１５秒間
５４°Ｃ，３０秒間
６８°Ｃ，６０秒間
サイクル３： ６８°Ｃ，７分間
４°Ｃ，∞
【００４３】
得られた約７５０ｂｐのサイズを有するＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製した後，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素消化し，同じエンドヌクレアーゼで処理したｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＱＥ７０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）の主鎖にそれぞれライゲーションした。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限分析により，７５０ｂｐのサイズを有する挿入物の存在について調べた。フラグメントについて陽性のクローンからのプラスミド調製物を配列分析し，次にそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＢ７９１（ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ）にトランスフォームした。
【００４４】
実施例２
配列番号１のポリペプチドのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における効率的な発現
配列番号１のポリペプチドのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における効率的な発現を得るために，発現ベクターへのクローニング用に，配列番号３のコーディングＤＮＡをＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いた。
【００４５】
このＤＮＡ配列は，最初の１６０塩基対の領域において，これまでに知られているＤＮＡ配列（配列番号２）と５１塩基相違した。この変更は保存的であり，アミノ酸配列は変化しない。
【００４６】
増幅は，ＰＣＲバッファ［１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ；２０ｐＭｏｌのプライマー（配列番号６，配列番号５）および２，５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５０ｎｇの配列番号３のＤＮＡをテンプレートとして用い，以下の温度サイクルで実施した。
サイクル１： ９４°Ｃ，２分間
サイクル２ｘ３０： ９４°Ｃ，４０秒間
５６°Ｃ，３０秒間
６８°Ｃ，６０秒間
サイクル３： ６８°Ｃ，７分間
４°Ｃ，∞
【００４７】
得られた約７５０ｂｐのサイズを有するＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製した後，エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて，同じエンドヌクレアーゼで処理したｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の主鎖にライゲーションした。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限分析により７５０ｂｐのサイズを有する挿入物の存在について調べた。フラグメントが陽性であるクローンからのプラスミド調製物を配列分析し，次にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした。
【００４８】
実施例３
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ９９４１からのオキシドレダクターゼの調製
発現コンストラクトでトランスフォームしたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＲＢ７９１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ，ＵＳＡ）をそれぞれ，アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を加えた培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）中で５５０ｎｍの光学密度が０．５に達するまで培養した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの濃度で加えることにより，組換え蛋白質の発現を誘導した。２５℃および２２０ｒｐｍで誘導した１６時間後，細胞を回収し，−２０℃で凍結した。
【００４９】
酵素を回収するためには，３０ｇの細胞を１５０ｍｌのトリエタノールアミンバッファ（１００ｍＭ，ｐＨ＝７，２ｍＭＭｇＣｌ２，１０％グリセロール）に懸濁し，高圧ホモジナイザーにより破壊した。次に，酵素溶液を１５０ｍｌのグリセロールと混合し，−２０℃で保存した。
【００５０】
このようにして得られた酵素溶液を，（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成に用いた。
【００５１】
得られた酵素溶液は，希釈した状態で，対応する酵素測定にも用いた。すなわち，活性試験は以下のものから構成された：８７０μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ緩衝液，ｐＨ７．０，１６０μｇのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，１０μｌの希釈細胞溶解物。１００μｌの１００ｍＭの基質溶液（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを反応混合物に加えることにより反応を開始した。
【００５２】
実施例４
オキシドレダクターゼ（配列番号１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルへの変換
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，９００μｌの緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７，１ｍＭ ＭｇＣｌ２），１００μｌの２−プロパノール，１０μｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），０．１ｍｇのＮＡＤおよび１００μｌの酵素懸濁液（実施例３を参照）の混合物を，エッペンドルフ反応容器中で室温で，連続的に混合しながら２４時間インキュベーションした。２４時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの９６％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５３】
変換ならびにジアステレオマー過剰の判定は，キラルガスクロマトグラフィーにより行った。この目的のためには，キラル分離カラムＣＰ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ ＣＢ（Ｖａｒｉａｎ Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフィーＧＣ−１７Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用い，キャリアガスとしてヘリウムを用いた。
【００５４】
６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの分離は，０．７２ｂａｒで，５０℃で１０分間，５℃／分で昇温，２００℃で１０分間で行った。保持時間は次のとおりであった：（Ｒ−ＢＣＨ）４．４分間；（Ｒ，Ｒ−ＢＣＨ）４７．１分間および（Ｒ，Ｓ−ＢＣＨ）４８．２分間。
【００５５】
実施例５
オキシドレダクターゼ（配列番号１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをさらに変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，５５０μｌのバッファ（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７，１ｍＭ ＭｇＣｌ２），１５０μｌの２−プロパノール，２００μｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），０．１ｍｇのＮＡＤおよび２００μｌの酵素懸濁液（実施例３を参照）の混合物を，エッペンドルフ反応容器中でインキュベーションした。反応の過程では，窒素を導入することにより，形成されたアセトン／２−プロパノール混合物を繰り返し蒸発させ，新たな２−プロパノールおよび５０μｌの酵素を加えた。２４時間間隔で２−３回繰り返した後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞９０％が還元されて（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとなった。ジアステレオマー過剰量＞９９％であった。
【００５６】
実施例６
オキシドレダクターゼ（配列番号１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをさらに変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，６．７ｍｌのバッファ（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝９），１，７ｍｌの２−プロパノール，２ｍｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），１．０ｍｇのＮＡＤおよび１５０ｍｇのオキシドレダクターゼ（配列番号１）を含む凍結細胞Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１Ｓｔａｒ（実施例３を参照）の混合物を反応容器中で４５℃でインキュベーションした。２４時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞９０％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５７】
実施例７
オキシドレダクターゼ（配列番号８）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをさらに変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，５．０ｍｌのバッファ（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７．５），２．０ｍｌの２−プロパノール，４．０ｍｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），１．０ｍｇのＮＡＤａｎｄおよび，配列番号８のオキシドレダクターゼ（実施例２および３に対応）を含む２５０ｍｇの凍結細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＢ７９１の混合物を，反応容器中で４０℃でインキュベーションした。２４時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞９０％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５８】
実施例８
オキシドレダクターゼ（配列番号１１）を用いる（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルから（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを変換して（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルとするために，３５０μｌのバッファ（１００ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ＝７），１５０μｌの２−プロパノール，５０μｌの（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル粗生成物（エナンチオマー純度＞９９％），０．０２５ｍｇのＮＡＤおよび１５μｌの酵素懸濁液（配列番号１１）（実施例３を参照）の混合物を，エッペンドルフ反応容器中で室温で，連続的に混合しながら４８時間インキュベーションした。４８時間後，用いた（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの＞８０％が（３Ｒ，５Ｒ）−６−シアノ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルに還元された。ジアステレオマー過剰は＞９９％であった。
【００５９】
配列のリスト
配列番号１
1 mlegkvavit gagsgigrat alrfaregar vvvaelderr
41 geevvreile sggeavfvrt dvsefeqvea averaveeyg
81 tldvmfnnag ighyaplleh dpehydrvvr vnqygvyygi
121 laagrkmael enpgviinta svyaflaspg vigyhaskga
161 vkmmtqaaal elaphgirvv aiapggvdtp iiqgykdmgl
201 gerlargqmr rrlqtpeqia gavvllatee adaingsvvm
241 tddgyaefk
【００６０】
配列番号２
1 atgctcgaggggaaggtcgcggtcatcacgggggccggca
41 gcggcataggccgggccaccgcgctcaggttcgcccgcga
81 aggggcccgggtggtcgtggcggagctcgacgagcggagg
121 ggggaggaggtcgtccgggagatcctcgagtccggcgggg
161 aggccgtcttcgtgaggacggacgtctcggagttcgagca
201 ggttgaggccgccgtcgagcgcgccgtcgaggagtacggg
241 acgctggacgtcatgttcaacaacgccggcatcgggcact
281 acgcccccctgctggagcacgacccggagcactacgaccg
321 ggtggtccgggtgaaccagtacggcgtctactacgggata
361 ctcgccgccggcaggaagatggccgagctggagaaccccg
401 gcgtgatcatcaacaccgcctcggtctacgctttcctggc
441 ctcccccggtgtgatcggctatcacgcttccaagggggcg
481 gtgaagatgatgacccaggccgcagccctggagctcgccc
521 cccacggcatacgggtcgtcgccatcgccccgggcggggt
561 ggacaccccgatcatccagggctacaaggacatgggcctc
601 ggtgagcggctggcccgcggccagatgcgtcgcaggctcc
641 agacccccgagcagatcgccggcgccgtcgtcctgctcgc
681 caccgaggaggcagacgccataaacggctcggtggtgatg
721 accgacgacggctacgcggagttcaagtaa
【００６１】
配列番号３
1 atgctggaag gtaaagtggc agtcatcacc ggtgcaggca
41 gcggcattgg gcgtgccact gcgctgcgtt ttgcgcgtga
81 aggcgctcgc gtcgttgtgg ccgagctgga tgaacgtcgc
121 ggtgaggaag ttgtacgtga gattctggaa tctggcgggg
161 gggaggccgt cttcgtgagg acggacgtct cggagttcga
201 gcaggttgag gccgccgtcg agcgcgccgt cgaggagtac
241 gggacgctgg acgtcatgtt caacaacgcc ggcatcgggc
281 actacgcccc cctgctggag cacgacccgg agcactacga
321 ccgggtggtc cgggtgaacc agtacggcgt ctactacggg
361 atactcgccg ccggcaggaa gatggccgag ctggagaacc
401 ccggcgtgat catcaacacc gcctcggtct acgctttcct
441 ggcctccccc ggtgtgatcg gctatcacgc ttccaagggg
481 gcggtgaaga tgatgaccca ggccgcagcc ctggagctcg
521 ccccccacgg catacgggtc gtcgccatcg ccccgggcgg
561 ggtggacacc ccgatcatcc agggctacaa ggacatgggc
601 ctcggtgagc ggctggcccg cggccagatg cgtcgcaggc
641 tccagacccc cgagcagatc gccggcgccg tcgtcctgct
681 cgccaccgag gaggcagacg ccataaacgg ctcggtggtg
721 atgaccgacg acggctacgc ggagttcaag taa
【００６２】
配列番号４
GGGAATTCCATATGATGCTCGAGGGGAAGGTCG
【００６３】
配列番号５
CCCAAGCTTATTACTTGAACTCCGCGTAGCCGTC
【００６４】
配列番号６
CCTAGCTAGCATGCTGGAAGGTAAAGTGGC
【００６５】
配列番号７
CACATGCATGCGAATGCTCGAGGGGAAGGTC
【００６６】
配列番号８
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５ 蛋白質配列 カルボニルレダクターゼ
1 mrlkgkaaiv tggasgigra tairfaeega kvavsdinee ggeetvrlir ekggeaifvq
61 tdvadskqvs rlvqtavdaf gglhilfnna gighsevrst dlseeewdrv invnlkgvfl
121 gikyavpvmk qcgggaivnt ssllgikgkk yesaynaska gvilltknaa leygkfnirv
181 naiapgvidt niitpwkqde rkwpiiskan algrigtpee vanavlflas deasfitgat
241 lsvdgggltf
【００６７】
配列番号９
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５ 核酸配列 カルボニルレダクターゼ
1 atgaggctaa aaggaaaagc ggcgattgtc accggcggcg cgagcggcat cggccgggcg
61 acggcgattc gctttgcgga agaaggcgcc aaagtggcgg tgagcgacat caatgaggaa
121 ggaggggaag aaacggtccg cctgattcgg gaaaaaggag gggaggcgat ttttgtccaa
181 acggacgtag ccgattccaa gcaagtgagc cgccttgtcc aaacggcggt tgatgccttt
241 ggcggcctac atattctctt taacaatgcc ggcatcggcc attcggaagt gcggagcacc
301 gacttgtctg aagaagagtg ggaccgggtc atcaacgtta atttgaaagg agtgttcctt
361 ggcatcaaat acgcggtgcc cgtgatgaag caatgcggtg gcggggccat tgtcaacaca
421 tcgagcctgc ttggaatcaa agggaaaaag tacgaatcgg cctacaacgc ctcgaaggcc
481 ggggtgattt tgttgacgaa aaatgcagca ttggaatatg ggaagtttaa cattcgcgtc
541 aatgccattg caccgggggt cattgatacg aacatcatca cgccgtggaa acaagatgag
601 cgcaaatggc cgatcatttc gaaagcgaac gccctcggcc gcatcgggac gccagaggaa
661 gtggcgaacg cggtgttgtt tttggcgtcc gatgaagcgt cgtttatcac cggcgcgaca
721 ttgtcggtcg acggcggcgg gctgacgttt tag
【００６８】
配列番号１０
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ４６５ 核酸配列 合成遺伝子
1 atgcgcctga aagggaaagc ggcaattgtg acgggtggcg ccagcggcat cgggcgcgcg
61 actgcgatcc gttttgcaga agagggtgcg aaagttgccg ttagcgacat taacgaggaa
121 ggcggtgagg aaaccgttcg cctgatccgt gaaaaaggcg gtgaggcaat cttcgtgcag
181 acggatgtgg ccgactcaaa acaggtatct cgtctggttc agaccgcggt cgacgcgttt
241 ggtggcctgc acatcctgtt caataacgcc ggcattggcc atagcgaagt gcgtagtact
301 gatctgagcg aggaagagtg ggatcgcgtg attaacgtga acctgaaagg tgtgtttctg
361 ggtattaagt atgcagtccc tgttatgaaa cagtgtggcg gtggtgcgat tgtgaatacc
421 tctagtctgt tgggaatcaa agggaaaaag tatgaatcgg cctacaacgc atcgaaagcc
481 ggcgtcatcc tgctgaccaa aaatgcggcc ctggagtatg gcaagttcaa tattcgtgtc
541 aacgcgatcg ctccaggcgt tatcgatacc aacatcatta caccgtggaa gcaagatgaa
601 cgcaagtggc cgattatctc caaagctaat gcgctgggcc gtatcggtac gccggaagaa
661 gtggctaatg cggttctgtt tctggcaagc gacgaagcga gctttattac gggtgcaacc
721 ctctccgtag atgggggcgg gttaaccttc taa
【００６９】
配列番号１１
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｔｉａｃｕｓ ＤＳＭＺ６３５ 蛋白質配列 カルボニルレダクターゼ
1 meppfigkva lvtgaaagig rasalafare gakvvvadvn veggeetial cralntdamf
61 vrcdvsqrde verlialavd tfgridfahn nagiegvqam ladypeevwd rvieinlkgv
121 wlcmkyeirh mlkqgggaiv ntssvaglag srgvsayvas khgivgitka aaleyarngi
181 rvnaicpgti htamidrftq gdpqllaqfa egepigrlgs peevanaviw lcsdkasfvt
241 gatlavdggr la
【００７０】
配列番号１２
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｔｉａｃｕｓ ＤＳＭＺ６３５ 核酸配列 カルボニルレダクターゼ
1 atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt
61 cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat
121 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc
181 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac
241 acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg
301 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc
361 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg
421 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc
481 aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt
541 cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag
601 ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg
661 cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc
721 ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa
【００７１】
配列番号１３
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｔｉａｃｕｓ ＤＳＭＺ６３５ 核酸配列 合成遺伝子
1 atggagcccc catttatcgg gaaagttgcg ttagttacgg gggcagcggc agggatcggc
61 agggcgagtg ccctggcgtt tgctagagaa ggggccaagg tcgttgtggc agacgttaac
121 gtagagggtg gcgaagagac aattgcttta tgcagagctc tcaacactga tgccatgttc
181 gtccgctgtg atgtgtcaca gcgagacgaa gtcgaaaggc taatcgccct agcggtagac
241 acattcggcc gtattgactt tgctcataat aacgcgggca tagagggagt acaagcaatg
301 ttggctgact atcctgagga agtatgggat cgagtaattg aaatcaatct caagggggtt
361 tggctgtgta tgaagtacga aataaggcac atgctcaagc aaggtggcgg agcgatcgta
421 aacactagct ctgtcgccgg tctagcagga tctcgggggg tttccgcata cgtcgcctcg
481 aaacacggca ttgtagggat taccaaagct gcagcccttg agtatgcccg aaatggaata
541 agagtgaatg ctatctgccc aggcacaata catactgcaa tgatagatcg gtttacgcag
601 ggtgatccgc aacttttggc gcagttcgcc gaaggtgagc ctataggtcg ccttggtagc
661 ccggaagagg tcgctaatgc ggtgatttgg ttgtgttcag acaaagcaag tttcgtgacg
721 ggagctaccc tggcagtgga tggaggacgt ttagct
【００７２】
配列番号１４
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＣＢＳ６３９６ 蛋白質配列 カルボニルレダクターゼ
1 msatsnalit gasrgmgeat aiklalegys vtlasrgieq lnaikeklpi vkkgqqhyvw
61 qldlsdieaa stfkgaplpa ssydvffsna gvvdfapfad qsetaqkdlf tvnllspval
121 tktivkaiad kpretpahii ftssivgirg vpnvavysat kgaidsfars larefgpkni
181 hvncvnpgtt rtemtkgvdl aafgdvpikg wievdaiada vlflikskni tgqslvvdng
241 fgv
【００７３】
配列番号１５
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＣＢＳ６３９６ 核酸配列 合成遺伝子
1 atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca
61 gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag
121 ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg
181 cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc
241 agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac
301 caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg
361 accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc
421 ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc
481 aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc
541 cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc
601 gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct
661 gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga
721 ttcggtgttt aa
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化２】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法であって，ヒドロキシケトンは，補因子としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でオキシドレダクターゼにより還元され，ここで，
ａ） ヒドロキシケトンは反応中に５０ｇ／ｌ以上の濃度で提供され；
ｂ） 形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキルを表し，Ｃの合計は３以上である）の２級アルコールの酸化により連続的に再生され；および
ｃ） ヒドロキシケトンの還元と２級アルコールの酸化とは同じオキシドレダクターゼにより触媒される，
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
オキシドレダクターゼは，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
請求項１記載の方法。
【請求項３】
一般式Ｉ：
【化３】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化４】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法であって，ヒドロキシケトンは，補因子の存在下でオキシドレダクターゼにより還元され，ここで，オキシドレダクターゼは，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
補因子は補基質により連続的に還元される，請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが補因子として用いられる，請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノールまたは２−オクタノールが，それぞれ補基質または２級アルコールとして用いられる，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒドロキシケトンは，総反応容量に基づいて，５−５０重量％，好ましくは８−４０重量％，特に１０−２５重量％の量で用いられる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが一般式（Ｉ）のヒドロキシケトンとして用いられる，請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＴＴＮ（総ターンオーバー数＝還元されたヒドロキシケトンのｍｏｌ／用いた補因子のｍｏｌ）が１０３以上である，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
水性有機２相系で行われる，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
さらに，ジエチルエーテル，３級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸エチル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサンまたはシクロヘキサン等の有機溶媒を用いる，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化２】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法であって，ヒドロキシケトンは，補因子としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でオキシドレダクターゼにより還元され，ここで，
ａ） ヒドロキシケトンは反応中に５０ｇ／ｌ以上の濃度で提供され；
ｂ） 形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキルを表し，Ｃの合計は３以上である）の２級アルコールの酸化により連続的に再生され；および
ｃ） ヒドロキシケトンの還元と２級アルコールの酸化とは同じオキシドレダクターゼにより触媒される，
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
オキシドレダクターゼは，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が，配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
請求項１記載の方法。
【請求項３】
一般式Ｉ：
【化３】
［式中，Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルであり，Ｒ２は，−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，−ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである］
のヒドロキシケトンをエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩ：
【化４】
［式中，Ｒ１およびＲ２は，式Ｉにおけるものと同じ意味を有する］
のキラルジオールとする方法であって，ヒドロキシケトンは，補因子の存在下でオキシドレダクターゼにより還元され，ここで，オキシドレダクターゼは，
ａ） アミノ酸の少なくとも５０％が配列番号１，配列番号８，配列番号１１または配列番号１４のアミノ酸配列のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を含むか，
ｂ） 配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５の核酸配列によりコードされるか，または
ｃ） ストリンジェントな条件下で，配列番号２，配列番号３，配列番号９，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１３または配列番号１５にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
補因子は補基質により連続的に還元される，請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが補因子として用いられる，請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノールまたは２−オクタノールが，それぞれ補基質または２級アルコールとして用いられる，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒドロキシケトンは，総反応容量に基づいて，５−５０重量％，好ましくは８−４０重量％，特に１０−２５重量％の量で用いられる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（５Ｒ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル，（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは（５Ｓ）−５，６−ジヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが一般式（Ｉ）のヒドロキシケトンとして用いられる，請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＴＴＮ（総ターンオーバー数＝還元されたヒドロキシケトンのｍｏｌ／用いた補因子のｍｏｌ）が１０３以上である，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
水性有機２相系で行われる，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
さらに，ジエチルエーテル，３級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸エチル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサンまたはシクロヘキサン等の有機溶媒を用いる，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５１９７２２（Ｐ２００９−５１９７２２Ａ）
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４６２０７（Ｐ２００８−５４６２０７）
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７３８７５
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０６３７１３１６）アイイーピー ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７３８７５
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０６３７１３１６）アイイーピー ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
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