ヒートショック応答調節因子のスクリーニング方法
細胞を１つ以上のストレスに晒し、続いて細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）発現の調節を定量的に測定する、高効率の方法が提供される。細胞を、化合物又は組成物等の薬剤で処理し、該細胞をストレスに晒し、続いて該薬剤の存在下又は非存在下におけるストレスに対する細胞の応答を測定することによる、細胞内のＨＳＰ又はＨＳＦ発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する、高効率の方法も提供される。本発明に係る高効率の方法の実施に有用な装置、及びそのような方法を使用して同定された調節因子も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月３日に出願された米国仮特許出願６１／１３０，９４５、及び２００８年１０月１日に出願された米国仮特許出願６１／１９４，９８４号の利益を主張し、それらの明細書の全内容を、本明細書中に参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）は、様々な生理的及び環境的刺激に対してホメオスタシス及び生存を維持するのに必須の細胞内タンパク質である。Ｖｏｅｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ， ５９４：８９−９９ （２００７）を参照されたい。この多重遺伝子スーパーファミリーのメンバーは、それらの分子サイズ及び関連する機能で表され、例えば、ＨＳＰｌ１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、及び小ヒートショックタンパク質等が挙げられる。ＨＳＰは、ミスフォールディングしたタンパク質の立体構造及び細胞機能の復活を支援し、又はダメージを受けたタンパク質をプロテオソーム誘導性の分解を導く、分子シャペロンとして機能する。例えばＨｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２：３４９−３８４ （１９９３）； Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． Ｎｅｐｈｒｏｌ， ２：１４９−１５６ （２００６）を参照されたい。ＨＳＰ発現は、ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）、特にＨＳＦ１により、迅速に誘導される。ＨＳＦは、制御される遺伝子のヒートショックエレメント（ＳＨＥ）配列への結合を通じて、ＨＳＰ遺伝子の転写を活性化する、プロトタイプの制御因子である。Ｐｉｒｋｋａｌａ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １５： １１１８− １１３１ （２００１）を参照されたい。ヒートショック応答に関与する経路の活性化は、ストレスに関連するタンパク質のミスフォールディング等、細胞ストレスに対するありふれた細胞応答であるから、細胞のヒートショック応答を調節することが出来る小分子は、例えば、幾つかの側面において、癌、虚血、創傷治癒及び神経変性疾患等の、細胞のヒートショック応答の活性化又は抑制に関与する、広範囲の臨床的適応の処置及び予防のための治療ツール等として使用されるものとして、大いに注目されている。近年、ＨＳＦ１及びＨＳＰを調節する多くの化合物が発見され、それらの幾つかは臨床試験に付されている。例えばＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５８１ ：３７５８−３７６９ （２００７）を参照されたい。
【０００３】
ＨＳＦ１は、直接的及び間接的メカニズムにより、正負両方向に細胞ストレス応答経路に関与する遺伝子を制御する。ＨＳＦ１の両方向の活性は、部分的には、ＨＳＦ１モノマーと比べて異なるＤＮＡ及びタンパク質因子に対する結合親和性等を有するマルチマーを形成するその能力に起因する。正常な成長条件の下で、ＨＳＦ１は、相対的に不活性であるモノマー形態で、細胞の細胞質及び核中に存在することが示されていた。ストレス刺激を受けた細胞（例えばヒートショック、重金属又はアミノ酸類似体に晒された細胞）において、ＨＳＦ１は、ＤＮＡ結合能力が向上し、及びタンパク質相互作用プロフィールが変化する、トリマーを形成する。該活性は、特定の部位の誘導性リン酸化により、更に亢進する。ＨＳＦ１は、ＨＳＰ７０のｍＲＮＡ転写の上方制御を調整するだけでなく、核孔のＴＰＲタンパク質と相互作用することにより、ストレス誘導性のＨＳＰ７０のｍＲＮＡの輸送も促進する。Ｓｋａｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８２（４７）：３３９０２−３３９０７ （２００７）を参照されたい。
【０００４】
興味深いことに、ＨＳＦ１は、ストレスを受けた細胞の核の中で、広く分散したパターンから、分離したＨＳＦ１を含む顆粒に再分布する。これらのストレス顆粒は、大きく、不定形で、そして主として、サテライトＩＩＩ反復配列と、ＤＮＡ−タンパク質間の直接相互作用を介して固定される。Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １５６（５）；７７５−７８１ （２００２）； Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １６４（ｌ）：２５−３３ （２００４）を参照されたい。
【０００５】
ＨＳＰ７０タンパク質は、分子シャペロンの最も重要なファミリーの１つである。このファミリーは、高度に相同で、重複配列を有し、異なる機能を有する、８つのシャペロンタンパク質を含む。Ｄａｕｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５８１（１９）：３７０２−３７１０ （２００７）を参照されたい。ＨＳＰ７０の主な機能は、ストレス誘導性のタンパク質のミスフォールディング又は分解に対する細胞保護機能を提供することである。加えて、構成的に発現したＨＳＰ７０タンパク質も、非ストレス細胞において、重要なハウスキーピング機能を有する。ヒートショックに続いて、ＨＳＰ７０の発現が顕著に増大し、そして多くの新たに合成されたＨＳＰタンパク質が、細胞質から細胞の核の中に急速に移動する。ＧＦＰと融合させたＨＳＰ７０を使用して、Ｚｅｎｇらは、細胞ストレスに応答して、核内のＧＦＰ−ＨＳＰ７０レベルが顕著に増大し、それらが核小体中に高度に濃縮して、ＨＳＰ７０顆粒を形成することを報告した。Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １１７（２１）：４９９１−５０００ （２００４）を参照されたい。また、ＨＳＰの発現のバランスに対する負のフィードバックループも存在する。マルチシャペロン複合体中のＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０タンパク質は、ＨＳＦ１と相互作用して、その活性を抑制する。ストレス誘導性のミスフォールディングタンパク質は、該相互作用を妨げ、そしてＨＳＦ１が開放され、転写活性化に至る。
【０００６】
ヒートショック応答におけるＨＳＦ１／ＨＳＰを標的とする治療的に活性な小分子のスクリーニングに、多大な労力が払われている。直接的なＨＳＦ１活性化（セラストロール（ｃｅｌａｓｔｒｏｌ））、ＨＳＰ９０阻害（ラジシコール（ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）、１７−ＡＡＧ）、炎症仲介（アラキドン酸、四環系酸Ａ（ｔｅｒｒａｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ））、プロテオソーム阻害（ＭＧ−１３２）、ヒートショック応答阻害（ＫＮＫ４３７、ケルセチン）、及びＨＳＦ１／ＨＳＰ７０共誘導（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（アリモクロモル、ビモクロモル）を通じての、ＨＳＦ１調節因子として、多くの化合物が同定されている。Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８０（３９）：３３９０７−３３１００ （２００５）を参照されたい。近年、標的治療学において、２つの主要なスキームが浮上している。１つは、ＨＳＰ９０を阻害するものであり、これにより、抗癌治療への道が開けた。即ち、ＨＳＰ９０は、悪性形質転換に関与する幾つかの重要なキナーゼを安定化する。Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ， ３：３４９−３５８ （２００３）を参照されたい。幾つかのＨＳＰ９０阻害剤が臨床試験に付されており、一例として、１７−ＡＡＧは、管理可能な毒性の範囲内で、明確な抗癌活性を示している。もう１つは、小分子を通じて、ＨＳＰ、特にＨＳＰ７０を上方制御するものであり、これにより、ミスフォールディングしたタンパク質が蓄積して、望ましくない症状に関与する、疾患、症状及び障害における、多大な治療的価値が示された。重要なことに、このカテゴリーの幾つかの化合物、例えばアリモクロモルは、正常細胞中のＨＳＰ７０及び他のシャペロンタンパク質に誘導的な作用を有さず、ストレス細胞のシャペロン誘導の亢進を活性化する（いわゆる「共誘導（ｃｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）又は「増幅」）。他の共誘導性（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）化合物も、恐らく有効な治療剤であり、正常細胞及びストレス細胞のＨＳＰ７０を活性化する薬剤よりも副作用が少ないと考えられる。Ｓｏｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １４６（６）：７６９−７８０ （２００５）を参照されたい。
【０００７】
上記を考慮して、標的を定めたシャペロン療法において診断的に又は治療的に使用される、細胞ストレス応答経路中のＨＳＦ１／ＨＳＰ活性を制御（誘導、共誘導、増幅、抑制又は減衰）させる小分子等の薬剤を同定するアッセイの開発は、有益であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一つの側面において、本発明は、細胞をストレス処理し、そして細胞のストレス応答を、細胞ストレスに応じて生じるＨＳＦ顆粒（例えばＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ３又はＨＳＦ４顆粒）形成、及びそれらの顆粒の正常に関する様々な変数、及び特に１つ以上の変数の組み合わせにより測定することにより、細胞内のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）発現の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）を定量的に測定する、高効率の方法を提供する。幾つかの態様において、前記組み合わせは、２つ以上の変数からなる。ＨＳＦ顆粒、例えばＨＳＦ１顆粒等に関連する、細胞のストレス応答に対応する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント、核発色強度（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）（ＣＶ）、顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率の１つ以上、場合によっては２つ以上から選択される場合もある。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度の変動係数（ＣＶ）、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【０００９】
他の側面において、本発明は、細胞を候補剤（候補化合物又は候補組成物等）で処理し、細胞をストレスに晒し、そして該薬剤の存在下又は非存在下における細胞のストレス応答を測定することを含む、細胞内のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。細胞のストレス応答は、細胞ストレスにより生じる、顆粒形成、例えばＨＳＰ及び／又はＨＳＦ（例えばＨＳＦ１）顆粒形成、並びに／あるいは該顆粒の性状に関する、１つ以上の変数、及び特に２つ以上の変数を測定することにより測定され得る。細胞ストレス応答に対応するＨＳＰ又はＨＳＦ顆粒、例えばＨＳＦ１等に関連する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント；核発色強度の変動係数（ＣＶ）；顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度の変動係数（ＣＶ）、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００１０】
更なる他の側面において、本発明は、細胞をストレス処理することによる、細胞内のＨＳＦ、例えばＨＳＦ１の転写活性を定量的に測定する高効率の方法、そして更に、上記方法を使用することによる、細胞内のＨＳＦ活性、例えばＨＳＦ１活性の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。活性化因子及び阻害因子の選択を最適化するための、細胞ストレスのレベルを調節する方法が提供される。本発明の高効率手法の信頼性及び再現性に関連する、ＨＳＰ及び／またはＨＳＦ顆粒の変数、細胞の種類、ストレス及び他の変数の選択は、以下に詳細に検討される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、実施例１に記載のように、無処理の、又はヒートショック処理の前に、２μＭのセラストロールＤＭＳＯ溶液（Ａ及びＣ）又は０．３３％ＤＭＳＯ（Ｂ及びＤ）で前処理したＨｅＬａ細胞を４１℃で２時間ヒートショックしたときの、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０（Ａ及びＣ）の核内での顆粒形成を示す。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、実施例１に記載のように、無処理の、又はヒートショック処理の前に、２μＭのセラストロールＤＭＳＯ溶液（Ａ及びＣ）又は０．３３％ＤＭＳＯ（Ｂ及びＤ）で前処理したＨｅＬａ細胞を４１℃で２時間ヒートショックしたときの、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０（Ａ及びＣ）の核内での顆粒形成を示す。
【００１２】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜Ｄは、実施例１で得た顆粒カウント及び核発色強度ＣＶによる核ＨＳＦ１顆粒の定量（Ａ及びＢ）、並びに顆粒カウント及び顆粒合計面積（Ｃ及びＤ）による核ＨＳＰ７０顆粒の定量を示す。平均値の違いを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した。Ａｐ値＜０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ〜Ｄは、実施例１で得た顆粒カウント及び核発色強度ＣＶによる核ＨＳＦ１顆粒の定量（Ａ及びＢ）、並びに顆粒カウント及び顆粒合計面積（Ｃ及びＤ）による核ＨＳＰ７０顆粒の定量を示す。平均値の違いを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した。Ａｐ値＜０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【００１３】
【図３】図３は、陽性対照としてヒートショック１時間前に２μＭセラストロールで処理したサンプル、及び陰性対照として０．３３％ＤＭＳＯで処理したサンプルについて実施された、高密度スクリーニング（ＨＣＳ）顆粒アッセイの評価を示す。
【００１４】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、実施例１に記載の、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（ＨＣＳ法により同定された新規調節因子）における、ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ（Ａ）及びＨＳＰ７０顆粒面積（Ｂ）のＥＣ５０値を使用した用量依存的試験を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、実施例１に記載の、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（ＨＣＳ法により同定された新規調節因子）における、ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ（Ａ）及びＨＳＰ７０顆粒面積（Ｂ）のＥＣ５０値を使用した用量依存的試験を示す。
【００１５】
【図５】図５は、実施例１に記載の、１０μＭの化合物Ａ又は１μＭのセラストロール（陽性対照）を用いた、前処理後６時間の回復期間にかけてのＨＳＦ１誘導キネティクスの比較を示す。
【００１６】
【図６】図６は、２μＭセラストロール陽性対照（黒正方形）及びＤＭＳＯ陰性対照（白丸）のＨｅＬａ細胞に対して、３０分間個別に４８０種類の異なる試験化合物で３０分処理して、その後２時間４１℃のヒートショックを与えた実験のデータを示す。
【００１７】
【図７】図７は、実施例２に記載の、非酸素グルコース除去（ＯＧＤ）ストレス及びＯＧＤストレスの下で、化合物Ａの細胞保護効果を評価するために採用された、ＭＴＳ細胞死アッセイを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を０．３３％ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯ中の２．５μＭ化合物Ａで１時間処理し、そしてＯＧＤで２８時間置き、続いて直ちにＭＴＳアッセイを行った。データは、独立した３つの実験の平均として表現した。Ａｐ値０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【００１８】
【図８】図８は、実施例３に記載の、ロテノン誘導性ミトコンドリアストレスの下で、化合物Ａの細胞保護効果を評価するために採用された、ＭＴＳ細胞死アッセイを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＤＭＳＯ及び２．５μＭ化合物Ａで１時間処理し、そして１００ｎＭのロテノンで２４時間処理し、続いて直ちにＭＴＳアッセイを行った。データは、独立した３つの実験の平均として表現した。Ａｐ値０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【００１９】
【図９】図９は、温度を３９℃又は４１℃に上昇させることによりストレス処理し、回復期間を与えずに測定した細胞を比較した、ＨＳＦ１顆粒データを示す。
【００２０】
【図１０】図１０は、ＤＭＳＯで処理して、温度を４３℃に上昇させて１時間置き、回復時間を与えず、又は２時間の回復時間を与えた細胞の、ＨＳＰ７０の顆粒カウントにおいて観察されたＣＶ値が、２５％を上回ることを示す。これらのデータは、両条件におけるＨＳＦ１顆粒カウントの値が、陽性対照の値の望ましいものより近接しており、そして４３℃において、ＨＣＳアッセイ検出窓（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）が、４１℃の場合よりも顕著に小さくなることを示す。
【００２１】
【図１１】図１１は、４１℃に上昇させた温度に２時間晒し、回復時間を与えずに０．３３％ＤＭＳＯ処理した細胞の、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒カウントの評価を示す。
【００２２】
【図１２】図１２は、４１℃に上昇させた温度に２時間晒し、回復時間を与えずに０．３３％ＤＭＳＯ処理した細胞の、ＨＳＦ１のＣＶ核発色強度及びＨＳＰ７０顆粒面積の評価を示す。
【００２３】
【図１３】図１３は、実施例６に記載される、ツニカマイシン誘導ＥＲストレスモデルにおける様々な時点での化合物Ｂ（本願ＨＣＳ法により同定された新規調節因子）からの応答を図示する。
【００２４】
【図１４】図１４は、温度上昇ストレスに晒されていない（例えば３７℃３時間）細胞における、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（試験化合物）の濃度（μＭ）の増大に応じた、ＨＳＦ１顆粒カウントの評価を示す。このデータは、セラストロールの濃度が１．２５〜５．０μＭのとき、正常（ヒートショック無し）細胞のＨＳＦ１陽性顆粒の形成が顕著に刺激されるが、化合物Ａはそのようにならないことを示す。
【００２５】
【図１５】図１５は、実施例８に記載される、１０μＭラジシコール（対照）又は５０μＭの９つの試験された化合物の１つで処理された細胞における、ＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性の阻害パーセントを示す。これらの結果は、ＨＣＦアッセイにおいて正のヒットとして同定された化合物が、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を顕著に阻害しないことを図示している。
【００２６】
【図１６】図１６は、最初にＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイ、続いて細胞保護及び細胞毒性をそれぞれ同定するＭＧ−１３２及びＭＴＳアッセイを使用する、リード開発用化合物をスクリーニングする方策を提供する。
【００２７】
【図１７Ａ】図１７Ａは、Ｘ軸にＨＳＦ１顆粒陽性細胞、Ｙ軸にＭＧ−１３２アッセイにおける生存細胞、そしてＺ軸にＭＴＳアッセイにおける生存細胞の阻害を示すデータの集合（４，０００化合物）を表す。各球体のサイズ及び濃淡は、それぞれ、ＨＳＰ７０及びＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【００２８】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞における、２０％の閾値を設けたＨＳＦ１顆粒スクリーニングで得られたデータを表す（４，０００化合物）。正方形の濃淡は、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞に対応する。
【００２９】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞における、３０％の閾値を設けたＨＳＰ７０顆粒アッセイで得られたデータを表す。正方形の濃淡は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【００３０】
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、生存細胞の増大パーセント（ＤＭＳＯとの比較）において３０％の閾値を設けたＭＧ−１３２アッセイで得られたデータを図示する。正方形の濃淡は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【００３１】
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、ＭＧ−１３２アッセイ及びＭＴＳアッセイのデータの組み合わせを図示する。球体のサイズはＨＳＰ７０顆粒データに対応し、そして濃淡はＨＳＦ１顆粒データに対応する。
【００３２】
【図１８】図１８は、３８４ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、０．３３％ＤＭＳＯ（黒い菱形）及び２μＭセラストロール（黒い正方形）で前処理し、続いて４１℃で２時間ヒートショックを与え、回復時間無し（Ｒ０）で、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価した結果を示す。
【００３３】
【図１９】図１９は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ（対照）又はＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション対照）を４８時間トランスフェクションし、続いて４３℃で２時間ヒートショックを加えた、又はヒートショック処理しないＨｅＬａ細胞の、ウェスタンブロット及び柱状図を示す。
【００３４】
【図２０】図２０は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクションし、続いて２５μＭの化合物Ｂ（ＣＹＴ４９２）又はＤＭＳＯ対照で処理した後、４１℃で２時間ヒートショックした、又はしていないＨｅＬａ細胞における、顆粒形成を図示している。
【００３５】
【図２１】図２１は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル（標的無し）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の細胞カウントを示し、これは、細胞毒性作用が最小であることを示している。
【００３６】
【図２２Ａ】図２２Ａ〜Ｂは、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）を４８時間（Ａ）、及び７２時間（Ｂ）トランスフェクションしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のｓｉＲＮＡノックダウンを図示している。ウエスタンブロットは、タンパク質の発現レベルに対応している。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜Ｂは、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）を４８時間（Ａ）、及び７２時間（Ｂ）トランスフェクションしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のｓｉＲＮＡノックダウンを図示している。ウエスタンブロットは、タンパク質の発現レベルに対応している。
【００３７】
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ（対照）又はＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション対照）と比較しての、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡを用いて４８時間かけてＨＳＦ１をノックダウンした後の、ＨＳＰ７０タンパク質の発現を図示するウエスタンブロットを示す。
【００３８】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【００３９】
【図２４】図２４は、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭのトリプトリドで処理し、その後４３℃で１、２、３又は４時間ヒートショックしたＨｅＬａ細胞において、顆粒５個／核を閾値とする顆粒カウントを行い、ＨＳＦ１顆粒形成の阻害を図示したものである。
【００４０】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【００４１】
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【００４２】
【図２７】図２７は、３８４ウェル中で、０．３３％ＤＭＳＯ及びＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理し、続いて４３℃、２時間、回復時間無し（Ｒ０）のヒートショックを与えたＨｅＬａ細胞を、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
便宜のため、本明細書、実施例及び特許請求の範囲において採用される幾つかの用語を、本明細書中に集めて定義する。特に定義されていない限り、本明細書中で使用される技術的及び科学的用語は、当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００４４】
本明細書中で使用されるとき、「核発色強度の変動係数（ＣＶ）」という用語は、発色ラベル、例えば蛍光ラベルの検出が可能な装置を用いたイメージングにより測定した細胞の核内の顆粒の発色強度の相異を意味する。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒」という用語は、核内のＨＳＰ、ＨＳＦ又は他のＨＳＰ補因子の濃度が増大することを指し、ここで、該核内の濃度増大は、ＨＳＰ若しくは分子シャペロンの発現、又はＨＳＦ転写レベルの増大に関連する。好ましくは、これらの顆粒は、発色ラベル、例えば蛍光ラベルの検出が可能な装置を用いたイメージングにより検出される。該「顆粒」という用語は、当業者には、ＨＳＰ若しくは分子シャペロンの発現、又はＨＳＦ転写レベルの増大に関連する、「スポット」、「ドット」、「粒子（ｇｒａｉｎ）」としても知られる。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒カウント」という用語は、細胞サンプル中に検出される顆粒の数を指す。例を挙げると、顆粒カウントは、肉眼で顆粒数をカウントすることにより測定され得る。他の態様において、顆粒カウントは、イメージング装置及び付属するソフトウエアの感度設定及び解像能力により決定される。幾つかの態様において、ＨＳＰ又はＨＳＦの顆粒カウントは、平均で細胞あたり２〜３０個、例えば細胞あたり３〜１０個であってもよい。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒発色強度」は、発色ラベル、例えば蛍光ラベルの検出が可能な装置を用いたイメージングにより測定される、細胞の核内の顆粒の発色強度を指す。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒サイズ」という用語は、イメージング装置により測定される、「顆粒面積」、「顆粒半径」又は「顆粒体積」等、検出可能な顆粒のサイズを指す。典型的には、顆粒サイズは、イメージング装置及び付属するソフトウエアの感度設定及び解像能力により決定される。例を挙げると、顆粒は、半径が平均で約０．０１〜２０μｍ２、例えば約０．１〜１０μｍ２、例えば約０．２〜５ μｍ２である。例を挙げると、顆粒は、平均体積が、約０．０１〜１００μｍ３、例えば約０．１〜５０μｍ３、例えば約１〜２０μｍ３である。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、「最大ストレス応答」という用語は、最大レベルのストレスに対する細胞の応答を指す。最大レベルのストレスは、細胞のストレスに対する応答がそれ以上変化しなくなる適用されるストレスのレベルである。例えば、温度上昇をストレスとするとき（ヒートショック）、対応する最大ストレス応答は、「最大ヒートショック応答」であり、これは、細胞に「最大レベルのヒートショック」、即ちヒートショックに対する細胞応答がそれ以上変化しなくなる温度を加えたときの応答を指す。最大ストレス応答の他の例として、細胞のストレス応答を誘導する、最大の重金属、化学毒物、酸素の濃度等が挙げられる。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、「穏和なストレス」という用語は、前処理ストレス（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ）に関連する、最大ストレス応答を下回るストレス応答を提供する条件を指す。例えば、最大ヒートショック応答を誘導する温度を下回るが、なおも細胞にストレス応答を誘導する温度上昇は、「穏和なヒートショック」条件である。穏和なストレス応答の他の例として、細胞のストレス応答を誘導する、最大未満の重金属、化学毒物、酸素の濃度等が挙げられる。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、「調節」という用語は、本明細書中に記載の化合物又は組成物が、生物学的経路に、又は所定の生物学的巨大分子、例えばタンパク質、例えばＨＳＰ、ＨＳＦ、もしくは核酸エレメント、例えばＨＳＥ等の活性又は機能に、変化を生じさせる作用を指す。幾つかの態様において、調節には、例えば、生物学的経路の阻害若しくはアンタゴナイズ（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ）、又は生物学的巨大分子の活性の阻害、中和、若しくは減衰等が挙げられる。他の態様において、調節として、生物学的経路の促進若しくはアゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）、又は生物学的巨大分子の活性の増大が挙げられる。例えば、幾つかの態様において、調節は、生物学的経路又は転写因子、例えばＨＳＦ等の転写活性に変化をもたらすことを含む。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、「小分子」という用語は、分子量が約２５００ａｍｕ（原子量単位）未満、好ましくは約２０００ａｍｕ未満、なおもより好ましくは約１５００ａｍｕ未満、更により好ましくは約１０００ａｍｕ未満、又は最も好ましくは約７５０ａｍｕの有機的化合物を指す。そのような分子は、典型的には、２つ以上の炭素及び水素原子からな、そして１つ以上の酸素及び窒素が存在する。また、そのような分子は、１つ以上の硫黄、リン及びハロゲン（フッ素、塩素及び臭素）を含むが、他の公知の原子が採用される場合もある。本方法に使用されるのに適した小分子は、合成のものであっても、又は天然に存在するものであってもよく、様々な化学物質ライブラリーから商業的に入手出来る。例えば、本方法に使用される小分子として、ヒドロキシルアミン化合物が挙げられる。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、「ストレス」という用語は、細胞の「ストレス応答」を誘導し得る、細胞に影響する条件又は因子と当業者が理解する、生理的ストレスを指す。ストレスを誘導するものの例として、温度上昇、金属、化学毒物、酸素供給及び酸素欠乏等が挙げられる。
【００５４】
本明細書中で使用されるとき、「ストレス応答」という用語は、細胞における、ストレスへの曝露に応答した、ＨＳＰ発現及び／又はＨＳＦ転写の増大を指す。例えば、温度上昇ストレスに対する応答は、ヒートショック応答である。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、「亜致命（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ）ストレス」という用語は、細胞の死滅を引き起こさない細胞のストレス応答を誘導するストレスに対する応答を指す。
【００５６】
本明細書中で使用されるとき、「亜最大（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）ストレス応答」は、前記最大ストレスレベルにより引き起こされる応答を下回るが、前記前処理ストレスにより引き起こされる応答を上回るストレス応答を指す。例えば、最大ヒートショックを誘導する温度により引き起こされるヒートショック応答を下回るが、前処理ストレスを誘導する温度の応答を上回るヒートショック応答は、亜最大ストレス応答である。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「処置」という用語は、対象の臨床的状態における改善を指し、治癒が達成されることを意図しない。
【００５８】
本明細書中に示される特許文献及び非特許文献は、それらの全てが参照により援用される。
【００５９】
態様
ＨＳＰ又はＨＳＦ発現の高効率の定量方法
ヒートショック誘導性のストレス顆粒の形成は公知であり、ヒートショック応答に関連していることが示されている。Ｃｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照されたい。また、Ｚａａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６６（３）： １７８３− １７９１ （２００６）を参照されたい。しかしながら、今日までに、高効率のフォーマットでＨＳＦ１／ＨＳＰの活性化を直接測定し得るアッセイは存在していなかった。ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の両方がヒートショック後にストレス顆粒を形成するという事実から、それらを正確かつ良好な再現性で定量する方法が開発出来れば、細胞ストレス活性化を定量する有用な細胞マーカーとなり得ることが予想される。この要求に取り組むために、本発明は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ活性に関連する細胞内でのストレス顆粒を正確に定量出来る、イメージベースの高密度スクリーニング（ＨＣＳ）を提供する。ＨＣＳの多パラメーター的性質（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｎａｔｕｒｅ）は、合理的な効率で複雑な細胞ネットワーク及び生物学的メカニズムを解析するのに特に有用である。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ２５−４２， （２００８）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ， １３（１０）：９５３−９ （２００８）を参照されたい。本明細書中で、ストレスで活性されたＨＳＦ１等のＨＳＦ及び／又はＨＳＰ７０等のＨＳＰを定量するために、顆粒形成のパラメーターの内、顆粒カウント、合計顆粒面積、顆粒発色強度、顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率、及び核発色強度が選択された。
【００６０】
よって、幾つかの態様において、本発明は、細胞をストレスに晒し、そして細胞のストレスに応じて起こるＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒形成（例えばＨＳＦ１顆粒形成）及び該顆粒の性状に関する１つ以上の変数、又は２つ以上の変数の組み合わせにより細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のＨＳＰ発現の調節を定量的に測定する高効率の方法を提供する。細胞ストレス応答に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒（例えばＨＳＦ１顆粒）に関する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント、核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率、の１つ以上から、そして好ましくは２つ以上から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００６１】
更なる他の側面において、本発明は、細胞をストレスに晒し、そして細胞のストレスに応じて起こるＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒形成（例えばＨＳＦ１顆粒形成）及び該顆粒の性状に関する１つ以上の変数、又は２つ以上の変数の組み合わせにより細胞のストレス応答を測定することによる、ＨＳＦ、例えばＨＳＦ１の転写活性を定量的に測定する高効率の方法を提供する。細胞ストレス応答に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒に関する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント、核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率、の１つ以上から、そして好ましくは２つ以上から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００６２】
ＨＳＰ発現の調節因子を同定する方法
他の側面において、本発明は、細胞を調節因子と推定される薬剤（即ち候補剤）、例えば候補化合物又は有効成分を含む候補組成物で処理し；処理細胞及び非処理対照細胞をストレスに晒し；そして該推定調節因子が継続的に存在する場合、又はある時点で除去した場合における細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のＨＳＰの発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。加えて、他の側面において、本発明は、細胞を調節因子と推定される薬剤（即ち候補剤）、例えば候補化合物又は有効成分を含む候補組成物で処理し；処理細胞及び非処理対照細胞をストレスに晒し；そして該推定調節因子が継続的に存在する場合、又はある時点で除去した場合における細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のＨＳＦ、例えばＨＳＦ１の発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。細胞のストレス応答は、細胞ストレスにより生じる、ＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒（例えばＨＳＦ１顆粒）形成、並びに該顆粒の性状に関する、１つ以上の変数、及び特に２つ以上の変数の組み合わせを測定することにより測定され得る。細胞ストレス応答に対応するＨＳＰ又はＨＳＦ顆粒に関連する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント；核発色強度のＣＶ；顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００６３】
幾つかの態様において、ＨＳＰ発現の推定調節因子は、ポリペプチド配列から構成され、又はこれを含む。他の態様において、該薬剤は、小分子から構成され、又はこれを含む。なおも他の態様において、該薬剤は、核酸部分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組み合わせ等から構成され、又はこれを含む。ある態様において、前記核酸部分は、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはＲＮＡ干渉を誘導する、若しくはｍＲＮＡ等のＲＮＡの転写、プロセシング又は翻訳を制御する他の小核酸分子等の阻害的ＲＮＡであり、又はこれを生産する。
【００６４】
幾つかの態様において、推定調節因子は、細胞をストレスに晒す前の時点で、細胞に投与される。適切な投与期間は、試験される薬剤（細胞応答に作用する速度も考慮される）；試験される細胞の有糸分裂又は他の細胞増殖状態等に依存して、当業者により選択され得る。前処理段階で作用する、又はより良好に作用する、ヒートショック応答等のストレス応答の調節因子は、本発明の予防的治療方法において有用であり得る。細胞は、選択されたストレスに晒される前に、例えば数日乾、数時間、数分間又は数秒間（及びそれ以下）、推定調節因子で前処理される場合がある。推定調節因子は、任意で、ストレス後、及びストレス応答の誘導後、様々な時点で、細胞から除去されてもよい。
【００６５】
本発明の高密度スクリーニング（ＨＣＳ）顆粒アッセイは、前記高効率手法において使用される変数の迅速な定量を、好ましくは自動的に、可能とする。故に、ある態様において、前記ＨＣＳは自動化され、そして合理的かつ迅速な高効率での、大量の化合物のスクリーニングを可能とする。幾つかの態様において、前記ＨＣＳは、１日に約２，０００〜１０，０００種類の化合物のスクリーニングを可能とする。幾つかの態様において、前記ＨＣＳ顆粒アッセイは、高度なイメージングソフトウェアを使用して、複雑なイメージの断片化及び高速でのデータ処理を顕著に改善する。本明細書に例示される態様の一つは、「マスターシャペロン制御因子アッセイ（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ａｓｓａｙ）」あるいは「ＭａＣＲＡ」と称される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ， １３（１０）：９５３−９ （２００８）を参照されたい）。ＭａＣＲＡは、細胞イメージベースのスクリーニングツールで、大量の小分子化合物を迅速かつ定量的にスクリーニングすることで、ＨＳＦ１の活性を調節する潜在的な薬剤候補を同定する。ＨＳＦ１の調節因子は、疾患細胞中に存在する毒性のミスフォールディングしたタンパク質を修復又は分解する分子シャペロンタンパク質のグループ全体をコントロールすることが予想される。幾つかの他の種類のＨＳＦ１調節因子は、癌又は腫瘍細胞のアポトーシス、細胞毒性及び増殖制御に影響をもたらすことが予想される。本明細書中に例示するように、これまでにＭａＣＲＡスクリーニングで同定された化合物の一部を評価したところ、それらは、疾患の細胞培養モデルの細胞保護能力を示した。
【００６６】
本願の方法におけるイメージングソフトウェアの一例として、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＴＡ）モジュールが挙げられ、これは、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度及び核発色強度のＣＶを包括的に記録する、細胞内の顆粒の高速での測定を提供する。他のイメージングシステム及びソフトウェアを、本発明のアッセイ及び方法において使用する場合もある。幾つかの態様において、該イメージングシステム及びソフトウェアは、所定のアッセイにおけるアッセイの条件及び試験された個々の化合物の結果の情報を保存し、該情報は、他の試験化合物との比較情報（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用され得る巨大なデータセットを集積するデータベースに格納される。そして、化合物は、１つのアッセイ又は複数のアッセイの組み合わせにおける成績に従ってタイプ及びサブタイプごとに分類され得て、そのような分類は、後で、構造と機能の関係性の理解に、及び予測的化学及び生物学等に使用される。
【００６７】
幾つかの態様において、本方法、例えばＨＣＳ顆粒アッセイ等は、異なる細胞の１つ以上の異なるストレス条件に対する応答をスクリーニングするのに使用される場合が在る。本発明のいずれかの方法に使用されるストレスは、限定されないが、温度上昇（ヒートショック等）、重金属ストレス（カドミウム等）、化学毒物又は小分子によるストレス（アゼチジン等のアミノ酸類似体、抗炎症薬物、又はアラキドン酸及びその誘導体等）、酸化ストレス、酸素グルコース除去（ＯＧＤ）、及び酸素除去（ＯＤ）から選択されてもよい。幾つかの態様において、前記細胞は、温度上昇ストレスに晒される。他の態様において、前記細胞は、ＯＧＤストレスに晒される。幾つかの態様において、前記細胞は、小胞体（ＥＲ）ストレスに晒される。
【００６８】
化学毒物により引き起こされるストレスにおいて、毒物は、タンパク質合成阻害剤、プロテオソーム阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、ＨＳＰ阻害剤（例えばＨＳＰ９０阻害剤）、炎症誘導剤、トリテルペノイド、ＮＳＡＩＤ、ヒドロキシルアミン誘導体、フラボノイド、及び細胞の呼吸又は代謝の他の阻害剤から選択され得る。幾つかの態様において、前記化学毒物はロテノンである。
【００６９】
適切なタンパク質合成阻害剤として、限定されないが、ピューロマイシン及びアゼチジンが挙げられる。
【００７０】
適切なプロテオソーム阻害剤として、限定されないが、ＭＧ１３２及びラクタシスチンが挙げられる。
【００７１】
適切なセリンプロテアーゼ阻害剤として、限定されないが、ＤＣＩＣ、ＴＰＣＫ及びＴＬＣＫが挙げられる。
【００７２】
適切な炎症誘導剤として、限定されないが、シクロペンテノンプロスタグランジン、アラキドン酸塩及びホスホリパーゼＡ２が挙げられる。
【００７３】
適切なトリテルペノイドとして、限定されないが、セラストロールが挙げられる。
【００７４】
適切なＮＳＡＩＤＳとして、限定されないが、サリチル酸ナトリウム及びインドメタシンが挙げられる。
【００７５】
適切なヒドロキシアミン誘導体として、限定されないが、ビモクロモル、アリモクロモル、及びイロキサナジンが挙げられる。
【００７６】
適切なフラボノイドとして、限定されないが、ケルセチンが挙げられる。
【００７７】
適切な他の阻害剤として、限定されないが、ベンジリデンラクタム化合物、例えばＫＮＫ４３７、並びにＨＳＰ９０阻害剤、例えばラジシコール、ゲルダナマイシン及び１７−ＡＡｇが挙げられる。
【００７８】
幾つかの態様において、細胞ストレスは、温度上昇ストレス（例えば室温を上回る温度）であり、細胞を培養する温度を４７℃未満、例えば４５℃、４３℃又は４２℃未満まで上昇させることを含む。例えば、温度上昇ストレスは、細胞を、約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、又は３９℃から、４２℃、４３℃、又は４５℃直下若しくは未満まで、又は約４２℃、４３℃、又は４５℃以下の温度で培養することを含んでもよい。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約３９℃から、約４３℃若しくは未満までの温度で、例えば約３９℃、４０℃、４１℃、又は４２℃から、約４３℃若しくは未満までの温度で培養することを含む。幾つかの態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約３９℃から、約４２℃若しくは未満までの温度で、例えば約３９℃、４０℃、又は４１℃から、約４２℃若しくは未満までの温度で培養することを含む。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４１℃以下の温度で培養することを含む。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４１℃以下の温度、例えば４１℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４１℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。更なる態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４３℃以下の温度で培養することを含む。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４３℃以下の温度で、例えば４３℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４３℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。
【００７９】
幾つかの態様において、前記方法は、ＨＳＰ発現及びＨＳＦ発現の活性化因子を同定する高効率の方法である。その幾つかの例において、前記細胞ストレスは温度上昇ストレスであり、細胞を、約４１℃以下の温度、例えば４１℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４１℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。その特定の一例において、前記方法は、ＨＳＦ発現、例えばＨＳＦ１発現の活性化因子、及び／又はＨＳＰ発現、例えばＨＳＰ７０発現の活性化因子を同定する高効率の方法であり、該細胞は、約４１℃以下の温度で、又は約４１℃±０．５℃で培養される。
【００８０】
幾つかの態様において、前記方法は、ＨＳＰ発現又はＨＳＦ発現の阻害因子を同定する高効率の方法である。その幾つかの例において、前記細胞ストレスは温度上昇ストレスであり、細胞を、約４３℃以下の温度、例えば４３℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４３℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。その特定の一例において、前記方法は、ＨＳＦ発現、例えばＨＳＦ１発現の阻害因子、及び／又はＨＳＰ発現、例えばＨＳＰ７０発現の阻害因子を同定する高効率の方法であり、該細胞は、約４３℃以下の温度で、又は約４３℃±０．５℃で培養される。
【００８１】
幾つかの例において、本発明の方法のいずれかにより誘導されるヒートショックは、穏和なヒートショックであってもよい。幾つかの態様において、細胞は、前処理、亜致命ストレスで処理される。この細胞の前処理は、細胞に、致命ストレスに対する良好な耐性／適応性を付与する。該前処理ストレスは、亜最大ヒートショック応答に達する程度の強さであってもよい。
【００８２】
幾つかの態様において、温度上昇ストレスの工程は、伝導性の金属、例えばアルミニウム製の、サーモスタットでコントロールするヒートプレートを使用して達成される。このアルミニウムプレートは、実験に使用される適切な器具に適合するように特注される場合があり、そして、適切な温度を維持するように加熱され得る。このアルミニウムプレートは、公知の加熱方法と比較して、良好な熱伝導をもたらすことが出来る。当業者であれば、複数の細胞サンプルの温度を正確にコントロールし得るプレート系を構築するのに、他の金属、固体若しくは半固体材料、又は保温性の液体を使用してもよいと容易に認めるであろう。そのような材料は、本明細書中に記載のアルミニウムプレートの代わりとなる場合もある。
【００８３】
上記のように、本方法において測定される変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド強度に対する比率から選択される任意の組み合わせであってもよい。幾つかの態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒カウントである。他の態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒面積である。他の態様において、前記変数の組み合わせは、顆粒カウント及び顆粒面積である。他の態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度である。他の態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度のバックグラウンド強度に対する比率である。なおも他の態様において、前記変数の組み合わせは、顆粒カウント及び顆粒発色強度のバックグラウンド強度に対する比率である。幾つかの態様において、前記イメージングされた顆粒は、ＨＳＰ顆粒である。他の態様において前記イメージングされた顆粒は、ＨＳＦ１顆粒等のＨＳＦ顆粒であってもよい。なおも他の態様において、前記イメージングされた顆粒は、ＨＳＰ及びＨＳＦ１顆粒であってもよい。幾つかの例において、所定の顆粒は均一であり、例えば実質的にＨＳＰ又はＨＳＦのいずれかのみから構成される。他の例において、所定の顆粒は負均一であり、例えばＨＳＰ及びＨＳＦの両方、並びに／又は追加的な核成分から構成される。
【００８４】
本発明の高効率の方法は、任意のＨＳＰの発現の調節を測定するのに使用されてもよい。本発明に適したＨＳＰの幾つかの具体例として、限定されないが、ＨＳＰｌ０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１０４及びＨＳＰｌ１０が挙げられる。幾つかの好ましい態様において、本方法に使用されるヒートショックタンパク質は、ＨＳＰ７０である。
【００８５】
本発明の高効率の方法は、癌細胞、神経細胞、又は神経癌細胞等の、様々な異なる種類の細胞を、スクリーニングに利用する場合がある。本高効率の方法に使用される細胞は、不動化細胞、初代細胞（例えば線維芽細胞及び上皮細胞等）、及び／又は形質転換細胞、例えばヒト形質転換細胞株由来のものであってもよい。適切な例として、限定されないが、ＨＯＳ（高二倍体骨肉腫（ｈｙｐｅｒｄｉｐｌｏｉｄ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）細胞株）及びＡ４３１（高四倍体表皮癌細胞株）が挙げられる。
【００８６】
幾つかの態様において、前記神経細胞株は、限定されないが、ＡＣＮ、ＢＥ（２）−Ｃ、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＣＨＰ−２１２、ＣＨＰ−１２６、ＧＩ−ＣＡ−Ｎ、ＧＩ−ＬＩ−Ｎ、ＧＩ−ＭＥ−Ｎ、ＩＭＲ−３２、ＩＭＲ−５、ＫＥＬＬＹ、ＬＡＮ−Ｉ、ＬＡＮ−１８８、ＬＡＮ−５、ＭＨＨ−ＮＢ−Ｉｌ、ＮＢ−１００、ＮＧＭ９６、ＮＧＰ９６、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＩＭＡ、ＳＪ−Ｎ−ＫＰ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−Ｆｌ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、又はＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株から選択される。幾つかの態様において、前記神経細胞株は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株である。
【００８７】
幾つかの態様において、本方法のいずれかに使用される癌細胞株は、限定されないが、癌腫細胞、肉腫細胞、食道癌細胞等から選択される。適切な癌細胞の非限定的な例として、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＤＬＤ−Ｉ、ＤＵ−１４５、Ｈ１２９９、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、Ｋ−５６２、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＯＶＣＡＲ−３、Ｐａｃａ−２、ＰＡＮＣ−Ｉ、ＰＣ−３、Ｓａｏｓ−２、ＳＦ−２６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＷ−４８０、ＳＷ−６２０、ＷＭ−２６６−４、ＨＬ−６０、ＴＥ−２、又はＫ−５６２細胞株が挙げられる。幾つかの態様において、該癌細胞株は、ＨｅＬａ細胞株である。
【００８８】
幾つかの態様において、前記ＨＣＳは自動化され、そして合理的かつ迅速な高効率での、大量の化合物のスクリーニングを可能とする。幾つかの態様において、前記ＨＣＳは、高度なイメージングソフトウェアを使用して、複雑なイメージの断片化及び高速でのデータ処理を顕著に改善する。幾つかの態様において、前記ＨＣＳは、異なる複数のストレス条件をスクリーニングするのに使用され得る。幾つかの態様において、前記異なる複数のストレス条件は、温度、ＯＧＤ、ロテノン、及びＥＲ誘導性ストレス、あるいは他の本明細書に記載のものから選択される。
【００８９】
幾つかの態様において、上記の調節因子同定方法は、更に、１つ以上の公知の第二のアッセイと組み合わされることにより、細胞保護等のより好ましい性質を有する調節因子を提供することが出来る。幾つかの態様において、第二のアッセイは、ＭＧ−１３２アッセイ、又はこれと類似のデータ、例えば細胞保護効果についてのデータを提供する他の多くのアッセイのいずれかである。例えば、Ｓｕｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２００６ ２７ （５）： ８０７； Ｊｕｌｌｉｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ２００６ １１ （４）： ６２７； ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔａ ＥＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４ ３０４： １１５８を参照されたい。
【００９０】
幾つかの態様において、前記第二のアッセイは、ＭＴＳアッセイ、又はこれと類似のデータ、例えば細胞毒性効果についてのデータを提供する他の多くのアッセイのいずれかである。幾つかの態様において、上記調節因子同定方法は、ＭＧ−１３２アッセイ及びＭＴＳアッセイの両方と組み合わせることが出来る。
【００９１】
細胞のベースラインストレスのレベルの調節
幾つかの態様において、前記口腔率の方法における測定工程は、選択された種類のストレスで処理した細胞内のＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現のレベルを測定し、これを該ストレスに晒されていない細胞のＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現のベースラインレベルと比較することにより、ストレス処理に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現の変化を定量的に測定することを含む、幾つかの態様において、ストレス処理に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現は、発現のベースラインレベルを上回るＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現の増大である。他の態様において、ストレス処理に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現は、発現のベースラインレベルを下回るＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現の減少である。
【００９２】
故に、幾つかの態様において、推定調節因子で処理される細胞のＨＳＦ及び／又はＨＳＰ発現のベースラインレベルは、例えば公知のＨＳＦ及び／又はＨＳＰ調節因子（活性化因子又は阻害因子）で前処理すること等により、それ自体が外部から変化させられ、又は選択させられる。これは、いずれかの方向における相対的に小さな発現の変化が、本発明の方法に従って、推定される細胞ストレス応答調節因子による処理に応じて検出されるために行われる。このＨＳＦ及び／又はＨＳＰ発現のベースラインレベルを外部から変化させ、又は選択する工程は、任意で、試験される各細胞種又は各調節因子において、アッセイの感度、例えばシグナルのノイズ比の増大、及び結果的にアッセイの感度において、微調整が行われる。故に、本発明の幾つかの態様において、ＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現のベースラインは、いずれかの方向における発現の変化がより正確に、又はより迅速に検出されるために外部から変化させられ、アッセイの感度が増大させられる場合がある。
【００９３】
所定の細胞種に適用される軽度又は中程度のレベルの細胞ストレスを選択することにより、例えば、より高い（より低い）レベルの細胞ストレスにおいて試験された細胞に対して同一の工程を実施して一旦失敗した本発明の方法を使用して、上方又は下方調節因子の同定が可能となる場合がある。本発明のアッセイにおけるヒートショック応答の調節因子の同定に使用される細胞ストレスのベースラインレベルの調節は、１つ以上の選択されたストレスで処理された所定の細胞種の用量及び時間に対する応答曲線を作成し、ストレス処理の最適な時間及び用量を決定することにより、ＨＳＦ及び／又はＨＳＰ発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を選択する能力における増大した、又は最適な感度を達成することにより実現され得る。
【００９４】
装置
幾つかの態様において、本明細書中に記載のヒートショック方法の温度上昇は、プレート、例えばアルミニウムプレート等の金属プレート等を備えた加熱器具により実施され、そして維持される。該プレートは、実験に使用される適切な器具に適合するように特注される場合があり、そして、適切な温度を維持するように加熱され得る。該プレートは、ウォーターバス等の公知の加熱方法と比較して、良好な熱伝導をもたらすことが出来るため、その結果、細胞サンプルに安定的かつ正確なヒートショックを与えることが出来る。
【００９５】
故に、幾つかの例において、本発明は、複数の細胞サンプルにヒートショックを与える装置を含み、該装置は、プレート及び該プレートを温める熱源を備え、ここで該プレートは、該複数の細胞サンプルに均一に熱を伝導させるように配置されている。一つの態様において、前記プレートは金属プレートであり、例えば鉄、銅若しくはアルミニウムプレートであり、特にアルミニウムプレートであり、又は合金であり、例えば鉄、銅又はアルミニウムを含む合金である。他の例において、前記プレートは、ガラス又は他の非金属プレートである。ある態様において、前記プレートは、複数の細胞サンプル中の各細胞サンプルと直接接触する。前記プレートは、前記熱源から各サンプルへの均一な熱の伝導を促進し、ゆえに、該サンプルのそれぞれに均一なヒートショックを誘導する。例えば、前記プレートは、複数のサンプルを含むマルチウェルプレート（９６ウェルプレート又はそれ以上）と連結して使用される場合がある。幾つかの態様において、前記プレートは、前記プレートは、マルチウェルプレートと直接連結、例えば直接接触している場合がある。例えば、前記マルチウェルプレートは、前記プレートの上に載っている場合もある。
【００９６】
診断及び／又は治療のための処置方法に使用される調節因子
幾つかの態様において、本発明の高効率の方法により同定される調節因子は、細胞のストレス応答成分を有する生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候に関する診断方法に有用であり得る。該診断方法を実施するキット及び診断方法が提供される。
【００９７】
本発明において同定されたＨＳＦ及び／又はＨＳＰの調節因子（及び放射活性、蛍光、燐光、核酸、抗体、又はタンパク質ベースタグ等の異種部分を結合させた該調節因子の誘導体）は、細胞又は細胞集団の細胞のストレス状態を診断するのに有用なツールであり得る。加えて、本発明の調節因子をコードする核酸分子（又は本発明の調節因子をコードする他の核酸分子の核酸制御領域と結合し得る核酸分子）が、細胞内の制御因子を発現し、検出し、及び／又はその発現を制御するように設計され得る場合もある。本発明の核酸分子を含むベクター、及び核酸分子又はベクターを含む細胞も、提供される。
【００９８】
他の態様において、本発明の高効率の方法により同定される調節因子は、細胞のストレス応答成分を有する生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候を治療又は予防する方法に有用であり得る。他の態様において、前記口腔率の方法により同定される調節因子は、細胞のストレス応答成分を有する生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候を処置又は予防する医薬を製造するのに使用される。該疾患又は兆候は、ヒト又は非ヒト動物におけるものであってもよい。
【００９９】
幾つかの態様において、前記疾患、症状又は兆候は、心臓血管疾患、血管疾患、脳疾患、アレルギー疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、皮膚疾患、粘膜疾患、表皮疾患、又は尿細管（ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌｉ）の疾患等から選択される。
【０１００】
幾つかの態様において、前記心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、冠状動脈疾患、又は筋緊張亢進及び肺の筋緊張亢進により引き起こされる心臓血管疾患である。
【０１０１】
幾つかの態様において、前記脳疾患は、脳血管虚血、脳卒中、外傷性脳損傷、老年性認知症等の老年性神経変性疾患、ＡＩＤＳ認知症、アルコール性認知症、アルツハイマー症、パーキンソン症又はてんかんである。
【０１０２】
いくつかの態様において、前記皮膚又は粘膜疾患は、皮膚科学的疾患又は消化器系の潰瘍性疾患である。
【０１０３】
幾つかの他の態様において、特にＨＳＦ１／ＨＳＰ調節因子が阻害的である態様において、前記疾患、症状又は兆候は、全体的な、制御される及び／又は目標とされる細胞毒性、アポトーシス又は他の種類の細胞死に関与する。多くの癌、腫瘍、又は異常な増殖又は細胞分裂を呈する他の細胞若しくは細胞種、例えばウイルス感染等により正常な増殖コントロールを損なったもの等の処置が挙げられる。
【０１０４】
例証
本願明細書全体に記載されている請求項に係る発明は、以下の実施例を参照してより速やかに理解され得る。該実施例は、本願請求項に係る発明の幾つかの特徴及び態様を詳述することのみを目的として記載され、限定を意図するものではない。
【０１０５】
マスターシャペロン制御因子アッセイ（ＭａＣＲＡ）
マスターシャペロン制御因子アッセイあるいは「ＭａＣＲＡ」は、細胞内のストレス応答経路の調節因子、例えばＨＳＦ１及びＨＳＰ７０等を同定する、高密度かつ細胞イメージベースのアッセイとして開発された。該ＭａＣＲＡアッセイは、複数の各アッセイ（下記参照）におけるそれらの性能に基づいて、異なるクラスの細胞ストレス応答調節因子化合物を同定することが出来る、高効率のスクリーニング方法に発達している。ＭａＣＲＡアッセイの発達は、細胞内のショック応答経路の異なるパラメーターを認識する一連のアッセイ系がいかにして設計され得るかの一例として、下記に記載される。実施例１では、詳述するとおり、ＨＳＦ１活性化因子を同定するように設計された、スクリーニングにおける高密度かつイメージベースのＨＳＦ／ＨＳＰ顆粒アッセイ、及びＥＣ５０フォーマットの開発を説明する。
【０１０６】
ＨＣＳ顆粒アッセイのヒートショックスクリーニング条件の最適化
ＨＣＳの設定において、アッセイの陽性対照として、公知のＨＳＦ１活性化因子であるセラストロール（Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ＳＤ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００４； ２７９（５３）：５６０５３−６０）が使用された。とりわけ、セラストロールは、ストレス細胞と非ストレス細胞の両方においてＨＳＦ１活性を誘導出来る。故に、セラストロールは、ＨＳＦ１増幅因子として特定される化合物の本発明の定義には適合しない。
【０１０７】
ヒートショックベースのスクリーニングにおいて、２つの技術的問題を克服する必要がある。第一に、ヒートショックの温度及び時間を最適化しなければならない。様々なヒートショック温度及び回復時間が、公知文献中に報告されている（Ｃｏｔｔｏ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９７； １１０ （Ｐｔ ２３）：２９２５−３４；上記Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．）。温度をより高く（例えば４３℃超）すると、ＤＭＳＯ処理サンプルのバックグランドが著しく高くなり、化合物増幅効果のシグナル／ノイズ比率が小さくなる。最適化された条件は、実験的に、約４１℃２時間で回復時間無しが選択され、この条件の下で、充分窓（ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｗｉｎｄｏｗ）は、ＤＭＳＯ溶媒対照（図１Ｂ及びＤ）と比較して、２μＭセラストロール（図１Ａ及びＣ）により誘導されるＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒形成において観察された。
【０１０８】
第二に、一般に、９６ウェル又はそれ以上のウェルプレートフォーマットにおいてヒートショック実験が実施されるとき、各ウェルへの均等な熱の伝導を保証するのは困難である。ヒートショック実験に通常の空気加熱（インキュベーターから）を使用した場合、９６ウェルプレート全体のＨＳＦ１／ＨＳＰ７０の顆粒カウントで観察されるばらつきが大きかった（ＣＶ＞４０％）。高効率ヒートショック手法としては、４５℃のウォーターバスにプレートを浸漬させる方法が報告されているが、この方法は、イメージベースの高密度手法に適しない（Ｚａａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６； ６６（３）： １７８３−９１）。１つの解決策としては、急速熱伝導用の特注アルミニウムプレートを使用することであり、これにより、ＨＳＦ１顆粒カウントにおいて、比較的低いＣＶ（７．９４％）で９６ウェルプレートベースヒートショックを実施出来た。
【０１０９】
ＨＳＦ１／ＨＳＰストレス顆粒の定量及びアッセイの検証
次に、観察された顆粒状粒子の幾つかの画像パラメーターを定量した。Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＴＡ）モジュールにより、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度及び核発色強度ＣＶ（核中のピクセル強度のＣＶを測定する）等の核顆粒の高速測定が可能となる。図２Ａ〜Ｄに記載のように、核カウント及び核発色強度ＣＶは、ＨＳＦ１顆粒の定量に選択された（図２Ａ及び２Ｂ）が、顆粒カウント及び顆粒面積は、ＨＳＰ７０顆粒のシグナルの測定に適用された（図２Ｃ及び２Ｄ）。図２Ａのデータは、ヒートショック（４１℃２時間）により、２μＭのセラストロールに晒されたＨｅＬａ細胞の核１つあたり、（ＭＴＡによる定量では）平均で５．３４±０．７２個のＨＳＦ１ストレス顆粒が誘導されたことを示す。比較対照としたＤＭＳＯ処理細胞では、２．４６±０．２２個の顆粒が誘導されていた。バックグラウンドを相対的に低くするために、化合物処理により誘導されるＨＳＦ１顆粒カウントの閾値として、５を選択した。５つを超える顆粒を含むＨｅＬａ細胞を、「ＨＳＦ１顆粒陽性細胞」と定義した。ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ、ＨＳＰ７０顆粒カウント及びＨＳＰ７０顆粒面積の閾値も、ＤＭＳＯ処理サンプルの平均プラス２又はそれ以上の標準偏差に相当するゲート値（ｇａｔｉｎｇ ｖａｌｕｅ）が選択された。これらの結果は、セラストロール処理ＨｅＬａ細胞が、対照（ＤＭＳＯ）処理細胞と比較して、ＨＳＦ１及び／又はＨＳＦ１陽性顆粒の数（顆粒カウント；図２Ａ及びＣ）、核内のＨＳＦ１陽性顆粒の発色強度（図２Ｂ）、及びＨＳＰ７０陽性顆粒の合計面積（図２Ｄ）における、統計的に顕著な増大を示すものであり、このことから、以上の４つのパラメーターが、単独で、及び好ましくは様々な組み合わせで、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０シグナルの定量、並びに試験化合物又は条件によるそれらの調節の定量に利用出来ることが検証された。
【０１１０】
９６ウェルプレートフォーマットにおける高密度スクリーニング（ＨＣＳ）顆粒アッセイの性能を、陽性対照として２μＭのセラストロールで１時間処理し、その後ヒートショックを与えたサンプルと、陰性対照として０．３３％ＤＭＳＯで処理したサンプルを用いて、評価した。図３に示されるように、実験データは、ＨＳＦ１顆粒アッセイが、広いスクリーニング窓及びＺ’をもたらすことを示している。（Ｚ要素は、高効率素クリーニング（ＨＴＳ）アッセイの性能又は能力の尺度である。Ｚ要素解析は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ２００８； １３（６）：５３８−４３に記載のように実施された）。
【０１１１】
前記最初の高性能スクリーニングから幾つかの陽性のヒットを選択して、実施例１に更に記載されるように、ＨＳＦ１共誘導に対するそれらの用量依存性を試験した。一例として、図４Ａは、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（本ＨＣＳ方法により同定された新規調節因子）のＨＳＦ１発色強度ＣＶのＥＣ５０値を用いた、用量依存性の実験を示す。陽性対照であるセラストロールのＥＣ５０値は、１．３２μＭであった。この結果は、公知の、ＨＳＰ７０．１プロモーター−ルシフェラーゼレポーターをセラストロール活性化ヒートショック応答の特定に使用したときのＨｅＬａ細胞における３μＭのＥＣ５０値と、良好に符合する。Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９（５３）：５６０５３−５６０６０ （２００４）を参照されたい。同様に、図４Ｂは、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａにおける、ＨＳＰ顆粒面積のＥＣ５０値を用いた用量依存性の実験を示す。陽性対照であるセラストロールのＥＣ５０値は、０．６５μＭであった。化合物Ａ及び他のヒットは、セラストロール程強力ではないが、これらのヒットは、構造−活性ベースの研究において良好な出発点を示した。とりわけ、セラストロールと異なり、化合物Ａは、ヒートショックストレスで処理されていない正常細胞においてＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒の形成を刺激又は誘導しない。これは、該化合物（若しくは誘導体化号物）が、シャペロン増幅を仲介する候補薬剤であることを示唆する。
【０１１２】
ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導における化合物Ａ及びセラストロールの動力学を比較するために、実施例１に更に記載されるように、詳細なタイムコース試験（回復時間中６時間まで）を行った（図５も参照されたい）。本実験において使用される濃度は、セラストロール及び化合物Ａにおいてそれぞれ１μＭ及び１０μＭであり、これらは、各化合物のＥＣ５０値に近い。図５は、１０μＭの化合物Ａ又は１μＭのセラストロール（陽性対照）で前処理した後の６時間の回復期間（Ｒ１〜Ｒ６）にかけての、細胞におけるＨＳＦ１誘導の動力学の比較を示す。化合物Ａは、試験された殆どの時点で、セラストロールと類似の誘導挙動を呈した。いずれの化合物も、ヒートショック後６時間にかけてＨＳＦ１ストレス顆粒を活性化しており、これは、それらの化合物が、ＨＳＰを持続的に誘導するＨＳＦ１の活性構造を維持又は安定化している可能性があることを強力に示唆する。ＨＳＰ７０シグナルは、ヒートショック１時間後にピークを有し、そしてヒートショック後６時間まで、相対的に高いレベル（〜２５％陽性染色細胞）を維持していた。ヒートショック１時間後、約３０％〜４０％の細胞が、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ７０＋である。他の細胞は、ＨＳＦ１−ＨＳＰ７０＋（〜３０％）、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ−（〜３０％）及びＨＳＦｌ−ＨＳＰ−（〜１０％）である。ＨＳＰ７０シグナルは、ヒートショック後６時間は、相対的に高レベルである。ＨＳＰ７０が持続的に発現することによって、ミスフォールディングしたタンパク質の保護領域（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）が拡張する。図６は、４８０種類の異なる試験化合物（黒色の菱形）でそれぞれ３０分間処理して、その後４１℃２時間で回復時間無しのヒートショックにかけた、ＨｅＬａ細胞の実験データを示す。陽性対照として２μＭセラストロール（黒色の正方形）で、そして陰性対照としてＤＭＳＯ（黒色の丸）で処理して、対照処理を並行して実施した。多くの試験化合物（黒色の菱形）のＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大パーセント（％）は、２０％以上であった（増大マークの大半が２０％を下回るＤＭＳＯ処理細胞と比較されたい）。この実験は、この実験に使用されたアッセイ条件が、多数の試験化合物のセットから有用なＨＳＦ１調節化合物（ここでは活性化因子）を同定するのに充分な感度であったことを示し、及び、この方法がそのような調節化合物の高効率のスクリーニングに利用可能であることを裏付ける。
【０１１３】
次の問題は、生物学的に関連するモデル系における細胞保護効果をどのように試験するかであった。酸素グルコース除去（ＯＧＤ）は、虚血及び脳卒中のインビトロ系であり、ニューロンの損傷の研究に特に適している。ＯＧＤにより誘導される細胞毒性は、主に、タンパク質のミスフォールディング及び凝集により起こる。海馬ＣＡ１ニューロンにおけるＨＳＰ７０の過剰発現は、タンパク質の凝集を低下させ、ニューロンの生存を顕著に増大させる。Ｇｉｆｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ．， ２０７（Ｐａｒｔ １８）：３２１３−３２２０ （２００４）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．， ２６（７）：９３７− ９５０ （２００６）を参照されたい。ＯＧＤに加えて、パーキンソン症のロテノンモデルは、タンパク質凝集により誘導される細胞毒性の研究用の、他のインビトロ系である。ミトコンドリア阻害剤であるロテノンは、α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の発現を増大させ、やがて、Ｌｅｗｙ小体と類似の細胞質内容物を形成することが報告されている。Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅｌａｔ． Ｄｉｓｏｒｄ．， Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ５９−Ｓ６４ （２００３）を参照されたい。故に、ＨＣＳスクリーニングのヒットの細胞保護効果を評価するために、上記２つのインビトロ細胞アッセイ系のいずれかが利用され得る。以前に報告されたＭＴＳ比色分析アッセイは、様々なストレス処理後の生存細胞の測定のための第二の方法となる。
【０１１４】
前記ＯＧＤアッセイは、実施例２に記載されるように実施された。図７に示すように、２．５μＭの化合物Ａにより前処理した場合、生存ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の９１％の増大が観察され、これは、顕著な細胞保護効果を有していた。とりわけ、通常（ストレス無し）条件下では、化合物Ａで処理したものとＤＭＳＯで処理したものとの間で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率には殆ど差が観察されなかった。ロテノンモデルに関して、１００ｎＭのロテノンを２４時間適用したとき、４２％超のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が死滅した。２．５ｍＭの化合物Ａで前処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＤＭＳＯ対照処理細胞と比較して、細胞生存率が２９％増大した（図８）。
【０１１５】
ヒートショックの温度及び回復の時間等のアッセイのパラメーターを更に最適化する、一連の実験が実施された（実施例４）。ＨＳＦ１顆粒陽性細胞は、温度上昇３９℃（黒色の菱形）又は４１℃（黒色の正方形）２時間、回復時間無しでストレス処理した細胞において、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞を定量した（図９）。図９に示されるように、ヒートショックを４１℃、２時間、回復時間無しで実行した場合、ヒートショックが３９℃の場合と比較して、顕著な数の陽性ヒットが検出された。（１５％陽性細胞カットオフ以上の黒色の正方形のヒットを参照されたい）。図１０のデータは、ヒートショックが４３℃の４つの条件（１時間で回復時間無し、１時間で回復時間２時間、１２時間で回復時間無し、２時間で回復時間２時間）において、ＤＭＳＯ処理サンプル中のＨＳＰ７０顆粒が異なり、ＣＶ値は２５％超も異なり、これは、正確な定量において不十分であることを示す。また、図１０のデータは、試験された全ての条件において、ＤＭＳＯ処理サンプル（陰性対照）において観察されるＨＳＦ１陽性顆粒カウントが、セラストロール処理サンプル（陽性対照）のカウントに近いことを示す。更に、該データは、ヒートショック（４３℃１時間）後に回復時間を与えなかった場合、核あたり平均で６．８３個のＨＳＦ１ストレス顆粒が誘導され、これに対して、２時間の回復時間を与えた場合、核あたり平均で６．３８個のストレス顆粒が誘導されたことを示す。比較すると、陽性対照の値は約６．５６であり、従って、検出窓は、理想より小さかった。図１１は、ＤＭＳＯ処理細胞を、４１℃温度上昇ストレスに２時間晒し、回復時間を与えなかった場合の、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒カウント評価を示す。図１２は、ＤＭＳＯ処理細胞を、４１℃温度上昇ストレスに２時間晒し、回復時間を与えなかった場合の、ＨＳＦ１ ＣＶ核発色強度及びＨＳＰ７０顆粒面積の評価を示す。表１は、細胞を、４１℃温度上昇ストレスに２時間晒し、回復時間を与えなかった場合の、ＨＳＦ１顆粒変数、ＨＳＰ７０顆粒変数、ＨＳＦ１発色強度ＣＶ変数及びＨＳＰ７０顆粒面積のＣＶ値を、表形式でまとめたものである。
【表１】
【０１１６】
本明細書中で報告したＭａＣＲＡ ＨＣＳ顆粒アッセイは、様々なストレス条件下でＨＳＦ１／ＨＳＰ７０を調節（増大又は減少）させられる新規化学物質の直接的な同定を可能とする。従来のウエスタンブロット又は免疫蛍光アッセイと比較して、本ＨＣＳ顆粒アッセイは、以下の点において有利である。
【０１１７】
（１）ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０ストレス顆粒は、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の活性化と大いに関連している。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒の定量は、様々なストレッサーに対する応答におけるＨＳＦ１／ＨＳＰ７０活性の細胞の動力学を測定することが出来る。更に、穏和なストレス条件（４１℃のヒートショック）を利用した場合、化合物スクリーニングにおいて、良好な窓を用いて、改善されたシグナル／バックグラウンドが得られた。この設定は、前記項降雨率の方法においても観察された、誘導活性が弱いヒットの同定も可能とした。
【０１１８】
（２）ＨＣＳと連動して使用される最新のソフトウエアシステムは、複雑なイメージの断片化、細胞のソーティング及び解析、顆粒カウント／面積の計算、高速でのデータ処理等のための、顕著に改善されたプラットフォームを形成する。加えて、ＨＣＳは、化合物評価における、多くの他の表現形質のパラメーターを提示する。例えば、比較対象は、細胞ストレス、例えばヒートショック処理の存在下又は非存在下での、化合物により誘導される核の形態の変化（ＤＡＰＩ染色）の相異であってもよく、これは、細胞毒性の予測に特に有益な場合がある。
【０１１９】
（３）自動的であるというＨＣＳの特徴から、より高レベルな効率で、巨大な化合物ライブラリーのスクリーニングが可能となる。
【０１２０】
（４）ＨＣＳアッセイの多重化した特性から、込み入った生物学的経路を個別に分離する（ｔｅａｓｉｎｇ ａｐａｒｔ）のに特に有用な場合があり、潜在的な標的及びバイオマーカーを迅速に同定する有益なツールを提供する。ヒートショックベースのＨＣＳにおける主要な技術上の障害は、更に高効率のフォーマット（３８４ウェルあるいはそれ以上）でのヒートショック操作の制御である。この目的を達成するために、合理化され、かつ高速化されたデータ処理能力が発達し、これにより、３８４ウェル以上のフォーマットで、本明細書に記載のＨＣＳアッセイを行うことが可能となった（下記参照）。
【０１２１】
細胞保護及び細胞毒性−第二のアッセイ
ＨＳＰ７０の誘導において見られる効果が細胞保護に転化され得るか否かを判定するための１つ以上の第二のアッセイにおいて、ＭＴＳ細胞毒性アッセイが使用された。該アッセイは、本質的には、既に記載されたものと同様に実行された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ２００８； １３（６）：５３８−４３；実施例５を参照されたい）。このＭＴＳアッセイは、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０スクリーニングで同定された調節因子が細胞において細胞毒性を誘導するか否かを判定するための第二のアッセイに使用される場合もある（下記図１７Ａ及び１７Ｅも参照されたい）。
【０１２２】
ＭａＣＲＡ ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイのスクリーニングでヒットした化合物が、ツニカマイシン処理により誘導される小胞体（ＥＲ）系に対するストレスから細胞を保護出来るか否かが試験された。図１３に示されるように、最終濃度１０μＭの化合物Ｂが、ツニカマイシン誘導ＥＲストレスアッセイにおける様々な時点で、ＰＣ１２培養細胞に添加され、そして、実施例６に記載されるように、生存細胞を測定した。このデータは、ツニカマイシン処理の前に、又は処理中、そしてツニカマイシン処理後２４時間であっても、化合物Ｂで処理することにより、細胞が、ツニカマイシン誘導性のストレスから、顕著に保護されたことを示す。
【０１２３】
ＨＤＦ１ストレス誘導因子から区別されたシャペロンＨＳＦ１共誘導因子
図１４は、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（上記で挙げた新しくＭａＣＲＡで選択された調節因子）の濃度の増大に対する、非ストレス細胞（ここでは、３７℃で培養された非ヒートショック細胞）中のＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大パーセントを比較する実験の結果を示す。図１４に示されるように、セラストロール（陽性対照）とは対照的に、化合物Ａは、非ストレス細胞において、ヒートショック応答（ＨＳＦ１顆粒）を刺激しない。故に、化合物Ａは、セラストロールのようなストレス誘導因子ではなく、ＨＳＦ１共誘導因子、及び細胞ストレス応答の共誘導因子に分類され、本発明のＭａＣＲＡプラットフォーム及び関連する方法並びにアッセイは、この共誘導因子化合物のクラスの他のメンバーを同定するのに使用される場合もある（下記を参照されたい）。
【０１２４】
ＭａＣＲＡでヒットした化合物の作用はＨＳＰ９０の阻害を介しない
次に、ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットした化合物の幾つかの選択されたものがＨＳＰ９０を阻害するか否か、即ち、それらの化合物がネガティブフィードバックを起こすことによりＨＳＦ１発現を阻害し、これによりＨＳＦ１の間接的な調節因子となることが予想され得るか否かが試験された。ＨＳＰ９０（ＡＴＰアーゼ）の活性は、実施例８の方法に従い測定された。図１５に示すように、上記のＭａＣＲＡスクリーニングでヒットしたものとして同定された様々な化合物は、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を有意に阻害しない。従って、これらの化合物は、ＨＳＰ９０の阻害に関係しない新規のメカニズムを介して、ＨＳＦ１を調節している。
【０１２５】
ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋共誘導因子を同定するスクリーニングの方策
図１６は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイを第一のアッセイとして、そして細胞保護及び細胞毒性をそれぞれ同定するためのＭＧ−１３２及びＭＴＳアッセイを第二のアッセイとして使用する、リード開発用化合物をスクリーニングする方策の模式図である。上記で詳述した実験に基づいて、上記３つのアッセイを並行して行い、４０００の化合物ライブラリーの中から、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋共誘導因子をスクリーニングした。ＭＧ−１３２アッセイにおいて、細胞をプロテオソーム阻害剤で処理して、細胞質タンパク質のミスフォールディング（細胞ストレス及び細胞死を引き起こす）を誘導する。化合物は、処理を受けた細胞が、プロテオソーム阻害剤誘導性の細胞死を免れて生存するパーセントの増大においてスクリーニングされた（実施例５を参照されたい）。ＭＴＳアッセイは、正常細胞に対して一般的に毒性である化合物をスクリーニングする（そして排除する）のに使用された（実施例５を参照されたい）。
【０１２６】
図１７Ａは、Ｘ軸にＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大パーセント（ＨＳＦ１顆粒カウントの測定による）、Ｙ軸にＭＧ−１３２アッセイにおける生存細胞の増大パーセント、そしてＺ軸にＭＴＳアッセイにおける生存細胞の阻害パーセントを示す、４，０００化合物のスクリーニングから得た、データの集合を表す。各球体のサイズ及び濃淡は、それぞれ、ＨＳＰ７０及びＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。従って、より暗く大きな球体はＨＳＦ１＋かつＨＳＰ７０＋の化合物であり、原点により近いものと比較して、Ｙ軸に沿うものはＭＧ−１３２アッセイにおける細胞生存（細胞保護）に優れ；そしてＺ軸に沿うものは、ＭＴＳアッセイにおける生存（細胞毒性）に優れている。そのような多元的解析を使用するデータのソーティング又はビニングにより、並行したアッセイから得たデータを、関心のある（本明細書ではＨＳＦ１共誘導因子）調節化合物を同定するために迅速に使用することが可能となる。これらの、及び類似の多元的解析は、任意の数のアッセイからのデータを表示するのに使用される場合もある。該データは、化合物のスクリーニング及び選択において将来使用するために、及び比較及び予測のために、データベースに保存される場合もある。
【０１２７】
図１７Ａの多元的データは、個々のアッセイで得たデータが分離される。図１７Ｂは、ＨＳＦ１顆粒スクリーニング（４０００化合物；Ｒ０＝ヒートショック後の回復時間が０時間）で得られたデータを表し、Ｙ軸が、ＨＳＦ１陽性顆粒の増大を示す。正方形の濃淡は、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞に対応する。このスクリーニングにおける閾値として、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞の２０％の増大が使用された。正方形の影は、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞に対応する。つまり、閾値２０％を超える暗い正方形は、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ７＋のヒットである。図１７Ｃは、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞における、３０％の閾値を設けたＨＳＰ７０顆粒アッセイ（４０００化合物；Ｒ２＝ヒートショック後の回復時間が２時間）で得られたデータを表す。正方形の影は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。つまり、閾値３０％を超える暗い正方形は、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ７＋のヒットである。図１７Ｄは、生存細胞の増大パーセント（ＤＭＳＯとの比較）において３０％の閾値を設けたＭＧ−１３２アッセイで得られたデータを図示する。正方形の濃淡は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【０１２８】
最後に、図１７Ｅは、ＭＧ−１３２アッセイ及びＭＴＳアッセイの第二のデータの組み合わせを表す。上記と同様に、球体のサイズ及び濃淡は、それぞれＨＳＰ７０及びＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。関心の在る化合物は、ＭＧ−１３２アッセイにおいて約３０％以上の細胞保護の増大を示し、そしてＭＴＳアッセイにおいて、約２０％を超える細胞毒性の阻害（生存細胞の増大等）を示すものとして選択された。
【０１２９】
表３〜５は、本発明の方法に係る第一及び第二のアッセイにおいて同定した化合物を選択して、それらの化合物を、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋（Ａ）、ＨＳＦｌ−ＨＳＰ＋（Ｂ）及びＨＳＦｌ−ＨＳＰ−（Ｃ）のカテゴリーに分けたものを示している。重要なことに、本明細書に記載のアッセイ及びデータ解析用の方法は、第四の可能なカテゴリー、即ちＨＳＦｌ−ＨＳＰ７０＋に当てはまる化合物が一つもヒットしない。このことから、本発明のスクリーニング及びアッセイの方法（例えばＭａＣＲＡ）がＨＳＦ１依存的であり、そしてＨＳＦ１が直接的な分子標的であることが確認される。
【表２】
【表３】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【０１３０】
上記実験は、実験条件を最適化し、そしてデータのソーティングを実証するために、９６ウェルフォーマットで実施された。次に、化合物は、より高効率（３８４ウェルフォーマット）で、対照としてセラストロールを使用して行われ、３８４ウェルフォーマットにおいてＭａＣＲＡプラットフォームがどの程度高効率であるかが確認された（実施例１０）。図１８は、３８４ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、ＤＭＳＯ（黒い菱形）及びセラストロール（黒い正方形）で前処理し、続いて４１℃で２時間ヒートショックを与え、回復時間無しで、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価した結果を示す。このデータは、９６ウェルフォーマットで定めた全てのスクリーニングの基準が、ＭａＣＲＡを３８４ウェルフォーマットにスケールアップした場合にも適用されることを示す（Ｚ’＝０．５５、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）＝６．７３、及びＣＶ＝０．１３）。
【０１３１】
ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットしたＨＳＦ１＋化合物は、ＨＳＦ依存的である
上記ＭａＣＲＡで同定されたＨＳＦ１活性化化合物が実際に直接ＨＳＦ１を通じて作用していることを立証するため、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ノックダウン実験を行い、ＨＳＦ１特異的なｓｉＲＮＡ投与により細胞内のＨＳＦ１発現レベルを直接低下させたときの該化合物の効果を、非特異的対照ＲＮＡ投与の場合と比較して観察した（実施例１１）。図１９は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ又はトランスフェクション対照を４８時間トランスフェクションしてｓｉＲＮＡ処理し、続いて４３℃で２時間ヒートショックを加え、回復時間無しの、又はヒートショック処理しないＨｅＬａ細胞における、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０タンパク質発現（ローディング対照にＧＡＰＤＨタンパク質発現）のウェスタンブロットを示す。これらの条件下で、対照のレベルに対し、ＨＳＦ１発現が約８０〜９０％低下し、及びＨＳＰ７０発現が約５０％低下した。
【０１３２】
図２０は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクションし、続いて２５μＭの化合物Ｂ（ＣＹＴ４９２）又はＤＭＳＯ対照で処理した後、４１℃で２時間ヒートショックした、又はしていないＨｅＬａ細胞における、ＨＳＦ１陽性顆粒形成に対するＨＳＦ１ノックダウンの効果を図示している。顆粒形成は、対照（スクランブル）ｓｉＲＮＡ処理細胞において認められるが、ＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ特異的ｓｉＲＮＡ処理細胞においては認められない。これは、ＨＳＦ１陽性顆粒形成が、細胞内のＨＳＦ１発現に直接依存していることを示す。上記ｓｉＲＮＡ処理が処理された細胞を単純に死滅させるものではないことを示すために、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル（標的無し）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の細胞カウントを測定した（図２１）。この実験により、ＨｅＬａ細胞において、ＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、非特異的細胞死を引き起こさないことが確認された。
【０１３３】
表５は、ＨＳＦ１の共誘導因子（増幅因子）としても同定されたＨＳＦ１＋ＨＳＰ７０＋カテゴリーの９個の独立したヒットを使用して、そのようなｓｉＲＮＡノックダウン実験を行って得たデータをまとめたものを示す。表５に示されるように、各化合物が、ＨＳＦ１依存的活性化因子である。
【表５】
【０１３４】
次に、ＭａＣＲＡにより選択された化合物は、ｓｉＲＮＡノックダウン実験において試験され、続いて第二の機能的実験（ＭＴＳ及びＭＧ−１３２アッセイ、実施例５参照）に付された。図２２Ａ〜Ｂは、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）を４８時間（Ａ）、及び７２時間（Ｂ）トランスフェクションした、ＭＧ−１３２に使用されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＨＳＦ１のｓｉＲＮＡノックダウン、及び対応するウエスタンブロットを図示している。図２２Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡと比較しての、１０、２５及び５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡを用いて４８時間かけてＨＳＦ１をノックダウンした後の、ＨＳＰ７０の発現に対する効果を図示するウエスタンブロットを示す。ここで、ＨＳＦ１ノックダウンは、ＨｅＬａ細胞において見られた（上記）よりも有効ではなかった。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡノックダウンでは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、ＨＳＦ１の約７０％、そしてＨＳＰ７０の約６０％をノックダウンした。とは言え、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において達成されたノックダウンレベルは、ＭＧ−１３２アッセイにおいて、ヒット化合物が直接ＨＳＦ１を介して作用するか否かを試験するのに充分である。
【０１３５】
図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）のいずれかの化合物で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイにおけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。これらの４つの試験は、ＨＳＦ１依存的細胞保護を示した。ＨＳＦ１のレベルをｓｉＲＮＡノックダウンにより低下させたとき、ＭＧ−１３２アッセイにおいて細胞保護が約１０〜２０％低下した。
【０１３６】
ＨＳＦ１顆粒アッセイを使用しての細胞ストレス応答の阻害因子の同定
ＨＳＦ１阻害因子の同定は、それらが、例えば癌治療等において、及び標的を定めた、又は制御された細胞死の方法等において、細胞の増殖の阻害に関する処置に使用され得る点で、望ましい場合がある。トリプトリドは、癌治療用の公知のＨＳＦ１阻害剤である。例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００７） ６７， ９４０７； Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００６） ２８１， ９６１６； Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２００７； １３０（６）： １００５−１８を参照されたい。しかしながら、現在までに、ＨＳＦ１阻害候補化合物をスクリーニング及び選択する、定量的かつ高効率な方法は、確実に報告されていなかった。ＨＳＦ１阻害化合物（細胞内のＨＳＦ１活性を低下させる調節因子）の選択用にＭａＣＲＡフォーマットを調整するために、上記ＨＳＦ１顆粒アッセイ及び第二のアッセイにおける陽性対照として、トリプトリドを使用した。従って、トリプトリドの量を増大させることによるＨＳＦ１顆粒形成の阻害は、４３℃で、４つの異なる処理時間で、回復時間無しで試験された（実施例１２）。ＨＳＦ１阻害因子の選択において、４３℃で回復時間無しがより良好な検出感度となることが観察された（活性化因子の選択において４１℃のヒートショックがより良好な検出感度となるのとは対照的である）。
【０１３７】
図２４は、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭのトリプトリドで処理し、その後４３℃で１、２、３又は４時間ヒートショックしたＨｅＬａ細胞における、用量依存的なＨＳＦ１顆粒形成の阻害を図示したものである。顆粒５個／核を閾値として、顆粒カウントを測定した。本明細書に記載のＭｅＣＲＡ法を使用して選択された様々な化合物の効果の試験に、同様のアッセイ条件が使用された。図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１３８】
上記データに基づき、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の阻害における以下の４つの条件を、ＭａＣＲＡプラットフォームにおけるフォローアップ試験に選択した：（１）ＨＳＦ１阻害において４３℃で２時間、Ｒ０（図２６Ａ）；（２）ＨＳＦ１阻害において４３℃で４時間、Ｒ４（図２６Ｂ）；（３）ＨＳＰ７０阻害において４３℃で２時間、Ｒ４（図２６Ｃ）；（４）ＨＳＰ７０阻害において４３℃で４時間、Ｒ４（図２６Ｄ）。陽性対照として、１μＭトリプトリド及び１０μＭ ＣＹＴ１５６３を使用した。
【０１３９】
これらの実験のデータを下記表６にまとめ、トリプトリド及びＣＹＴ１５６３について計算したＺ’を併記する。ＣＶＹ１５６３のＺ’は、４３℃で４時間、Ｒ４のＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒アッセイにおいて良好（Ｚ’＞０．５でロボット的（ｒｏｂｏｔｉｃ）と見做される）であるから、この条件は、更にＨＳＦ１／ＨＳＰ７０阻害因子スクリーニングに選択された。
【０１４０】
表６
＊４３℃で４時間、回復時間４時間（Ｒ４）が、更なるＨＳＦ１及びＨＳＰ７０阻害因子スクリーニング用の最適の条件として選択された。
【表６】
【０１４１】
次の工程において、ＭａＣＲＡベースのＨＳＦ１／ＨＳＰ阻害因子スクリーニングアッセイは、９６ウェルから３８４ウェルにスケールアップされ、上記の最適条件が使用された（実施例１４）。この実験において、上記ＨＳＦ１共誘導因子同定に使用されたのと類似のデータビニングの方策が採用されたが、本方策は、細胞ストレスの非存在下で阻害活性を有しない化合物ではなく、細胞ストレス（即ちヒートショック）に応じてＨＳＦ１特異的な阻害活性を示す化合物が探索された。図２７は、３８４ウェル中で、ＤＭＳＯのみ（黒色の菱形）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）（黒色の正方形）で処理し、続いて４３℃で２時間ヒートショックして、回復時間無しのＨｅＬａ細胞を、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価したものを示す。ＣＹＴ１５６３のＺ’は０．６５、シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比率は１１．２５、そしてＣＶは１２％であった。
【０１４２】
当業者は、上記アッセイ及びデータビニングの方策が、具体的な条件に適合するように変更させられる場合があることを認識し得る。一般に、前記パラメーターは、具体的な細胞、化合物及びアッセイ条件に基づいて、スクリーニングを最適化するために、個別に、及びに一緒に変化させられる。前述の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、限定を意図しない。当業者は、前述の一般的な開示の範囲内で、本発明の追加的な態様が補足されることを認識し得て、そして下記非限定的な実施例は、いかなる形でも権利放棄（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を意図しない。
【実施例】
【０１４３】
実施例１：ＨＳＦ１／ＨＳＰストレス顆粒の定量及びアッセイの検証
本実施例は、ＨＳＦ１活性化因子をスクリーニングするための、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０高密度スクリーニング（ＨＣＳ）アッセイの開発に関する。ＨｅＬａ細胞を化合物（セラストロール）で１時間前処理し、２時間ヒートショックをかけた。希釈はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で２００倍になるように行われ、最終的なスクリーニング用の濃度は３０μＭとなった。熱伝導をより良好にするために特注のアルミニウムプレートが設計され、これにより、９６ウェルプレートにおいて定常的な温度及び最小のばらつきが達成された。該アルミニウムプレートは、実験前日に４１℃のインキュベーターに置かれた。
【０１４４】
ＨｅＬａ細胞中のＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の免疫組織化学的染色は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．， １３（６）：５３８−５４３， ２００８にあるように実施された。プレートの移動を自動化するために、Ｔｗｉｓｔｅｒ ＩＩ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）と一体化したＩＮｃｅｌｌ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、画像取得が実施された。画像解析は、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ３．６のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用して遂行された。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒カウント、顆粒面積及び核発色強度ＣＶのアルゴリズムは、アッセイ条件及び使用説明書に従い設計した。ＥＣ５０値及び曲線の当てはめは、Ｐｒｉｓｍ ４．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び非線形回帰解析を使用して実施された。セラストロール（２μＭ）誘導性の顆粒形成は、処理群において観察された（図１Ａ及び１Ｃ）が、ＤＭＳＯ溶媒処理対照細胞では観察されなかった（図１Ｂ及び１Ｄ）。
【０１４５】
Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ （ＭＴＡ）モジュールは、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度及び核発色強度ＣＶ（核内のピクセル強度のＣＶ）等の、核顆粒の高速の測定を提供する。図２Ａ及び２Ｂは、顆粒カウント及び核発色強度ＣＶを通じての、ＨＳＦ１変数の定量を提供する。図２Ｃ及び２Ｄは、ＨＳＰ７０顆粒の定量に、顆粒カウント及び顆粒面積を採用したものである。
【０１４６】
図２Ａは、ＭＴＡにより定量されたように、ヒートショック（４１℃２時間）が、２μＭのセラストロールに晒されたＨｅＬａ細胞において、核あたり平均で５．３４±０．７２個のＨＳＦ１ストレス顆粒を誘導した。比較対照としたＤＭＳＯ処理細胞では、２．４６±０．２２個の顆粒が誘導されていた。バックグラウンドを相対的に低くするために、５つを超える顆粒を含むＨｅＬａ細胞を、「ＨＳＦ１顆粒陽性細胞」と定義した。ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ、ＨＳＰ７０顆粒カウント及びＨＳＰ７０顆粒面積の閾値も、ＤＭＳＯ処理サンプルの平均プラス２又はそれ以上の標準偏差に相当するゲート値が選択された（図２Ｂ〜Ｄ）。
【０１４７】
更に、ＨＣＳ顆粒アッセイは、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ液体操作システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）を用いた自動高効率オペレーションにおいて検証された。２０枚のＨＣＳアッセイプレートから取ったセラストロール処理サンプルを集めてＺ’値を計算すると０．６２であり、これは、ロボット的アッセイを実施するのに妥当であることを示している。Ｓｃｉｃｌｏｎｅ ＡＬＨ３０００におけるＨＣＳ顆粒アッセイの性能の評価では、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して、図３に示す第一のスクリーニングデータが得られた。ＨＳＦ１顆粒陽性細胞は、狭いＣＶ（７．９４％）で平均５９．３６％±４．７１％であり、これに対してＤＭＳＯ対照は、８．１７％±２．００％であった。セラストロールのシグナル対ノイズ比は７．１３で、これは、４１℃でヒートショックを行ったとき、アッセイ窓が顕著に改善される（４３℃との比較、データ無し）ことを示唆する。
【０１４８】
図４Ａ及び４Ｂは、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０を誘導するセラストロール及び化合物ＡのＥＣ５０値を提供する。ＨＳＦ１のＥＣ５０を決定する際に使用された閾値は核発色強度ＣＶで、一方ＨＳＰ７０のＥＣ５０を決定する際に使用された閾値は合計顆粒面積であった。
【０１４９】
ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導における化合物Ａ及びセラストロールの動力学を比較するために、図５に図示されるように、詳細なタイムコース試験（回復時間中６時間まで）を行った。本実験において使用される濃度は、セラストロール及び化合物Ａにおいてそれぞれ１μＭ及び１０μＭであり、これらは、各化合物のＥＣ５０値に近い。化合物Ａは、試験された殆どの時点で、セラストロールと類似の誘導挙動を呈した。いずれの化合物も、ヒートショック後６時間にかけてＨＳＦ１ストレス顆粒を活性化しており、これは、それらの化合物が、ＨＳＰを持続的に誘導するＨＳＦ１の活性構造を維持又は安定化している可能性があることを強力に示唆する。ＨＳＰ７０シグナルは、ヒートショック１時間後にピークを有し、そしてヒートショック後６時間まで、相対的に高いレベル（〜２５％陽性染色細胞）を維持していた。ＨＳＰ７０が持続的に発現することによって、ミスフォールディングしたタンパク質の保護領域（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）が拡張する。
【０１５０】
実施例２：ＯＧＤストレスにおける、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０応答でのスクリーニングでヒットした化合物の評価
これらの実験において、前記ＭａＣＲＡ ＨＳＦ１活性化因子のスクリーニングでヒットした化合物を、試験化合物のＳＨＳＹ５Ｙ細胞に対する細胞保護効果を測るための、第二の酸素グルコース除去（ＯＧＤ）アッセイにおいて試験する。コラーゲンＩでプレコートした９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に、２５０００細胞／ウェルの密度でＳＨＳＹ５Ｙ細胞をプレーティングし、完全培地（Ｎｅｕｒａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で１６〜２４時間培養した。ＯＧＤの誘導において、細胞を、グルコース又は血清を含まない、予め酸素を除去した培地で２回洗浄した。所望の濃度の選択された化合物をストレスの１時間前に添加し、そしてプレートを、モジュラーインキュベーターチャンバー中に置いた（Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ， Ｄｅｌ Ｍａｒ， ＣＡ）。該チャンバーを、室温の９５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２のガス混合物で、１０Ｌ／分の流速で３０分間還流した。特殊なＯ２電極を使用して残留酸素（Ｏ２）濃度がモニタリングされ、最終的な酸素濃度は１％未満であった。還流の後、チャンバーを密封し、そして３７℃のインキュベーター中で２８時間維持した。ＯＧＤ実験の後、酸素欠乏又は低酸素症の指標である、ＨＩＦ１αの誘導を確認するために、免疫染色が実施された。全ての液体操作手順はＳｃｉｃｌｏｎｅ ＡＬＨ３０００ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）を使用して行われ、良好な再現性が達成された。細胞の生存率は、ＭＴＳアッセイ（下記）を使用して測定された。ＯＧＤ実験は、図７に記載されるように、ＤＭＳＯ（対照）使用と比較して、化合物Ａで処理された細胞において、顕著な細胞保護効果が認められることを示した。
【０１５１】
実施例３：ロテノンモデルにおける、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０応答でのスクリーニングでヒットした化合物の発展（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
この実験において、前記ＭａＣＲＡ ＨＳＦ１活性化因子のスクリーニングでヒットした化合物を、試験化合物のＳＨＳＹ５Ｙ細胞に対する細胞保護効果を測るための、第二のロテノンアッセイにおいて試験する。パーキンソン症のロテノンモデルは、タンパク質凝集により誘導される細胞毒性を研究するためのインビトロ系である。ミトコンドリア阻害剤であるロテノンは、α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の発現を増大させ、やがて、Ｌｅｗｙ小体と類似の細胞質内容物を形成することが報告されている。Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅｌａｔ． Ｄｉｓｏｒｄ．， Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ５９−Ｓ６４ （２００３）を参照されたい。故に、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０ ＭａＣＲＡスクリーニングのヒットの細胞保護効果を評価するために、このインビトロ系が採用され、Ｓｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２３（３４）：１０７５６−１０７６４， ２００３に本質的に記載されるように実行される場合がある。このデータは、１００ｎＭのロテノンで２４時間処理すると、４２％を超えるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が死滅することを示す。しかしながら、２．５μＭの化合物Ａで前処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率は、ＤＭＳＯ対照処理細胞と比較して、２９％増大した。要するに、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０スクリーニングで同定された小分子ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０増幅因子は、恐らくＨＳＦ１／ＨＳＰ７０増幅のメカニズムを通じての、細胞保護の効能により、２つの異なるストレス条件から、細胞を救済することが出来る。
【０１５２】
実施例４：亜最大加熱ストレス条件でのＭａＣＲＡアッセイの開発
実験１：これらの実験は、ヒートショックの温度や回復時間等のアッセイのパラメーターを最適化するために実施された。ＨｅＬａ細胞は、アッセイ評価用の９６ウェルプレート中で、０．３３％ＤＭＳＯにより処理された（実施例４、下記実験３参照）。該サンプルに、３９℃、２時間、回復時間無しでヒートショックを行い、そして別のサンプルの群（９６ウェルプレート）に、４１℃、２時間、回復時間無しでヒートショックを行った。セラストロールを陽性対照とした。図９に示すように、ヒートショックが４１℃、２時間、回復時間無しで行われたとき、３９℃のヒートショックの場合と比較して、多くの陽性のヒットが検出された。
【０１５３】
実験２：ＨｅＬａ細胞を０．３３％ＤＭＳＯで前処理し、そして該サンプルを、以下の：（１）４３℃、２時間、回復時間２時間；（２）４３℃、２時間、回復時間無し；（３）４３℃、１時間、回復時間無し；及び（４）４３℃、１時間、回復時間２時間；のいずれかのヒートショック条件で処理した。図１０に示すように、ＨＳＰ７０のＣＶ値は２５％を超え、これは定量に適しない。また、このデータは、ヒートショック（４３℃、１時間）により、回復時間無しでは平均で核あたり６．８３個のＨＳＦ１ストレス顆粒を誘導し一方、２時間の回復時間を設けた場合、誘導されたＨＳＦ１ストレス顆粒は平均で核あたり６．３８個であったことを示す。ＤＭＳＯ処理サンプルにおける両方のＨＳＦ１ストレス顆粒カウントの値は、陽性対照処理サンプルのものに非常に近く（６．５６）、ゆえに、４３℃で１又は２時間、回復時間有り又は無しのヒートショック条件は、化合物のスクリーニングに最適の条件ではない。
【０１５４】
実験３：ＨｅＬａ細胞を８０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）に播種し、化合物処理の前に約１６〜２４時間培養した。続いて、該細胞をＤＭＳＯで処理した。ＤＭＥＭ中での化合物の全体の希釈は２００倍であり、最終的なスクリーニング用の濃度は３０μＭとなり、そしてこれを、ＥＣ５Ｏ決定のために、１０μＭ〜０．１μＭの濃度範囲内で連続希釈した（アッセイポイントを１０個設けた）（ＤＭＳＯの最終濃度は０．３％ｖ／ｖ）。ヒートショックは、４１℃、２時間、回復時間無しで実行された。ヒートショックの直後、５０μＬの１６％パラホルムアルデヒドを培養培地と混合（合計体積１５０μＬ）して、最終濃度を４％とした。プレートを室温で３０分インキュベートして、そしてＰＢＳで洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ＯＯのＰＢＳ溶液で３０分間処理して、細胞膜を易透化（Ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートに室温で５％ＦＢＳ／ＰＢＳを８０μＬ添加して、１時間置いた。抗体染色のために、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００に希釈した抗ＨＳＦ１及び抗ＨＳＰ抗体をプレートに添加した。プレートを、室温で２時間、又は４℃で一昼夜インキュベーションした。最後に、プレートに、ＦＩＴＣ又はローダミンでラベルした二次抗体及びＤＡＰＩの混合物を、それぞれ最終濃度が１：５０００（ＤＡＰＩ、５ｍｇ／ｍＬ）、１：５００（ＦＩＴＣ／ローダミンラベル抗ウサギ二次抗体）となるように添加した。室温で１時間置いた後、プレートをＰＢＳで洗浄して、４℃で保存した。
【０１５５】
プレートの移動を自動化するために、Ｔｗｉｓｔｅｒ ＩＩ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）と一体化したＩＮｃｅｌｌ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、画像取得及び解析が実施された。画像取得の設定は、以前記載（２０）したように、ＤＡＰＩにおいて５００ｍｓ、ＦＩＴＣ又はローダミンにおいて１００ｍｓで、ウェルあたり３回撮像した。画像解析は、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ３．６のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用して実施された。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒カウント、顆粒面積及び核発色強度ＣＶにおけるアルゴリズムは、アッセイ条件及び使用説明書に従い設計及び最適化された。ＥＣ５０値及び曲線の当てはめは、Ｐｒｉｓｍ ４．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び非線形回帰解析を使用して実施された。
【０１５６】
そして、陽性染色細胞は、顆粒カウントアッセイを使用して決定された。図１１は、本実験における、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒カウントの評価を示す。
【０１５７】
実験４：９６ウェルフォーマットのＨｅＬａ細胞（上記実施例３参照）を０．３３ＤＭＳＯで前処理し、そして４１℃２時間、回復時間無しでヒートショックを行った。そして、陽性染色ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０細胞を、顆粒発色強度ＣＶ及び顆粒面積を使用して測定した。図１２に、この実験の結果を示す。また、表１は、このデータを表形式でまとめたものであり、４１℃２時間、回復時間無しで温度上昇ストレスに晒したときの、ＨＳＦ１顆粒の変数、ＨＳＰ７０顆粒の変数、ＨＳＦ１発色強度ＣＶの変数におけるＣＶ値を示している。
【０１５８】
実施例５：細胞保護及び細胞毒性−第二のアッセイ
これらの実験は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導において見られる効果が細胞保護に転化され得るか否かを判定するために実行された。ＷＥＨＩ又はＨＥＫ２９３細胞を１５０００細胞／ウェルの密度で培養し、これをスクリーニング化合物で７２時間処理した。１５０００細胞／ウェルの密度のＷＥＨ１又はＨＥＫ２９３細胞を前記スクリーニング化合物で処置した。陽性対照として、タキソール（５００ｎＭ）及びスタウロスポリン（５００ｎＭ）を使用した。陰性対照として、ＤＭＳＯを使用した。７２時間後、ＭＴＳ／ＰＥＳ（生存細胞中でのみ活性のミトコンドリアデヒドロゲナーゼの基質）を用いて、細胞の生存率を測定した。ＩＣ５０の数値を以って、細胞毒性を誘導した化合物を判定した（図１７Ａ及び１７Ｅ参照）。
【０１５９】
ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導において見られる効果が細胞保護に転化され得るか否かを判定するための第二のアッセイとして、ＭＧ−１３２アッセイが使用された。１２０００細胞／ウェルの密度のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、化合物で処理した。３０分後、細胞に５μＭのＭＧ−１３２を添加して、２４時間インキュベーションした。この実験の陽性及び陰性対照はそれぞれＣＹＴ４９２及びＤＭＳＯとした。２４時間後、製造元（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の説明書に従い、ＡＴＰｌｉｔｅを使用して、細胞生存率を測定した。ＥＣ５０値を以って、ＭＧ−１３２誘導性の細胞死から細胞を保護する化合物を判定した（図１７Ａ、１７Ｄ及び１７Ｅ参照）。
【０１６０】
実施例６：ツニカマイシンＥＲストレスモデル
この実験は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０アッセイのスクリーニングでヒットした化合物が、ＥＲストレスを負ったツニカマイシン処理細胞を保護又は救済することが出来るか否かを試験するために行われる。図１３に示すデータを得るために使用した手順は、本質的には、Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０７：９３５−９３９ （２００５）又はＹｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２１ ：８７２−８８４ （２００７）に記載のものと同様である。具体的には、様々な時点で、培養細胞に、最終濃度１０μＭの化合物Ｂを添加した。ＰＣ１２細胞は、７５０μｇ／ｍＬのツニカマイシン処理で、ＥＲストレスを誘導することが出来た。生存細胞は、ＡＴＰｌｉｔｅ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して測定することが出来た。図１３に示されるように、化合物Ｂは、ツニカマイシンにより誘導されるＥＲストレスからＰＣ−１２細胞を保護する。
【０１６１】
実施例７：シャペロンＨＳＦ１共誘導因子
この試験は、非ストレス細胞中のＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大と、セラストロール又は化合物Ａの濃度の増大との関係を比較するために行われた。８０００細胞／ウェルのＨｅＬａ細胞を、段階的に濃度を増大させる（０．７８μＭ〜３５μＭ）セラストロール又は化合物Ａで処理し、そして３７℃で３時間インキュベーションした。５０μＬの１６％パラホルムアルデヒドを培養培地と混合（合計体積１５０μＬ）して、最終濃度を４％とした。プレートを室温で３０分インキュベートして、そしてＰＢＳで洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ＯＯのＰＢＳ溶液で３０分間処理して、細胞膜を易透化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートに室温で５％ＦＢＳ／ＰＢＳを８０μＬ添加して、１時間置いた。抗体染色のために、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００に希釈した抗ＨＳＦ１及び抗ＨＳＰ抗体をプレートに添加した。プレートを、室温で２時間、又は４℃で一昼夜インキュベーションした。最後に、プレートに、ＦＩＴＣ又はローダミンでラベルした二次抗体及びＤＡＰＩの混合物を、それぞれ最終濃度が１：５０００（ＤＡＰＩ、５ｍｇ／ｍＬ）、１：５００（ＦＩＴＣ／ローダミンラベル抗ウサギ二次抗体）となるように添加した。室温で１時間置いた後、プレートをＰＢＳで洗浄して、４℃で保存した。
【０１６２】
画像取得及び解析は、ＩＮｃｅｌｌ １０００を使用して行われた。図１４Ｃに示されるように、化合物Ａは、セラストロールと対照的に、非ストレス細胞において、ＨＳＦ１陽性顆粒を有意に刺激しない。
【０１６３】
実施例８：カウンタースクリーニングＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼアッセイによる、ＨＳＰ９０の阻害に作用する化合物のモニタリング
この実験は、ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットした化合物がＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性を阻害するか否かを試験するために行われた。２．５μｇのＨＳＰ９０（Ｓｔ９細胞から精製した）を、１０μＭのラジシコール及び５０μＭの化合物Ａ〜Ｇのいずれかで、３７℃で３時間処理した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ （Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）のＡＤＰクエストキットを使用して、ＡＴＰアーゼ活性を測定した。図１５に示されるように、ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットしたものとして同定された上記の様々な化合物は、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を有意に阻害しない。従って、それらのＨＳＦ１及びＨＳＰ７０陽性顆粒形成に対する効果は、ＨＳＰ９０阻害から独立している。
【０１６４】
実施例９：ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋共誘導因子を同定するスクリーニングの方策
上記で詳述した実験に基づき、第一のＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイ並びに細胞保護及び細胞毒性をそれぞれ同定する第二のＭＧ−１３２及びＭＴＳアッセイを使用して、４０００個の化合物がスクリーニングされた。データの多元的解析は、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ （ＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ， Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＭＡ）を使用して、ＨＳＦ顆粒陽性細胞％において２０％超（ＨＳＦ１＋）、ＨＳＰ顆粒陽性細胞％において３０％超（ＨＳＰ＋）、ＭＧ１３２アッセイにおける生存細胞の増大％において３０％超、及びＭＴＳアッセイにおける阻害％において２０％未満をカットオフ値として、実施された。各スクリーニングのデータは、図１７Ｂ、１７Ｃ及び１７Ｄに示される。図１７Ａ及び１７Ｅは、４０００個の化合物のスクリーニングから得たデータの多元的集合（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）を表す。
【０１６５】
表２〜４は、本発明の方法に従い第一及び第二のアッセイにおいて同定した選択化合物のデータをまとめた表であり、これらの化合物は、上記のように、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋（Ａ）、ＨＳＦｌ−ＨＳＰ＋（Ｂ）、及びＨＳＦｌ−ＨＳＰ−（Ｃ）のカテゴリーに分けられる。
【０１６６】
実施例１０：セラストロール対照を用いての３８４ウェルフォーマットへの転換
ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−３８４アッセイプレートに適切な密度でＨｅＬａ細胞を播種し、化合物処理の前に、１６〜２４時間培養した。続いて、細胞をセラストロール（対照）又はスクリーニング化合物で処理した。ＤＭＥＭ中での化合物の全体の希釈は２００倍であり、最終的なスクリーニング用の濃度は３０μＭとなり、そしてこれを、ＥＣ５Ｏ決定のために、１０μＭ〜０．１μＭの濃度範囲内で連続希釈した（アッセイポイントを１０個設けた）（ＤＭＳＯの最終濃度は０．３％ｖ／ｖ）。４３℃、２時間、回復時間無しで実行されたヒートショックの直後、２５μＬの１６％パラホルムアルデヒドを培養培地と混合（合計体積７５μＬ）して、最終濃度を４％とした。プレートを室温で３０分インキュベートして、そしてＰＢＳで洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ＯＯのＰＢＳ溶液で３０分間処理して、細胞膜を易透化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートに室温で５％ＦＢＳ／ＰＢＳを２０μＬ添加して、１時間置いた。抗体染色のために、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００に希釈した抗ＨＳＦ１及び抗ＨＳＰ抗体をプレートに添加した。プレートを、室温で２時間、又は４℃で一昼夜インキュベーションした。最後に、プレートに、ＦＩＴＣ又はローダミンでラベルした二次抗体及びＤＡＰＩの混合物を、それぞれ最終濃度が１：５０００（ＤＡＰＩ、５ｍｇ／ｍＬ）、１：５００（ＦＩＴＣ／ローダミンラベル抗ウサギ二次抗体）となるように添加した。室温で１時間置いた後、プレートをＰＢＳで洗浄して、４℃で保存した。
【０１６７】
プレートの移動を自動化するために、Ｔｗｉｓｔｅｒ ＩＩ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）と一体化したＩＮｃｅｌｌ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、画像取得及び解析が実施された。画像取得の設定は、ＤＡＰＩにおいて５００ｍｓ、ＦＩＴＣ又はローダミンにおいて１００ｍｓで、ウェルあたり３回撮像した。画像解析は、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ３．６のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用して実施された。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒カウント、顆粒面積及び核発色強度ＣＶにおけるアルゴリズムは、アッセイ条件及び使用説明書に従い設計及び最適化された。ＥＣ５０値及び曲線の当てはめは、Ｐｒｉｓｍ ４．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び非線形回帰解析を使用して実施された。このスクリーニングの結果は、図１８に示される。
【０１６８】
実施例１１：ＨＳＦ１ノックダウン例
実験１：ＨｅＬａ細胞に、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ又はトランスフェクション対照を４８時間トランスフェクションし、続いて４３℃で２時間ヒートショックを加え、又は加えなかった。ウェスタンブロット実験により、ローディング対照のＧＡＰＤＨと比較しての、ＨＳＦ１及びスクランブルのノックダウンを比較した。及び柱状図を示す。柱状図中の柱において示されるように、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の発現は、減少する。
【０１６９】
実験２：ＨｅＬａ細胞に、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、４８時間のインキュベーションに付した。続いてこの細胞を２５μＭの化合物Ｂ又はＤＭＳＯ対照で処理した後、４１℃で２時間ヒートショックを行い、又は行わなかった。ＨＳＦ１顆粒を染色するために、免疫細胞化学実験を行った。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ， “Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｅ−Ｂａｓｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ ｉｎ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ”， Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ， （２００８）を参照されたい）。画像取得は、対物１０ｘのＩＮｃｅｌｌ １０００を使用して行われ、これらを図２０に示す。
【０１７０】
実験３：ＨｅＬａ細胞に、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ又はスクランブル（標的無し）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ＨＳＦ１顆粒を染色するために、免疫細胞化学実験を行った（上記）。画像取得は、対物１０ｘのＩＮｃｅｌｌ １０００を使用して行われた。細胞カウントは、ＩＮｃｅｌｌ １０００ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ中のＭｕｌｔｉ−Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓアルゴリズムを用いて取得された（図２１を参照されたい）。表５は、ＨＳＦ１の共誘導因子（増幅因子）としても同定されたＨＳＦ１＋ＨＳＰ７０＋カテゴリーの９個の独立したヒットを使用して、そのようなｓｉＲＮＡノックダウン実験を行って得たデータをまとめたものを示す。表２に示されるように、各化合物が、ＨＳＦ１依存的活性化因子である。
【０１７１】
実験４：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクションした。この細胞を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ試薬を使用）の４８時間後に回収した。ウエスタンブロットは、抗ＨＳＦ１及び抗ＧＡＰＤＨ（ローディング対照）を使用して（図２２Ａ及び２２Ｂ）、又は抗ＨＳＰ７０及び抗ＧＡＰＤＨを使用して（図２２Ｃ）実施された。画像の強度は、Ｌｉ−Ｃｏｒ製のソフトウェアを使用して解析され、ＨＳＦ１強度は、スクランブルｓｉＲＮＡ処理サンプルで正規化したＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ処理サンプルから求められた。図２２Ａ〜Ｂは、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）に対して、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＭＧ−１３２アッセイに使用した、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の、トランスフェクション時間が４８時間（Ａ）及び７２時間（Ｂ）の場合のｓｉＲＮＡノックダウン、並びに対応するウエスタンブロットを提供する。図２２Ｃ中のウエスタンブロットは、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）と比較しての、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の、ＨＳＰ７０に対する効果を示す。
【０１７２】
実験５：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを、４８時間トランスフェクションした。ＣＹＴ２２３９、ＣＹＴ２２４４、ＣＹＴ２２８２又はＣＹＴ２５３２を添加し、３０分後に５μＭのＭＧ−１３２で２４時間処理した。生存細胞を、ＡＴＰｌｉｔｅキットで測定した。ＨＳＦ１のノックダウンは、免疫細胞化学及び高密度イメージングにおけるＨＳＦ１核発色強度により確認した。図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（図２３Ａ）、ＣＹＴ２２４４（図２３Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（図２３Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（図２３Ｄ）のいずれか１つの化合物で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理した場合の、ＭＧ−１３２アッセイにおけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【０１７３】
実施例１２：ＨＳＦ１顆粒アッセイを使用しての細胞ストレス応答の阻害因子の同定
実験１：ＨｅＬａ細胞を、異なる濃度（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭ）のトリプトリドで処理し、その後４３℃で１〜４時間ヒートショックした。図２４は、処理に用いられるトリプトリドの濃度の増大（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭ）に応じた、用量依存的なＨＳＦ１顆粒形成の阻害を図示したものである。ＨＳＦ１顆粒カウントは、顆粒５個／核を閾値として測定した。本明細書に記載のＭｅＣＲＡ法を使用して選択された様々な化合物の効果の試験に、同様のアッセイ条件が使用された。
【０１７４】
実験２：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、１時間、回復時間０、５及び７時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ａは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７５】
実験３：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、２時間、回復時間０、４又は６時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ｂは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７６】
実験４：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、３時間、回復時間０、３又は５時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ｃは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７７】
実験５：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、４時間、回復時間０、２又は４時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ｄは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７８】
実施例１３：トリプトリド及びスクリーニングヒット化合物の９６ウェルプレート評価
実験１：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＰ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＦ１顆粒形成を、４３℃、２時間、回復時間無しのヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ａは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１７９】
実験２：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＯ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＦ１顆粒形成を、４３℃、４時間、回復時間４時間のヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ｂは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１８０】
実験３：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＯ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＰ７０顆粒形成を、４３℃、２時間、回復時間４時間のヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ｃは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１８１】
実験４：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＯ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＰ７０顆粒形成を、４３℃、４時間、回復時間４時間のヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ｄは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１８２】
実施例１４：９６ウェルフォーマットの３８４ウェルフォーマットへの転換
ＨｅＬａ細胞を、ＤＭＳＯ（黒色の菱形）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）（黒色の正方形）で処理し、続いて４３℃、２時間、回復時間無しのヒートショックを与え、これを、３８４ウェルフォーマット（実施例１０を参照されたい）におけるＨＳＦ１顆粒カウントを使用して試験した。Ｚ’値及びシグナル／バックグラウンド（ＳｆＢ）比を含む結果を、図２７に示す。
【０１８３】
上記実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、限定を意図しない。当業者は、前述の一般的な開示の範囲内で、本発明の追加的な態様が補足されることを認識し得て、そして上記非限定的な実施例は、いかなる形でも権利放棄を意図しない。
【０１８４】
均等
当業者は、ありふれたものに過ぎない実験を利用して、本明細書中に記載の化合物、組成物、及びそれらを使用する方法の、多くの均等なものを認識し得て、又は突き止めることが出来る。そのような均等なものは、本願請求項に記載の発明の範囲内とみなされ、本願請求項の範囲内にある。
【０１８５】
本願全体に引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許文献の内容、並びにそれらに関連する図は、それらの全てが、参照により援用される。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月３日に出願された米国仮特許出願６１／１３０，９４５、及び２００８年１０月１日に出願された米国仮特許出願６１／１９４，９８４号の利益を主張し、それらの明細書の全内容を、本明細書中に参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）は、様々な生理的及び環境的刺激に対してホメオスタシス及び生存を維持するのに必須の細胞内タンパク質である。Ｖｏｅｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ， ５９４：８９−９９ （２００７）を参照されたい。この多重遺伝子スーパーファミリーのメンバーは、それらの分子サイズ及び関連する機能で表され、例えば、ＨＳＰｌ１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、及び小ヒートショックタンパク質等が挙げられる。ＨＳＰは、ミスフォールディングしたタンパク質の立体構造及び細胞機能の復活を支援し、又はダメージを受けたタンパク質をプロテオソーム誘導性の分解を導く、分子シャペロンとして機能する。例えばＨｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２：３４９−３８４ （１９９３）； Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． Ｎｅｐｈｒｏｌ， ２：１４９−１５６ （２００６）を参照されたい。ＨＳＰ発現は、ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）、特にＨＳＦ１により、迅速に誘導される。ＨＳＦは、制御される遺伝子のヒートショックエレメント（ＳＨＥ）配列への結合を通じて、ＨＳＰ遺伝子の転写を活性化する、プロトタイプの制御因子である。Ｐｉｒｋｋａｌａ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １５： １１１８− １１３１ （２００１）を参照されたい。ヒートショック応答に関与する経路の活性化は、ストレスに関連するタンパク質のミスフォールディング等、細胞ストレスに対するありふれた細胞応答であるから、細胞のヒートショック応答を調節することが出来る小分子は、例えば、幾つかの側面において、癌、虚血、創傷治癒及び神経変性疾患等の、細胞のヒートショック応答の活性化又は抑制に関与する、広範囲の臨床的適応の処置及び予防のための治療ツール等として使用されるものとして、大いに注目されている。近年、ＨＳＦ１及びＨＳＰを調節する多くの化合物が発見され、それらの幾つかは臨床試験に付されている。例えばＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５８１ ：３７５８−３７６９ （２００７）を参照されたい。
【０００３】
ＨＳＦ１は、直接的及び間接的メカニズムにより、正負両方向に細胞ストレス応答経路に関与する遺伝子を制御する。ＨＳＦ１の両方向の活性は、部分的には、ＨＳＦ１モノマーと比べて異なるＤＮＡ及びタンパク質因子に対する結合親和性等を有するマルチマーを形成するその能力に起因する。正常な成長条件の下で、ＨＳＦ１は、相対的に不活性であるモノマー形態で、細胞の細胞質及び核中に存在することが示されていた。ストレス刺激を受けた細胞（例えばヒートショック、重金属又はアミノ酸類似体に晒された細胞）において、ＨＳＦ１は、ＤＮＡ結合能力が向上し、及びタンパク質相互作用プロフィールが変化する、トリマーを形成する。該活性は、特定の部位の誘導性リン酸化により、更に亢進する。ＨＳＦ１は、ＨＳＰ７０のｍＲＮＡ転写の上方制御を調整するだけでなく、核孔のＴＰＲタンパク質と相互作用することにより、ストレス誘導性のＨＳＰ７０のｍＲＮＡの輸送も促進する。Ｓｋａｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８２（４７）：３３９０２−３３９０７ （２００７）を参照されたい。
【０００４】
興味深いことに、ＨＳＦ１は、ストレスを受けた細胞の核の中で、広く分散したパターンから、分離したＨＳＦ１を含む顆粒に再分布する。これらのストレス顆粒は、大きく、不定形で、そして主として、サテライトＩＩＩ反復配列と、ＤＮＡ−タンパク質間の直接相互作用を介して固定される。Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １５６（５）；７７５−７８１ （２００２）； Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １６４（ｌ）：２５−３３ （２００４）を参照されたい。
【０００５】
ＨＳＰ７０タンパク質は、分子シャペロンの最も重要なファミリーの１つである。このファミリーは、高度に相同で、重複配列を有し、異なる機能を有する、８つのシャペロンタンパク質を含む。Ｄａｕｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５８１（１９）：３７０２−３７１０ （２００７）を参照されたい。ＨＳＰ７０の主な機能は、ストレス誘導性のタンパク質のミスフォールディング又は分解に対する細胞保護機能を提供することである。加えて、構成的に発現したＨＳＰ７０タンパク質も、非ストレス細胞において、重要なハウスキーピング機能を有する。ヒートショックに続いて、ＨＳＰ７０の発現が顕著に増大し、そして多くの新たに合成されたＨＳＰタンパク質が、細胞質から細胞の核の中に急速に移動する。ＧＦＰと融合させたＨＳＰ７０を使用して、Ｚｅｎｇらは、細胞ストレスに応答して、核内のＧＦＰ−ＨＳＰ７０レベルが顕著に増大し、それらが核小体中に高度に濃縮して、ＨＳＰ７０顆粒を形成することを報告した。Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １１７（２１）：４９９１−５０００ （２００４）を参照されたい。また、ＨＳＰの発現のバランスに対する負のフィードバックループも存在する。マルチシャペロン複合体中のＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０タンパク質は、ＨＳＦ１と相互作用して、その活性を抑制する。ストレス誘導性のミスフォールディングタンパク質は、該相互作用を妨げ、そしてＨＳＦ１が開放され、転写活性化に至る。
【０００６】
ヒートショック応答におけるＨＳＦ１／ＨＳＰを標的とする治療的に活性な小分子のスクリーニングに、多大な労力が払われている。直接的なＨＳＦ１活性化（セラストロール（ｃｅｌａｓｔｒｏｌ））、ＨＳＰ９０阻害（ラジシコール（ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）、１７−ＡＡＧ）、炎症仲介（アラキドン酸、四環系酸Ａ（ｔｅｒｒａｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ））、プロテオソーム阻害（ＭＧ−１３２）、ヒートショック応答阻害（ＫＮＫ４３７、ケルセチン）、及びＨＳＦ１／ＨＳＰ７０共誘導（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（アリモクロモル、ビモクロモル）を通じての、ＨＳＦ１調節因子として、多くの化合物が同定されている。Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８０（３９）：３３９０７−３３１００ （２００５）を参照されたい。近年、標的治療学において、２つの主要なスキームが浮上している。１つは、ＨＳＰ９０を阻害するものであり、これにより、抗癌治療への道が開けた。即ち、ＨＳＰ９０は、悪性形質転換に関与する幾つかの重要なキナーゼを安定化する。Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ， ３：３４９−３５８ （２００３）を参照されたい。幾つかのＨＳＰ９０阻害剤が臨床試験に付されており、一例として、１７−ＡＡＧは、管理可能な毒性の範囲内で、明確な抗癌活性を示している。もう１つは、小分子を通じて、ＨＳＰ、特にＨＳＰ７０を上方制御するものであり、これにより、ミスフォールディングしたタンパク質が蓄積して、望ましくない症状に関与する、疾患、症状及び障害における、多大な治療的価値が示された。重要なことに、このカテゴリーの幾つかの化合物、例えばアリモクロモルは、正常細胞中のＨＳＰ７０及び他のシャペロンタンパク質に誘導的な作用を有さず、ストレス細胞のシャペロン誘導の亢進を活性化する（いわゆる「共誘導（ｃｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）又は「増幅」）。他の共誘導性（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）化合物も、恐らく有効な治療剤であり、正常細胞及びストレス細胞のＨＳＰ７０を活性化する薬剤よりも副作用が少ないと考えられる。Ｓｏｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １４６（６）：７６９−７８０ （２００５）を参照されたい。
【０００７】
上記を考慮して、標的を定めたシャペロン療法において診断的に又は治療的に使用される、細胞ストレス応答経路中のＨＳＦ１／ＨＳＰ活性を制御（誘導、共誘導、増幅、抑制又は減衰）させる小分子等の薬剤を同定するアッセイの開発は、有益であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一つの側面において、本発明は、細胞をストレス処理し、そして細胞のストレス応答を、細胞ストレスに応じて生じるＨＳＦ顆粒（例えばＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ３又はＨＳＦ４顆粒）形成、及びそれらの顆粒の正常に関する様々な変数、及び特に１つ以上の変数の組み合わせにより測定することにより、細胞内のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）発現の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）を定量的に測定する、高効率の方法を提供する。幾つかの態様において、前記組み合わせは、２つ以上の変数からなる。ＨＳＦ顆粒、例えばＨＳＦ１顆粒等に関連する、細胞のストレス応答に対応する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント、核発色強度（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）（ＣＶ）、顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率の１つ以上、場合によっては２つ以上から選択される場合もある。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度の変動係数（ＣＶ）、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【０００９】
他の側面において、本発明は、細胞を候補剤（候補化合物又は候補組成物等）で処理し、細胞をストレスに晒し、そして該薬剤の存在下又は非存在下における細胞のストレス応答を測定することを含む、細胞内のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。細胞のストレス応答は、細胞ストレスにより生じる、顆粒形成、例えばＨＳＰ及び／又はＨＳＦ（例えばＨＳＦ１）顆粒形成、並びに／あるいは該顆粒の性状に関する、１つ以上の変数、及び特に２つ以上の変数を測定することにより測定され得る。細胞ストレス応答に対応するＨＳＰ又はＨＳＦ顆粒、例えばＨＳＦ１等に関連する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント；核発色強度の変動係数（ＣＶ）；顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度の変動係数（ＣＶ）、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００１０】
更なる他の側面において、本発明は、細胞をストレス処理することによる、細胞内のＨＳＦ、例えばＨＳＦ１の転写活性を定量的に測定する高効率の方法、そして更に、上記方法を使用することによる、細胞内のＨＳＦ活性、例えばＨＳＦ１活性の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。活性化因子及び阻害因子の選択を最適化するための、細胞ストレスのレベルを調節する方法が提供される。本発明の高効率手法の信頼性及び再現性に関連する、ＨＳＰ及び／またはＨＳＦ顆粒の変数、細胞の種類、ストレス及び他の変数の選択は、以下に詳細に検討される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、実施例１に記載のように、無処理の、又はヒートショック処理の前に、２μＭのセラストロールＤＭＳＯ溶液（Ａ及びＣ）又は０．３３％ＤＭＳＯ（Ｂ及びＤ）で前処理したＨｅＬａ細胞を４１℃で２時間ヒートショックしたときの、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０（Ａ及びＣ）の核内での顆粒形成を示す。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、実施例１に記載のように、無処理の、又はヒートショック処理の前に、２μＭのセラストロールＤＭＳＯ溶液（Ａ及びＣ）又は０．３３％ＤＭＳＯ（Ｂ及びＤ）で前処理したＨｅＬａ細胞を４１℃で２時間ヒートショックしたときの、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０（Ａ及びＣ）の核内での顆粒形成を示す。
【００１２】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜Ｄは、実施例１で得た顆粒カウント及び核発色強度ＣＶによる核ＨＳＦ１顆粒の定量（Ａ及びＢ）、並びに顆粒カウント及び顆粒合計面積（Ｃ及びＤ）による核ＨＳＰ７０顆粒の定量を示す。平均値の違いを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した。Ａｐ値＜０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ〜Ｄは、実施例１で得た顆粒カウント及び核発色強度ＣＶによる核ＨＳＦ１顆粒の定量（Ａ及びＢ）、並びに顆粒カウント及び顆粒合計面積（Ｃ及びＤ）による核ＨＳＰ７０顆粒の定量を示す。平均値の違いを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した。Ａｐ値＜０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【００１３】
【図３】図３は、陽性対照としてヒートショック１時間前に２μＭセラストロールで処理したサンプル、及び陰性対照として０．３３％ＤＭＳＯで処理したサンプルについて実施された、高密度スクリーニング（ＨＣＳ）顆粒アッセイの評価を示す。
【００１４】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、実施例１に記載の、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（ＨＣＳ法により同定された新規調節因子）における、ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ（Ａ）及びＨＳＰ７０顆粒面積（Ｂ）のＥＣ５０値を使用した用量依存的試験を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、実施例１に記載の、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（ＨＣＳ法により同定された新規調節因子）における、ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ（Ａ）及びＨＳＰ７０顆粒面積（Ｂ）のＥＣ５０値を使用した用量依存的試験を示す。
【００１５】
【図５】図５は、実施例１に記載の、１０μＭの化合物Ａ又は１μＭのセラストロール（陽性対照）を用いた、前処理後６時間の回復期間にかけてのＨＳＦ１誘導キネティクスの比較を示す。
【００１６】
【図６】図６は、２μＭセラストロール陽性対照（黒正方形）及びＤＭＳＯ陰性対照（白丸）のＨｅＬａ細胞に対して、３０分間個別に４８０種類の異なる試験化合物で３０分処理して、その後２時間４１℃のヒートショックを与えた実験のデータを示す。
【００１７】
【図７】図７は、実施例２に記載の、非酸素グルコース除去（ＯＧＤ）ストレス及びＯＧＤストレスの下で、化合物Ａの細胞保護効果を評価するために採用された、ＭＴＳ細胞死アッセイを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を０．３３％ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯ中の２．５μＭ化合物Ａで１時間処理し、そしてＯＧＤで２８時間置き、続いて直ちにＭＴＳアッセイを行った。データは、独立した３つの実験の平均として表現した。Ａｐ値０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【００１８】
【図８】図８は、実施例３に記載の、ロテノン誘導性ミトコンドリアストレスの下で、化合物Ａの細胞保護効果を評価するために採用された、ＭＴＳ細胞死アッセイを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＤＭＳＯ及び２．５μＭ化合物Ａで１時間処理し、そして１００ｎＭのロテノンで２４時間処理し、続いて直ちにＭＴＳアッセイを行った。データは、独立した３つの実験の平均として表現した。Ａｐ値０．０１（＊＊）は、統計的に有意と見做された。
【００１９】
【図９】図９は、温度を３９℃又は４１℃に上昇させることによりストレス処理し、回復期間を与えずに測定した細胞を比較した、ＨＳＦ１顆粒データを示す。
【００２０】
【図１０】図１０は、ＤＭＳＯで処理して、温度を４３℃に上昇させて１時間置き、回復時間を与えず、又は２時間の回復時間を与えた細胞の、ＨＳＰ７０の顆粒カウントにおいて観察されたＣＶ値が、２５％を上回ることを示す。これらのデータは、両条件におけるＨＳＦ１顆粒カウントの値が、陽性対照の値の望ましいものより近接しており、そして４３℃において、ＨＣＳアッセイ検出窓（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）が、４１℃の場合よりも顕著に小さくなることを示す。
【００２１】
【図１１】図１１は、４１℃に上昇させた温度に２時間晒し、回復時間を与えずに０．３３％ＤＭＳＯ処理した細胞の、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒カウントの評価を示す。
【００２２】
【図１２】図１２は、４１℃に上昇させた温度に２時間晒し、回復時間を与えずに０．３３％ＤＭＳＯ処理した細胞の、ＨＳＦ１のＣＶ核発色強度及びＨＳＰ７０顆粒面積の評価を示す。
【００２３】
【図１３】図１３は、実施例６に記載される、ツニカマイシン誘導ＥＲストレスモデルにおける様々な時点での化合物Ｂ（本願ＨＣＳ法により同定された新規調節因子）からの応答を図示する。
【００２４】
【図１４】図１４は、温度上昇ストレスに晒されていない（例えば３７℃３時間）細胞における、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（試験化合物）の濃度（μＭ）の増大に応じた、ＨＳＦ１顆粒カウントの評価を示す。このデータは、セラストロールの濃度が１．２５〜５．０μＭのとき、正常（ヒートショック無し）細胞のＨＳＦ１陽性顆粒の形成が顕著に刺激されるが、化合物Ａはそのようにならないことを示す。
【００２５】
【図１５】図１５は、実施例８に記載される、１０μＭラジシコール（対照）又は５０μＭの９つの試験された化合物の１つで処理された細胞における、ＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性の阻害パーセントを示す。これらの結果は、ＨＣＦアッセイにおいて正のヒットとして同定された化合物が、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を顕著に阻害しないことを図示している。
【００２６】
【図１６】図１６は、最初にＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイ、続いて細胞保護及び細胞毒性をそれぞれ同定するＭＧ−１３２及びＭＴＳアッセイを使用する、リード開発用化合物をスクリーニングする方策を提供する。
【００２７】
【図１７Ａ】図１７Ａは、Ｘ軸にＨＳＦ１顆粒陽性細胞、Ｙ軸にＭＧ−１３２アッセイにおける生存細胞、そしてＺ軸にＭＴＳアッセイにおける生存細胞の阻害を示すデータの集合（４，０００化合物）を表す。各球体のサイズ及び濃淡は、それぞれ、ＨＳＰ７０及びＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【００２８】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞における、２０％の閾値を設けたＨＳＦ１顆粒スクリーニングで得られたデータを表す（４，０００化合物）。正方形の濃淡は、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞に対応する。
【００２９】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞における、３０％の閾値を設けたＨＳＰ７０顆粒アッセイで得られたデータを表す。正方形の濃淡は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【００３０】
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、生存細胞の増大パーセント（ＤＭＳＯとの比較）において３０％の閾値を設けたＭＧ−１３２アッセイで得られたデータを図示する。正方形の濃淡は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【００３１】
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、ＭＧ−１３２アッセイ及びＭＴＳアッセイのデータの組み合わせを図示する。球体のサイズはＨＳＰ７０顆粒データに対応し、そして濃淡はＨＳＦ１顆粒データに対応する。
【００３２】
【図１８】図１８は、３８４ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、０．３３％ＤＭＳＯ（黒い菱形）及び２μＭセラストロール（黒い正方形）で前処理し、続いて４１℃で２時間ヒートショックを与え、回復時間無し（Ｒ０）で、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価した結果を示す。
【００３３】
【図１９】図１９は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ（対照）又はＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション対照）を４８時間トランスフェクションし、続いて４３℃で２時間ヒートショックを加えた、又はヒートショック処理しないＨｅＬａ細胞の、ウェスタンブロット及び柱状図を示す。
【００３４】
【図２０】図２０は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクションし、続いて２５μＭの化合物Ｂ（ＣＹＴ４９２）又はＤＭＳＯ対照で処理した後、４１℃で２時間ヒートショックした、又はしていないＨｅＬａ細胞における、顆粒形成を図示している。
【００３５】
【図２１】図２１は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル（標的無し）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の細胞カウントを示し、これは、細胞毒性作用が最小であることを示している。
【００３６】
【図２２Ａ】図２２Ａ〜Ｂは、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）を４８時間（Ａ）、及び７２時間（Ｂ）トランスフェクションしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のｓｉＲＮＡノックダウンを図示している。ウエスタンブロットは、タンパク質の発現レベルに対応している。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜Ｂは、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）を４８時間（Ａ）、及び７２時間（Ｂ）トランスフェクションしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のｓｉＲＮＡノックダウンを図示している。ウエスタンブロットは、タンパク質の発現レベルに対応している。
【００３７】
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ（対照）又はＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション対照）と比較しての、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡを用いて４８時間かけてＨＳＦ１をノックダウンした後の、ＨＳＰ７０タンパク質の発現を図示するウエスタンブロットを示す。
【００３８】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイ（実施例５）におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【００３９】
【図２４】図２４は、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭのトリプトリドで処理し、その後４３℃で１、２、３又は４時間ヒートショックしたＨｅＬａ細胞において、顆粒５個／核を閾値とする顆粒カウントを行い、ＨＳＦ１顆粒形成の阻害を図示したものである。
【００４０】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【００４１】
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜Ｄは、０．３３％ＤＭＳＯ、トリプトリド（１μＭ）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞における、４３℃で（Ａ）２時間ヒートショックし、回復時間無し（Ｒ０）；及び（Ｂ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＦ１顆粒カウントの評価、並びに４３℃で（Ｃ）２時間ヒートショックし、回復時間４時間；及び（Ｄ）４時間ヒートショックし、回復時間４時間；のＨＳＰ７０細胞発色強度ＣＶの評価を示す。
【００４２】
【図２７】図２７は、３８４ウェル中で、０．３３％ＤＭＳＯ及びＣＹＴ１５６３（１０μＭ）で処理し、続いて４３℃、２時間、回復時間無し（Ｒ０）のヒートショックを与えたＨｅＬａ細胞を、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
便宜のため、本明細書、実施例及び特許請求の範囲において採用される幾つかの用語を、本明細書中に集めて定義する。特に定義されていない限り、本明細書中で使用される技術的及び科学的用語は、当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００４４】
本明細書中で使用されるとき、「核発色強度の変動係数（ＣＶ）」という用語は、発色ラベル、例えば蛍光ラベルの検出が可能な装置を用いたイメージングにより測定した細胞の核内の顆粒の発色強度の相異を意味する。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒」という用語は、核内のＨＳＰ、ＨＳＦ又は他のＨＳＰ補因子の濃度が増大することを指し、ここで、該核内の濃度増大は、ＨＳＰ若しくは分子シャペロンの発現、又はＨＳＦ転写レベルの増大に関連する。好ましくは、これらの顆粒は、発色ラベル、例えば蛍光ラベルの検出が可能な装置を用いたイメージングにより検出される。該「顆粒」という用語は、当業者には、ＨＳＰ若しくは分子シャペロンの発現、又はＨＳＦ転写レベルの増大に関連する、「スポット」、「ドット」、「粒子（ｇｒａｉｎ）」としても知られる。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒カウント」という用語は、細胞サンプル中に検出される顆粒の数を指す。例を挙げると、顆粒カウントは、肉眼で顆粒数をカウントすることにより測定され得る。他の態様において、顆粒カウントは、イメージング装置及び付属するソフトウエアの感度設定及び解像能力により決定される。幾つかの態様において、ＨＳＰ又はＨＳＦの顆粒カウントは、平均で細胞あたり２〜３０個、例えば細胞あたり３〜１０個であってもよい。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒発色強度」は、発色ラベル、例えば蛍光ラベルの検出が可能な装置を用いたイメージングにより測定される、細胞の核内の顆粒の発色強度を指す。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、「顆粒サイズ」という用語は、イメージング装置により測定される、「顆粒面積」、「顆粒半径」又は「顆粒体積」等、検出可能な顆粒のサイズを指す。典型的には、顆粒サイズは、イメージング装置及び付属するソフトウエアの感度設定及び解像能力により決定される。例を挙げると、顆粒は、半径が平均で約０．０１〜２０μｍ２、例えば約０．１〜１０μｍ２、例えば約０．２〜５ μｍ２である。例を挙げると、顆粒は、平均体積が、約０．０１〜１００μｍ３、例えば約０．１〜５０μｍ３、例えば約１〜２０μｍ３である。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、「最大ストレス応答」という用語は、最大レベルのストレスに対する細胞の応答を指す。最大レベルのストレスは、細胞のストレスに対する応答がそれ以上変化しなくなる適用されるストレスのレベルである。例えば、温度上昇をストレスとするとき（ヒートショック）、対応する最大ストレス応答は、「最大ヒートショック応答」であり、これは、細胞に「最大レベルのヒートショック」、即ちヒートショックに対する細胞応答がそれ以上変化しなくなる温度を加えたときの応答を指す。最大ストレス応答の他の例として、細胞のストレス応答を誘導する、最大の重金属、化学毒物、酸素の濃度等が挙げられる。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、「穏和なストレス」という用語は、前処理ストレス（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ）に関連する、最大ストレス応答を下回るストレス応答を提供する条件を指す。例えば、最大ヒートショック応答を誘導する温度を下回るが、なおも細胞にストレス応答を誘導する温度上昇は、「穏和なヒートショック」条件である。穏和なストレス応答の他の例として、細胞のストレス応答を誘導する、最大未満の重金属、化学毒物、酸素の濃度等が挙げられる。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、「調節」という用語は、本明細書中に記載の化合物又は組成物が、生物学的経路に、又は所定の生物学的巨大分子、例えばタンパク質、例えばＨＳＰ、ＨＳＦ、もしくは核酸エレメント、例えばＨＳＥ等の活性又は機能に、変化を生じさせる作用を指す。幾つかの態様において、調節には、例えば、生物学的経路の阻害若しくはアンタゴナイズ（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ）、又は生物学的巨大分子の活性の阻害、中和、若しくは減衰等が挙げられる。他の態様において、調節として、生物学的経路の促進若しくはアゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）、又は生物学的巨大分子の活性の増大が挙げられる。例えば、幾つかの態様において、調節は、生物学的経路又は転写因子、例えばＨＳＦ等の転写活性に変化をもたらすことを含む。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、「小分子」という用語は、分子量が約２５００ａｍｕ（原子量単位）未満、好ましくは約２０００ａｍｕ未満、なおもより好ましくは約１５００ａｍｕ未満、更により好ましくは約１０００ａｍｕ未満、又は最も好ましくは約７５０ａｍｕの有機的化合物を指す。そのような分子は、典型的には、２つ以上の炭素及び水素原子からな、そして１つ以上の酸素及び窒素が存在する。また、そのような分子は、１つ以上の硫黄、リン及びハロゲン（フッ素、塩素及び臭素）を含むが、他の公知の原子が採用される場合もある。本方法に使用されるのに適した小分子は、合成のものであっても、又は天然に存在するものであってもよく、様々な化学物質ライブラリーから商業的に入手出来る。例えば、本方法に使用される小分子として、ヒドロキシルアミン化合物が挙げられる。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、「ストレス」という用語は、細胞の「ストレス応答」を誘導し得る、細胞に影響する条件又は因子と当業者が理解する、生理的ストレスを指す。ストレスを誘導するものの例として、温度上昇、金属、化学毒物、酸素供給及び酸素欠乏等が挙げられる。
【００５４】
本明細書中で使用されるとき、「ストレス応答」という用語は、細胞における、ストレスへの曝露に応答した、ＨＳＰ発現及び／又はＨＳＦ転写の増大を指す。例えば、温度上昇ストレスに対する応答は、ヒートショック応答である。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、「亜致命（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ）ストレス」という用語は、細胞の死滅を引き起こさない細胞のストレス応答を誘導するストレスに対する応答を指す。
【００５６】
本明細書中で使用されるとき、「亜最大（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）ストレス応答」は、前記最大ストレスレベルにより引き起こされる応答を下回るが、前記前処理ストレスにより引き起こされる応答を上回るストレス応答を指す。例えば、最大ヒートショックを誘導する温度により引き起こされるヒートショック応答を下回るが、前処理ストレスを誘導する温度の応答を上回るヒートショック応答は、亜最大ストレス応答である。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「処置」という用語は、対象の臨床的状態における改善を指し、治癒が達成されることを意図しない。
【００５８】
本明細書中に示される特許文献及び非特許文献は、それらの全てが参照により援用される。
【００５９】
態様
ＨＳＰ又はＨＳＦ発現の高効率の定量方法
ヒートショック誘導性のストレス顆粒の形成は公知であり、ヒートショック応答に関連していることが示されている。Ｃｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照されたい。また、Ｚａａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６６（３）： １７８３− １７９１ （２００６）を参照されたい。しかしながら、今日までに、高効率のフォーマットでＨＳＦ１／ＨＳＰの活性化を直接測定し得るアッセイは存在していなかった。ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の両方がヒートショック後にストレス顆粒を形成するという事実から、それらを正確かつ良好な再現性で定量する方法が開発出来れば、細胞ストレス活性化を定量する有用な細胞マーカーとなり得ることが予想される。この要求に取り組むために、本発明は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ活性に関連する細胞内でのストレス顆粒を正確に定量出来る、イメージベースの高密度スクリーニング（ＨＣＳ）を提供する。ＨＣＳの多パラメーター的性質（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｎａｔｕｒｅ）は、合理的な効率で複雑な細胞ネットワーク及び生物学的メカニズムを解析するのに特に有用である。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ２５−４２， （２００８）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ， １３（１０）：９５３−９ （２００８）を参照されたい。本明細書中で、ストレスで活性されたＨＳＦ１等のＨＳＦ及び／又はＨＳＰ７０等のＨＳＰを定量するために、顆粒形成のパラメーターの内、顆粒カウント、合計顆粒面積、顆粒発色強度、顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率、及び核発色強度が選択された。
【００６０】
よって、幾つかの態様において、本発明は、細胞をストレスに晒し、そして細胞のストレスに応じて起こるＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒形成（例えばＨＳＦ１顆粒形成）及び該顆粒の性状に関する１つ以上の変数、又は２つ以上の変数の組み合わせにより細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のＨＳＰ発現の調節を定量的に測定する高効率の方法を提供する。細胞ストレス応答に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒（例えばＨＳＦ１顆粒）に関する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント、核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率、の１つ以上から、そして好ましくは２つ以上から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００６１】
更なる他の側面において、本発明は、細胞をストレスに晒し、そして細胞のストレスに応じて起こるＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒形成（例えばＨＳＦ１顆粒形成）及び該顆粒の性状に関する１つ以上の変数、又は２つ以上の変数の組み合わせにより細胞のストレス応答を測定することによる、ＨＳＦ、例えばＨＳＦ１の転写活性を定量的に測定する高効率の方法を提供する。細胞ストレス応答に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒に関する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント、核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率、の１つ以上から、そして好ましくは２つ以上から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００６２】
ＨＳＰ発現の調節因子を同定する方法
他の側面において、本発明は、細胞を調節因子と推定される薬剤（即ち候補剤）、例えば候補化合物又は有効成分を含む候補組成物で処理し；処理細胞及び非処理対照細胞をストレスに晒し；そして該推定調節因子が継続的に存在する場合、又はある時点で除去した場合における細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のＨＳＰの発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。加えて、他の側面において、本発明は、細胞を調節因子と推定される薬剤（即ち候補剤）、例えば候補化合物又は有効成分を含む候補組成物で処理し；処理細胞及び非処理対照細胞をストレスに晒し；そして該推定調節因子が継続的に存在する場合、又はある時点で除去した場合における細胞のストレス応答を測定することによる、細胞内のＨＳＦ、例えばＨＳＦ１の発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を同定する高効率の方法を提供する。細胞のストレス応答は、細胞ストレスにより生じる、ＨＳＰ及び／又はＨＳＦ顆粒（例えばＨＳＦ１顆粒）形成、並びに該顆粒の性状に関する、１つ以上の変数、及び特に２つ以上の変数の組み合わせを測定することにより測定され得る。細胞ストレス応答に対応するＨＳＰ又はＨＳＦ顆粒に関連する幾つかの好ましい変数は、以下：顆粒カウント；核発色強度のＣＶ；顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択されてもよい。幾つかの態様において、第一の変数が顆粒カウントであるとき、それは：核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度；及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率から選択される第二の変数と組み合わせて測定される。任意で、追加的な変数を任意の組み合わせで測定する場合もある。
【００６３】
幾つかの態様において、ＨＳＰ発現の推定調節因子は、ポリペプチド配列から構成され、又はこれを含む。他の態様において、該薬剤は、小分子から構成され、又はこれを含む。なおも他の態様において、該薬剤は、核酸部分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組み合わせ等から構成され、又はこれを含む。ある態様において、前記核酸部分は、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはＲＮＡ干渉を誘導する、若しくはｍＲＮＡ等のＲＮＡの転写、プロセシング又は翻訳を制御する他の小核酸分子等の阻害的ＲＮＡであり、又はこれを生産する。
【００６４】
幾つかの態様において、推定調節因子は、細胞をストレスに晒す前の時点で、細胞に投与される。適切な投与期間は、試験される薬剤（細胞応答に作用する速度も考慮される）；試験される細胞の有糸分裂又は他の細胞増殖状態等に依存して、当業者により選択され得る。前処理段階で作用する、又はより良好に作用する、ヒートショック応答等のストレス応答の調節因子は、本発明の予防的治療方法において有用であり得る。細胞は、選択されたストレスに晒される前に、例えば数日乾、数時間、数分間又は数秒間（及びそれ以下）、推定調節因子で前処理される場合がある。推定調節因子は、任意で、ストレス後、及びストレス応答の誘導後、様々な時点で、細胞から除去されてもよい。
【００６５】
本発明の高密度スクリーニング（ＨＣＳ）顆粒アッセイは、前記高効率手法において使用される変数の迅速な定量を、好ましくは自動的に、可能とする。故に、ある態様において、前記ＨＣＳは自動化され、そして合理的かつ迅速な高効率での、大量の化合物のスクリーニングを可能とする。幾つかの態様において、前記ＨＣＳは、１日に約２，０００〜１０，０００種類の化合物のスクリーニングを可能とする。幾つかの態様において、前記ＨＣＳ顆粒アッセイは、高度なイメージングソフトウェアを使用して、複雑なイメージの断片化及び高速でのデータ処理を顕著に改善する。本明細書に例示される態様の一つは、「マスターシャペロン制御因子アッセイ（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ａｓｓａｙ）」あるいは「ＭａＣＲＡ」と称される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ， １３（１０）：９５３−９ （２００８）を参照されたい）。ＭａＣＲＡは、細胞イメージベースのスクリーニングツールで、大量の小分子化合物を迅速かつ定量的にスクリーニングすることで、ＨＳＦ１の活性を調節する潜在的な薬剤候補を同定する。ＨＳＦ１の調節因子は、疾患細胞中に存在する毒性のミスフォールディングしたタンパク質を修復又は分解する分子シャペロンタンパク質のグループ全体をコントロールすることが予想される。幾つかの他の種類のＨＳＦ１調節因子は、癌又は腫瘍細胞のアポトーシス、細胞毒性及び増殖制御に影響をもたらすことが予想される。本明細書中に例示するように、これまでにＭａＣＲＡスクリーニングで同定された化合物の一部を評価したところ、それらは、疾患の細胞培養モデルの細胞保護能力を示した。
【００６６】
本願の方法におけるイメージングソフトウェアの一例として、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＴＡ）モジュールが挙げられ、これは、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度及び核発色強度のＣＶを包括的に記録する、細胞内の顆粒の高速での測定を提供する。他のイメージングシステム及びソフトウェアを、本発明のアッセイ及び方法において使用する場合もある。幾つかの態様において、該イメージングシステム及びソフトウェアは、所定のアッセイにおけるアッセイの条件及び試験された個々の化合物の結果の情報を保存し、該情報は、他の試験化合物との比較情報（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用され得る巨大なデータセットを集積するデータベースに格納される。そして、化合物は、１つのアッセイ又は複数のアッセイの組み合わせにおける成績に従ってタイプ及びサブタイプごとに分類され得て、そのような分類は、後で、構造と機能の関係性の理解に、及び予測的化学及び生物学等に使用される。
【００６７】
幾つかの態様において、本方法、例えばＨＣＳ顆粒アッセイ等は、異なる細胞の１つ以上の異なるストレス条件に対する応答をスクリーニングするのに使用される場合が在る。本発明のいずれかの方法に使用されるストレスは、限定されないが、温度上昇（ヒートショック等）、重金属ストレス（カドミウム等）、化学毒物又は小分子によるストレス（アゼチジン等のアミノ酸類似体、抗炎症薬物、又はアラキドン酸及びその誘導体等）、酸化ストレス、酸素グルコース除去（ＯＧＤ）、及び酸素除去（ＯＤ）から選択されてもよい。幾つかの態様において、前記細胞は、温度上昇ストレスに晒される。他の態様において、前記細胞は、ＯＧＤストレスに晒される。幾つかの態様において、前記細胞は、小胞体（ＥＲ）ストレスに晒される。
【００６８】
化学毒物により引き起こされるストレスにおいて、毒物は、タンパク質合成阻害剤、プロテオソーム阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、ＨＳＰ阻害剤（例えばＨＳＰ９０阻害剤）、炎症誘導剤、トリテルペノイド、ＮＳＡＩＤ、ヒドロキシルアミン誘導体、フラボノイド、及び細胞の呼吸又は代謝の他の阻害剤から選択され得る。幾つかの態様において、前記化学毒物はロテノンである。
【００６９】
適切なタンパク質合成阻害剤として、限定されないが、ピューロマイシン及びアゼチジンが挙げられる。
【００７０】
適切なプロテオソーム阻害剤として、限定されないが、ＭＧ１３２及びラクタシスチンが挙げられる。
【００７１】
適切なセリンプロテアーゼ阻害剤として、限定されないが、ＤＣＩＣ、ＴＰＣＫ及びＴＬＣＫが挙げられる。
【００７２】
適切な炎症誘導剤として、限定されないが、シクロペンテノンプロスタグランジン、アラキドン酸塩及びホスホリパーゼＡ２が挙げられる。
【００７３】
適切なトリテルペノイドとして、限定されないが、セラストロールが挙げられる。
【００７４】
適切なＮＳＡＩＤＳとして、限定されないが、サリチル酸ナトリウム及びインドメタシンが挙げられる。
【００７５】
適切なヒドロキシアミン誘導体として、限定されないが、ビモクロモル、アリモクロモル、及びイロキサナジンが挙げられる。
【００７６】
適切なフラボノイドとして、限定されないが、ケルセチンが挙げられる。
【００７７】
適切な他の阻害剤として、限定されないが、ベンジリデンラクタム化合物、例えばＫＮＫ４３７、並びにＨＳＰ９０阻害剤、例えばラジシコール、ゲルダナマイシン及び１７−ＡＡｇが挙げられる。
【００７８】
幾つかの態様において、細胞ストレスは、温度上昇ストレス（例えば室温を上回る温度）であり、細胞を培養する温度を４７℃未満、例えば４５℃、４３℃又は４２℃未満まで上昇させることを含む。例えば、温度上昇ストレスは、細胞を、約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、又は３９℃から、４２℃、４３℃、又は４５℃直下若しくは未満まで、又は約４２℃、４３℃、又は４５℃以下の温度で培養することを含んでもよい。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約３９℃から、約４３℃若しくは未満までの温度で、例えば約３９℃、４０℃、４１℃、又は４２℃から、約４３℃若しくは未満までの温度で培養することを含む。幾つかの態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約３９℃から、約４２℃若しくは未満までの温度で、例えば約３９℃、４０℃、又は４１℃から、約４２℃若しくは未満までの温度で培養することを含む。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４１℃以下の温度で培養することを含む。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４１℃以下の温度、例えば４１℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４１℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。更なる態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４３℃以下の温度で培養することを含む。他の態様において、前記温度上昇ストレスは、細胞を、約４３℃以下の温度で、例えば４３℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４３℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。
【００７９】
幾つかの態様において、前記方法は、ＨＳＰ発現及びＨＳＦ発現の活性化因子を同定する高効率の方法である。その幾つかの例において、前記細胞ストレスは温度上昇ストレスであり、細胞を、約４１℃以下の温度、例えば４１℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４１℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。その特定の一例において、前記方法は、ＨＳＦ発現、例えばＨＳＦ１発現の活性化因子、及び／又はＨＳＰ発現、例えばＨＳＰ７０発現の活性化因子を同定する高効率の方法であり、該細胞は、約４１℃以下の温度で、又は約４１℃±０．５℃で培養される。
【００８０】
幾つかの態様において、前記方法は、ＨＳＰ発現又はＨＳＦ発現の阻害因子を同定する高効率の方法である。その幾つかの例において、前記細胞ストレスは温度上昇ストレスであり、細胞を、約４３℃以下の温度、例えば４３℃±１．８、１．５、１．２、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．２又は０．１℃、例えば４３℃±０．５℃以下の温度で培養することを含む。その特定の一例において、前記方法は、ＨＳＦ発現、例えばＨＳＦ１発現の阻害因子、及び／又はＨＳＰ発現、例えばＨＳＰ７０発現の阻害因子を同定する高効率の方法であり、該細胞は、約４３℃以下の温度で、又は約４３℃±０．５℃で培養される。
【００８１】
幾つかの例において、本発明の方法のいずれかにより誘導されるヒートショックは、穏和なヒートショックであってもよい。幾つかの態様において、細胞は、前処理、亜致命ストレスで処理される。この細胞の前処理は、細胞に、致命ストレスに対する良好な耐性／適応性を付与する。該前処理ストレスは、亜最大ヒートショック応答に達する程度の強さであってもよい。
【００８２】
幾つかの態様において、温度上昇ストレスの工程は、伝導性の金属、例えばアルミニウム製の、サーモスタットでコントロールするヒートプレートを使用して達成される。このアルミニウムプレートは、実験に使用される適切な器具に適合するように特注される場合があり、そして、適切な温度を維持するように加熱され得る。このアルミニウムプレートは、公知の加熱方法と比較して、良好な熱伝導をもたらすことが出来る。当業者であれば、複数の細胞サンプルの温度を正確にコントロールし得るプレート系を構築するのに、他の金属、固体若しくは半固体材料、又は保温性の液体を使用してもよいと容易に認めるであろう。そのような材料は、本明細書中に記載のアルミニウムプレートの代わりとなる場合もある。
【００８３】
上記のように、本方法において測定される変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度、及び顆粒発色強度のバックグラウンド強度に対する比率から選択される任意の組み合わせであってもよい。幾つかの態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒カウントである。他の態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒面積である。他の態様において、前記変数の組み合わせは、顆粒カウント及び顆粒面積である。他の態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度である。他の態様において、前記変数の組み合わせは、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度のバックグラウンド強度に対する比率である。なおも他の態様において、前記変数の組み合わせは、顆粒カウント及び顆粒発色強度のバックグラウンド強度に対する比率である。幾つかの態様において、前記イメージングされた顆粒は、ＨＳＰ顆粒である。他の態様において前記イメージングされた顆粒は、ＨＳＦ１顆粒等のＨＳＦ顆粒であってもよい。なおも他の態様において、前記イメージングされた顆粒は、ＨＳＰ及びＨＳＦ１顆粒であってもよい。幾つかの例において、所定の顆粒は均一であり、例えば実質的にＨＳＰ又はＨＳＦのいずれかのみから構成される。他の例において、所定の顆粒は負均一であり、例えばＨＳＰ及びＨＳＦの両方、並びに／又は追加的な核成分から構成される。
【００８４】
本発明の高効率の方法は、任意のＨＳＰの発現の調節を測定するのに使用されてもよい。本発明に適したＨＳＰの幾つかの具体例として、限定されないが、ＨＳＰｌ０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１０４及びＨＳＰｌ１０が挙げられる。幾つかの好ましい態様において、本方法に使用されるヒートショックタンパク質は、ＨＳＰ７０である。
【００８５】
本発明の高効率の方法は、癌細胞、神経細胞、又は神経癌細胞等の、様々な異なる種類の細胞を、スクリーニングに利用する場合がある。本高効率の方法に使用される細胞は、不動化細胞、初代細胞（例えば線維芽細胞及び上皮細胞等）、及び／又は形質転換細胞、例えばヒト形質転換細胞株由来のものであってもよい。適切な例として、限定されないが、ＨＯＳ（高二倍体骨肉腫（ｈｙｐｅｒｄｉｐｌｏｉｄ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）細胞株）及びＡ４３１（高四倍体表皮癌細胞株）が挙げられる。
【００８６】
幾つかの態様において、前記神経細胞株は、限定されないが、ＡＣＮ、ＢＥ（２）−Ｃ、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＣＨＰ−２１２、ＣＨＰ−１２６、ＧＩ−ＣＡ−Ｎ、ＧＩ−ＬＩ−Ｎ、ＧＩ−ＭＥ−Ｎ、ＩＭＲ−３２、ＩＭＲ−５、ＫＥＬＬＹ、ＬＡＮ−Ｉ、ＬＡＮ−１８８、ＬＡＮ−５、ＭＨＨ−ＮＢ−Ｉｌ、ＮＢ−１００、ＮＧＭ９６、ＮＧＰ９６、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＩＭＡ、ＳＪ−Ｎ−ＫＰ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−Ｆｌ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、又はＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株から選択される。幾つかの態様において、前記神経細胞株は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株である。
【００８７】
幾つかの態様において、本方法のいずれかに使用される癌細胞株は、限定されないが、癌腫細胞、肉腫細胞、食道癌細胞等から選択される。適切な癌細胞の非限定的な例として、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＤＬＤ−Ｉ、ＤＵ−１４５、Ｈ１２９９、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、Ｋ−５６２、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＯＶＣＡＲ−３、Ｐａｃａ−２、ＰＡＮＣ−Ｉ、ＰＣ−３、Ｓａｏｓ−２、ＳＦ−２６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＷ−４８０、ＳＷ−６２０、ＷＭ−２６６−４、ＨＬ−６０、ＴＥ−２、又はＫ−５６２細胞株が挙げられる。幾つかの態様において、該癌細胞株は、ＨｅＬａ細胞株である。
【００８８】
幾つかの態様において、前記ＨＣＳは自動化され、そして合理的かつ迅速な高効率での、大量の化合物のスクリーニングを可能とする。幾つかの態様において、前記ＨＣＳは、高度なイメージングソフトウェアを使用して、複雑なイメージの断片化及び高速でのデータ処理を顕著に改善する。幾つかの態様において、前記ＨＣＳは、異なる複数のストレス条件をスクリーニングするのに使用され得る。幾つかの態様において、前記異なる複数のストレス条件は、温度、ＯＧＤ、ロテノン、及びＥＲ誘導性ストレス、あるいは他の本明細書に記載のものから選択される。
【００８９】
幾つかの態様において、上記の調節因子同定方法は、更に、１つ以上の公知の第二のアッセイと組み合わされることにより、細胞保護等のより好ましい性質を有する調節因子を提供することが出来る。幾つかの態様において、第二のアッセイは、ＭＧ−１３２アッセイ、又はこれと類似のデータ、例えば細胞保護効果についてのデータを提供する他の多くのアッセイのいずれかである。例えば、Ｓｕｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２００６ ２７ （５）： ８０７； Ｊｕｌｌｉｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ２００６ １１ （４）： ６２７； ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔａ ＥＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４ ３０４： １１５８を参照されたい。
【００９０】
幾つかの態様において、前記第二のアッセイは、ＭＴＳアッセイ、又はこれと類似のデータ、例えば細胞毒性効果についてのデータを提供する他の多くのアッセイのいずれかである。幾つかの態様において、上記調節因子同定方法は、ＭＧ−１３２アッセイ及びＭＴＳアッセイの両方と組み合わせることが出来る。
【００９１】
細胞のベースラインストレスのレベルの調節
幾つかの態様において、前記口腔率の方法における測定工程は、選択された種類のストレスで処理した細胞内のＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現のレベルを測定し、これを該ストレスに晒されていない細胞のＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現のベースラインレベルと比較することにより、ストレス処理に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現の変化を定量的に測定することを含む、幾つかの態様において、ストレス処理に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現は、発現のベースラインレベルを上回るＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現の増大である。他の態様において、ストレス処理に関連するＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現は、発現のベースラインレベルを下回るＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現の減少である。
【００９２】
故に、幾つかの態様において、推定調節因子で処理される細胞のＨＳＦ及び／又はＨＳＰ発現のベースラインレベルは、例えば公知のＨＳＦ及び／又はＨＳＰ調節因子（活性化因子又は阻害因子）で前処理すること等により、それ自体が外部から変化させられ、又は選択させられる。これは、いずれかの方向における相対的に小さな発現の変化が、本発明の方法に従って、推定される細胞ストレス応答調節因子による処理に応じて検出されるために行われる。このＨＳＦ及び／又はＨＳＰ発現のベースラインレベルを外部から変化させ、又は選択する工程は、任意で、試験される各細胞種又は各調節因子において、アッセイの感度、例えばシグナルのノイズ比の増大、及び結果的にアッセイの感度において、微調整が行われる。故に、本発明の幾つかの態様において、ＨＳＰ及び／又はＨＳＦ発現のベースラインは、いずれかの方向における発現の変化がより正確に、又はより迅速に検出されるために外部から変化させられ、アッセイの感度が増大させられる場合がある。
【００９３】
所定の細胞種に適用される軽度又は中程度のレベルの細胞ストレスを選択することにより、例えば、より高い（より低い）レベルの細胞ストレスにおいて試験された細胞に対して同一の工程を実施して一旦失敗した本発明の方法を使用して、上方又は下方調節因子の同定が可能となる場合がある。本発明のアッセイにおけるヒートショック応答の調節因子の同定に使用される細胞ストレスのベースラインレベルの調節は、１つ以上の選択されたストレスで処理された所定の細胞種の用量及び時間に対する応答曲線を作成し、ストレス処理の最適な時間及び用量を決定することにより、ＨＳＦ及び／又はＨＳＰ発現の調節因子（活性化因子又は阻害因子）を選択する能力における増大した、又は最適な感度を達成することにより実現され得る。
【００９４】
装置
幾つかの態様において、本明細書中に記載のヒートショック方法の温度上昇は、プレート、例えばアルミニウムプレート等の金属プレート等を備えた加熱器具により実施され、そして維持される。該プレートは、実験に使用される適切な器具に適合するように特注される場合があり、そして、適切な温度を維持するように加熱され得る。該プレートは、ウォーターバス等の公知の加熱方法と比較して、良好な熱伝導をもたらすことが出来るため、その結果、細胞サンプルに安定的かつ正確なヒートショックを与えることが出来る。
【００９５】
故に、幾つかの例において、本発明は、複数の細胞サンプルにヒートショックを与える装置を含み、該装置は、プレート及び該プレートを温める熱源を備え、ここで該プレートは、該複数の細胞サンプルに均一に熱を伝導させるように配置されている。一つの態様において、前記プレートは金属プレートであり、例えば鉄、銅若しくはアルミニウムプレートであり、特にアルミニウムプレートであり、又は合金であり、例えば鉄、銅又はアルミニウムを含む合金である。他の例において、前記プレートは、ガラス又は他の非金属プレートである。ある態様において、前記プレートは、複数の細胞サンプル中の各細胞サンプルと直接接触する。前記プレートは、前記熱源から各サンプルへの均一な熱の伝導を促進し、ゆえに、該サンプルのそれぞれに均一なヒートショックを誘導する。例えば、前記プレートは、複数のサンプルを含むマルチウェルプレート（９６ウェルプレート又はそれ以上）と連結して使用される場合がある。幾つかの態様において、前記プレートは、前記プレートは、マルチウェルプレートと直接連結、例えば直接接触している場合がある。例えば、前記マルチウェルプレートは、前記プレートの上に載っている場合もある。
【００９６】
診断及び／又は治療のための処置方法に使用される調節因子
幾つかの態様において、本発明の高効率の方法により同定される調節因子は、細胞のストレス応答成分を有する生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候に関する診断方法に有用であり得る。該診断方法を実施するキット及び診断方法が提供される。
【００９７】
本発明において同定されたＨＳＦ及び／又はＨＳＰの調節因子（及び放射活性、蛍光、燐光、核酸、抗体、又はタンパク質ベースタグ等の異種部分を結合させた該調節因子の誘導体）は、細胞又は細胞集団の細胞のストレス状態を診断するのに有用なツールであり得る。加えて、本発明の調節因子をコードする核酸分子（又は本発明の調節因子をコードする他の核酸分子の核酸制御領域と結合し得る核酸分子）が、細胞内の制御因子を発現し、検出し、及び／又はその発現を制御するように設計され得る場合もある。本発明の核酸分子を含むベクター、及び核酸分子又はベクターを含む細胞も、提供される。
【００９８】
他の態様において、本発明の高効率の方法により同定される調節因子は、細胞のストレス応答成分を有する生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候を治療又は予防する方法に有用であり得る。他の態様において、前記口腔率の方法により同定される調節因子は、細胞のストレス応答成分を有する生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候を処置又は予防する医薬を製造するのに使用される。該疾患又は兆候は、ヒト又は非ヒト動物におけるものであってもよい。
【００９９】
幾つかの態様において、前記疾患、症状又は兆候は、心臓血管疾患、血管疾患、脳疾患、アレルギー疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、ウイルス性若しくは細菌性感染症、皮膚疾患、粘膜疾患、表皮疾患、又は尿細管（ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌｉ）の疾患等から選択される。
【０１００】
幾つかの態様において、前記心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、冠状動脈疾患、又は筋緊張亢進及び肺の筋緊張亢進により引き起こされる心臓血管疾患である。
【０１０１】
幾つかの態様において、前記脳疾患は、脳血管虚血、脳卒中、外傷性脳損傷、老年性認知症等の老年性神経変性疾患、ＡＩＤＳ認知症、アルコール性認知症、アルツハイマー症、パーキンソン症又はてんかんである。
【０１０２】
いくつかの態様において、前記皮膚又は粘膜疾患は、皮膚科学的疾患又は消化器系の潰瘍性疾患である。
【０１０３】
幾つかの他の態様において、特にＨＳＦ１／ＨＳＰ調節因子が阻害的である態様において、前記疾患、症状又は兆候は、全体的な、制御される及び／又は目標とされる細胞毒性、アポトーシス又は他の種類の細胞死に関与する。多くの癌、腫瘍、又は異常な増殖又は細胞分裂を呈する他の細胞若しくは細胞種、例えばウイルス感染等により正常な増殖コントロールを損なったもの等の処置が挙げられる。
【０１０４】
例証
本願明細書全体に記載されている請求項に係る発明は、以下の実施例を参照してより速やかに理解され得る。該実施例は、本願請求項に係る発明の幾つかの特徴及び態様を詳述することのみを目的として記載され、限定を意図するものではない。
【０１０５】
マスターシャペロン制御因子アッセイ（ＭａＣＲＡ）
マスターシャペロン制御因子アッセイあるいは「ＭａＣＲＡ」は、細胞内のストレス応答経路の調節因子、例えばＨＳＦ１及びＨＳＰ７０等を同定する、高密度かつ細胞イメージベースのアッセイとして開発された。該ＭａＣＲＡアッセイは、複数の各アッセイ（下記参照）におけるそれらの性能に基づいて、異なるクラスの細胞ストレス応答調節因子化合物を同定することが出来る、高効率のスクリーニング方法に発達している。ＭａＣＲＡアッセイの発達は、細胞内のショック応答経路の異なるパラメーターを認識する一連のアッセイ系がいかにして設計され得るかの一例として、下記に記載される。実施例１では、詳述するとおり、ＨＳＦ１活性化因子を同定するように設計された、スクリーニングにおける高密度かつイメージベースのＨＳＦ／ＨＳＰ顆粒アッセイ、及びＥＣ５０フォーマットの開発を説明する。
【０１０６】
ＨＣＳ顆粒アッセイのヒートショックスクリーニング条件の最適化
ＨＣＳの設定において、アッセイの陽性対照として、公知のＨＳＦ１活性化因子であるセラストロール（Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ＳＤ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００４； ２７９（５３）：５６０５３−６０）が使用された。とりわけ、セラストロールは、ストレス細胞と非ストレス細胞の両方においてＨＳＦ１活性を誘導出来る。故に、セラストロールは、ＨＳＦ１増幅因子として特定される化合物の本発明の定義には適合しない。
【０１０７】
ヒートショックベースのスクリーニングにおいて、２つの技術的問題を克服する必要がある。第一に、ヒートショックの温度及び時間を最適化しなければならない。様々なヒートショック温度及び回復時間が、公知文献中に報告されている（Ｃｏｔｔｏ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９７； １１０ （Ｐｔ ２３）：２９２５−３４；上記Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．）。温度をより高く（例えば４３℃超）すると、ＤＭＳＯ処理サンプルのバックグランドが著しく高くなり、化合物増幅効果のシグナル／ノイズ比率が小さくなる。最適化された条件は、実験的に、約４１℃２時間で回復時間無しが選択され、この条件の下で、充分窓（ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｗｉｎｄｏｗ）は、ＤＭＳＯ溶媒対照（図１Ｂ及びＤ）と比較して、２μＭセラストロール（図１Ａ及びＣ）により誘導されるＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒形成において観察された。
【０１０８】
第二に、一般に、９６ウェル又はそれ以上のウェルプレートフォーマットにおいてヒートショック実験が実施されるとき、各ウェルへの均等な熱の伝導を保証するのは困難である。ヒートショック実験に通常の空気加熱（インキュベーターから）を使用した場合、９６ウェルプレート全体のＨＳＦ１／ＨＳＰ７０の顆粒カウントで観察されるばらつきが大きかった（ＣＶ＞４０％）。高効率ヒートショック手法としては、４５℃のウォーターバスにプレートを浸漬させる方法が報告されているが、この方法は、イメージベースの高密度手法に適しない（Ｚａａｒｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６； ６６（３）： １７８３−９１）。１つの解決策としては、急速熱伝導用の特注アルミニウムプレートを使用することであり、これにより、ＨＳＦ１顆粒カウントにおいて、比較的低いＣＶ（７．９４％）で９６ウェルプレートベースヒートショックを実施出来た。
【０１０９】
ＨＳＦ１／ＨＳＰストレス顆粒の定量及びアッセイの検証
次に、観察された顆粒状粒子の幾つかの画像パラメーターを定量した。Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＴＡ）モジュールにより、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度及び核発色強度ＣＶ（核中のピクセル強度のＣＶを測定する）等の核顆粒の高速測定が可能となる。図２Ａ〜Ｄに記載のように、核カウント及び核発色強度ＣＶは、ＨＳＦ１顆粒の定量に選択された（図２Ａ及び２Ｂ）が、顆粒カウント及び顆粒面積は、ＨＳＰ７０顆粒のシグナルの測定に適用された（図２Ｃ及び２Ｄ）。図２Ａのデータは、ヒートショック（４１℃２時間）により、２μＭのセラストロールに晒されたＨｅＬａ細胞の核１つあたり、（ＭＴＡによる定量では）平均で５．３４±０．７２個のＨＳＦ１ストレス顆粒が誘導されたことを示す。比較対照としたＤＭＳＯ処理細胞では、２．４６±０．２２個の顆粒が誘導されていた。バックグラウンドを相対的に低くするために、化合物処理により誘導されるＨＳＦ１顆粒カウントの閾値として、５を選択した。５つを超える顆粒を含むＨｅＬａ細胞を、「ＨＳＦ１顆粒陽性細胞」と定義した。ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ、ＨＳＰ７０顆粒カウント及びＨＳＰ７０顆粒面積の閾値も、ＤＭＳＯ処理サンプルの平均プラス２又はそれ以上の標準偏差に相当するゲート値（ｇａｔｉｎｇ ｖａｌｕｅ）が選択された。これらの結果は、セラストロール処理ＨｅＬａ細胞が、対照（ＤＭＳＯ）処理細胞と比較して、ＨＳＦ１及び／又はＨＳＦ１陽性顆粒の数（顆粒カウント；図２Ａ及びＣ）、核内のＨＳＦ１陽性顆粒の発色強度（図２Ｂ）、及びＨＳＰ７０陽性顆粒の合計面積（図２Ｄ）における、統計的に顕著な増大を示すものであり、このことから、以上の４つのパラメーターが、単独で、及び好ましくは様々な組み合わせで、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０シグナルの定量、並びに試験化合物又は条件によるそれらの調節の定量に利用出来ることが検証された。
【０１１０】
９６ウェルプレートフォーマットにおける高密度スクリーニング（ＨＣＳ）顆粒アッセイの性能を、陽性対照として２μＭのセラストロールで１時間処理し、その後ヒートショックを与えたサンプルと、陰性対照として０．３３％ＤＭＳＯで処理したサンプルを用いて、評価した。図３に示されるように、実験データは、ＨＳＦ１顆粒アッセイが、広いスクリーニング窓及びＺ’をもたらすことを示している。（Ｚ要素は、高効率素クリーニング（ＨＴＳ）アッセイの性能又は能力の尺度である。Ｚ要素解析は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ２００８； １３（６）：５３８−４３に記載のように実施された）。
【０１１１】
前記最初の高性能スクリーニングから幾つかの陽性のヒットを選択して、実施例１に更に記載されるように、ＨＳＦ１共誘導に対するそれらの用量依存性を試験した。一例として、図４Ａは、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（本ＨＣＳ方法により同定された新規調節因子）のＨＳＦ１発色強度ＣＶのＥＣ５０値を用いた、用量依存性の実験を示す。陽性対照であるセラストロールのＥＣ５０値は、１．３２μＭであった。この結果は、公知の、ＨＳＰ７０．１プロモーター−ルシフェラーゼレポーターをセラストロール活性化ヒートショック応答の特定に使用したときのＨｅＬａ細胞における３μＭのＥＣ５０値と、良好に符合する。Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９（５３）：５６０５３−５６０６０ （２００４）を参照されたい。同様に、図４Ｂは、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａにおける、ＨＳＰ顆粒面積のＥＣ５０値を用いた用量依存性の実験を示す。陽性対照であるセラストロールのＥＣ５０値は、０．６５μＭであった。化合物Ａ及び他のヒットは、セラストロール程強力ではないが、これらのヒットは、構造−活性ベースの研究において良好な出発点を示した。とりわけ、セラストロールと異なり、化合物Ａは、ヒートショックストレスで処理されていない正常細胞においてＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒の形成を刺激又は誘導しない。これは、該化合物（若しくは誘導体化号物）が、シャペロン増幅を仲介する候補薬剤であることを示唆する。
【０１１２】
ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導における化合物Ａ及びセラストロールの動力学を比較するために、実施例１に更に記載されるように、詳細なタイムコース試験（回復時間中６時間まで）を行った（図５も参照されたい）。本実験において使用される濃度は、セラストロール及び化合物Ａにおいてそれぞれ１μＭ及び１０μＭであり、これらは、各化合物のＥＣ５０値に近い。図５は、１０μＭの化合物Ａ又は１μＭのセラストロール（陽性対照）で前処理した後の６時間の回復期間（Ｒ１〜Ｒ６）にかけての、細胞におけるＨＳＦ１誘導の動力学の比較を示す。化合物Ａは、試験された殆どの時点で、セラストロールと類似の誘導挙動を呈した。いずれの化合物も、ヒートショック後６時間にかけてＨＳＦ１ストレス顆粒を活性化しており、これは、それらの化合物が、ＨＳＰを持続的に誘導するＨＳＦ１の活性構造を維持又は安定化している可能性があることを強力に示唆する。ＨＳＰ７０シグナルは、ヒートショック１時間後にピークを有し、そしてヒートショック後６時間まで、相対的に高いレベル（〜２５％陽性染色細胞）を維持していた。ヒートショック１時間後、約３０％〜４０％の細胞が、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ７０＋である。他の細胞は、ＨＳＦ１−ＨＳＰ７０＋（〜３０％）、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ−（〜３０％）及びＨＳＦｌ−ＨＳＰ−（〜１０％）である。ＨＳＰ７０シグナルは、ヒートショック後６時間は、相対的に高レベルである。ＨＳＰ７０が持続的に発現することによって、ミスフォールディングしたタンパク質の保護領域（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）が拡張する。図６は、４８０種類の異なる試験化合物（黒色の菱形）でそれぞれ３０分間処理して、その後４１℃２時間で回復時間無しのヒートショックにかけた、ＨｅＬａ細胞の実験データを示す。陽性対照として２μＭセラストロール（黒色の正方形）で、そして陰性対照としてＤＭＳＯ（黒色の丸）で処理して、対照処理を並行して実施した。多くの試験化合物（黒色の菱形）のＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大パーセント（％）は、２０％以上であった（増大マークの大半が２０％を下回るＤＭＳＯ処理細胞と比較されたい）。この実験は、この実験に使用されたアッセイ条件が、多数の試験化合物のセットから有用なＨＳＦ１調節化合物（ここでは活性化因子）を同定するのに充分な感度であったことを示し、及び、この方法がそのような調節化合物の高効率のスクリーニングに利用可能であることを裏付ける。
【０１１３】
次の問題は、生物学的に関連するモデル系における細胞保護効果をどのように試験するかであった。酸素グルコース除去（ＯＧＤ）は、虚血及び脳卒中のインビトロ系であり、ニューロンの損傷の研究に特に適している。ＯＧＤにより誘導される細胞毒性は、主に、タンパク質のミスフォールディング及び凝集により起こる。海馬ＣＡ１ニューロンにおけるＨＳＰ７０の過剰発現は、タンパク質の凝集を低下させ、ニューロンの生存を顕著に増大させる。Ｇｉｆｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ．， ２０７（Ｐａｒｔ １８）：３２１３−３２２０ （２００４）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．， ２６（７）：９３７− ９５０ （２００６）を参照されたい。ＯＧＤに加えて、パーキンソン症のロテノンモデルは、タンパク質凝集により誘導される細胞毒性の研究用の、他のインビトロ系である。ミトコンドリア阻害剤であるロテノンは、α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の発現を増大させ、やがて、Ｌｅｗｙ小体と類似の細胞質内容物を形成することが報告されている。Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅｌａｔ． Ｄｉｓｏｒｄ．， Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ５９−Ｓ６４ （２００３）を参照されたい。故に、ＨＣＳスクリーニングのヒットの細胞保護効果を評価するために、上記２つのインビトロ細胞アッセイ系のいずれかが利用され得る。以前に報告されたＭＴＳ比色分析アッセイは、様々なストレス処理後の生存細胞の測定のための第二の方法となる。
【０１１４】
前記ＯＧＤアッセイは、実施例２に記載されるように実施された。図７に示すように、２．５μＭの化合物Ａにより前処理した場合、生存ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の９１％の増大が観察され、これは、顕著な細胞保護効果を有していた。とりわけ、通常（ストレス無し）条件下では、化合物Ａで処理したものとＤＭＳＯで処理したものとの間で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率には殆ど差が観察されなかった。ロテノンモデルに関して、１００ｎＭのロテノンを２４時間適用したとき、４２％超のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が死滅した。２．５ｍＭの化合物Ａで前処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＤＭＳＯ対照処理細胞と比較して、細胞生存率が２９％増大した（図８）。
【０１１５】
ヒートショックの温度及び回復の時間等のアッセイのパラメーターを更に最適化する、一連の実験が実施された（実施例４）。ＨＳＦ１顆粒陽性細胞は、温度上昇３９℃（黒色の菱形）又は４１℃（黒色の正方形）２時間、回復時間無しでストレス処理した細胞において、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞を定量した（図９）。図９に示されるように、ヒートショックを４１℃、２時間、回復時間無しで実行した場合、ヒートショックが３９℃の場合と比較して、顕著な数の陽性ヒットが検出された。（１５％陽性細胞カットオフ以上の黒色の正方形のヒットを参照されたい）。図１０のデータは、ヒートショックが４３℃の４つの条件（１時間で回復時間無し、１時間で回復時間２時間、１２時間で回復時間無し、２時間で回復時間２時間）において、ＤＭＳＯ処理サンプル中のＨＳＰ７０顆粒が異なり、ＣＶ値は２５％超も異なり、これは、正確な定量において不十分であることを示す。また、図１０のデータは、試験された全ての条件において、ＤＭＳＯ処理サンプル（陰性対照）において観察されるＨＳＦ１陽性顆粒カウントが、セラストロール処理サンプル（陽性対照）のカウントに近いことを示す。更に、該データは、ヒートショック（４３℃１時間）後に回復時間を与えなかった場合、核あたり平均で６．８３個のＨＳＦ１ストレス顆粒が誘導され、これに対して、２時間の回復時間を与えた場合、核あたり平均で６．３８個のストレス顆粒が誘導されたことを示す。比較すると、陽性対照の値は約６．５６であり、従って、検出窓は、理想より小さかった。図１１は、ＤＭＳＯ処理細胞を、４１℃温度上昇ストレスに２時間晒し、回復時間を与えなかった場合の、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒カウント評価を示す。図１２は、ＤＭＳＯ処理細胞を、４１℃温度上昇ストレスに２時間晒し、回復時間を与えなかった場合の、ＨＳＦ１ ＣＶ核発色強度及びＨＳＰ７０顆粒面積の評価を示す。表１は、細胞を、４１℃温度上昇ストレスに２時間晒し、回復時間を与えなかった場合の、ＨＳＦ１顆粒変数、ＨＳＰ７０顆粒変数、ＨＳＦ１発色強度ＣＶ変数及びＨＳＰ７０顆粒面積のＣＶ値を、表形式でまとめたものである。
【表１】
【０１１６】
本明細書中で報告したＭａＣＲＡ ＨＣＳ顆粒アッセイは、様々なストレス条件下でＨＳＦ１／ＨＳＰ７０を調節（増大又は減少）させられる新規化学物質の直接的な同定を可能とする。従来のウエスタンブロット又は免疫蛍光アッセイと比較して、本ＨＣＳ顆粒アッセイは、以下の点において有利である。
【０１１７】
（１）ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０ストレス顆粒は、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の活性化と大いに関連している。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒の定量は、様々なストレッサーに対する応答におけるＨＳＦ１／ＨＳＰ７０活性の細胞の動力学を測定することが出来る。更に、穏和なストレス条件（４１℃のヒートショック）を利用した場合、化合物スクリーニングにおいて、良好な窓を用いて、改善されたシグナル／バックグラウンドが得られた。この設定は、前記項降雨率の方法においても観察された、誘導活性が弱いヒットの同定も可能とした。
【０１１８】
（２）ＨＣＳと連動して使用される最新のソフトウエアシステムは、複雑なイメージの断片化、細胞のソーティング及び解析、顆粒カウント／面積の計算、高速でのデータ処理等のための、顕著に改善されたプラットフォームを形成する。加えて、ＨＣＳは、化合物評価における、多くの他の表現形質のパラメーターを提示する。例えば、比較対象は、細胞ストレス、例えばヒートショック処理の存在下又は非存在下での、化合物により誘導される核の形態の変化（ＤＡＰＩ染色）の相異であってもよく、これは、細胞毒性の予測に特に有益な場合がある。
【０１１９】
（３）自動的であるというＨＣＳの特徴から、より高レベルな効率で、巨大な化合物ライブラリーのスクリーニングが可能となる。
【０１２０】
（４）ＨＣＳアッセイの多重化した特性から、込み入った生物学的経路を個別に分離する（ｔｅａｓｉｎｇ ａｐａｒｔ）のに特に有用な場合があり、潜在的な標的及びバイオマーカーを迅速に同定する有益なツールを提供する。ヒートショックベースのＨＣＳにおける主要な技術上の障害は、更に高効率のフォーマット（３８４ウェルあるいはそれ以上）でのヒートショック操作の制御である。この目的を達成するために、合理化され、かつ高速化されたデータ処理能力が発達し、これにより、３８４ウェル以上のフォーマットで、本明細書に記載のＨＣＳアッセイを行うことが可能となった（下記参照）。
【０１２１】
細胞保護及び細胞毒性−第二のアッセイ
ＨＳＰ７０の誘導において見られる効果が細胞保護に転化され得るか否かを判定するための１つ以上の第二のアッセイにおいて、ＭＴＳ細胞毒性アッセイが使用された。該アッセイは、本質的には、既に記載されたものと同様に実行された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ２００８； １３（６）：５３８−４３；実施例５を参照されたい）。このＭＴＳアッセイは、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０スクリーニングで同定された調節因子が細胞において細胞毒性を誘導するか否かを判定するための第二のアッセイに使用される場合もある（下記図１７Ａ及び１７Ｅも参照されたい）。
【０１２２】
ＭａＣＲＡ ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイのスクリーニングでヒットした化合物が、ツニカマイシン処理により誘導される小胞体（ＥＲ）系に対するストレスから細胞を保護出来るか否かが試験された。図１３に示されるように、最終濃度１０μＭの化合物Ｂが、ツニカマイシン誘導ＥＲストレスアッセイにおける様々な時点で、ＰＣ１２培養細胞に添加され、そして、実施例６に記載されるように、生存細胞を測定した。このデータは、ツニカマイシン処理の前に、又は処理中、そしてツニカマイシン処理後２４時間であっても、化合物Ｂで処理することにより、細胞が、ツニカマイシン誘導性のストレスから、顕著に保護されたことを示す。
【０１２３】
ＨＤＦ１ストレス誘導因子から区別されたシャペロンＨＳＦ１共誘導因子
図１４は、セラストロール（陽性対照）及び化合物Ａ（上記で挙げた新しくＭａＣＲＡで選択された調節因子）の濃度の増大に対する、非ストレス細胞（ここでは、３７℃で培養された非ヒートショック細胞）中のＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大パーセントを比較する実験の結果を示す。図１４に示されるように、セラストロール（陽性対照）とは対照的に、化合物Ａは、非ストレス細胞において、ヒートショック応答（ＨＳＦ１顆粒）を刺激しない。故に、化合物Ａは、セラストロールのようなストレス誘導因子ではなく、ＨＳＦ１共誘導因子、及び細胞ストレス応答の共誘導因子に分類され、本発明のＭａＣＲＡプラットフォーム及び関連する方法並びにアッセイは、この共誘導因子化合物のクラスの他のメンバーを同定するのに使用される場合もある（下記を参照されたい）。
【０１２４】
ＭａＣＲＡでヒットした化合物の作用はＨＳＰ９０の阻害を介しない
次に、ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットした化合物の幾つかの選択されたものがＨＳＰ９０を阻害するか否か、即ち、それらの化合物がネガティブフィードバックを起こすことによりＨＳＦ１発現を阻害し、これによりＨＳＦ１の間接的な調節因子となることが予想され得るか否かが試験された。ＨＳＰ９０（ＡＴＰアーゼ）の活性は、実施例８の方法に従い測定された。図１５に示すように、上記のＭａＣＲＡスクリーニングでヒットしたものとして同定された様々な化合物は、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を有意に阻害しない。従って、これらの化合物は、ＨＳＰ９０の阻害に関係しない新規のメカニズムを介して、ＨＳＦ１を調節している。
【０１２５】
ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋共誘導因子を同定するスクリーニングの方策
図１６は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイを第一のアッセイとして、そして細胞保護及び細胞毒性をそれぞれ同定するためのＭＧ−１３２及びＭＴＳアッセイを第二のアッセイとして使用する、リード開発用化合物をスクリーニングする方策の模式図である。上記で詳述した実験に基づいて、上記３つのアッセイを並行して行い、４０００の化合物ライブラリーの中から、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋共誘導因子をスクリーニングした。ＭＧ−１３２アッセイにおいて、細胞をプロテオソーム阻害剤で処理して、細胞質タンパク質のミスフォールディング（細胞ストレス及び細胞死を引き起こす）を誘導する。化合物は、処理を受けた細胞が、プロテオソーム阻害剤誘導性の細胞死を免れて生存するパーセントの増大においてスクリーニングされた（実施例５を参照されたい）。ＭＴＳアッセイは、正常細胞に対して一般的に毒性である化合物をスクリーニングする（そして排除する）のに使用された（実施例５を参照されたい）。
【０１２６】
図１７Ａは、Ｘ軸にＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大パーセント（ＨＳＦ１顆粒カウントの測定による）、Ｙ軸にＭＧ−１３２アッセイにおける生存細胞の増大パーセント、そしてＺ軸にＭＴＳアッセイにおける生存細胞の阻害パーセントを示す、４，０００化合物のスクリーニングから得た、データの集合を表す。各球体のサイズ及び濃淡は、それぞれ、ＨＳＰ７０及びＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。従って、より暗く大きな球体はＨＳＦ１＋かつＨＳＰ７０＋の化合物であり、原点により近いものと比較して、Ｙ軸に沿うものはＭＧ−１３２アッセイにおける細胞生存（細胞保護）に優れ；そしてＺ軸に沿うものは、ＭＴＳアッセイにおける生存（細胞毒性）に優れている。そのような多元的解析を使用するデータのソーティング又はビニングにより、並行したアッセイから得たデータを、関心のある（本明細書ではＨＳＦ１共誘導因子）調節化合物を同定するために迅速に使用することが可能となる。これらの、及び類似の多元的解析は、任意の数のアッセイからのデータを表示するのに使用される場合もある。該データは、化合物のスクリーニング及び選択において将来使用するために、及び比較及び予測のために、データベースに保存される場合もある。
【０１２７】
図１７Ａの多元的データは、個々のアッセイで得たデータが分離される。図１７Ｂは、ＨＳＦ１顆粒スクリーニング（４０００化合物；Ｒ０＝ヒートショック後の回復時間が０時間）で得られたデータを表し、Ｙ軸が、ＨＳＦ１陽性顆粒の増大を示す。正方形の濃淡は、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞に対応する。このスクリーニングにおける閾値として、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞の２０％の増大が使用された。正方形の影は、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞に対応する。つまり、閾値２０％を超える暗い正方形は、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ７＋のヒットである。図１７Ｃは、ＨＳＰ７０顆粒陽性細胞における、３０％の閾値を設けたＨＳＰ７０顆粒アッセイ（４０００化合物；Ｒ２＝ヒートショック後の回復時間が２時間）で得られたデータを表す。正方形の影は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。つまり、閾値３０％を超える暗い正方形は、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ７＋のヒットである。図１７Ｄは、生存細胞の増大パーセント（ＤＭＳＯとの比較）において３０％の閾値を設けたＭＧ−１３２アッセイで得られたデータを図示する。正方形の濃淡は、ＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。
【０１２８】
最後に、図１７Ｅは、ＭＧ−１３２アッセイ及びＭＴＳアッセイの第二のデータの組み合わせを表す。上記と同様に、球体のサイズ及び濃淡は、それぞれＨＳＰ７０及びＨＳＦ１顆粒陽性細胞に対応する。関心の在る化合物は、ＭＧ−１３２アッセイにおいて約３０％以上の細胞保護の増大を示し、そしてＭＴＳアッセイにおいて、約２０％を超える細胞毒性の阻害（生存細胞の増大等）を示すものとして選択された。
【０１２９】
表３〜５は、本発明の方法に係る第一及び第二のアッセイにおいて同定した化合物を選択して、それらの化合物を、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋（Ａ）、ＨＳＦｌ−ＨＳＰ＋（Ｂ）及びＨＳＦｌ−ＨＳＰ−（Ｃ）のカテゴリーに分けたものを示している。重要なことに、本明細書に記載のアッセイ及びデータ解析用の方法は、第四の可能なカテゴリー、即ちＨＳＦｌ−ＨＳＰ７０＋に当てはまる化合物が一つもヒットしない。このことから、本発明のスクリーニング及びアッセイの方法（例えばＭａＣＲＡ）がＨＳＦ１依存的であり、そしてＨＳＦ１が直接的な分子標的であることが確認される。
【表２】
【表３】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【０１３０】
上記実験は、実験条件を最適化し、そしてデータのソーティングを実証するために、９６ウェルフォーマットで実施された。次に、化合物は、より高効率（３８４ウェルフォーマット）で、対照としてセラストロールを使用して行われ、３８４ウェルフォーマットにおいてＭａＣＲＡプラットフォームがどの程度高効率であるかが確認された（実施例１０）。図１８は、３８４ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、ＤＭＳＯ（黒い菱形）及びセラストロール（黒い正方形）で前処理し、続いて４１℃で２時間ヒートショックを与え、回復時間無しで、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価した結果を示す。このデータは、９６ウェルフォーマットで定めた全てのスクリーニングの基準が、ＭａＣＲＡを３８４ウェルフォーマットにスケールアップした場合にも適用されることを示す（Ｚ’＝０．５５、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）＝６．７３、及びＣＶ＝０．１３）。
【０１３１】
ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットしたＨＳＦ１＋化合物は、ＨＳＦ依存的である
上記ＭａＣＲＡで同定されたＨＳＦ１活性化化合物が実際に直接ＨＳＦ１を通じて作用していることを立証するため、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ノックダウン実験を行い、ＨＳＦ１特異的なｓｉＲＮＡ投与により細胞内のＨＳＦ１発現レベルを直接低下させたときの該化合物の効果を、非特異的対照ＲＮＡ投与の場合と比較して観察した（実施例１１）。図１９は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ又はトランスフェクション対照を４８時間トランスフェクションしてｓｉＲＮＡ処理し、続いて４３℃で２時間ヒートショックを加え、回復時間無しの、又はヒートショック処理しないＨｅＬａ細胞における、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０タンパク質発現（ローディング対照にＧＡＰＤＨタンパク質発現）のウェスタンブロットを示す。これらの条件下で、対照のレベルに対し、ＨＳＦ１発現が約８０〜９０％低下し、及びＨＳＰ７０発現が約５０％低下した。
【０１３２】
図２０は、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクションし、続いて２５μＭの化合物Ｂ（ＣＹＴ４９２）又はＤＭＳＯ対照で処理した後、４１℃で２時間ヒートショックした、又はしていないＨｅＬａ細胞における、ＨＳＦ１陽性顆粒形成に対するＨＳＦ１ノックダウンの効果を図示している。顆粒形成は、対照（スクランブル）ｓｉＲＮＡ処理細胞において認められるが、ＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ特異的ｓｉＲＮＡ処理細胞においては認められない。これは、ＨＳＦ１陽性顆粒形成が、細胞内のＨＳＦ１発現に直接依存していることを示す。上記ｓｉＲＮＡ処理が処理された細胞を単純に死滅させるものではないことを示すために、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル（標的無し）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の細胞カウントを測定した（図２１）。この実験により、ＨｅＬａ細胞において、ＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、非特異的細胞死を引き起こさないことが確認された。
【０１３３】
表５は、ＨＳＦ１の共誘導因子（増幅因子）としても同定されたＨＳＦ１＋ＨＳＰ７０＋カテゴリーの９個の独立したヒットを使用して、そのようなｓｉＲＮＡノックダウン実験を行って得たデータをまとめたものを示す。表５に示されるように、各化合物が、ＨＳＦ１依存的活性化因子である。
【表５】
【０１３４】
次に、ＭａＣＲＡにより選択された化合物は、ｓｉＲＮＡノックダウン実験において試験され、続いて第二の機能的実験（ＭＴＳ及びＭＧ−１３２アッセイ、実施例５参照）に付された。図２２Ａ〜Ｂは、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）を４８時間（Ａ）、及び７２時間（Ｂ）トランスフェクションした、ＭＧ−１３２に使用されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＨＳＦ１のｓｉＲＮＡノックダウン、及び対応するウエスタンブロットを図示している。図２２Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡと比較しての、１０、２５及び５０ｎＭのＨＳＦ１特異的ｓｉＲＮＡを用いて４８時間かけてＨＳＦ１をノックダウンした後の、ＨＳＰ７０の発現に対する効果を図示するウエスタンブロットを示す。ここで、ＨＳＦ１ノックダウンは、ＨｅＬａ細胞において見られた（上記）よりも有効ではなかった。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡノックダウンでは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、ＨＳＦ１の約７０％、そしてＨＳＰ７０の約６０％をノックダウンした。とは言え、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において達成されたノックダウンレベルは、ＭＧ−１３２アッセイにおいて、ヒット化合物が直接ＨＳＦ１を介して作用するか否かを試験するのに充分である。
【０１３５】
図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（Ａ）、ＣＹＴ２２４４（Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（Ｄ）のいずれかの化合物で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理したときの、ＭＧ−１３２アッセイにおけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。これらの４つの試験は、ＨＳＦ１依存的細胞保護を示した。ＨＳＦ１のレベルをｓｉＲＮＡノックダウンにより低下させたとき、ＭＧ−１３２アッセイにおいて細胞保護が約１０〜２０％低下した。
【０１３６】
ＨＳＦ１顆粒アッセイを使用しての細胞ストレス応答の阻害因子の同定
ＨＳＦ１阻害因子の同定は、それらが、例えば癌治療等において、及び標的を定めた、又は制御された細胞死の方法等において、細胞の増殖の阻害に関する処置に使用され得る点で、望ましい場合がある。トリプトリドは、癌治療用の公知のＨＳＦ１阻害剤である。例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００７） ６７， ９４０７； Ｗｅｓｔｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００６） ２８１， ９６１６； Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２００７； １３０（６）： １００５−１８を参照されたい。しかしながら、現在までに、ＨＳＦ１阻害候補化合物をスクリーニング及び選択する、定量的かつ高効率な方法は、確実に報告されていなかった。ＨＳＦ１阻害化合物（細胞内のＨＳＦ１活性を低下させる調節因子）の選択用にＭａＣＲＡフォーマットを調整するために、上記ＨＳＦ１顆粒アッセイ及び第二のアッセイにおける陽性対照として、トリプトリドを使用した。従って、トリプトリドの量を増大させることによるＨＳＦ１顆粒形成の阻害は、４３℃で、４つの異なる処理時間で、回復時間無しで試験された（実施例１２）。ＨＳＦ１阻害因子の選択において、４３℃で回復時間無しがより良好な検出感度となることが観察された（活性化因子の選択において４１℃のヒートショックがより良好な検出感度となるのとは対照的である）。
【０１３７】
図２４は、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭのトリプトリドで処理し、その後４３℃で１、２、３又は４時間ヒートショックしたＨｅＬａ細胞における、用量依存的なＨＳＦ１顆粒形成の阻害を図示したものである。顆粒５個／核を閾値として、顆粒カウントを測定した。本明細書に記載のＭｅＣＲＡ法を使用して選択された様々な化合物の効果の試験に、同様のアッセイ条件が使用された。図２５Ａ〜Ｄは、１μＭトリプトリド（黒色の菱形）、１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、１０μＭのＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、又は１０μＭのＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理し、１、２、３又は４時間ヒートショックを与え、０、５及び７時間の回復時間を設けたＨｅＬａ細胞における、ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値として使用しての、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１３８】
上記データに基づき、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の阻害における以下の４つの条件を、ＭａＣＲＡプラットフォームにおけるフォローアップ試験に選択した：（１）ＨＳＦ１阻害において４３℃で２時間、Ｒ０（図２６Ａ）；（２）ＨＳＦ１阻害において４３℃で４時間、Ｒ４（図２６Ｂ）；（３）ＨＳＰ７０阻害において４３℃で２時間、Ｒ４（図２６Ｃ）；（４）ＨＳＰ７０阻害において４３℃で４時間、Ｒ４（図２６Ｄ）。陽性対照として、１μＭトリプトリド及び１０μＭ ＣＹＴ１５６３を使用した。
【０１３９】
これらの実験のデータを下記表６にまとめ、トリプトリド及びＣＹＴ１５６３について計算したＺ’を併記する。ＣＶＹ１５６３のＺ’は、４３℃で４時間、Ｒ４のＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒アッセイにおいて良好（Ｚ’＞０．５でロボット的（ｒｏｂｏｔｉｃ）と見做される）であるから、この条件は、更にＨＳＦ１／ＨＳＰ７０阻害因子スクリーニングに選択された。
【０１４０】
表６
＊４３℃で４時間、回復時間４時間（Ｒ４）が、更なるＨＳＦ１及びＨＳＰ７０阻害因子スクリーニング用の最適の条件として選択された。
【表６】
【０１４１】
次の工程において、ＭａＣＲＡベースのＨＳＦ１／ＨＳＰ阻害因子スクリーニングアッセイは、９６ウェルから３８４ウェルにスケールアップされ、上記の最適条件が使用された（実施例１４）。この実験において、上記ＨＳＦ１共誘導因子同定に使用されたのと類似のデータビニングの方策が採用されたが、本方策は、細胞ストレスの非存在下で阻害活性を有しない化合物ではなく、細胞ストレス（即ちヒートショック）に応じてＨＳＦ１特異的な阻害活性を示す化合物が探索された。図２７は、３８４ウェル中で、ＤＭＳＯのみ（黒色の菱形）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）（黒色の正方形）で処理し、続いて４３℃で２時間ヒートショックして、回復時間無しのＨｅＬａ細胞を、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して評価したものを示す。ＣＹＴ１５６３のＺ’は０．６５、シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比率は１１．２５、そしてＣＶは１２％であった。
【０１４２】
当業者は、上記アッセイ及びデータビニングの方策が、具体的な条件に適合するように変更させられる場合があることを認識し得る。一般に、前記パラメーターは、具体的な細胞、化合物及びアッセイ条件に基づいて、スクリーニングを最適化するために、個別に、及びに一緒に変化させられる。前述の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、限定を意図しない。当業者は、前述の一般的な開示の範囲内で、本発明の追加的な態様が補足されることを認識し得て、そして下記非限定的な実施例は、いかなる形でも権利放棄（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を意図しない。
【実施例】
【０１４３】
実施例１：ＨＳＦ１／ＨＳＰストレス顆粒の定量及びアッセイの検証
本実施例は、ＨＳＦ１活性化因子をスクリーニングするための、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０高密度スクリーニング（ＨＣＳ）アッセイの開発に関する。ＨｅＬａ細胞を化合物（セラストロール）で１時間前処理し、２時間ヒートショックをかけた。希釈はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で２００倍になるように行われ、最終的なスクリーニング用の濃度は３０μＭとなった。熱伝導をより良好にするために特注のアルミニウムプレートが設計され、これにより、９６ウェルプレートにおいて定常的な温度及び最小のばらつきが達成された。該アルミニウムプレートは、実験前日に４１℃のインキュベーターに置かれた。
【０１４４】
ＨｅＬａ細胞中のＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の免疫組織化学的染色は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．， １３（６）：５３８−５４３， ２００８にあるように実施された。プレートの移動を自動化するために、Ｔｗｉｓｔｅｒ ＩＩ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）と一体化したＩＮｃｅｌｌ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、画像取得が実施された。画像解析は、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ３．６のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用して遂行された。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒カウント、顆粒面積及び核発色強度ＣＶのアルゴリズムは、アッセイ条件及び使用説明書に従い設計した。ＥＣ５０値及び曲線の当てはめは、Ｐｒｉｓｍ ４．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び非線形回帰解析を使用して実施された。セラストロール（２μＭ）誘導性の顆粒形成は、処理群において観察された（図１Ａ及び１Ｃ）が、ＤＭＳＯ溶媒処理対照細胞では観察されなかった（図１Ｂ及び１Ｄ）。
【０１４５】
Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ （ＭＴＡ）モジュールは、顆粒カウント、顆粒面積、顆粒発色強度及び核発色強度ＣＶ（核内のピクセル強度のＣＶ）等の、核顆粒の高速の測定を提供する。図２Ａ及び２Ｂは、顆粒カウント及び核発色強度ＣＶを通じての、ＨＳＦ１変数の定量を提供する。図２Ｃ及び２Ｄは、ＨＳＰ７０顆粒の定量に、顆粒カウント及び顆粒面積を採用したものである。
【０１４６】
図２Ａは、ＭＴＡにより定量されたように、ヒートショック（４１℃２時間）が、２μＭのセラストロールに晒されたＨｅＬａ細胞において、核あたり平均で５．３４±０．７２個のＨＳＦ１ストレス顆粒を誘導した。比較対照としたＤＭＳＯ処理細胞では、２．４６±０．２２個の顆粒が誘導されていた。バックグラウンドを相対的に低くするために、５つを超える顆粒を含むＨｅＬａ細胞を、「ＨＳＦ１顆粒陽性細胞」と定義した。ＨＳＦ１核発色強度ＣＶ、ＨＳＰ７０顆粒カウント及びＨＳＰ７０顆粒面積の閾値も、ＤＭＳＯ処理サンプルの平均プラス２又はそれ以上の標準偏差に相当するゲート値が選択された（図２Ｂ〜Ｄ）。
【０１４７】
更に、ＨＣＳ顆粒アッセイは、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ液体操作システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）を用いた自動高効率オペレーションにおいて検証された。２０枚のＨＣＳアッセイプレートから取ったセラストロール処理サンプルを集めてＺ’値を計算すると０．６２であり、これは、ロボット的アッセイを実施するのに妥当であることを示している。Ｓｃｉｃｌｏｎｅ ＡＬＨ３０００におけるＨＣＳ顆粒アッセイの性能の評価では、ＨＳＦ１顆粒カウントを使用して、図３に示す第一のスクリーニングデータが得られた。ＨＳＦ１顆粒陽性細胞は、狭いＣＶ（７．９４％）で平均５９．３６％±４．７１％であり、これに対してＤＭＳＯ対照は、８．１７％±２．００％であった。セラストロールのシグナル対ノイズ比は７．１３で、これは、４１℃でヒートショックを行ったとき、アッセイ窓が顕著に改善される（４３℃との比較、データ無し）ことを示唆する。
【０１４８】
図４Ａ及び４Ｂは、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０を誘導するセラストロール及び化合物ＡのＥＣ５０値を提供する。ＨＳＦ１のＥＣ５０を決定する際に使用された閾値は核発色強度ＣＶで、一方ＨＳＰ７０のＥＣ５０を決定する際に使用された閾値は合計顆粒面積であった。
【０１４９】
ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導における化合物Ａ及びセラストロールの動力学を比較するために、図５に図示されるように、詳細なタイムコース試験（回復時間中６時間まで）を行った。本実験において使用される濃度は、セラストロール及び化合物Ａにおいてそれぞれ１μＭ及び１０μＭであり、これらは、各化合物のＥＣ５０値に近い。化合物Ａは、試験された殆どの時点で、セラストロールと類似の誘導挙動を呈した。いずれの化合物も、ヒートショック後６時間にかけてＨＳＦ１ストレス顆粒を活性化しており、これは、それらの化合物が、ＨＳＰを持続的に誘導するＨＳＦ１の活性構造を維持又は安定化している可能性があることを強力に示唆する。ＨＳＰ７０シグナルは、ヒートショック１時間後にピークを有し、そしてヒートショック後６時間まで、相対的に高いレベル（〜２５％陽性染色細胞）を維持していた。ＨＳＰ７０が持続的に発現することによって、ミスフォールディングしたタンパク質の保護領域（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）が拡張する。
【０１５０】
実施例２：ＯＧＤストレスにおける、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０応答でのスクリーニングでヒットした化合物の評価
これらの実験において、前記ＭａＣＲＡ ＨＳＦ１活性化因子のスクリーニングでヒットした化合物を、試験化合物のＳＨＳＹ５Ｙ細胞に対する細胞保護効果を測るための、第二の酸素グルコース除去（ＯＧＤ）アッセイにおいて試験する。コラーゲンＩでプレコートした９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に、２５０００細胞／ウェルの密度でＳＨＳＹ５Ｙ細胞をプレーティングし、完全培地（Ｎｅｕｒａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で１６〜２４時間培養した。ＯＧＤの誘導において、細胞を、グルコース又は血清を含まない、予め酸素を除去した培地で２回洗浄した。所望の濃度の選択された化合物をストレスの１時間前に添加し、そしてプレートを、モジュラーインキュベーターチャンバー中に置いた（Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ， Ｄｅｌ Ｍａｒ， ＣＡ）。該チャンバーを、室温の９５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２のガス混合物で、１０Ｌ／分の流速で３０分間還流した。特殊なＯ２電極を使用して残留酸素（Ｏ２）濃度がモニタリングされ、最終的な酸素濃度は１％未満であった。還流の後、チャンバーを密封し、そして３７℃のインキュベーター中で２８時間維持した。ＯＧＤ実験の後、酸素欠乏又は低酸素症の指標である、ＨＩＦ１αの誘導を確認するために、免疫染色が実施された。全ての液体操作手順はＳｃｉｃｌｏｎｅ ＡＬＨ３０００ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）を使用して行われ、良好な再現性が達成された。細胞の生存率は、ＭＴＳアッセイ（下記）を使用して測定された。ＯＧＤ実験は、図７に記載されるように、ＤＭＳＯ（対照）使用と比較して、化合物Ａで処理された細胞において、顕著な細胞保護効果が認められることを示した。
【０１５１】
実施例３：ロテノンモデルにおける、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０応答でのスクリーニングでヒットした化合物の発展（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
この実験において、前記ＭａＣＲＡ ＨＳＦ１活性化因子のスクリーニングでヒットした化合物を、試験化合物のＳＨＳＹ５Ｙ細胞に対する細胞保護効果を測るための、第二のロテノンアッセイにおいて試験する。パーキンソン症のロテノンモデルは、タンパク質凝集により誘導される細胞毒性を研究するためのインビトロ系である。ミトコンドリア阻害剤であるロテノンは、α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の発現を増大させ、やがて、Ｌｅｗｙ小体と類似の細胞質内容物を形成することが報告されている。Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅｌａｔ． Ｄｉｓｏｒｄ．， Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ５９−Ｓ６４ （２００３）を参照されたい。故に、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０ ＭａＣＲＡスクリーニングのヒットの細胞保護効果を評価するために、このインビトロ系が採用され、Ｓｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２３（３４）：１０７５６−１０７６４， ２００３に本質的に記載されるように実行される場合がある。このデータは、１００ｎＭのロテノンで２４時間処理すると、４２％を超えるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が死滅することを示す。しかしながら、２．５μＭの化合物Ａで前処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率は、ＤＭＳＯ対照処理細胞と比較して、２９％増大した。要するに、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０スクリーニングで同定された小分子ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０増幅因子は、恐らくＨＳＦ１／ＨＳＰ７０増幅のメカニズムを通じての、細胞保護の効能により、２つの異なるストレス条件から、細胞を救済することが出来る。
【０１５２】
実施例４：亜最大加熱ストレス条件でのＭａＣＲＡアッセイの開発
実験１：これらの実験は、ヒートショックの温度や回復時間等のアッセイのパラメーターを最適化するために実施された。ＨｅＬａ細胞は、アッセイ評価用の９６ウェルプレート中で、０．３３％ＤＭＳＯにより処理された（実施例４、下記実験３参照）。該サンプルに、３９℃、２時間、回復時間無しでヒートショックを行い、そして別のサンプルの群（９６ウェルプレート）に、４１℃、２時間、回復時間無しでヒートショックを行った。セラストロールを陽性対照とした。図９に示すように、ヒートショックが４１℃、２時間、回復時間無しで行われたとき、３９℃のヒートショックの場合と比較して、多くの陽性のヒットが検出された。
【０１５３】
実験２：ＨｅＬａ細胞を０．３３％ＤＭＳＯで前処理し、そして該サンプルを、以下の：（１）４３℃、２時間、回復時間２時間；（２）４３℃、２時間、回復時間無し；（３）４３℃、１時間、回復時間無し；及び（４）４３℃、１時間、回復時間２時間；のいずれかのヒートショック条件で処理した。図１０に示すように、ＨＳＰ７０のＣＶ値は２５％を超え、これは定量に適しない。また、このデータは、ヒートショック（４３℃、１時間）により、回復時間無しでは平均で核あたり６．８３個のＨＳＦ１ストレス顆粒を誘導し一方、２時間の回復時間を設けた場合、誘導されたＨＳＦ１ストレス顆粒は平均で核あたり６．３８個であったことを示す。ＤＭＳＯ処理サンプルにおける両方のＨＳＦ１ストレス顆粒カウントの値は、陽性対照処理サンプルのものに非常に近く（６．５６）、ゆえに、４３℃で１又は２時間、回復時間有り又は無しのヒートショック条件は、化合物のスクリーニングに最適の条件ではない。
【０１５４】
実験３：ＨｅＬａ細胞を８０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）に播種し、化合物処理の前に約１６〜２４時間培養した。続いて、該細胞をＤＭＳＯで処理した。ＤＭＥＭ中での化合物の全体の希釈は２００倍であり、最終的なスクリーニング用の濃度は３０μＭとなり、そしてこれを、ＥＣ５Ｏ決定のために、１０μＭ〜０．１μＭの濃度範囲内で連続希釈した（アッセイポイントを１０個設けた）（ＤＭＳＯの最終濃度は０．３％ｖ／ｖ）。ヒートショックは、４１℃、２時間、回復時間無しで実行された。ヒートショックの直後、５０μＬの１６％パラホルムアルデヒドを培養培地と混合（合計体積１５０μＬ）して、最終濃度を４％とした。プレートを室温で３０分インキュベートして、そしてＰＢＳで洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ＯＯのＰＢＳ溶液で３０分間処理して、細胞膜を易透化（Ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートに室温で５％ＦＢＳ／ＰＢＳを８０μＬ添加して、１時間置いた。抗体染色のために、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００に希釈した抗ＨＳＦ１及び抗ＨＳＰ抗体をプレートに添加した。プレートを、室温で２時間、又は４℃で一昼夜インキュベーションした。最後に、プレートに、ＦＩＴＣ又はローダミンでラベルした二次抗体及びＤＡＰＩの混合物を、それぞれ最終濃度が１：５０００（ＤＡＰＩ、５ｍｇ／ｍＬ）、１：５００（ＦＩＴＣ／ローダミンラベル抗ウサギ二次抗体）となるように添加した。室温で１時間置いた後、プレートをＰＢＳで洗浄して、４℃で保存した。
【０１５５】
プレートの移動を自動化するために、Ｔｗｉｓｔｅｒ ＩＩ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）と一体化したＩＮｃｅｌｌ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、画像取得及び解析が実施された。画像取得の設定は、以前記載（２０）したように、ＤＡＰＩにおいて５００ｍｓ、ＦＩＴＣ又はローダミンにおいて１００ｍｓで、ウェルあたり３回撮像した。画像解析は、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ３．６のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用して実施された。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒カウント、顆粒面積及び核発色強度ＣＶにおけるアルゴリズムは、アッセイ条件及び使用説明書に従い設計及び最適化された。ＥＣ５０値及び曲線の当てはめは、Ｐｒｉｓｍ ４．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び非線形回帰解析を使用して実施された。
【０１５６】
そして、陽性染色細胞は、顆粒カウントアッセイを使用して決定された。図１１は、本実験における、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０顆粒カウントの評価を示す。
【０１５７】
実験４：９６ウェルフォーマットのＨｅＬａ細胞（上記実施例３参照）を０．３３ＤＭＳＯで前処理し、そして４１℃２時間、回復時間無しでヒートショックを行った。そして、陽性染色ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０細胞を、顆粒発色強度ＣＶ及び顆粒面積を使用して測定した。図１２に、この実験の結果を示す。また、表１は、このデータを表形式でまとめたものであり、４１℃２時間、回復時間無しで温度上昇ストレスに晒したときの、ＨＳＦ１顆粒の変数、ＨＳＰ７０顆粒の変数、ＨＳＦ１発色強度ＣＶの変数におけるＣＶ値を示している。
【０１５８】
実施例５：細胞保護及び細胞毒性−第二のアッセイ
これらの実験は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導において見られる効果が細胞保護に転化され得るか否かを判定するために実行された。ＷＥＨＩ又はＨＥＫ２９３細胞を１５０００細胞／ウェルの密度で培養し、これをスクリーニング化合物で７２時間処理した。１５０００細胞／ウェルの密度のＷＥＨ１又はＨＥＫ２９３細胞を前記スクリーニング化合物で処置した。陽性対照として、タキソール（５００ｎＭ）及びスタウロスポリン（５００ｎＭ）を使用した。陰性対照として、ＤＭＳＯを使用した。７２時間後、ＭＴＳ／ＰＥＳ（生存細胞中でのみ活性のミトコンドリアデヒドロゲナーゼの基質）を用いて、細胞の生存率を測定した。ＩＣ５０の数値を以って、細胞毒性を誘導した化合物を判定した（図１７Ａ及び１７Ｅ参照）。
【０１５９】
ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０誘導において見られる効果が細胞保護に転化され得るか否かを判定するための第二のアッセイとして、ＭＧ−１３２アッセイが使用された。１２０００細胞／ウェルの密度のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、化合物で処理した。３０分後、細胞に５μＭのＭＧ−１３２を添加して、２４時間インキュベーションした。この実験の陽性及び陰性対照はそれぞれＣＹＴ４９２及びＤＭＳＯとした。２４時間後、製造元（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の説明書に従い、ＡＴＰｌｉｔｅを使用して、細胞生存率を測定した。ＥＣ５０値を以って、ＭＧ−１３２誘導性の細胞死から細胞を保護する化合物を判定した（図１７Ａ、１７Ｄ及び１７Ｅ参照）。
【０１６０】
実施例６：ツニカマイシンＥＲストレスモデル
この実験は、ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０アッセイのスクリーニングでヒットした化合物が、ＥＲストレスを負ったツニカマイシン処理細胞を保護又は救済することが出来るか否かを試験するために行われる。図１３に示すデータを得るために使用した手順は、本質的には、Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０７：９３５−９３９ （２００５）又はＹｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２１ ：８７２−８８４ （２００７）に記載のものと同様である。具体的には、様々な時点で、培養細胞に、最終濃度１０μＭの化合物Ｂを添加した。ＰＣ１２細胞は、７５０μｇ／ｍＬのツニカマイシン処理で、ＥＲストレスを誘導することが出来た。生存細胞は、ＡＴＰｌｉｔｅ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して測定することが出来た。図１３に示されるように、化合物Ｂは、ツニカマイシンにより誘導されるＥＲストレスからＰＣ−１２細胞を保護する。
【０１６１】
実施例７：シャペロンＨＳＦ１共誘導因子
この試験は、非ストレス細胞中のＨＳＦ１顆粒陽性細胞の増大と、セラストロール又は化合物Ａの濃度の増大との関係を比較するために行われた。８０００細胞／ウェルのＨｅＬａ細胞を、段階的に濃度を増大させる（０．７８μＭ〜３５μＭ）セラストロール又は化合物Ａで処理し、そして３７℃で３時間インキュベーションした。５０μＬの１６％パラホルムアルデヒドを培養培地と混合（合計体積１５０μＬ）して、最終濃度を４％とした。プレートを室温で３０分インキュベートして、そしてＰＢＳで洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ＯＯのＰＢＳ溶液で３０分間処理して、細胞膜を易透化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートに室温で５％ＦＢＳ／ＰＢＳを８０μＬ添加して、１時間置いた。抗体染色のために、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００に希釈した抗ＨＳＦ１及び抗ＨＳＰ抗体をプレートに添加した。プレートを、室温で２時間、又は４℃で一昼夜インキュベーションした。最後に、プレートに、ＦＩＴＣ又はローダミンでラベルした二次抗体及びＤＡＰＩの混合物を、それぞれ最終濃度が１：５０００（ＤＡＰＩ、５ｍｇ／ｍＬ）、１：５００（ＦＩＴＣ／ローダミンラベル抗ウサギ二次抗体）となるように添加した。室温で１時間置いた後、プレートをＰＢＳで洗浄して、４℃で保存した。
【０１６２】
画像取得及び解析は、ＩＮｃｅｌｌ １０００を使用して行われた。図１４Ｃに示されるように、化合物Ａは、セラストロールと対照的に、非ストレス細胞において、ＨＳＦ１陽性顆粒を有意に刺激しない。
【０１６３】
実施例８：カウンタースクリーニングＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼアッセイによる、ＨＳＰ９０の阻害に作用する化合物のモニタリング
この実験は、ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットした化合物がＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性を阻害するか否かを試験するために行われた。２．５μｇのＨＳＰ９０（Ｓｔ９細胞から精製した）を、１０μＭのラジシコール及び５０μＭの化合物Ａ〜Ｇのいずれかで、３７℃で３時間処理した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ （Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）のＡＤＰクエストキットを使用して、ＡＴＰアーゼ活性を測定した。図１５に示されるように、ＭａＣＲＡスクリーニングでヒットしたものとして同定された上記の様々な化合物は、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を有意に阻害しない。従って、それらのＨＳＦ１及びＨＳＰ７０陽性顆粒形成に対する効果は、ＨＳＰ９０阻害から独立している。
【０１６４】
実施例９：ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋共誘導因子を同定するスクリーニングの方策
上記で詳述した実験に基づき、第一のＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒アッセイ並びに細胞保護及び細胞毒性をそれぞれ同定する第二のＭＧ−１３２及びＭＴＳアッセイを使用して、４０００個の化合物がスクリーニングされた。データの多元的解析は、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ （ＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ， Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＭＡ）を使用して、ＨＳＦ顆粒陽性細胞％において２０％超（ＨＳＦ１＋）、ＨＳＰ顆粒陽性細胞％において３０％超（ＨＳＰ＋）、ＭＧ１３２アッセイにおける生存細胞の増大％において３０％超、及びＭＴＳアッセイにおける阻害％において２０％未満をカットオフ値として、実施された。各スクリーニングのデータは、図１７Ｂ、１７Ｃ及び１７Ｄに示される。図１７Ａ及び１７Ｅは、４０００個の化合物のスクリーニングから得たデータの多元的集合（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）を表す。
【０１６５】
表２〜４は、本発明の方法に従い第一及び第二のアッセイにおいて同定した選択化合物のデータをまとめた表であり、これらの化合物は、上記のように、ＨＳＦ１＋ＨＳＰ＋（Ａ）、ＨＳＦｌ−ＨＳＰ＋（Ｂ）、及びＨＳＦｌ−ＨＳＰ−（Ｃ）のカテゴリーに分けられる。
【０１６６】
実施例１０：セラストロール対照を用いての３８４ウェルフォーマットへの転換
ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−３８４アッセイプレートに適切な密度でＨｅＬａ細胞を播種し、化合物処理の前に、１６〜２４時間培養した。続いて、細胞をセラストロール（対照）又はスクリーニング化合物で処理した。ＤＭＥＭ中での化合物の全体の希釈は２００倍であり、最終的なスクリーニング用の濃度は３０μＭとなり、そしてこれを、ＥＣ５Ｏ決定のために、１０μＭ〜０．１μＭの濃度範囲内で連続希釈した（アッセイポイントを１０個設けた）（ＤＭＳＯの最終濃度は０．３％ｖ／ｖ）。４３℃、２時間、回復時間無しで実行されたヒートショックの直後、２５μＬの１６％パラホルムアルデヒドを培養培地と混合（合計体積７５μＬ）して、最終濃度を４％とした。プレートを室温で３０分インキュベートして、そしてＰＢＳで洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ＯＯのＰＢＳ溶液で３０分間処理して、細胞膜を易透化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートに室温で５％ＦＢＳ／ＰＢＳを２０μＬ添加して、１時間置いた。抗体染色のために、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００に希釈した抗ＨＳＦ１及び抗ＨＳＰ抗体をプレートに添加した。プレートを、室温で２時間、又は４℃で一昼夜インキュベーションした。最後に、プレートに、ＦＩＴＣ又はローダミンでラベルした二次抗体及びＤＡＰＩの混合物を、それぞれ最終濃度が１：５０００（ＤＡＰＩ、５ｍｇ／ｍＬ）、１：５００（ＦＩＴＣ／ローダミンラベル抗ウサギ二次抗体）となるように添加した。室温で１時間置いた後、プレートをＰＢＳで洗浄して、４℃で保存した。
【０１６７】
プレートの移動を自動化するために、Ｔｗｉｓｔｅｒ ＩＩ （Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）と一体化したＩＮｃｅｌｌ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、画像取得及び解析が実施された。画像取得の設定は、ＤＡＰＩにおいて５００ｍｓ、ＦＩＴＣ又はローダミンにおいて１００ｍｓで、ウェルあたり３回撮像した。画像解析は、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ３．６のＭｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用して実施された。ＨＳＦ１／ＨＳＰ７０顆粒カウント、顆粒面積及び核発色強度ＣＶにおけるアルゴリズムは、アッセイ条件及び使用説明書に従い設計及び最適化された。ＥＣ５０値及び曲線の当てはめは、Ｐｒｉｓｍ ４．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び非線形回帰解析を使用して実施された。このスクリーニングの結果は、図１８に示される。
【０１６８】
実施例１１：ＨＳＦ１ノックダウン例
実験１：ＨｅＬａ細胞に、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ又はトランスフェクション対照を４８時間トランスフェクションし、続いて４３℃で２時間ヒートショックを加え、又は加えなかった。ウェスタンブロット実験により、ローディング対照のＧＡＰＤＨと比較しての、ＨＳＦ１及びスクランブルのノックダウンを比較した。及び柱状図を示す。柱状図中の柱において示されるように、ＨＳＦ１及びＨＳＰ７０の発現は、減少する。
【０１６９】
実験２：ＨｅＬａ細胞に、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、４８時間のインキュベーションに付した。続いてこの細胞を２５μＭの化合物Ｂ又はＤＭＳＯ対照で処理した後、４１℃で２時間ヒートショックを行い、又は行わなかった。ＨＳＦ１顆粒を染色するために、免疫細胞化学実験を行った。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ， “Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｅ−Ｂａｓｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ ｉｎ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ”， Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ， （２００８）を参照されたい）。画像取得は、対物１０ｘのＩＮｃｅｌｌ １０００を使用して行われ、これらを図２０に示す。
【０１７０】
実験３：ＨｅＬａ細胞に、２５ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ又はスクランブル（標的無し）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ＨＳＦ１顆粒を染色するために、免疫細胞化学実験を行った（上記）。画像取得は、対物１０ｘのＩＮｃｅｌｌ １０００を使用して行われた。細胞カウントは、ＩＮｃｅｌｌ １０００ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ中のＭｕｌｔｉ−Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓアルゴリズムを用いて取得された（図２１を参照されたい）。表５は、ＨＳＦ１の共誘導因子（増幅因子）としても同定されたＨＳＦ１＋ＨＳＰ７０＋カテゴリーの９個の独立したヒットを使用して、そのようなｓｉＲＮＡノックダウン実験を行って得たデータをまとめたものを示す。表２に示されるように、各化合物が、ＨＳＦ１依存的活性化因子である。
【０１７１】
実験４：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクションした。この細胞を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ試薬を使用）の４８時間後に回収した。ウエスタンブロットは、抗ＨＳＦ１及び抗ＧＡＰＤＨ（ローディング対照）を使用して（図２２Ａ及び２２Ｂ）、又は抗ＨＳＰ７０及び抗ＧＡＰＤＨを使用して（図２２Ｃ）実施された。画像の強度は、Ｌｉ−Ｃｏｒ製のソフトウェアを使用して解析され、ＨＳＦ１強度は、スクランブルｓｉＲＮＡ処理サンプルで正規化したＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ処理サンプルから求められた。図２２Ａ〜Ｂは、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）に対して、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＭＧ−１３２アッセイに使用した、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の、トランスフェクション時間が４８時間（Ａ）及び７２時間（Ｂ）の場合のｓｉＲＮＡノックダウン、並びに対応するウエスタンブロットを提供する。図２２Ｃ中のウエスタンブロットは、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（対照）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）と比較しての、１０、２５又は５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の、ＨＳＰ７０に対する効果を示す。
【０１７２】
実験５：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、５０ｎＭのＨＳＦ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを、４８時間トランスフェクションした。ＣＹＴ２２３９、ＣＹＴ２２４４、ＣＹＴ２２８２又はＣＹＴ２５３２を添加し、３０分後に５μＭのＭＧ−１３２で２４時間処理した。生存細胞を、ＡＴＰｌｉｔｅキットで測定した。ＨＳＦ１のノックダウンは、免疫細胞化学及び高密度イメージングにおけるＨＳＦ１核発色強度により確認した。図２３Ａ〜Ｄは、ＣＹＴ２２３９（図２３Ａ）、ＣＹＴ２２４４（図２３Ｂ）、ＣＹＴ２２８２（図２３Ｃ）又はＣＹＴ２５３２（図２３Ｄ）のいずれか１つの化合物で前処理した後、５０ｎＭのＨＳＦｌ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡで４８時間処理した場合の、ＭＧ−１３２アッセイにおけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＨＳＦ１依存的細胞保護を示す。
【０１７３】
実施例１２：ＨＳＦ１顆粒アッセイを使用しての細胞ストレス応答の阻害因子の同定
実験１：ＨｅＬａ細胞を、異なる濃度（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭ）のトリプトリドで処理し、その後４３℃で１〜４時間ヒートショックした。図２４は、処理に用いられるトリプトリドの濃度の増大（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭ）に応じた、用量依存的なＨＳＦ１顆粒形成の阻害を図示したものである。ＨＳＦ１顆粒カウントは、顆粒５個／核を閾値として測定した。本明細書に記載のＭｅＣＲＡ法を使用して選択された様々な化合物の効果の試験に、同様のアッセイ条件が使用された。
【０１７４】
実験２：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、１時間、回復時間０、５及び７時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ａは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７５】
実験３：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、２時間、回復時間０、４又は６時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ｂは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７６】
実験４：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、３時間、回復時間０、３又は５時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ｃは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７７】
実験５：ヒートショックの３０分前に、ＨｅＬａ細胞を、１μＭトリプトリド、並びに１０μＭのＣＴＹ９７５（黒色の正方形）、ＣＴＹ１５６３（黒色の三角形）、及びＣＴＹ１５９０（黒色の丸）で処理した。続いて、該細胞を、４３℃、４時間、回復時間０、２又は４時間でヒートショックに付した。ＨＳＰ７０の核及び細胞の発色強度の合計を閾値とした。図２５Ｄは、ＨＳＰ７０発現の減少を示す。
【０１７８】
実施例１３：トリプトリド及びスクリーニングヒット化合物の９６ウェルプレート評価
実験１：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＰ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＦ１顆粒形成を、４３℃、２時間、回復時間無しのヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ａは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１７９】
実験２：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＯ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＦ１顆粒形成を、４３℃、４時間、回復時間４時間のヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ｂは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１８０】
実験３：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＯ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＰ７０顆粒形成を、４３℃、２時間、回復時間４時間のヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ｃは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１８１】
実験４：トリプトリド（黒色の正方形）、ＣＹＴ１５６３（黒色の三角形）及びＤＭＳＯ（黒色の菱形、対照）により誘導されるＨＳＰ７０顆粒形成を、４３℃、４時間、回復時間４時間のヒートショックの後に、９６ウェルプレートフォーマット（実施例４を参照されたい）で評価した。図２６Ｄは、ＨＳＦ１の阻害を示す。
【０１８２】
実施例１４：９６ウェルフォーマットの３８４ウェルフォーマットへの転換
ＨｅＬａ細胞を、ＤＭＳＯ（黒色の菱形）又はＣＹＴ１５６３（１０μＭ）（黒色の正方形）で処理し、続いて４３℃、２時間、回復時間無しのヒートショックを与え、これを、３８４ウェルフォーマット（実施例１０を参照されたい）におけるＨＳＦ１顆粒カウントを使用して試験した。Ｚ’値及びシグナル／バックグラウンド（ＳｆＢ）比を含む結果を、図２７に示す。
【０１８３】
上記実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、限定を意図しない。当業者は、前述の一般的な開示の範囲内で、本発明の追加的な態様が補足されることを認識し得て、そして上記非限定的な実施例は、いかなる形でも権利放棄を意図しない。
【０１８４】
均等
当業者は、ありふれたものに過ぎない実験を利用して、本明細書中に記載の化合物、組成物、及びそれらを使用する方法の、多くの均等なものを認識し得て、又は突き止めることが出来る。そのような均等なものは、本願請求項に記載の発明の範囲内とみなされ、本願請求項の範囲内にある。
【０１８５】
本願全体に引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許文献の内容、並びにそれらに関連する図は、それらの全てが、参照により援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）を定量的に測定する高効率の方法であり：
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）の転写活性を定量的に測定する高効率の方法であり：
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の調節因子を同定する高効率の方法であり：
細胞を候補化合物で処理し、
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４】
ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）の発現の調節因子を同定する高効率の方法であり：
細胞を候補化合物で処理し、
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５】
前記ＨＳＰがＨＳＰ７０である、請求項１又は３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ストレスが、温度上昇、重金属ストレス、酸化ストレス、酸素グルコース除去（ＯＧＤ）、及び奪酸素（ＯＤ）から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ストレスが酸素グルコース除去（ＯＧＤ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ストレスが温度上昇である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記温度上昇が約４３℃未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度上昇が、約３９℃〜約４３℃未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度上昇が、４１℃±約０．５℃である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記温度上昇が、４３℃±約０．５℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み合わせが顆粒カウントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み合わせが、更に核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度、又は顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み合わせが、核発色強度のＣＶ及び顆粒面積を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み合わせが、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組み合わせが、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ストレスに晒された細胞が癌細胞由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌細胞が不死化細胞由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞がＨｅＬａ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌細胞がＳＨＳＹ５Ｙ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現が、ヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）により誘導される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記顆粒がＨＳＰにおいて陽性の顆粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記顆粒がＨＳＦ１において陽性顆粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記顆粒がＨＳＰ及びＨＳＦ１において陽性の顆粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記測定が、ストレスに晒された細胞におけるＨＳＰ発現のレベルの測定、及び該発現レベルと、該ストレスに晒されていない細胞のＨＳＰ発現のベースラインレベルとを比較することによる、ストレス曝露に関連するＨＳＰ発現の変化の定量的測定を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ストレス曝露に関連するＨＳＰ発現が、発現のベースラインレベルを上回るＨＳＰ発現の増大である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ストレス曝露に関連するＨＳＰ発現が、発現のベースラインレベルを下回るＨＳＰ発現の減少である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＳＰ発現のベースラインレベルが外部から変化させられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＳＦがＨＳＦ１である、請求項２又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記候補化合物がタンパク質である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記候補化合物が小分子である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記候補化合物が核酸部分である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記候補化合物が、ＨＳＦ１活性化因子、ＨＳＦ１共誘導因子（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＨＳＦ１阻害因子、又はＨＳＦ１共阻害因子（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ＨＳＰ及び／又はＨＳＦの活性化因子を同定するために行われ、前記ストレスが温度上昇であり、そして該温度上昇が４１℃±約０．５℃である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＨＳＰ及び／又はＨＳＦの阻害因子を同定するために行われ、前記ストレスが温度上昇であり、そして該温度上昇が４３℃±約０．５℃である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候の処置に有用である、請求項３、４、又は３１〜３６のいずれか１項に記載の方法により同定される調節因子。
【請求項３８】
温度上昇により複数の細胞サンプルにヒートショックストレスを誘導する装置であり；プレート、及び該プレートを加熱する熱源を備え、該プレートが、該複数の細胞サンプルに均一に熱を伝導させる、前記装置。
【請求項３９】
前記プレートが金属プレートである、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
前記金属プレートがアルミニウムプレートである、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記金属プレートが、複数の細胞サンプル中の各細胞サンプルと直接接触する、請求項３９に記載の装置。
【請求項１】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）を定量的に測定する高効率の方法であり：
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）の転写活性を定量的に測定する高効率の方法であり：
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の調節因子を同定する高効率の方法であり：
細胞を候補化合物で処理し、
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４】
ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）の発現の調節因子を同定する高効率の方法であり：
細胞を候補化合物で処理し、
細胞をストレスに晒し、そして
以下の１つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；及び（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；を測定し、又は
以下の２つ以上の変数：核発色強度の変動係数（ＣＶ）；（ｉｉ）顆粒面積；（ｉｉｉ）顆粒発色強度；（ｉｖ）顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率；及び（ｖ）顆粒カウント；の組み合わせを測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５】
前記ＨＳＰがＨＳＰ７０である、請求項１又は３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ストレスが、温度上昇、重金属ストレス、酸化ストレス、酸素グルコース除去（ＯＧＤ）、及び奪酸素（ＯＤ）から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ストレスが酸素グルコース除去（ＯＧＤ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ストレスが温度上昇である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記温度上昇が約４３℃未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度上昇が、約３９℃〜約４３℃未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度上昇が、４１℃±約０．５℃である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記温度上昇が、４３℃±約０．５℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み合わせが顆粒カウントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み合わせが、更に核発色強度のＣＶ、顆粒面積、顆粒発色強度、又は顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み合わせが、核発色強度のＣＶ及び顆粒面積を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み合わせが、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組み合わせが、核発色強度のＣＶ及び顆粒発色強度のバックグラウンド発色強度に対する比率を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ストレスに晒された細胞が癌細胞由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌細胞が不死化細胞由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞がＨｅＬａ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌細胞がＳＨＳＹ５Ｙ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現が、ヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）により誘導される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記顆粒がＨＳＰにおいて陽性の顆粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記顆粒がＨＳＦ１において陽性顆粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記顆粒がＨＳＰ及びＨＳＦ１において陽性の顆粒である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記測定が、ストレスに晒された細胞におけるＨＳＰ発現のレベルの測定、及び該発現レベルと、該ストレスに晒されていない細胞のＨＳＰ発現のベースラインレベルとを比較することによる、ストレス曝露に関連するＨＳＰ発現の変化の定量的測定を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ストレス曝露に関連するＨＳＰ発現が、発現のベースラインレベルを上回るＨＳＰ発現の増大である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ストレス曝露に関連するＨＳＰ発現が、発現のベースラインレベルを下回るＨＳＰ発現の減少である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＳＰ発現のベースラインレベルが外部から変化させられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＳＦがＨＳＦ１である、請求項２又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記候補化合物がタンパク質である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記候補化合物が小分子である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記候補化合物が核酸部分である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記候補化合物が、ＨＳＦ１活性化因子、ＨＳＦ１共誘導因子（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＨＳＦ１阻害因子、又はＨＳＦ１共阻害因子（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ＨＳＰ及び／又はＨＳＦの活性化因子を同定するために行われ、前記ストレスが温度上昇であり、そして該温度上昇が４１℃±約０．５℃である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＨＳＰ及び／又はＨＳＦの阻害因子を同定するために行われ、前記ストレスが温度上昇であり、そして該温度上昇が４３℃±約０．５℃である、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
生理的ストレスに伴う疾患、症状又は兆候の処置に有用である、請求項３、４、又は３１〜３６のいずれか１項に記載の方法により同定される調節因子。
【請求項３８】
温度上昇により複数の細胞サンプルにヒートショックストレスを誘導する装置であり；プレート、及び該プレートを加熱する熱源を備え、該プレートが、該複数の細胞サンプルに均一に熱を伝導させる、前記装置。
【請求項３９】
前記プレートが金属プレートである、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
前記金属プレートがアルミニウムプレートである、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記金属プレートが、複数の細胞サンプル中の各細胞サンプルと直接接触する、請求項３９に記載の装置。
【図１Ａ−Ｂ】
【図１Ｃ−Ｄ】
【図２Ａ−Ｂ】
【図２Ｃ−Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２３Ｄ】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２６Ｄ】
【図２７】
【図１Ｃ−Ｄ】
【図２Ａ−Ｂ】
【図２Ｃ−Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２３Ｄ】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２６Ｄ】
【図２７】
【公表番号】特表２０１１−５２３７１０（Ｐ２０１１−５２３７１０Ａ）
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２４７６（Ｐ２０１１−５１２４７６）
【出願日】平成２１年６月３日（２００９．６．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３４０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８６０８
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（３１１００７５９０）
【出願人】（３１１００７６０４）
【出願人】（３１１００７５８９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３日（２００９．６．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３４０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８６０８
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（３１１００７５９０）
【出願人】（３１１００７６０４）
【出願人】（３１１００７５８９）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]