ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステル
本発明は、以下の構造を有する新規化合物に関する。
【化１】
本発明の別の目的は、腫瘍疾病の治療のために使用される医薬の製造のための化合物（Ｉ）の使用である。
【化１】
本発明の別の目的は、腫瘍疾病の治療のために使用される医薬の製造のための化合物（Ｉ）の使用である。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］部分に関連したアルカロイドである新規化合物に関する。
【０００２】
本発明は、更に、これらの化合物を製造する方法、これらを含む医薬、及び癌の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００３】
現在利用可能な抗癌剤は多種多様であるにもかかわらず、抗増殖活性を示す植物から抽出される新規な天然物質の研究および同定は、未だに優先事項である。入手可能なわずか少数の植物のみがこの観点の下で研究されているが、天然の生物多様性は潜在的な抗癌剤の発見のために非限定的な領域を提供する。
【０００４】
さらに、現在、伝統的な医薬において多数の植物抽出物が使用されているが、それらの有効成分は単離および同定されていないことに注意が払われるべきである。新薬の中では、アルカロイドの天然産物および半合成誘導体が抗増殖活性を有するものとして報告されている。
【０００５】
これらの天然産物の一例は、キルギス共和国にて成育する伝統的な薬用植物であり、これは先行してスクリーニングされてきた。より正確には、この植物はアコニタム（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）属キンポウゲ科に属し、この国において長年癌に対して伝統的に使用されているため、詳細な調査のために選択された。実際、アコニタム・カラコリカム（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｋａｒａｋｏｌｉｃｕｍ）の根は、キルギスの伝統医薬のある処方において癌に対して使用されてきた。
【０００６】
アコニタム・カラコリカム・ラプクス（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｋａｒａｋｏｌｉｃｕｍ Ｒａｐｃｓ）は、葉が多く丈の高い茎（７０−１３０ｃｍ）を持ち、長く込み合った総状花序に青紫または青色の左右相称の花を咲かせる多年草植物である。この植物の地下部分は、互いに並んでくっついて成長する、２．０−２．５×０．７−１．０ｃｍの円錐形の小塊茎を示す。アコニタム・カラコリカムは中央アジアに特有である。
【０００７】
アコニタム種の全ての部分が、ジテルペノイド基のアルカロイドを含む。アルカロイドの最大の含有量は、生長の期間（８月−１０月）後の小塊茎において見つかった。
【０００８】
この植物において同定された主要なアルカロイドは次のとおりである：
−アコニチン（０．８−１％）（ナトリウム・チャンネルの通常の閉鎖を妨げることにより、強い毒性を有し、中枢的または末梢的効果を示すことが周知である）
−カラコリン（０．０５％）、
−カラコリジン（ｋａｒａｋｏｌｉｄｉｎｅ）（０．０５％）、
−ゾンゴリン（ｚｏｎｇｏｒｉｎｅ）（０．１％）、および
−ゾンゴラミン（ｚｏｎｇｏｒａｍｉｎｅ）（０．０１％）。
【０００９】
ナペリン（Ｎａｐｅｌｌｉｎｅ）、アコニフィン（ａｃｏｎｉｆｉｎｅ）、アセチルナペリンおよびカラコニチン（ｋａｒａｋｏｎｉｔｉｎｅ）もまた同定された。
【００１０】
しかしながら、これらの化合物の何れも、植物抽出物が持つような抗増殖活性を示さないことがわかった。
【００１１】
このため、この活性の原因となるＡ．カラコリカムの根の抽出物に存在する化合物の単離および同定について研究が行われ、A. Chodoeva らの文献（“8-O-Azeloyl-14-benzoylaconine: A new alkaloid from the roots of Aconitum karakolicum Rapcs and its proliferative activities”; Bioorg. Med. Chem. (2005), 13, 6493-6501）に詳述されている。
【００１２】
実際、この文献は、以下の構造（１）を有する新規な化合物：８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンを開示している。
【化１】
【００１３】
アコニンの幾つかの脂肪酸アシルエステルが以前に記述されたものの（Wie, X.; Xie, H. ; Liu, M.; Ge, X., Heterocycles (2000), 53, 2027）、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンは化学文献において記述されていない。
【００１４】
アコニンはそれ自体抗増殖活性を欠くが、以下の構造（２）を有する。
【化２】
【００１５】
上述したアコニチンはアコニンの誘導体であり、以下の構造（３）を有する。
【化３】
【００１６】
一般式Ｃ４１Ｈ５９ＮＯ１３の８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンは、アコニチン誘導体である。これは、実際、アコニチン骨格の炭素８における、アセチル基のアゼライディックアシル（ａｚｅｌａｉｄｉｃ ａｃｙｌ）部分による置換により生じるためである。
【００１７】
８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンの化合物の特徴は、アゼライン酸鎖の末端のカルボキシ官能基の負電荷とヘテロ環の窒素原子に形成される第四アンモニウムの正電荷との間における双性イオン構造に存在する。アゼライン鎖の長さが決まると、これらの２部分間の内部イオン結合を仮定することができる。
【００１８】
アゼライン酸に関して、それは、腫瘍細胞におけるミトコンドリアのオキシドリダクターゼの阻害剤であることが示された(Picardo, M.; Passi, S.; Sirlanni, M. C.; Fiorilli, M.; Russo, G. D.; Cortesi, E.; Barile, G.; Breathnach, A. S.; NazzaroPorro, M.; Biochem. Pharmacol. (1985), 34,1653)。
【００１９】
結論として、アゼライン酸は一般的な抗腫瘍剤であることが提案された(Breathnach, A. S., Med. Hypotheses, (1999), 52, 221)。
【００２０】
アゼライン酸はＮＣＩのインビトロスクリーニングパネルにおいて試験されていないが、マウス腫瘍において、インビボで実験が行われ、抗腫瘍活性が全く存在しないと結論されている。
【００２１】
したがって、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンにて観察された抗増殖活性は、その個々の成分の活性に起因しえない。
【００２２】
しかしながら、上述のＡ．Ｃｈｏｄｏｅｖａらの文献によると、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンは、培養されるヒト腫瘍細胞の以下の３つの株に対する抗増殖性インビトロ活性の原因であることがわかった：
−ＨＴＣ−１５（大腸癌）、
−Ａ５４９（肺癌）、
−ＭＣＦ−７（乳癌）。
【００２３】
これら３つ細胞株におけるＩＣ５０は約１０−１８μＭであり、これは、いくつかのクラスに属する主要な抗癌剤（すなわち、代謝拮抗剤、アルキル化剤、白金（ｐｌａｔｉｎｉｕｍ）化合物、トポイソメラーゼ阻害剤）の活性に匹敵する。
【００２４】
上述の通り、ヒト腫瘍細胞に対する抗増殖活性を示す新規化合物が集中的に探索される。
【００２５】
したがって、本発明の目的は、癌に対して非常に興味深く有望な特性を示したデザイン８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンの改良、および癌化学療法に有用な新規化合物を提供することである。
【００２６】
本発明に関して、この目的は、第一に、［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］部分と関係するアルカロイドである、癌化学療法に有用な新規の化合物を提供することにより解決される。
【００２７】
より正確には、これらの新規化合物はビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステルである。
【００２８】
したがって、本発明に関して、以下の一般的構造（Ｉ）を有する新規化合物が提供される。
【化４】
【００２９】
ここにおいて、ｎは、０および１０の間、好ましくは３および１０の間、より好ましくは４および８の間に含まれる整数である。
【００３０】
それゆえ、本発明に係る好ましい化合物は、
−ｎが５である化合物、すなわち化合物ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（すなわちＰＤＤ）、
−ｎが６である化合物、すなわち化合物ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（すなわちＳＤＤ）、
−ｎが７である化合物、すなわちビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（すなわちＡＤＤ）である。
【００３１】
したがって、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレートは以下の構造を有する。
【化５】
【００３２】
したがって、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（すなわちＳＤＤ）は以下の構造を有する。
【化６】
【００３３】
したがって、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（すなわちＡＤＤ）は以下の構造を有する。
【化７】
【００３４】
本発明の別の目的は、本発明に係る化合物を製造する方法に関する。
【００３５】
本発明に係る化合物は、アコニチン部分に位置する８−アセチル官能基において行われるエステル転移反応により得られる。
【００３６】
アコニチンからの反応は、分解の産物の形成を回避し且つエステル転移反応を最適化するように制御された反応時間および温度にて達成される。
【００３７】
これは、対応するモノ−［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］およびビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステルをもたらす。したがって、本発明に係るビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステルを単離するために、精製の工程が必要である。
【００３８】
より正確には、本発明に係る化合物の製造方法は以下の工程を含む：
ａ）ＤＭＦなどの溶媒中にて、８０℃以下の温度でアコニチンをジカルボン酸と共に撹拌する（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）工程、
ｂ）得られた混合物を、エステル転移反応が行われるように室温でかき混ぜる（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）工程、
ｃ）前記溶媒を減圧下で蒸発させる工程、
ｄ）前記工程ｃ）の終わりにおいて得られる油状残渣を精製して、前記化合物（Ｉ）を単離する工程。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、ジカルボン酸は、２および１２、好ましくは５および１２、より好ましくは６および１０の間に含まれる数の炭素原子を有するジカルボン酸の中から選択してよい。
【００４０】
最も好ましくは、ジカルボン酸は、ピメリン酸、スベリン酸およびアゼライン酸から成る群から選択してよい。
【００４１】
工程ａ）の撹拌は、７０℃および８０℃の間に含まれる温度で、反応を行うのに十分な時間、最も好ましくは７時間実行してよい。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によると、工程ｂ）の揺り動かしは、反応を最適化するために１６時間実行される。
【００４３】
より好ましくは、工程ｃ）の溶媒の蒸発は７０℃以下の温度で実行される。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態によると、工程ｄ）の精製は、セミ分取高速液体クロマトグラフィーにより実行される。
【００４５】
前記セミ分取高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りであってよい：
−溶媒Ａ：トリフルオロ酢酸／水；比率１／１０００；
−溶媒Ｂ：トリフルオロ酢酸／アセトニトリル，比率１／１０００。
【００４６】
溶出条件は、０．５ｍＬの容量の注入；２５％のＢを３０分間で１００％とする勾配であってよい。
【００４７】
吸収率は２３４ｎｍでモニターされる。
【００４８】
本発明の別の目的は、本発明に係る化合物を含む医薬組成物である。
【００４９】
医薬組成物は、さらに、適切で医薬的に許容可能な希釈剤または担体物質を含んでよい。
【００５０】
本発明に関して、上述の医薬組成物は、錠剤、カプセル、小滴および坐薬の形態、経口、経直腸または非経口の使用のための注射または注入の製剤とすることができる。そのような投与形態およびそれらの生成物は当業者に既知である。
【００５１】
さらに、本発明は、医薬の製造のための本発明に係る化合物の使用に関する。
【００５２】
より正確には、本発明は、前記医薬が腫瘍疾病の治療のために使用される、本発明に係る化合物の使用に関する。前記腫瘍疾病は、大腸癌、肺癌または乳癌であってよい。
【００５３】
以下の例はさらに本発明を例証する。しかし、当然、その範囲を限定する任意の方法として解釈されるべきでない。
【００５４】
第１に、種々の技術の条件が詳述される：
−ＨＰＬＣ、
−質量分光法、
−ＮＭＲ。
【００５５】
全ての例に関して、ＨＰＬＣ精製に使用される条件は以下の通りである：
使用されるカラム：Ｕｌｔｒａｓｅｐ ＥＳ １０、ＲＰ１８６．０μｍ逆相、Ｃ１８カラム、２５０ｘ１０ｍｍ（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
使用される溶媒：
・Ａ：トリフルオロ酢酸／水；比率１／１０００；
・Ｂ：トリフルオロ酢酸／アセトニトリル，比率１／１０００；
溶出条件：０．５ｍＬの容量の注入；２５％のＢを３０分間で１００％とする勾配。
吸収率は２３４ｎｍでモニターされる。
【００５６】
全ての例に関して、質量分光法の条件は以下の通りである：
高分解能ＥＳＩ質量測定は、エレクトロスプレーソースを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱＳｔａｒｍａｓｓスペクトロメーターを用いて、ポジティブモードにて行った。
【００５７】
エレクトロスプレーニードルは、５０００Ｖに維持され、室温で操作した。
【００５８】
サンプルは、注入により、１０μＬサンプルループを通して、２００μＬ／分のメタノールの流れにＬＣポンプから導入した。
【００５９】
ＭＳ２分析は、３０から５０にわたる衝突エネルギーおよび５から１０にわたるＣＡＤ衝突ガスを用いて行われる。
【００６０】
全ての例に関して、核磁気共鳴（ＮＭＲ）の条件は以下の通りである：
１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲ実験を、５ｍｍブロードバンドプローブおよびＢｏグラジエントを備えたＢｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００分光計を用いて、１Ｈおよび１３Ｃの実験に対してそれぞれ４００．１３および１００．６ＭＨｚにて行った。全てのスペクトルは、０．７ｍＬのＣＤＣｌ３に溶解した９ｍｇの物質を使用して記録した。化学シフト（ｐｐｍ）はＴＭＳに関して与えられる。１Ｈ−１Ｈシフト相関２次元（ＣＯＳＹ）スペクトルが、ＣＯＳＹ９０パルスシーケンスを使用して得られる（Picardo, M.; Passi, S.; Sirlanni, M.C.; Fiorilli, M.; Russo, G.D.; Cortesi, E.; Barile, G.; Breathnach, A.S.; Nazzaro-Porro, M., Biochem. Pharmacol. (1985), 34, 1653参照）。
【００６１】
炭素のタイプは２つの実験１Ｄ（ＤＥＰＴ９０および１３５）により定義される。単結合１Ｈ−１３Ｃ化学シフト相関関係（ＨＭＱＣ）スペクトルは、１３Ｃ炭素に連結された１Ｈの選択のためのＢｏグラジエントパルス用いてＢａｘ配列に従って得られた（Reference is made to Breathnach, A.S. Med. Hypoth. (1999), 52, 221）。
【００６２】
ＨＭＱＣ実験では、Ｂｏグラジエントパルスは、１３Ｃ核に連結した１Ｈを選択するように適用されたため、１Ｈ検出異核多重結合相関関係（ＨＭＢＣ）スペクトルは、ローパスＪｎフィルター（３．８ｍｓ）に関するＢａｘおよびＳｕｍｍｅｒｓにより提案されたパルスシーケンス並びにロングレンジカップリングを観察するための遅延（６０ｍｓ）を使用して記録した。グラジエント選択ＮＯＥＳＹスペクトルは、ＮＯＥＳＹＧＰＰＨ Ｂｒｕｋｅｒパルスプログラムにより得られた。
【００６３】
以下に、本発明に係る３つの化合物の合成および特徴が詳述される。
【００６４】
Ａ）ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（ＰＤＤ）
化合物の合成
アコニチン（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびピメリン酸（２４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にて、８０℃で７時間、よく撹拌した。その混合物を、室温で一晩揺り動かす（ａｇｉｔａｔｅｄ）。その後、溶媒を７０℃以下の温度にて減圧下で蒸発させる。油状残渣をセミ分取高速液体クロマトグラフィーにより精製する。
【００６５】
得られた化合物のＮＭＲ特徴：
白色粉末 : 1H NMRスペクトル (400.13 MHz, CDCl3)は次の通りである。 δ: 8.1 (d, 4H, J = 7.6, H-2'/H-6'), 7.71 (t, 2H, J = 7.4, H-4'), 7.58 (t, 4H, J = 7.6, H-3'/H-5'), 5.04 (d, 2H, J = 4.4, H-14), 4.63 (d, 2H, J = 5.2, H-15), 4.44 (br s, 2H, H-3), 4.27 (br d, 2H, H-6), 3.92 (ma, 2H, H-19b), 3.95 (s, 6H, 16-OCH3), 3.67 (s, 2H, H-18ba), 3.64 (m,2H, H-1), 3.53 (s, 6H, 1-OCH3), 3.48 (s, 2H, H-17), 3.47 (s, 6H, 18-OCH3), 3.41 (s, 2H, 18aa), 3.39 (br d, 2H, H-16), 3.36 (s, 6H, 6-OCH3), 3.31 (ma, 2H, H-19a), 3.33 (ma, 4H, N-CH2-CH3), 3.08 (ma, 2H, H-9), 3.06 (s, 2H, H-5), 2.74 (br d, 2H, H-7), 2.58 (br s, 2H, H-2b), 2.51 (br d, 2H, H-12b), 2.49 (ma, 2H, H-10), 2.07 (d, 2H, J = 10, H-12a), 1.87 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"b, 8-CO2-(CH2)6"b), 1.60 (m, 10H, 8-CO2-(CH2)1"a, 8-CO2-(CH2)5”a, N-CH2-CH3, H-2aa), 1.12 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”b, 8-CO2-(CH2)4”b), 0.95 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”a, 8-CO2-(CH2)4”a), 0.72 (quint, 2H, J = 7.2, 8-CO2-(CH2)3”). 13C NMR (CDCl3) δ: 174.9 (8-COO, 8-COO”), 165.76 (C-7'), 133.8 (C-4'), 129.9 (C-2'/C-6'), 129.5 (C-1'), 129 (C3'/C-5'), 90 (C-16), 89.98 (C-8), 82.48 (C-6), 79.83 (C-1), 78.12 (C-15), 78.45 (C-14), 75.79 (C-18), 74.02 (C-13), 69.9 (C-3), 63.12 (C-17), 62.01 (16-OCH3), 59.3 (18-OCH3), 59.05 (6-OCH3), 55.36 (1-OCH3), 50.63 (C-19), 50.42 (C-11), 50.38 (N-CH2-CH3), 45.0 (C-5), 43.42 (C-4), 43.47 (C-9), 41.91 (C-7), 40.09 (C-10), 35.01 (C-12), 34.27 (C-1", C-5"), 29.49(C-2", C-4"), 28.02 (C-2), 23.86 (C-3"), 10;99 (N-CH2-CH3)。
【００６６】
Ｂ）ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）
化合物の合成
アコニチン（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびスベリン酸（２６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で、８０℃で７時間よく撹拌した。その混合物を室温で一晩揺り動かす。その後、溶媒を７０℃以下の温度にて減圧下で蒸発させる。油状残渣をセミ分取高速液体クロマトグラフィーにより精製する。
【００６７】
得られた化合物の特徴：
白色粉末: 1H NMRスペクトル (400.13 MHz, CDCl3)は次の通りである。δ: 8.00 (d, 4H, J = 7.8, H-2'/H-6'), 7.58 (t, 2H, J = 7.32, H-4'), 7.46 (t, 4H, J = 7.66, H-3'/H-5'), 5.04 (d, 2H, J = 4.9, H-14), 4.64 (d, 2H, J = 5.36, H-15), 4.43 (br s, 2H, H-3), 4.28 (d, 2H, J = 6.1, H-6), 3.97 (d, 2H, J = 12.96, H-19b), 3.94 (s, 6H, 16-OCH3), 3.67 (s, 2H, H-18ba), 3.64 (m,2H, H-1), 3.53 (s, 6H, 1-OCH3), 3.47 (s, 2H, H-17), 3.43 (s, 6H, 18-OCH3), 3.41 (s, 2H, 18aa), 3.39 (d, 2H, J = 5.4, H-16), 3.36 (s, 6H, 6-OCH3), 3.31 (d, 2H, J = 12.96, H-19a), 3.30 (ma, 4H, N-CH2-CH3), 3.10 (m, 2H, H-9), 3.07 (s, 2H, H-5), 2.74 (d, 2H, J = 6.1, H-7), 2.58 (br s, 2H, H-2b), 2.51 (br d, 2H, H-12b), 2.49 (m, 2H, H-10), 2.07 (d, 2H, J = 9.9, H-12a), 1.94 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"b, 8-CO2-(CH2)6"b), 1.63 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"a, 8-CO2-(CH2)6"a), 1.60 (t, 6H, J = 6.98, N-CH2-CH3), 1.56 (br d, 2H, H-2aa), 1.24 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”b, 8-CO2-(CH2)5”b), 1.09 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”a, 8-CO2-(CH2)5”a), 0.83 (m, 4H, 8-CO2-(CH2)3”, 8-CO2-(CH2)4”). 13C NMR (CDCl3) δ: 175.1 (8-COO, 8-COO”), 165.8 (C-7'), 133.8 (C-4'), 129.9 (C-2'/C-6'), 129.5 (C-1'), 129 (C3'/C-5'), 90 (C-16), 89.97 (C-8), 82.51 (C-6), 79.82 (C-1), 78.82 (C-15), 78.40 (C-14), 75.75 (C-18), 74.01 (C-13), 70 (C-3), 63.13 (C-17), 61.95 (16-OCH3), 59.26 (18-OCH3), 59.01 (6-OCH3), 55.29 (1-OCH3), 50.64 (C-19), 50.51 (C-11), 50.28 (N-CH2-CH3), 45.0 (C-5), 43.43 (C-4), 43.40 (C-9), 41.87 (C-7), 40.06 (C-10), 35.0 (C-12), 34.49 (C-1”, C-6”), 29.50 (C-2), 28.54 (C-3”, C-4”), 24.05 (C-2”, C-5”), 10;94 (N-CH2-CH3)。
【００６８】
更に、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレートのＥＳＩスペクトルを実行した。２つのピークがこのスペクトル上で観察される：２重に帯電した質量に相当するｍ／ｚ６７３．３の主要なもの、および単独に帯電したピークに相当するｍ／ｚ１３４５．７のマイナーなもの。このスペクトルによって確認することができる。
【００６９】
さらに、高解像度質量測定を、合成された化合物の式を確認するために行なった。単独帯電したピークで得られた実験の質量は１３４５．６８２９である。式Ｃ７２Ｈ１０１Ｎ２Ｏ２２のための理論的な質量は１３４５．６８４０（高解像度質量）である。
【００７０】
さらに、ＭＳ２実験を行なった。これらの測定は単独帯電および２重帯電したピークにて行った。ｍ／ｚ１３４６．７（単独帯電ピーク）の破片化は、アコニチン単位の１つの喪失に対応するｍ／ｚ７６０の主要な破片化ピークをもたらした。ｍ／ｚ６７３（２重帯電ピーク）の破片化は、アコニチン単位の破片化の機構に対応する、より多くの断片をもたらした。
【００７１】
Ｃ）ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）
化合物の合成：
アコニチン（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびアゼライン酸（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で、８０℃で７時間よく撹拌した。その混合物を室温で一晩揺り動かす。その後、溶媒を７０℃以下の温度にて減圧下で蒸発させる。油状残渣はセミ分取高速液体クロマトグラフィーにより精製される。
【００７２】
得られた化合物の特徴：
白色粉末 : 1H NMRスペクトル (400.13 MHz, CDCL3)は次の通りである。δ: 8.03 (d, 4H, J = 7.2, H-2'/H-6'), 7.56 (t, 2H, J = 7.4, H-4'), 7.45 (t, 4H, J = 7.2, H-3'/H-5'), 5.09 (d, 2H, J = 5, H-14), 4.51 (d, 2H, J = 5.2, H-15), 4.30 (br s, 2H, H-3), 4.12 (d, 2H, J = 6.1, H-6), 4.06 (d, 2H, J = 11.91, H-19b), 3.79 (s, 6H, 16-OCH3), 3.52 (s, 2H, H-18ba), 3.47 (m,2H, H-1), 3.36 (s, 6H, 1-OCH3), 3.29 (s, 2H, H-17), 3.27 (s, 6H, 18-OCH3), 3.24 (s, 2H, 18aa), 3.22 (br s, 2H, H-16), 3.19 (s, 6H, 6-OCH3), 3.11 (d, 2H, J = 11.9, H-19a), 3.16 (m, 4H, N-CH2-CH3), 2.90 (m, 2H, H-9), 2.86 (s, 2H, H-5), 2.55 (d, 2H, J = 6.1, H-7), 2.34 (br s, 2H, H-2b), 2.28 (br d, 2H, H-12b), 2.24 (m, 2H, H-10), 2.02 (br d, 2H, H-12a), 1.82 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"b, 8-CO2-(CH2)7"b), 1.50 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"a, 8-CO2-(CH2)7"a), 1.42 (t, 6H, J = 7.01, N-CH2-CH3), 1.35 (br s, 2H, H-2aa), 1.13 (m, 4H, 8-CO2-(CH2)2"b, 8-CO2-(CH2)3"b, 8-CO2-(CH2)5"b, 8-CO2-(CH2)6"b), 1.04 (m, 4H, 8-CO2-(CH2)2"a, 8-CO2-(CH2)3"a, 8-CO2-(CH2)5"a, 8-CO2-(CH2)6"a), 0.87 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)4"). 13C NMR (CDCl3) δ: 175.1 (8-COO, 8-COO”), 166 (C-7'), 134 (C-4'), 130 (C-2'/C-6'), 129.7 (C-1'), 129,3 (C3'/C-5'), 90,3 (C-16), 90.1 (C-8), 82.9 (C-6), 80,1 (C-1), 79,0 (C-15), 78.7 (C-14), 76,0 (C-18), 74.3 (C-13), 70,3 (C-3), 63.4 (C-17), 60.9 (16-OCH3), 59.5 (18-OCH3), 59.06 (6-OCH3), 55.6 (1-OCH3), 50.7 (C-19), 50.51 (C-11), 50.50 (N-CH2-CH3), 45.4 (C-5), 43.7 (C-4), 43.40 (C-9), 41.9 (C-7), 40.5 (C-10), 35.3 (C-12), 34.49 (C-1”,C-7”), 28.8 (C-2”, C-6”), 26.54 (C-3”, C-5”), 24.05 (C-4”), 11 (N-CH2-CH3).
ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）−スベレート（ＳＤＤ）および−ピメレート（ＰＤＤ）アルカロイドの評価：
ヒト腫瘍細胞株に対するインビトロ細胞毒性試験
材料および方法
ヒト腫瘍細胞株Ａ５４９（肺癌）、ＨＣＴ−１５（大腸癌）およびＭＣＦ−７（乳癌）は、国立癌研究所（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）の開発的治療プログラムから得た。細胞は、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（いずれもＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ （Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）を用いて日常的に増殖させた。それらは５％のＣＯ２を含む湿性大気下で３７℃にてペトリ皿（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）上で成長させた。細胞は４日ごとに複製し、培地は合間に１度交換した。
【００７３】
細胞毒性は、試験すべき化合物の存在下で２４時間増殖させた、指数関数的に増殖した細胞において評価した。簡潔には、４０００個の細胞を２００μＬの完全培地を含む９６ウェルプレートに播種した；２４時間後、培地に一連の異なる濃度の化合物を補い、接触を２４時間維持した。化合物を純水に溶解し、０．２２μｍのポリカーボネート濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｍｏｌｓｈｅｉｍ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して滅菌した。その後、再び細胞を４８時間増殖させた；生存可能で代謝的に活性のある細胞を、ＭＴＴ色素（１−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３，５−ジフェニルホルマザン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｉｍｉｅ， Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）による着色により定量的に推定した。細胞の数を５０％減少させた物質の量は細胞毒性を示し、化合物のＩＣ５０を表わす。
【００７４】
以下の表１は、３つのビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）およびビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（ＰＤＤ）の細胞毒性効果を示す。
【００７５】
より正確には、表１に以下のＩＣ５０値（μＭ）を要約する：
−ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）、
−ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）、
−ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（ＰＤＤ）、および
−８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニン（比較１）、および
−４つの主要な抗癌剤（比較２）、国立癌研究所の開発的治療プログラムのデータベースに示されるものであり、次のものである：
・フルオロウラシル（すなわち、５−ＦＵ）、
・シスプラチン、
・エトポシド、
・メファラン
これらを、以下の細胞で試験した：
−Ａ５４９、
−ＨＣＴ−１５、および
−ＭＣＦ−７ヒト腫瘍細胞株。
【表１】
【００７６】
表１から、本発明に係る全ての化合物が阻害効果を示すことがわかる。２つのＳＤＤおよびＰＤＤにおいて最高の結果が得られ、４つの主要な抗癌剤（比較２）に匹敵する値を示した。他方、ＡＤＤは、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンと非常に類似した阻害効果を示した。
【００７７】
以下に、これら３つの本発明に係る化合物のうち最も強力なビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）において行った研究を記載する。
【００７８】
分配係数：ＳＤＤのｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）
水／オクタノールの間の分配係数は、化合物の水／脂肪−可溶性の評価を可能にする。これは、様々な生物学的障壁の侵入および生物における分散といった薬物動態学パラメーターの測定において主要な役割を果たす。
【００７９】
この研究における相対的なｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）は、A microscale HPLC method for the evaluation of octanol-water partition coefficients in a series of new 2-amino-2oxazolines Pehourcq, F.; Thomas, J.; Jarry, C., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. (2000), 23, 443-453に開示されるようなマイクロＨＰＬＣ法により評価した。
【００８０】
これらの測定はクロマトグラフィー装置で行なった(Spectra Series, San Jose, USA)。次の逆相カラムを使用した：アセトニトリル（＋１‰トリフルオロ酢酸）−水（＋１‰トリフルオロ酢酸）（４０：６０ｖ／ｖ）から成る移動相によるＳｔａｂｉｌｉｔｙＲＰ１８（４．６×１５０ｍｍ；５μｍ粒子サイズ）。
【００８１】
化合物を、ｎ−オクタノール（ＨＰＬＣ等級）とリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）との間で分離した。オクタノールは緩衝液で予め且つ反対に飽和させた。１ｍｇ／ｍＬの原液を得るために、１ｍｇの化合物を適切な量のメタノールに溶解した。その後、適切な分割量のこのメタノール溶液を緩衝液に溶解し、終濃度１００μｇ／ｍＬを得た。上記のクロマトグラフィー条件の下、２０μＬのこの水相をクロマトグラフに注入し、分割（Ｗ０）前のピーク面積を測定した。
【００８２】
スクリューキャップをしたチューブにおいて、その後、２０００μＬの水相（Ｖａｑ）を１０μＬのｎ−オクタノール（Ｖｏｃｔ）（ｐＨ＝７．４）に添加した。その混合物を機械的な回転により３０分間振盪した。遠心分離を３０００ｒｐｍで１５分間行った。２０μＬの量の下相をクロマトグラフカラムに注入した。これは分割（Ｗ１）後にピーク面積の測定を可能にした。ＬｏｇＤは次式から計算した：ＬｏｇＤ＝Ｌｏｇ［（Ｗ０−Ｗ１）Ｖａｑ／Ｗ１Ｖｏｃｔ。］。
【００８３】
化合物ＳＤＤに関して、２．８６のｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）の値は、相対的に高い脂溶性を意味し、様々な生物学的障壁の膜貫通侵入および生物内の分散に好ましい（Lipinski, C.A.; Lombardo, F.; Dominy, B.W.; Feeney, P.J., Adv. Drug Delivery Rev. (1997), 23, 3-25参照）。
【００８４】
脂溶解性の経験的な尺度が開示される、創薬および開発設定における可溶性および透過性を推定するための実験的および計算上のアプローチ。
【００８５】
種々の腫瘍細胞株の細胞周期停止に対するビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）の効果
方法
１０６細胞のＡ５４９、ＨＣＴ−１５およびＭＣＦ−７細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を有するペトリ皿に播種した。２４時間後、ＳＤＤは２０μＭの濃度で水に溶解され、培地に直接添加された。接触を７２時間維持した。その後、細胞をトリプシン処理して取り外し、採取し、ＰＢＳによりリンスし、血球計数器でカウントした。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけた後、２．５×１０６細胞／ｍＬを得るために決まった量に再懸濁した。１００μＬの細胞浮遊液をトリプシンで１０分間消化し、核とした。その後、トリプシンインヒビターおよびＲＮＡｓｅを含む溶液を細胞浮遊液に添加し、１０分間放置した。最後に、細胞をプロピジウムヨウ化物で染色し、フローサイトメトリー装置により分析した。細胞周期の異なる時期における細胞の分散を、A detergent-trypsin method for preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Vindelov, L.; Christensen, I.; Nissen, N.; Cytometry (1983), 3, 323 - 327に開示される手法により決定した。
【００８６】
以下の表２は、以下の細胞から得られた結果を要約している：
−Ｇ０Ｇ１：Ｇ０Ｇ１期の細胞
−Ｇ２Ｍ：Ｇ２Ｍ期の細胞
−Ｓ：ＤＮＡ合成期の細胞
−Ｓｕｂ Ｇ１：アポトーシス細胞
−ＳＵＰ Ｇ２Ｍ：二倍体細胞。
【表２】
【００８７】
以下の表３は、種々の細胞周期における生存細胞のパーセンテージを要約している。
【表３】
【００８８】
結果
表２に示すように、ＳＤＤは、２０μＭの用量で、Ｇ２Ｍ期およびＳ期において、Ａ５４９およびＨＣＴ−１５細胞の著しい蓄積およびＭＣＦ−７細胞の中程度の蓄積をもたらし、これは発生のこの段階における細胞周期停止の特徴である。アポトーシス細胞（Ｓｕｂ Ｇ１）の数は、ＨＣＴ−１５細胞株を有する試験において著しく増大した。
【００８９】
Ｇ２Ｍ期における細胞の数は、Ａ５４９およびＨＣＴ−１５細胞株においてそれぞれ８５％および７５％まで増大し、Ｓ期で停止した細胞の数は、コントロールと比較して両細胞種において１００％を超えて増大したことに留意すべきである。
【００９０】
ＳＤＤ処理において、Ｇ２Ｍ期およびＳ期における蓄積の同様の傾向ＭＣＦ−７細胞においても認められるものの、程度は低い。細胞周期に対する効果はＳＤＤの細胞毒性に関与しなかった：細胞周期におけるＡ５４９細胞の分布はＩＣ５０に近いＳＤＤ濃度にて変更された一方、周期におけるＭＣＦ−７細胞分布は、ＩＣ５０よりも５倍高いＳＳＤ濃度において変更されない。このことは、我々に、ＤＮＡ合成の阻害およびＧ２Ｍ期のブロックに限定されない複数の作用機構を推測させる。
【００９１】
トポイソメラーゼＩ切断活性に対するＳＤＤの効果の研究
ＤＮＡトポイソメラーゼ１（すなわちＴｏｐ１）は、複製、転写、組換えおよびクロマチンリモデリングを含むほとんどのＤＮＡ処理に関連するＤＮＡトポロジーの調節に関与する必須の核酵素である。その役割は、切断された鎖の３’−リン酸と酵素との間の共有結合の形成を介して、二本鎖ＤＮＡに一時的な一本鎖の破壊を導入することである。共有結合のＴｏｐ１−ＤＮＡ複合体内において、切断された鎖の周辺における破壊された鎖の回転が、ＤＮＡスーパーコイルの緩和をもたらす。その後、ＤＮＡの連続性は、Ｔｏｐ１により、５’−ヒドロキシル末端の再連結による回復される。カンプトセシン（ＣＰＴ）のようなＴｏｐ１毒は、Ｔｏｐ１−ＤＮＡ複合体を安定化させ、それによりＤＮＡの再連結を阻害する。
【００９２】
ＳＤＤの影響は、カンプトセシンと比較したＴｏｐ１分裂活性について様々な濃度で研究された。
【００９３】
方法は、３’ラベルオリゴヌクレオチドと酵素Ｔｏｐ１、またはＴｏｐ１＋ＣＰＴもしくはＴｏｐ１＋ＳＤＤとのインキュベーションから成る。Ｔｏｐ１は、ＤＮＡ一本鎖突出部の３’末端と共有結合を形成し、その後、ＤＮＡを再連結させ、このことは単一のバンドとして現れ、ポジティブコントロールとしてのカンプトセシンは、複合体Ｔｏｐ１−ＤＮＡを安定化させ、ＤＮＡの再連結を阻害し、このことは二本のバンドとして現れる。
【００９４】
方法
オリゴヌクレオチド標識
裂けやすい鎖の３’末端標識を以前の文献に記載されるとおりに行った：Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Pommier, Y.; Jenkins, J.; Kohlhagen, G.; and Leteurtre, F.; Mutat. Res. (1995), 337, 135-145。
【００９５】
従って、１０ｐｍｏｌのデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを、標識バッファー（１００ｍＭカコジル酸カリウム、ｐＨ７．２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ ＤＴＴ）中で１時間、３７℃でインキュベートした。
【００９６】
反応混合物を、５分間の遠心分離によりＧ−２５セファデックススピンカラムを通過させ、取り込まれていない過剰のヌクレオチドを除去した。
【００９７】
３’標識オリゴヌクレオチドを、同量の非標識相補鎖と混合し、アニーリングバッファー（すなわち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）中で、反応混合物を、５分間９５℃で過熱してアニールさせ、室温まで徐冷した。
【００９８】
Ｔｏｐ１触媒切断アッセイ
Ｔｏｐ１触媒切断アッセイは、自殺酵素と呼ばれる、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドまたは部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの何れかを用いて行った。
【００９９】
それぞれの反応について、１０μＭの濃度で２０ｆｍｏｌの３’標識基質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１５μｇのウシ血清アルブミン、０．２μＭ ＤＴＴおよび１０μＭ ＣＰＴを含む緩衝液中で、ＳＤＤの存在下または非存在下で、室温で１５分間、０．２ｐｍｏｌの精製されたヒト組み換えＴｏｐ１とインキュベートした。
【０１００】
反応を０．５％ＳＤＳの添加によって停止し、（３：１）の比率でバッファー（すなわち、８０％ホルムアミド、１０μＭ ＮａＯＨ、１μＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロモフェノールブルー）を充填し、サンプルを、７Ｍウレアを含む、１６または２０％アクリルアミドＤＮＡシーケンシングゲルに溶解した。
【０１０１】
分解産物のイメージングおよび定量化は、Inhibition of Topoisomerase I cleavage activity by thiol-reactive compounds. Montaudon, D. ; Palle, K. ; Rivory, L. ; Robert, J. ; Douat-Casassus, C. ; Quideau S. ; Bjornsti M. ; Pourquier P ; J. Biol. Chem. (2007), 282, 14403 - 14412に記載されるように、Typhoon Phosphorimager (Amersham Biosciences)を用いて行った。
【０１０２】
結果
４つの異なる濃度：１、１０、１００および１０００μＭで使用したＳＤＤは、カンプトセシンと比較して、Ｔｏｐ１阻害活性を示さなかった。
【０１０３】
トポイソメラーゼＩＩの触媒活性に対するＳＤＤの効果の評価。
【０１０４】
一般に、核酵素ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ＴｏｐｏＩＩ）は、アントラサイクリン、アクリジン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｅｓ）およびエリプティシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅｓ）を含む様々な抗癌剤の一般的な標的であることが認められる。これらの薬剤はすべて、三元複合系ＤＮＡ薬剤−ＴｏｐｏＩＩの形成および安定化を誘導するにもかかわらず、特異的な結合のドメインおよび機構は、効果および抵抗性のような薬剤の薬理学の特徴を決定する、種々の化学基と同等のようには見えない。
【０１０５】
ＴｏｐｏＩＩ触媒活性に対するＳＤＤの潜在的阻害効果の顕色のための試験を、トリパノソーマ・キネトプラスツ（ｋＤＮＡ、ＴｏｐｏＧｅｎ）に由来する連鎖したＤＮＡ基質を非連鎖化し、緩和したＤＮＡ形態にすることにより行った。
【０１０６】
方法
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰおよび０．０２ｇ／ｍｌ ｋＤＮＡを含む以下の標準的反応混合物を行った。
【０１０７】
反応は、核抽出物の添加により開始し、３７℃で２０分のインキュベーションの後、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーを含む変性溶液の添加により停止した。
【０１０８】
その後、サンプルを、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／酢酸（ｐＨ８．０）中で、８０Ｖで４５分間、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
【０１０９】
非連鎖化のためのポジティブコントローは、緩和されたＤＮＡ、開環ＤＮＡおよび共有結合的閉環ＤＮＡの２種の混合物を含む、ＴｏｐｏＧｅｎから得られる非連鎖化ｋＤＮＡマーカーである。連鎖化ＤＮＡはゲルに入らない一方で、非連鎖化ＤＮＡ環は、ゲルに入り移動する。
【０１１０】
ＤＮＡをＵＶ光の下で視覚化し、上記の装置を使用して濃度計のスキャニングにより種々のＤＮＡ形態を定量した。
【０１１１】
エトポシドは、次の文献に記載されるとおり、ポジティブコントロールとして使用した：Differential stabilisation of topoisomerase-II-DNA cleavable complexes doxorubicine and etoposide in doxorubicin-resistant rat glioblastoma cells. Montaudon, D. ; Pourquier, P. ; Denois, F. ; De Tinguy-Moreaud, E. ; Lagarde, P. ; Robert, J.; Eur., J. Biochem. (1997), 245, 307 - 315.
結果
１、１０、１００および１０００μＭの濃度で使用したＳＤＤは、エトポシドと比較して、用量に依存しない様式で、相対的に中程度のＴｏｐｏＩＩ活性の阻害を示した。したがって、ＴｏｐｏＩＩ活性の有意でない阻害を示すものの、それはＳＤＤの濃度に依存しない。
【０１１２】
ＳＤＤ（ＬＤ５０）のための急性毒性測定
マウス予備試験においてＳＤＤの急性全身毒性を評価するために研究を行なった。
【０１１３】
ＳＤＤを以下のように静脈内投与した：
−第１工程において、１匹のメスのスイスマウスに対して、９５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量、
−第２工程において、１匹のメスのスイスマウスに対して、６０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量、
−第３工程において、１匹のメスのスイスマウスに対して、５５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量、および
−第４工程において、２匹のメスのスイスマウスの群に対して、５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量。
【０１１４】
試験項目投与の直後に、９５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．にて処理した動物が死亡したことに注目される。
【０１１５】
試験項目投与の３時間後に、６０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．にて処理した動物が死亡したことに注目される。
【０１１６】
死亡の前に、被食者の反射（Ｐｒｅｙｅｒ’ｓ ｒｅｆｌｅｘ）の減少、正向反射の欠落、緊張度の減少および目を細める状態（ｅｙｅｓ ｐａｒｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ）に関連する自発的活動の減少が生じた。
【０１１７】
試験項目投与の２４時間後における、５５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．で処理した動物の死亡に注目される。死亡の前に、正向反射の減少に関連する自発的活動の減少が生じた。
【０１１８】
５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．で処理した動物では死亡は生じなかった。
【０１１９】
試験項目投与の１時間後に、正向反射の減少（１／２）に関連した自発的活動の減少（２／２）（すなわち、２匹のうち２匹）が記録された。動物は、試験の２日目において、通常の活動に戻った。
【０１２０】
初日および１４日目の間における、マウスの尾のレベルにおける浮腫に注目された。
【０１２１】
動物の体重増加は、研究を通じて正常のままであった。研究の最後に５０ｍｇ／ｋｇで処理した動物の目視による試験では、処理に関連した変化は何ら明らかとならなかった
主要試験
ＳＤＤを５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、５匹のメスのスイスマウスの群に静脈内投与した。実験プロトコールは、医学的装置の生物学的評価に関する国際標準ＮＦ ＥＮ ＩＳＯ １０９９３−１１：「全身毒性のための試験」から確立した。
【０１２２】
研究を通じて死亡は生じなかった。試験項目投与から１時間後において、処理した動物にて、正向反射の減少（２／５）および目を細めた状態（２／５）に関連した自発的活動の減少（５／５）が記録された。試験の２日目において、動物は正常な活動に戻った。
【０１２３】
初日から１４日目の間における、マウスの尾のレベルにおける浮腫に注目された。動物の体重増加は、研究を通じて正常のままであった。研究の最後に５０ｍｇ／ｋｇで処理した動物の目視による試験では、尾のレベルにおける壊死（３／５）のみが明らかとなった。
【０１２４】
結論：
結論として、ＳＤＤに対するマウスＬＤ５０は、静脈内投与を行った場合、５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えることがわかる。
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］部分に関連したアルカロイドである新規化合物に関する。
【０００２】
本発明は、更に、これらの化合物を製造する方法、これらを含む医薬、及び癌の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００３】
現在利用可能な抗癌剤は多種多様であるにもかかわらず、抗増殖活性を示す植物から抽出される新規な天然物質の研究および同定は、未だに優先事項である。入手可能なわずか少数の植物のみがこの観点の下で研究されているが、天然の生物多様性は潜在的な抗癌剤の発見のために非限定的な領域を提供する。
【０００４】
さらに、現在、伝統的な医薬において多数の植物抽出物が使用されているが、それらの有効成分は単離および同定されていないことに注意が払われるべきである。新薬の中では、アルカロイドの天然産物および半合成誘導体が抗増殖活性を有するものとして報告されている。
【０００５】
これらの天然産物の一例は、キルギス共和国にて成育する伝統的な薬用植物であり、これは先行してスクリーニングされてきた。より正確には、この植物はアコニタム（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）属キンポウゲ科に属し、この国において長年癌に対して伝統的に使用されているため、詳細な調査のために選択された。実際、アコニタム・カラコリカム（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｋａｒａｋｏｌｉｃｕｍ）の根は、キルギスの伝統医薬のある処方において癌に対して使用されてきた。
【０００６】
アコニタム・カラコリカム・ラプクス（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｋａｒａｋｏｌｉｃｕｍ Ｒａｐｃｓ）は、葉が多く丈の高い茎（７０−１３０ｃｍ）を持ち、長く込み合った総状花序に青紫または青色の左右相称の花を咲かせる多年草植物である。この植物の地下部分は、互いに並んでくっついて成長する、２．０−２．５×０．７−１．０ｃｍの円錐形の小塊茎を示す。アコニタム・カラコリカムは中央アジアに特有である。
【０００７】
アコニタム種の全ての部分が、ジテルペノイド基のアルカロイドを含む。アルカロイドの最大の含有量は、生長の期間（８月−１０月）後の小塊茎において見つかった。
【０００８】
この植物において同定された主要なアルカロイドは次のとおりである：
−アコニチン（０．８−１％）（ナトリウム・チャンネルの通常の閉鎖を妨げることにより、強い毒性を有し、中枢的または末梢的効果を示すことが周知である）
−カラコリン（０．０５％）、
−カラコリジン（ｋａｒａｋｏｌｉｄｉｎｅ）（０．０５％）、
−ゾンゴリン（ｚｏｎｇｏｒｉｎｅ）（０．１％）、および
−ゾンゴラミン（ｚｏｎｇｏｒａｍｉｎｅ）（０．０１％）。
【０００９】
ナペリン（Ｎａｐｅｌｌｉｎｅ）、アコニフィン（ａｃｏｎｉｆｉｎｅ）、アセチルナペリンおよびカラコニチン（ｋａｒａｋｏｎｉｔｉｎｅ）もまた同定された。
【００１０】
しかしながら、これらの化合物の何れも、植物抽出物が持つような抗増殖活性を示さないことがわかった。
【００１１】
このため、この活性の原因となるＡ．カラコリカムの根の抽出物に存在する化合物の単離および同定について研究が行われ、A. Chodoeva らの文献（“8-O-Azeloyl-14-benzoylaconine: A new alkaloid from the roots of Aconitum karakolicum Rapcs and its proliferative activities”; Bioorg. Med. Chem. (2005), 13, 6493-6501）に詳述されている。
【００１２】
実際、この文献は、以下の構造（１）を有する新規な化合物：８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンを開示している。
【化１】
【００１３】
アコニンの幾つかの脂肪酸アシルエステルが以前に記述されたものの（Wie, X.; Xie, H. ; Liu, M.; Ge, X., Heterocycles (2000), 53, 2027）、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンは化学文献において記述されていない。
【００１４】
アコニンはそれ自体抗増殖活性を欠くが、以下の構造（２）を有する。
【化２】
【００１５】
上述したアコニチンはアコニンの誘導体であり、以下の構造（３）を有する。
【化３】
【００１６】
一般式Ｃ４１Ｈ５９ＮＯ１３の８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンは、アコニチン誘導体である。これは、実際、アコニチン骨格の炭素８における、アセチル基のアゼライディックアシル（ａｚｅｌａｉｄｉｃ ａｃｙｌ）部分による置換により生じるためである。
【００１７】
８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンの化合物の特徴は、アゼライン酸鎖の末端のカルボキシ官能基の負電荷とヘテロ環の窒素原子に形成される第四アンモニウムの正電荷との間における双性イオン構造に存在する。アゼライン鎖の長さが決まると、これらの２部分間の内部イオン結合を仮定することができる。
【００１８】
アゼライン酸に関して、それは、腫瘍細胞におけるミトコンドリアのオキシドリダクターゼの阻害剤であることが示された(Picardo, M.; Passi, S.; Sirlanni, M. C.; Fiorilli, M.; Russo, G. D.; Cortesi, E.; Barile, G.; Breathnach, A. S.; NazzaroPorro, M.; Biochem. Pharmacol. (1985), 34,1653)。
【００１９】
結論として、アゼライン酸は一般的な抗腫瘍剤であることが提案された(Breathnach, A. S., Med. Hypotheses, (1999), 52, 221)。
【００２０】
アゼライン酸はＮＣＩのインビトロスクリーニングパネルにおいて試験されていないが、マウス腫瘍において、インビボで実験が行われ、抗腫瘍活性が全く存在しないと結論されている。
【００２１】
したがって、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンにて観察された抗増殖活性は、その個々の成分の活性に起因しえない。
【００２２】
しかしながら、上述のＡ．Ｃｈｏｄｏｅｖａらの文献によると、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンは、培養されるヒト腫瘍細胞の以下の３つの株に対する抗増殖性インビトロ活性の原因であることがわかった：
−ＨＴＣ−１５（大腸癌）、
−Ａ５４９（肺癌）、
−ＭＣＦ−７（乳癌）。
【００２３】
これら３つ細胞株におけるＩＣ５０は約１０−１８μＭであり、これは、いくつかのクラスに属する主要な抗癌剤（すなわち、代謝拮抗剤、アルキル化剤、白金（ｐｌａｔｉｎｉｕｍ）化合物、トポイソメラーゼ阻害剤）の活性に匹敵する。
【００２４】
上述の通り、ヒト腫瘍細胞に対する抗増殖活性を示す新規化合物が集中的に探索される。
【００２５】
したがって、本発明の目的は、癌に対して非常に興味深く有望な特性を示したデザイン８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンの改良、および癌化学療法に有用な新規化合物を提供することである。
【００２６】
本発明に関して、この目的は、第一に、［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］部分と関係するアルカロイドである、癌化学療法に有用な新規の化合物を提供することにより解決される。
【００２７】
より正確には、これらの新規化合物はビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステルである。
【００２８】
したがって、本発明に関して、以下の一般的構造（Ｉ）を有する新規化合物が提供される。
【化４】
【００２９】
ここにおいて、ｎは、０および１０の間、好ましくは３および１０の間、より好ましくは４および８の間に含まれる整数である。
【００３０】
それゆえ、本発明に係る好ましい化合物は、
−ｎが５である化合物、すなわち化合物ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（すなわちＰＤＤ）、
−ｎが６である化合物、すなわち化合物ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（すなわちＳＤＤ）、
−ｎが７である化合物、すなわちビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（すなわちＡＤＤ）である。
【００３１】
したがって、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレートは以下の構造を有する。
【化５】
【００３２】
したがって、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（すなわちＳＤＤ）は以下の構造を有する。
【化６】
【００３３】
したがって、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（すなわちＡＤＤ）は以下の構造を有する。
【化７】
【００３４】
本発明の別の目的は、本発明に係る化合物を製造する方法に関する。
【００３５】
本発明に係る化合物は、アコニチン部分に位置する８−アセチル官能基において行われるエステル転移反応により得られる。
【００３６】
アコニチンからの反応は、分解の産物の形成を回避し且つエステル転移反応を最適化するように制御された反応時間および温度にて達成される。
【００３７】
これは、対応するモノ−［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］およびビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステルをもたらす。したがって、本発明に係るビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］エステルを単離するために、精製の工程が必要である。
【００３８】
より正確には、本発明に係る化合物の製造方法は以下の工程を含む：
ａ）ＤＭＦなどの溶媒中にて、８０℃以下の温度でアコニチンをジカルボン酸と共に撹拌する（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）工程、
ｂ）得られた混合物を、エステル転移反応が行われるように室温でかき混ぜる（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）工程、
ｃ）前記溶媒を減圧下で蒸発させる工程、
ｄ）前記工程ｃ）の終わりにおいて得られる油状残渣を精製して、前記化合物（Ｉ）を単離する工程。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、ジカルボン酸は、２および１２、好ましくは５および１２、より好ましくは６および１０の間に含まれる数の炭素原子を有するジカルボン酸の中から選択してよい。
【００４０】
最も好ましくは、ジカルボン酸は、ピメリン酸、スベリン酸およびアゼライン酸から成る群から選択してよい。
【００４１】
工程ａ）の撹拌は、７０℃および８０℃の間に含まれる温度で、反応を行うのに十分な時間、最も好ましくは７時間実行してよい。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によると、工程ｂ）の揺り動かしは、反応を最適化するために１６時間実行される。
【００４３】
より好ましくは、工程ｃ）の溶媒の蒸発は７０℃以下の温度で実行される。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態によると、工程ｄ）の精製は、セミ分取高速液体クロマトグラフィーにより実行される。
【００４５】
前記セミ分取高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りであってよい：
−溶媒Ａ：トリフルオロ酢酸／水；比率１／１０００；
−溶媒Ｂ：トリフルオロ酢酸／アセトニトリル，比率１／１０００。
【００４６】
溶出条件は、０．５ｍＬの容量の注入；２５％のＢを３０分間で１００％とする勾配であってよい。
【００４７】
吸収率は２３４ｎｍでモニターされる。
【００４８】
本発明の別の目的は、本発明に係る化合物を含む医薬組成物である。
【００４９】
医薬組成物は、さらに、適切で医薬的に許容可能な希釈剤または担体物質を含んでよい。
【００５０】
本発明に関して、上述の医薬組成物は、錠剤、カプセル、小滴および坐薬の形態、経口、経直腸または非経口の使用のための注射または注入の製剤とすることができる。そのような投与形態およびそれらの生成物は当業者に既知である。
【００５１】
さらに、本発明は、医薬の製造のための本発明に係る化合物の使用に関する。
【００５２】
より正確には、本発明は、前記医薬が腫瘍疾病の治療のために使用される、本発明に係る化合物の使用に関する。前記腫瘍疾病は、大腸癌、肺癌または乳癌であってよい。
【００５３】
以下の例はさらに本発明を例証する。しかし、当然、その範囲を限定する任意の方法として解釈されるべきでない。
【００５４】
第１に、種々の技術の条件が詳述される：
−ＨＰＬＣ、
−質量分光法、
−ＮＭＲ。
【００５５】
全ての例に関して、ＨＰＬＣ精製に使用される条件は以下の通りである：
使用されるカラム：Ｕｌｔｒａｓｅｐ ＥＳ １０、ＲＰ１８６．０μｍ逆相、Ｃ１８カラム、２５０ｘ１０ｍｍ（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
使用される溶媒：
・Ａ：トリフルオロ酢酸／水；比率１／１０００；
・Ｂ：トリフルオロ酢酸／アセトニトリル，比率１／１０００；
溶出条件：０．５ｍＬの容量の注入；２５％のＢを３０分間で１００％とする勾配。
吸収率は２３４ｎｍでモニターされる。
【００５６】
全ての例に関して、質量分光法の条件は以下の通りである：
高分解能ＥＳＩ質量測定は、エレクトロスプレーソースを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱＳｔａｒｍａｓｓスペクトロメーターを用いて、ポジティブモードにて行った。
【００５７】
エレクトロスプレーニードルは、５０００Ｖに維持され、室温で操作した。
【００５８】
サンプルは、注入により、１０μＬサンプルループを通して、２００μＬ／分のメタノールの流れにＬＣポンプから導入した。
【００５９】
ＭＳ２分析は、３０から５０にわたる衝突エネルギーおよび５から１０にわたるＣＡＤ衝突ガスを用いて行われる。
【００６０】
全ての例に関して、核磁気共鳴（ＮＭＲ）の条件は以下の通りである：
１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲ実験を、５ｍｍブロードバンドプローブおよびＢｏグラジエントを備えたＢｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００分光計を用いて、１Ｈおよび１３Ｃの実験に対してそれぞれ４００．１３および１００．６ＭＨｚにて行った。全てのスペクトルは、０．７ｍＬのＣＤＣｌ３に溶解した９ｍｇの物質を使用して記録した。化学シフト（ｐｐｍ）はＴＭＳに関して与えられる。１Ｈ−１Ｈシフト相関２次元（ＣＯＳＹ）スペクトルが、ＣＯＳＹ９０パルスシーケンスを使用して得られる（Picardo, M.; Passi, S.; Sirlanni, M.C.; Fiorilli, M.; Russo, G.D.; Cortesi, E.; Barile, G.; Breathnach, A.S.; Nazzaro-Porro, M., Biochem. Pharmacol. (1985), 34, 1653参照）。
【００６１】
炭素のタイプは２つの実験１Ｄ（ＤＥＰＴ９０および１３５）により定義される。単結合１Ｈ−１３Ｃ化学シフト相関関係（ＨＭＱＣ）スペクトルは、１３Ｃ炭素に連結された１Ｈの選択のためのＢｏグラジエントパルス用いてＢａｘ配列に従って得られた（Reference is made to Breathnach, A.S. Med. Hypoth. (1999), 52, 221）。
【００６２】
ＨＭＱＣ実験では、Ｂｏグラジエントパルスは、１３Ｃ核に連結した１Ｈを選択するように適用されたため、１Ｈ検出異核多重結合相関関係（ＨＭＢＣ）スペクトルは、ローパスＪｎフィルター（３．８ｍｓ）に関するＢａｘおよびＳｕｍｍｅｒｓにより提案されたパルスシーケンス並びにロングレンジカップリングを観察するための遅延（６０ｍｓ）を使用して記録した。グラジエント選択ＮＯＥＳＹスペクトルは、ＮＯＥＳＹＧＰＰＨ Ｂｒｕｋｅｒパルスプログラムにより得られた。
【００６３】
以下に、本発明に係る３つの化合物の合成および特徴が詳述される。
【００６４】
Ａ）ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（ＰＤＤ）
化合物の合成
アコニチン（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびピメリン酸（２４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にて、８０℃で７時間、よく撹拌した。その混合物を、室温で一晩揺り動かす（ａｇｉｔａｔｅｄ）。その後、溶媒を７０℃以下の温度にて減圧下で蒸発させる。油状残渣をセミ分取高速液体クロマトグラフィーにより精製する。
【００６５】
得られた化合物のＮＭＲ特徴：
白色粉末 : 1H NMRスペクトル (400.13 MHz, CDCl3)は次の通りである。 δ: 8.1 (d, 4H, J = 7.6, H-2'/H-6'), 7.71 (t, 2H, J = 7.4, H-4'), 7.58 (t, 4H, J = 7.6, H-3'/H-5'), 5.04 (d, 2H, J = 4.4, H-14), 4.63 (d, 2H, J = 5.2, H-15), 4.44 (br s, 2H, H-3), 4.27 (br d, 2H, H-6), 3.92 (ma, 2H, H-19b), 3.95 (s, 6H, 16-OCH3), 3.67 (s, 2H, H-18ba), 3.64 (m,2H, H-1), 3.53 (s, 6H, 1-OCH3), 3.48 (s, 2H, H-17), 3.47 (s, 6H, 18-OCH3), 3.41 (s, 2H, 18aa), 3.39 (br d, 2H, H-16), 3.36 (s, 6H, 6-OCH3), 3.31 (ma, 2H, H-19a), 3.33 (ma, 4H, N-CH2-CH3), 3.08 (ma, 2H, H-9), 3.06 (s, 2H, H-5), 2.74 (br d, 2H, H-7), 2.58 (br s, 2H, H-2b), 2.51 (br d, 2H, H-12b), 2.49 (ma, 2H, H-10), 2.07 (d, 2H, J = 10, H-12a), 1.87 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"b, 8-CO2-(CH2)6"b), 1.60 (m, 10H, 8-CO2-(CH2)1"a, 8-CO2-(CH2)5”a, N-CH2-CH3, H-2aa), 1.12 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”b, 8-CO2-(CH2)4”b), 0.95 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”a, 8-CO2-(CH2)4”a), 0.72 (quint, 2H, J = 7.2, 8-CO2-(CH2)3”). 13C NMR (CDCl3) δ: 174.9 (8-COO, 8-COO”), 165.76 (C-7'), 133.8 (C-4'), 129.9 (C-2'/C-6'), 129.5 (C-1'), 129 (C3'/C-5'), 90 (C-16), 89.98 (C-8), 82.48 (C-6), 79.83 (C-1), 78.12 (C-15), 78.45 (C-14), 75.79 (C-18), 74.02 (C-13), 69.9 (C-3), 63.12 (C-17), 62.01 (16-OCH3), 59.3 (18-OCH3), 59.05 (6-OCH3), 55.36 (1-OCH3), 50.63 (C-19), 50.42 (C-11), 50.38 (N-CH2-CH3), 45.0 (C-5), 43.42 (C-4), 43.47 (C-9), 41.91 (C-7), 40.09 (C-10), 35.01 (C-12), 34.27 (C-1", C-5"), 29.49(C-2", C-4"), 28.02 (C-2), 23.86 (C-3"), 10;99 (N-CH2-CH3)。
【００６６】
Ｂ）ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）
化合物の合成
アコニチン（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびスベリン酸（２６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で、８０℃で７時間よく撹拌した。その混合物を室温で一晩揺り動かす。その後、溶媒を７０℃以下の温度にて減圧下で蒸発させる。油状残渣をセミ分取高速液体クロマトグラフィーにより精製する。
【００６７】
得られた化合物の特徴：
白色粉末: 1H NMRスペクトル (400.13 MHz, CDCl3)は次の通りである。δ: 8.00 (d, 4H, J = 7.8, H-2'/H-6'), 7.58 (t, 2H, J = 7.32, H-4'), 7.46 (t, 4H, J = 7.66, H-3'/H-5'), 5.04 (d, 2H, J = 4.9, H-14), 4.64 (d, 2H, J = 5.36, H-15), 4.43 (br s, 2H, H-3), 4.28 (d, 2H, J = 6.1, H-6), 3.97 (d, 2H, J = 12.96, H-19b), 3.94 (s, 6H, 16-OCH3), 3.67 (s, 2H, H-18ba), 3.64 (m,2H, H-1), 3.53 (s, 6H, 1-OCH3), 3.47 (s, 2H, H-17), 3.43 (s, 6H, 18-OCH3), 3.41 (s, 2H, 18aa), 3.39 (d, 2H, J = 5.4, H-16), 3.36 (s, 6H, 6-OCH3), 3.31 (d, 2H, J = 12.96, H-19a), 3.30 (ma, 4H, N-CH2-CH3), 3.10 (m, 2H, H-9), 3.07 (s, 2H, H-5), 2.74 (d, 2H, J = 6.1, H-7), 2.58 (br s, 2H, H-2b), 2.51 (br d, 2H, H-12b), 2.49 (m, 2H, H-10), 2.07 (d, 2H, J = 9.9, H-12a), 1.94 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"b, 8-CO2-(CH2)6"b), 1.63 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"a, 8-CO2-(CH2)6"a), 1.60 (t, 6H, J = 6.98, N-CH2-CH3), 1.56 (br d, 2H, H-2aa), 1.24 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”b, 8-CO2-(CH2)5”b), 1.09 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)2”a, 8-CO2-(CH2)5”a), 0.83 (m, 4H, 8-CO2-(CH2)3”, 8-CO2-(CH2)4”). 13C NMR (CDCl3) δ: 175.1 (8-COO, 8-COO”), 165.8 (C-7'), 133.8 (C-4'), 129.9 (C-2'/C-6'), 129.5 (C-1'), 129 (C3'/C-5'), 90 (C-16), 89.97 (C-8), 82.51 (C-6), 79.82 (C-1), 78.82 (C-15), 78.40 (C-14), 75.75 (C-18), 74.01 (C-13), 70 (C-3), 63.13 (C-17), 61.95 (16-OCH3), 59.26 (18-OCH3), 59.01 (6-OCH3), 55.29 (1-OCH3), 50.64 (C-19), 50.51 (C-11), 50.28 (N-CH2-CH3), 45.0 (C-5), 43.43 (C-4), 43.40 (C-9), 41.87 (C-7), 40.06 (C-10), 35.0 (C-12), 34.49 (C-1”, C-6”), 29.50 (C-2), 28.54 (C-3”, C-4”), 24.05 (C-2”, C-5”), 10;94 (N-CH2-CH3)。
【００６８】
更に、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレートのＥＳＩスペクトルを実行した。２つのピークがこのスペクトル上で観察される：２重に帯電した質量に相当するｍ／ｚ６７３．３の主要なもの、および単独に帯電したピークに相当するｍ／ｚ１３４５．７のマイナーなもの。このスペクトルによって確認することができる。
【００６９】
さらに、高解像度質量測定を、合成された化合物の式を確認するために行なった。単独帯電したピークで得られた実験の質量は１３４５．６８２９である。式Ｃ７２Ｈ１０１Ｎ２Ｏ２２のための理論的な質量は１３４５．６８４０（高解像度質量）である。
【００７０】
さらに、ＭＳ２実験を行なった。これらの測定は単独帯電および２重帯電したピークにて行った。ｍ／ｚ１３４６．７（単独帯電ピーク）の破片化は、アコニチン単位の１つの喪失に対応するｍ／ｚ７６０の主要な破片化ピークをもたらした。ｍ／ｚ６７３（２重帯電ピーク）の破片化は、アコニチン単位の破片化の機構に対応する、より多くの断片をもたらした。
【００７１】
Ｃ）ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）
化合物の合成：
アコニチン（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびアゼライン酸（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で、８０℃で７時間よく撹拌した。その混合物を室温で一晩揺り動かす。その後、溶媒を７０℃以下の温度にて減圧下で蒸発させる。油状残渣はセミ分取高速液体クロマトグラフィーにより精製される。
【００７２】
得られた化合物の特徴：
白色粉末 : 1H NMRスペクトル (400.13 MHz, CDCL3)は次の通りである。δ: 8.03 (d, 4H, J = 7.2, H-2'/H-6'), 7.56 (t, 2H, J = 7.4, H-4'), 7.45 (t, 4H, J = 7.2, H-3'/H-5'), 5.09 (d, 2H, J = 5, H-14), 4.51 (d, 2H, J = 5.2, H-15), 4.30 (br s, 2H, H-3), 4.12 (d, 2H, J = 6.1, H-6), 4.06 (d, 2H, J = 11.91, H-19b), 3.79 (s, 6H, 16-OCH3), 3.52 (s, 2H, H-18ba), 3.47 (m,2H, H-1), 3.36 (s, 6H, 1-OCH3), 3.29 (s, 2H, H-17), 3.27 (s, 6H, 18-OCH3), 3.24 (s, 2H, 18aa), 3.22 (br s, 2H, H-16), 3.19 (s, 6H, 6-OCH3), 3.11 (d, 2H, J = 11.9, H-19a), 3.16 (m, 4H, N-CH2-CH3), 2.90 (m, 2H, H-9), 2.86 (s, 2H, H-5), 2.55 (d, 2H, J = 6.1, H-7), 2.34 (br s, 2H, H-2b), 2.28 (br d, 2H, H-12b), 2.24 (m, 2H, H-10), 2.02 (br d, 2H, H-12a), 1.82 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"b, 8-CO2-(CH2)7"b), 1.50 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)1"a, 8-CO2-(CH2)7"a), 1.42 (t, 6H, J = 7.01, N-CH2-CH3), 1.35 (br s, 2H, H-2aa), 1.13 (m, 4H, 8-CO2-(CH2)2"b, 8-CO2-(CH2)3"b, 8-CO2-(CH2)5"b, 8-CO2-(CH2)6"b), 1.04 (m, 4H, 8-CO2-(CH2)2"a, 8-CO2-(CH2)3"a, 8-CO2-(CH2)5"a, 8-CO2-(CH2)6"a), 0.87 (m, 2H, 8-CO2-(CH2)4"). 13C NMR (CDCl3) δ: 175.1 (8-COO, 8-COO”), 166 (C-7'), 134 (C-4'), 130 (C-2'/C-6'), 129.7 (C-1'), 129,3 (C3'/C-5'), 90,3 (C-16), 90.1 (C-8), 82.9 (C-6), 80,1 (C-1), 79,0 (C-15), 78.7 (C-14), 76,0 (C-18), 74.3 (C-13), 70,3 (C-3), 63.4 (C-17), 60.9 (16-OCH3), 59.5 (18-OCH3), 59.06 (6-OCH3), 55.6 (1-OCH3), 50.7 (C-19), 50.51 (C-11), 50.50 (N-CH2-CH3), 45.4 (C-5), 43.7 (C-4), 43.40 (C-9), 41.9 (C-7), 40.5 (C-10), 35.3 (C-12), 34.49 (C-1”,C-7”), 28.8 (C-2”, C-6”), 26.54 (C-3”, C-5”), 24.05 (C-4”), 11 (N-CH2-CH3).
ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）−スベレート（ＳＤＤ）および−ピメレート（ＰＤＤ）アルカロイドの評価：
ヒト腫瘍細胞株に対するインビトロ細胞毒性試験
材料および方法
ヒト腫瘍細胞株Ａ５４９（肺癌）、ＨＣＴ−１５（大腸癌）およびＭＣＦ−７（乳癌）は、国立癌研究所（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）の開発的治療プログラムから得た。細胞は、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（いずれもＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ （Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）を用いて日常的に増殖させた。それらは５％のＣＯ２を含む湿性大気下で３７℃にてペトリ皿（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）上で成長させた。細胞は４日ごとに複製し、培地は合間に１度交換した。
【００７３】
細胞毒性は、試験すべき化合物の存在下で２４時間増殖させた、指数関数的に増殖した細胞において評価した。簡潔には、４０００個の細胞を２００μＬの完全培地を含む９６ウェルプレートに播種した；２４時間後、培地に一連の異なる濃度の化合物を補い、接触を２４時間維持した。化合物を純水に溶解し、０．２２μｍのポリカーボネート濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｍｏｌｓｈｅｉｍ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して滅菌した。その後、再び細胞を４８時間増殖させた；生存可能で代謝的に活性のある細胞を、ＭＴＴ色素（１−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３，５−ジフェニルホルマザン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｉｍｉｅ， Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）による着色により定量的に推定した。細胞の数を５０％減少させた物質の量は細胞毒性を示し、化合物のＩＣ５０を表わす。
【００７４】
以下の表１は、３つのビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）、ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）およびビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（ＰＤＤ）の細胞毒性効果を示す。
【００７５】
より正確には、表１に以下のＩＣ５０値（μＭ）を要約する：
−ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−アゼレート（ＡＤＤ）、
−ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）、
−ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−ピメレート（ＰＤＤ）、および
−８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニン（比較１）、および
−４つの主要な抗癌剤（比較２）、国立癌研究所の開発的治療プログラムのデータベースに示されるものであり、次のものである：
・フルオロウラシル（すなわち、５−ＦＵ）、
・シスプラチン、
・エトポシド、
・メファラン
これらを、以下の細胞で試験した：
−Ａ５４９、
−ＨＣＴ−１５、および
−ＭＣＦ−７ヒト腫瘍細胞株。
【表１】
【００７６】
表１から、本発明に係る全ての化合物が阻害効果を示すことがわかる。２つのＳＤＤおよびＰＤＤにおいて最高の結果が得られ、４つの主要な抗癌剤（比較２）に匹敵する値を示した。他方、ＡＤＤは、８−Ｏ−アゼロイル−１４−ベンゾイルアコニンと非常に類似した阻害効果を示した。
【００７７】
以下に、これら３つの本発明に係る化合物のうち最も強力なビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）において行った研究を記載する。
【００７８】
分配係数：ＳＤＤのｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）
水／オクタノールの間の分配係数は、化合物の水／脂肪−可溶性の評価を可能にする。これは、様々な生物学的障壁の侵入および生物における分散といった薬物動態学パラメーターの測定において主要な役割を果たす。
【００７９】
この研究における相対的なｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）は、A microscale HPLC method for the evaluation of octanol-water partition coefficients in a series of new 2-amino-2oxazolines Pehourcq, F.; Thomas, J.; Jarry, C., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. (2000), 23, 443-453に開示されるようなマイクロＨＰＬＣ法により評価した。
【００８０】
これらの測定はクロマトグラフィー装置で行なった(Spectra Series, San Jose, USA)。次の逆相カラムを使用した：アセトニトリル（＋１‰トリフルオロ酢酸）−水（＋１‰トリフルオロ酢酸）（４０：６０ｖ／ｖ）から成る移動相によるＳｔａｂｉｌｉｔｙＲＰ１８（４．６×１５０ｍｍ；５μｍ粒子サイズ）。
【００８１】
化合物を、ｎ−オクタノール（ＨＰＬＣ等級）とリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）との間で分離した。オクタノールは緩衝液で予め且つ反対に飽和させた。１ｍｇ／ｍＬの原液を得るために、１ｍｇの化合物を適切な量のメタノールに溶解した。その後、適切な分割量のこのメタノール溶液を緩衝液に溶解し、終濃度１００μｇ／ｍＬを得た。上記のクロマトグラフィー条件の下、２０μＬのこの水相をクロマトグラフに注入し、分割（Ｗ０）前のピーク面積を測定した。
【００８２】
スクリューキャップをしたチューブにおいて、その後、２０００μＬの水相（Ｖａｑ）を１０μＬのｎ−オクタノール（Ｖｏｃｔ）（ｐＨ＝７．４）に添加した。その混合物を機械的な回転により３０分間振盪した。遠心分離を３０００ｒｐｍで１５分間行った。２０μＬの量の下相をクロマトグラフカラムに注入した。これは分割（Ｗ１）後にピーク面積の測定を可能にした。ＬｏｇＤは次式から計算した：ＬｏｇＤ＝Ｌｏｇ［（Ｗ０−Ｗ１）Ｖａｑ／Ｗ１Ｖｏｃｔ。］。
【００８３】
化合物ＳＤＤに関して、２．８６のｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）の値は、相対的に高い脂溶性を意味し、様々な生物学的障壁の膜貫通侵入および生物内の分散に好ましい（Lipinski, C.A.; Lombardo, F.; Dominy, B.W.; Feeney, P.J., Adv. Drug Delivery Rev. (1997), 23, 3-25参照）。
【００８４】
脂溶解性の経験的な尺度が開示される、創薬および開発設定における可溶性および透過性を推定するための実験的および計算上のアプローチ。
【００８５】
種々の腫瘍細胞株の細胞周期停止に対するビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレート（ＳＤＤ）の効果
方法
１０６細胞のＡ５４９、ＨＣＴ−１５およびＭＣＦ−７細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を有するペトリ皿に播種した。２４時間後、ＳＤＤは２０μＭの濃度で水に溶解され、培地に直接添加された。接触を７２時間維持した。その後、細胞をトリプシン処理して取り外し、採取し、ＰＢＳによりリンスし、血球計数器でカウントした。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけた後、２．５×１０６細胞／ｍＬを得るために決まった量に再懸濁した。１００μＬの細胞浮遊液をトリプシンで１０分間消化し、核とした。その後、トリプシンインヒビターおよびＲＮＡｓｅを含む溶液を細胞浮遊液に添加し、１０分間放置した。最後に、細胞をプロピジウムヨウ化物で染色し、フローサイトメトリー装置により分析した。細胞周期の異なる時期における細胞の分散を、A detergent-trypsin method for preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Vindelov, L.; Christensen, I.; Nissen, N.; Cytometry (1983), 3, 323 - 327に開示される手法により決定した。
【００８６】
以下の表２は、以下の細胞から得られた結果を要約している：
−Ｇ０Ｇ１：Ｇ０Ｇ１期の細胞
−Ｇ２Ｍ：Ｇ２Ｍ期の細胞
−Ｓ：ＤＮＡ合成期の細胞
−Ｓｕｂ Ｇ１：アポトーシス細胞
−ＳＵＰ Ｇ２Ｍ：二倍体細胞。
【表２】
【００８７】
以下の表３は、種々の細胞周期における生存細胞のパーセンテージを要約している。
【表３】
【００８８】
結果
表２に示すように、ＳＤＤは、２０μＭの用量で、Ｇ２Ｍ期およびＳ期において、Ａ５４９およびＨＣＴ−１５細胞の著しい蓄積およびＭＣＦ−７細胞の中程度の蓄積をもたらし、これは発生のこの段階における細胞周期停止の特徴である。アポトーシス細胞（Ｓｕｂ Ｇ１）の数は、ＨＣＴ−１５細胞株を有する試験において著しく増大した。
【００８９】
Ｇ２Ｍ期における細胞の数は、Ａ５４９およびＨＣＴ−１５細胞株においてそれぞれ８５％および７５％まで増大し、Ｓ期で停止した細胞の数は、コントロールと比較して両細胞種において１００％を超えて増大したことに留意すべきである。
【００９０】
ＳＤＤ処理において、Ｇ２Ｍ期およびＳ期における蓄積の同様の傾向ＭＣＦ−７細胞においても認められるものの、程度は低い。細胞周期に対する効果はＳＤＤの細胞毒性に関与しなかった：細胞周期におけるＡ５４９細胞の分布はＩＣ５０に近いＳＤＤ濃度にて変更された一方、周期におけるＭＣＦ−７細胞分布は、ＩＣ５０よりも５倍高いＳＳＤ濃度において変更されない。このことは、我々に、ＤＮＡ合成の阻害およびＧ２Ｍ期のブロックに限定されない複数の作用機構を推測させる。
【００９１】
トポイソメラーゼＩ切断活性に対するＳＤＤの効果の研究
ＤＮＡトポイソメラーゼ１（すなわちＴｏｐ１）は、複製、転写、組換えおよびクロマチンリモデリングを含むほとんどのＤＮＡ処理に関連するＤＮＡトポロジーの調節に関与する必須の核酵素である。その役割は、切断された鎖の３’−リン酸と酵素との間の共有結合の形成を介して、二本鎖ＤＮＡに一時的な一本鎖の破壊を導入することである。共有結合のＴｏｐ１−ＤＮＡ複合体内において、切断された鎖の周辺における破壊された鎖の回転が、ＤＮＡスーパーコイルの緩和をもたらす。その後、ＤＮＡの連続性は、Ｔｏｐ１により、５’−ヒドロキシル末端の再連結による回復される。カンプトセシン（ＣＰＴ）のようなＴｏｐ１毒は、Ｔｏｐ１−ＤＮＡ複合体を安定化させ、それによりＤＮＡの再連結を阻害する。
【００９２】
ＳＤＤの影響は、カンプトセシンと比較したＴｏｐ１分裂活性について様々な濃度で研究された。
【００９３】
方法は、３’ラベルオリゴヌクレオチドと酵素Ｔｏｐ１、またはＴｏｐ１＋ＣＰＴもしくはＴｏｐ１＋ＳＤＤとのインキュベーションから成る。Ｔｏｐ１は、ＤＮＡ一本鎖突出部の３’末端と共有結合を形成し、その後、ＤＮＡを再連結させ、このことは単一のバンドとして現れ、ポジティブコントロールとしてのカンプトセシンは、複合体Ｔｏｐ１−ＤＮＡを安定化させ、ＤＮＡの再連結を阻害し、このことは二本のバンドとして現れる。
【００９４】
方法
オリゴヌクレオチド標識
裂けやすい鎖の３’末端標識を以前の文献に記載されるとおりに行った：Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Pommier, Y.; Jenkins, J.; Kohlhagen, G.; and Leteurtre, F.; Mutat. Res. (1995), 337, 135-145。
【００９５】
従って、１０ｐｍｏｌのデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを、標識バッファー（１００ｍＭカコジル酸カリウム、ｐＨ７．２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ ＤＴＴ）中で１時間、３７℃でインキュベートした。
【００９６】
反応混合物を、５分間の遠心分離によりＧ−２５セファデックススピンカラムを通過させ、取り込まれていない過剰のヌクレオチドを除去した。
【００９７】
３’標識オリゴヌクレオチドを、同量の非標識相補鎖と混合し、アニーリングバッファー（すなわち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）中で、反応混合物を、５分間９５℃で過熱してアニールさせ、室温まで徐冷した。
【００９８】
Ｔｏｐ１触媒切断アッセイ
Ｔｏｐ１触媒切断アッセイは、自殺酵素と呼ばれる、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドまたは部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの何れかを用いて行った。
【００９９】
それぞれの反応について、１０μＭの濃度で２０ｆｍｏｌの３’標識基質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１５μｇのウシ血清アルブミン、０．２μＭ ＤＴＴおよび１０μＭ ＣＰＴを含む緩衝液中で、ＳＤＤの存在下または非存在下で、室温で１５分間、０．２ｐｍｏｌの精製されたヒト組み換えＴｏｐ１とインキュベートした。
【０１００】
反応を０．５％ＳＤＳの添加によって停止し、（３：１）の比率でバッファー（すなわち、８０％ホルムアミド、１０μＭ ＮａＯＨ、１μＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロモフェノールブルー）を充填し、サンプルを、７Ｍウレアを含む、１６または２０％アクリルアミドＤＮＡシーケンシングゲルに溶解した。
【０１０１】
分解産物のイメージングおよび定量化は、Inhibition of Topoisomerase I cleavage activity by thiol-reactive compounds. Montaudon, D. ; Palle, K. ; Rivory, L. ; Robert, J. ; Douat-Casassus, C. ; Quideau S. ; Bjornsti M. ; Pourquier P ; J. Biol. Chem. (2007), 282, 14403 - 14412に記載されるように、Typhoon Phosphorimager (Amersham Biosciences)を用いて行った。
【０１０２】
結果
４つの異なる濃度：１、１０、１００および１０００μＭで使用したＳＤＤは、カンプトセシンと比較して、Ｔｏｐ１阻害活性を示さなかった。
【０１０３】
トポイソメラーゼＩＩの触媒活性に対するＳＤＤの効果の評価。
【０１０４】
一般に、核酵素ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ＴｏｐｏＩＩ）は、アントラサイクリン、アクリジン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｅｓ）およびエリプティシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅｓ）を含む様々な抗癌剤の一般的な標的であることが認められる。これらの薬剤はすべて、三元複合系ＤＮＡ薬剤−ＴｏｐｏＩＩの形成および安定化を誘導するにもかかわらず、特異的な結合のドメインおよび機構は、効果および抵抗性のような薬剤の薬理学の特徴を決定する、種々の化学基と同等のようには見えない。
【０１０５】
ＴｏｐｏＩＩ触媒活性に対するＳＤＤの潜在的阻害効果の顕色のための試験を、トリパノソーマ・キネトプラスツ（ｋＤＮＡ、ＴｏｐｏＧｅｎ）に由来する連鎖したＤＮＡ基質を非連鎖化し、緩和したＤＮＡ形態にすることにより行った。
【０１０６】
方法
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰおよび０．０２ｇ／ｍｌ ｋＤＮＡを含む以下の標準的反応混合物を行った。
【０１０７】
反応は、核抽出物の添加により開始し、３７℃で２０分のインキュベーションの後、３０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーを含む変性溶液の添加により停止した。
【０１０８】
その後、サンプルを、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／酢酸（ｐＨ８．０）中で、８０Ｖで４５分間、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
【０１０９】
非連鎖化のためのポジティブコントローは、緩和されたＤＮＡ、開環ＤＮＡおよび共有結合的閉環ＤＮＡの２種の混合物を含む、ＴｏｐｏＧｅｎから得られる非連鎖化ｋＤＮＡマーカーである。連鎖化ＤＮＡはゲルに入らない一方で、非連鎖化ＤＮＡ環は、ゲルに入り移動する。
【０１１０】
ＤＮＡをＵＶ光の下で視覚化し、上記の装置を使用して濃度計のスキャニングにより種々のＤＮＡ形態を定量した。
【０１１１】
エトポシドは、次の文献に記載されるとおり、ポジティブコントロールとして使用した：Differential stabilisation of topoisomerase-II-DNA cleavable complexes doxorubicine and etoposide in doxorubicin-resistant rat glioblastoma cells. Montaudon, D. ; Pourquier, P. ; Denois, F. ; De Tinguy-Moreaud, E. ; Lagarde, P. ; Robert, J.; Eur., J. Biochem. (1997), 245, 307 - 315.
結果
１、１０、１００および１０００μＭの濃度で使用したＳＤＤは、エトポシドと比較して、用量に依存しない様式で、相対的に中程度のＴｏｐｏＩＩ活性の阻害を示した。したがって、ＴｏｐｏＩＩ活性の有意でない阻害を示すものの、それはＳＤＤの濃度に依存しない。
【０１１２】
ＳＤＤ（ＬＤ５０）のための急性毒性測定
マウス予備試験においてＳＤＤの急性全身毒性を評価するために研究を行なった。
【０１１３】
ＳＤＤを以下のように静脈内投与した：
−第１工程において、１匹のメスのスイスマウスに対して、９５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量、
−第２工程において、１匹のメスのスイスマウスに対して、６０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量、
−第３工程において、１匹のメスのスイスマウスに対して、５５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量、および
−第４工程において、２匹のメスのスイスマウスの群に対して、５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の単一用量。
【０１１４】
試験項目投与の直後に、９５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．にて処理した動物が死亡したことに注目される。
【０１１５】
試験項目投与の３時間後に、６０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．にて処理した動物が死亡したことに注目される。
【０１１６】
死亡の前に、被食者の反射（Ｐｒｅｙｅｒ’ｓ ｒｅｆｌｅｘ）の減少、正向反射の欠落、緊張度の減少および目を細める状態（ｅｙｅｓ ｐａｒｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ）に関連する自発的活動の減少が生じた。
【０１１７】
試験項目投与の２４時間後における、５５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．で処理した動物の死亡に注目される。死亡の前に、正向反射の減少に関連する自発的活動の減少が生じた。
【０１１８】
５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．で処理した動物では死亡は生じなかった。
【０１１９】
試験項目投与の１時間後に、正向反射の減少（１／２）に関連した自発的活動の減少（２／２）（すなわち、２匹のうち２匹）が記録された。動物は、試験の２日目において、通常の活動に戻った。
【０１２０】
初日および１４日目の間における、マウスの尾のレベルにおける浮腫に注目された。
【０１２１】
動物の体重増加は、研究を通じて正常のままであった。研究の最後に５０ｍｇ／ｋｇで処理した動物の目視による試験では、処理に関連した変化は何ら明らかとならなかった
主要試験
ＳＤＤを５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、５匹のメスのスイスマウスの群に静脈内投与した。実験プロトコールは、医学的装置の生物学的評価に関する国際標準ＮＦ ＥＮ ＩＳＯ １０９９３−１１：「全身毒性のための試験」から確立した。
【０１２２】
研究を通じて死亡は生じなかった。試験項目投与から１時間後において、処理した動物にて、正向反射の減少（２／５）および目を細めた状態（２／５）に関連した自発的活動の減少（５／５）が記録された。試験の２日目において、動物は正常な活動に戻った。
【０１２３】
初日から１４日目の間における、マウスの尾のレベルにおける浮腫に注目された。動物の体重増加は、研究を通じて正常のままであった。研究の最後に５０ｍｇ／ｋｇで処理した動物の目視による試験では、尾のレベルにおける壊死（３／５）のみが明らかとなった。
【０１２４】
結論：
結論として、ＳＤＤに対するマウスＬＤ５０は、静脈内投与を行った場合、５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般構造（Ｉ）：
【化１】
の化合物であって、ｎは、０および１０の間、好ましくは３および１０の間に含まれる整数である化合物。
【請求項２】
ｎが４および８の間に含まれる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが５、６または７に等しい請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレートである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
一般的構造（Ｉ）を有する化合物の製造方法であって、
ａ）ＤＭＦなどの溶媒中にて、８０℃以下の温度でアコニチンをジカルボン酸と共に撹拌する工程と、
ｂ）得られた混合物を、エステル転移反応が行われるように室温でかき混ぜる工程と、
ｃ）前記溶媒を減圧下で蒸発させる工程と、
ｄ）前記工程ｃ）の終わりにおいて得られる油状残渣を精製して、前記化合物（Ｉ）を単離する工程と
を含んだ方法。
【請求項６】
前記ジカルボン酸が、２および１２、好ましくは５および１２、より好ましくは６および１０の間に含まれる数の炭素原子を有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ジカルボン酸が、ピメリン酸、スベリン酸およびアゼライン酸から成る群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から４の何れか１項に定義される化合物を含む医薬組成物。
【請求項９】
適切で医薬的に許容可能な希釈剤または担体物質を更に含む請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬の製造のための請求項１から４の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
前記医薬が腫瘍疾病の治療のために使用される請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬が大腸癌、肺癌または乳癌の治療のために使用される請求項１１に記載の使用。
【請求項１】
以下の一般構造（Ｉ）：
【化１】
の化合物であって、ｎは、０および１０の間、好ましくは３および１０の間に含まれる整数である化合物。
【請求項２】
ｎが４および８の間に含まれる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが５、６または７に等しい請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ビス［Ｏ−（１４−ベンゾイルアコニン−８−イル）］−スベレートである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
一般的構造（Ｉ）を有する化合物の製造方法であって、
ａ）ＤＭＦなどの溶媒中にて、８０℃以下の温度でアコニチンをジカルボン酸と共に撹拌する工程と、
ｂ）得られた混合物を、エステル転移反応が行われるように室温でかき混ぜる工程と、
ｃ）前記溶媒を減圧下で蒸発させる工程と、
ｄ）前記工程ｃ）の終わりにおいて得られる油状残渣を精製して、前記化合物（Ｉ）を単離する工程と
を含んだ方法。
【請求項６】
前記ジカルボン酸が、２および１２、好ましくは５および１２、より好ましくは６および１０の間に含まれる数の炭素原子を有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ジカルボン酸が、ピメリン酸、スベリン酸およびアゼライン酸から成る群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から４の何れか１項に定義される化合物を含む医薬組成物。
【請求項９】
適切で医薬的に許容可能な希釈剤または担体物質を更に含む請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬の製造のための請求項１から４の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
前記医薬が腫瘍疾病の治療のために使用される請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬が大腸癌、肺癌または乳癌の治療のために使用される請求項１１に記載の使用。
【公表番号】特表２０１２−５１０４９０（Ｐ２０１２−５１０４９０Ａ）
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８９６１（Ｐ２０１１−５３８９６１）
【出願日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５９１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３６３８
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３３３４７）ウニベルジテ・ボルドー・セガラン (2)
【住所又は居所原語表記】１４６ ｒｕｅ Ｌｅｏ Ｓａｉｇｎａｔ， ３３０７６ ＢＯＲＤＥＡＵＸ ＣＥＤＥＸ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５９１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３６３８
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３３３４７）ウニベルジテ・ボルドー・セガラン (2)
【住所又は居所原語表記】１４６ ｒｕｅ Ｌｅｏ Ｓａｉｇｎａｔ， ３３０７６ ＢＯＲＤＥＡＵＸ ＣＥＤＥＸ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]