ビルレンス関連付着因子
【課題】細菌感染の予防および処置用の物質と方法の提供。
【解決手段】以下の病原菌由来のビルレンス関連付着因子抗原および該抗原を含むワクチン組成物：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１；ＥＨＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ；ＥＰＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ；ＥＡＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ；尿路病原体Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ；Ｂｒａｄｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ。
【解決手段】以下の病原菌由来のビルレンス関連付着因子抗原および該抗原を含むワクチン組成物：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１；ＥＨＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ；ＥＰＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ；ＥＡＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ；尿路病原体Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ；Ｂｒａｄｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての書類は、それらの全体において、参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細菌性付着因子の分野にある。特に、本発明は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび他の生物に由来するビルレンス関連付着因子抗原に関する。
【０００３】
（背景技術）
グラム陰性Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属としては、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ａｅｇｙｐｔｉｕｓ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｔｉｕｓ生物群とも呼ばれる）、Ｈ．ｄｅｃｒｅｙｉおよびＨ．ｓｏｍｎｕｓが挙げられる。これらの細菌は、結膜炎、軟性下疳、紫斑病の熱（ｐｕｒｐｕｒｉｃ ｆｅｖｅｒ）、髄膜炎、肺炎および喉頭蓋炎を含む疾患を引き起こし得る。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、この属のなかで最も一般的に見られる病原体であり、そして、類型可能な株（被包性）および類型できない株（非被包性；「ＮＴＨｉ」）の両方を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するワクチンは、その莢膜サッカリドとキャリアタンパク質との結合体に基づき、充分な成功を収めているが、上記種の他のメンバーに対する保護の提供は、ほとんど発展していない。特に、Ｄ型 Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよび類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、問題のままである。
【０００５】
同様に、ワクチンは、他の生物病原体（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの腸毒素産生性株（ＥＴＥＣ）、腸病原性株（ＥＰＥＣ）、腸凝集性株（ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ）（ＥＡＥＣ）、腸出血性株（ＥＨＥＣ）および志賀毒素株（ＳＴＥＣ））に対しても、利用できないままである。
【０００６】
このような細菌によって引き起こされる感染の予防および処置を改善するための物質および方法を提供することが、本発明の目的である。より詳細には、細菌感染に対して免疫するために適切な材料を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
付着因子に関与するビルレンス関連抗原は、いくつかの細菌および他の生物において同定され、そしてこれらの抗原は、細菌感染（特に、有毒株によって引き起こされる細菌感染）の診断、予防および処置のために有用である。特に、抗原は、以下：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群（配列番号１）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１（配列番号２および３）およびＥＨＥＣ ＥＤＬ９３３株；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（配列番号４）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ（配列番号５）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ（配列番号６）；ＥＰＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ２３４８／６９株（配列番号７）；ＥＰＥＣ（配列番号１８）；ＥＡＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ４２株（配列番号８および９）；尿路病原体（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ（配列番号１０）；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（配列番号１１）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ（配列番号１２）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ（配列番号１３）；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（配列番号１４）；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（配列番号１５）；Ｂｒａｄｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（配列番号１６）；ならびにＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ（配列番号１７）において、同定されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）配列番号５１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および５４からなる群より選択される、アミノ酸配列；（ｂ）（ａ）に規定されるような配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列；ならびに／または
（ｃ）（ａ）に規定されるような配列の少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントを含む、アミノ酸配列
のうちの１つ以上を含む、ポリペプチド。
（項目２）
項目１に記載のポリペプチドであって、前記（ｃ）のフラグメントは、前記（ａ）の配列の４つのドメインのうちの１つ以上を含まない、ポリペプチド。
（項目３）
項目１に記載のポリペプチドであって、前記（ｃ）のフラグメントは、前記(ａ）の
配列の少なくとも１つの完全なドメインを含む、ポリペプチド。
（項目４）
オリゴマー形態にある、項目１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目５）
式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｘ−Ｂ−ＣＯＯＨのポリペプチドであって、ここで：
Ｘは：（ａ）配列番号１〜１８、５１および５４の１つ以上に対して少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列；ならびに／または
（ｂ）配列番号１〜１８、５１または５４の１つ以上の少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、アミノ酸配列、を含み；Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり；そしてｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、
ポリペプチド。
（項目６）
アミノ酸配列−Ａ−Ｗ１−Ｗ２−Ｗ３−Ｗ４−Ｂ−を含むポリペプチドであって：
Ａは、任意のＮ末端配列であり；
Ｂは、任意のＣ末端配列であり；
Ｗ１は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
Ｗ２は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上の球状ヘッドに対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
Ｗ３は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のコイルドコイルドメインに対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
Ｗ４は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上の膜貫通アンカー領域に対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
ただし、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３またはＷ４のうちの少なくとも１つが存在する、ポリペプチド。
（項目７）
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ由来の付着因子であって、ここで、該付着因子は：
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号５２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列；および／または（ｃ）配列番号５２の少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、アミノ酸配列
を含む、付着因子。
（項目８）
項目１に記載のポリペプチドに結合する抗体。
（項目９）
項目１に記載のポリペプチドまたは項目８に記載の抗体をコードする、核酸。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または核酸および／または抗体を含有する、薬学的組成物。
（項目１１）
薬物としての使用のための、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
哺乳動物において免疫応答を上昇させるための医薬の製造における、項目１に記載のポリペプチドの使用。
（項目１３）
哺乳動物において免疫応答を上昇させるための方法であって、該方法は、有効量の項目１０に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【０００８】
本発明の抗原の間の配列同一性の程度は低いが、単純な一次配列情報を超えるレベルでの上記抗原の理解は、それらが、Ｎ末端からＣ末端のドメインの共通の配置、すなわち：・リーダーペプチド
・球状ヘッド
・コイルドコイル領域
・膜貫通アンカー領域
を共有することを示す。
【０００９】
上記種々の抗原の間の配列類似性は、主に、上記Ｃ末端アンカー領域に限定される。このドメインの配置は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質ＮａｄＡと共有される｛１｝。
【００１０】
配列番号１〜１８におけるこれらの特徴の位置は、以下のとおりである：
【００１１】
【表１】
（抗原）
本発明は、以下のアミノ酸配列うちの１つ以上を含むポリペプチドを提供する：配列番号１〜１８、配列番号５１および配列番号５４のいずれか。
【００１２】
本発明はまた、以下：（ａ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで、ｍは、５０以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上）である、アミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸であって、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である、アミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、配列番号１〜１８、５１および５４の改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体など）を含む。
【００１３】
（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上由来のエピトープを含み、好ましくは、Ｂ細胞エピトープを含む。Ｂ細胞エピトープは、実験的に同定され得るかまたはアルゴリズム的に予測され得る。
【００１４】
（ｂ）の他の好ましいフラグメントは、配列番号１〜１８、５１および５４由来の関連するアミノ酸配列の、Ｃ末端からの１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端からの１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４５またはそれ以上）を欠く。特に、好ましいフラグメントは、少なくともＮ末端リーダー配列を省く（そして、その省かれたリーダー配列は、異種リーダー配列によって置換され得る）。
【００１５】
他の好ましいフラグメントは、上の表に基づく配列番号１〜１８および５１の４つのドメインのうちの１つ以上（すなわち、１、２または３）を省く。他の好ましいフラグメントは、配列番号１〜１８および５１の４つのドメインのうちの１つ以上（すなわち、１、２または３）からなる。
【００１６】
本発明の好ましいポリペプチドは、オリゴマー形態（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなど）で存在する。トリマーが好ましいが、本発明のモノマーポリペプチドはまた、有用である。
【００１７】
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｘ−Ｂ−ＣＯＯＨのポリペプチドを提供し、ここで：
−Ｘは、上に規定されたように：（ａ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列を含み；
−Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり；
−Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり；
−Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり；そして
−ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である（好ましくは、ｘ＝２である）。
【００１８】
−Ｘ−部分がリーダーペプチドを有する場合、このリーダーペプチドは、上記ハイブリッドタンパク質中に含まれても省かれてもよい。いくつかの実施形態において、上記リーダーペプチドは、上記ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除いて、削除される（すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２．．．Ｘｘのリーダーペプチドは省略される）。このことは、全てのリーダーペプチドを削除し、そしてＸ１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと等価である。
【００１９】
｛−Ｘ−Ｌ−｝の各々のｘについて、−Ｘ−は、同じであっても異なっていてもよく、そしてリンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもしなくてもよい。例えば、ｘ＝２の場合、上記ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的には、短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎを含み、ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１９）であり、そのＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドは、ＢａｍＨＩ制限部位から形成され、従って、クローニングおよび操作を助け、そして上記（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは、代表的なポリグリシンリンカーである。
【００２０】
−Ａ−は、任意のＮ末端アミノ酸配列である。これは、代表的に、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送に関するリーダー配列、またはクローニングもしくは操作を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｈ、ここで、ｈ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸を有する）である。
【００２１】
−Ｂ−は、任意のＣ末端アミノ酸配列である。これは、代表的に、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送に関する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｈ、ここで、ｈ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）またはタンパク質安定性を増大させる配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【００２２】
本発明はまた、アミノ酸配列：
−Ａ−Ｗ１−Ｗ２−Ｗ３−Ｗ４−Ｂ−
を含むポリペプチドを提供し、ここで：
−Ａは、上に規定されるような任意の配列であり（好ましくは、上記ペプチドのＮ末端にある）；
−Ｂは、上に規定されるような任意の配列であり（好ましくは、上記ペプチドのＣ末端にある）；
−Ｗ１は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上のリーダーペプチドに対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１うちの１つ以上のリーダーペプチドの少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
−Ｗ２は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の球状ヘッドドメインに対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の球状ヘッドドメインの少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
−Ｗ３は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上のコイルドコイルドメインに対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上のコイルドコイルドメインの少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
−Ｗ４は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の膜貫通アンカー領域に対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の膜貫通アンカー領域の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
ただし、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３またはＷ４のうちの少なくとも１つが存在する。
【００２３】
本発明はまた、上に記載されるようなポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、ここで、そのペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸変異を含む。その変異は、好ましくは、本発明のポリペプチドの活性の減少または除去をもたらし、この減少または除去は、直接的または間接的に、ビルレンスまたは付着を担う。例えば、上記変異は、酵素活性を阻害し得るかまたはそのタンパク質における結合部位を除去し得る。変異は、欠失、置換および／または挿入を含み得、それらのうちのいずれかは、１つ以上のアミノ酸を含み得る。代替として、上記変異は、トランケーションを含み得る。
【００２４】
ビルレンス因子の突然変異は、多くの細菌について充分に確立された科学である｛例えば、参考文献２〜８に記載されるトキシン突然変異｝。突然変異は、本発明のポリペプチドをコードする核酸に対して、特異的に標的化され得る。あるいは、突然変異は、（例えば、照射、化学的突然変異などに起因して）全体的であってもランダムであってもよく、代表的には、その後、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中に変異が導入されているものについて、細菌をスクリーニングする。このようなスクリーニングは、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロットまたはノザンブロットなど）、プライマーに基づく増幅（例えば、ＰＣＲ）、スクリーニング、プロテオミクス、異常ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル移動（ａｂｅｒｒａｎｔ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）などにより得る。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、種々の手段によって（例えば、組み換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）、そして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、非ポリグリコシル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）など）で調製され得る。それらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、実質的に他の細菌または宿主細胞タンパク質を含まない）で調製される。
【００２６】
本発明のペプチドの発現は、ネイティブな宿主中で行われ得るが、本発明は、好ましくは、異種宿主を利用する。上記異種宿主は、原核生物（例えば、細菌）であっても真核生物であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉが好ましいが、他の適切な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【００２７】
本発明のポリペプチドが配列番号５１に関する場合、そのポリペプチドは、好ましくは、少なくとも２２４個（例えば、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３５個、２４０個、２４５個、２５０個、２５５個またはそれ以上）のアミノ酸を含む。
【００２８】
本発明はまた、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ由来の付着因子を提供し、ここで、その付着因子は以下を含む：（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号５２に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｃ）配列番号５２の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、アミノ酸配列。
【００２９】
（抗体）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【００３０】
本発明の抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに対して、少なくとも１０−７Ｍの親和性（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍまたはそれ以上に大きな親和性）を有する。好ましい抗体は、本発明のポリペプチドのヒト細胞に結合する能力を阻害し得る。
【００３１】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段により（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成などにより）、そして種々の形態（例えば、ネイティブな形態、融合形態、グリコシル化形態、非グリコシル化形態など）で産生され得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、実質的に他の抗体が存在しない形態）で調製される。
【００３２】
用語「抗体」は、抗体全体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などを包含する。
【００３３】
本発明の抗体は、標識を含み得る。上記標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識）は、直接的に検出可能であり得る。あるいは、標識（例えば、生成物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど））は、間接的に検出可能であり得る。
【００３４】
本発明の抗体は、固体支持体に結合され得る。
【００３５】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを適切な動物（例えば、ウサギ、ハムスター、マウス、または他の齧歯類）に投与（例えば、注射）することにより調製され得る。
【００３６】
ヒト免疫系との適合性を増大させるために、上記抗体は、キメラ抗体もしくはヒト化抗体であり得るか（例えば、参考文献９および１０）、または十分にヒト化した抗体が使用され得る。ヒト化抗体は、元の非ヒトモノクローナル抗体よりもヒトの中では免疫原性がさらに弱いので、ヒト化抗体は、ヒトの処置のために使用され得、アナフィラキシーのリスクはさらに低い。従って、これらの抗体は、治療上の適用において好ましくあり得、この治療上の適用（例えば、腫瘍性疾患の処置のための放射増感剤（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）としての使用または癌療法の副作用を低減する方法における使用）は、インビボでのヒトへの投与を包含する。
【００３７】
ヒト化抗体は、種々の方法（例えば：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク領域および定常領域へと移植（「ヒト化」）し、そして非ヒト抗体から１以上のフレームワーク残基を必要に応じて移動させる工程；（２）非ヒト可変ドメイン全体を、移植はするが表面残基の置換によりヒト様表面で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（化粧張り）工程が挙げられる）により達成され得る。本発明において、ヒト化抗体としては、「ヒト化」抗体および「化粧張り」抗体の両方が挙げられる。｛１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７｝。ヒト化抗体または完全なヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を含むように操作されたトランスジェニック動物を用いて産生され得る。
【００３８】
句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の一部をいう。キメラ抗体においては、マウス定常領域は、ヒト定常領域により置換される。ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α、δ、ε、γまたはμのいずれかより選択され得る。
【００３９】
（核酸）
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェントな」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中で、６５℃）でこの核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００４０】
本発明に従う核酸は、多くの方法（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自身から、など）により調製され得、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、他の細菌の核酸または宿主細胞の核酸が実質的に存在しない形態）で調製される。
【００４１】
用語「核酸」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれらのアナログ（例えば、改変骨格（例えば、ホスホロチオエートなど）を含むアナログ、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。本発明は、上に記載された配列（例えば、アンチセンスまたはプローブの目的）に相補的な配列を含む核酸を包含する。
【００４２】
（免疫原性組成物および医薬）
ＮａｄＡ（これは、優れた抗−髄膜炎菌性免疫原である｛１｝）（毒力との関連を含む）に対する構造上の類似点および機能上の類似点に基づき、本発明のポリペプチドは、免疫化の目的に対しても有用であるはずである。
【００４３】
本発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の核酸および／または本発明の抗体を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、好ましくは、免疫原性の組成物であり、そしてより好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防用（すなわち、感染を予防する）であるか、または治療用（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防用である。
【００４４】
この組成物のｐＨは、好ましくは、６と８との間であり、好ましくは、約７である。上記ｐＨは、緩衝液の使用により維持され得る。この組成物は、滅菌されており、そして／または発熱物質なしであり得る。上記組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【００４５】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を引き起こし得（すなわち、この医薬は、免疫原性の組成物である）、より好ましくは、ワクチンである。
【００４６】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための医薬の製造における１種以上（例えば、２、３、４、５、６）の本発明のポリペプチドの使用を提供する。この医薬は、好ましくは、ワクチンである。
【００４７】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための方法を提供し、この方法は、本発明の有効量の組成物を投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは防御的であり、そして好ましくは、抗体および／または細胞の媒介する免疫性を包含する。この方法は、追加免疫応答を引き起こし得る。
【００４８】
上記哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（ｃｈｉｌｄ）（例えば、よちよち歩きの幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または幼児（ｉｎｆａｎｔ））または若者であり；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、若者または成人である。小児に対して使用される予定であるワクチンはまた、（例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために）大人にも投与され得る。
【００４９】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（特に、ＥＨＥＣ株、ＥＡＥＣ株、ＥＴＥＣ株、ＥＰＥＣ株およびＵＰＥＣ株）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｂｒａｄｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍにより引き起こされる疾患の予防および／または処置のためのものである。従って、本発明は、疾患（結膜炎、軟性下疳、紫斑病熱、髄膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、インプラント周囲炎、歯周病、歯肉炎、ウシ脳炎、関節炎、心筋炎、下痢、ヒツジ流産、精巣炎、波状熱、ブタ生殖性喪失（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｗａｓｔａｇｅ）、ブルセラ症などの予防および／または処置に適切である。
【００５０】
治療上の処置の有効性を調査する一つの方法は、本発明の組成物の投与後の細菌の感染をモニタリングする工程を包含する。予防上の処置の有効性を調査する一つの方法は、この組成物の投与後に、上記ポリペプチドに対する免疫応答をモニタリングする工程を包含する。
【００５１】
本発明の組成物は、一般的に、患者に対して直接的に投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射、筋肉注射、もしくは組織の腸空間への注射）、または直腸投与、経口投与（例えば、錠剤、噴霧剤）、膣投与、局所投与、経皮投与（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）｛例えば、参考文献１８を参照のこと｝、もしくは経皮投与（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）｛例えば、参考文献１９および２０を参照のこと｝、鼻内投与｛例えば、参考文献２１を参照のこと｝、眼内投与（ｏｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、耳内投与（ａｕｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、肺内投与（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｉｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ）、もしくは他の粘膜投与により達成され得る。
【００５２】
本発明は、全身性の免疫性および／または粘膜性の免疫性を惹起するために使用され得る。
【００５３】
投薬処置は、単回用量計画であっても、複数回用量計画であってもよい。複数回用量は、初回免疫化計画および／または追加免疫免疫化計画において使用され得る。複数回用量計画において、種々の用量が、同一または別個の経路（例えば、非経口の刺激および粘膜性ブースト、粘膜性刺激および非経口ブーストなど）により与えられ得る。
【００５４】
細菌の感染は、身体の種々の領域に影響する。それで、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、注射可能な物質（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｓ）（液状液剤または懸濁剤のいずれか）として調製され得る。液体ビヒクルにおいて、溶液または懸濁剤に対して適切な固体形態（例えば、凍結乾燥された組成物）もまた、注射前に調製され得る。この組成物は、（例えば、軟膏剤、乳剤、または散剤として）局所投与のために調製され得る。この組成物は、（例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、噴霧剤として、またはシロップ剤（必要に応じて、矯味矯臭されたシロップ剤）として）経口投与のために調製され得る。この組成物は、細かい粉末（ｆｉｎｅ ｐｏｗｄｅｒ）もしくは噴霧剤を用いて、（例えば、吸入剤として）肺内投与のために調製され得る。この組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。この組成物は、鼻内投与、耳内投与、または眼内投与のために（例えば、滴（ｄｒｏｐ）として）調製され得る。この組成物は、合わされた組成物が患者に対する投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。このようなキットは、液体形態中に１種以上の抗原および１種以上の凍結乾燥された抗原を含み得る。
【００５５】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、必要とされる場合、免疫学的に有効な量の抗原ならびに他の任意の成分を含有する。「免疫学的に有効な量」により、個体へのこの量の投与（単回用量においてか、または一連の一部としてのいずれか）が処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の、健康状態および身体的状態、年齢、処置されるべき個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成するこの個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方物、医学的状態の処置医の所見、ならびに他の関連する因子に依存して変動する。この量が、日々の試行を通して決定され得る、比較的広汎な範囲に収まることが期待される。
【００５６】
本発明はまた、（非経口および／または粘膜の）アジュバントとして使用するための本発明のポリペプチド（ＮａｄＡそれ自体を含む）を提供する。同様に、本発明は、本発明のポリペプチドを第二の抗原と混合して含有する組成物を提供し、第二の抗原の混合により、本発明のポリペプチドは、患者に投与された場合に第二の抗原に対する免疫応答を増強する。
【００５７】
（組成物のさらなる成分）
本発明の組成物は、代表的には、上記成分に加えて、１種以上の「薬学的に受容可能なキャリア」を含有し、この薬学的に受容可能なキャリアとしては、上記組成物を受け取る個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的には、大きな、緩徐に代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、アミノ酸コポリマーおよび脂質凝集体（例えば、油滴もしくはリポソーム））である。このようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含有し得る。さらに、補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤）、ｐＨ緩衝物質などが存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤についての全体の考察が、参考文献２２において入手できる。
【００５８】
本発明のワクチンは、他の免疫制御因子と併せて投与され得る。特に、組成物は、通常アジュバントを含有する。好ましいさらなるアジュバントとしては、（Ａ）アルミニウム塩（ヒドロキシド（例えば、オキシヒドロキシド）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、スルフェートなどが挙げられる｛例えば、参考文献２３の第８章および第９章を参照のこと｝）、または、種々のアルミニウム化合物の混合物（この化合物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶性化合物、非晶質化合物など）をとる）ならびにこれらが好ましく吸着されたもの；（Ｂ）ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５が微小フリューダイザ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子へと処方された）｛２３の１０章を参照のこと；参考文献２４もまた参照のこと｝；（Ｃ）リポソーム｛参考文献２３の第１３章および第１４章を参照のこと｝；（Ｄ）さらなる界面活性剤が欠損し得るＩＳＣＯＭ（参考文献２３の第２３章を参照のこと）｛２５｝；（Ｅ）１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦであって、サブミクロンエマルジョンへと微小流動化するか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成したＳＡＦ｛参考文献２３の第１２章を参照のこと｝；（Ｆ）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０、ならびに、モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される一種以上の細菌細胞壁構成成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（Ｇ）サポニンアジュバント（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１｛参考文献２３の第２２章を参照のこと｝、これは、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても公知である｛２６｝；（Ｈ）キトサン｛例えば、２７｝；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など｛参考文献２３の第２７章および第２８章を参照のこと｝；（Ｋ）モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）もしくは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）｛例えば、参考文献２３の第２１章｝；（Ｌ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油滴エマルジョンとの組み合わせ｛２８｝；（Ｍ）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル｛２９｝；（Ｎ）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）｛３０｝または、少なくとも１種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）もしくはポリオキシエチレンエステル界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）｛３１｝；（Ｎ）金属塩の粒子｛３２｝；（Ｏ）サポニンおよび水中油滴エマルジョン｛３３｝；（Ｐ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）｛３４｝；（Ｑ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱−不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはこの無毒化変異物（例えば、Ｋ６３変異物もしくはＲ７２変異物）｛参考文献３５の第５章｝；（Ｒ）コレラトキシン（「ＣＴ」）、またはこの無毒化変異物｛例えば、参考文献３５の第５章｝；（Ｓ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｔ）生体分解性でかつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、好ましいポリ（ラクチド−コ−グリコリド）と共に形成され、必要に応じて、（例えば、ＳＤＳを用いて）負に荷電した表面または（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を用いて）正に荷電した表面を有するように処理された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜直径約１５０μｍの粒子、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜直径約３０μｍの粒子、そして最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜直径約１０μｍの粒子）；（Ｕ）必要に応じて、シトシンの代わりに５−メチルシトシンが使用されているＣｐＧモチーフ（すなわち、少なくとも１のＣＧジヌクレオチドを含む）を含むオリゴヌクレオチド；（Ｖ）モノホスホリル脂質Ａ模造物（例えば、アミノアルキルグルコサミドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））｛３６｝；（Ｗ）ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｈａｚｅｎ）（ＰＣＰＰ）；（Ｘ）生体付着物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）｛３７｝（例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア｛３８｝または、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋された誘導体からなる群より選択される粘膜付着性物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）；あるいは、（Ｙ）この組成物の有効性を増強する免疫刺激因子として作用する他の物質｛例えば、参考文献２３の第７章を参照のこと｝が挙げられるが、これらに限定されない。アルミニウム塩およびＭＦ５９は、非経口免疫化にとっての好ましいアジュバントである。変異体毒素は、好ましい粘膜アジュバントである。
【００５９】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【００６０】
この組成物は、抗生物質を含有し得る。
【００６１】
（さらなる抗原）
本発明のポリペプチドを含有するのみならず、本発明の組成物はまた、１種以上の更なる抗原を含有し得る。封入のためのさらなる抗原は、例えば：
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および／または血清群Ｙ由来のサッカライド抗原（例えば、参考文献３９に開示されている血清群Ｃ由来のオリゴサッカライド（参考文献４０もまた参照のこと）または参考文献４１のオリゴサッカライド）。
− Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原（例えば、ＣａｇＡ｛４２〜４５｝、ＶａｃＡ｛４６、４７｝、ＮＡＰ｛４８、４９、５０｝、ＨｏｐＸ｛例えば、５１｝、ＨｏｐＹ｛例えば、５１｝および／または尿素分解酵素）。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカライド抗原｛例えば、５２、５３、５４｝。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質抗原｛例えば、５５｝。
− Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活化ウイルス）由来の抗原｛例えば、５６、５７｝。− Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面の抗原および／またはコア抗原）｛例えば、５７、５８｝。
− Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原｛例えば、５９｝。
− ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド｛例えば、参考文献６０の第３章｝）（例えば、ＣＲＭ１９７変異体）｛例えば、６１｝。
− 破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）｛例えば、参考文献６０の第４章｝。
− Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および糸状構造ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、これらはまた、必要に応じて、パータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）および／または凝集原２および凝集原３｛例えば、参考文献６２および６３｝と組み合わせられる）；細胞全体の百日咳抗原もまた使用され得る。
− Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ｛例えば、４０｝由来のサッカライド抗原。
− ポリオ抗原｛例えば、６４、６５｝（例えば、ＯＰＶまたは、好ましくは、ＩＰＶ）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ｛例えば、参考文献６６〜７７｝由来のタンパク質抗原（例えば、ＮａｄＡ）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ（例えば、参考文献７８、７９、８０、８１などに開示されるもの）由来の外側膜小胞（ＯＭＶ）調製物。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原｛例えば、参考文献８２〜８８｝。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原｛例えば、８９｝。
− Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原｛例えば、９０｝。− 狂犬病抗原｛例えば、９１｝（例えば、凍結乾燥された不活化ウイルス｛例えば、９２、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ｝。
− 麻疹、耳下腺炎および／または風疹の抗原｛例えば、参考文献６０の第９章、第１０章および第１１章｝。
− インフルエンザ抗原｛例えば、参考文献６０の第１９章｝（例えば、ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）。
− Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原｛例えば、９３、９４、９５、９６｝。
−呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ｛９７、９８｝）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３｛９９｝）のようなパラミクソウイルス由来の抗原
−ＵｓｐＡ１および／またはＵｓｐＡ２のような、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ｛例えば、１００｝由来の抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）｛例えば、１０１、１０２、１０３｝由来の抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）｛例えば、１０４｝由来の抗原
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ｛例えば、１０５｝由来の抗原
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ｛例えば、１０６、１０７、１０８｝由来の抗原
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）に属するウイルス由来（例えば、黄熱病ウイルス由来、日本脳炎ウイルス由来、デング熱ウイルスの４つの血清群由来、ダニ媒介性脳炎ウイルス由来、西ナイルウイルス由来）の抗原
−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来の抗原
−ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）由来の抗原
−ロタウイルス由来の抗原
−ペスチウイルス抗原（例えば、古典的ブタ熱ウイルス由来、ウシウイルス性下痢ウイルス由来および／またはボーダー病ウイルス由来）
−パルボウイルス抗原（例えば、パルボウイルスＢ１９由来）
−コロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス由来）
−癌抗原（例えば、参考文献１０９の表１、または参考文献１１０の表３および表４に列挙される抗原）。
【００６２】
上記組成物は、これらのさらなる抗原の１つ以上を含有し得る。抗原の組み合わせは、共有された特徴（例えば、呼吸器疾患に関連した抗原、腸疾患に関連した抗原、性感染症に関連した抗原など）に基づくべきであることが望ましい。
【００６３】
糖類抗原または炭水化物抗原が使用される場合、免疫原性を増強するために、その抗原は、好ましくはキャリアータンパク質と結合される｛例えば、参考文献１１１〜参考文献１２０｝。好ましいキャリアータンパク質は、細菌毒素または細菌トキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドは、特に好ましい｛１２１｝。他のキャリアーポリペプチドとしては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質｛１２２｝、合成ペプチド｛１２３、１２４｝、熱ショックタンパク質｛１２５、１２６｝、百日咳タンパク質｛１２７、１２８｝、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ｛１２９｝、サイトカイン｛１３０｝、リンホカイン｛１３０｝、ホルモン｛１３０｝、成長因子｛１３０｝、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の、毒素Ａまたは毒素Ｂ｛１３１｝、鉄取り込みタンパク質｛１３２｝などが挙げられる。混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方に由来する莢膜糖類を含有する場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の比（ｗ／ｗ）は、１より大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはより高い）ことが好ましくあり得る。異なる糖類は、同じ型のキャリアータンパク質または異なる型のキャリアータンパク質に結合され得る。任意の適切な結合反応は、必要な場合、任意の適切なリンカーと共に使用され得る。
【００６４】
毒素タンパク質抗原は、必要な場合、無毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の無毒化｛６３｝）。
【００６５】
ジフテリア抗原が上記組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むこともまた好ましい。
【００６６】
上記組成物中の抗原は代表的に、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的には、任意に所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘起するのに十分である。
【００６７】
本発明の組成物におけるタンパク質抗原の使用に代わるものとしては、上記抗原をコードする核酸が使用され得る｛例えば、参考文献１３３〜参考文献１４１｝。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態である）によって置換され得る。
【００６８】
（プロセス）
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の核酸によって形質転換された宿主細胞を、ポリペプチド発現を誘導する条件下で培養する工程を包含する。
【００６９】
本発明は、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、化学的手段によって、少なくとも一部の上記ポリペプチドを合成する工程を包含する。
【００７０】
本発明は、本発明の核酸を生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、プライマーベースの増幅方法（例えば、ＰＣＲ）を使用して核酸を増幅する工程を包含する。
【００７１】
本発明は、本発明の核酸を生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、化学的手段によって、少なくとも一部の上記核酸を合成する工程を包含する。
【００７２】
本発明はまた、サンプル中の細菌の存在を検出ためのプロセスを提供し、このプロセスは、ハイブリダイズ条件下で、上記サンプルと本発明の核酸とを接触させる工程；そして（ｂ）上記サンプル中に存在する核酸に対する本発明の核酸のハイブリダイゼーションの、存在または非存在を検出する工程を包含する。工程（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの存在は、上記サンプルが、関連する細菌を含むことを示す。
【００７３】
本発明はまた、細菌の存在を検出するための免疫学的アッセイ法を提供し、この方法は、サンプルと、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体とを接触させる工程を包含する。
【００７４】
（付着阻害）
本発明は、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）に対する細菌細胞の付着を阻害するための方法を提供する。上記細胞は、インビトロ（例えば、細胞培養物中）またはインビボであり得る。上記細胞は、最も好ましくはヒト細胞である。上記宿主細胞は代表的に、上皮細胞または内皮細胞である。
【００７５】
本発明は、宿主細胞に対する細菌細胞の付着を防ぐための方法を提供し、ここで１つ以上の本発明のポリペプチドの上記宿主細胞に対して結合する能力はブロックされる。
【００７６】
上記結合する能力は、様々な方法でブロックされ得るが、最も都合良くは、本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体が使用される。抗体の使用に代わるものとしては、本発明のポリペプチドと上記宿主細胞上のそのレセプターとの間の相互作用のアンタゴニストが使用され得る。さらに代替的には、上記宿主細胞レセプターの可溶性形態が、おとりとして使用され得る。これらは、レセプターの膜貫通領域、および必要に応じて細胞質領域を除去することによって生成され得る。
【００７７】
本発明の抗体、本発明のアンタゴニストおよび本発明の可溶性レセプターは、宿主細胞に対する細菌細胞の付着を防ぐ医薬として使用され得る。
【００７８】
本発明は、宿主細胞に対する細菌細胞の付着を防ぐための方法を提供し、ここで本発明のポリペプチドの発現は阻害される。上記阻害は転写のレベルおよび／または翻訳のレベルにおいてであり得る。上記遺伝子の発現を阻害するための好ましい技術は、アンチセンスである｛例えば、参考文献１４２〜参考文献１４８など｝。抗細菌アンチセンス技術は、例えば、参考文献１４９および参考文献１５０に開示される。
【００７９】
本発明は、上皮細胞に対する細菌（例えば、ナイセリアの）細胞の付着を防ぐための方法を提供し、ここで本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、ノックアウトされる。従って、本発明は、そのような遺伝子がノックアウトされた細菌を提供する。ノックアウト細菌を作製するための技術は、周知である。ノックアウト変異は、上記遺伝子のコード領域中に位置され得るか、またはその転写制御領域内（例えば、そのプロモーター内）に位置し得る。上記ノックアウト変異は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌によって生成されるｍＲＮＡのレベルの＜１％に低下させる（例えば、＜０．５％、＜０．１％、０％）。本発明のノックアウト変異は、免疫原性の組成物として（例えば、ワクチンとして）使用され得る。そのようなワクチンは、弱毒化された生細菌のような変異体を含み得る。
【００８０】
本発明はまた、宿主細胞に対する細菌細胞の結合を阻害する化合物（アンタゴニスト）を同定するために化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００８１】
スクリーニングにおける潜在的なアンタゴニストとしては、低分子有機分子、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリアミン、抗体、およびそれらの誘導体が挙げられる。低分子有機分子は、５０ダルトンと約２，５００ダルトンとの間の分子量、そして最も好ましくは２００ダルトン〜８００ダルトンの範囲内の分子量を有する。天然物を含む抽出物、化合物ライブラリーまたは混合された組み合わせ合成の生成物のような物質の複合混合物もまた、潜在的なアンタゴニストを含む。
【００８２】
代表的には、本発明のポリペプチドは、宿主細胞および試験化合物（例えば、抗体）と一緒にインキュベートされ、次いでその混合物は、上記タンパク質と上皮細胞との間の相互作用が阻害されたか否かを見るために試験される。上記タンパク質、細胞および化合物は、任意の順序で混合され得る。
【００８３】
当然のこととして、阻害は、スタンダード（例えば、ネイティブの、タンパク質／細胞相互作用）と比較して決定される。好ましくは、上記スタンダードは、上記試験化合物の非存在下で測定されたコントロール値である。上記スタンダードは、上記方法が行われる前に決定され得るか、あるいは上記方法が、行われた際か、または行われた後に決定され得ることが理解される。それはまた、絶対的スタンダードであり得る。
【００８４】
好ましいハイスループットスクリーニング方法に関して、このアッセイにおける全ての生化学的工程は、例えば、試験管内またはマイクロタイタープレート内の単一溶液中で行われ、そして上記試験化合物は、最初に、単一化合物濃度において分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のため、実験的条件は、スクリーニングされた全化合物の中から、「陽性」化合物として同定される試験化合物の割合を達成するために調整される。
【００８５】
上記方法はまた、１つ以上の試験化合物を、本発明のポリペプチドと一緒にインキュベートする工程、そしてそれらが相互作用するか否かを決定する工程を包含し得る。次いで、上記タンパク質と相互作用する化合物は、上記タンパク質と上皮細胞との間の相互作用をブロックするそれらの能力について試験され得る。
【００８６】
使用され得る他の方法としては、例えば、細菌：宿主レセプター相互作用の阻害は、転写を活性化しないものとして報告されているリバース２ハイブリッドスクリーニング（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）｛１５１｝が挙げられる。
【００８７】
本発明はまた、これらの方法を使用して同定された化合物を提供する。これらは、細菌感染を処置するためか、または細菌感染を防ぐために使用され得る。上記化合物は、好ましくは、少なくとも１０−７Ｍ（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍまたはより高い）の本発明のポリペプチドに対する親和性を有する。
【００８８】
（定義）
用語「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含有する」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、または付加的なもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含み得る。
【００８９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
２つのアミノ酸配列間における配列同一性のパーセンテージへの言及は、アラインメント（ａｌｉｇｎ）された場合に，アミノ酸のパーセンテージは、２つの配列の比較において同一であることを意味する。このアライメント、および相同性のパーセントまたは配列同一性のパーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１５２の節７．７．１８に記載されるソフトウェアプログラム）を使用して決定され得る。好ましいアライメントは、１２のギャップ開始ペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）および２のギャップ伸長ペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いたアフィンギャップ検索（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｓｅａｒｃｈ）を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１５３に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図２】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図３】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図４】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図５】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図６】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図７】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図８】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図９】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１０】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１１】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１２】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１３】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１４】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１５】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１６】図１６は、本発明のポリペプチドのアンカー領域間における保存を示す。
【図１７】図１７は、単量体形態および三量体形態における髄膜炎菌性外膜内の、ＮａｄＡの例示である。
【図１８】図１８および図１９は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、遺伝子環境（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の比較を示す。図２０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１対Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における遺伝子環境を例示する。
【図１９】図１８および図１９は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、遺伝子環境の比較を示す。図２０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１対Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における遺伝子環境を例示する。
【図２０】図１８および図１９は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、遺伝子環境の比較を示す。図２０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１対Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における遺伝子環境を例示する。
【図２１】図２１は、（図２１Ａ）ＮａｄＡおよび（図２１Ｂ）ＨａｄＡについてのコイル分析を示す。
【図２２】図２２は、ｈａｄＡ陽性株（Ｆ３０３１）および種々のｈａｄＡ陰性株（ｄ型、ｂ型、およびいくつかの類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）におけるｈａｄＡ遺伝子座の模式的な構成である。
【図２３】図２３は、異なる株のＨａｄＡの間の関係を示す系統樹である。
【図２４】図２４は、Ｅ．ｃｏｌｉでのＨａｄＡの発現に関する３つの構造を例示する。
【図２５】図２５は、発現されたＨａｄＡ−ＨｉｓのＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す。レーンは、（奇数）全タンパク質および（偶数）可溶性タンパク質の対にされる。レーン１およびレーン２は、２０℃における空プラスミドであり；レーン３およびレーン４は、２０℃における発現であり；レーン５およびレーン６は、３０℃における空プラスミドであり；レーン７およびレーン８は、３０℃における発現であり；レーン９およびレーン１０は、３７℃における空プラスミドであり；レーン１１およびレーン１２は、３７℃における発現であり；Ｍは、前染色されたタンパク質スタンダードである（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを参照のこと）。
【図２６】図２６はウェスタンブロットである。レーンは：（１）前染色されたタンパク質スタンダード（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２を参照のこと）であり；（２）３０℃での空プラスミドにおける全タンパク質であり；（３）３０℃での空プラスミドにおける可溶性タンパク質であり；（４）３０℃において発現された全タンパク質であり；（５）３０℃において発現された可溶性タンパク質であり；（６）ｒＨａｄＡ−Ｈｉｓである。
【図２７】図２７は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＨａｄＡのＣｈａｎｇ細胞に対する結合のＦＡＣＳ分析を示す。ＨａｄＡは、９つの濃度で試験され、そして結合は評価された。４つの代表的なＦＡＣＳ分析スペクトルが示される。
【図２８】図２８は、パネルＡ〜パネルＣにおいて３つの異なる凝集、およびパネルＤにおける空ｐＥＴプラスミドを含む細胞の、位相差顕微鏡写真を示す。
【図２９】図２９は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＨａｄＡによるＣｈａｎｇ細胞の、（Ａ）吸着および（Ｂ）侵襲を示す。左のバーは、空プラスミドによって形質転換されたコントロール細胞であり；右のバーは、ＨａｄＡ発現細菌である。結果は、３つ組で作成された測定の平均の平均±標準誤差である。
【図３０】図３０は、Ｅ．ｃｏｌｉ−ｐＥＴ ＨａｄＡ ｎａとＣｈａｎｇ上皮細胞との免疫蛍光顕微鏡分析を示す。細胞外の細菌は緑色に見え；細胞内の細菌は赤色である。
【図３１】図３１は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された、ＨａｄＡ／ｎａおよびＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）前染色されたタンパク質スタンダード（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２を参照のこと）であり；（２）空プラスミドの一晩未誘導培養物であり；（３）ＨａｄＡ／ｎａの一晩培養物であり；（４）ＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａの一晩培養物であり；（５）〜（７）ＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘導後３時間における（２）〜（４）である。矢印は、モノマーおよびオリゴマーを示す。
【図３２】図３２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された、ＨａｄＡ／ｎａおよびＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａのウェスタンブロットを示す。レーンは、図３１と同じである。矢印は、モノマーおよびオリゴマーを示す。
【図３３】図３３は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で誘導せずに一晩発現されたＨａｄＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）前染色されたタンパク質スタンダード（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２を参照のこと）であり；（２）空プラスミドであり；（３）ＨａｄＡ／ｎａ形質転換であり；（４）空プラスミドの外膜抽出物であり；（５）ＨａｄＡ／ｎａ形質転換の外膜抽出物である。
【図３４】図３４は、空ｐＥＴプラスミドによってか、またはＨａｄＡ／ｎａ ｐＥＴプラスミドによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを示す、ＨａｄＡ発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３５】図３５は、ＨａｄＡ発現を伴うか、またはＨａｄＡ発現を伴わない、Ｅ．ｃｏｌｉにおける沈降アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
（発明を実施するための様式）
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＮａｄＡタンパク質）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂゲノム｛７５｝内において、外膜タンパク質（ＮａｄＡ）が同定された｛１｝。これは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ付着因子ＹａｄＡに対して、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ表面タンパク質ＵｓｐＡ２｛１５４｝に対して弱い相同性を示す。ｎａｄＡ遺伝子は、高病原性Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株のサブグループ中に存在し、そしてそれは、低ＧＣ含有量によって特徴付けられ、このことは水平移行による遺伝子の起こりうる獲得現象を示唆する。
【００９２】
上記ＮａｄＡ付着因子に類似するタンパク質が、他の病原体によって獲得され得たという可能性を研究するために、本発明者らは、相同的なタンパク質を調査した。
【００９３】
ＮａｄＡおよびＹａｄＡの配列アライメントは、その２つのタンパク質がＣ末端において、最も類似しており、それが膜アンカードメインであることを明らかにした。ＮａｄＡにおいて、このドメインは約７０残基長であり、そしてそれは５つの予測された両親媒性のβ鎖を含み、そのドメインは、上記外膜を複数回横断し、従って上記タンパク質を上記細菌の表面に固定する（図１７）。この領域内において、ＮａｄＡとＹａｄＡとの間の配列類似性のレベルは、６０％前後の同一性である一方で、Ｎ末端ドメインおよび中央ドメインにおける相同性は、２５％以下の同一性である。
【００９４】
最初の調査（ＮａｄＡアンカードメインに基づいた）において、結果は、ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２だけでなく、他のタンパク質（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉの血清抵抗性タンパク質ＤｓｒＡ、Ｅ．ｃｏｌｉの免疫グロブリン結合タンパク質ＥｉｂＡ、ＥｉｂＣ、ＥｉｂＤ、ＥｉｂＥおよびＥｉｂＦ、ならびにＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの外膜タンパク質１００｛１５４｝）をも含む。この科の、より離れたメンバーを明らかにするために、これら結果はさらなる調査に使用され、そしてこのアプローチは１６個のさらなる結果を同定した。これら１６個のポチペプチドは、２次構造分析、コイルドコイル予測、およびリーダーペプチドの存在／非存在についてさらに評価された。予想通り、中央領域内で僅かなアミノ酸類似性を示したにもかかわらず、上記同定されたポリペプチドのほとんどは、そのポリペプチドに安定なオリゴマーを形成する能力を与える、コイルドコイル特徴を有する。上記同定されたポリペプチドのアンカー領域は、良く保存されている（図１６）。さらに、これらのポリペプチドをコードする遺伝子のＧＣ含有量は、それらの代表的なゲノムにおける平均より低く、それらが移動性の遺伝的要素を維持する遺伝子によってコードされることを示唆している。
【００９５】
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ポリペプチドは、腸管病原性（ＥＰＥＣ）株、腸管凝集性（ＥＡＥＣ）株、腸管出血性（ＥＨＥＣ）株および尿路疾患性（ＵＰＥＣ）株を含むＥ．ｃｏｌｉの病原性株において見出された。さらに、ＥＨＥＣ株およびＥＰＥＣ株のポリペプチドとほとんど一致するポリペプチドは、新生児髄膜炎を引き起こす、カプセル化されたＥ．ｃｏｌｉ株であるＫ１株において見出された。Ｋ１配列はＮａｄＡと、以下の通りにアラインメントする。
【００９６】
【表２】
別のＮａｄＡアナログを、Ｅ．ｃｏｌｉの志賀毒素産生性株（ＳＴＥＣ）｛１５５｝に存在する強毒性プラスミドによりコードした。このタンパク質（Ｓａａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜上に発現され、そして高分子量オリゴマーを形成する。対照的に、ＮａｄＡに対応するものは、良性のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株においては検出することができず、これはこれらの遺伝子が、その種の進化の初期の間に側方交換（ｌａｔｅｒａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ）により獲得されているという見解を支持する（図２０）。研究室株ＭＧ１６５５においてもまた、対応するものは見出すことはできなかった。
【００９７】
これらの知見に後押しされ、そしてこれらの遺伝子の挿入／欠失の可能なメカニズムを評価するために、上記ＮａｄＡ様分子をコードする遺伝子が存在する（ｈａｒｂｏｕｒ）する領域の配列を研究した。ＥＨＥＣ株についてのこの領域の配列が、配列番号２３である。
【００９８】
この分析は、上記ＮａｄＡ様タンパク質の配列保存性は、Ｋ１とＥＨＥＣとの間の同一性９５％からＫ１とＥＰＥＣとの間の同一性９８％までの範囲であり、上記ＤＮＡセグメントの遺伝子組織が、Ｋ１、ＥＨＥＣおよびＥＰＥＣのゲノム間でほとんど同一であることを示した。ＥＡＥＣの場合は、その隣接領域は保存されているが、たとえそのＮ末端およびＣ末端はよく保存されているとしてもＮａｄＡ様タンパク質の配列は他よりも３８０残基長い。
【００９９】
【表３】
上記の分析をＫ１２のゲノムにまで広げると、上記挿入部位は、対向するストランド上にコードされる２つの仮想オープンリーディングフレーム（ＹｂｂＪおよびＹｂｂＩ）間に存在し、そして小さな「島」が、３つの遺伝子（機能未知の仮想内在性膜タンパク質をコードするＯＲＦ、推定ＮａｄＡ様付着因子の遺伝子、および機能未知のリポタンパク質と予想されるＯＲＦ）からなることが分かった。後半の２つのＯＲＦは、おそらく共転写されるが、最初のＯＲＦは、逆向きにコードされている。推定の挿入部位を表し得る一対の７ｂｐ（ＣＴＧＡＣＧＣ）のダイレクトリピートは、上記の挿入されたフラグメント（配列番号２３；ヌクレオチド１８１１および４２５５から開始する）の境界にマッピングされ得、そしてこのリピートは、上記Ｋ１２株における挿入点の近傍には存在しない。
【０１００】
獲得されたＤＮＡ領域の長さは、ＥＰＥＣについては２３４８塩基、Ｋ１およびＥＨＥＣについては２４５０塩基、そしてＥＡＥＣについては２６３０塩基である（図１８）。全ての場合において、そのフラグメントのＧ＋Ｃ含量は、各ゲノムについて計算された平均組成と比較した場合より少なく、これはこのセグメントが側鎖交換のメカニズムで病原性Ｅ．ｃｏｌｉにより獲得されているという初期の仮定を確認する。
【０１０１】
尿路疾患性のＥ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）の場合、種々のＤＮＡセグメントが、上記ｙｂｂＪ遺伝子とｙｂｂＩ遺伝子との間で見出された。このセグメントは、１３４２ｂｐの長さであり、推定の細胞質タンパク質をコードする。このタンパク質は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｐｈｙｍｕｒｉｕｍ ＬＴ１２においてのみ保存され、他の分析された全てのＥ．ｃｏｌｉ株において存在しなかった。記載された他の挿入フラグメントと異なり、いずれのダイレクトリピートも、この島（そのＧＣ組成もまた、上記平均値に非常に類似）の境界にマッピングされ得なかった。これらのデータは、上記ＮａｄＡ様コード遺伝子が、ｃ０６０８遺伝子の場所に、後に挿入されたことを示し得る。それにもかかわらず、その後の研究は、ＮａｄＡのホモログをコードする遺伝子が、尿路疾患性のＥ．ｃｏｌｉのＣＦＴ０７３株のゲノムの異なる場所に見られ得ることを明らかにした。このタンパク質は、ＮａｄＡにより遠く関連し、第二のＮａｄＡ様タンパク質のファミリーのメンバーとして見られる。このタンパク質に対応するものは、Ｅ．ｃｏｌｉの他の病原性株の、類似した場所に含まれ、かつ第一のＥ．ｃｏｌｉのＮａｄＡ様分子群と同様に、その対応する遺伝子もまた、小さな島上にコードされ、上記Ｋ１２株には存在しない（図１９）。さらに、これらの遺伝子は、フレームシフトしたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ配列と、３’末端に強い類似性を有する。ＮＬＭ隣接領域の配列を、著しい類似性を示す２種（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ）において比較した。配列の保存は、上記付着因子コード領域のアミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に限定されるが、これらの隣接領域は、ヌクレオチドレベルでシンテニーかつ８０％を越える同一性を共有する。そのＮａｄＡ様遺伝子の上流で、この島が、ＥＰＥＣかＥＨＥＣのいずれかにおいて、そしてＳｈｉｇｅｌｌａにおいて、フレームシフトされるリポタンパク質をコードするＯＲＦを含有する。さらに、Ｓｈｉｇｅｌｌａのゲノムにおいて、トランスポザーゼエレメントをコードする２つのさらなる遺伝子（ｉｎｓＡおよびｉｎｓＢ）が、そのＮＬＭ遺伝子の近傍に見出される。
【０１０２】
【表４】
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）
不完全なＮａｄＡホモログを、ブラジル出血熱（ＢＰＦ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離体｛１５６｝において発見した。このポリペプチドは、ＨａｄＡと名付けられている。ＮａｄＡおよびＨａｄＡのアライメントは、以下：
【０１０３】
【表５】
のとおりである。
【０１０４】
ＨａｄＡに対応するものは、類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６０２８株（これは、小児における中耳炎の原因である）、または非病原性Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ ＫＷ２０株のいずれにおいても、検出され得ない。Ｃ末端アンカー領域におけるＨａｄＡとＮａｄＡとの間の非常に高レベルの配列同一性は、共通の起源を示し得る。
【０１０５】
そのｈａｄＡ遺伝子の起源を解析するために、ＢＰＦ単離体におけるこのＤＮＡ領域のヌクレオチド配列（配列番号２０）を、小児の中耳炎と関連するＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株（非病原性株Ｒｄ｛１５７｝、および類型できない８６０２８株（ＮＴＨｉ８６０２８））のゲノム配列の同じ領域と比較した。
【０１０６】
この比較の結果は、上記付着因子コード遺伝子が、ブラジル出血熱クローン（Ｆ３０３１株）に対して特異的であることを示すが、一方対応するものは、研究室のＲｄ株または類型できない株のいずれにおいても、マッピングされ得なかった。そのＨａｄＡをコードするフラグメントは、ＮａｄＡについて記載されたもの｛１｝と密接に似ている組織を有し、かつインタクトなオープンリーディングフレーム＋上流領域１８２ｂｐ（これは−１０および−３５のプロモーターエレメントを含む）を含有する。その小さな遺伝的な島は、その５’末端でＲＮＡヘリカーゼ遺伝子に、そしてその３’末端に位置する推定のプロテアーゼをコードする遺伝子に、隣接される。その組み換えられたセグメントのＧＣ組成は、そのゲノムの残りと一貫している。
【０１０７】
対照的に、ＮＴＨｉ ８６０２８株は、それがＲＮＡヘリカーゼのＯＲＦおよびＲＮＡプロテアーゼのＯＲＦを包含する全領域を欠損しているために、全くネガティブな株であると考えられ得るが、Ｒｄゲノムは、この領域に、機能未知の２本の短いＯＲＦをコードする１．１ｋｂのＤＮＡセグメントを含有する。この領域は、異常なＧＣ含量（３２％）により特徴付けられ、従って、この部位において独立した組み換え事象が起こったことを示唆している。
【０１０８】
さらなるＮａｄＡ様分子を、他のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、すなわち、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉおよびＨ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓとしてもまた公知）において、同定した。
【０１０９】
【表６】
ＮａｄＡおよび上記Ｈ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの配列アライメントは、以下：
【０１１０】
【表７】
のとおりである。
【０１１１】
ＮａｄＡおよび上記Ｈ．ｓｏｍｎｕｓの配列アライメントは、以下：
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
【表９】
のとおりである。
【０１１４】
ＮａｄＡおよび上記Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉの配列アライメントは、以下：
【０１１５】
【表１０】
のとおりである。
ＮＢ：Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉポリペプチドについてのコイルドコイル予想は高くない。
【０１１６】
（他の細菌）
本調査において同定されたさらなるＮａｄＡホモログは、以下：
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】
【表１２】
である。
【０１１９】
（多重配列アライメント）
ＮａｄＡの「ファミリー」のメンバーの、多重配列アライメントは、以下：
【０１２０】
【表１３】
【０１２１】
【表１４】
である。
【０１２２】
（ＨａｄＡの研究）
上記されたように、ＨａｄＡ配列（配列番号１）を、当初は不完全な形態で発見した。完全なＨａｄＡ遺伝子座を、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーＨＯＭ Ｆ（配列番号４０）、リバースプライマーＨＯＭ Ｒ２（配列番号４１）およびＨＯＭ Ｒ２よりさらに下流の代替リバースプライマーＨＯＭ Ｒ３（配列番号４２）を使用して増幅した。７個のプライマー（フォワード：配列番号４３〜４６；リバース：配列番号４７〜４９）を、完全な遺伝子座の配列決定のために使用した。
【０１２３】
Ｆ３０３１株における完全な遺伝子座は、配列番号５０として与えられる。この配列のヌクレオチド８７４〜１３３９は、新規であり、そして配列番号２０の下流である。ＨａｄＡのアミノ酸配列は、配列番号５１である。配列番号２０のＣ末端の下流は、単独で、配列番号５２として与えられる。
【０１２４】
ＮａｄＡおよびＨａｄＡのアライメント（２４３ａａオーバーラップにおいて、３９．５％の同一性）は、以下：
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
【表１６】
に与えられる。
【０１２７】
全体の同一性は３９．５％であるが、Ｃ末端部分における同一性は、ずっと高い（８６％まで）。この２つのタンパク質の中央ドメインはあまり保存されていないが、両方のタンパク質は、強いコイルドコイル構造をとると推測される（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
【０１２８】
ｈａｄＡポジティブ株（Ｆ３０３１）および多種多様なｈａｄＡネガティブ株（ｄ型、ｂ型、および複数の類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）におけるｈａｄＡ遺伝子座の概略的な構成を、図２２に示す。隣接する遺伝子（ＲＮＡヘリカーゼであるＨＩ０４２２および推定のプロテアーゼであるＨＩ０４１９（どちらもｈａｄＡに対して逆向き））は、常に保存されている。
【０１２９】
ｈａｄＡのすぐ下流は、ＫＷ２０株においてフレームシフトされ、かつ試験された全ての他のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株には存在しない仮想タンパク質（配列番号５３および５４）をコードする遺伝子である。このタンパク質に対する最も近いデータベースのマッチは、ＺＰ＿００１３２２１８．１（配列番号５５）であり：
【０１３０】
【表１７】
これは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ ２３３６由来の関連するアセチルトランスフェラーゼである。
【０１３１】
ＨａｄＡネガティブ株におけるその遺伝子座のアライメントは、以下：
【０１３２】
【表１８】
【０１３３】
【表１９】
に与えられる。
【０１３４】
ＥＡＧＡＮ配列およびＨＫ７０７配列は、ｂ型Ｈｉ株由来であり；他の４つは、ＮＴＨｉ株由来である。上流遺伝子（ＨＩ０４２２）の終止コドンＴＡＡに、下線が引いてあり、下流遺伝子（ＨＩ０４１９）の終止コドンＴＡＧの逆向きの相補体も同様である。そのＨａｄＡ遺伝子は、これら２つの遺伝子の間に見られ、その重要な遺伝子間配列は、配列番号６２である。
【０１３５】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株およびＦ１９４７株は、ＨａｄＡ遺伝子を欠失しているが、ＨＩ０４１９とＨＩ０４２２との間の配列は、より長く、かつＨａｄＡの上流およびＨａｄＡの最初の５個のコドンを含む領域と相同性を有する配列を含む。Ｈｉ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群の配列は、以下：
【０１３６】
【表２０】
のとおりである。
【０１３７】
下線が引かれた７７マー（配列番号６３）：
【０１３８】
【表２１】
はまた、Ｒｄ株およびＦ１９４７株においても、ＨＩ０４２２の下流に見られる。
【０１３９】
この共有される配列は、株がＨａｄＡネガティブであっても、サザンブロットにおいて交差反応のある程度のレベルを生じ得る。
【０１４０】
種々のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株のパネルにおけるサザンブロット実験は、多様な株におけるＨａｄＡの存在を明らかにした（図２３）。全ての他の類型可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株または類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株は、この解析によると、ｈａｄＡ遺伝子を欠失していた。
【０１４１】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨａｄＡ発現）
ＨａｄＡの構造および機能を研究するために、図２４に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための種々の構築物：（１）全長のタンパク質を発現するための構築物（ネイティブＨａｄＡ、すなわち「ＨａｄＡ／ｎａ」）；（２）ＮａｄＡリーダーペプチドの制御下にあるＨａｄＡタンパク質を発現するための構築物（「ＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａ」）；（３）Ｃ末端ヒスチジン融合タンパク質を発現するための構築物（「ＨａｄＡ−ｈｉｓ」）、を調製した。全ての構築物を、ｐＥＴ２１ｂ発現ベクターにおいて作製し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、発現宿主として使用した。
【０１４２】
ＨａｄＡ−ｈｉｓを、種々の温度で発現させた。全体のかつ可溶性のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、１２％ＭＯＰＳ；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）により解析した。このゲルを、図２５に示す。３０℃で発現されたこの可溶性タンパク質（レーン９）を精製し、マウスを免疫化するために使用した。
【０１４３】
ＨａｄＡ−Ｈｉｓの精製は、ＩＭＡＣプロセスにより行われ得るが、これは全てのＥ．ｃｏｌｉ夾雑物を除去するのにあまり効果的ではなかった。従って、ＩＭＡＣに引き続いて、ｐＨ７．７緩衝液中で、陰イオン交換クロマトグラフィーで透析した。意外にも、このタンパク質は、完全に沈殿した。続いて、そのタンパク質を、４つの異なるｐＨ条件（６．３、６．５、７．７および８．５）の緩衝液中で透析し、そしてｐＨ７．７でのみ沈殿を観察した。理論的ｐＩが４．３８なので、その沈殿は、等電点沈殿ではないはずである。
【０１４４】
上記マウスの血清を、Ｅ．ｃｏｌｉ株の種々の画分および精製された組み換えＨａｄＡのウェスタンブロット（１２％ Ｍｏｐｓ）を可視化するために使用した。一次抗体は、抗ＨａｄＡ（１：１０００）であり；二次抗体は、抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）１：１００００であった。この結果は、図２６である。
【０１４５】
ＨａｄＡ／ｎａおよびＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを、図３１に示す。一晩中および誘導培養の両方において、ＨａｄＡタンパク質は、ＳＤＳゲル中で熱安定なモノマーおよびオリゴマー（例えば、トリマー）として、発現された。ウェスタンブロットは、図３２に示され、上記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌中におけるＨａｄＡモノマーおよびＨａｄＡオリゴマーの存在を確認した。
【０１４６】
発現をまた、細菌の外膜タンパク質を試験することにより研究した。図３３は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯＭＶ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル１０％ ＭＯＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＨａｄＡオリゴマーがその外膜で見られることを示す。その細胞表面部分を、図３４に示されるように、ＦＡＣＳにより確認した。
【０１４７】
（付着）
精製したＨａｄＡを、Ｃｈａｎｇ上皮細胞に結合する能力について試験した。その実験は、ＦＡＣＳ解析により、ＨａｄＡ−ｈｉｓがその細胞に用量依存的な様式で結合することを示した（図２７）。
【０１４８】
ＨａｄＡ／ｎａを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、凝集について試験した。図２８は、室温で４時間放置されていた後期対数期の培養物から収集された細胞凝集物の位相差顕微鏡を示す。３つの異なるサンプルを、図２８Ａ〜図２８Ｃに示す。細菌は、目に見える「雲状物」を形成し、そして細菌の凝集は、マイクロコロニー形成と相関し得る。対照的に、ｐＥＴプラスミドのみで形質転換された細胞は、凝集性を全く示さない。
【０１４９】
凝集をまた、チューブ沈降アッセイを用いて研究した。空のｐＥＴまたはＨａｄＡ／ｎａを含有するｐＥＴのいずれかで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの培養物を、後期対数期までインキュベートし、次いで室温で４時間沈降させた。そのＨａｄＡ発現細菌は、濁度を失ったが、コントロールの細胞は、失わなかった（図３５）。これは、ＨａｄＡが細菌の凝集を促進することを示している。
【０１５０】
付着実験および侵襲実験もまた、ＨａｄＡ／ｎａを発現するＥ．ｃｏｌｉおよびＣｈａｎｇ細胞の単層を使用して行った。付着（侵襲）を、細胞単層上の付着した（侵襲された）細菌の数を数えることにより計算した（ＭＯＩ＝１：１０００）。結果を、３連の実験で作成された測定の平均±平均値の標準誤差とし、図２９に示す。付着および侵襲を示す細胞数は、以下：
【０１５１】
【表２２】
のとおりであった。
【０１５２】
付着および侵襲を、免疫蛍光顕微鏡分析により確認した（図３０）。細胞外の細菌（緑色）および細胞内の細菌（赤色）が、見られ得る。
【０１５３】
ＨａｄＡのさらなる研究としては、付着／侵襲アッセイにおける試験のためのＢＰＦ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株の同系ＨａｄＡノックアウトの構築；ＮａｄＡノックインにより付着が相補され得るかどうか確かめるための、このようなノックアウト変異体の試験；ＨａｄＡおよびＮａｄＡが同じレセプターに結合するかどうか確かめるための、ヒト細胞への付着／侵襲におけるＨａｄＡおよびＮａｄＡを用いた競合実験、が挙げられる。
【０１５４】
本発明は一例としてのみ説明され、本発明の範囲および精神の中になお存在しながら改変がなされ得ることが、理解される。
【０１５５】
【表２３−１】
【０１５６】
【表２３−２】
【０１５７】
【表２３−３】
【０１５８】
【表２３−４】
【０１５９】
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【数１５】
【数１６】
【数１７】
【数１８】
【背景技術】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての書類は、それらの全体において、参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細菌性付着因子の分野にある。特に、本発明は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび他の生物に由来するビルレンス関連付着因子抗原に関する。
【０００３】
（背景技術）
グラム陰性Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属としては、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ａｅｇｙｐｔｉｕｓ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｔｉｕｓ生物群とも呼ばれる）、Ｈ．ｄｅｃｒｅｙｉおよびＨ．ｓｏｍｎｕｓが挙げられる。これらの細菌は、結膜炎、軟性下疳、紫斑病の熱（ｐｕｒｐｕｒｉｃ ｆｅｖｅｒ）、髄膜炎、肺炎および喉頭蓋炎を含む疾患を引き起こし得る。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、この属のなかで最も一般的に見られる病原体であり、そして、類型可能な株（被包性）および類型できない株（非被包性；「ＮＴＨｉ」）の両方を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するワクチンは、その莢膜サッカリドとキャリアタンパク質との結合体に基づき、充分な成功を収めているが、上記種の他のメンバーに対する保護の提供は、ほとんど発展していない。特に、Ｄ型 Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよび類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、問題のままである。
【０００５】
同様に、ワクチンは、他の生物病原体（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの腸毒素産生性株（ＥＴＥＣ）、腸病原性株（ＥＰＥＣ）、腸凝集性株（ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ）（ＥＡＥＣ）、腸出血性株（ＥＨＥＣ）および志賀毒素株（ＳＴＥＣ））に対しても、利用できないままである。
【０００６】
このような細菌によって引き起こされる感染の予防および処置を改善するための物質および方法を提供することが、本発明の目的である。より詳細には、細菌感染に対して免疫するために適切な材料を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
付着因子に関与するビルレンス関連抗原は、いくつかの細菌および他の生物において同定され、そしてこれらの抗原は、細菌感染（特に、有毒株によって引き起こされる細菌感染）の診断、予防および処置のために有用である。特に、抗原は、以下：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群（配列番号１）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１（配列番号２および３）およびＥＨＥＣ ＥＤＬ９３３株；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（配列番号４）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ（配列番号５）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ（配列番号６）；ＥＰＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ２３４８／６９株（配列番号７）；ＥＰＥＣ（配列番号１８）；ＥＡＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ４２株（配列番号８および９）；尿路病原体（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ（配列番号１０）；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（配列番号１１）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ（配列番号１２）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ（配列番号１３）；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（配列番号１４）；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（配列番号１５）；Ｂｒａｄｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（配列番号１６）；ならびにＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ（配列番号１７）において、同定されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）配列番号５１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および５４からなる群より選択される、アミノ酸配列；（ｂ）（ａ）に規定されるような配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列；ならびに／または
（ｃ）（ａ）に規定されるような配列の少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントを含む、アミノ酸配列
のうちの１つ以上を含む、ポリペプチド。
（項目２）
項目１に記載のポリペプチドであって、前記（ｃ）のフラグメントは、前記（ａ）の配列の４つのドメインのうちの１つ以上を含まない、ポリペプチド。
（項目３）
項目１に記載のポリペプチドであって、前記（ｃ）のフラグメントは、前記(ａ）の
配列の少なくとも１つの完全なドメインを含む、ポリペプチド。
（項目４）
オリゴマー形態にある、項目１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目５）
式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｘ−Ｂ−ＣＯＯＨのポリペプチドであって、ここで：
Ｘは：（ａ）配列番号１〜１８、５１および５４の１つ以上に対して少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列；ならびに／または
（ｂ）配列番号１〜１８、５１または５４の１つ以上の少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、アミノ酸配列、を含み；Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり；そしてｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、
ポリペプチド。
（項目６）
アミノ酸配列−Ａ−Ｗ１−Ｗ２−Ｗ３−Ｗ４−Ｂ−を含むポリペプチドであって：
Ａは、任意のＮ末端配列であり；
Ｂは、任意のＣ末端配列であり；
Ｗ１は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドに対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
Ｗ２は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上の球状ヘッドに対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
Ｗ３は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のコイルドコイルドメインに対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
Ｗ４は：（ａ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上の膜貫通アンカー領域に対して少なくとも７０％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１の１つ以上のリーダーペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
ただし、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３またはＷ４のうちの少なくとも１つが存在する、ポリペプチド。
（項目７）
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ由来の付着因子であって、ここで、該付着因子は：
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号５２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列；および／または（ｃ）配列番号５２の少なくとも８個の連続するアミノ酸のフラグメントである、アミノ酸配列
を含む、付着因子。
（項目８）
項目１に記載のポリペプチドに結合する抗体。
（項目９）
項目１に記載のポリペプチドまたは項目８に記載の抗体をコードする、核酸。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または核酸および／または抗体を含有する、薬学的組成物。
（項目１１）
薬物としての使用のための、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
哺乳動物において免疫応答を上昇させるための医薬の製造における、項目１に記載のポリペプチドの使用。
（項目１３）
哺乳動物において免疫応答を上昇させるための方法であって、該方法は、有効量の項目１０に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【０００８】
本発明の抗原の間の配列同一性の程度は低いが、単純な一次配列情報を超えるレベルでの上記抗原の理解は、それらが、Ｎ末端からＣ末端のドメインの共通の配置、すなわち：・リーダーペプチド
・球状ヘッド
・コイルドコイル領域
・膜貫通アンカー領域
を共有することを示す。
【０００９】
上記種々の抗原の間の配列類似性は、主に、上記Ｃ末端アンカー領域に限定される。このドメインの配置は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質ＮａｄＡと共有される｛１｝。
【００１０】
配列番号１〜１８におけるこれらの特徴の位置は、以下のとおりである：
【００１１】
【表１】
（抗原）
本発明は、以下のアミノ酸配列うちの１つ以上を含むポリペプチドを提供する：配列番号１〜１８、配列番号５１および配列番号５４のいずれか。
【００１２】
本発明はまた、以下：（ａ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで、ｍは、５０以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上）である、アミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸であって、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である、アミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、配列番号１〜１８、５１および５４の改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体など）を含む。
【００１３】
（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上由来のエピトープを含み、好ましくは、Ｂ細胞エピトープを含む。Ｂ細胞エピトープは、実験的に同定され得るかまたはアルゴリズム的に予測され得る。
【００１４】
（ｂ）の他の好ましいフラグメントは、配列番号１〜１８、５１および５４由来の関連するアミノ酸配列の、Ｃ末端からの１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）および／またはＮ末端からの１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４５またはそれ以上）を欠く。特に、好ましいフラグメントは、少なくともＮ末端リーダー配列を省く（そして、その省かれたリーダー配列は、異種リーダー配列によって置換され得る）。
【００１５】
他の好ましいフラグメントは、上の表に基づく配列番号１〜１８および５１の４つのドメインのうちの１つ以上（すなわち、１、２または３）を省く。他の好ましいフラグメントは、配列番号１〜１８および５１の４つのドメインのうちの１つ以上（すなわち、１、２または３）からなる。
【００１６】
本発明の好ましいポリペプチドは、オリゴマー形態（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなど）で存在する。トリマーが好ましいが、本発明のモノマーポリペプチドはまた、有用である。
【００１７】
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｘ−Ｂ−ＣＯＯＨのポリペプチドを提供し、ここで：
−Ｘは、上に規定されたように：（ａ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８、５１および５４のうちの１つ以上の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列を含み；
−Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり；
−Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり；
−Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり；そして
−ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である（好ましくは、ｘ＝２である）。
【００１８】
−Ｘ−部分がリーダーペプチドを有する場合、このリーダーペプチドは、上記ハイブリッドタンパク質中に含まれても省かれてもよい。いくつかの実施形態において、上記リーダーペプチドは、上記ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除いて、削除される（すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２．．．Ｘｘのリーダーペプチドは省略される）。このことは、全てのリーダーペプチドを削除し、そしてＸ１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと等価である。
【００１９】
｛−Ｘ−Ｌ−｝の各々のｘについて、−Ｘ−は、同じであっても異なっていてもよく、そしてリンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもしなくてもよい。例えば、ｘ＝２の場合、上記ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的には、短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎを含み、ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１９）であり、そのＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドは、ＢａｍＨＩ制限部位から形成され、従って、クローニングおよび操作を助け、そして上記（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは、代表的なポリグリシンリンカーである。
【００２０】
−Ａ−は、任意のＮ末端アミノ酸配列である。これは、代表的に、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送に関するリーダー配列、またはクローニングもしくは操作を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｈ、ここで、ｈ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸を有する）である。
【００２１】
−Ｂ−は、任意のＣ末端アミノ酸配列である。これは、代表的に、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送に関する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｈ、ここで、ｈ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）またはタンパク質安定性を増大させる配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【００２２】
本発明はまた、アミノ酸配列：
−Ａ−Ｗ１−Ｗ２−Ｗ３−Ｗ４−Ｂ−
を含むポリペプチドを提供し、ここで：
−Ａは、上に規定されるような任意の配列であり（好ましくは、上記ペプチドのＮ末端にある）；
−Ｂは、上に規定されるような任意の配列であり（好ましくは、上記ペプチドのＣ末端にある）；
−Ｗ１は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上のリーダーペプチドに対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１うちの１つ以上のリーダーペプチドの少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
−Ｗ２は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の球状ヘッドドメインに対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の球状ヘッドドメインの少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
−Ｗ３は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上のコイルドコイルドメインに対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上のコイルドコイルドメインの少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
−Ｗ４は：（ａ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の膜貫通アンカー領域に対して少なくともｍ％の同一性を有する、任意のアミノ酸配列；ならびに／または（ｂ）配列番号１〜１８および５１のうちの１つ以上の膜貫通アンカー領域の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、任意のアミノ酸配列であり；
ただし、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３またはＷ４のうちの少なくとも１つが存在する。
【００２３】
本発明はまた、上に記載されるようなポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、ここで、そのペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸変異を含む。その変異は、好ましくは、本発明のポリペプチドの活性の減少または除去をもたらし、この減少または除去は、直接的または間接的に、ビルレンスまたは付着を担う。例えば、上記変異は、酵素活性を阻害し得るかまたはそのタンパク質における結合部位を除去し得る。変異は、欠失、置換および／または挿入を含み得、それらのうちのいずれかは、１つ以上のアミノ酸を含み得る。代替として、上記変異は、トランケーションを含み得る。
【００２４】
ビルレンス因子の突然変異は、多くの細菌について充分に確立された科学である｛例えば、参考文献２〜８に記載されるトキシン突然変異｝。突然変異は、本発明のポリペプチドをコードする核酸に対して、特異的に標的化され得る。あるいは、突然変異は、（例えば、照射、化学的突然変異などに起因して）全体的であってもランダムであってもよく、代表的には、その後、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中に変異が導入されているものについて、細菌をスクリーニングする。このようなスクリーニングは、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロットまたはノザンブロットなど）、プライマーに基づく増幅（例えば、ＰＣＲ）、スクリーニング、プロテオミクス、異常ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル移動（ａｂｅｒｒａｎｔ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）などにより得る。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、種々の手段によって（例えば、組み換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）、そして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、非ポリグリコシル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）など）で調製され得る。それらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、実質的に他の細菌または宿主細胞タンパク質を含まない）で調製される。
【００２６】
本発明のペプチドの発現は、ネイティブな宿主中で行われ得るが、本発明は、好ましくは、異種宿主を利用する。上記異種宿主は、原核生物（例えば、細菌）であっても真核生物であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉが好ましいが、他の適切な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【００２７】
本発明のポリペプチドが配列番号５１に関する場合、そのポリペプチドは、好ましくは、少なくとも２２４個（例えば、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３５個、２４０個、２４５個、２５０個、２５５個またはそれ以上）のアミノ酸を含む。
【００２８】
本発明はまた、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ由来の付着因子を提供し、ここで、その付着因子は以下を含む：（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号５２に対して少なくともｍ％の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｃ）配列番号５２の少なくともｎ個の連続するアミノ酸のフラグメントである、アミノ酸配列。
【００２９】
（抗体）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【００３０】
本発明の抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに対して、少なくとも１０−７Ｍの親和性（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍまたはそれ以上に大きな親和性）を有する。好ましい抗体は、本発明のポリペプチドのヒト細胞に結合する能力を阻害し得る。
【００３１】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段により（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成などにより）、そして種々の形態（例えば、ネイティブな形態、融合形態、グリコシル化形態、非グリコシル化形態など）で産生され得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、実質的に他の抗体が存在しない形態）で調製される。
【００３２】
用語「抗体」は、抗体全体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などを包含する。
【００３３】
本発明の抗体は、標識を含み得る。上記標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識）は、直接的に検出可能であり得る。あるいは、標識（例えば、生成物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど））は、間接的に検出可能であり得る。
【００３４】
本発明の抗体は、固体支持体に結合され得る。
【００３５】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを適切な動物（例えば、ウサギ、ハムスター、マウス、または他の齧歯類）に投与（例えば、注射）することにより調製され得る。
【００３６】
ヒト免疫系との適合性を増大させるために、上記抗体は、キメラ抗体もしくはヒト化抗体であり得るか（例えば、参考文献９および１０）、または十分にヒト化した抗体が使用され得る。ヒト化抗体は、元の非ヒトモノクローナル抗体よりもヒトの中では免疫原性がさらに弱いので、ヒト化抗体は、ヒトの処置のために使用され得、アナフィラキシーのリスクはさらに低い。従って、これらの抗体は、治療上の適用において好ましくあり得、この治療上の適用（例えば、腫瘍性疾患の処置のための放射増感剤（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）としての使用または癌療法の副作用を低減する方法における使用）は、インビボでのヒトへの投与を包含する。
【００３７】
ヒト化抗体は、種々の方法（例えば：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク領域および定常領域へと移植（「ヒト化」）し、そして非ヒト抗体から１以上のフレームワーク残基を必要に応じて移動させる工程；（２）非ヒト可変ドメイン全体を、移植はするが表面残基の置換によりヒト様表面で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（化粧張り）工程が挙げられる）により達成され得る。本発明において、ヒト化抗体としては、「ヒト化」抗体および「化粧張り」抗体の両方が挙げられる。｛１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７｝。ヒト化抗体または完全なヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を含むように操作されたトランスジェニック動物を用いて産生され得る。
【００３８】
句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の一部をいう。キメラ抗体においては、マウス定常領域は、ヒト定常領域により置換される。ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α、δ、ε、γまたはμのいずれかより選択され得る。
【００３９】
（核酸）
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェントな」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中で、６５℃）でこの核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００４０】
本発明に従う核酸は、多くの方法（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自身から、など）により調製され得、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、他の細菌の核酸または宿主細胞の核酸が実質的に存在しない形態）で調製される。
【００４１】
用語「核酸」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれらのアナログ（例えば、改変骨格（例えば、ホスホロチオエートなど）を含むアナログ、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。本発明は、上に記載された配列（例えば、アンチセンスまたはプローブの目的）に相補的な配列を含む核酸を包含する。
【００４２】
（免疫原性組成物および医薬）
ＮａｄＡ（これは、優れた抗−髄膜炎菌性免疫原である｛１｝）（毒力との関連を含む）に対する構造上の類似点および機能上の類似点に基づき、本発明のポリペプチドは、免疫化の目的に対しても有用であるはずである。
【００４３】
本発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の核酸および／または本発明の抗体を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、好ましくは、免疫原性の組成物であり、そしてより好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防用（すなわち、感染を予防する）であるか、または治療用（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防用である。
【００４４】
この組成物のｐＨは、好ましくは、６と８との間であり、好ましくは、約７である。上記ｐＨは、緩衝液の使用により維持され得る。この組成物は、滅菌されており、そして／または発熱物質なしであり得る。上記組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【００４５】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を引き起こし得（すなわち、この医薬は、免疫原性の組成物である）、より好ましくは、ワクチンである。
【００４６】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための医薬の製造における１種以上（例えば、２、３、４、５、６）の本発明のポリペプチドの使用を提供する。この医薬は、好ましくは、ワクチンである。
【００４７】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための方法を提供し、この方法は、本発明の有効量の組成物を投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは防御的であり、そして好ましくは、抗体および／または細胞の媒介する免疫性を包含する。この方法は、追加免疫応答を引き起こし得る。
【００４８】
上記哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（ｃｈｉｌｄ）（例えば、よちよち歩きの幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または幼児（ｉｎｆａｎｔ））または若者であり；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、若者または成人である。小児に対して使用される予定であるワクチンはまた、（例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために）大人にも投与され得る。
【００４９】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（特に、ＥＨＥＣ株、ＥＡＥＣ株、ＥＴＥＣ株、ＥＰＥＣ株およびＵＰＥＣ株）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｂｒａｄｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍにより引き起こされる疾患の予防および／または処置のためのものである。従って、本発明は、疾患（結膜炎、軟性下疳、紫斑病熱、髄膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、インプラント周囲炎、歯周病、歯肉炎、ウシ脳炎、関節炎、心筋炎、下痢、ヒツジ流産、精巣炎、波状熱、ブタ生殖性喪失（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｗａｓｔａｇｅ）、ブルセラ症などの予防および／または処置に適切である。
【００５０】
治療上の処置の有効性を調査する一つの方法は、本発明の組成物の投与後の細菌の感染をモニタリングする工程を包含する。予防上の処置の有効性を調査する一つの方法は、この組成物の投与後に、上記ポリペプチドに対する免疫応答をモニタリングする工程を包含する。
【００５１】
本発明の組成物は、一般的に、患者に対して直接的に投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射、筋肉注射、もしくは組織の腸空間への注射）、または直腸投与、経口投与（例えば、錠剤、噴霧剤）、膣投与、局所投与、経皮投与（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）｛例えば、参考文献１８を参照のこと｝、もしくは経皮投与（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）｛例えば、参考文献１９および２０を参照のこと｝、鼻内投与｛例えば、参考文献２１を参照のこと｝、眼内投与（ｏｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、耳内投与（ａｕｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、肺内投与（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｉｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ）、もしくは他の粘膜投与により達成され得る。
【００５２】
本発明は、全身性の免疫性および／または粘膜性の免疫性を惹起するために使用され得る。
【００５３】
投薬処置は、単回用量計画であっても、複数回用量計画であってもよい。複数回用量は、初回免疫化計画および／または追加免疫免疫化計画において使用され得る。複数回用量計画において、種々の用量が、同一または別個の経路（例えば、非経口の刺激および粘膜性ブースト、粘膜性刺激および非経口ブーストなど）により与えられ得る。
【００５４】
細菌の感染は、身体の種々の領域に影響する。それで、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、注射可能な物質（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｓ）（液状液剤または懸濁剤のいずれか）として調製され得る。液体ビヒクルにおいて、溶液または懸濁剤に対して適切な固体形態（例えば、凍結乾燥された組成物）もまた、注射前に調製され得る。この組成物は、（例えば、軟膏剤、乳剤、または散剤として）局所投与のために調製され得る。この組成物は、（例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、噴霧剤として、またはシロップ剤（必要に応じて、矯味矯臭されたシロップ剤）として）経口投与のために調製され得る。この組成物は、細かい粉末（ｆｉｎｅ ｐｏｗｄｅｒ）もしくは噴霧剤を用いて、（例えば、吸入剤として）肺内投与のために調製され得る。この組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。この組成物は、鼻内投与、耳内投与、または眼内投与のために（例えば、滴（ｄｒｏｐ）として）調製され得る。この組成物は、合わされた組成物が患者に対する投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。このようなキットは、液体形態中に１種以上の抗原および１種以上の凍結乾燥された抗原を含み得る。
【００５５】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、必要とされる場合、免疫学的に有効な量の抗原ならびに他の任意の成分を含有する。「免疫学的に有効な量」により、個体へのこの量の投与（単回用量においてか、または一連の一部としてのいずれか）が処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の、健康状態および身体的状態、年齢、処置されるべき個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成するこの個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方物、医学的状態の処置医の所見、ならびに他の関連する因子に依存して変動する。この量が、日々の試行を通して決定され得る、比較的広汎な範囲に収まることが期待される。
【００５６】
本発明はまた、（非経口および／または粘膜の）アジュバントとして使用するための本発明のポリペプチド（ＮａｄＡそれ自体を含む）を提供する。同様に、本発明は、本発明のポリペプチドを第二の抗原と混合して含有する組成物を提供し、第二の抗原の混合により、本発明のポリペプチドは、患者に投与された場合に第二の抗原に対する免疫応答を増強する。
【００５７】
（組成物のさらなる成分）
本発明の組成物は、代表的には、上記成分に加えて、１種以上の「薬学的に受容可能なキャリア」を含有し、この薬学的に受容可能なキャリアとしては、上記組成物を受け取る個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的には、大きな、緩徐に代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、アミノ酸コポリマーおよび脂質凝集体（例えば、油滴もしくはリポソーム））である。このようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含有し得る。さらに、補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤）、ｐＨ緩衝物質などが存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤についての全体の考察が、参考文献２２において入手できる。
【００５８】
本発明のワクチンは、他の免疫制御因子と併せて投与され得る。特に、組成物は、通常アジュバントを含有する。好ましいさらなるアジュバントとしては、（Ａ）アルミニウム塩（ヒドロキシド（例えば、オキシヒドロキシド）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、スルフェートなどが挙げられる｛例えば、参考文献２３の第８章および第９章を参照のこと｝）、または、種々のアルミニウム化合物の混合物（この化合物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶性化合物、非晶質化合物など）をとる）ならびにこれらが好ましく吸着されたもの；（Ｂ）ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５が微小フリューダイザ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子へと処方された）｛２３の１０章を参照のこと；参考文献２４もまた参照のこと｝；（Ｃ）リポソーム｛参考文献２３の第１３章および第１４章を参照のこと｝；（Ｄ）さらなる界面活性剤が欠損し得るＩＳＣＯＭ（参考文献２３の第２３章を参照のこと）｛２５｝；（Ｅ）１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦであって、サブミクロンエマルジョンへと微小流動化するか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成したＳＡＦ｛参考文献２３の第１２章を参照のこと｝；（Ｆ）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０、ならびに、モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される一種以上の細菌細胞壁構成成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（Ｇ）サポニンアジュバント（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１｛参考文献２３の第２２章を参照のこと｝、これは、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても公知である｛２６｝；（Ｈ）キトサン｛例えば、２７｝；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など｛参考文献２３の第２７章および第２８章を参照のこと｝；（Ｋ）モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）もしくは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）｛例えば、参考文献２３の第２１章｝；（Ｌ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油滴エマルジョンとの組み合わせ｛２８｝；（Ｍ）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル｛２９｝；（Ｎ）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）｛３０｝または、少なくとも１種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）もしくはポリオキシエチレンエステル界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）｛３１｝；（Ｎ）金属塩の粒子｛３２｝；（Ｏ）サポニンおよび水中油滴エマルジョン｛３３｝；（Ｐ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）｛３４｝；（Ｑ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱−不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはこの無毒化変異物（例えば、Ｋ６３変異物もしくはＲ７２変異物）｛参考文献３５の第５章｝；（Ｒ）コレラトキシン（「ＣＴ」）、またはこの無毒化変異物｛例えば、参考文献３５の第５章｝；（Ｓ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｔ）生体分解性でかつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、好ましいポリ（ラクチド−コ−グリコリド）と共に形成され、必要に応じて、（例えば、ＳＤＳを用いて）負に荷電した表面または（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を用いて）正に荷電した表面を有するように処理された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜直径約１５０μｍの粒子、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜直径約３０μｍの粒子、そして最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜直径約１０μｍの粒子）；（Ｕ）必要に応じて、シトシンの代わりに５−メチルシトシンが使用されているＣｐＧモチーフ（すなわち、少なくとも１のＣＧジヌクレオチドを含む）を含むオリゴヌクレオチド；（Ｖ）モノホスホリル脂質Ａ模造物（例えば、アミノアルキルグルコサミドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））｛３６｝；（Ｗ）ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｈａｚｅｎ）（ＰＣＰＰ）；（Ｘ）生体付着物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）｛３７｝（例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア｛３８｝または、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋された誘導体からなる群より選択される粘膜付着性物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）；あるいは、（Ｙ）この組成物の有効性を増強する免疫刺激因子として作用する他の物質｛例えば、参考文献２３の第７章を参照のこと｝が挙げられるが、これらに限定されない。アルミニウム塩およびＭＦ５９は、非経口免疫化にとっての好ましいアジュバントである。変異体毒素は、好ましい粘膜アジュバントである。
【００５９】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【００６０】
この組成物は、抗生物質を含有し得る。
【００６１】
（さらなる抗原）
本発明のポリペプチドを含有するのみならず、本発明の組成物はまた、１種以上の更なる抗原を含有し得る。封入のためのさらなる抗原は、例えば：
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および／または血清群Ｙ由来のサッカライド抗原（例えば、参考文献３９に開示されている血清群Ｃ由来のオリゴサッカライド（参考文献４０もまた参照のこと）または参考文献４１のオリゴサッカライド）。
− Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原（例えば、ＣａｇＡ｛４２〜４５｝、ＶａｃＡ｛４６、４７｝、ＮＡＰ｛４８、４９、５０｝、ＨｏｐＸ｛例えば、５１｝、ＨｏｐＹ｛例えば、５１｝および／または尿素分解酵素）。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカライド抗原｛例えば、５２、５３、５４｝。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質抗原｛例えば、５５｝。
− Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活化ウイルス）由来の抗原｛例えば、５６、５７｝。− Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面の抗原および／またはコア抗原）｛例えば、５７、５８｝。
− Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原｛例えば、５９｝。
− ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド｛例えば、参考文献６０の第３章｝）（例えば、ＣＲＭ１９７変異体）｛例えば、６１｝。
− 破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）｛例えば、参考文献６０の第４章｝。
− Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および糸状構造ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、これらはまた、必要に応じて、パータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）および／または凝集原２および凝集原３｛例えば、参考文献６２および６３｝と組み合わせられる）；細胞全体の百日咳抗原もまた使用され得る。
− Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ｛例えば、４０｝由来のサッカライド抗原。
− ポリオ抗原｛例えば、６４、６５｝（例えば、ＯＰＶまたは、好ましくは、ＩＰＶ）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ｛例えば、参考文献６６〜７７｝由来のタンパク質抗原（例えば、ＮａｄＡ）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ（例えば、参考文献７８、７９、８０、８１などに開示されるもの）由来の外側膜小胞（ＯＭＶ）調製物。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原｛例えば、参考文献８２〜８８｝。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原｛例えば、８９｝。
− Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原｛例えば、９０｝。− 狂犬病抗原｛例えば、９１｝（例えば、凍結乾燥された不活化ウイルス｛例えば、９２、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ｝。
− 麻疹、耳下腺炎および／または風疹の抗原｛例えば、参考文献６０の第９章、第１０章および第１１章｝。
− インフルエンザ抗原｛例えば、参考文献６０の第１９章｝（例えば、ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）。
− Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原｛例えば、９３、９４、９５、９６｝。
−呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ｛９７、９８｝）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３｛９９｝）のようなパラミクソウイルス由来の抗原
−ＵｓｐＡ１および／またはＵｓｐＡ２のような、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ｛例えば、１００｝由来の抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）｛例えば、１０１、１０２、１０３｝由来の抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）｛例えば、１０４｝由来の抗原
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ｛例えば、１０５｝由来の抗原
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ｛例えば、１０６、１０７、１０８｝由来の抗原
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）に属するウイルス由来（例えば、黄熱病ウイルス由来、日本脳炎ウイルス由来、デング熱ウイルスの４つの血清群由来、ダニ媒介性脳炎ウイルス由来、西ナイルウイルス由来）の抗原
−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来の抗原
−ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）由来の抗原
−ロタウイルス由来の抗原
−ペスチウイルス抗原（例えば、古典的ブタ熱ウイルス由来、ウシウイルス性下痢ウイルス由来および／またはボーダー病ウイルス由来）
−パルボウイルス抗原（例えば、パルボウイルスＢ１９由来）
−コロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス由来）
−癌抗原（例えば、参考文献１０９の表１、または参考文献１１０の表３および表４に列挙される抗原）。
【００６２】
上記組成物は、これらのさらなる抗原の１つ以上を含有し得る。抗原の組み合わせは、共有された特徴（例えば、呼吸器疾患に関連した抗原、腸疾患に関連した抗原、性感染症に関連した抗原など）に基づくべきであることが望ましい。
【００６３】
糖類抗原または炭水化物抗原が使用される場合、免疫原性を増強するために、その抗原は、好ましくはキャリアータンパク質と結合される｛例えば、参考文献１１１〜参考文献１２０｝。好ましいキャリアータンパク質は、細菌毒素または細菌トキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドは、特に好ましい｛１２１｝。他のキャリアーポリペプチドとしては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質｛１２２｝、合成ペプチド｛１２３、１２４｝、熱ショックタンパク質｛１２５、１２６｝、百日咳タンパク質｛１２７、１２８｝、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ｛１２９｝、サイトカイン｛１３０｝、リンホカイン｛１３０｝、ホルモン｛１３０｝、成長因子｛１３０｝、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の、毒素Ａまたは毒素Ｂ｛１３１｝、鉄取り込みタンパク質｛１３２｝などが挙げられる。混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方に由来する莢膜糖類を含有する場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の比（ｗ／ｗ）は、１より大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはより高い）ことが好ましくあり得る。異なる糖類は、同じ型のキャリアータンパク質または異なる型のキャリアータンパク質に結合され得る。任意の適切な結合反応は、必要な場合、任意の適切なリンカーと共に使用され得る。
【００６４】
毒素タンパク質抗原は、必要な場合、無毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の無毒化｛６３｝）。
【００６５】
ジフテリア抗原が上記組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むこともまた好ましい。
【００６６】
上記組成物中の抗原は代表的に、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的には、任意に所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘起するのに十分である。
【００６７】
本発明の組成物におけるタンパク質抗原の使用に代わるものとしては、上記抗原をコードする核酸が使用され得る｛例えば、参考文献１３３〜参考文献１４１｝。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態である）によって置換され得る。
【００６８】
（プロセス）
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の核酸によって形質転換された宿主細胞を、ポリペプチド発現を誘導する条件下で培養する工程を包含する。
【００６９】
本発明は、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、化学的手段によって、少なくとも一部の上記ポリペプチドを合成する工程を包含する。
【００７０】
本発明は、本発明の核酸を生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、プライマーベースの増幅方法（例えば、ＰＣＲ）を使用して核酸を増幅する工程を包含する。
【００７１】
本発明は、本発明の核酸を生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、化学的手段によって、少なくとも一部の上記核酸を合成する工程を包含する。
【００７２】
本発明はまた、サンプル中の細菌の存在を検出ためのプロセスを提供し、このプロセスは、ハイブリダイズ条件下で、上記サンプルと本発明の核酸とを接触させる工程；そして（ｂ）上記サンプル中に存在する核酸に対する本発明の核酸のハイブリダイゼーションの、存在または非存在を検出する工程を包含する。工程（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの存在は、上記サンプルが、関連する細菌を含むことを示す。
【００７３】
本発明はまた、細菌の存在を検出するための免疫学的アッセイ法を提供し、この方法は、サンプルと、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体とを接触させる工程を包含する。
【００７４】
（付着阻害）
本発明は、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）に対する細菌細胞の付着を阻害するための方法を提供する。上記細胞は、インビトロ（例えば、細胞培養物中）またはインビボであり得る。上記細胞は、最も好ましくはヒト細胞である。上記宿主細胞は代表的に、上皮細胞または内皮細胞である。
【００７５】
本発明は、宿主細胞に対する細菌細胞の付着を防ぐための方法を提供し、ここで１つ以上の本発明のポリペプチドの上記宿主細胞に対して結合する能力はブロックされる。
【００７６】
上記結合する能力は、様々な方法でブロックされ得るが、最も都合良くは、本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体が使用される。抗体の使用に代わるものとしては、本発明のポリペプチドと上記宿主細胞上のそのレセプターとの間の相互作用のアンタゴニストが使用され得る。さらに代替的には、上記宿主細胞レセプターの可溶性形態が、おとりとして使用され得る。これらは、レセプターの膜貫通領域、および必要に応じて細胞質領域を除去することによって生成され得る。
【００７７】
本発明の抗体、本発明のアンタゴニストおよび本発明の可溶性レセプターは、宿主細胞に対する細菌細胞の付着を防ぐ医薬として使用され得る。
【００７８】
本発明は、宿主細胞に対する細菌細胞の付着を防ぐための方法を提供し、ここで本発明のポリペプチドの発現は阻害される。上記阻害は転写のレベルおよび／または翻訳のレベルにおいてであり得る。上記遺伝子の発現を阻害するための好ましい技術は、アンチセンスである｛例えば、参考文献１４２〜参考文献１４８など｝。抗細菌アンチセンス技術は、例えば、参考文献１４９および参考文献１５０に開示される。
【００７９】
本発明は、上皮細胞に対する細菌（例えば、ナイセリアの）細胞の付着を防ぐための方法を提供し、ここで本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、ノックアウトされる。従って、本発明は、そのような遺伝子がノックアウトされた細菌を提供する。ノックアウト細菌を作製するための技術は、周知である。ノックアウト変異は、上記遺伝子のコード領域中に位置され得るか、またはその転写制御領域内（例えば、そのプロモーター内）に位置し得る。上記ノックアウト変異は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌によって生成されるｍＲＮＡのレベルの＜１％に低下させる（例えば、＜０．５％、＜０．１％、０％）。本発明のノックアウト変異は、免疫原性の組成物として（例えば、ワクチンとして）使用され得る。そのようなワクチンは、弱毒化された生細菌のような変異体を含み得る。
【００８０】
本発明はまた、宿主細胞に対する細菌細胞の結合を阻害する化合物（アンタゴニスト）を同定するために化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００８１】
スクリーニングにおける潜在的なアンタゴニストとしては、低分子有機分子、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリアミン、抗体、およびそれらの誘導体が挙げられる。低分子有機分子は、５０ダルトンと約２，５００ダルトンとの間の分子量、そして最も好ましくは２００ダルトン〜８００ダルトンの範囲内の分子量を有する。天然物を含む抽出物、化合物ライブラリーまたは混合された組み合わせ合成の生成物のような物質の複合混合物もまた、潜在的なアンタゴニストを含む。
【００８２】
代表的には、本発明のポリペプチドは、宿主細胞および試験化合物（例えば、抗体）と一緒にインキュベートされ、次いでその混合物は、上記タンパク質と上皮細胞との間の相互作用が阻害されたか否かを見るために試験される。上記タンパク質、細胞および化合物は、任意の順序で混合され得る。
【００８３】
当然のこととして、阻害は、スタンダード（例えば、ネイティブの、タンパク質／細胞相互作用）と比較して決定される。好ましくは、上記スタンダードは、上記試験化合物の非存在下で測定されたコントロール値である。上記スタンダードは、上記方法が行われる前に決定され得るか、あるいは上記方法が、行われた際か、または行われた後に決定され得ることが理解される。それはまた、絶対的スタンダードであり得る。
【００８４】
好ましいハイスループットスクリーニング方法に関して、このアッセイにおける全ての生化学的工程は、例えば、試験管内またはマイクロタイタープレート内の単一溶液中で行われ、そして上記試験化合物は、最初に、単一化合物濃度において分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のため、実験的条件は、スクリーニングされた全化合物の中から、「陽性」化合物として同定される試験化合物の割合を達成するために調整される。
【００８５】
上記方法はまた、１つ以上の試験化合物を、本発明のポリペプチドと一緒にインキュベートする工程、そしてそれらが相互作用するか否かを決定する工程を包含し得る。次いで、上記タンパク質と相互作用する化合物は、上記タンパク質と上皮細胞との間の相互作用をブロックするそれらの能力について試験され得る。
【００８６】
使用され得る他の方法としては、例えば、細菌：宿主レセプター相互作用の阻害は、転写を活性化しないものとして報告されているリバース２ハイブリッドスクリーニング（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）｛１５１｝が挙げられる。
【００８７】
本発明はまた、これらの方法を使用して同定された化合物を提供する。これらは、細菌感染を処置するためか、または細菌感染を防ぐために使用され得る。上記化合物は、好ましくは、少なくとも１０−７Ｍ（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍまたはより高い）の本発明のポリペプチドに対する親和性を有する。
【００８８】
（定義）
用語「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含有する」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、または付加的なもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含み得る。
【００８９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
２つのアミノ酸配列間における配列同一性のパーセンテージへの言及は、アラインメント（ａｌｉｇｎ）された場合に，アミノ酸のパーセンテージは、２つの配列の比較において同一であることを意味する。このアライメント、および相同性のパーセントまたは配列同一性のパーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１５２の節７．７．１８に記載されるソフトウェアプログラム）を使用して決定され得る。好ましいアライメントは、１２のギャップ開始ペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）および２のギャップ伸長ペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いたアフィンギャップ検索（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｓｅａｒｃｈ）を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１５３に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図２】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図３】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図４】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図５】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図６】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図７】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図８】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図９】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１０】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１１】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１２】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１３】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１４】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１５】図１〜図１５は、コイルドコイル領域を示す、本発明のアミノ酸配列の分析を示す。
【図１６】図１６は、本発明のポリペプチドのアンカー領域間における保存を示す。
【図１７】図１７は、単量体形態および三量体形態における髄膜炎菌性外膜内の、ＮａｄＡの例示である。
【図１８】図１８および図１９は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、遺伝子環境（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の比較を示す。図２０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１対Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における遺伝子環境を例示する。
【図１９】図１８および図１９は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、遺伝子環境の比較を示す。図２０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１対Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における遺伝子環境を例示する。
【図２０】図１８および図１９は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、遺伝子環境の比較を示す。図２０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１対Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における遺伝子環境を例示する。
【図２１】図２１は、（図２１Ａ）ＮａｄＡおよび（図２１Ｂ）ＨａｄＡについてのコイル分析を示す。
【図２２】図２２は、ｈａｄＡ陽性株（Ｆ３０３１）および種々のｈａｄＡ陰性株（ｄ型、ｂ型、およびいくつかの類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）におけるｈａｄＡ遺伝子座の模式的な構成である。
【図２３】図２３は、異なる株のＨａｄＡの間の関係を示す系統樹である。
【図２４】図２４は、Ｅ．ｃｏｌｉでのＨａｄＡの発現に関する３つの構造を例示する。
【図２５】図２５は、発現されたＨａｄＡ−ＨｉｓのＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す。レーンは、（奇数）全タンパク質および（偶数）可溶性タンパク質の対にされる。レーン１およびレーン２は、２０℃における空プラスミドであり；レーン３およびレーン４は、２０℃における発現であり；レーン５およびレーン６は、３０℃における空プラスミドであり；レーン７およびレーン８は、３０℃における発現であり；レーン９およびレーン１０は、３７℃における空プラスミドであり；レーン１１およびレーン１２は、３７℃における発現であり；Ｍは、前染色されたタンパク質スタンダードである（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを参照のこと）。
【図２６】図２６はウェスタンブロットである。レーンは：（１）前染色されたタンパク質スタンダード（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２を参照のこと）であり；（２）３０℃での空プラスミドにおける全タンパク質であり；（３）３０℃での空プラスミドにおける可溶性タンパク質であり；（４）３０℃において発現された全タンパク質であり；（５）３０℃において発現された可溶性タンパク質であり；（６）ｒＨａｄＡ−Ｈｉｓである。
【図２７】図２７は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＨａｄＡのＣｈａｎｇ細胞に対する結合のＦＡＣＳ分析を示す。ＨａｄＡは、９つの濃度で試験され、そして結合は評価された。４つの代表的なＦＡＣＳ分析スペクトルが示される。
【図２８】図２８は、パネルＡ〜パネルＣにおいて３つの異なる凝集、およびパネルＤにおける空ｐＥＴプラスミドを含む細胞の、位相差顕微鏡写真を示す。
【図２９】図２９は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＨａｄＡによるＣｈａｎｇ細胞の、（Ａ）吸着および（Ｂ）侵襲を示す。左のバーは、空プラスミドによって形質転換されたコントロール細胞であり；右のバーは、ＨａｄＡ発現細菌である。結果は、３つ組で作成された測定の平均の平均±標準誤差である。
【図３０】図３０は、Ｅ．ｃｏｌｉ−ｐＥＴ ＨａｄＡ ｎａとＣｈａｎｇ上皮細胞との免疫蛍光顕微鏡分析を示す。細胞外の細菌は緑色に見え；細胞内の細菌は赤色である。
【図３１】図３１は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された、ＨａｄＡ／ｎａおよびＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）前染色されたタンパク質スタンダード（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２を参照のこと）であり；（２）空プラスミドの一晩未誘導培養物であり；（３）ＨａｄＡ／ｎａの一晩培養物であり；（４）ＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａの一晩培養物であり；（５）〜（７）ＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘導後３時間における（２）〜（４）である。矢印は、モノマーおよびオリゴマーを示す。
【図３２】図３２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された、ＨａｄＡ／ｎａおよびＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａのウェスタンブロットを示す。レーンは、図３１と同じである。矢印は、モノマーおよびオリゴマーを示す。
【図３３】図３３は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で誘導せずに一晩発現されたＨａｄＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）前染色されたタンパク質スタンダード（ＢｌｕｅＴＭＰｌｕｓ２を参照のこと）であり；（２）空プラスミドであり；（３）ＨａｄＡ／ｎａ形質転換であり；（４）空プラスミドの外膜抽出物であり；（５）ＨａｄＡ／ｎａ形質転換の外膜抽出物である。
【図３４】図３４は、空ｐＥＴプラスミドによってか、またはＨａｄＡ／ｎａ ｐＥＴプラスミドによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを示す、ＨａｄＡ発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３５】図３５は、ＨａｄＡ発現を伴うか、またはＨａｄＡ発現を伴わない、Ｅ．ｃｏｌｉにおける沈降アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
（発明を実施するための様式）
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＮａｄＡタンパク質）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂゲノム｛７５｝内において、外膜タンパク質（ＮａｄＡ）が同定された｛１｝。これは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ付着因子ＹａｄＡに対して、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ表面タンパク質ＵｓｐＡ２｛１５４｝に対して弱い相同性を示す。ｎａｄＡ遺伝子は、高病原性Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株のサブグループ中に存在し、そしてそれは、低ＧＣ含有量によって特徴付けられ、このことは水平移行による遺伝子の起こりうる獲得現象を示唆する。
【００９２】
上記ＮａｄＡ付着因子に類似するタンパク質が、他の病原体によって獲得され得たという可能性を研究するために、本発明者らは、相同的なタンパク質を調査した。
【００９３】
ＮａｄＡおよびＹａｄＡの配列アライメントは、その２つのタンパク質がＣ末端において、最も類似しており、それが膜アンカードメインであることを明らかにした。ＮａｄＡにおいて、このドメインは約７０残基長であり、そしてそれは５つの予測された両親媒性のβ鎖を含み、そのドメインは、上記外膜を複数回横断し、従って上記タンパク質を上記細菌の表面に固定する（図１７）。この領域内において、ＮａｄＡとＹａｄＡとの間の配列類似性のレベルは、６０％前後の同一性である一方で、Ｎ末端ドメインおよび中央ドメインにおける相同性は、２５％以下の同一性である。
【００９４】
最初の調査（ＮａｄＡアンカードメインに基づいた）において、結果は、ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２だけでなく、他のタンパク質（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉの血清抵抗性タンパク質ＤｓｒＡ、Ｅ．ｃｏｌｉの免疫グロブリン結合タンパク質ＥｉｂＡ、ＥｉｂＣ、ＥｉｂＤ、ＥｉｂＥおよびＥｉｂＦ、ならびにＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの外膜タンパク質１００｛１５４｝）をも含む。この科の、より離れたメンバーを明らかにするために、これら結果はさらなる調査に使用され、そしてこのアプローチは１６個のさらなる結果を同定した。これら１６個のポチペプチドは、２次構造分析、コイルドコイル予測、およびリーダーペプチドの存在／非存在についてさらに評価された。予想通り、中央領域内で僅かなアミノ酸類似性を示したにもかかわらず、上記同定されたポリペプチドのほとんどは、そのポリペプチドに安定なオリゴマーを形成する能力を与える、コイルドコイル特徴を有する。上記同定されたポリペプチドのアンカー領域は、良く保存されている（図１６）。さらに、これらのポリペプチドをコードする遺伝子のＧＣ含有量は、それらの代表的なゲノムにおける平均より低く、それらが移動性の遺伝的要素を維持する遺伝子によってコードされることを示唆している。
【００９５】
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ポリペプチドは、腸管病原性（ＥＰＥＣ）株、腸管凝集性（ＥＡＥＣ）株、腸管出血性（ＥＨＥＣ）株および尿路疾患性（ＵＰＥＣ）株を含むＥ．ｃｏｌｉの病原性株において見出された。さらに、ＥＨＥＣ株およびＥＰＥＣ株のポリペプチドとほとんど一致するポリペプチドは、新生児髄膜炎を引き起こす、カプセル化されたＥ．ｃｏｌｉ株であるＫ１株において見出された。Ｋ１配列はＮａｄＡと、以下の通りにアラインメントする。
【００９６】
【表２】
別のＮａｄＡアナログを、Ｅ．ｃｏｌｉの志賀毒素産生性株（ＳＴＥＣ）｛１５５｝に存在する強毒性プラスミドによりコードした。このタンパク質（Ｓａａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜上に発現され、そして高分子量オリゴマーを形成する。対照的に、ＮａｄＡに対応するものは、良性のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株においては検出することができず、これはこれらの遺伝子が、その種の進化の初期の間に側方交換（ｌａｔｅｒａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ）により獲得されているという見解を支持する（図２０）。研究室株ＭＧ１６５５においてもまた、対応するものは見出すことはできなかった。
【００９７】
これらの知見に後押しされ、そしてこれらの遺伝子の挿入／欠失の可能なメカニズムを評価するために、上記ＮａｄＡ様分子をコードする遺伝子が存在する（ｈａｒｂｏｕｒ）する領域の配列を研究した。ＥＨＥＣ株についてのこの領域の配列が、配列番号２３である。
【００９８】
この分析は、上記ＮａｄＡ様タンパク質の配列保存性は、Ｋ１とＥＨＥＣとの間の同一性９５％からＫ１とＥＰＥＣとの間の同一性９８％までの範囲であり、上記ＤＮＡセグメントの遺伝子組織が、Ｋ１、ＥＨＥＣおよびＥＰＥＣのゲノム間でほとんど同一であることを示した。ＥＡＥＣの場合は、その隣接領域は保存されているが、たとえそのＮ末端およびＣ末端はよく保存されているとしてもＮａｄＡ様タンパク質の配列は他よりも３８０残基長い。
【００９９】
【表３】
上記の分析をＫ１２のゲノムにまで広げると、上記挿入部位は、対向するストランド上にコードされる２つの仮想オープンリーディングフレーム（ＹｂｂＪおよびＹｂｂＩ）間に存在し、そして小さな「島」が、３つの遺伝子（機能未知の仮想内在性膜タンパク質をコードするＯＲＦ、推定ＮａｄＡ様付着因子の遺伝子、および機能未知のリポタンパク質と予想されるＯＲＦ）からなることが分かった。後半の２つのＯＲＦは、おそらく共転写されるが、最初のＯＲＦは、逆向きにコードされている。推定の挿入部位を表し得る一対の７ｂｐ（ＣＴＧＡＣＧＣ）のダイレクトリピートは、上記の挿入されたフラグメント（配列番号２３；ヌクレオチド１８１１および４２５５から開始する）の境界にマッピングされ得、そしてこのリピートは、上記Ｋ１２株における挿入点の近傍には存在しない。
【０１００】
獲得されたＤＮＡ領域の長さは、ＥＰＥＣについては２３４８塩基、Ｋ１およびＥＨＥＣについては２４５０塩基、そしてＥＡＥＣについては２６３０塩基である（図１８）。全ての場合において、そのフラグメントのＧ＋Ｃ含量は、各ゲノムについて計算された平均組成と比較した場合より少なく、これはこのセグメントが側鎖交換のメカニズムで病原性Ｅ．ｃｏｌｉにより獲得されているという初期の仮定を確認する。
【０１０１】
尿路疾患性のＥ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）の場合、種々のＤＮＡセグメントが、上記ｙｂｂＪ遺伝子とｙｂｂＩ遺伝子との間で見出された。このセグメントは、１３４２ｂｐの長さであり、推定の細胞質タンパク質をコードする。このタンパク質は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｐｈｙｍｕｒｉｕｍ ＬＴ１２においてのみ保存され、他の分析された全てのＥ．ｃｏｌｉ株において存在しなかった。記載された他の挿入フラグメントと異なり、いずれのダイレクトリピートも、この島（そのＧＣ組成もまた、上記平均値に非常に類似）の境界にマッピングされ得なかった。これらのデータは、上記ＮａｄＡ様コード遺伝子が、ｃ０６０８遺伝子の場所に、後に挿入されたことを示し得る。それにもかかわらず、その後の研究は、ＮａｄＡのホモログをコードする遺伝子が、尿路疾患性のＥ．ｃｏｌｉのＣＦＴ０７３株のゲノムの異なる場所に見られ得ることを明らかにした。このタンパク質は、ＮａｄＡにより遠く関連し、第二のＮａｄＡ様タンパク質のファミリーのメンバーとして見られる。このタンパク質に対応するものは、Ｅ．ｃｏｌｉの他の病原性株の、類似した場所に含まれ、かつ第一のＥ．ｃｏｌｉのＮａｄＡ様分子群と同様に、その対応する遺伝子もまた、小さな島上にコードされ、上記Ｋ１２株には存在しない（図１９）。さらに、これらの遺伝子は、フレームシフトしたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ配列と、３’末端に強い類似性を有する。ＮＬＭ隣接領域の配列を、著しい類似性を示す２種（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ）において比較した。配列の保存は、上記付着因子コード領域のアミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に限定されるが、これらの隣接領域は、ヌクレオチドレベルでシンテニーかつ８０％を越える同一性を共有する。そのＮａｄＡ様遺伝子の上流で、この島が、ＥＰＥＣかＥＨＥＣのいずれかにおいて、そしてＳｈｉｇｅｌｌａにおいて、フレームシフトされるリポタンパク質をコードするＯＲＦを含有する。さらに、Ｓｈｉｇｅｌｌａのゲノムにおいて、トランスポザーゼエレメントをコードする２つのさらなる遺伝子（ｉｎｓＡおよびｉｎｓＢ）が、そのＮＬＭ遺伝子の近傍に見出される。
【０１０２】
【表４】
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）
不完全なＮａｄＡホモログを、ブラジル出血熱（ＢＰＦ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離体｛１５６｝において発見した。このポリペプチドは、ＨａｄＡと名付けられている。ＮａｄＡおよびＨａｄＡのアライメントは、以下：
【０１０３】
【表５】
のとおりである。
【０１０４】
ＨａｄＡに対応するものは、類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６０２８株（これは、小児における中耳炎の原因である）、または非病原性Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ ＫＷ２０株のいずれにおいても、検出され得ない。Ｃ末端アンカー領域におけるＨａｄＡとＮａｄＡとの間の非常に高レベルの配列同一性は、共通の起源を示し得る。
【０１０５】
そのｈａｄＡ遺伝子の起源を解析するために、ＢＰＦ単離体におけるこのＤＮＡ領域のヌクレオチド配列（配列番号２０）を、小児の中耳炎と関連するＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株（非病原性株Ｒｄ｛１５７｝、および類型できない８６０２８株（ＮＴＨｉ８６０２８））のゲノム配列の同じ領域と比較した。
【０１０６】
この比較の結果は、上記付着因子コード遺伝子が、ブラジル出血熱クローン（Ｆ３０３１株）に対して特異的であることを示すが、一方対応するものは、研究室のＲｄ株または類型できない株のいずれにおいても、マッピングされ得なかった。そのＨａｄＡをコードするフラグメントは、ＮａｄＡについて記載されたもの｛１｝と密接に似ている組織を有し、かつインタクトなオープンリーディングフレーム＋上流領域１８２ｂｐ（これは−１０および−３５のプロモーターエレメントを含む）を含有する。その小さな遺伝的な島は、その５’末端でＲＮＡヘリカーゼ遺伝子に、そしてその３’末端に位置する推定のプロテアーゼをコードする遺伝子に、隣接される。その組み換えられたセグメントのＧＣ組成は、そのゲノムの残りと一貫している。
【０１０７】
対照的に、ＮＴＨｉ ８６０２８株は、それがＲＮＡヘリカーゼのＯＲＦおよびＲＮＡプロテアーゼのＯＲＦを包含する全領域を欠損しているために、全くネガティブな株であると考えられ得るが、Ｒｄゲノムは、この領域に、機能未知の２本の短いＯＲＦをコードする１．１ｋｂのＤＮＡセグメントを含有する。この領域は、異常なＧＣ含量（３２％）により特徴付けられ、従って、この部位において独立した組み換え事象が起こったことを示唆している。
【０１０８】
さらなるＮａｄＡ様分子を、他のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、すなわち、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉおよびＨ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓとしてもまた公知）において、同定した。
【０１０９】
【表６】
ＮａｄＡおよび上記Ｈ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの配列アライメントは、以下：
【０１１０】
【表７】
のとおりである。
【０１１１】
ＮａｄＡおよび上記Ｈ．ｓｏｍｎｕｓの配列アライメントは、以下：
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
【表９】
のとおりである。
【０１１４】
ＮａｄＡおよび上記Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉの配列アライメントは、以下：
【０１１５】
【表１０】
のとおりである。
ＮＢ：Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉポリペプチドについてのコイルドコイル予想は高くない。
【０１１６】
（他の細菌）
本調査において同定されたさらなるＮａｄＡホモログは、以下：
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】
【表１２】
である。
【０１１９】
（多重配列アライメント）
ＮａｄＡの「ファミリー」のメンバーの、多重配列アライメントは、以下：
【０１２０】
【表１３】
【０１２１】
【表１４】
である。
【０１２２】
（ＨａｄＡの研究）
上記されたように、ＨａｄＡ配列（配列番号１）を、当初は不完全な形態で発見した。完全なＨａｄＡ遺伝子座を、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーＨＯＭ Ｆ（配列番号４０）、リバースプライマーＨＯＭ Ｒ２（配列番号４１）およびＨＯＭ Ｒ２よりさらに下流の代替リバースプライマーＨＯＭ Ｒ３（配列番号４２）を使用して増幅した。７個のプライマー（フォワード：配列番号４３〜４６；リバース：配列番号４７〜４９）を、完全な遺伝子座の配列決定のために使用した。
【０１２３】
Ｆ３０３１株における完全な遺伝子座は、配列番号５０として与えられる。この配列のヌクレオチド８７４〜１３３９は、新規であり、そして配列番号２０の下流である。ＨａｄＡのアミノ酸配列は、配列番号５１である。配列番号２０のＣ末端の下流は、単独で、配列番号５２として与えられる。
【０１２４】
ＮａｄＡおよびＨａｄＡのアライメント（２４３ａａオーバーラップにおいて、３９．５％の同一性）は、以下：
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
【表１６】
に与えられる。
【０１２７】
全体の同一性は３９．５％であるが、Ｃ末端部分における同一性は、ずっと高い（８６％まで）。この２つのタンパク質の中央ドメインはあまり保存されていないが、両方のタンパク質は、強いコイルドコイル構造をとると推測される（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
【０１２８】
ｈａｄＡポジティブ株（Ｆ３０３１）および多種多様なｈａｄＡネガティブ株（ｄ型、ｂ型、および複数の類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）におけるｈａｄＡ遺伝子座の概略的な構成を、図２２に示す。隣接する遺伝子（ＲＮＡヘリカーゼであるＨＩ０４２２および推定のプロテアーゼであるＨＩ０４１９（どちらもｈａｄＡに対して逆向き））は、常に保存されている。
【０１２９】
ｈａｄＡのすぐ下流は、ＫＷ２０株においてフレームシフトされ、かつ試験された全ての他のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株には存在しない仮想タンパク質（配列番号５３および５４）をコードする遺伝子である。このタンパク質に対する最も近いデータベースのマッチは、ＺＰ＿００１３２２１８．１（配列番号５５）であり：
【０１３０】
【表１７】
これは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ ２３３６由来の関連するアセチルトランスフェラーゼである。
【０１３１】
ＨａｄＡネガティブ株におけるその遺伝子座のアライメントは、以下：
【０１３２】
【表１８】
【０１３３】
【表１９】
に与えられる。
【０１３４】
ＥＡＧＡＮ配列およびＨＫ７０７配列は、ｂ型Ｈｉ株由来であり；他の４つは、ＮＴＨｉ株由来である。上流遺伝子（ＨＩ０４２２）の終止コドンＴＡＡに、下線が引いてあり、下流遺伝子（ＨＩ０４１９）の終止コドンＴＡＧの逆向きの相補体も同様である。そのＨａｄＡ遺伝子は、これら２つの遺伝子の間に見られ、その重要な遺伝子間配列は、配列番号６２である。
【０１３５】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株およびＦ１９４７株は、ＨａｄＡ遺伝子を欠失しているが、ＨＩ０４１９とＨＩ０４２２との間の配列は、より長く、かつＨａｄＡの上流およびＨａｄＡの最初の５個のコドンを含む領域と相同性を有する配列を含む。Ｈｉ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ生物群の配列は、以下：
【０１３６】
【表２０】
のとおりである。
【０１３７】
下線が引かれた７７マー（配列番号６３）：
【０１３８】
【表２１】
はまた、Ｒｄ株およびＦ１９４７株においても、ＨＩ０４２２の下流に見られる。
【０１３９】
この共有される配列は、株がＨａｄＡネガティブであっても、サザンブロットにおいて交差反応のある程度のレベルを生じ得る。
【０１４０】
種々のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株のパネルにおけるサザンブロット実験は、多様な株におけるＨａｄＡの存在を明らかにした（図２３）。全ての他の類型可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株または類型できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株は、この解析によると、ｈａｄＡ遺伝子を欠失していた。
【０１４１】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨａｄＡ発現）
ＨａｄＡの構造および機能を研究するために、図２４に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための種々の構築物：（１）全長のタンパク質を発現するための構築物（ネイティブＨａｄＡ、すなわち「ＨａｄＡ／ｎａ」）；（２）ＮａｄＡリーダーペプチドの制御下にあるＨａｄＡタンパク質を発現するための構築物（「ＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａ」）；（３）Ｃ末端ヒスチジン融合タンパク質を発現するための構築物（「ＨａｄＡ−ｈｉｓ」）、を調製した。全ての構築物を、ｐＥＴ２１ｂ発現ベクターにおいて作製し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、発現宿主として使用した。
【０１４２】
ＨａｄＡ−ｈｉｓを、種々の温度で発現させた。全体のかつ可溶性のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、１２％ＭＯＰＳ；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）により解析した。このゲルを、図２５に示す。３０℃で発現されたこの可溶性タンパク質（レーン９）を精製し、マウスを免疫化するために使用した。
【０１４３】
ＨａｄＡ−Ｈｉｓの精製は、ＩＭＡＣプロセスにより行われ得るが、これは全てのＥ．ｃｏｌｉ夾雑物を除去するのにあまり効果的ではなかった。従って、ＩＭＡＣに引き続いて、ｐＨ７．７緩衝液中で、陰イオン交換クロマトグラフィーで透析した。意外にも、このタンパク質は、完全に沈殿した。続いて、そのタンパク質を、４つの異なるｐＨ条件（６．３、６．５、７．７および８．５）の緩衝液中で透析し、そしてｐＨ７．７でのみ沈殿を観察した。理論的ｐＩが４．３８なので、その沈殿は、等電点沈殿ではないはずである。
【０１４４】
上記マウスの血清を、Ｅ．ｃｏｌｉ株の種々の画分および精製された組み換えＨａｄＡのウェスタンブロット（１２％ Ｍｏｐｓ）を可視化するために使用した。一次抗体は、抗ＨａｄＡ（１：１０００）であり；二次抗体は、抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）１：１００００であった。この結果は、図２６である。
【０１４５】
ＨａｄＡ／ｎａおよびＨａｄＡ／ＬＮａｄＡ／ｎａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを、図３１に示す。一晩中および誘導培養の両方において、ＨａｄＡタンパク質は、ＳＤＳゲル中で熱安定なモノマーおよびオリゴマー（例えば、トリマー）として、発現された。ウェスタンブロットは、図３２に示され、上記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌中におけるＨａｄＡモノマーおよびＨａｄＡオリゴマーの存在を確認した。
【０１４６】
発現をまた、細菌の外膜タンパク質を試験することにより研究した。図３３は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯＭＶ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル１０％ ＭＯＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＨａｄＡオリゴマーがその外膜で見られることを示す。その細胞表面部分を、図３４に示されるように、ＦＡＣＳにより確認した。
【０１４７】
（付着）
精製したＨａｄＡを、Ｃｈａｎｇ上皮細胞に結合する能力について試験した。その実験は、ＦＡＣＳ解析により、ＨａｄＡ−ｈｉｓがその細胞に用量依存的な様式で結合することを示した（図２７）。
【０１４８】
ＨａｄＡ／ｎａを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、凝集について試験した。図２８は、室温で４時間放置されていた後期対数期の培養物から収集された細胞凝集物の位相差顕微鏡を示す。３つの異なるサンプルを、図２８Ａ〜図２８Ｃに示す。細菌は、目に見える「雲状物」を形成し、そして細菌の凝集は、マイクロコロニー形成と相関し得る。対照的に、ｐＥＴプラスミドのみで形質転換された細胞は、凝集性を全く示さない。
【０１４９】
凝集をまた、チューブ沈降アッセイを用いて研究した。空のｐＥＴまたはＨａｄＡ／ｎａを含有するｐＥＴのいずれかで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの培養物を、後期対数期までインキュベートし、次いで室温で４時間沈降させた。そのＨａｄＡ発現細菌は、濁度を失ったが、コントロールの細胞は、失わなかった（図３５）。これは、ＨａｄＡが細菌の凝集を促進することを示している。
【０１５０】
付着実験および侵襲実験もまた、ＨａｄＡ／ｎａを発現するＥ．ｃｏｌｉおよびＣｈａｎｇ細胞の単層を使用して行った。付着（侵襲）を、細胞単層上の付着した（侵襲された）細菌の数を数えることにより計算した（ＭＯＩ＝１：１０００）。結果を、３連の実験で作成された測定の平均±平均値の標準誤差とし、図２９に示す。付着および侵襲を示す細胞数は、以下：
【０１５１】
【表２２】
のとおりであった。
【０１５２】
付着および侵襲を、免疫蛍光顕微鏡分析により確認した（図３０）。細胞外の細菌（緑色）および細胞内の細菌（赤色）が、見られ得る。
【０１５３】
ＨａｄＡのさらなる研究としては、付着／侵襲アッセイにおける試験のためのＢＰＦ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株の同系ＨａｄＡノックアウトの構築；ＮａｄＡノックインにより付着が相補され得るかどうか確かめるための、このようなノックアウト変異体の試験；ＨａｄＡおよびＮａｄＡが同じレセプターに結合するかどうか確かめるための、ヒト細胞への付着／侵襲におけるＨａｄＡおよびＮａｄＡを用いた競合実験、が挙げられる。
【０１５４】
本発明は一例としてのみ説明され、本発明の範囲および精神の中になお存在しながら改変がなされ得ることが、理解される。
【０１５５】
【表２３−１】
【０１５６】
【表２３−２】
【０１５７】
【表２３−３】
【０１５８】
【表２３−４】
【０１５９】
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【数１５】
【数１６】
【数１７】
【数１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公開番号】特開２０１１−６２２０３（Ｐ２０１１−６２２０３Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２９１４９（Ｐ２０１０−２２９１４９）
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【分割の表示】特願２００６−５１６５９８（Ｐ２００６−５１６５９８）の分割
【原出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【分割の表示】特願２００６−５１６５９８（Ｐ２００６−５１６５９８）の分割
【原出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
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