ピロリン酸の定量方法
【課題】被検液中に存在するＡＴＰ等の影響を受けず、ピロリン酸のみを検出・定量する方法を提供すること
【解決手段】妨害物質であるＡＴＰ等を含む試料に、キナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに非発色性電子受容体の存在下、電子伝達体を作用させて消去し、ついでピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、同様にして生成するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定するピロリン酸の第一の測定方法、及び第一の方法と同様にして生成するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから、電子伝達体を経由して、生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を消去し、ついでピロリン酸からＡＴＰを生成させ、同様に過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する第二の測定方法。
【解決手段】妨害物質であるＡＴＰ等を含む試料に、キナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに非発色性電子受容体の存在下、電子伝達体を作用させて消去し、ついでピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、同様にして生成するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定するピロリン酸の第一の測定方法、及び第一の方法と同様にして生成するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから、電子伝達体を経由して、生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を消去し、ついでピロリン酸からＡＴＰを生成させ、同様に過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する第二の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体成分として存在するピロリン酸の測定方法及び各種核酸増幅法による核酸の検知・定量方法の分野において、核酸を増幅したときに生成するピロリン酸を定量することにより核酸を検知・定量する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節液中のピロリン酸はピロリン酸カルシウム（ＣＰＰＤ）結晶沈着性関節炎の指標として有用である。この関節炎はＣＰＰＤ結晶により惹起され、軟骨の石灰化を伴う結晶性滑膜炎である。現在の検査法は偏光顕微鏡を用いたＣＰＰＤ結晶の確認により、確定診断とされる。この方法は操作が煩雑で、連続分析への適用が困難であり、新規測定法が望まれている。
また、ピロリン酸の測定は、各種核酸増幅法による核酸の検知・定量に有用である。すなわち、Polymerase chain reaction（ＰＣＲ法）、Nucleic Acid Sequence Based Amplification（ＮＡＳＢＡ法）、loop-mediated isothermal amplification法（ＬＡＭＰ法）、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids法（ＩＣＡＮ法）、Transcription Mediated Amplification（ＴＭＡ法）、Transcription Reverse transcription Concerted amplification（ＴＲＣ法）等の核酸増幅法では核酸合成の副産物としてピロリン酸が放出される。従って、ピロリン酸の生成量を測定すれば、核酸の増幅を検出することができる。
【０００３】
従来、核酸を測定する場合、ラジオアイソトープ、ビオチン、酵素等で標識された核酸を用いて測定対象となる核酸と結合させ、結合物と未結合物とを分離した後、その標識体から信号を検出する方法が一般的である。例えば、増幅産物をポリアクリルアミド電気泳動したのち、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して検出する方法や、放射性同位元素により標識された標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを用い、これと標的核酸とをハイブリダイゼーションさせ、反応産物中の放射活性を検出する方法等がある。また非放射性標識プローブを用いた方法として、５’末端にビオチンを標識し、測定対象となる核酸とハイブリダイゼーションさせた後、予め酵素標識されたアビジンと結合させて酵素活性を測定する方法がある。しかしながら、これらの手法では未反応の標識体と反応産物とを分離する操作が煩雑であり、多検体の処理には不向きであるし、放射性同位元素を用いる手法では特別な施設を必要とし、放射線にさらされる危険性から汎用性には乏しい。
一方、核酸を測定するためのピロリン酸の測定方法としては、ピロリン酸に無機ピロフォスファターゼを作用させ、生成したリン酸を検出する方法がある（特許文献１）。しかしながら、この手法では増幅産物や試薬成分中に混在するリン酸がバックグラウンドとして検出される。
【０００４】
また、ピロリン酸にＡＴＰスルフリラーゼを作用させた後、ルシフェラーゼを利用して、生成するＡＴＰを発光系に導き検出する方法がある（特許文献２、非特許文献１）。しかしながら、この手法ではＤＮＡポリメラーゼの基質として予め増幅産物に共存するデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）がバックグラウンドとして検出される。また、ＲＮＡを増幅するＮＡＳＢＡ法等の場合、ＲＮＡポリメラーゼの基質として予め増幅産物に共存するＡＴＰがバックグラウンドとして検出される。
【特許文献１】特開平７−５９６００号
【特許文献２】WO ９２／１６６５４
【非特許文献１】J. Immunol. Methods 156, 55 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、被検液中に存在するアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）及びそれらの類似体の影響を受けず、ピロリン酸のみを検出・定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ピロリン酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ）に変換して定量する方法において、ＡＴＰやｄＡＴＰの影響を回避して、ピロリン酸のみ測定する方法を新たに見出した。
本発明は二つの方法に大別される。
【０００７】
第一の方法は次の二つの工程よりなる。
妨害物質であるＡＴＰ、ｄＡＴＰ及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに非発色性電子受容体の存在下、電子伝達体を作用させ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに変換する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定する第二工程。
【０００８】
第二の方法は次の二つの工程よりなる。
妨害物質であるＡＴＰ、ｄＡＴＰ及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を消去する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する第二工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、ピロリン酸を定量する方法において、被検液中に存在するＡＴＰ及びｄＡＴＰの影響を全く受けず、ピロリン酸のみを測定でき、測定値の正確さ及び信頼性を一層高めることができるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の二つの方法を詳細に説明する。
尚、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは公知の方法用いてホルマザン色素や過酸化水素に変換し、測定することができる（特開昭５８−１６５０５４号、特開昭５９−２１０８９９号、特開昭６０−８３５９８号）
本発明における第一の方法は二つの工程から成る。第一の工程はＡＴＰ及びｄＡＴＰの消去系となる反応で、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ及びそれらの類似体はキナーゼ、例えばヘキソキナーゼ（ＨＫ）の作用により、グルコ−スからグルコ−ス６リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成する。生成したＧ６Ｐは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素として要求する脱水素酵素、例えばグルコ−ス６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）の作用によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、酸化触媒である電子伝達体、例えば１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）の存在下、非発色性電子受容体、例えば酸素により酸化され、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに戻る。該反応は以下の反応式で示される。
【００１１】
【化１】
（式中、PPiはピロリン酸、ADPはアデノシン２リン酸、6-PGは６−ホスホグルコノラクトン、1-mPMSH2は1-mPMSの還元型を意味する）
【００１２】
第二の工程はピロリン酸をホルマザン色素に変換して測定する系で、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、例えばＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰを生成させる。生成したＡＴＰは前述の第一の工程と同一の方法によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換される。生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、電子伝達体、例えば１−ｍＰＭＳの存在下、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに酸化される。一方、発色性電子受容体であるテトラゾリウム塩はホルマザン色素に還元され、分光学的に定量することができる。なお発色性電子受容体であるテトラゾリウム塩の反応は非発色性電子受容体である酸素の反応よりも優先するため、ピロリン酸は定量的にホルマザン色素に変換される。また第一工程のＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ及び１−ｍＰＭＳ等は、第二工程で改めて添加する必要はない。該反応は以下の反応式で示される。
【００１３】
【化２】
【００１４】
第一工程で使用される非発色性電子受容体は、通常溶存酸素が好適であるが、溶液中濃度が有限であるため、消去できるＡＴＰ及びｄＡＴＰの量が制限される。そのためフェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン、フェロセン等の有機化合物を組み合わせれば、より多くのＡＴＰ及びｄＡＴＰを消去することができる。
また、溶存酸素から生成した過酸化水素にカタラーゼ（EC 1.11.1.6）を作用させた場合、過酸化水素から酸素に戻るため、より多くのＡＴＰ及びｄＡＴＰを消去することができるので、カタラーゼを添加してもよい。
【００１５】
本発明の第一の方法に使用されるテトラゾリウム塩は特に制限されるものではなく、例えば２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩［ＩＮＴ］、３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩［ＭＴＴ］、２，２′，５，５′−テトラキス（４−ニトロフェニル）−３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ジフェニレン）−２Ｈ，２′Ｈ−ジテトラゾリウム塩［ＮＴＢ］、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩［ＷＳＴ−１］、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩［ＷＳＴ−８］等を挙げることができる。
本発明の第一の方法に使用される各酵素、テトラゾリウム塩及び電子伝達体の添加量は、特に制限されるものではなく、例えば、各酵素の量は０．１〜１００ｕ／ｍＬ、テトラゾリウム塩の量は０．０１〜１０ｍＭ、電子伝達体として、例えば１−ｍＰＭＳを用いた場合の量は０．００１〜１ｍＭの範囲が好適である。
【００１６】
本発明における第二の方法は二つの工程から成る。第一の工程はＡＴＰ、ｄＡＴＰ及びそれらの類似体の消去系となる反応で、ＡＴＰ及びｄＡＴＰはキナーゼ、例えばＨＫの作用により、グルコ−スからＧ６Ｐを生成する。生成したＧ６Ｐは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素として要求する脱水素酵素、例えばＧ６ＰＤＨの作用によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは電子伝達体を経由して、電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素はカタラーゼを用いて消去することができる。該反応は以下の反応式で示される。
【００１７】
【化３】
【００１８】
第二の工程はピロリン酸を過酸化水素に変換して測定する系で、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、例えばＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰを生成させる。生成したＡＴＰは前述の第一の工程と同一の方法により過酸化水素に変換される。生成した過酸化水素はカタラーゼ阻害剤であるアジ化ナトリウム等を添加すれば、第一工程で添加したカタラーゼの反応を止めることができ、ピロリン酸を定量的に過酸化水素に変換できる。生成した過酸化水素は例えば、ペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）と水素供与体と発色カプラーとを作用させ、生成した発色物を分光学的に定量することができる。なお第一工程のＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ及び１−ｍＰＭＳ等は、第二工程で改めて添加する必要はない。該反応は以下の反応式で示される。
【００１９】
【化４】
【００２０】
水素供与体としては、特に制限されるものではなく、例えば、フェノール又はトリンダー試薬を挙げることができる。トリンダー試薬には、Ｎ−スルホプロピルアニリン誘導体若しくはＮ−ヒドロキシスルホプロピルアニリン誘導体、又はそれらのナトリウム塩が含まれ、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドキロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドキロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、又はＮ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）等を挙げることができる。
【００２１】
発色カプラーとしては、特に制限されるものではなく、例えば、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）等を挙げることができる。
本発明において前述二つの方法に使用されるピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素は特に制限されるものではなく、上述のＡＴＰスルフリラーゼ（EC 2.7.7.4）以外にピルビン酸オルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）（EC 2.7.9.1）及びフェニルアラニンラセマーゼ（EC 5.1.1.11）等を挙げることができる。該反応は以下の反応式で示される。
【００２２】
【化５】
（式中、ＰＥＰはホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰはアデノシン１リン酸を意味する）
【００２３】
【化６】
【００２４】
該反応に使用されるアデニリル硫酸の添加量は、特に制限されるものではないが、０．０１〜１０ｍＭの範囲が好適である。該反応に使用されるＡＴＰを生成させる酵素にＰＰＤＫを用いる場合に使用されるＰＥＰの添加量、または、該反応に使用されるＡＴＰを生成させる酵素にフェニルアラニンラセマーゼを用いる場合に使用されるＤ−フェニルアラニンの添加量は、特に制限されるものではないが、ＰＥＰの量は０．１〜１００ｍＭ、Ｄ−フェニルアラニンの量は０．１〜１００ｍＭの範囲が好適である。
本発明において前述二つの方法に使用されるキナーゼと脱水素酵素は、キナーゼから生成する誘導物質が脱水素酵素の基質となる組み合わせであれば、特に制限されるものではなく、上述のＨＫ（EC 2.7.1.1）とＧ６ＰＤＨ（EC 1.1.1.49）の組み合わせ以外にグリセロールキナーゼ（EC 2.7.1.30）とグリセロール３リン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.8、EC 1.1.1.94）の組み合わせ等を挙げることができる。該反応は以下の反応式で示される。
【００２５】
【化７】
【００２６】
【化８】
（式中、Ｇ３ＰＤＨはグリセロール３リン酸脱水素酵素を意味する）
【００２７】
本発明において前述二つの方法に使用されるＨＫは、同一の反応を触媒するグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)も使用することができる。
本発明において前述二つの方法に使用される脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを必要とする酵素であれば特に制限されるものではなく、その起源も限定されない。
本発明において前述二つの方法に使用される電子伝達体は、特に制限されるものではなく、非タンパク性の電子転移剤として、例えばフェナジンメト硫酸塩（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）、フェナジンエト硫酸塩（ＰＥＳ）、又はメルドラブルー等を挙げることができる。またタンパク性の電子伝達体としてジアフォラーゼ等の酵素を挙げることができる。ジアフォラーゼとして、例えばBacillus megaterium、Bacillus stearothermophilus、Clostridium kluyveri等の微生物由来のものを挙げることができる。
本発明の測定方法が適用される試料は、特に制限されるものではなく、例えば血液、血清、血漿、髄液、関節液、尿等の生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料等が好適に使用される。
測定条件は、第一工程、第二工程とも測定試料と各試薬を混合し、１０〜４５℃で１〜６０分間反応させた後、吸光度を測定する。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
〔ピロリン酸ならびにＡＴＰの測定〕
ピロリン酸をホルマザン色素に変換して測定する系として、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、１−ｍＰＭＳを含有する試薬１及びＡＴＰスルフリラーゼ、ＷＳＴ−８を含有する試薬２を以下に示すとおり調製した。
試薬１ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
グルコース １０ｍＭ
塩化マグネシウム ５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２ｍＭ
ＨＫ １ｕ／ｍＬ
Ｇ６ＰＤＨ ５ｕ／ｍＬ
１−ｍＰＭＳ ０．０５ｍＭ
試薬２ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
アデニリル硫酸 ０．５ｍＭ
ＡＴＰスルフリラーゼ １ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−８ ０．５ｍＭ
注）ＨＥＰＥＳ：ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸
ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
ＨＫ：ヘキソキナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ：グルコ−ス６リン酸脱水素酵素
１−ｍＰＭＳ：１−メトキシフェナジンメト硫酸塩
ＷＳＴ−８：２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩
【００２９】
下記の手順でピロリン酸ならびにＡＴＰをＨ７１７０型自動分析装置（株式会社日立製作所製）にて測定した。すなわち、試料としてピロリン酸ならびにＡＴＰの濃度を各０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭとなるよう調製した水溶液を用い、試料３０μＬに試薬１ １８０μＬを加え、その後これを３７℃にて５分間加温し、次いで、試薬２ １８０μＬを混合し、さらに３７℃にて５分間加温した後、水をブランクとして波長４５０ｎｍにおける吸光度をエンド法に基づき、上記の自動分析装置にて測定した。その結果を図１にまとめて示す。同図より、ＡＴＰとは全く反応せず、ピロリン酸を定量的に測定できることが示された。本発明の方法がＡＴＰの影響を受けず、ピロリン酸を定量できることがわかる。
【００３０】
実施例２
〔ピロリン酸ならびにＡＴＰの測定〕
ピロリン酸を過酸化水素に変換して測定する系として、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、１−ｍＰＭＳ、４−ＡＡＰを含有する試薬１及びＡＴＰスルフリラーゼ、ＴＯＯＳ、ＰＯＤを含有する試薬２を以下に示すとおり調製した。
試薬１ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
グルコース １０ｍＭ
塩化マグネシウム ５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２ｍＭ
ＨＫ １ｕ／ｍＬ
Ｇ６ＰＤＨ ５ｕ／ｍＬ
１−ｍＰＭＳ ０．０１ｍＭ
４−ＡＡＰ ３ｍＭ
カタラーゼ １００ｕ／ｍＬ
試薬２ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
アデニリル硫酸 ０．５ｍＭ
ＡＴＰスルフリラーゼ １ｕ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ３ｍＭ
ＰＯＤ １０ｕ／ｍＬ
注）ＨＥＰＥＳ：ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸
ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
ＨＫ：ヘキソキナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ：グルコ−ス６リン酸脱水素酵素
１−ｍＰＭＳ：１−メトキシフェナジンメト硫酸塩
４−ＡＡＰ：４−アミノアンチピリン
ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドキロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ
【００３１】
下記の手順でピロリン酸ならびにＡＴＰをＨ７１７０型自動分析装置（株式会社日立製作所製）にて測定した。すなわち、試料としてピロリン酸ならびにＡＴＰの濃度を各０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭとなるよう調製した水溶液を用い、試料５μＬに試薬１ １８０μＬを加え、その後これを３７℃にて５分間加温し、次いで、試薬２ １８０μＬを混合し、さらに３７℃にて５分間加温した後、水をブランクとして波長５４６ｎｍにおける吸光度をエンド法に基づき、上記の自動分析装置にて測定した。その結果を図２にまとめて示す。同図より、ＡＴＰとは全く反応せず、ピロリン酸を定量的に測定できることが示された。本発明の方法がＡＴＰの影響を受けず、ピロリン酸を定量できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明における測定方法及び測定試薬は、特に臨床検査の分野における測定値の正確さ及び信頼性の向上に寄与することができるという利益を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１で調製した試薬を用いて、ピロリン酸ならびにＡＴＰを波長４５０ｎｍで測定したときの吸光度値を示したグラフで、白抜きの○印は、試料としてピロリン酸を用いた場合を表し、黒塗りの●印は、試料としてＡＴＰを用いた場合を表す。
【図２】実施例２で調製した試薬を用いて、ピロリン酸ならびにＡＴＰを波長５４６ｎｍで測定したときの吸光度値を示したグラフで、白抜きの○印は、試料としてピロリン酸を用いた場合を表し、黒塗りの●印は、試料としてＡＴＰを用いた場合を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体成分として存在するピロリン酸の測定方法及び各種核酸増幅法による核酸の検知・定量方法の分野において、核酸を増幅したときに生成するピロリン酸を定量することにより核酸を検知・定量する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節液中のピロリン酸はピロリン酸カルシウム（ＣＰＰＤ）結晶沈着性関節炎の指標として有用である。この関節炎はＣＰＰＤ結晶により惹起され、軟骨の石灰化を伴う結晶性滑膜炎である。現在の検査法は偏光顕微鏡を用いたＣＰＰＤ結晶の確認により、確定診断とされる。この方法は操作が煩雑で、連続分析への適用が困難であり、新規測定法が望まれている。
また、ピロリン酸の測定は、各種核酸増幅法による核酸の検知・定量に有用である。すなわち、Polymerase chain reaction（ＰＣＲ法）、Nucleic Acid Sequence Based Amplification（ＮＡＳＢＡ法）、loop-mediated isothermal amplification法（ＬＡＭＰ法）、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids法（ＩＣＡＮ法）、Transcription Mediated Amplification（ＴＭＡ法）、Transcription Reverse transcription Concerted amplification（ＴＲＣ法）等の核酸増幅法では核酸合成の副産物としてピロリン酸が放出される。従って、ピロリン酸の生成量を測定すれば、核酸の増幅を検出することができる。
【０００３】
従来、核酸を測定する場合、ラジオアイソトープ、ビオチン、酵素等で標識された核酸を用いて測定対象となる核酸と結合させ、結合物と未結合物とを分離した後、その標識体から信号を検出する方法が一般的である。例えば、増幅産物をポリアクリルアミド電気泳動したのち、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して検出する方法や、放射性同位元素により標識された標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを用い、これと標的核酸とをハイブリダイゼーションさせ、反応産物中の放射活性を検出する方法等がある。また非放射性標識プローブを用いた方法として、５’末端にビオチンを標識し、測定対象となる核酸とハイブリダイゼーションさせた後、予め酵素標識されたアビジンと結合させて酵素活性を測定する方法がある。しかしながら、これらの手法では未反応の標識体と反応産物とを分離する操作が煩雑であり、多検体の処理には不向きであるし、放射性同位元素を用いる手法では特別な施設を必要とし、放射線にさらされる危険性から汎用性には乏しい。
一方、核酸を測定するためのピロリン酸の測定方法としては、ピロリン酸に無機ピロフォスファターゼを作用させ、生成したリン酸を検出する方法がある（特許文献１）。しかしながら、この手法では増幅産物や試薬成分中に混在するリン酸がバックグラウンドとして検出される。
【０００４】
また、ピロリン酸にＡＴＰスルフリラーゼを作用させた後、ルシフェラーゼを利用して、生成するＡＴＰを発光系に導き検出する方法がある（特許文献２、非特許文献１）。しかしながら、この手法ではＤＮＡポリメラーゼの基質として予め増幅産物に共存するデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）がバックグラウンドとして検出される。また、ＲＮＡを増幅するＮＡＳＢＡ法等の場合、ＲＮＡポリメラーゼの基質として予め増幅産物に共存するＡＴＰがバックグラウンドとして検出される。
【特許文献１】特開平７−５９６００号
【特許文献２】WO ９２／１６６５４
【非特許文献１】J. Immunol. Methods 156, 55 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、被検液中に存在するアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）及びそれらの類似体の影響を受けず、ピロリン酸のみを検出・定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ピロリン酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ）に変換して定量する方法において、ＡＴＰやｄＡＴＰの影響を回避して、ピロリン酸のみ測定する方法を新たに見出した。
本発明は二つの方法に大別される。
【０００７】
第一の方法は次の二つの工程よりなる。
妨害物質であるＡＴＰ、ｄＡＴＰ及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに非発色性電子受容体の存在下、電子伝達体を作用させ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに変換する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定する第二工程。
【０００８】
第二の方法は次の二つの工程よりなる。
妨害物質であるＡＴＰ、ｄＡＴＰ及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を消去する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する第二工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、ピロリン酸を定量する方法において、被検液中に存在するＡＴＰ及びｄＡＴＰの影響を全く受けず、ピロリン酸のみを測定でき、測定値の正確さ及び信頼性を一層高めることができるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の二つの方法を詳細に説明する。
尚、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは公知の方法用いてホルマザン色素や過酸化水素に変換し、測定することができる（特開昭５８−１６５０５４号、特開昭５９−２１０８９９号、特開昭６０−８３５９８号）
本発明における第一の方法は二つの工程から成る。第一の工程はＡＴＰ及びｄＡＴＰの消去系となる反応で、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ及びそれらの類似体はキナーゼ、例えばヘキソキナーゼ（ＨＫ）の作用により、グルコ−スからグルコ−ス６リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成する。生成したＧ６Ｐは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素として要求する脱水素酵素、例えばグルコ−ス６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）の作用によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、酸化触媒である電子伝達体、例えば１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）の存在下、非発色性電子受容体、例えば酸素により酸化され、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに戻る。該反応は以下の反応式で示される。
【００１１】
【化１】
（式中、PPiはピロリン酸、ADPはアデノシン２リン酸、6-PGは６−ホスホグルコノラクトン、1-mPMSH2は1-mPMSの還元型を意味する）
【００１２】
第二の工程はピロリン酸をホルマザン色素に変換して測定する系で、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、例えばＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰを生成させる。生成したＡＴＰは前述の第一の工程と同一の方法によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換される。生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、電子伝達体、例えば１−ｍＰＭＳの存在下、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに酸化される。一方、発色性電子受容体であるテトラゾリウム塩はホルマザン色素に還元され、分光学的に定量することができる。なお発色性電子受容体であるテトラゾリウム塩の反応は非発色性電子受容体である酸素の反応よりも優先するため、ピロリン酸は定量的にホルマザン色素に変換される。また第一工程のＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ及び１−ｍＰＭＳ等は、第二工程で改めて添加する必要はない。該反応は以下の反応式で示される。
【００１３】
【化２】
【００１４】
第一工程で使用される非発色性電子受容体は、通常溶存酸素が好適であるが、溶液中濃度が有限であるため、消去できるＡＴＰ及びｄＡＴＰの量が制限される。そのためフェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン、フェロセン等の有機化合物を組み合わせれば、より多くのＡＴＰ及びｄＡＴＰを消去することができる。
また、溶存酸素から生成した過酸化水素にカタラーゼ（EC 1.11.1.6）を作用させた場合、過酸化水素から酸素に戻るため、より多くのＡＴＰ及びｄＡＴＰを消去することができるので、カタラーゼを添加してもよい。
【００１５】
本発明の第一の方法に使用されるテトラゾリウム塩は特に制限されるものではなく、例えば２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩［ＩＮＴ］、３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩［ＭＴＴ］、２，２′，５，５′−テトラキス（４−ニトロフェニル）−３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ジフェニレン）−２Ｈ，２′Ｈ−ジテトラゾリウム塩［ＮＴＢ］、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩［ＷＳＴ−１］、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩［ＷＳＴ−８］等を挙げることができる。
本発明の第一の方法に使用される各酵素、テトラゾリウム塩及び電子伝達体の添加量は、特に制限されるものではなく、例えば、各酵素の量は０．１〜１００ｕ／ｍＬ、テトラゾリウム塩の量は０．０１〜１０ｍＭ、電子伝達体として、例えば１−ｍＰＭＳを用いた場合の量は０．００１〜１ｍＭの範囲が好適である。
【００１６】
本発明における第二の方法は二つの工程から成る。第一の工程はＡＴＰ、ｄＡＴＰ及びそれらの類似体の消去系となる反応で、ＡＴＰ及びｄＡＴＰはキナーゼ、例えばＨＫの作用により、グルコ−スからＧ６Ｐを生成する。生成したＧ６Ｐは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素として要求する脱水素酵素、例えばＧ６ＰＤＨの作用によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは電子伝達体を経由して、電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素はカタラーゼを用いて消去することができる。該反応は以下の反応式で示される。
【００１７】
【化３】
【００１８】
第二の工程はピロリン酸を過酸化水素に変換して測定する系で、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、例えばＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰを生成させる。生成したＡＴＰは前述の第一の工程と同一の方法により過酸化水素に変換される。生成した過酸化水素はカタラーゼ阻害剤であるアジ化ナトリウム等を添加すれば、第一工程で添加したカタラーゼの反応を止めることができ、ピロリン酸を定量的に過酸化水素に変換できる。生成した過酸化水素は例えば、ペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）と水素供与体と発色カプラーとを作用させ、生成した発色物を分光学的に定量することができる。なお第一工程のＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ及び１−ｍＰＭＳ等は、第二工程で改めて添加する必要はない。該反応は以下の反応式で示される。
【００１９】
【化４】
【００２０】
水素供与体としては、特に制限されるものではなく、例えば、フェノール又はトリンダー試薬を挙げることができる。トリンダー試薬には、Ｎ−スルホプロピルアニリン誘導体若しくはＮ−ヒドロキシスルホプロピルアニリン誘導体、又はそれらのナトリウム塩が含まれ、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドキロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドキロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、又はＮ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）等を挙げることができる。
【００２１】
発色カプラーとしては、特に制限されるものではなく、例えば、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）等を挙げることができる。
本発明において前述二つの方法に使用されるピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素は特に制限されるものではなく、上述のＡＴＰスルフリラーゼ（EC 2.7.7.4）以外にピルビン酸オルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）（EC 2.7.9.1）及びフェニルアラニンラセマーゼ（EC 5.1.1.11）等を挙げることができる。該反応は以下の反応式で示される。
【００２２】
【化５】
（式中、ＰＥＰはホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰはアデノシン１リン酸を意味する）
【００２３】
【化６】
【００２４】
該反応に使用されるアデニリル硫酸の添加量は、特に制限されるものではないが、０．０１〜１０ｍＭの範囲が好適である。該反応に使用されるＡＴＰを生成させる酵素にＰＰＤＫを用いる場合に使用されるＰＥＰの添加量、または、該反応に使用されるＡＴＰを生成させる酵素にフェニルアラニンラセマーゼを用いる場合に使用されるＤ−フェニルアラニンの添加量は、特に制限されるものではないが、ＰＥＰの量は０．１〜１００ｍＭ、Ｄ−フェニルアラニンの量は０．１〜１００ｍＭの範囲が好適である。
本発明において前述二つの方法に使用されるキナーゼと脱水素酵素は、キナーゼから生成する誘導物質が脱水素酵素の基質となる組み合わせであれば、特に制限されるものではなく、上述のＨＫ（EC 2.7.1.1）とＧ６ＰＤＨ（EC 1.1.1.49）の組み合わせ以外にグリセロールキナーゼ（EC 2.7.1.30）とグリセロール３リン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.8、EC 1.1.1.94）の組み合わせ等を挙げることができる。該反応は以下の反応式で示される。
【００２５】
【化７】
【００２６】
【化８】
（式中、Ｇ３ＰＤＨはグリセロール３リン酸脱水素酵素を意味する）
【００２７】
本発明において前述二つの方法に使用されるＨＫは、同一の反応を触媒するグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)も使用することができる。
本発明において前述二つの方法に使用される脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを必要とする酵素であれば特に制限されるものではなく、その起源も限定されない。
本発明において前述二つの方法に使用される電子伝達体は、特に制限されるものではなく、非タンパク性の電子転移剤として、例えばフェナジンメト硫酸塩（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）、フェナジンエト硫酸塩（ＰＥＳ）、又はメルドラブルー等を挙げることができる。またタンパク性の電子伝達体としてジアフォラーゼ等の酵素を挙げることができる。ジアフォラーゼとして、例えばBacillus megaterium、Bacillus stearothermophilus、Clostridium kluyveri等の微生物由来のものを挙げることができる。
本発明の測定方法が適用される試料は、特に制限されるものではなく、例えば血液、血清、血漿、髄液、関節液、尿等の生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料等が好適に使用される。
測定条件は、第一工程、第二工程とも測定試料と各試薬を混合し、１０〜４５℃で１〜６０分間反応させた後、吸光度を測定する。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
〔ピロリン酸ならびにＡＴＰの測定〕
ピロリン酸をホルマザン色素に変換して測定する系として、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、１−ｍＰＭＳを含有する試薬１及びＡＴＰスルフリラーゼ、ＷＳＴ−８を含有する試薬２を以下に示すとおり調製した。
試薬１ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
グルコース １０ｍＭ
塩化マグネシウム ５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２ｍＭ
ＨＫ １ｕ／ｍＬ
Ｇ６ＰＤＨ ５ｕ／ｍＬ
１−ｍＰＭＳ ０．０５ｍＭ
試薬２ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
アデニリル硫酸 ０．５ｍＭ
ＡＴＰスルフリラーゼ １ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−８ ０．５ｍＭ
注）ＨＥＰＥＳ：ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸
ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
ＨＫ：ヘキソキナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ：グルコ−ス６リン酸脱水素酵素
１−ｍＰＭＳ：１−メトキシフェナジンメト硫酸塩
ＷＳＴ−８：２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩
【００２９】
下記の手順でピロリン酸ならびにＡＴＰをＨ７１７０型自動分析装置（株式会社日立製作所製）にて測定した。すなわち、試料としてピロリン酸ならびにＡＴＰの濃度を各０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭとなるよう調製した水溶液を用い、試料３０μＬに試薬１ １８０μＬを加え、その後これを３７℃にて５分間加温し、次いで、試薬２ １８０μＬを混合し、さらに３７℃にて５分間加温した後、水をブランクとして波長４５０ｎｍにおける吸光度をエンド法に基づき、上記の自動分析装置にて測定した。その結果を図１にまとめて示す。同図より、ＡＴＰとは全く反応せず、ピロリン酸を定量的に測定できることが示された。本発明の方法がＡＴＰの影響を受けず、ピロリン酸を定量できることがわかる。
【００３０】
実施例２
〔ピロリン酸ならびにＡＴＰの測定〕
ピロリン酸を過酸化水素に変換して測定する系として、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、１−ｍＰＭＳ、４−ＡＡＰを含有する試薬１及びＡＴＰスルフリラーゼ、ＴＯＯＳ、ＰＯＤを含有する試薬２を以下に示すとおり調製した。
試薬１ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
グルコース １０ｍＭ
塩化マグネシウム ５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２ｍＭ
ＨＫ １ｕ／ｍＬ
Ｇ６ＰＤＨ ５ｕ／ｍＬ
１−ｍＰＭＳ ０．０１ｍＭ
４−ＡＡＰ ３ｍＭ
カタラーゼ １００ｕ／ｍＬ
試薬２ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
アデニリル硫酸 ０．５ｍＭ
ＡＴＰスルフリラーゼ １ｕ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ３ｍＭ
ＰＯＤ １０ｕ／ｍＬ
注）ＨＥＰＥＳ：ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸
ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
ＨＫ：ヘキソキナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ：グルコ−ス６リン酸脱水素酵素
１−ｍＰＭＳ：１−メトキシフェナジンメト硫酸塩
４−ＡＡＰ：４−アミノアンチピリン
ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドキロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ
【００３１】
下記の手順でピロリン酸ならびにＡＴＰをＨ７１７０型自動分析装置（株式会社日立製作所製）にて測定した。すなわち、試料としてピロリン酸ならびにＡＴＰの濃度を各０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭとなるよう調製した水溶液を用い、試料５μＬに試薬１ １８０μＬを加え、その後これを３７℃にて５分間加温し、次いで、試薬２ １８０μＬを混合し、さらに３７℃にて５分間加温した後、水をブランクとして波長５４６ｎｍにおける吸光度をエンド法に基づき、上記の自動分析装置にて測定した。その結果を図２にまとめて示す。同図より、ＡＴＰとは全く反応せず、ピロリン酸を定量的に測定できることが示された。本発明の方法がＡＴＰの影響を受けず、ピロリン酸を定量できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明における測定方法及び測定試薬は、特に臨床検査の分野における測定値の正確さ及び信頼性の向上に寄与することができるという利益を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１で調製した試薬を用いて、ピロリン酸ならびにＡＴＰを波長４５０ｎｍで測定したときの吸光度値を示したグラフで、白抜きの○印は、試料としてピロリン酸を用いた場合を表し、黒塗りの●印は、試料としてＡＴＰを用いた場合を表す。
【図２】実施例２で調製した試薬を用いて、ピロリン酸ならびにＡＴＰを波長５４６ｎｍで測定したときの吸光度値を示したグラフで、白抜きの○印は、試料としてピロリン酸を用いた場合を表し、黒塗りの●印は、試料としてＡＴＰを用いた場合を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の二つの工程よりなるピロリン酸の測定方法、
妨害物質であるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）を要求する脱水素酵素を用い、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ）を生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに非発色性電子受容体の存在下、電子伝達体を作用させ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに変換する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定する第二工程。
【請求項２】
次の二つの工程よりなるピロリン酸の測定方法、
妨害物質であるＡＴＰ、ｄＡＴＰ及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して、生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を消去する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する第二工程。
【請求項３】
前記キナーゼがヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグリセロールキナーゼ（ＧＫ）であることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項４】
前記ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素がグルコ−ス６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）又はグリセロール３リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項５】
前記電子伝達体がフェナジンメト硫酸塩（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）、フェナジンエト硫酸塩（ＰＥＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ―α―フェナゾキソニウムクロライド（メルドラブルー）又はジアフォラーゼであることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項６】
前記ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素がＡＴＰスルフリラーゼ、ピルビン酸オルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）又はフェニルアラニンラセマーゼであることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項７】
ピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検知・定量方法であって、核酸増幅後の被検液に含有されるピロリン酸を請求項１又は２の方法により測定することを特徴とする検知・定量方法。
【請求項１】
次の二つの工程よりなるピロリン酸の測定方法、
妨害物質であるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）を要求する脱水素酵素を用い、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ）を生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに非発色性電子受容体の存在下、電子伝達体を作用させ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰに変換する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定する第二工程。
【請求項２】
次の二つの工程よりなるピロリン酸の測定方法、
妨害物質であるＡＴＰ、ｄＡＴＰ及び／又はそれらの類似体を消去するためにキナーゼ及び補酵素としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを要求する脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して、生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を消去する第一工程、
ついで、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにキナーゼ及び脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する第二工程。
【請求項３】
前記キナーゼがヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグリセロールキナーゼ（ＧＫ）であることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項４】
前記ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素がグルコ−ス６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）又はグリセロール３リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項５】
前記電子伝達体がフェナジンメト硫酸塩（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）、フェナジンエト硫酸塩（ＰＥＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ―α―フェナゾキソニウムクロライド（メルドラブルー）又はジアフォラーゼであることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項６】
前記ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素がＡＴＰスルフリラーゼ、ピルビン酸オルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）又はフェニルアラニンラセマーゼであることを特徴とする請求項１又は２の測定方法。
【請求項７】
ピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検知・定量方法であって、核酸増幅後の被検液に含有されるピロリン酸を請求項１又は２の方法により測定することを特徴とする検知・定量方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１８７２５１（Ｐ２００６−１８７２５１Ａ）
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１３３（Ｐ２００５−２１３３）
【出願日】平成１７年１月７日（２００５．１．７）
【出願人】（３９１０３１０７４）株式会社カイノス (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月７日（２００５．１．７）
【出願人】（３９１０３１０７４）株式会社カイノス (5)
【Ｆターム（参考）】
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