ピロリン酸の測定方法
【課題】試料中のピロリン酸を測定する新規で有用な方法を提供することにある。
【解決手段】ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、及び脱水素酵素を使用して、試料中のピロリン酸を測定する新規で有用な方法を提供できる。
【解決手段】ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、及び脱水素酵素を使用して、試料中のピロリン酸を測定する新規で有用な方法を提供できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はピロリン酸を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリン酸を酵素的に測定する従来技術としては、（ｉ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、及びルシフェラーゼを使用する方法（特許文献１）、（ｉｉ）ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用する方法（特許文献２）、又は（ｉｉｉ）キナーゼ、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素を使用する方法（特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−０９７４７１号公報
【０００４】
【特許文献２】特開２００３−１７４９００号公報
【０００５】
【特許文献３】特開２００６−１８７２５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
試料中のピロリン酸を測定する新規で有用な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、及び脱水素酵素を使用して試料中のピロリン酸を測定する新規な方法を見出した。次に、ＮＡＤサイクリング反応を利用して、該方法を、高感度且つ簡便な方法となすことに成功した。更に、トリ燐酸化デオキシリボ核酸類（以下、ｄＮＴＰｓということがある）に比べてＡＴＰに対して選択的に反応するニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼを発見し、該酵素を用いることで試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中にｄＮＴＰｓやリン酸等が存在している場合においても、試料中のピロリン酸を選択的に測定できる方法を確立して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
下記（１）から（４）の各工程を含むピロリン酸の選択的な測定方法。
（１）試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸を、少なくともＡＭＰの存在下、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する第一の反応を含む工程；
（２）上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する第二の反応を含む工程；
（３）上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する第三の反応を含む工程；
（４）上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程；
［１−１］
第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程が、以下の工程を含む［１］に記載の測定方法。（５）ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とＮＡＤ類とする第四の反応を含む工程；
（６）上記第四の反応により生ずる還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩類を検出する工程；
［１−２］
第四の反応により生ずるＮＡＤ類を、第三の反応に用い、第三の反応と第四の反応の間でサイクリング反応をさせる上記［１−１］に記載の測定方法。
［１−３］
第二の反応により生ずるピロリン酸を、第一の反応に用い、第一の反応と第二の反応の間でサイクリング反応をさせる上記［１］から［１−２］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−４］
第一の反応が、更に金属イオンを含む反応である上記［１］から［１−３］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−５］
金属イオンが、マグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンからなる群から選ばれる１種、又は２種以上である上記［１−４］に記載の測定方法。
［１−６］
第一の反応が、更にホスホエノールピルビン酸（本明細書ではＰＥＰと記載する場合がある）を含む反応である上記［１］から［１−５］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−７］
第二の反応が、更に金属イオンを含む反応である上記［１］から［１−６］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−８］
第二の反応に含まれる金属イオンが、マグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンからなる群から選ばれる１種、又は２種以上である上記［１−７］に記載の測定方法。
［１−９］
第二の反応が、更にβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド類（本明細書ではＮＭＮ類と記載する場合がある）を含む反応である上記［１］から［１−８］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１０］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素、又は、〔３〕下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記［１］から［１−９］のいずれか１つに記載の測定方法。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、アデノシン５’一リン酸（本明細書ではＡＭＰと記載する場合がある）に対して特異的に補酵素として作用し、アデノシン５’二リン酸、イノシン５’一リン酸、シチジン５’一リン酸、グアノシン５’一リン酸、チミジン５’一リン酸又はウリジン５’一リン酸（本明細書では、順に、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、ＵＭＰと記載する場合がある）に作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［１−１１］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１０］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１２］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１１］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１３］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１２］のいずれか１つに記載の測定方法。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、又はＵＭＰに作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［１−１４］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、更に以下の《６》又は《７》のいずれかの理化学的性質を有する上記［１］から［１−１３］のいずれか１つに記載の測定方法。
《６》冷凍安定性
−２０℃で２週間保存後、９０％以上の活性を保持する；
《７》冷蔵安定性
４℃で２７日間保存後、８０％以上の活性を保持する；
［１−１５］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属由来である上記［１］から［１−１４］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１６］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来である上記［１］から［１−１５］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１７］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍ ａ ＤＳＭ ３１０９株由来である上記［１］から［１−１６］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１８］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号２又は配列表配列番号３で表される塩基配列である上記［１］から［１−１１］、又は［１−１３］から［１−１７］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１９］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記［１］から［１−１８］のいずれか１つに記載の測定方法。［１−２０］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、下記の＜ａ＞から＜ｅ＞に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１９］のいずれか１つに記載の測定方法。
＜ａ＞Ｖ１３２Ｉ（配列表配列番号６の１３２番目のＶがＩに置換したことを示す。以下同様。）
＜ｂ＞Ｄ２６９Ｖ
＜ｃ＞Ｎ６４Ｙ
＜ｄ＞Ａ６５Ｓ
＜ｅ＞Ａ１０３Ｓ
［１−２１］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号７で表される塩基配列である上記［１］から［１−２０］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２２］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、真核生物由来である上記［１］から［１−２１］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２３］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、酵母由来である上記［１］から［１−２２］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２４］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来である上記［１］から［１−２３］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２５］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である上記［１］から［１−２４］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２６］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下である上記［１］から［１−２５］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２７］
第三の反応が、ＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元し得る酵素により触媒される反応である上記［１］から［１−２６］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２８］
第三の反応が、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される反応である上記［１］から［１−２７］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２９］
第四の反応におけるＮＡＤＨ還元物質が、ジアホラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ、本明細書では、ＤＩと記載する場合がある）である上記［１］から［１−２８］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−３０］
試料が、ｄＮＴＰｓを含有する試料である、上記［１］から［１−２９］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−３１］
上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程が、ｄＮＴＰｓを含有する工程である、上記［１］から［１−２９］のいずれか１つに記載の測定方法。［１−３２］
ｄＮＴＰｓが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる群から選ばれる１種又は２種以上である、上記［１−３０］または［１−３１］に記載の測定方法。
［１−３３］
ｄＮＴＰｓが、少なくともｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物である、上記［１−３０］または［１−３１］に記載の測定方法。
［１−３４］
ｄＮＴＰｓが、それぞれ０．４ｍＭ以下である上記［１−３０］から［１−３３］のいずれか１つに記載の測定方法。
［２］
上記［１］から［１−３４］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定する核酸の検出又は定量方法。［２−１］
上記［１］から［１−３４］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定し、核酸増幅前の試料におけるピロリン酸の値をブランク値として引くことを特徴とする核酸の検出又は定量方法。
［２−２］
上記［１］から［２−１］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を測定するピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法。
［２−３］
上記［１］から［２−２］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を測定し、核酸増幅前の試料におけるピロリン酸の値をブランク値として引くことを特徴とするピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法。
［３］
少なくとも以下の（１）から（７）を含む組成物。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（５）ＮＭＮ類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
［３−１］
更に以下の（８）と（９）を含む上記［３］に記載の組成物。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ニトロブルーテトラゾリウム塩類（本明細書ではＮＴＢ類と記載する場合がある）
［３−２］
下記の（Ａ）と（Ｂ）の２種の試薬を含む組成物。
（Ａ）少なくとも以下の（１）から（４）を含む第１の試薬。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（Ｂ）少なくとも以下の（５）から（７）を含む第２の試薬。
（５）ＮＭＮ類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
［３−３］
更に、第２の試薬に、以下の（８）と（９）を含む上記［３−２］に記載の組成物。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ＮＴＢ類
［３−４］
金属イオンがマグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンのうち、いずれか１つ以上である上記［３］から［３−３］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−５］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素、又は、〔３〕下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記［３］から［３−４］のいずれかに１つ記載の組成物。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＵＭＰに作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［３−６］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［３］から［３−５］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−７］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［３］から［３−６］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−８］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、のいずれかの酵素である上記［３］から［３−７］のいずれか１つに記載の組成物。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＵＭＰに作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［３−９］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、更に以下の《６》又は《７》のいずれかの理化学的性質を有する上記［３］から［３−８］のいずれか１つに記載の組成物。
《６》冷凍安定性
−２０℃で２週間保存後、９０％以上の活性を保持する；
《７》冷蔵安定性
４℃で２７日間保存後、８０％以上の活性を保持する；
［３−１０］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属由来である上記［３］から［３−９］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１１］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来である上記［３］から［３−１０］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１２］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ ３１０９株由来である上記［３］から［３−６］、又は［３−８］から［３−１１］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１３］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号２又は配列表配列番号３で表される塩基配列である上記［３］から［３−１２］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１４］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、のいずれかの酵素である上記［３］から［３−１３］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１５］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、下記の＜ａ＞から＜ｅ＞に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素である上記［３］から［３−１２］、又は［３−１４］のいずれか１つに記載の組成物。
＜ａ＞Ｖ１３２Ｉ
＜ｂ＞Ｄ２６９Ｖ
＜ｃ＞Ｎ６４Ｙ
＜ｄ＞Ａ６５Ｓ
＜ｅ＞Ａ１０３Ｓ
［３−１６］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号７で表される塩基配列である上記［３］から［３−１５］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１７］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、真核生物由来である上記［３］から［３−１６］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１８］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、酵母由来である上記［３］から［３−１７］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１９］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来である上記［３］から［３−１８］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２０］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である上記［３］から［３−１９］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２１］
第三の反応が、ＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元し得る酵素により触媒される反応である上記［３］から［３−２０］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２２］
第三の反応が、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される反応である上記［３］から［３−２１］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２３］
第四の反応におけるＮＡＤＨ酸化物質が、ＤＩである上記［３］から［３−２２］のいずれかに記載の組成物。
［３−２４］
更に下記の（Ｃ）を含む上記［３］から［３−２３］のいずれか１つに記載の組成物。
（Ｃ）少なくとも既知量のピロリン酸を含むキャリブレーション試薬。
［４］
核酸を検出又は定量するための組成物である、上記［３］から［３−２４］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］
上記［４］に記載の組成物を用いて上記［２］又は［２−１］に記載の方法を行うことを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
［６］
ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下であるニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、簡便、高感度、且つ選択的なピロリン酸を測定する方法を提供できる。また、該ピロリン酸の測定方法を用いれば、核酸増幅工程における核酸の検出又は定量方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２で発現したＰＰＤＫの素精製液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。矢印がＰＰＤＫである。
【図２】ＨＰＬＣで、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンを分離した結果を示す。
【図３】反応液の反応前をＨＰＬＣで分離した結果を示す。
【図４】反応液の反応後をＨＰＬＣで分離した結果を示す。
【図５】ＰＰＤＫの冷蔵保存（４℃）安定性を示す。
【図６】ＰＰＤＫの熱安定性を示す。
【図７】ＰＰＤＫの熱安定性を示す。
【図８】ＰＰＤＫの至適ｐＨを示す。
【図９】ＰＰＤＫのｐＨ安定性を示す。
【図１０】ピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１１】ｄＮＴＰｓ存在下と非存在下のピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１２】ＰＣＲによる核酸増幅反応中の、ピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１３】ＰＣＲによる核酸増幅反応中の、ピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１４】配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫとの発現量（Ａ）と、配列表配列番号３の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（Ｂ）を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１５】タカラバイオ株式会社のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍを使用したリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅を検出した結果（●）と、本発明のピロリン酸濃度測定組成物とピロリン酸濃度測定方法を用いて核酸増幅を検出した結果（○）を示す。
【図１６】第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示す。
【図１７】第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示す。
【図１８】ｄＮＴＰｓ存在下と非存在下のピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一態様は、下記（１）から（４）の各工程を含む試料中のピロリン酸の選択的な測定方法である。（１）試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸をピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する第一の反応を含む工程；（２）上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する第二の反応を含む工程；（３）上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する第三の反応を含む工程；（４）上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程。
本発明は更に、（５）ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とＮＡＤ類とする第四の反応を含む工程、を含み、第四の反応により生ずる還元型ＮＴＢ類（本明細書では、ＮＴＢＨ２と記載する場合がある）を検出する選択的ピロリン酸を測定する方法も挙げられる。
【００１１】
ピロリン酸（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｈ４Ｐ２Ｏ７）は、・|オキソ−ヘキサオキソ二リン酸や二リン酸等と記載される場合もある。本発明におけるピロリン酸は、公知のピロリン酸を含み、由来、剤型、添加物、又は商品名等により限定されない。
【００１２】
本発明におけるピロリン酸は、例えば各種核酸増幅法によるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を増幅したときに生成するピロリン酸や、例えば細胞中等でＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応の生成物として合成されるピロリン酸を含む。すなわち、本発明おけるピロリン酸は、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ （ＩＣＡＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＴＭＡ）、及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＲＣ）等の核酸増幅法による生成物であるピロリン酸や、結晶沈着性関節炎の指標となる関節液中のピロリン酸等を含む。このように、ピロリン酸を測定すれば、各種核酸増幅法による核酸の検知や定量、核酸の増幅の検出、結晶沈着性関節炎の検出などが可能となる。
【００１３】
本発明の試料は特に限定されないが、上記の核酸増幅法による核酸増幅反応中の被検液の他、関節液、全血、血漿、血清、血球、髄液、リンパ液、尿等を含む生体試料や研究用試料及びそれらの抽出物等を挙げることができる。その他の試料としては、例えば、海水、天然水、果汁、飲料、廃液等が挙げられる。又、本発明の試料は、ピロリン酸が含まれているかどうかには限定されず、含まれている可能性があれば好ましい。通常は上記の核酸増幅法による核酸増幅反応中や反応後の被検液にはピロリン酸が含まれている可能性があるし、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼが直接又は間接的に接触する（した）生体由来物質や微生物等の生物が直接又は間接的に接触する（した）物質もピロリン酸が含まれている可能性のある試料である。これらの試料は、測定に影響のある不純物を除く前処理行程があっても良い。
【００１４】
本発明のｄＮＴＰｓは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる群から選ばれる１種又は２種以上であり、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物であってもよい。ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合比は任意であり、等モルの混合物でも良い。
【００１５】
ｄＮＴＰｓは、試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中に存在する場合と存在しない場合があり、存在する場合の濃度は任意であるが、それぞれの濃度が４ｍＭ以下であれば好ましく、１ｍＭ以下であれば更に好ましく、０．４ｍＭ以下であれば最も好ましい。
【００１６】
本発明の測定方法は、ピロリン酸の生成又は生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法であって、上記の核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を選択的に測定する検出又は定量方法も含む。又、生体内や生体外における天然の核酸増幅反応による生成物であるピロリン酸を選択的に測定する検出又は定量方法も含む。
【００１７】
本発明の第一の反応は、試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸をピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する反応である。
本発明の第一の反応に使用する酵素は、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（Ｐ
ｙｒｕｖａｔｅ ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ （本明細書ではＰＰＤＫと記載する場合がある））でも良く、該ＰＰＤＫは、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ）や、ＥＣ ２．７．９．１等と表現される場合がある。本発明のＰＰＤＫの酵素作用は、例えばマグネシウムイオン等の金属イオンの存在下で、[式１]に示す通りである。例えば、ＡＴＰ、ピルビン酸、及びリン酸を基質として用いたときの反応式は[式１]の左方向である。又、例えば、ＡＭＰ、ＰＥＰ、及びピロリン酸を基質として用いたときの反応式は[式１]の右方向である。本発明の第一の反応式は、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを生じさせる反応であることから右方向の反応式である。
[式１]
ＡＭＰ ＋ ＰＥＰ ＋ ピロリン酸＜＝＞ＡＴＰ ＋ ピルビン酸 ＋ リン酸
【００１８】
本発明のＰＰＤＫは、上記[式１]の触媒作用を示す酵素であれば由来、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されない。該ＰＰＤＫとしては、上記の《１》から《５》の理化学的性質や本願明細書に記載された該ＰＰＤＫの性質のいずれかを有する酵素であれば好ましい。すなわち、上記[式１]の触媒作用を有すれば好ましく、その他の性質の有無は特に限定されないが、上記の《１》から《５》の理化学的性質や本願明細書に記載された該ＰＰＤＫの性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていることも好ましい。更に該ＰＰＤＫは、上記の《６》又は《７》性質を備えていることも好ましい。本発明のＰＰＤＫにおいては、本願明細書に記載された該ＰＰＤＫの性質のその他の理化学的性質や物性等を採用する事も出来る。
【００１９】
そのようなＰＰＤＫとしては、例えば、トウモロコシ葉由来（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，２８６２−２８６７（１９７３））、サトウキビ葉由来（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １１４，１１７−１２５ （１９６９））、菊科植物由来（Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１，２９ ５−２９７ （１９９０））、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ由来（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０，７２１−７２９ （１９７１））、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ由来（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２，１９９−２１２（１９７５））、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ由来（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １０４，２１１−２１８ （１９７０））、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ属由来（特開平０８−１６８３７５号公報）等の公知のＰＰＤＫやそれらのアイソザイムがある。
【００２０】
本発明のＰＰＤＫは、上記以外の天然の生物由来であっても良いが、微生物由来の場合は、例えばＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、好ましくはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、最も好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ３１０９株由来である。該菌株は後述の菌株バンクで購入できるし、他の菌株バンクで購入できる該菌株との同等株や、公知の方法で分離した同等株を用いて、本発明のＰＰＤＫの各性質を有する酵素を生産し得ることを確認して、本発明の測定方法に使用することもできる。
【００２１】
本発明の第一の反応において使用するＰＰＤＫの量は、本発明のピロリン酸測定ができれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、ＰＰＤＫの純度や種類、及び／又は経済的な事情等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の第一の反応において、更に、ＡＭＰ、金属イオン、又はピルビン酸を使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００２２】
本発明の第一の反応において使用するＰＰＤＫの量は、例えば、下限が０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、１００Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは２０
Ｕ／ｍｌ以下である。
【００２３】
本発明の第一の反応は、少なくともＡＭＰの存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＡＭＰの量は、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００２４】
本発明の第一の反応は、少なくともＰＥＰ等の高エネルギーリン酸化合物の存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＰＥＰの量は、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００２５】
本発明の第一の反応は、少なくとも金属イオンの存在下であることが好ましく、マグネシウムイオン、コバルトイオン、又はニッケルイオンのうちいずれか一つ以上の金属イオンであっても良いがマグネシウムイオンが特に好ましい。上記条件下で使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限がＡＭＰの濃度に対して０．２当量以上、好ましくは０．５当量以上、更に好ましくは０．８当量以上であり、上限が５当量以下、好ましくは３当量以下、更に好ましくは２当量以下である。最も好ましい濃度はリン酸供与体の１当量である。
【００２６】
本発明のＰＰＤＫは、上記[式１]の触媒作用を示す酵素であればアミノ酸配列は限定されず、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列の場合は、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であっても良い。該アミノ酸配列は、配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む配列が好ましい。又、該アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＳＭＰＧＭＭＤＴ、又はアミノ酸配列ＬＮＬＧＬＮＤを含むと更に好ましい。本発明のＰＰＤＫのアミノ酸配列として典型的な例は配列表配列番号１のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列表配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加の例としては、ＰＰＤＫのＮ末端側及び／又はＣ末端側にチオレドキシン等機能性酵素やその他のアミノ酸配列からなる部分を付加する例が挙げられ、融合蛋白質とすることも好ましく、その付加する部分により精製や確認等をすることのできるタグと呼ばれる部分を融合させ、場合によっては、そのタグ部分を削除しても、場合によってはその全部又は一部が残る場合も例示される。タグは、例えば、ＰＰＤＫを菌体外やペリプラズムへ輸送する為の約２０個のシグナルペプチドや、効率的な精製を行う為の５から１０個のＨｉｓの付加でも良いし、それらを直列して付加しても良い。又、それらのアミノ酸配列の間等に数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加することもできる。
【００２８】
上述の付加の例と同様に、欠失、又は置換を行うことができ、例えば、本発明のＰＰＤＫの本質的な機能とは無関係の数個のアミノ酸からなるドメインが存在する場合や、配列表配列番号１のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。又、欠失、置換もしくは付加を適宜組み合わせることも可能である。更に、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、その配列表配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側、及びＣ末端側は、アミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む、すなわち付加していても良く、その付加アミノ酸残基としてはシグナルペプチド、ＴＥＥ配列、Ｓタグ、又はＨｉｓタグ等が挙げられる。配列表配列番号１のアミノ酸を欠失する場合は、例えば、Ｎ末端側又はＣ末端側から順に削除する例が挙げられる。配列表配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端のＭｅｔの欠失や、Ｎ末端がアシル基やアルキル基等による修飾を受ける等の翻訳後修飾された酵素も本発明のＰＰＤＫである。又、ＰＰＤＫを公知の方法で無水コハク酸やＰＥＧ等により化学修飾して、ＰＰＤＫの至適
ｐＨや安定性等の性質を利用しやすいように変化させることも可能である。上記の場合、ＰＰＤＫの分子量は変化する場合があり、例えば、後述のｐＥＴベクターを利用してＮ末端にＨｉｓタグを付加すると分子量が約１，０００大きくなる。本発明のＰＰＤＫのアミノ酸配列の二次構造や三次構造は、特に限定されない。
【００２９】
本発明のＰＰＤＫの塩基配列は、本発明のＰＰＤＫをコードする塩基配列であれば特に限定されないが、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の場合、配列表配列番号１と実質的に均等なアミノ酸配列をコードする塩基配列であっても良く、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列のうち、上記第一の反応の触媒作用に関与しない一部のアミノ酸を変異させたもの、例えば１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の均等物をコードする塩基配列であっても良い。好ましくは、配列表配列番号４及び配列表配列番号５や上記のそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるように行うことが特に好ましい。配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列表配列番号２の塩基配列や配列表配列番号２の塩基配列を適当な宿主のコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列が例示される。そのような例としては、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて配列表配列番号２の塩基配列を変更した塩基配列表配列番号３が例示される。
【００３０】
ＰＰＤＫをコードする塩基配列の調製においては、通常用いられる公知の遺伝子操作手段を利用することができ、例えば、部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定塩基の断片を人工変異塩基で置換する等の種々の方法が例示される。
【００３１】
本発明の第二の反応は、上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する反応である。
【００３２】
本発明の第二の反応に使用する酵素は、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄｅｎｙｌｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ（本明細書ではＮＭＮＡＴａｓｅと記載する場合がある））でも良く、該ＮＭＮＡＴａｓｅは、ＮＡＤ（＋） ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅや、ＥＣ
２．７．７．１等と表現される場合がある。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの酵素作用は、例えばマグネシウムイオン等の金属イオンの存在下で、[式２]に示す通りである。例えば、ＡＴＰ、及びＮＭＮを基質として用いたときの反応式は[式２]の右方向である。又、例えば、ＮＡＤ及びピロリン酸を基質として用いたときの反応式は[式２]の左方向である。本発明の第二の反応式は、右方向の反応式である。
[式２]
ＡＴＰ ＋ ＮＭＮ ＜＝＞ ＮＡＤ ＋ ピロリン酸
【００３３】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、上記[式２]の触媒作用を示す酵素であれば由来、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されず、その他の性質の有無には特に限定されないが、本願明細書に記載された該ＮＭＮＡＴａｓｅの性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていることも好ましい。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅにおいては、本願明細書に記載された該ＮＭＮＡＴａｓｅの性質のその他の理化学的性質や物性等を採用する事も出来る。そのようなＮＭＮＡＴａｓｅとしては、例えば、古細菌であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ
ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７９巻、７７１８頁、１９９７年）、古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７９巻、７７１８頁、１９９７年）、ヒト由来等の公知のＮＭＮＡＴａｓｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、３７７巻、３１７頁、２００４年）がある。尚、ヒト等を含む哺乳類や酵母等のＭＮＡＴａｓｅに、公知のアイソザイムがあればそれらを採用することもできる。
【００３４】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、例えば天然の生物由来であっても良いが、真核生物由来が好ましく、微生物由来の場合は、酵母由来が好ましい。更に好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属が、最も好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。該菌株の取得方法は上記ＰＰＤＫの場合と同様である。
【００３５】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、後述の方法など常法により探索したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株、３−２株、及び６−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅを使用しても良い。
【００３６】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの、ＡＴＰとｄＮＴＰｓの基質特異性が交差する場合、すなわちＡＴＰとｄＮＴＰｓがＮＭＮＡＴａｓｅの基質となりえる場合、ｄＮＴＰｓの消去反応を本発明の第一から第四の反応のいずれか一つ以上と同時に、又は別異に行えばよい。好ましくは、ＡＴＰとｄＮＴＰｓの基質特異性の交差は小さい方が良い。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、例えば、ｄＮＴＰｓ／ＡＴＰ（ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率）として７０％以下が好ましく、３０％以下であれば更に好ましく、１０％以下であれば特に好ましく、最も好ましくは５％以下である。
【００３７】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列として典型的な例は、配列表配列番号６である。
配列表配列番号６のアミノ酸配列であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ６−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列は、Ｅｍａｎｕｅｌｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００３年、２７巻、３５７頁により公知となったｙＮＭＮＡＴ−２と同一であった。本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列は、配列表配列番号６のアミノ酸配列の１３２番目のＶがＩに置換され（本明細書ではこのような置換を、置換前のアミノ酸、置換される位置、置換後のアミノ酸の順序からなる表記「Ｖ１３２Ｉ」等と記載する場合がある）、且つＤ２６９Ｖであった。又、本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列は、Ｎ６４Ｙ、Ａ６５Ｓ、且つ、Ａ１０３Ｓであった。従って、配列表配列番号６のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換の例としては、Ｖ１３２Ｉ、Ｄ２６９Ｖ、Ｎ６４Ｙ、Ａ６５Ｓ、Ａ１０３Ｓ等が挙げられる。
【００３８】
配列表配列番号６のアミノ酸配列を有するＮＭＮＡＴａｓｅは、Ｅｍａｎｕｅｌｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００３年、２７巻、３５７頁に従えば製造できるし、本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株、及び３−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅは、上記配列表配列番号６のアミノ酸配列の１３２番目のＶ、２６９番目のＤ、１０３番目のＡ、６４番目のＮ、６５番目のＡを、ＰＣＲや市販のキット等を利用した部位特異アミノ酸置換等の常法にてアミノ酸置換すれば製造できる。
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの塩基配列については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。
【００３９】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの塩基配列としては、配列表配列番号７が例示される。
本発明の第二の反応において使用するＮＭＮＡＴａｓｅの量については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明の第二の反応において、更に、ＮＭＮ類、又は金属イオンを使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００４０】
本発明の第二の反応において使用するＮＭＮＡＴａｓｅの量は、例えば、下限が０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．３Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、上
限は特に設けないが、２０Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは５Ｕ／ｍｌ以下である。
【００４１】
本発明の第二の反応は、少なくともβ−ニコチンアミドモノヌクレオチドやニコチン酸モノヌクレオチド等のＮＭＮ類の存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＮＭＮ類の量は、例えば、ＮＭＮの場合、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００４２】
本発明の第二の反応は、少なくとも金属イオンの存在下であることが好ましく、マグネシウムイオンが特に好ましい。上記条件下で使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００４３】
尚、本発明の第二の反応において、例えばマグネシウムイオンとＮＭＮの存在下、第一の反応により生ずるＡＴＰをＮＭＮＡＴａｓｅに接触させると、ピロリン酸とＮＡＤが生成される。又、例えばマグネシウムイオンとニコチン酸モノヌクレオチドの存在下、第一の反応により生ずるＡＴＰをＮＭＮＡＴａｓｅに接触させると、ピロリン酸とデアミドＮＡＤが生成される。
【００４４】
本発明の第三の反応は、上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する反応である。
本発明の第三の反応におけるＮＡＤ類は、ＮＡＤまたはデアミドＮＡＤ（ＮＡＡＤ）等が挙げられ、そのうちいずれか一つ以上であっても良いがＮＡＤが特に好ましい
【００４５】
本発明の第三の反応において、ＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する方法は公知の方法であれば特に限定されず、本発明のＮＡＤ還元物質を利用してＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する。該方法は、酵素的であっても非酵素的であっても良いが、酵素的にＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する場合は、例えばＮＡＤ類を補酵素とする酵素を使用すれば良い。そのような酵素には脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が例示される。
[式３]
基質 ＋ ＮＡＤ類 ＜＝＞ 酸化された基質 ＋ ＮＡＤＨ類
【００４６】
本発明の第三の反応を酵素的に行う場合、使用する脱水素酵素は上記[式３]の触媒作用を示す酵素であれば、酵素名、ＥＣ番号、由来、アミノ酸配列、塩基配列、又は製造方法等により限定されない。そのような脱水素酵素としては、例えばｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（本明細書ではＨＳＤと記載する場合がある）が好ましく、更に好ましくは３α−ＨＳＤ、３β−ＨＳＤ、１７β−ＨＳＤ、１１β−ＨＳＤ、１６α−ＨＳＤ、２０α−ＨＳＤ、７α−ＨＳＤ、１２α−ＨＳＤ、７β−ＨＳＤ、又は１２β−ＨＳＤが挙げられ、特に好ましくは３α−ＨＳＤと１２α−ＨＳＤである。
【００４７】
本発明の第三の反応において、例えば脱水素酵素を使用する場合、脱水素酵素の量については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明の第三の反応において、更に、使用する脱水素酵素の反応に必要な基質や補酵素等の種類と量についても同様である。
本発明の第三の反応において、例えば１２α−ＨＳＤを使用する場合、使用する１２α−ＨＳＤの量は、例えば、下限が０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、５０Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは２０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下である。
【００４８】
本発明の第三の反応は、例えば１２α−ＨＳＤを使用する場合、少なくとも１２α−ＨＳＤの基質の存在下であることが好ましく、その基質は３α−、７α−、又は１２α−ヒドロキシ胆汁酸やコール酸やデオキシコール酸等が挙げられる。上記条件下で使用する１２α−ＨＳＤの基質の量は、例えば、コール酸の場合、下限が０．１ｍＭ以上、好ましくは０．２ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。これらの基質が本発明の各反応を阻害する場合は、濃度を調整したり、基質を変更したりすればよい。
１２α−ＨＳＤを使用する場合の一例として、コール酸（３α、７α、１２α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−５β−ｃｈｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）を基質にした場合、生成物は３α、７α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｘｏ−５−β−ｃｈｏｌａｎａｔｅである。
【００４９】
本発明の第四の反応は、ＮＴＢ類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ＮＴＢ類とＮＡＤ類とする反応である。
本発明の第四の反応におけるＮＴＢ類は、１，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｆｏｒｍａｚａｎ、１，５−Ｂｉｓ（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌｆｏｒｍａｚａｎ、１，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−３−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｆｏｒｍａｚａｎ等のホルマザン類や２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、２，３，５−Ｔｒｉｓ（ｐ−ｔｏｌｙｌ）ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、２，３−Ｂｉｓ（３−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ等のテトラゾリウム塩等、各種酵素の検出試薬、酸化還元系発色試薬として広く一般に用いられている複素環式有機化合物を含む。該ＮＴＢ類や還元型ＮＴＢ類は、水に不溶性、難溶性、又は可溶性のいずれでも良い。
【００５０】
本発明の第四の反応におけるＮＡＤＨ類とは、本発明の第三の反応の場合と同様である。
本発明の第四の反応において、ＮＴＢ類の存在下ＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に酸化する方法は公知の方法であれば特に限定されず、本発明のＮＡＤＨ酸化物質を利用してＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に酸化する（ＮＴＢ類を還元型ＮＴＢ類に還元する）。該方法は、酵素的であっても非酵素的であっても良い。本発明の第四の反応は、[式４]に示す通りである。
[式４]
ＮＴＢ類 ＋ ＮＡＤＨ類 ＜＝＞ 還元型ＮＴＢ類 ＋ ＮＡＤ類
【００５１】
本発明の第四の反応を酵素的に行う場合、使用する酵素は上記[式４]の触媒作用を示す酵素であれば、酵素名、ＥＣ番号、由来、アミノ酸配列、塩基配列、又は製造方法等により限定されない。酵素的にＮＴＢ類の存在下ＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に酸化する場合は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ｑｕｉｎｏｎｅ）、ＮＡＤＰＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ等のジアホラーゼ類を使用できる。これらの酵素は、順にＥＣ １．６．５．２、ＥＣ １．６．９９．１、ＥＣ
１．６．９９．３と表現される場合がある。
【００５２】
本発明の第四の反応において、例えばＤＩ類を使用する場合、該ＤＩ類の量については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明の第四の反応において、更に、ＤＩ類の反応に必要な基質や補酵素等を使用する場合は、その種類と量についても同様である。
【００５３】
本発明の第四の反応において、例えばＤＩを使用する場合、使用するＤＩの量は、例えば、下限が０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、５０Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは２０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下である。
【００５４】
本発明の第四の反応は、例えばＤＩを使用する場合、例えば少なくともＮＴＢ（ｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｌｕｅ （ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）と記載される場合もある））の存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＮＴＢ類の基質の量は、存在すれば良いが、下限が０．００１％以上、好ましくは０．００５％以上、更に好ましくは０．０１％以上、上限は特に設けないが、好ましくは１％以下、更に好ましくは０．５％以下、特に好ましくは０．１％以下である。還元型ＮＴＢ類が難水溶性の場合は、後述する界面活性剤を使用する等、公知の方法で可溶化すればよい。
【００５５】
本発明における選択的ピロリン酸の測定方法には、試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中において、ピロリン酸の測定値に正誤差又は負誤差を与える可能性のある物質（共存物質）がピロリン酸と共存する場合に、ピロリン酸を選択的に測定する方法を含む。すなわち、本発明おける選択的ピロリン酸の測定方法には、共存物質の影響を受けない、又は受け難い、選択的なピロリン酸の測定方法を含む。該共存物質としては、例えば、ｄＮＴＰｓが挙げられる。
【００５６】
本発明のＮＡＤＨ類を検出する測定方法には、定性反応によりＮＡＤＨ類を検出する測定方法を含み、好ましくは第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類の変化量を検出する測定方法であり、更に好ましくは、第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類の変化量を検出し定量する測定方法である。第四の反応により生ずる還元型ＮＴＢ類を検出する測定方法の場合も同様である。
【００５７】
定量する測定方法とは、例えば次の通りである。ピロリン酸が含まれている可能性のある試料を、上記第一の反応から第三の反応を含む工程で処理し、上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出し、既知の濃度のピロリン酸を含む試料について同様に反応させて検出したＮＡＤＨ類の濃度と比較することにより試料中に含まれていたピロリン酸を定量する。また、ＮＡＤＨの検出は、上記第四の工程により還元型ＮＴＢ類として検出することもできる。試薬ブランクを差し引く場合は、ピロリン酸が含まれている可能性のある試料の代わりに、蒸留水等ピロリン酸が含まれていない試料を同様の工程で処理し差し引けばよい。
【００５８】
ＮＡＤＨ類は公知の方法で検出すれば良く、ＮＡＤＨ類を直接検出する場合のほか、ＮＡＤＨ類をさらに他の反応に供して間接的に検出してもよい。間接的に検出する方法としては、本発明の上記第四の反応を含む場合が挙げられ、ＮＡＤＨ類をＮＴＢ類と反応させて、還元型ＮＴＢ類として検出すれば、目視で検出できるので簡便である。その他の場合は、ＮＡＤＨ類や還元型ＮＴＢ類の変化に伴うそれら該測定対象の吸収スペクトルや吸光強度の変化を、装置を用いて光学的方法で検出する方法が例示され、ＮＡＤＨ類、又は還元型ＮＴＢ類に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出する方法でも良い。ＮＡＤＨ類の蛍光の変化を検出することも可能である。酸化還元に伴う電位差を測定する場合は電極を使用すれば良い。
【００５９】
本発明における測定方法では、第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でサイクリング反応を採用することができる。ここでいうサイクリング反応とは、第二の反応を含む工程により生ずるピロリン酸を、再度第一の反応を含む工程で反応させることをいう。図１６に第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示した。このサイクリング反応ではＮＡＤ、Ｐｙｒｕｖａｔｅ、およびリン酸（Ｐｉ）が増幅される。従って、該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、ＮＡＤが増幅されるので、本発明の測定方法の測定感度の向上が期待できる。
また、本発明における測定方法では、第四の反応を含む工程により生ずるＮＡＤ類を、
再度第三の反応を含む工程で反応させ、第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応を採用する事ができる。このサイクリング反応では還元型ＮＴＢ類が増幅される。該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、本発明の測定方法の、測定感度の向上が期待できる。図１７に第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示した。このサイクリング反応では３α、７α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｘｏ−５−β−ｃｈｏｌａｎａｔｅ、還元型ＮＴＢ（ＮＴＢＨ２）が増幅されることになる。従って、該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、還元型ＮＴＢが増幅されるので、本発明の測定方法の測定感度の向上が期待できる。
さらに、本発明における測定方法では、第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でのサイクリング反応と、第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でのサイクリング反応を同時に採用するダブルサイクリング反応を採用する事ができる。すなわち、第二の反応を含む工程により生じるピロリン酸を第一の反応を含む工程で反応させ、第二の反応を含む工程によりＮＡＤを増幅し、かつ、第四の反応を含む工程により生じるＮＡＤを第三の反応を含む工程で反応させ、第四の反応を含む工程により還元型ＮＴＢ類を増幅する該ダブルサイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、本発明の測定方法の、測定感度の向上が期待できる。
【００６０】
本発明の測定方法は、液相、気相、又は固相等やそれぞれの臨界面で実施すれば良いが、液相で実施する事が好ましい。液相には水相、有機溶媒相等が考えられ、本発明の測定方法を水相で実施する場合、水相には例えば水、水溶液や適宜の有機溶媒を含有した水性媒体が例示されるが、適宜のｐＨ緩衝剤を用いることが好ましい。ｐＨ緩衝剤を使用する場合、その種類は目的のｐＨを保つことができ、試料中のピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、酢酸／ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液が例示できる。本発明の測定方法を実施する際のｐＨは、試料中のピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、下限としてｐＨ５以上、好ましくはｐＨ５．５以上、更に好ましくはｐＨ６以上が例示され、上限としてはｐＨ１０以下、好ましくはｐＨ９以下が、更に好ましくはｐＨ８．５以下が例示される。ｐＨ緩衝剤の濃度は目的のｐＨを保つことができ、ピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、下限として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下が、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。
【００６１】
本発明の測定方法のその他の好ましい液相として、例えばゾル・ゲルが挙げられる。ゾル・ゲルとするためには、例えば、寒天等の多糖類を利用すれば良い。ゾル・ゲルと乳濁液を区別する場合は、乳濁液として実施しても良い。乳濁液とするためには、例えば、有機溶媒等を利用すれば良いし、両親媒性物質を利用すればミセルとしても実施できる。いずれの場合も、ｐＨ緩衝剤を用いる場合は上記と同様である。
【００６２】
本発明の測定方法における、第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程はそれぞれ別異の反応槽（相）で実施できるが、同一反応槽（相）で実施する事が好ましい。又、第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程は、不連続に実施できるが、連続して実施する事が好ましい。又、第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程は、第一の反応を含む工程、第二の反応を含む工程、第三の反応を含む工程の順に行っても良く、二つ以上の行程を同時に行ったり、単独に行う行程と組み合わせたりする等、目的、試料、使用する装置等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
【００６３】
本発明の第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の反応時間は、試料中のピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、それぞれ、下限が１５秒以上、好ましくは１
分以上、更に好ましくは３分以上である。上限は特に設けないが、好ましくは３０分以下、更に好ましくは１５分以下、特に好ましくは１０分以下である。第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程の反応時間は不均等であっても良い。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
【００６４】
本発明の測定方法を実施するための反応の温度は、試料中のピロリン酸が測定できる温度であれば特に限定されないが、酵素を使用する場合は使用する酵素の作用温度の範囲内が好ましく、下限は１０℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上が、上限は７０℃以下、好ましくは５０℃以下、更に好ましくは４０℃以下である。第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程の温度は不均等であっても良い。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
【００６５】
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、少なくとも以下の（１）から（７）を含む。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）
（４）ＰＰＤＫ（ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ）
（５）ＮＭＮ類（β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類）
（６）ＮＭＮＡＴａｓｅ（ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）
（７）ＮＡＤ還元物質（例えばデヒドロゲナーゼ）
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、更に以下の（８）と（９）を含んでも良い。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ＮＴＢ類
【００６６】
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、好ましくは少なくとも以下の（Ａ）と（Ｂ）を含む。
（Ａ）少なくとも以下の（１）から（４）を含む第１の試薬。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ
（４）ＰＰＤＫ
（Ｂ）少なくとも以下の（５）から（７）を含む第２の試薬。
（５）ＮＭＮ類
（６）ＮＭＮＡＴａｓｅ
（７）ＮＡＤ還元物質
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物（Ｂ）は、更に以下の（８）と（９）を含んでも良い。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ＮＴＢ類
【００６７】
上記本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、適宜ｐＨ緩衝剤を含む事も好ましい。
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、更に下記の（Ｃ）を含んでも良い。
（Ｃ）少なくとも既知量のピロリン酸を含むキャリブレーション試薬。
【００６８】
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物に含まれる、本発明の金属イオン、ＡＭＰ、ＰＥＰ、ＰＰＤＫ、ＮＭＮ類、ＮＭＮＡＴａｓｅ、ＮＡＤ還元物質、ＮＡＤＨ酸化物質、
及び、ＮＴＢ類の種類と量、すなわち、該組成物がピロリン酸測定用の組成物となり得る為に有効な上記物質の量、及びｐＨ緩衝剤の条件等は、上記の本発明の測定方法と同様である。
【００６９】
本発明のピロリン酸測定用の組成物及びキャリブレーション試薬は、液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品の凍結物が好ましく、液状品の凍結乾燥品が更に好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。更に別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。本発明のピロリン酸測定用の組成物は、一試薬の組成物としても良いが、通常は上記のように二試薬以上に分離すると好ましい。又、試薬の品質向上等を目的としてＮａＣｌやＫＣｌ等の塩、ＴＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤、及び／又はアジ化ナトリウムや抗性物等防腐剤を混合しても良い。又、例えば、ＰＯＣのキャピラリーへの使用、又は酵素センサーとしての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも濃い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状組成物としたりして使用することが好ましい。塩を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は５から２００ｍＭの範囲であり、界面活性剤を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は０．００１％から２％である。アジ化ナトリウムや抗性物等を含む場合、種類や濃度は防腐効果があれば限定されないが、例えばアジ化ナトリウムの場合、下限は０．００５％以上、好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．０３％以上、上限は１％以下、好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．１％以下である。例えば抗生物質の場合、下限は５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上、上限は１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７５μｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは６０μｇ／ｍｌ以下である。
【００７０】
本発明のキャリブレーション試薬は、少なくとも既知量のピロリン酸を含む試薬で良いが、好ましくはｐＨ緩衝剤、アジ化ナトリウムや抗生物等の防腐剤、糖等の安定化剤を含む試薬である。ｐＨ緩衝剤を含む場合、種類や濃度等の条件等は、上記の本発明の測定方法と同様である。安定化剤や防腐剤を含む場合は上記の本発明の組成物と同様である。
該既知量は特に限定されないが、例えばピロリン酸の場合、下限は０μＭ以上、好ましくは０．１μＭ以上、更に好ましくは０．５μＭ以上、上限は特に設けないが、１ｍＭ以下、好ましくは１００μＭ以下、更に好ましくは５０μＭ以下である。
【００７１】
本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法について説明する。
本発明の第一の反応に使用する酵素は、公知の方法により、自然界から該酵素を形成する天然の生物を探索（スクリーニング）し、該生物の細胞から取得すれば良い。該生物は［式１］を触媒し得る酵素を形成する生物であれば限定されず、例えば真正細菌、真核生物、又は古細菌を含む微生物が挙げられる。微生物を探索の対象とする場合には、微生物は公知の方法に従って自然界から分離すれば良く、高温、低温、高圧、酸、アルカリ環境等の極限環境を含む土壌や水中、落下菌や氷核等を含む空中、又は、生物の体内等から得ることができる。特に高温環境から分離した微生物からは安定性の高い第一の反応に使用する酵素を得ることが期待できる。又、微生物は後述するＡＴＣＣやＤＳＭ等の菌株バンクから購入しても良い。分離した微生物は、限界希釈法やモノコロニーの形成等公知の方法に従って純粋分離し、最少培地、ＬＢ培地、ブイヨン培地等で純粋培養し、その培養物において［式１］の酵素活性の有無を確認する事により、第一の反応に使用する酵素を形成する生物を選別できる。又、集積培養による微生物の取得等、探索の効率を上げる工夫も可能である。［式１］の酵素活性の有無は、後述する酵素活性測定方法等により当業者なら容易に確認できる。
【００７２】
分離した菌株の同定は、実験書（鈴木健一朗ら、微生物の分類・同定実験法―分子遺伝
学・分子生物学的手法を中心に、シュプリンガー・フェアラーク東京）等に従うことにより同定することができ、又、市販の各種菌株同定キット（日本ビオメリュー社等）を使用することによっても可能であり、更には、財団法人日本食品分析センター（東京都渋谷区元代々木町５２番１号）等に依頼して同定しても良い。
【００７３】
かくして得られた本発明の第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物は、更にＮＴＧ等の薬剤、紫外線、及び／又は放射線で処理した変異株とすることもできる。該変異株によって、第一の反応に使用する酵素の生産性を向上することや、第一の反応に使用する酵素の変異体を形成させることが可能であり、安定性、生産性、反応性等が優れた性質を有する変異体を形成することも可能である。
又、得られた該酵素をコードする塩基配列やその情報は、上記の該酵素や該酵素を形成する天然の微生物を用いた、プロテインシーケンス、ＤＮＡシーケンスや公知遺伝子工学手法で取得できる。
【００７４】
本発明の第一の反応に使用する酵素は、公知のバイオインフォマティクス手法によっても取得可能である。配列表配列番号１は、本発明の測定方法の第一の反応において好ましい第一の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の例なので、これらの配列をクエリーとしてＮＣＢＩ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ等のデータベースでＢＬＡＳＴサーチ等にてホモロジー検索を行い、配列表配列番号１に一致する、あるいは類似するアミノ酸配列又は塩基配列をもった蛋白質又は遺伝子、すなわち、第一の反応に使用し得る酵素を生産する可能性のある生物の情報や遺伝子情報を得ることが可能である。
【００７５】
上記の方法で得られた第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物や、第一の反応に使用する酵素の塩基配列、又は塩基配列の情報に基づいて形成された該酵素を取得する工程を含む該酵素の製造方法にて、該酵素を取得できる。該酵素を形成する工程としては、該酵素をコードする塩基配列を含む無細胞酵素合成系が例示され、好ましくは該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程、天然の該酵素を形成する微生物等該酵素をコードする塩基配列を有する微生物を用いる工程、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いる工程等が例示される。
【００７６】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を含む無細胞酵素合成系を採用する場合には、上記の第一の酵素をコードする塩基配列を、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、又は昆虫細胞由来等の公知の無細胞酵素合成系に使用すれば良い。
又、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程を採用する場合には、上記の第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列をベクターに挿入して宿主微生物に導入させて形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて該酵素を形成する例が示される。
【００７７】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体は、該塩基配列が挿入されたベクターである組換体ファージ又は組換体プラスミドを宿主に導入した細胞、又は微生物を含む。第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列は、一部又は全てを合成して使用することができ、好ましくは第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を、遺伝子供与体から公知の方法で取得して使用する。遺伝子供与体としては、第一の反応に使用する酵素を形成する細胞であれば限定されないが、好ましくは、上記の探索し選別した天然の微生物や、バイオインフォマティクス手法で情報を得た生物を含む第一の反応に使用する酵素を形成する生物が挙げられる。
【００７８】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を挿入するベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドのうち遺伝子組換用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、大腸菌に属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。又、プラスミドベクター
としては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴベクター、又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主とするプラスミドベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。
このようなベクターを、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列の切断に使用した制限酵素により生成する塩基配列の末端と、同じ末端を生成する制限酵素により切断してベクター断片を作成し、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列の断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼにより常法に従って結合させて第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を目的のベクターに挿入して、組換体ファージ又は組換体プラスミドとする。
【００７９】
組換体プラスミドを導入する宿主としては、組換体プラスミドが安定且つ自律的に増殖可能な細胞、又は微生物であれば良く、例えば宿主微生物が大腸菌に属する微生物の場合、大腸菌 ＢＬ２１、大腸菌 ＤＨ１、大腸菌 ＪＭ１０９、大腸菌 ＪＭ１０１、大腸菌 Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００等を含む、大腸菌Ｂ株、Ｋ株、Ｃ株やそれらの溶原菌が利用できる。又、宿主微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物の場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等、放線菌に属する微生物の場合、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４等、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する微生物の場合、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＮＶＳＣ１等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主微生物とする事が好ましい。
【００８０】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いて該酵素を形成させる事ができる好適なその他の例としては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における組換酵素を形成する方法が挙げられる（特許第３９４４５７７号公報、特許第３７９３８１２号公報）。具体的には、低温での組換酵素の形成に適したｐＴｉｐ ＱＣ１やｐＴｉｐ ＱＣ２等のプラスミドベクターに、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を挿入し、その組換体プラスミドをリゾチーム感受性微生物に導入した形質転換体を用いる方法が示される。リゾチーム感受性微生物としてはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい（特許第３８７６３１０号公報）。
【００８１】
第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物や、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体等の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。培養温度は宿主となる微生物が発育し、第一の反応に使用する酵素が形成される範囲で適宜変更し得るが、大腸菌の場合、下限が１０℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上、上限が４５℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３８℃以下である。放線菌の場合、下限が４℃以上、好ましくは１０℃以上、更に好ましくは２０℃以上、上限が５０℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３７℃以下である。培養条件は、条件によって多少異なるが、第一の反応に使用する酵素が最高形成量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれば良く、大腸菌の場合、通常は下限が１０時間以上、好ましくは１２時間以上、更に好ましくは１７時間以上、上限が６０時間以下、好ましくは４８時間以下、更に好ましくは３０時間以下である。放線菌の場合、通常は下限が１７時間以上、好ましくは２０時間以上、更に好ましくは２４時間以上、上限が８０時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下である。培地のｐＨは菌が発育
し、第一の反応に使用する酵素を形成する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌や放線菌の場合、好ましくは下限としてｐＨ５．８以上、好ましくはｐＨ６．２以上で、上限としてｐＨ８．５以下、好ましくはｐＨ７．５以下である。
【００８２】
第一の反応に使用する酵素は、上記のように形成された該酵素を取得する工程を含む方法によって製造できるが、簡便には殺菌、非殺菌を問わず菌体を含む細胞等のままであっても良いが、培養不純物や細胞破砕物等を軽く除いた不純物がある酵素とすることも好ましい。更に該酵素の粗酵素は、目的や用途等場合によっては実質的に不純物を包含しないようにすることも好ましいが、通常は、例えば５０％以上、７０％以上、９５％以上の各種の純度にすることが例示される。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥやＨＰＬＣ等の公知の方法で確認すれば良い。
【００８３】
第一の反応に使用する酵素を、上記の探索し選別した天然の微生物や、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体の微生物等を培養し取得することによって製造する場合、まず、該微生物等を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該酵素を形成させ、菌体内に形成される場合には培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集する。次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ、及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該酵素を濃縮するか濃縮する事なく、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して第一の反応に使用する酵素を沈殿させ回収する。この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水的クロマトグラフィーにより処理して、第一の反応に使用する酵素を得ることができる。又、これらの方法を適宜組み合わせて行うことができる。又、本発明の酵素が培養液中に形成される場合には、培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を除去し、培養液について、前記菌体内に形成される場合と同様の処理を行えばよい。
かくして得られる第一の反応に使用する酵素は安定化剤又は賦型剤として、各種の塩類、糖類、酵素、脂質、界面活性化剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形の第一の反応に使用する酵素を得ることができ、又、適宜凍結乾燥を行う場合、安定化剤又は賦型剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を０．５から１０％程度添加しても良い。
【００８４】
本発明の第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属が好ましく、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａが更に好ましく、 Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ ３１０９株が最も好ましい。本発明の第一の反応に使用する好適な酵素はＰＰＤＫである。
【００８５】
本発明の第一の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号１のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号２の塩基配列である。該塩基配列は、Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９９年、３９９巻、３２３頁により明らかにされていたが、該塩基配列がコードする酵素の性質はこれまでに解明されておらず、単にＰＰＤＫらしいとして予想されていた。すなわち、配列表配列番号２の塩基配列がコードする配列表配列番号１のアミノ酸配列が、［式１］の反応を触媒することは従来全く知られていなかった。
【００８６】
本発明の第二の反応に使用する酵素の製造方法は、本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法と同様である。本発明の第二の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物は、真核生物由来が好ましく、酵母由来が更に好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来が特に好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来が最も好ましい。本発明の第二の反応に使用する好適な酵素はＮＭＮＡＴａｓｅである。本発明の第
二の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号６のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号７の塩基配列である。該塩基配列は、Ｅｍａｎｕｅｌｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００３年、２７巻、３５７頁によりｙＮＭＮＡＴ−２として明らかにされ、該塩基配列がコードする酵素は、ＮＭＮＡＴａｓｅであるがｄＡＴＰも基質にすると報告されていた。したがって、当業者は当該先行文献から該塩基配列がコードするＮＭＮＡＴａｓｅを使用した場合、ｄＡＴＰやｄＮＴＰｓの影響を受けない選択的なピロリン酸を測定する事は不可能であると、考えるのが自然と思われる。
【００８７】
本発明の第三の反応を酵素的に行う場合、該酵素の製造方法は、本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法と同様である。
【００８８】
本発明の第四の反応を酵素的に行う場合、該酵素の製造方法は、本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法と同様である。
【００８９】
ところで、従来、核酸の測定方法は、放射性同位元素、ビオチン、酵素等で標識された核酸を測定対象となる核酸と結合させ測定する方法等が公知である。これらの方法は、結合物と未結合物との分離操作が必要で、測定のための特別な施設、装置等が必要である。エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）等の蛍光物質を使用して、測定対象となる核酸を染色する測定方法も同様である。
【００９０】
一方、ピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ピロリン酸にピロフォスファターゼを作用させ、生成したリン酸を検出する方法が公知である（特開平７−５９６００号）。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料や試薬成分中に存在する可能性のあるリン酸の消去が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ピロリン酸にＡＴＰスルフリラーゼを作用させた後、ルシフェラーゼを利用して、生成するＡＴＰを発光で検出する方法（ＷＯ９２／１６６５４）、及びピルビン酸リン酸ジキナーゼとルシフェラーゼを使用する方法（特許文献１）が公知である。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在するｄＡＴＰの消去が必要である場合があるし、発光を測定する装置が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用する方法が公知である（特許文献２）。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在する可能性のあるヒポキサンチンの消去が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、キナーゼ、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素を使用する方法が公知である（特許文献３）。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在するｄＡＴＰの消去が必要である。
【００９１】
本発明の測定方法は、例えば試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中において、ピロリン酸と上記の物質が共存しても影響を受けない選択的なピロリン酸の測定方法となり得る。又、本発明の測定方法は、還元型ＮＴＢ類を検出する場合、ピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定が可視光で測定できるために、目視、又は汎用機器で測定でき簡便である。
従って本発明の測定方法は、例えば上記核酸増幅法による核酸増幅反応中又は反応後の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例等に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されない。尚、常法に従い、と記述した技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）や上記の蛋白質・酵素の基礎実験法、市販の各種酵素、又は、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。又、以下に示した測定値等は測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得る。
尚、本発明で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等であり、市販で容易に入手できるものを使用することができる。ＤＳＭ菌株はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨで購入できる。ＡＴＣＣ菌株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで購入できる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されない。
【００９３】
［ＰＰＤＫ活性測定方法１］
［ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液１］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
５ｍＭ ＰＥＰ
２ｍＭ ＡＭＰ
４ｍＭ ＭｇＣｌ２
４ｍＭ ピロリン酸
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ
１ｍｌのＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液１を層長１ｃｍの石英セル中で３７１分間予備加温した後、５，０００Ｕ／ｍｌの乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を３μｌ添加し、更に３７℃で１分間加温した。これに適当な濃度に希釈したＰＰＤＫを１０μｌ添混和して酵素反応を開始し、反応開始後３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光変化をＡｓ／ｍｉｎとした。ＰＰＤＫの代わりに精製水を用いた場合の１分間当たりの吸光変化をＡｂ／ｍｉｎとした。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は［式５］で算出した。本明細書では特に記載がない場合、ＰＰＤＫの活性測定はＰＰＤＫ活性測定方法１を使用した。
［式５］
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．２２｝×１．０１３／０．０１×希釈倍数
【００９４】
［ＰＰＤＫ活性測定方法２］
上記ＰＰＤＫ活性測定方法１は、連続反応なので一度に多くの試料の活性測定が出来るが、乳酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を考慮し３７℃で測定するため、至適温度が５０℃以上と予想される本発明のＰＰＤＫ本の性質を正しく調べることは難しい。ＰＰＤＫ活性測定方法２は第一反応がＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａの生育至適温度（８０℃）に近い温度（５０℃）なので、本発明のＰＰＤＫの正しい性質を調べることが出来る可能性があるが、一方でトリクロロ酢酸を使用するので取扱上注意が必要であり、又、二段階で活性測定するため、一度に多くの試料の活性を測定するには操作が煩雑である。本実施例では、必要に応じてＰＰＤＫ活性測定方法２を使用し、使用した場合は特に記載する。
［ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ ７．５
５ｍＭ ＰＥＰ
２ｍＭ ＡＭＰ
５ｍＭ ＭｇＣｌ２
５ｍＭ ピロリン酸
酵素液と蒸留水を加えて４００μｌとする。
［ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−２］
１．１５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ８．０
０．１３５ｍＭ ＮＡＤＨ
５Ｕ／ｍｌ 乳酸デヒドロゲナーゼ
遠心上精４００μｌを加えて１ｍｌとする。
ＰＰＤＫ活性測定方法２は、酵素反応を2段階に分けて活性測定する方法である。適当な濃度に希釈したＰＰＤＫを用いてＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１を調製した。このとき、酵素を加えずに調製したものを「ブランク」とし、酵素を加えたものを「テスト」とした。予め５０℃に調製したＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１にＰＰＤＫ液と蒸留水を添加して４００μｌとして反応を開始し、１０分間インキュベートして１段階目の反応を行った。続いてこの反応液を氷冷して５０％トリクロロ酢酸を５０μｌ加えて反応を停止した。反応液を４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた上清４００μｌを、新しいエッペンドルフチューブに予め準備しておいたＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−２に移した。これを３７℃で１０分間インキュベートすることにより２段階目の反応を行った後、「ブランク」と「テスト」の３４０ｎｍの吸光度を測定してそれぞれＡｂ、Ａｔとした。酵素活性１単位（１ユニット）は、３７℃で１分間に１マイクロモルのＰＥＰをピルビン酸に変化させる酵素量として、Ａｂ−Ａｔより酵素活性を求めた（ＮＡＤＨのミリモル吸光係数は６．２２）。
【００９５】
［ＮＭＮＡＴａｓｅ活性測定方法］
［ＮＭＮＡＴａｓｅ活性測定用反応試薬混合液］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
２ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＡＴＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ株式会社製）
１ｍｌのＮＭＮＡＴａｓｅ活性測定用反応試薬混合液を層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１分間予備加温した後、適当な濃度に希釈したＮＭＮＡＴａｓｅを３０μｌ混和して酵素反応を開始し、反応開始後３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光変化をＡｓ／ｍｉｎとした。ＮＭＮＡＴａｓｅの代わりに精製水を用いた場合の１分間当たりの吸光変化をＡｂ／ｍｉｎとした。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は［式６］で算出した。
［式６］
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．３｝×１．０３／０．０３×希釈倍数
【００９６】
［蛋白質濃度測定法］
精製前の酵素、粗酵素液、および精製酵素等の蛋白質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキット（ブラッドフォード法）を用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡをスタンダードとして算出した。
［実施例１］
＜ＤＮＡの抽出＞
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ ３１０９株の菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。更に等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して水層を回収し
た。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（本明細書ではＴＥと記載する場合がある）に溶解し、適量のＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体をＴＥに溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）とエタノールを加え、撹拌後、−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ ３１０９株のＤＮＡ標品を得た。
【００９７】
［実施例２］
＜ＰＣＲ法による配列表配列番号１に示す遺伝子の増幅＞
ｐＥＴ２１ａ（＋）又はｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニングサイトＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に配列表配列番号２の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号８と９のプライマーを設計した。ｐＵＣ１１８を使用する場合は、マルチクローニングサイトＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入するように配列表配列番号１０と９のプライマーを設計した。ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約２．７ｋｂｐのＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。
【００９８】
［実施例３］
＜発現ベクターとのライゲーション＞
実施例２で精製した配列表配列番号８と９のプライマーを使用したＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより常法に従って制限酵素処理した（インサートＡ）。実施例２で精製した配列番号１０と９のプライマーを使用したＰＣＲ産物はＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより常法に従って制限酵素処理した（インサートＢ）。これらインサートＡとＢは、例えばＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。インサートＡはＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＥＴ２１ａ（＋）又はｐＥＴ２８ａ（＋）と常法に従ってライゲーションし、ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２又はｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２を作成した。インサートＢはＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＵＣ１１８と常法に従ってライゲーションし、ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２を作成した。コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換え体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスしてインサート配列が正しい事を確認した。
【００９９】
［実施例４］
＜ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２とｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２の発現チェック＞
ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２を大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（トリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール５ｍｌを蒸留水０．９Ｌに溶かして１２１℃２０分間滅菌した。リン酸一水素カリウム１２．５ｇ、リン酸二水素カリウム３．８ｇを蒸留水０．１Ｌに溶かして１２１℃２０分間滅菌した。それぞれを室温まで冷却後混合して１ＬのＳＢ培地とした。）に植菌した。３７℃で１３時間培養後にＩＰ
ＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えて、更に５時間培養を行った。培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１００】
［実施例５］
＜ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２の発現チェック＞
ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２を大腸菌 ＪＭ１０９に常法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地に植菌した。３７℃で１８時間培養後に培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１０１】
［実施例６］
＜粗酵素液の熱処理＞
実施例５で得た粗酵素液は８０℃で１５分間熱処理し遠心分離して、上清を粗精製液とした。この粗精製液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１に示した。
【０１０２】
［実施例７］
＜ＰＰＤＫの精製１＞
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のＵｎｏＱ（登録商標）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに、実施例６の粗精製液をアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を用いたベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１００倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析する事により脱塩した。
１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のハイドロキシアパタイトを用いたカラムに上記の脱塩したＰＰＤＫをアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で洗浄した後、３００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いてベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１ｍＭのＤＴＴを含む１００倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析、又は１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨで平衡化したゲル濾過剤であるＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用して脱塩し、精製酵素とした。
本実施例により、５００ｍｌの培養液から収率約１５％で比活性約５Ｕ／ｍｇの精製酵素を約５ｍｇ得た。ＰＰＤＫ活性測定方法２で測定した。
【０１０３】
［実施例８］
＜ＰＰＤＫの精製２＞
０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したシグマアルドリッチ社のニッケルアフィニティーゲルクロマトグラフィーカラムに、実施例４の粗酵素液をアプライした。０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でカラムをベッド体積の５倍以上洗浄した後、０．２ＭのＮａＣｌと０．２Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で吸着画分の溶出を行った。
溶出した活性画分に２０％の硫酸アンモニウムを添加し、２０％の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したフェニルトヨパールクロマトグラフィーカラム（東ソー社製）にアプライした。２０％の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でカラムをベッド体積の５倍以上洗浄
した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を用いたベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。溶出した活性画分は実施例７と同様の方法で脱塩した。収率は約５０％だった。本実施例により得られたＰＰＤＫの比活性は、７Ｕ／ｍｇだった。ＰＰＤＫ活性測定方法２で測定した。
【０１０４】
［実施例９］
＜ＰＰＤＫ活性の確認＞
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＡＭＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＰＥＰ、１ｍＭ ピロリン酸からなる反応液に実施例７で得たＰＰＤＫ １０μｌを添加し、５０℃で２０分間反応した。反応液をＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０（昭和電工株式会社製）を用いたＨＰＬＣで分析した。移動相は２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ３）で、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温で２６０ｎｍの吸光を測定した。反応液の代わりにＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシン混合液を用いて、同条件下、ＨＰＬＣで分析し、分離した結果を図２に示す。図３は反応前の反応液を分離した結果である。図４は反応後の反応液を分離した結果である。本結果より、ＡＭＰを基質とした時にＡＴＰが反応によって生じており、ＰＰＤＫ活性が確認できた。
【０１０５】
［実施例１０］
＜ＰＰＤＫ凍結保存安定性＞
実施例７の脱塩していないＰＰＤＫ（１．２Ｕ／ｍｌ）を−２０℃で凍結保存して２週間後に融解し、凍結保存前後の活性を比較した結果、凍結保存後も９４％の残存活性があった。
【０１０６】
［実施例１１］
＜ＰＰＤＫ冷蔵保存安定性＞
実施例７で得た脱塩していないＰＰＤＫ（１．２Ｕ／ｍｌ）を４℃で保存して、０、５、８、１２、１９、２７日後に活性測定した結果を図５に示した。ＰＰＤＫは冷蔵保存下で、２７日保存後も８０％以上の残存活性があった。また、該ＰＰＤＫを同条件で９ヶ月保存後も８０％以上の残存活性があった。ＰＰＤＫ活性は、測定方法２で測定した。
【０１０７】
［実施例１２］
＜熱安定性１＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫ約０．２ｍｇ／ｍｌを５０℃から１００℃の範囲で２０分間熱処理した。未処理の酵素活性を１００％として残存活性（％）を図６に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは９０℃、２０分間の熱処理で、９０％以上の活性を保持した。ＰＰＤＫ活性を、測定方法２で測定した。
【０１０８】
［実施例１３］
＜熱安定性２＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫ 約０．２ｍｇ／ｍｌを８０℃又は９０℃で、０から１時間の範囲で熱処理した。未処理の酵素活性を１００％として残存活性（％）を図７に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは９０℃、1時間の熱処理で、７０％以上の活性を保持し、８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持した。ＰＰＤＫ活性を測定方法２で測定した。
【０１０９】
［実施例１４］
＜至適ｐＨ＞
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１における緩衝液をｐＨ６からｐＨ７の範囲はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図８中○印）、ｐＨ７からｐＨ８の範囲はＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（図８中△印）、ｐＨ８からｐＨ９の範囲はグリシルグリシン／ＮａＯ
Ｈ（図８中□印）に変更して活性測定を行い、本発明のＰＰＤＫの至適ｐＨを測定した。図８に、最大活性を１００％とした相対活性（％）としてその結果を示した。本発明のＰＰＤＫの至適ｐＨはｐＨ７からｐＨ７．５であった。ＰＰＤＫ活性を、測定方法２で測定した。実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを使用した。
【０１１０】
［実施例１５］
＜ｐＨ安定性＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを約０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、１００ｍＭのｐＨ４からｐＨ６．５はクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（図９中○印）、ｐＨ６．５からｐＨ７はイミダゾール／ＨＣｌ緩衝液（図９中△印）、ｐＨ７からｐＨ８はＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（図９中□印）、ｐＨ８からｐＨ９はグリシルグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（図９中●印）、ｐＨ９からｐＨ１１はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液に溶解し（図９中■印）、５０℃２０分間で保存し、最大活性が得られた場合を１００％として残存活性（％）を図９に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持した。ＰＰＤＫ活性を測定方法２で測定した。
【０１１１】
［実施例１６］
＜補酵素特異性＞
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１におけるＡＭＰを、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及びＵＭＰに変更して活性測定を行った。その結果、本発明のＰＰＤＫはマグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及びＵＭＰに作用しなかった。実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを使用した。
【０１１２】
［実施例１７］
＜金属イオン＞
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１におけるＭｇＣｌ２を、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣａＣｌ２、及びＺｎＣｌ２に変更して、予め１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２Ｍの硫酸ナトリウムを含む１００倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で２回透析した本発明のＰＰＤＫの活性測定を行った。その結果、本発明のＰＰＤＫは、金属イオンの無い場合、ＣａＣｌ２及びＺｎＣｌ２の場合は活性を示さなかったが、ＣｏＣｌ２の場合、ＮｉＣｌ２の場合は、ＭｇＣｌ２の場合を１００％として、それぞれ７４％、２９％の相対活性を示した。実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを使用した。
【０１１３】
［実施例１８］
＜分子量＞
分子量の計算値及び測定値は以下のとおりである。
（１）アミノ酸の一次配列からの計算値：９８，１０２
（２）実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定値（図１の矢印）：８３，０００
【０１１４】
［実施例１９］
＜Ｋｍ値＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫのＰＥＰ、ピロリン酸及びＡＭＰに対する見かけのＫｍを、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより算出した。ＰＥＰ、ピロリン酸及びＡＭＰに対する見かけのＫｍは、それぞれ０．３２ｍＭ、１．１２ｍＭ、０．０６５ｍＭであった。ＰＰＤＫ活性を測定方法２で測定した。
【０１１５】
［実施例２０］
＜ＮＭＮＡＴａｓｅの調整＞
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株、３−２株、及び６−２株のＤＮＡを、実施例１と同様の方法で得た。ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に配列表配列番号７の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号１１と１２のプライマーを設計した。実施例２と同様の方法でｐＵＣ１１８／Ｓｃ１−２、ｐＵＣ１１８／Ｓｃ３−２、及びｐＵＣ１１８／Ｓｃ６−２を作成し、実施例５と同様の方法でＮＭＮＡＴａｓｅの粗酵素液を調整した。該粗酵素液は１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着して１５及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩してＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２を得た。１００ｍｌの培養液から本実施例により得られたＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２は、約６０Ｕ、７００Ｕ、４００Ｕであった。
【０１１６】
［実施例２１］
＜ＮＭＮＡＴａｓｅのｄＮＴＰｓ／ＡＴＰの比較＞
下記の［組成物］を作成し、ＮＭＮＡＴａｓｅの、ｄＮＴＰｓ／ＡＴＰ（ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率）を測定した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物］を１８０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、５分反応、測光ポイントは２−３とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料として、１ｍＭのｄＮＴＰｓとＡＴＰを使用した。尚、レートＡ（Ｒａｔｅ Ａ）とは測定機器（日立７０８０形自動分析機）の測定方法の１つであり、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。その結果、ＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２のｄＮＴＰｓ／ＡＴＰは順に、１．７、１．３、０．８％であった。
［組成物］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
１Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２
【０１１７】
［実施例２２］
＜ピロリン酸の測定１＞
下記の［組成物］を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、２ポイントエンド、１０分反応、測光ポイントは１６−３１とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてピロリン酸を図１０の横軸の範囲となるよう
に調整して、測定した結果を図１０に示した。本発明の組成物を使用して本発明の測定方法によりピロリン酸の測定が実施できた。図中○、△、□は順にＰＰＤＫの［組成物Ａ］中の濃度１、５、１０Ｕ／ｍｌを示す。尚、２ポイントエンド（２ｐｏｉｎｔ ｅｎｄ）とは測定機器（日立７０８０形自動分析機）の測定方法の１つであり、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１、５、１０Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整した脱塩後のＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
【０１１８】
［実施例２３］
＜ピロリン酸の測定２＞
下記の［組成物］を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイントは２７−３０とし、精製水によるブランクを差し引いた。０から２０μＭのピロリン酸を試料とした場合の測定結果を図１１の○で、０から４０μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合の測定結果を図１１の●で示した。０から２０μＭのピロリン酸を試料とした場合、Ｙ＝０．４Ｘ＋５、Ｒ２＝０．９９６、０から４０μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合、Ｙ＝０．４Ｘ＋１４、Ｒ２＝０．９９１、となり、ｄＮＴＰｓの共存下でも精度良くピロリン酸が測定できた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー
０．５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
５Ｕ／ｍｌ ＤＩ（旭化成ファーマ社製）
【０１１９】
［実施例２４］
＜ピロリン酸の測定３＞
ＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度を測定した。ＰＣＲは、ＴＯＹＯＢＯ社製Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑを使用して以下の［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］で実施した。ＰＣＲ条件は９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分を２５サイクル実施し、図１２の横軸に示した各サイクル数の時に［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］を一部抜き取り被検液とし、下記の［組成物］でピロリン酸濃度を検出した。Ｔｅｍｐｌａｔｅは実施例２０のｐＵＣ１１８／Ｓｃ６−２とし、配列表配列番号７の遺伝子を増幅した。増幅遺伝子は約１．５ｋｂｐであった。定量は、２０μＭのピロリン酸水溶液をキャリブレーターとして測定して被検液中のピロリン酸濃度を算出した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプルとして被検液を２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイント２７−３０とし、０サイクル目の被検液の値をブランクとして差し引いた。
その結果を図１２に示したように、本発明の組成物を使用してＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度を、可視光で測定することができた。本発明の測定方法は、上記核酸増幅法による核酸増幅反応中の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である事が確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］
×１０ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ １０μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
２．５Ｕ／μｌ Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μｌ
５０μｌ プライマーＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄ ２μｌ
５０μｌ プライマーＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ ２μｌ
２００ｎｇ／μｌ ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ １μｌ
蒸留水 ７９μｌ
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー
０．５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
５Ｕ／ｍｌ ＤＩ（旭化成ファーマ社製）
【０１２０】
［実施例２５］
＜ピロリン酸の測定４＞
ＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液中のピロリン酸濃度を測定した。測定方法は実施例２４と同様である。Ｔｅｍｐｌａｔｅは実施例５のｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２とし、配列表配列番号２の遺伝子を増幅した。
その結果を図１３に示した様に、本発明の組成物を使用してＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度が可視光で測定できた。本発明の測定方法は、上記核酸増幅
法による核酸増幅反応中の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である事が確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
【０１２１】
［実施例２６］
＜ＰＰＤＫ発現の改良＞
配列表配列番号１に示す遺伝子の中で、大腸菌において使用頻度が低いと考えられるコドン（ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＴＡ、ＣＧＧ、ＣＣＣ、ＣＵＡ）全てを大腸菌において使用頻度が高いコドンに変換して配列表配列番号３の遺伝子を作成した。コドン変換は、合成プライマーを使用したＰＣＲによる常法で行った。実施例２、３、５、６と同様の方法で粗精製液を得て、図１４に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥで、配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（図中（Ａ））と配列表配列番号３（図中（Ｂ））の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量を比較した。配列表配列番号３の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量は、配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量に比べて改善された。又、配列表配列番号３の遺伝子によるＰＰＤＫの培養力価は、配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫの培養力価に比べて約３倍高くなった。
【０１２２】
［実施例２７］
＜リアルタイムＰＣＲとの比較＞
ＰＣＲによる核酸増幅を、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを用いた蛍光と、本発明のピロリン酸濃度測定方法を用いた可視光で検出して比較した。ＰＣＲはタカラバイオ株式会社のＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）を用いて、下記の［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］を調整して行った。Ｔｅｍｐｌａｔｅは約２２０ｂｐのフラグメントを挿入したｐＵＣ１１９を使用した。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを用いたＰＣＲは、タカラバイオ株式会社のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍを使用したリアルタイムＰＣＲで蛍光を検出した。通常のＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９８００ Ｆａｓｔ サーマルサイクラーを使用した。各サイクル数の時に［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］を一部抜き取り被検液とし、下記の［組成物］で日立７０８０形自動分析機を使用して、本発明のピロリン酸濃度測定方法を用いて、可視光で検出した。ＰＣＲ条件は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）の取扱説明書に記載のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍの標準プロトコール、すなわち９５℃１０秒の後、９５℃５秒と６０℃２０秒を４０サイクル実施するシャトルＰＣＲとした。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９８００ Ｆａｓｔ サーマルサイクラーを用いたＰＣＲ条件も同様であった。日立７０８０形自動分析機のパラメーターはサンプルとして被検液を２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイント２３−２１とし、０サイクル目の被検液の値をブランクとして差し引いた。
その結果を図１５に示した。図１５中●がタカラバイオ株式会社のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍを使用したリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅を検出した結果で、○は本発明のピロリン酸濃度測定組成物とピロリン酸濃度測定方法を用いて核酸増幅を検出した結果である。リアルタイムＰＣＲでは約１５サイクル目から、本発明の測定方法は、約１７サイクル目から核酸増幅を検出できた。このように、本発明の測定方法は、従来から汎用されているリアルタイムＰＣＲとほぼ同時期に核酸増幅を検出することができ、しかも、本発明は可視光によるピロリン酸の生成量を指標とすることから、リアルタイムＰＣＲよりも簡便に核酸を測定することができ、好適な測定方法であることが確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］
×１ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
０．２μＭ Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
０．２μＭ Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｃｅ Ｐｒｉｍｅｒ
約５０ｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ
［組成物Ａ］
１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
１．５ｍＭ ＰＥＰ
１．５ｍＭ ＡＭＰ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
１．５Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
２ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
２ｍＭ コール酸
０．０５％ ニトロテトラゾリウムブルー
１Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
１０Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ＤＩ（旭化成ファーマ社製）
【０１２３】
［実施例２８］
＜ピロリン酸の測定３＞
下記の［組成物］を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイントは２７−３０とし、精製水によるブランクを差し引いた。０から１μＭのピロリン酸を試料とした場合の測定結果を図１８の○で、０から２μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合の測定結果を図１８の●で示した。０から１μＭのピロリン酸を試料とした場合、Ｙ＝１１．０Ｘ＋０．８、Ｒ２＝０．９９８、０から２μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合、Ｙ＝９．８４Ｘ＋８．０、Ｒ２＝０．９９９、となり、ｄＮＴＰｓの共存下でも精度良くピロリン酸が測定できた。Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ（シグマ社製）、ＡＤＰ−ＨＫＴＩＩ（ＡＤＰ依存型のヘキソキナーゼ（旭化成ファーマ社製））は試料中のＡＴＰやｄＡＴＰを消去するために添加した。Ｐ１，Ｐ５，−ｄｉａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａｐ５Ａ）はＭｙｏｋｉｎａｓｅの阻害剤である。
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
０．２％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
２Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫＴＩＩ
３Ｕ／ｍｌ Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ
１ｍＭ コール酸
０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー
０．５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ ＤＩ
０．２％ ＴＸ−１００
１Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
４０μＭ Ａｐ５Ａ
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
高感度、簡便、且つ選択的なピロリン酸を測定する方法を提供できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明はピロリン酸を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリン酸を酵素的に測定する従来技術としては、（ｉ）ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、及びルシフェラーゼを使用する方法（特許文献１）、（ｉｉ）ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用する方法（特許文献２）、又は（ｉｉｉ）キナーゼ、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素を使用する方法（特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−０９７４７１号公報
【０００４】
【特許文献２】特開２００３−１７４９００号公報
【０００５】
【特許文献３】特開２００６−１８７２５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
試料中のピロリン酸を測定する新規で有用な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、及び脱水素酵素を使用して試料中のピロリン酸を測定する新規な方法を見出した。次に、ＮＡＤサイクリング反応を利用して、該方法を、高感度且つ簡便な方法となすことに成功した。更に、トリ燐酸化デオキシリボ核酸類（以下、ｄＮＴＰｓということがある）に比べてＡＴＰに対して選択的に反応するニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼを発見し、該酵素を用いることで試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中にｄＮＴＰｓやリン酸等が存在している場合においても、試料中のピロリン酸を選択的に測定できる方法を確立して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
下記（１）から（４）の各工程を含むピロリン酸の選択的な測定方法。
（１）試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸を、少なくともＡＭＰの存在下、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する第一の反応を含む工程；
（２）上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する第二の反応を含む工程；
（３）上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する第三の反応を含む工程；
（４）上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程；
［１−１］
第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程が、以下の工程を含む［１］に記載の測定方法。（５）ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とＮＡＤ類とする第四の反応を含む工程；
（６）上記第四の反応により生ずる還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩類を検出する工程；
［１−２］
第四の反応により生ずるＮＡＤ類を、第三の反応に用い、第三の反応と第四の反応の間でサイクリング反応をさせる上記［１−１］に記載の測定方法。
［１−３］
第二の反応により生ずるピロリン酸を、第一の反応に用い、第一の反応と第二の反応の間でサイクリング反応をさせる上記［１］から［１−２］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−４］
第一の反応が、更に金属イオンを含む反応である上記［１］から［１−３］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−５］
金属イオンが、マグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンからなる群から選ばれる１種、又は２種以上である上記［１−４］に記載の測定方法。
［１−６］
第一の反応が、更にホスホエノールピルビン酸（本明細書ではＰＥＰと記載する場合がある）を含む反応である上記［１］から［１−５］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−７］
第二の反応が、更に金属イオンを含む反応である上記［１］から［１−６］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−８］
第二の反応に含まれる金属イオンが、マグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンからなる群から選ばれる１種、又は２種以上である上記［１−７］に記載の測定方法。
［１−９］
第二の反応が、更にβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド類（本明細書ではＮＭＮ類と記載する場合がある）を含む反応である上記［１］から［１−８］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１０］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素、又は、〔３〕下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記［１］から［１−９］のいずれか１つに記載の測定方法。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、アデノシン５’一リン酸（本明細書ではＡＭＰと記載する場合がある）に対して特異的に補酵素として作用し、アデノシン５’二リン酸、イノシン５’一リン酸、シチジン５’一リン酸、グアノシン５’一リン酸、チミジン５’一リン酸又はウリジン５’一リン酸（本明細書では、順に、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、ＵＭＰと記載する場合がある）に作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［１−１１］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１０］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１２］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１１］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１３］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１２］のいずれか１つに記載の測定方法。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、又はＵＭＰに作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［１−１４］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、更に以下の《６》又は《７》のいずれかの理化学的性質を有する上記［１］から［１−１３］のいずれか１つに記載の測定方法。
《６》冷凍安定性
−２０℃で２週間保存後、９０％以上の活性を保持する；
《７》冷蔵安定性
４℃で２７日間保存後、８０％以上の活性を保持する；
［１−１５］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属由来である上記［１］から［１−１４］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１６］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来である上記［１］から［１−１５］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１７］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍ ａ ＤＳＭ ３１０９株由来である上記［１］から［１−１６］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１８］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号２又は配列表配列番号３で表される塩基配列である上記［１］から［１−１１］、又は［１−１３］から［１−１７］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−１９］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記［１］から［１−１８］のいずれか１つに記載の測定方法。［１−２０］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、下記の＜ａ＞から＜ｅ＞に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素である上記［１］から［１−１９］のいずれか１つに記載の測定方法。
＜ａ＞Ｖ１３２Ｉ（配列表配列番号６の１３２番目のＶがＩに置換したことを示す。以下同様。）
＜ｂ＞Ｄ２６９Ｖ
＜ｃ＞Ｎ６４Ｙ
＜ｄ＞Ａ６５Ｓ
＜ｅ＞Ａ１０３Ｓ
［１−２１］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号７で表される塩基配列である上記［１］から［１−２０］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２２］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、真核生物由来である上記［１］から［１−２１］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２３］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、酵母由来である上記［１］から［１−２２］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２４］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来である上記［１］から［１−２３］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２５］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である上記［１］から［１−２４］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２６］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下である上記［１］から［１−２５］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２７］
第三の反応が、ＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元し得る酵素により触媒される反応である上記［１］から［１−２６］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２８］
第三の反応が、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される反応である上記［１］から［１−２７］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−２９］
第四の反応におけるＮＡＤＨ還元物質が、ジアホラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ、本明細書では、ＤＩと記載する場合がある）である上記［１］から［１−２８］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−３０］
試料が、ｄＮＴＰｓを含有する試料である、上記［１］から［１−２９］のいずれか１つに記載の測定方法。
［１−３１］
上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程が、ｄＮＴＰｓを含有する工程である、上記［１］から［１−２９］のいずれか１つに記載の測定方法。［１−３２］
ｄＮＴＰｓが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる群から選ばれる１種又は２種以上である、上記［１−３０］または［１−３１］に記載の測定方法。
［１−３３］
ｄＮＴＰｓが、少なくともｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物である、上記［１−３０］または［１−３１］に記載の測定方法。
［１−３４］
ｄＮＴＰｓが、それぞれ０．４ｍＭ以下である上記［１−３０］から［１−３３］のいずれか１つに記載の測定方法。
［２］
上記［１］から［１−３４］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定する核酸の検出又は定量方法。［２−１］
上記［１］から［１−３４］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定し、核酸増幅前の試料におけるピロリン酸の値をブランク値として引くことを特徴とする核酸の検出又は定量方法。
［２−２］
上記［１］から［２−１］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を測定するピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法。
［２−３］
上記［１］から［２−２］のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を測定し、核酸増幅前の試料におけるピロリン酸の値をブランク値として引くことを特徴とするピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法。
［３］
少なくとも以下の（１）から（７）を含む組成物。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（５）ＮＭＮ類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
［３−１］
更に以下の（８）と（９）を含む上記［３］に記載の組成物。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ニトロブルーテトラゾリウム塩類（本明細書ではＮＴＢ類と記載する場合がある）
［３−２］
下記の（Ａ）と（Ｂ）の２種の試薬を含む組成物。
（Ａ）少なくとも以下の（１）から（４）を含む第１の試薬。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（Ｂ）少なくとも以下の（５）から（７）を含む第２の試薬。
（５）ＮＭＮ類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
［３−３］
更に、第２の試薬に、以下の（８）と（９）を含む上記［３−２］に記載の組成物。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ＮＴＢ類
［３−４］
金属イオンがマグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンのうち、いずれか１つ以上である上記［３］から［３−３］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−５］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、
〔１〕配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素、又は、〔３〕下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記［３］から［３−４］のいずれかに１つ記載の組成物。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＵＭＰに作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［３−６］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［３］から［３−５］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−７］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素である上記［３］から［３−６］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−８］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、下記の《１》から《５》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、のいずれかの酵素である上記［３］から［３−７］のいずれか１つに記載の組成物。
《１》至適ｐＨ
ｐＨ７から７．５の間に存在する；
《２》ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
《３》熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、且つ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
《４》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＵＭＰに作用しない；
《５》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする；
［３−９］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、更に以下の《６》又は《７》のいずれかの理化学的性質を有する上記［３］から［３−８］のいずれか１つに記載の組成物。
《６》冷凍安定性
−２０℃で２週間保存後、９０％以上の活性を保持する；
《７》冷蔵安定性
４℃で２７日間保存後、８０％以上の活性を保持する；
［３−１０］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属由来である上記［３］から［３−９］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１１］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来である上記［３］から［３−１０］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１２］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＳＭ ３１０９株由来である上記［３］から［３−６］、又は［３−８］から［３−１１］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１３］
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号２又は配列表配列番号３で表される塩基配列である上記［３］から［３−１２］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１４］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、のいずれかの酵素である上記［３］から［３−１３］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１５］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、下記の＜ａ＞から＜ｅ＞に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素である上記［３］から［３−１２］、又は［３−１４］のいずれか１つに記載の組成物。
＜ａ＞Ｖ１３２Ｉ
＜ｂ＞Ｄ２６９Ｖ
＜ｃ＞Ｎ６４Ｙ
＜ｄ＞Ａ６５Ｓ
＜ｅ＞Ａ１０３Ｓ
［３−１６］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号７で表される塩基配列である上記［３］から［３−１５］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１７］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、真核生物由来である上記［３］から［３−１６］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１８］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、酵母由来である上記［３］から［３−１７］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−１９］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来である上記［３］から［３−１８］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２０］
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である上記［３］から［３−１９］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２１］
第三の反応が、ＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元し得る酵素により触媒される反応である上記［３］から［３−２０］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２２］
第三の反応が、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される反応である上記［３］から［３−２１］のいずれか１つに記載の組成物。
［３−２３］
第四の反応におけるＮＡＤＨ酸化物質が、ＤＩである上記［３］から［３−２２］のいずれかに記載の組成物。
［３−２４］
更に下記の（Ｃ）を含む上記［３］から［３−２３］のいずれか１つに記載の組成物。
（Ｃ）少なくとも既知量のピロリン酸を含むキャリブレーション試薬。
［４］
核酸を検出又は定量するための組成物である、上記［３］から［３−２４］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］
上記［４］に記載の組成物を用いて上記［２］又は［２−１］に記載の方法を行うことを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
［６］
ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下であるニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、簡便、高感度、且つ選択的なピロリン酸を測定する方法を提供できる。また、該ピロリン酸の測定方法を用いれば、核酸増幅工程における核酸の検出又は定量方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２で発現したＰＰＤＫの素精製液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。矢印がＰＰＤＫである。
【図２】ＨＰＬＣで、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンを分離した結果を示す。
【図３】反応液の反応前をＨＰＬＣで分離した結果を示す。
【図４】反応液の反応後をＨＰＬＣで分離した結果を示す。
【図５】ＰＰＤＫの冷蔵保存（４℃）安定性を示す。
【図６】ＰＰＤＫの熱安定性を示す。
【図７】ＰＰＤＫの熱安定性を示す。
【図８】ＰＰＤＫの至適ｐＨを示す。
【図９】ＰＰＤＫのｐＨ安定性を示す。
【図１０】ピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１１】ｄＮＴＰｓ存在下と非存在下のピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１２】ＰＣＲによる核酸増幅反応中の、ピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１３】ＰＣＲによる核酸増幅反応中の、ピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【図１４】配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫとの発現量（Ａ）と、配列表配列番号３の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（Ｂ）を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１５】タカラバイオ株式会社のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍを使用したリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅を検出した結果（●）と、本発明のピロリン酸濃度測定組成物とピロリン酸濃度測定方法を用いて核酸増幅を検出した結果（○）を示す。
【図１６】第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示す。
【図１７】第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示す。
【図１８】ｄＮＴＰｓ存在下と非存在下のピロリン酸濃度の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一態様は、下記（１）から（４）の各工程を含む試料中のピロリン酸の選択的な測定方法である。（１）試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸をピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する第一の反応を含む工程；（２）上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する第二の反応を含む工程；（３）上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する第三の反応を含む工程；（４）上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程。
本発明は更に、（５）ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とＮＡＤ類とする第四の反応を含む工程、を含み、第四の反応により生ずる還元型ＮＴＢ類（本明細書では、ＮＴＢＨ２と記載する場合がある）を検出する選択的ピロリン酸を測定する方法も挙げられる。
【００１１】
ピロリン酸（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｈ４Ｐ２Ｏ７）は、・|オキソ−ヘキサオキソ二リン酸や二リン酸等と記載される場合もある。本発明におけるピロリン酸は、公知のピロリン酸を含み、由来、剤型、添加物、又は商品名等により限定されない。
【００１２】
本発明におけるピロリン酸は、例えば各種核酸増幅法によるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を増幅したときに生成するピロリン酸や、例えば細胞中等でＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応の生成物として合成されるピロリン酸を含む。すなわち、本発明おけるピロリン酸は、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ （ＩＣＡＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＴＭＡ）、及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＲＣ）等の核酸増幅法による生成物であるピロリン酸や、結晶沈着性関節炎の指標となる関節液中のピロリン酸等を含む。このように、ピロリン酸を測定すれば、各種核酸増幅法による核酸の検知や定量、核酸の増幅の検出、結晶沈着性関節炎の検出などが可能となる。
【００１３】
本発明の試料は特に限定されないが、上記の核酸増幅法による核酸増幅反応中の被検液の他、関節液、全血、血漿、血清、血球、髄液、リンパ液、尿等を含む生体試料や研究用試料及びそれらの抽出物等を挙げることができる。その他の試料としては、例えば、海水、天然水、果汁、飲料、廃液等が挙げられる。又、本発明の試料は、ピロリン酸が含まれているかどうかには限定されず、含まれている可能性があれば好ましい。通常は上記の核酸増幅法による核酸増幅反応中や反応後の被検液にはピロリン酸が含まれている可能性があるし、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼが直接又は間接的に接触する（した）生体由来物質や微生物等の生物が直接又は間接的に接触する（した）物質もピロリン酸が含まれている可能性のある試料である。これらの試料は、測定に影響のある不純物を除く前処理行程があっても良い。
【００１４】
本発明のｄＮＴＰｓは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる群から選ばれる１種又は２種以上であり、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物であってもよい。ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合比は任意であり、等モルの混合物でも良い。
【００１５】
ｄＮＴＰｓは、試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中に存在する場合と存在しない場合があり、存在する場合の濃度は任意であるが、それぞれの濃度が４ｍＭ以下であれば好ましく、１ｍＭ以下であれば更に好ましく、０．４ｍＭ以下であれば最も好ましい。
【００１６】
本発明の測定方法は、ピロリン酸の生成又は生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法であって、上記の核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を選択的に測定する検出又は定量方法も含む。又、生体内や生体外における天然の核酸増幅反応による生成物であるピロリン酸を選択的に測定する検出又は定量方法も含む。
【００１７】
本発明の第一の反応は、試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸をピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する反応である。
本発明の第一の反応に使用する酵素は、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（Ｐ
ｙｒｕｖａｔｅ ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ （本明細書ではＰＰＤＫと記載する場合がある））でも良く、該ＰＰＤＫは、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ）や、ＥＣ ２．７．９．１等と表現される場合がある。本発明のＰＰＤＫの酵素作用は、例えばマグネシウムイオン等の金属イオンの存在下で、[式１]に示す通りである。例えば、ＡＴＰ、ピルビン酸、及びリン酸を基質として用いたときの反応式は[式１]の左方向である。又、例えば、ＡＭＰ、ＰＥＰ、及びピロリン酸を基質として用いたときの反応式は[式１]の右方向である。本発明の第一の反応式は、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを生じさせる反応であることから右方向の反応式である。
[式１]
ＡＭＰ ＋ ＰＥＰ ＋ ピロリン酸＜＝＞ＡＴＰ ＋ ピルビン酸 ＋ リン酸
【００１８】
本発明のＰＰＤＫは、上記[式１]の触媒作用を示す酵素であれば由来、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されない。該ＰＰＤＫとしては、上記の《１》から《５》の理化学的性質や本願明細書に記載された該ＰＰＤＫの性質のいずれかを有する酵素であれば好ましい。すなわち、上記[式１]の触媒作用を有すれば好ましく、その他の性質の有無は特に限定されないが、上記の《１》から《５》の理化学的性質や本願明細書に記載された該ＰＰＤＫの性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていることも好ましい。更に該ＰＰＤＫは、上記の《６》又は《７》性質を備えていることも好ましい。本発明のＰＰＤＫにおいては、本願明細書に記載された該ＰＰＤＫの性質のその他の理化学的性質や物性等を採用する事も出来る。
【００１９】
そのようなＰＰＤＫとしては、例えば、トウモロコシ葉由来（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，２８６２−２８６７（１９７３））、サトウキビ葉由来（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １１４，１１７−１２５ （１９６９））、菊科植物由来（Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１，２９ ５−２９７ （１９９０））、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ由来（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０，７２１−７２９ （１９７１））、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ由来（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２，１９９−２１２（１９７５））、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ由来（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １０４，２１１−２１８ （１９７０））、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ属由来（特開平０８−１６８３７５号公報）等の公知のＰＰＤＫやそれらのアイソザイムがある。
【００２０】
本発明のＰＰＤＫは、上記以外の天然の生物由来であっても良いが、微生物由来の場合は、例えばＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、好ましくはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、最も好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ３１０９株由来である。該菌株は後述の菌株バンクで購入できるし、他の菌株バンクで購入できる該菌株との同等株や、公知の方法で分離した同等株を用いて、本発明のＰＰＤＫの各性質を有する酵素を生産し得ることを確認して、本発明の測定方法に使用することもできる。
【００２１】
本発明の第一の反応において使用するＰＰＤＫの量は、本発明のピロリン酸測定ができれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、ＰＰＤＫの純度や種類、及び／又は経済的な事情等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の第一の反応において、更に、ＡＭＰ、金属イオン、又はピルビン酸を使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００２２】
本発明の第一の反応において使用するＰＰＤＫの量は、例えば、下限が０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、１００Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは２０
Ｕ／ｍｌ以下である。
【００２３】
本発明の第一の反応は、少なくともＡＭＰの存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＡＭＰの量は、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００２４】
本発明の第一の反応は、少なくともＰＥＰ等の高エネルギーリン酸化合物の存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＰＥＰの量は、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００２５】
本発明の第一の反応は、少なくとも金属イオンの存在下であることが好ましく、マグネシウムイオン、コバルトイオン、又はニッケルイオンのうちいずれか一つ以上の金属イオンであっても良いがマグネシウムイオンが特に好ましい。上記条件下で使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限がＡＭＰの濃度に対して０．２当量以上、好ましくは０．５当量以上、更に好ましくは０．８当量以上であり、上限が５当量以下、好ましくは３当量以下、更に好ましくは２当量以下である。最も好ましい濃度はリン酸供与体の１当量である。
【００２６】
本発明のＰＰＤＫは、上記[式１]の触媒作用を示す酵素であればアミノ酸配列は限定されず、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列の場合は、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であっても良い。該アミノ酸配列は、配列表配列番号４のアミノ酸配列及び配列表配列番号５のアミノ酸配列を含む配列が好ましい。又、該アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＳＭＰＧＭＭＤＴ、又はアミノ酸配列ＬＮＬＧＬＮＤを含むと更に好ましい。本発明のＰＰＤＫのアミノ酸配列として典型的な例は配列表配列番号１のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列表配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加の例としては、ＰＰＤＫのＮ末端側及び／又はＣ末端側にチオレドキシン等機能性酵素やその他のアミノ酸配列からなる部分を付加する例が挙げられ、融合蛋白質とすることも好ましく、その付加する部分により精製や確認等をすることのできるタグと呼ばれる部分を融合させ、場合によっては、そのタグ部分を削除しても、場合によってはその全部又は一部が残る場合も例示される。タグは、例えば、ＰＰＤＫを菌体外やペリプラズムへ輸送する為の約２０個のシグナルペプチドや、効率的な精製を行う為の５から１０個のＨｉｓの付加でも良いし、それらを直列して付加しても良い。又、それらのアミノ酸配列の間等に数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加することもできる。
【００２８】
上述の付加の例と同様に、欠失、又は置換を行うことができ、例えば、本発明のＰＰＤＫの本質的な機能とは無関係の数個のアミノ酸からなるドメインが存在する場合や、配列表配列番号１のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。又、欠失、置換もしくは付加を適宜組み合わせることも可能である。更に、配列表配列番号１のアミノ酸配列において、その配列表配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側、及びＣ末端側は、アミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む、すなわち付加していても良く、その付加アミノ酸残基としてはシグナルペプチド、ＴＥＥ配列、Ｓタグ、又はＨｉｓタグ等が挙げられる。配列表配列番号１のアミノ酸を欠失する場合は、例えば、Ｎ末端側又はＣ末端側から順に削除する例が挙げられる。配列表配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端のＭｅｔの欠失や、Ｎ末端がアシル基やアルキル基等による修飾を受ける等の翻訳後修飾された酵素も本発明のＰＰＤＫである。又、ＰＰＤＫを公知の方法で無水コハク酸やＰＥＧ等により化学修飾して、ＰＰＤＫの至適
ｐＨや安定性等の性質を利用しやすいように変化させることも可能である。上記の場合、ＰＰＤＫの分子量は変化する場合があり、例えば、後述のｐＥＴベクターを利用してＮ末端にＨｉｓタグを付加すると分子量が約１，０００大きくなる。本発明のＰＰＤＫのアミノ酸配列の二次構造や三次構造は、特に限定されない。
【００２９】
本発明のＰＰＤＫの塩基配列は、本発明のＰＰＤＫをコードする塩基配列であれば特に限定されないが、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の場合、配列表配列番号１と実質的に均等なアミノ酸配列をコードする塩基配列であっても良く、例えば配列表配列番号１のアミノ酸配列のうち、上記第一の反応の触媒作用に関与しない一部のアミノ酸を変異させたもの、例えば１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の均等物をコードする塩基配列であっても良い。好ましくは、配列表配列番号４及び配列表配列番号５や上記のそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるように行うことが特に好ましい。配列表配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列表配列番号２の塩基配列や配列表配列番号２の塩基配列を適当な宿主のコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列が例示される。そのような例としては、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて配列表配列番号２の塩基配列を変更した塩基配列表配列番号３が例示される。
【００３０】
ＰＰＤＫをコードする塩基配列の調製においては、通常用いられる公知の遺伝子操作手段を利用することができ、例えば、部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定塩基の断片を人工変異塩基で置換する等の種々の方法が例示される。
【００３１】
本発明の第二の反応は、上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する反応である。
【００３２】
本発明の第二の反応に使用する酵素は、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄｅｎｙｌｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ（本明細書ではＮＭＮＡＴａｓｅと記載する場合がある））でも良く、該ＮＭＮＡＴａｓｅは、ＮＡＤ（＋） ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅや、ＥＣ
２．７．７．１等と表現される場合がある。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの酵素作用は、例えばマグネシウムイオン等の金属イオンの存在下で、[式２]に示す通りである。例えば、ＡＴＰ、及びＮＭＮを基質として用いたときの反応式は[式２]の右方向である。又、例えば、ＮＡＤ及びピロリン酸を基質として用いたときの反応式は[式２]の左方向である。本発明の第二の反応式は、右方向の反応式である。
[式２]
ＡＴＰ ＋ ＮＭＮ ＜＝＞ ＮＡＤ ＋ ピロリン酸
【００３３】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、上記[式２]の触媒作用を示す酵素であれば由来、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されず、その他の性質の有無には特に限定されないが、本願明細書に記載された該ＮＭＮＡＴａｓｅの性質のうち、任意の１つ又は２つ以上を備えていることも好ましい。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅにおいては、本願明細書に記載された該ＮＭＮＡＴａｓｅの性質のその他の理化学的性質や物性等を採用する事も出来る。そのようなＮＭＮＡＴａｓｅとしては、例えば、古細菌であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ
ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７９巻、７７１８頁、１９９７年）、古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７９巻、７７１８頁、１９９７年）、ヒト由来等の公知のＮＭＮＡＴａｓｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、３７７巻、３１７頁、２００４年）がある。尚、ヒト等を含む哺乳類や酵母等のＭＮＡＴａｓｅに、公知のアイソザイムがあればそれらを採用することもできる。
【００３４】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、例えば天然の生物由来であっても良いが、真核生物由来が好ましく、微生物由来の場合は、酵母由来が好ましい。更に好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属が、最も好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。該菌株の取得方法は上記ＰＰＤＫの場合と同様である。
【００３５】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、後述の方法など常法により探索したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株、３−２株、及び６−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅを使用しても良い。
【００３６】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの、ＡＴＰとｄＮＴＰｓの基質特異性が交差する場合、すなわちＡＴＰとｄＮＴＰｓがＮＭＮＡＴａｓｅの基質となりえる場合、ｄＮＴＰｓの消去反応を本発明の第一から第四の反応のいずれか一つ以上と同時に、又は別異に行えばよい。好ましくは、ＡＴＰとｄＮＴＰｓの基質特異性の交差は小さい方が良い。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅは、例えば、ｄＮＴＰｓ／ＡＴＰ（ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率）として７０％以下が好ましく、３０％以下であれば更に好ましく、１０％以下であれば特に好ましく、最も好ましくは５％以下である。
【００３７】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列として典型的な例は、配列表配列番号６である。
配列表配列番号６のアミノ酸配列であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ６−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列は、Ｅｍａｎｕｅｌｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００３年、２７巻、３５７頁により公知となったｙＮＭＮＡＴ−２と同一であった。本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列は、配列表配列番号６のアミノ酸配列の１３２番目のＶがＩに置換され（本明細書ではこのような置換を、置換前のアミノ酸、置換される位置、置換後のアミノ酸の順序からなる表記「Ｖ１３２Ｉ」等と記載する場合がある）、且つＤ２６９Ｖであった。又、本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅのアミノ酸配列は、Ｎ６４Ｙ、Ａ６５Ｓ、且つ、Ａ１０３Ｓであった。従って、配列表配列番号６のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換の例としては、Ｖ１３２Ｉ、Ｄ２６９Ｖ、Ｎ６４Ｙ、Ａ６５Ｓ、Ａ１０３Ｓ等が挙げられる。
【００３８】
配列表配列番号６のアミノ酸配列を有するＮＭＮＡＴａｓｅは、Ｅｍａｎｕｅｌｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００３年、２７巻、３５７頁に従えば製造できるし、本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株、及び３−２株由来のＮＭＮＡＴａｓｅは、上記配列表配列番号６のアミノ酸配列の１３２番目のＶ、２６９番目のＤ、１０３番目のＡ、６４番目のＮ、６５番目のＡを、ＰＣＲや市販のキット等を利用した部位特異アミノ酸置換等の常法にてアミノ酸置換すれば製造できる。
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの塩基配列については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。
【００３９】
本発明のＮＭＮＡＴａｓｅの塩基配列としては、配列表配列番号７が例示される。
本発明の第二の反応において使用するＮＭＮＡＴａｓｅの量については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明の第二の反応において、更に、ＮＭＮ類、又は金属イオンを使用する場合、その種類と量についても同様である。
【００４０】
本発明の第二の反応において使用するＮＭＮＡＴａｓｅの量は、例えば、下限が０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．３Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、上
限は特に設けないが、２０Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは５Ｕ／ｍｌ以下である。
【００４１】
本発明の第二の反応は、少なくともβ−ニコチンアミドモノヌクレオチドやニコチン酸モノヌクレオチド等のＮＭＮ類の存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＮＭＮ類の量は、例えば、ＮＭＮの場合、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００４２】
本発明の第二の反応は、少なくとも金属イオンの存在下であることが好ましく、マグネシウムイオンが特に好ましい。上記条件下で使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限が０．０５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００４３】
尚、本発明の第二の反応において、例えばマグネシウムイオンとＮＭＮの存在下、第一の反応により生ずるＡＴＰをＮＭＮＡＴａｓｅに接触させると、ピロリン酸とＮＡＤが生成される。又、例えばマグネシウムイオンとニコチン酸モノヌクレオチドの存在下、第一の反応により生ずるＡＴＰをＮＭＮＡＴａｓｅに接触させると、ピロリン酸とデアミドＮＡＤが生成される。
【００４４】
本発明の第三の反応は、上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する反応である。
本発明の第三の反応におけるＮＡＤ類は、ＮＡＤまたはデアミドＮＡＤ（ＮＡＡＤ）等が挙げられ、そのうちいずれか一つ以上であっても良いがＮＡＤが特に好ましい
【００４５】
本発明の第三の反応において、ＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する方法は公知の方法であれば特に限定されず、本発明のＮＡＤ還元物質を利用してＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する。該方法は、酵素的であっても非酵素的であっても良いが、酵素的にＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する場合は、例えばＮＡＤ類を補酵素とする酵素を使用すれば良い。そのような酵素には脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が例示される。
[式３]
基質 ＋ ＮＡＤ類 ＜＝＞ 酸化された基質 ＋ ＮＡＤＨ類
【００４６】
本発明の第三の反応を酵素的に行う場合、使用する脱水素酵素は上記[式３]の触媒作用を示す酵素であれば、酵素名、ＥＣ番号、由来、アミノ酸配列、塩基配列、又は製造方法等により限定されない。そのような脱水素酵素としては、例えばｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（本明細書ではＨＳＤと記載する場合がある）が好ましく、更に好ましくは３α−ＨＳＤ、３β−ＨＳＤ、１７β−ＨＳＤ、１１β−ＨＳＤ、１６α−ＨＳＤ、２０α−ＨＳＤ、７α−ＨＳＤ、１２α−ＨＳＤ、７β−ＨＳＤ、又は１２β−ＨＳＤが挙げられ、特に好ましくは３α−ＨＳＤと１２α−ＨＳＤである。
【００４７】
本発明の第三の反応において、例えば脱水素酵素を使用する場合、脱水素酵素の量については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明の第三の反応において、更に、使用する脱水素酵素の反応に必要な基質や補酵素等の種類と量についても同様である。
本発明の第三の反応において、例えば１２α−ＨＳＤを使用する場合、使用する１２α−ＨＳＤの量は、例えば、下限が０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、５０Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは２０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下である。
【００４８】
本発明の第三の反応は、例えば１２α−ＨＳＤを使用する場合、少なくとも１２α−ＨＳＤの基質の存在下であることが好ましく、その基質は３α−、７α−、又は１２α−ヒドロキシ胆汁酸やコール酸やデオキシコール酸等が挙げられる。上記条件下で使用する１２α−ＨＳＤの基質の量は、例えば、コール酸の場合、下限が０．１ｍＭ以上、好ましくは０．２ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、上限は特に設けないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。これらの基質が本発明の各反応を阻害する場合は、濃度を調整したり、基質を変更したりすればよい。
１２α−ＨＳＤを使用する場合の一例として、コール酸（３α、７α、１２α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−５β−ｃｈｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）を基質にした場合、生成物は３α、７α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｘｏ−５−β−ｃｈｏｌａｎａｔｅである。
【００４９】
本発明の第四の反応は、ＮＴＢ類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ＮＴＢ類とＮＡＤ類とする反応である。
本発明の第四の反応におけるＮＴＢ類は、１，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｆｏｒｍａｚａｎ、１，５−Ｂｉｓ（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌｆｏｒｍａｚａｎ、１，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−３−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｆｏｒｍａｚａｎ等のホルマザン類や２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、２，３，５−Ｔｒｉｓ（ｐ−ｔｏｌｙｌ）ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、２，３−Ｂｉｓ（３−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ等のテトラゾリウム塩等、各種酵素の検出試薬、酸化還元系発色試薬として広く一般に用いられている複素環式有機化合物を含む。該ＮＴＢ類や還元型ＮＴＢ類は、水に不溶性、難溶性、又は可溶性のいずれでも良い。
【００５０】
本発明の第四の反応におけるＮＡＤＨ類とは、本発明の第三の反応の場合と同様である。
本発明の第四の反応において、ＮＴＢ類の存在下ＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に酸化する方法は公知の方法であれば特に限定されず、本発明のＮＡＤＨ酸化物質を利用してＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に酸化する（ＮＴＢ類を還元型ＮＴＢ類に還元する）。該方法は、酵素的であっても非酵素的であっても良い。本発明の第四の反応は、[式４]に示す通りである。
[式４]
ＮＴＢ類 ＋ ＮＡＤＨ類 ＜＝＞ 還元型ＮＴＢ類 ＋ ＮＡＤ類
【００５１】
本発明の第四の反応を酵素的に行う場合、使用する酵素は上記[式４]の触媒作用を示す酵素であれば、酵素名、ＥＣ番号、由来、アミノ酸配列、塩基配列、又は製造方法等により限定されない。酵素的にＮＴＢ類の存在下ＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に酸化する場合は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ｑｕｉｎｏｎｅ）、ＮＡＤＰＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ等のジアホラーゼ類を使用できる。これらの酵素は、順にＥＣ １．６．５．２、ＥＣ １．６．９９．１、ＥＣ
１．６．９９．３と表現される場合がある。
【００５２】
本発明の第四の反応において、例えばＤＩ類を使用する場合、該ＤＩ類の量については、上記ＰＰＤＫの場合と同様である。本発明の第四の反応において、更に、ＤＩ類の反応に必要な基質や補酵素等を使用する場合は、その種類と量についても同様である。
【００５３】
本発明の第四の反応において、例えばＤＩを使用する場合、使用するＤＩの量は、例えば、下限が０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１Ｕ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが、５０Ｕ／ｍｌ以下、好ましくは２０Ｕ／ｍｌ以下、更に好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以下である。
【００５４】
本発明の第四の反応は、例えばＤＩを使用する場合、例えば少なくともＮＴＢ（ｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｌｕｅ （ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）と記載される場合もある））の存在下であることが好ましく、上記条件下で使用するＮＴＢ類の基質の量は、存在すれば良いが、下限が０．００１％以上、好ましくは０．００５％以上、更に好ましくは０．０１％以上、上限は特に設けないが、好ましくは１％以下、更に好ましくは０．５％以下、特に好ましくは０．１％以下である。還元型ＮＴＢ類が難水溶性の場合は、後述する界面活性剤を使用する等、公知の方法で可溶化すればよい。
【００５５】
本発明における選択的ピロリン酸の測定方法には、試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中において、ピロリン酸の測定値に正誤差又は負誤差を与える可能性のある物質（共存物質）がピロリン酸と共存する場合に、ピロリン酸を選択的に測定する方法を含む。すなわち、本発明おける選択的ピロリン酸の測定方法には、共存物質の影響を受けない、又は受け難い、選択的なピロリン酸の測定方法を含む。該共存物質としては、例えば、ｄＮＴＰｓが挙げられる。
【００５６】
本発明のＮＡＤＨ類を検出する測定方法には、定性反応によりＮＡＤＨ類を検出する測定方法を含み、好ましくは第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類の変化量を検出する測定方法であり、更に好ましくは、第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類の変化量を検出し定量する測定方法である。第四の反応により生ずる還元型ＮＴＢ類を検出する測定方法の場合も同様である。
【００５７】
定量する測定方法とは、例えば次の通りである。ピロリン酸が含まれている可能性のある試料を、上記第一の反応から第三の反応を含む工程で処理し、上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出し、既知の濃度のピロリン酸を含む試料について同様に反応させて検出したＮＡＤＨ類の濃度と比較することにより試料中に含まれていたピロリン酸を定量する。また、ＮＡＤＨの検出は、上記第四の工程により還元型ＮＴＢ類として検出することもできる。試薬ブランクを差し引く場合は、ピロリン酸が含まれている可能性のある試料の代わりに、蒸留水等ピロリン酸が含まれていない試料を同様の工程で処理し差し引けばよい。
【００５８】
ＮＡＤＨ類は公知の方法で検出すれば良く、ＮＡＤＨ類を直接検出する場合のほか、ＮＡＤＨ類をさらに他の反応に供して間接的に検出してもよい。間接的に検出する方法としては、本発明の上記第四の反応を含む場合が挙げられ、ＮＡＤＨ類をＮＴＢ類と反応させて、還元型ＮＴＢ類として検出すれば、目視で検出できるので簡便である。その他の場合は、ＮＡＤＨ類や還元型ＮＴＢ類の変化に伴うそれら該測定対象の吸収スペクトルや吸光強度の変化を、装置を用いて光学的方法で検出する方法が例示され、ＮＡＤＨ類、又は還元型ＮＴＢ類に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出する方法でも良い。ＮＡＤＨ類の蛍光の変化を検出することも可能である。酸化還元に伴う電位差を測定する場合は電極を使用すれば良い。
【００５９】
本発明における測定方法では、第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でサイクリング反応を採用することができる。ここでいうサイクリング反応とは、第二の反応を含む工程により生ずるピロリン酸を、再度第一の反応を含む工程で反応させることをいう。図１６に第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示した。このサイクリング反応ではＮＡＤ、Ｐｙｒｕｖａｔｅ、およびリン酸（Ｐｉ）が増幅される。従って、該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、ＮＡＤが増幅されるので、本発明の測定方法の測定感度の向上が期待できる。
また、本発明における測定方法では、第四の反応を含む工程により生ずるＮＡＤ類を、
再度第三の反応を含む工程で反応させ、第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応を採用する事ができる。このサイクリング反応では還元型ＮＴＢ類が増幅される。該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、本発明の測定方法の、測定感度の向上が期待できる。図１７に第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示した。このサイクリング反応では３α、７α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｘｏ−５−β−ｃｈｏｌａｎａｔｅ、還元型ＮＴＢ（ＮＴＢＨ２）が増幅されることになる。従って、該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、還元型ＮＴＢが増幅されるので、本発明の測定方法の測定感度の向上が期待できる。
さらに、本発明における測定方法では、第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でのサイクリング反応と、第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でのサイクリング反応を同時に採用するダブルサイクリング反応を採用する事ができる。すなわち、第二の反応を含む工程により生じるピロリン酸を第一の反応を含む工程で反応させ、第二の反応を含む工程によりＮＡＤを増幅し、かつ、第四の反応を含む工程により生じるＮＡＤを第三の反応を含む工程で反応させ、第四の反応を含む工程により還元型ＮＴＢ類を増幅する該ダブルサイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、本発明の測定方法の、測定感度の向上が期待できる。
【００６０】
本発明の測定方法は、液相、気相、又は固相等やそれぞれの臨界面で実施すれば良いが、液相で実施する事が好ましい。液相には水相、有機溶媒相等が考えられ、本発明の測定方法を水相で実施する場合、水相には例えば水、水溶液や適宜の有機溶媒を含有した水性媒体が例示されるが、適宜のｐＨ緩衝剤を用いることが好ましい。ｐＨ緩衝剤を使用する場合、その種類は目的のｐＨを保つことができ、試料中のピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、酢酸／ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液が例示できる。本発明の測定方法を実施する際のｐＨは、試料中のピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、下限としてｐＨ５以上、好ましくはｐＨ５．５以上、更に好ましくはｐＨ６以上が例示され、上限としてはｐＨ１０以下、好ましくはｐＨ９以下が、更に好ましくはｐＨ８．５以下が例示される。ｐＨ緩衝剤の濃度は目的のｐＨを保つことができ、ピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、下限として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下が、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。
【００６１】
本発明の測定方法のその他の好ましい液相として、例えばゾル・ゲルが挙げられる。ゾル・ゲルとするためには、例えば、寒天等の多糖類を利用すれば良い。ゾル・ゲルと乳濁液を区別する場合は、乳濁液として実施しても良い。乳濁液とするためには、例えば、有機溶媒等を利用すれば良いし、両親媒性物質を利用すればミセルとしても実施できる。いずれの場合も、ｐＨ緩衝剤を用いる場合は上記と同様である。
【００６２】
本発明の測定方法における、第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程はそれぞれ別異の反応槽（相）で実施できるが、同一反応槽（相）で実施する事が好ましい。又、第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程は、不連続に実施できるが、連続して実施する事が好ましい。又、第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程は、第一の反応を含む工程、第二の反応を含む工程、第三の反応を含む工程の順に行っても良く、二つ以上の行程を同時に行ったり、単独に行う行程と組み合わせたりする等、目的、試料、使用する装置等に応じて好ましい結果が得られるように決定し得る。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
【００６３】
本発明の第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の反応時間は、試料中のピロリン酸が測定できれば特に限定されないが、それぞれ、下限が１５秒以上、好ましくは１
分以上、更に好ましくは３分以上である。上限は特に設けないが、好ましくは３０分以下、更に好ましくは１５分以下、特に好ましくは１０分以下である。第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程の反応時間は不均等であっても良い。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
【００６４】
本発明の測定方法を実施するための反応の温度は、試料中のピロリン酸が測定できる温度であれば特に限定されないが、酵素を使用する場合は使用する酵素の作用温度の範囲内が好ましく、下限は１０℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上が、上限は７０℃以下、好ましくは５０℃以下、更に好ましくは４０℃以下である。第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程の温度は不均等であっても良い。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
【００６５】
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、少なくとも以下の（１）から（７）を含む。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）
（４）ＰＰＤＫ（ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ）
（５）ＮＭＮ類（β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類）
（６）ＮＭＮＡＴａｓｅ（ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）
（７）ＮＡＤ還元物質（例えばデヒドロゲナーゼ）
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、更に以下の（８）と（９）を含んでも良い。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ＮＴＢ類
【００６６】
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、好ましくは少なくとも以下の（Ａ）と（Ｂ）を含む。
（Ａ）少なくとも以下の（１）から（４）を含む第１の試薬。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ＰＥＰ
（４）ＰＰＤＫ
（Ｂ）少なくとも以下の（５）から（７）を含む第２の試薬。
（５）ＮＭＮ類
（６）ＮＭＮＡＴａｓｅ
（７）ＮＡＤ還元物質
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物（Ｂ）は、更に以下の（８）と（９）を含んでも良い。
（８）ＮＡＤＨ酸化物質
（９）ＮＴＢ類
【００６７】
上記本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、適宜ｐＨ緩衝剤を含む事も好ましい。
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、更に下記の（Ｃ）を含んでも良い。
（Ｃ）少なくとも既知量のピロリン酸を含むキャリブレーション試薬。
【００６８】
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物に含まれる、本発明の金属イオン、ＡＭＰ、ＰＥＰ、ＰＰＤＫ、ＮＭＮ類、ＮＭＮＡＴａｓｅ、ＮＡＤ還元物質、ＮＡＤＨ酸化物質、
及び、ＮＴＢ類の種類と量、すなわち、該組成物がピロリン酸測定用の組成物となり得る為に有効な上記物質の量、及びｐＨ緩衝剤の条件等は、上記の本発明の測定方法と同様である。
【００６９】
本発明のピロリン酸測定用の組成物及びキャリブレーション試薬は、液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品の凍結物が好ましく、液状品の凍結乾燥品が更に好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。更に別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。本発明のピロリン酸測定用の組成物は、一試薬の組成物としても良いが、通常は上記のように二試薬以上に分離すると好ましい。又、試薬の品質向上等を目的としてＮａＣｌやＫＣｌ等の塩、ＴＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤、及び／又はアジ化ナトリウムや抗性物等防腐剤を混合しても良い。又、例えば、ＰＯＣのキャピラリーへの使用、又は酵素センサーとしての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも濃い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状組成物としたりして使用することが好ましい。塩を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は５から２００ｍＭの範囲であり、界面活性剤を混合する場合、種類や濃度は限定されないが、通常は０．００１％から２％である。アジ化ナトリウムや抗性物等を含む場合、種類や濃度は防腐効果があれば限定されないが、例えばアジ化ナトリウムの場合、下限は０．００５％以上、好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．０３％以上、上限は１％以下、好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．１％以下である。例えば抗生物質の場合、下限は５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上、上限は１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７５μｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは６０μｇ／ｍｌ以下である。
【００７０】
本発明のキャリブレーション試薬は、少なくとも既知量のピロリン酸を含む試薬で良いが、好ましくはｐＨ緩衝剤、アジ化ナトリウムや抗生物等の防腐剤、糖等の安定化剤を含む試薬である。ｐＨ緩衝剤を含む場合、種類や濃度等の条件等は、上記の本発明の測定方法と同様である。安定化剤や防腐剤を含む場合は上記の本発明の組成物と同様である。
該既知量は特に限定されないが、例えばピロリン酸の場合、下限は０μＭ以上、好ましくは０．１μＭ以上、更に好ましくは０．５μＭ以上、上限は特に設けないが、１ｍＭ以下、好ましくは１００μＭ以下、更に好ましくは５０μＭ以下である。
【００７１】
本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法について説明する。
本発明の第一の反応に使用する酵素は、公知の方法により、自然界から該酵素を形成する天然の生物を探索（スクリーニング）し、該生物の細胞から取得すれば良い。該生物は［式１］を触媒し得る酵素を形成する生物であれば限定されず、例えば真正細菌、真核生物、又は古細菌を含む微生物が挙げられる。微生物を探索の対象とする場合には、微生物は公知の方法に従って自然界から分離すれば良く、高温、低温、高圧、酸、アルカリ環境等の極限環境を含む土壌や水中、落下菌や氷核等を含む空中、又は、生物の体内等から得ることができる。特に高温環境から分離した微生物からは安定性の高い第一の反応に使用する酵素を得ることが期待できる。又、微生物は後述するＡＴＣＣやＤＳＭ等の菌株バンクから購入しても良い。分離した微生物は、限界希釈法やモノコロニーの形成等公知の方法に従って純粋分離し、最少培地、ＬＢ培地、ブイヨン培地等で純粋培養し、その培養物において［式１］の酵素活性の有無を確認する事により、第一の反応に使用する酵素を形成する生物を選別できる。又、集積培養による微生物の取得等、探索の効率を上げる工夫も可能である。［式１］の酵素活性の有無は、後述する酵素活性測定方法等により当業者なら容易に確認できる。
【００７２】
分離した菌株の同定は、実験書（鈴木健一朗ら、微生物の分類・同定実験法―分子遺伝
学・分子生物学的手法を中心に、シュプリンガー・フェアラーク東京）等に従うことにより同定することができ、又、市販の各種菌株同定キット（日本ビオメリュー社等）を使用することによっても可能であり、更には、財団法人日本食品分析センター（東京都渋谷区元代々木町５２番１号）等に依頼して同定しても良い。
【００７３】
かくして得られた本発明の第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物は、更にＮＴＧ等の薬剤、紫外線、及び／又は放射線で処理した変異株とすることもできる。該変異株によって、第一の反応に使用する酵素の生産性を向上することや、第一の反応に使用する酵素の変異体を形成させることが可能であり、安定性、生産性、反応性等が優れた性質を有する変異体を形成することも可能である。
又、得られた該酵素をコードする塩基配列やその情報は、上記の該酵素や該酵素を形成する天然の微生物を用いた、プロテインシーケンス、ＤＮＡシーケンスや公知遺伝子工学手法で取得できる。
【００７４】
本発明の第一の反応に使用する酵素は、公知のバイオインフォマティクス手法によっても取得可能である。配列表配列番号１は、本発明の測定方法の第一の反応において好ましい第一の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の例なので、これらの配列をクエリーとしてＮＣＢＩ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ等のデータベースでＢＬＡＳＴサーチ等にてホモロジー検索を行い、配列表配列番号１に一致する、あるいは類似するアミノ酸配列又は塩基配列をもった蛋白質又は遺伝子、すなわち、第一の反応に使用し得る酵素を生産する可能性のある生物の情報や遺伝子情報を得ることが可能である。
【００７５】
上記の方法で得られた第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物や、第一の反応に使用する酵素の塩基配列、又は塩基配列の情報に基づいて形成された該酵素を取得する工程を含む該酵素の製造方法にて、該酵素を取得できる。該酵素を形成する工程としては、該酵素をコードする塩基配列を含む無細胞酵素合成系が例示され、好ましくは該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程、天然の該酵素を形成する微生物等該酵素をコードする塩基配列を有する微生物を用いる工程、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いる工程等が例示される。
【００７６】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を含む無細胞酵素合成系を採用する場合には、上記の第一の酵素をコードする塩基配列を、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、又は昆虫細胞由来等の公知の無細胞酵素合成系に使用すれば良い。
又、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程を採用する場合には、上記の第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列をベクターに挿入して宿主微生物に導入させて形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて該酵素を形成する例が示される。
【００７７】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体は、該塩基配列が挿入されたベクターである組換体ファージ又は組換体プラスミドを宿主に導入した細胞、又は微生物を含む。第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列は、一部又は全てを合成して使用することができ、好ましくは第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を、遺伝子供与体から公知の方法で取得して使用する。遺伝子供与体としては、第一の反応に使用する酵素を形成する細胞であれば限定されないが、好ましくは、上記の探索し選別した天然の微生物や、バイオインフォマティクス手法で情報を得た生物を含む第一の反応に使用する酵素を形成する生物が挙げられる。
【００７８】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を挿入するベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドのうち遺伝子組換用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、大腸菌に属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。又、プラスミドベクター
としては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴベクター、又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主とするプラスミドベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。
このようなベクターを、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列の切断に使用した制限酵素により生成する塩基配列の末端と、同じ末端を生成する制限酵素により切断してベクター断片を作成し、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列の断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼにより常法に従って結合させて第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を目的のベクターに挿入して、組換体ファージ又は組換体プラスミドとする。
【００７９】
組換体プラスミドを導入する宿主としては、組換体プラスミドが安定且つ自律的に増殖可能な細胞、又は微生物であれば良く、例えば宿主微生物が大腸菌に属する微生物の場合、大腸菌 ＢＬ２１、大腸菌 ＤＨ１、大腸菌 ＪＭ１０９、大腸菌 ＪＭ１０１、大腸菌 Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００等を含む、大腸菌Ｂ株、Ｋ株、Ｃ株やそれらの溶原菌が利用できる。又、宿主微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物の場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等、放線菌に属する微生物の場合、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４等、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する微生物の場合、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＮＶＳＣ１等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主微生物とする事が好ましい。
【００８０】
第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いて該酵素を形成させる事ができる好適なその他の例としては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における組換酵素を形成する方法が挙げられる（特許第３９４４５７７号公報、特許第３７９３８１２号公報）。具体的には、低温での組換酵素の形成に適したｐＴｉｐ ＱＣ１やｐＴｉｐ ＱＣ２等のプラスミドベクターに、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を挿入し、その組換体プラスミドをリゾチーム感受性微生物に導入した形質転換体を用いる方法が示される。リゾチーム感受性微生物としてはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい（特許第３８７６３１０号公報）。
【００８１】
第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物や、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体等の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。培養温度は宿主となる微生物が発育し、第一の反応に使用する酵素が形成される範囲で適宜変更し得るが、大腸菌の場合、下限が１０℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上、上限が４５℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３８℃以下である。放線菌の場合、下限が４℃以上、好ましくは１０℃以上、更に好ましくは２０℃以上、上限が５０℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３７℃以下である。培養条件は、条件によって多少異なるが、第一の反応に使用する酵素が最高形成量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれば良く、大腸菌の場合、通常は下限が１０時間以上、好ましくは１２時間以上、更に好ましくは１７時間以上、上限が６０時間以下、好ましくは４８時間以下、更に好ましくは３０時間以下である。放線菌の場合、通常は下限が１７時間以上、好ましくは２０時間以上、更に好ましくは２４時間以上、上限が８０時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下である。培地のｐＨは菌が発育
し、第一の反応に使用する酵素を形成する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌や放線菌の場合、好ましくは下限としてｐＨ５．８以上、好ましくはｐＨ６．２以上で、上限としてｐＨ８．５以下、好ましくはｐＨ７．５以下である。
【００８２】
第一の反応に使用する酵素は、上記のように形成された該酵素を取得する工程を含む方法によって製造できるが、簡便には殺菌、非殺菌を問わず菌体を含む細胞等のままであっても良いが、培養不純物や細胞破砕物等を軽く除いた不純物がある酵素とすることも好ましい。更に該酵素の粗酵素は、目的や用途等場合によっては実質的に不純物を包含しないようにすることも好ましいが、通常は、例えば５０％以上、７０％以上、９５％以上の各種の純度にすることが例示される。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥやＨＰＬＣ等の公知の方法で確認すれば良い。
【００８３】
第一の反応に使用する酵素を、上記の探索し選別した天然の微生物や、該酵素をコードする塩基配列を導入した形質転換体の微生物等を培養し取得することによって製造する場合、まず、該微生物等を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該酵素を形成させ、菌体内に形成される場合には培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集する。次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ、及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該酵素を濃縮するか濃縮する事なく、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して第一の反応に使用する酵素を沈殿させ回収する。この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水的クロマトグラフィーにより処理して、第一の反応に使用する酵素を得ることができる。又、これらの方法を適宜組み合わせて行うことができる。又、本発明の酵素が培養液中に形成される場合には、培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を除去し、培養液について、前記菌体内に形成される場合と同様の処理を行えばよい。
かくして得られる第一の反応に使用する酵素は安定化剤又は賦型剤として、各種の塩類、糖類、酵素、脂質、界面活性化剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形の第一の反応に使用する酵素を得ることができ、又、適宜凍結乾燥を行う場合、安定化剤又は賦型剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を０．５から１０％程度添加しても良い。
【００８４】
本発明の第一の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属が好ましく、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａが更に好ましく、 Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ ３１０９株が最も好ましい。本発明の第一の反応に使用する好適な酵素はＰＰＤＫである。
【００８５】
本発明の第一の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号１のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号２の塩基配列である。該塩基配列は、Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９９年、３９９巻、３２３頁により明らかにされていたが、該塩基配列がコードする酵素の性質はこれまでに解明されておらず、単にＰＰＤＫらしいとして予想されていた。すなわち、配列表配列番号２の塩基配列がコードする配列表配列番号１のアミノ酸配列が、［式１］の反応を触媒することは従来全く知られていなかった。
【００８６】
本発明の第二の反応に使用する酵素の製造方法は、本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法と同様である。本発明の第二の反応に使用する酵素を形成する天然の微生物は、真核生物由来が好ましく、酵母由来が更に好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属由来が特に好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来が最も好ましい。本発明の第二の反応に使用する好適な酵素はＮＭＮＡＴａｓｅである。本発明の第
二の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号６のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号７の塩基配列である。該塩基配列は、Ｅｍａｎｕｅｌｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００３年、２７巻、３５７頁によりｙＮＭＮＡＴ−２として明らかにされ、該塩基配列がコードする酵素は、ＮＭＮＡＴａｓｅであるがｄＡＴＰも基質にすると報告されていた。したがって、当業者は当該先行文献から該塩基配列がコードするＮＭＮＡＴａｓｅを使用した場合、ｄＡＴＰやｄＮＴＰｓの影響を受けない選択的なピロリン酸を測定する事は不可能であると、考えるのが自然と思われる。
【００８７】
本発明の第三の反応を酵素的に行う場合、該酵素の製造方法は、本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法と同様である。
【００８８】
本発明の第四の反応を酵素的に行う場合、該酵素の製造方法は、本発明の第一の反応に使用する酵素の製造方法と同様である。
【００８９】
ところで、従来、核酸の測定方法は、放射性同位元素、ビオチン、酵素等で標識された核酸を測定対象となる核酸と結合させ測定する方法等が公知である。これらの方法は、結合物と未結合物との分離操作が必要で、測定のための特別な施設、装置等が必要である。エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）等の蛍光物質を使用して、測定対象となる核酸を染色する測定方法も同様である。
【００９０】
一方、ピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ピロリン酸にピロフォスファターゼを作用させ、生成したリン酸を検出する方法が公知である（特開平７−５９６００号）。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料や試薬成分中に存在する可能性のあるリン酸の消去が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ピロリン酸にＡＴＰスルフリラーゼを作用させた後、ルシフェラーゼを利用して、生成するＡＴＰを発光で検出する方法（ＷＯ９２／１６６５４）、及びピルビン酸リン酸ジキナーゼとルシフェラーゼを使用する方法（特許文献１）が公知である。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在するｄＡＴＰの消去が必要である場合があるし、発光を測定する装置が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用する方法が公知である（特許文献２）。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在する可能性のあるヒポキサンチンの消去が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、キナーゼ、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素、及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする脱水素酵素を使用する方法が公知である（特許文献３）。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在するｄＡＴＰの消去が必要である。
【００９１】
本発明の測定方法は、例えば試料中や上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程中において、ピロリン酸と上記の物質が共存しても影響を受けない選択的なピロリン酸の測定方法となり得る。又、本発明の測定方法は、還元型ＮＴＢ類を検出する場合、ピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定が可視光で測定できるために、目視、又は汎用機器で測定でき簡便である。
従って本発明の測定方法は、例えば上記核酸増幅法による核酸増幅反応中又は反応後の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例等に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されない。尚、常法に従い、と記述した技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）や上記の蛋白質・酵素の基礎実験法、市販の各種酵素、又は、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。又、以下に示した測定値等は測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得る。
尚、本発明で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等であり、市販で容易に入手できるものを使用することができる。ＤＳＭ菌株はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨで購入できる。ＡＴＣＣ菌株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで購入できる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されない。
【００９３】
［ＰＰＤＫ活性測定方法１］
［ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液１］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
５ｍＭ ＰＥＰ
２ｍＭ ＡＭＰ
４ｍＭ ＭｇＣｌ２
４ｍＭ ピロリン酸
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ
１ｍｌのＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液１を層長１ｃｍの石英セル中で３７１分間予備加温した後、５，０００Ｕ／ｍｌの乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を３μｌ添加し、更に３７℃で１分間加温した。これに適当な濃度に希釈したＰＰＤＫを１０μｌ添混和して酵素反応を開始し、反応開始後３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光変化をＡｓ／ｍｉｎとした。ＰＰＤＫの代わりに精製水を用いた場合の１分間当たりの吸光変化をＡｂ／ｍｉｎとした。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は［式５］で算出した。本明細書では特に記載がない場合、ＰＰＤＫの活性測定はＰＰＤＫ活性測定方法１を使用した。
［式５］
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．２２｝×１．０１３／０．０１×希釈倍数
【００９４】
［ＰＰＤＫ活性測定方法２］
上記ＰＰＤＫ活性測定方法１は、連続反応なので一度に多くの試料の活性測定が出来るが、乳酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を考慮し３７℃で測定するため、至適温度が５０℃以上と予想される本発明のＰＰＤＫ本の性質を正しく調べることは難しい。ＰＰＤＫ活性測定方法２は第一反応がＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａの生育至適温度（８０℃）に近い温度（５０℃）なので、本発明のＰＰＤＫの正しい性質を調べることが出来る可能性があるが、一方でトリクロロ酢酸を使用するので取扱上注意が必要であり、又、二段階で活性測定するため、一度に多くの試料の活性を測定するには操作が煩雑である。本実施例では、必要に応じてＰＰＤＫ活性測定方法２を使用し、使用した場合は特に記載する。
［ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ ７．５
５ｍＭ ＰＥＰ
２ｍＭ ＡＭＰ
５ｍＭ ＭｇＣｌ２
５ｍＭ ピロリン酸
酵素液と蒸留水を加えて４００μｌとする。
［ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−２］
１．１５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ８．０
０．１３５ｍＭ ＮＡＤＨ
５Ｕ／ｍｌ 乳酸デヒドロゲナーゼ
遠心上精４００μｌを加えて１ｍｌとする。
ＰＰＤＫ活性測定方法２は、酵素反応を2段階に分けて活性測定する方法である。適当な濃度に希釈したＰＰＤＫを用いてＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１を調製した。このとき、酵素を加えずに調製したものを「ブランク」とし、酵素を加えたものを「テスト」とした。予め５０℃に調製したＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１にＰＰＤＫ液と蒸留水を添加して４００μｌとして反応を開始し、１０分間インキュベートして１段階目の反応を行った。続いてこの反応液を氷冷して５０％トリクロロ酢酸を５０μｌ加えて反応を停止した。反応液を４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた上清４００μｌを、新しいエッペンドルフチューブに予め準備しておいたＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−２に移した。これを３７℃で１０分間インキュベートすることにより２段階目の反応を行った後、「ブランク」と「テスト」の３４０ｎｍの吸光度を測定してそれぞれＡｂ、Ａｔとした。酵素活性１単位（１ユニット）は、３７℃で１分間に１マイクロモルのＰＥＰをピルビン酸に変化させる酵素量として、Ａｂ−Ａｔより酵素活性を求めた（ＮＡＤＨのミリモル吸光係数は６．２２）。
【００９５】
［ＮＭＮＡＴａｓｅ活性測定方法］
［ＮＭＮＡＴａｓｅ活性測定用反応試薬混合液］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
２ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＡＴＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ株式会社製）
１ｍｌのＮＭＮＡＴａｓｅ活性測定用反応試薬混合液を層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１分間予備加温した後、適当な濃度に希釈したＮＭＮＡＴａｓｅを３０μｌ混和して酵素反応を開始し、反応開始後３４０ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光変化をＡｓ／ｍｉｎとした。ＮＭＮＡＴａｓｅの代わりに精製水を用いた場合の１分間当たりの吸光変化をＡｂ／ｍｉｎとした。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は［式６］で算出した。
［式６］
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．３｝×１．０３／０．０３×希釈倍数
【００９６】
［蛋白質濃度測定法］
精製前の酵素、粗酵素液、および精製酵素等の蛋白質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキット（ブラッドフォード法）を用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡをスタンダードとして算出した。
［実施例１］
＜ＤＮＡの抽出＞
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ ３１０９株の菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。更に等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して水層を回収し
た。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（本明細書ではＴＥと記載する場合がある）に溶解し、適量のＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体をＴＥに溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）とエタノールを加え、撹拌後、−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＳＭ ３１０９株のＤＮＡ標品を得た。
【００９７】
［実施例２］
＜ＰＣＲ法による配列表配列番号１に示す遺伝子の増幅＞
ｐＥＴ２１ａ（＋）又はｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニングサイトＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に配列表配列番号２の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号８と９のプライマーを設計した。ｐＵＣ１１８を使用する場合は、マルチクローニングサイトＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入するように配列表配列番号１０と９のプライマーを設計した。ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約２．７ｋｂｐのＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。
【００９８】
［実施例３］
＜発現ベクターとのライゲーション＞
実施例２で精製した配列表配列番号８と９のプライマーを使用したＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより常法に従って制限酵素処理した（インサートＡ）。実施例２で精製した配列番号１０と９のプライマーを使用したＰＣＲ産物はＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより常法に従って制限酵素処理した（インサートＢ）。これらインサートＡとＢは、例えばＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。インサートＡはＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＥＴ２１ａ（＋）又はｐＥＴ２８ａ（＋）と常法に従ってライゲーションし、ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２又はｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２を作成した。インサートＢはＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＵＣ１１８と常法に従ってライゲーションし、ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２を作成した。コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換え体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスしてインサート配列が正しい事を確認した。
【００９９】
［実施例４］
＜ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２とｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２の発現チェック＞
ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２を大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（トリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール５ｍｌを蒸留水０．９Ｌに溶かして１２１℃２０分間滅菌した。リン酸一水素カリウム１２．５ｇ、リン酸二水素カリウム３．８ｇを蒸留水０．１Ｌに溶かして１２１℃２０分間滅菌した。それぞれを室温まで冷却後混合して１ＬのＳＢ培地とした。）に植菌した。３７℃で１３時間培養後にＩＰ
ＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えて、更に５時間培養を行った。培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１００】
［実施例５］
＜ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２の発現チェック＞
ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２を大腸菌 ＪＭ１０９に常法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地に植菌した。３７℃で１８時間培養後に培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１０１】
［実施例６］
＜粗酵素液の熱処理＞
実施例５で得た粗酵素液は８０℃で１５分間熱処理し遠心分離して、上清を粗精製液とした。この粗精製液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１に示した。
【０１０２】
［実施例７］
＜ＰＰＤＫの精製１＞
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のＵｎｏＱ（登録商標）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに、実施例６の粗精製液をアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を用いたベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１００倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析する事により脱塩した。
１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のハイドロキシアパタイトを用いたカラムに上記の脱塩したＰＰＤＫをアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で洗浄した後、３００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いてベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１ｍＭのＤＴＴを含む１００倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析、又は１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨで平衡化したゲル濾過剤であるＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用して脱塩し、精製酵素とした。
本実施例により、５００ｍｌの培養液から収率約１５％で比活性約５Ｕ／ｍｇの精製酵素を約５ｍｇ得た。ＰＰＤＫ活性測定方法２で測定した。
【０１０３】
［実施例８］
＜ＰＰＤＫの精製２＞
０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したシグマアルドリッチ社のニッケルアフィニティーゲルクロマトグラフィーカラムに、実施例４の粗酵素液をアプライした。０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でカラムをベッド体積の５倍以上洗浄した後、０．２ＭのＮａＣｌと０．２Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で吸着画分の溶出を行った。
溶出した活性画分に２０％の硫酸アンモニウムを添加し、２０％の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したフェニルトヨパールクロマトグラフィーカラム（東ソー社製）にアプライした。２０％の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でカラムをベッド体積の５倍以上洗浄
した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を用いたベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。溶出した活性画分は実施例７と同様の方法で脱塩した。収率は約５０％だった。本実施例により得られたＰＰＤＫの比活性は、７Ｕ／ｍｇだった。ＰＰＤＫ活性測定方法２で測定した。
【０１０４】
［実施例９］
＜ＰＰＤＫ活性の確認＞
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＡＭＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＰＥＰ、１ｍＭ ピロリン酸からなる反応液に実施例７で得たＰＰＤＫ １０μｌを添加し、５０℃で２０分間反応した。反応液をＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０（昭和電工株式会社製）を用いたＨＰＬＣで分析した。移動相は２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ３）で、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温で２６０ｎｍの吸光を測定した。反応液の代わりにＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシン混合液を用いて、同条件下、ＨＰＬＣで分析し、分離した結果を図２に示す。図３は反応前の反応液を分離した結果である。図４は反応後の反応液を分離した結果である。本結果より、ＡＭＰを基質とした時にＡＴＰが反応によって生じており、ＰＰＤＫ活性が確認できた。
【０１０５】
［実施例１０］
＜ＰＰＤＫ凍結保存安定性＞
実施例７の脱塩していないＰＰＤＫ（１．２Ｕ／ｍｌ）を−２０℃で凍結保存して２週間後に融解し、凍結保存前後の活性を比較した結果、凍結保存後も９４％の残存活性があった。
【０１０６】
［実施例１１］
＜ＰＰＤＫ冷蔵保存安定性＞
実施例７で得た脱塩していないＰＰＤＫ（１．２Ｕ／ｍｌ）を４℃で保存して、０、５、８、１２、１９、２７日後に活性測定した結果を図５に示した。ＰＰＤＫは冷蔵保存下で、２７日保存後も８０％以上の残存活性があった。また、該ＰＰＤＫを同条件で９ヶ月保存後も８０％以上の残存活性があった。ＰＰＤＫ活性は、測定方法２で測定した。
【０１０７】
［実施例１２］
＜熱安定性１＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫ約０．２ｍｇ／ｍｌを５０℃から１００℃の範囲で２０分間熱処理した。未処理の酵素活性を１００％として残存活性（％）を図６に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは９０℃、２０分間の熱処理で、９０％以上の活性を保持した。ＰＰＤＫ活性を、測定方法２で測定した。
【０１０８】
［実施例１３］
＜熱安定性２＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫ 約０．２ｍｇ／ｍｌを８０℃又は９０℃で、０から１時間の範囲で熱処理した。未処理の酵素活性を１００％として残存活性（％）を図７に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは９０℃、1時間の熱処理で、７０％以上の活性を保持し、８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持した。ＰＰＤＫ活性を測定方法２で測定した。
【０１０９】
［実施例１４］
＜至適ｐＨ＞
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１における緩衝液をｐＨ６からｐＨ７の範囲はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図８中○印）、ｐＨ７からｐＨ８の範囲はＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（図８中△印）、ｐＨ８からｐＨ９の範囲はグリシルグリシン／ＮａＯ
Ｈ（図８中□印）に変更して活性測定を行い、本発明のＰＰＤＫの至適ｐＨを測定した。図８に、最大活性を１００％とした相対活性（％）としてその結果を示した。本発明のＰＰＤＫの至適ｐＨはｐＨ７からｐＨ７．５であった。ＰＰＤＫ活性を、測定方法２で測定した。実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを使用した。
【０１１０】
［実施例１５］
＜ｐＨ安定性＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを約０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、１００ｍＭのｐＨ４からｐＨ６．５はクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（図９中○印）、ｐＨ６．５からｐＨ７はイミダゾール／ＨＣｌ緩衝液（図９中△印）、ｐＨ７からｐＨ８はＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（図９中□印）、ｐＨ８からｐＨ９はグリシルグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（図９中●印）、ｐＨ９からｐＨ１１はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液に溶解し（図９中■印）、５０℃２０分間で保存し、最大活性が得られた場合を１００％として残存活性（％）を図９に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持した。ＰＰＤＫ活性を測定方法２で測定した。
【０１１１】
［実施例１６］
＜補酵素特異性＞
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１におけるＡＭＰを、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及びＵＭＰに変更して活性測定を行った。その結果、本発明のＰＰＤＫはマグネシウムイオン存在下で、ＰＥＰ及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及びＵＭＰに作用しなかった。実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを使用した。
【０１１２】
［実施例１７］
＜金属イオン＞
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬混合液２−１におけるＭｇＣｌ２を、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣａＣｌ２、及びＺｎＣｌ２に変更して、予め１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２Ｍの硫酸ナトリウムを含む１００倍量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で２回透析した本発明のＰＰＤＫの活性測定を行った。その結果、本発明のＰＰＤＫは、金属イオンの無い場合、ＣａＣｌ２及びＺｎＣｌ２の場合は活性を示さなかったが、ＣｏＣｌ２の場合、ＮｉＣｌ２の場合は、ＭｇＣｌ２の場合を１００％として、それぞれ７４％、２９％の相対活性を示した。実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを使用した。
【０１１３】
［実施例１８］
＜分子量＞
分子量の計算値及び測定値は以下のとおりである。
（１）アミノ酸の一次配列からの計算値：９８，１０２
（２）実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定値（図１の矢印）：８３，０００
【０１１４】
［実施例１９］
＜Ｋｍ値＞
実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫのＰＥＰ、ピロリン酸及びＡＭＰに対する見かけのＫｍを、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより算出した。ＰＥＰ、ピロリン酸及びＡＭＰに対する見かけのＫｍは、それぞれ０．３２ｍＭ、１．１２ｍＭ、０．０６５ｍＭであった。ＰＰＤＫ活性を測定方法２で測定した。
【０１１５】
［実施例２０］
＜ＮＭＮＡＴａｓｅの調整＞
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−２株、３−２株、及び６−２株のＤＮＡを、実施例１と同様の方法で得た。ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に配列表配列番号７の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号１１と１２のプライマーを設計した。実施例２と同様の方法でｐＵＣ１１８／Ｓｃ１−２、ｐＵＣ１１８／Ｓｃ３−２、及びｐＵＣ１１８／Ｓｃ６−２を作成し、実施例５と同様の方法でＮＭＮＡＴａｓｅの粗酵素液を調整した。該粗酵素液は１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着して１５及び０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で充分に洗浄した後、０及び０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩してＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２を得た。１００ｍｌの培養液から本実施例により得られたＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２は、約６０Ｕ、７００Ｕ、４００Ｕであった。
【０１１６】
［実施例２１］
＜ＮＭＮＡＴａｓｅのｄＮＴＰｓ／ＡＴＰの比較＞
下記の［組成物］を作成し、ＮＭＮＡＴａｓｅの、ｄＮＴＰｓ／ＡＴＰ（ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率）を測定した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物］を１８０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、レートＡ、５分反応、測光ポイントは２−３とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料として、１ｍＭのｄＮＴＰｓとＡＴＰを使用した。尚、レートＡ（Ｒａｔｅ Ａ）とは測定機器（日立７０８０形自動分析機）の測定方法の１つであり、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。その結果、ＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２のｄＮＴＰｓ／ＡＴＰは順に、１．７、１．３、０．８％であった。
［組成物］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
１Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ１−２、３−２、６−２
【０１１７】
［実施例２２］
＜ピロリン酸の測定１＞
下記の［組成物］を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は３４０ｎｍ、測定副波長は４０５ｎｍ、２ポイントエンド、１０分反応、測光ポイントは１６−３１とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてピロリン酸を図１０の横軸の範囲となるよう
に調整して、測定した結果を図１０に示した。本発明の組成物を使用して本発明の測定方法によりピロリン酸の測定が実施できた。図中○、△、□は順にＰＰＤＫの［組成物Ａ］中の濃度１、５、１０Ｕ／ｍｌを示す。尚、２ポイントエンド（２ｐｏｉｎｔ ｅｎｄ）とは測定機器（日立７０８０形自動分析機）の測定方法の１つであり、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１、５、１０Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整した脱塩後のＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
【０１１８】
［実施例２３］
＜ピロリン酸の測定２＞
下記の［組成物］を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイントは２７−３０とし、精製水によるブランクを差し引いた。０から２０μＭのピロリン酸を試料とした場合の測定結果を図１１の○で、０から４０μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合の測定結果を図１１の●で示した。０から２０μＭのピロリン酸を試料とした場合、Ｙ＝０．４Ｘ＋５、Ｒ２＝０．９９６、０から４０μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合、Ｙ＝０．４Ｘ＋１４、Ｒ２＝０．９９１、となり、ｄＮＴＰｓの共存下でも精度良くピロリン酸が測定できた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー
０．５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
５Ｕ／ｍｌ ＤＩ（旭化成ファーマ社製）
【０１１９】
［実施例２４］
＜ピロリン酸の測定３＞
ＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度を測定した。ＰＣＲは、ＴＯＹＯＢＯ社製Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑを使用して以下の［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］で実施した。ＰＣＲ条件は９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分を２５サイクル実施し、図１２の横軸に示した各サイクル数の時に［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］を一部抜き取り被検液とし、下記の［組成物］でピロリン酸濃度を検出した。Ｔｅｍｐｌａｔｅは実施例２０のｐＵＣ１１８／Ｓｃ６−２とし、配列表配列番号７の遺伝子を増幅した。増幅遺伝子は約１．５ｋｂｐであった。定量は、２０μＭのピロリン酸水溶液をキャリブレーターとして測定して被検液中のピロリン酸濃度を算出した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプルとして被検液を２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイント２７−３０とし、０サイクル目の被検液の値をブランクとして差し引いた。
その結果を図１２に示したように、本発明の組成物を使用してＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度を、可視光で測定することができた。本発明の測定方法は、上記核酸増幅法による核酸増幅反応中の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である事が確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］
×１０ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ １０μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
２．５Ｕ／μｌ Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μｌ
５０μｌ プライマーＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄ ２μｌ
５０μｌ プライマーＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ ２μｌ
２００ｎｇ／μｌ ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ １μｌ
蒸留水 ７９μｌ
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ コール酸
０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー
０．５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
５Ｕ／ｍｌ ＤＩ（旭化成ファーマ社製）
【０１２０】
［実施例２５］
＜ピロリン酸の測定４＞
ＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液中のピロリン酸濃度を測定した。測定方法は実施例２４と同様である。Ｔｅｍｐｌａｔｅは実施例５のｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２とし、配列表配列番号２の遺伝子を増幅した。
その結果を図１３に示した様に、本発明の組成物を使用してＰＣＲによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度が可視光で測定できた。本発明の測定方法は、上記核酸増幅
法による核酸増幅反応中の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である事が確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
【０１２１】
［実施例２６］
＜ＰＰＤＫ発現の改良＞
配列表配列番号１に示す遺伝子の中で、大腸菌において使用頻度が低いと考えられるコドン（ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＴＡ、ＣＧＧ、ＣＣＣ、ＣＵＡ）全てを大腸菌において使用頻度が高いコドンに変換して配列表配列番号３の遺伝子を作成した。コドン変換は、合成プライマーを使用したＰＣＲによる常法で行った。実施例２、３、５、６と同様の方法で粗精製液を得て、図１４に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥで、配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（図中（Ａ））と配列表配列番号３（図中（Ｂ））の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量を比較した。配列表配列番号３の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量は、配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量に比べて改善された。又、配列表配列番号３の遺伝子によるＰＰＤＫの培養力価は、配列表配列番号２の遺伝子によるＰＰＤＫの培養力価に比べて約３倍高くなった。
【０１２２】
［実施例２７］
＜リアルタイムＰＣＲとの比較＞
ＰＣＲによる核酸増幅を、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを用いた蛍光と、本発明のピロリン酸濃度測定方法を用いた可視光で検出して比較した。ＰＣＲはタカラバイオ株式会社のＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）を用いて、下記の［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］を調整して行った。Ｔｅｍｐｌａｔｅは約２２０ｂｐのフラグメントを挿入したｐＵＣ１１９を使用した。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを用いたＰＣＲは、タカラバイオ株式会社のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍを使用したリアルタイムＰＣＲで蛍光を検出した。通常のＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９８００ Ｆａｓｔ サーマルサイクラーを使用した。各サイクル数の時に［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］を一部抜き取り被検液とし、下記の［組成物］で日立７０８０形自動分析機を使用して、本発明のピロリン酸濃度測定方法を用いて、可視光で検出した。ＰＣＲ条件は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）の取扱説明書に記載のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍの標準プロトコール、すなわち９５℃１０秒の後、９５℃５秒と６０℃２０秒を４０サイクル実施するシャトルＰＣＲとした。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９８００ Ｆａｓｔ サーマルサイクラーを用いたＰＣＲ条件も同様であった。日立７０８０形自動分析機のパラメーターはサンプルとして被検液を２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１００μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイント２３−２１とし、０サイクル目の被検液の値をブランクとして差し引いた。
その結果を図１５に示した。図１５中●がタカラバイオ株式会社のＳｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍを使用したリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅を検出した結果で、○は本発明のピロリン酸濃度測定組成物とピロリン酸濃度測定方法を用いて核酸増幅を検出した結果である。リアルタイムＰＣＲでは約１５サイクル目から、本発明の測定方法は、約１７サイクル目から核酸増幅を検出できた。このように、本発明の測定方法は、従来から汎用されているリアルタイムＰＣＲとほぼ同時期に核酸増幅を検出することができ、しかも、本発明は可視光によるピロリン酸の生成量を指標とすることから、リアルタイムＰＣＲよりも簡便に核酸を測定することができ、好適な測定方法であることが確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
［ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ］
×１ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
０．２μＭ Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ
０．２μＭ Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｃｅ Ｐｒｉｍｅｒ
約５０ｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ
［組成物Ａ］
１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
１．５ｍＭ ＰＥＰ
１．５ｍＭ ＡＭＰ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
１．５Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
［組成物Ｂ］
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０
２ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
２ｍＭ コール酸
０．０５％ ニトロテトラゾリウムブルー
１Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
１０Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ（旭化成ファーマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ＤＩ（旭化成ファーマ社製）
【０１２３】
［実施例２８］
＜ピロリン酸の測定３＞
下記の［組成物］を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル２０μｌ、Ｒ１として［組成物Ａ］を１５０μｌ、Ｒ２として［組成物Ｂ］を１５０μｌ、測定主波長は５４６ｎｍ、測定副波長は６６０ｎｍ、レートＡ、１０分反応、測光ポイントは２７−３０とし、精製水によるブランクを差し引いた。０から１μＭのピロリン酸を試料とした場合の測定結果を図１８の○で、０から２μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合の測定結果を図１８の●で示した。０から１μＭのピロリン酸を試料とした場合、Ｙ＝１１．０Ｘ＋０．８、Ｒ２＝０．９９８、０から２μＭのピロリン酸を０．８ｍＭのｄＮＴＰｓと１：１で混合して試料とした場合、Ｙ＝９．８４Ｘ＋８．０、Ｒ２＝０．９９９、となり、ｄＮＴＰｓの共存下でも精度良くピロリン酸が測定できた。Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ（シグマ社製）、ＡＤＰ−ＨＫＴＩＩ（ＡＤＰ依存型のヘキソキナーゼ（旭化成ファーマ社製））は試料中のＡＴＰやｄＡＴＰを消去するために添加した。Ｐ１，Ｐ５，−ｄｉａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ａｐ５Ａ）はＭｙｏｋｉｎａｓｅの阻害剤である。
［組成物Ａ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
０．２％ ＴＸ−１００
１ｍＭ ＰＥＰ
１ｍＭ ＡＭＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
２Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫＴＩＩ
３Ｕ／ｍｌ Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ
［組成物Ｂ］
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．５
１ｍＭ β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
５Ｕ／ｍｌ １２α−ＨＳＤ
１ｍＭ コール酸
０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー
０．５Ｕ／ｍｌ 実施例２０で調整したＮＭＮＡＴａｓｅ３−２
５Ｕ／ｍｌ ＤＩ
０．２％ ＴＸ−１００
１Ｕ／ｍｌ 実施例７で調整したＰＰＤＫ
４０μＭ Ａｐ５Ａ
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
高感度、簡便、且つ選択的なピロリン酸を測定する方法を提供できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（４）の各工程を含む試料中のピロリン酸の選択的な測定方法。
（１）試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸を、少なくともＡＭＰの存在下、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する第一の反応を含む工程；
（２）上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する第二の反応を含む工程；
（３）上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する第三の反応を含む工程；
（４）上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程；
【請求項２】
第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程が、以下の工程を含む請求項１に記載の測定方法。
（５）ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とＮＡＤ類とする第四の反応を含む工程；
（６）上記第四の反応により生ずる還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩類を検出する工程；
【請求項３】
第四の反応により生ずるＮＡＤ類を、第三の反応に用い、第三の反応と第四の反応の間でサイクリング反応をさせる請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
第二の反応により生ずるピロリン酸を、第一の反応に用い、第一の反応と第二の反応の間でサイクリング反応をさせる請求項１から３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
試料が、トリ燐酸化デオキシリボ核酸類（ｄＮＴＰｓ）を含有する試料である、請求項１から４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔３〕ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下であり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である請求項１から５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定することを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
【請求項８】
少なくとも以下の（１）から（７）を含む組成物。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ホスホエノールピルビン酸
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（５）β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
【請求項９】
下記の（Ａ）と（Ｂ）の２種の試薬を含む組成物。
（Ａ）少なくとも以下の（１）から（４）を含む第１の試薬。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ホスホエノールピルビン酸
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（Ｂ）少なくとも以下の（５）から（７）を含む第２の試薬。
（５）β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
【請求項１０】
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔３〕ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下であり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸を検出又は定量するための組成物である、請求項８から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物を用いて請求項７に記載の方法を行うことを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
【請求項１】
下記（１）から（４）の各工程を含む試料中のピロリン酸の選択的な測定方法。
（１）試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸を、少なくともＡＭＰの存在下、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ＡＴＰを生成する第一の反応を含む工程；
（２）上記第一の反応により生ずるＡＴＰをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とＮＡＤ類を生成する第二の反応を含む工程；
（３）上記第二の反応により生ずるＮＡＤ類をＮＡＤＨ類に還元する第三の反応を含む工程；
（４）上記第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程；
【請求項２】
第三の反応により生ずるＮＡＤＨ類を検出する工程が、以下の工程を含む請求項１に記載の測定方法。
（５）ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるＮＡＤＨ類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とＮＡＤ類とする第四の反応を含む工程；
（６）上記第四の反応により生ずる還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩類を検出する工程；
【請求項３】
第四の反応により生ずるＮＡＤ類を、第三の反応に用い、第三の反応と第四の反応の間でサイクリング反応をさせる請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
第二の反応により生ずるピロリン酸を、第一の反応に用い、第一の反応と第二の反応の間でサイクリング反応をさせる請求項１から３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
試料が、トリ燐酸化デオキシリボ核酸類（ｄＮＴＰｓ）を含有する試料である、請求項１から４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔３〕ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下であり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である請求項１から５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定することを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
【請求項８】
少なくとも以下の（１）から（７）を含む組成物。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ホスホエノールピルビン酸
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（５）β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
【請求項９】
下記の（Ａ）と（Ｂ）の２種の試薬を含む組成物。
（Ａ）少なくとも以下の（１）から（４）を含む第１の試薬。
（１）金属イオン
（２）ＡＭＰ
（３）ホスホエノールピルビン酸
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
（Ｂ）少なくとも以下の（５）から（７）を含む第２の試薬。
（５）β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類
（６）ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
（７）ＮＡＤ還元物質
【請求項１０】
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔１〕配列表配列番号６のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔２〕配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔３〕ｄＮＴＰｓとＡＴＰに対する基質特異性の比率（ｄＮＴＰｓに対する基質特異性／ＡＴＰに対する基質特異性）が５％以下であり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸を検出又は定量するための組成物である、請求項８から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物を用いて請求項７に記載の方法を行うことを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００９−２２５７８４（Ｐ２００９−２２５７８４Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８４２１（Ｐ２００９−８４２１）
【出願日】平成２１年１月１９日（２００９．１．１９）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【出願人】（５９１１７５３３２）イチビキ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１９日（２００９．１．１９）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【出願人】（５９１１７５３３２）イチビキ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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