フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法
【課題】フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質を用いるフォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法において、極めて短時間でＡＤＡＭＴＳ１３活性量を正確に定量することができる分析方法及び分析用キットを提供する。
【解決手段】前記分析方法は、被検試料と前記基質との液中での接触を、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下で実施する。前記分析用キットは、（１）フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、（２）基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含む。
【解決手段】前記分析方法は、被検試料と前記基質との液中での接触を、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下で実施する。前記分析用キットは、（１）フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、（２）基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中に含まれるフォンヴィルブランド因子（von Willebrand factor；以下、ｖＷＦと称する）分解酵素の分析方法及び分析用キットに関する。
近年、血小板血栓形成傾向の程度あるいは血栓症の検出等に際し、ｖＷＦ分解酵素［以下、ＡＤＡＭＴＳ１３（ｖＷＦ分解酵素の別称）と称する］の活性測定はその臨床的価値が認知されつつある。本発明方法によれば、簡便性、迅速性、及び感度に優れたＡＤＡＭＴＳ１３分析法を実現することができ、更には極めて短時間の測定によって全自動分析装置により酵素活性量を精細に定量化することができる。なお、本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭＴＳ１３は、元来、非常に重篤な致死率の高い血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura；以下、「ＴＴＰ」と称する）の発症に関与することが示唆され、血漿から精製され（非特許文献１）、ｃＤＮＡクローニングによりその遺伝子が決定された。実際、ＡＤＡＭＴＳ１３の遺伝子変異がｖＷＦ分解活性を著しく低下させることが明らかにされている（非特許文献２）。近年、ＡＤＡＭＴＳ１３に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を応用した酵素免疫測定法が開発され（特許文献１）、血小板凝集が関与した血栓症の原因及び血栓症の血栓形成傾向の検出法が確立された。これを使用し、各種血栓症患者の血漿中におけるＡＤＡＭＴＳ１３の濃度が健常人と比べて顕著に低下していることが見いだされている。
【０００３】
ＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定法は、従来より、ＳＤＳ−アガロース電気泳動とオートラジオグラフィー又はウエスタンブロット法とを組み合わせたｖＷＦ巨大マルチマーの検出法が用いられてきた（非特許文献３）。また近年、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｖＷＦの特異的分解部位であるＡ２ドメイン７３残基を用い、その周辺部位に蛍光基と消光基を導入したＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３が開発され、ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定が簡便に行われるようになった（非特許文献４）。
【０００４】
しかし、これら活性を測定する方法は操作が極めて煩雑であったり、またその測定に特殊な蛍光検出器を必要としたり、臨床検体の測定からその結果の出力までに多大な時間を要するために実際の臨床診断検査の現場での使用に堪えうるものではない。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２９２４２号パンフレット
【非特許文献１】ケー・フジカワ（K. Fujikawa）ら，「ブラッド（Blood）」,（米国），２００１年，第９８巻，ｐ．１６６２−６
【非特許文献２】ジー・ジー・レビー（G. G. Levy）ら，「ネイチャー（Nature）」，（英国），２００１年，第４１３巻，ｐ．４８８−４９４
【非特許文献３】エム・フルラン（M. Furlan）ら，「ブラッド（Blood）」，（米国），１９９６年，第８７巻，ｐ．４２２３−４２３４
【非特許文献４】コカメ・ケー（Kokame K）ら「ブリティッシュ ジャーナル オブ ヘマトロジー（British Journal of Haematology）」，（英国），２００５年，第１２９巻，９３−１００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のようにＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定は今後、臨床上、非常に有用で各種病態解明の中心となることが予想される。このような病態の診断においては簡便でかつ極めて迅速なＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定が求められることが予想される。これら求められる要素を実現するためには従来にない極めて短時間のＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定が必須となり、例えば測定者に極力負荷をかけない全自動化装置による短時間のＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定はその実例となり得ると考えられる。
【０００７】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、フォンヴィルブランド因子の基質となる断片を捕捉しうる磁性粒子及び、その断片を認識しうる酵素標識化パートナーを使用した全自動化装置によりＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定が行えることを示し、更にはＡＤＡＭＴＳ１３とその基質が接触する溶液中に、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することで、基質側にＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されやすい状況が発生し、その結果として酵素活性が著しく亢進し、従来にない極めて短時間でのＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定を実現させることができ、ここに本発明を完成するに至った。
【０００８】
従って、本発明の課題は、従来にない極めて短時間でＡＤＡＭＴＳ１３活性量を正確に定量することができる分析方法及び分析用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、
［１］フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質を用いるフォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法において、被検試料と前記基質との液中での接触を、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下で実施することを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法；
［２］前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とする多糖類である、［１］の分析方法；
［３］前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とし、カチオン性を発揮する官能基として第３級アミノ基及び／又は第四級アンモニウム基を有する多糖類である、［１］の分析方法；
［４］前記カチオン性水溶性多糖類が、ＤＥＡＥ−デキストランである、［１］の分析方法；
［５］前記分析を全自動分析装置を用いて実施する、［１］〜［４］の分析方法；
［６］前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の基質を、捕捉することのできる不溶性担体を使用する、［１］〜［５］の分析方法；
［７］不溶性担体が粒子である、［６］の分析方法；
［８］粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である、［７］の分析方法；
［９］前記基質が、フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断され遊離する基質断片側において標識物質で標識されているか、あるいは、特異的に認識されうるアミノ酸配列を有している、［６］〜［８］の分析方法；
［１０］標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である、［９］の分析方法；
［１１］前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するパートナーを使用する、［６］〜［８］の分析方法；
［１２］（１）フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、（２）基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含むことを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析用キット
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することで、基質側にＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されやすい状況が発生し、ＡＤＡＭＴＳ１３の基質を切断する酵素活性が、これを共存させない場合と比較し、極めて向上することを発見した。この発見を応用することにより、従来行われてきたＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定法に必要とされた時間（特にＡＤＡＭＴＳ１３と基質との接触時間）を大幅に短縮することができた。これにより、全自動化装置による測定に代表されるような簡便でかつ極めて迅速な定量測定が達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の分析方法では、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質、すなわち、フォンヴィルブランド因子の全長又はその基質となる部分の断片を少なくとも用いる。本発明の分析方法は、例えば、
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて、液中で接触させる工程、
（２）前記基質がＡＤＡＭＴＳ１３により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の前記基質とを分離する工程、並びに
（３）分離した前記基質断片及び／又は前記基質を分析する工程
を含むことができる。
【００１２】
本発明の分析方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質又は切断後の基質断片と特異的に反応することのできるパートナー（好ましくは抗体）を使用せずに実施することもできるし、あるいは、前記パートナーを使用して実施することもできる。前記パートナーを使用せずに実施する態様としては、例えば、切断後の基質断片を電気泳動で確認する方法、基質として、例えば、基質の切断部位周辺に蛍光基と消光基が導入されており、その切断により蛍光を検出できる基質［例えば、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３（非特許文献４）］を使用する方法などを挙げることができる。
【００１３】
本発明の分析方法では、簡便で迅速な定量測定を行うことができる点で、不溶性担体を使用した測定が好適である。不溶性担体を使用する態様では、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質を、不溶性担体に予め結合させた状態で使用することもできるし、あるいは、被検試料と接触させた後の基質（ＡＤＡＭＴＳ１３により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の基質を含む）を、不溶性担体と接触させることもできる。
【００１４】
本発明の分析方法において、不溶性担体を用いる態様では、例えば、
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて、液中で接触させる工程、
（２）前記工程（１）の後に、あるいは、同時に、前記基質又は切断後の基質断片を捕捉することのできる不溶性担体（所望により、更に標識化パートナー等）を接触させる工程、
（３）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに
（４）不溶性担体に残存する基質又は基質断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質又は基質断片を分析する工程
を含むことができる。
【００１５】
更に、本発明の分析方法には、用いる標識物質の標識化の態様に基づいて、例えば、
（ａ）基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、他の物質により認識されうる配列又は構造を有しており、これを認識することができる標識化パートナーを用いる態様、
（ｂ）基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、標識物質で直接標識化されている態様、又は
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じる基質のネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いる態様
が含まれる。
【００１６】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料としては、分析対象であるｖＷＦ分解酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む可能性のある試料であれば特に限定されないが、例えば、生物学的液体試料、特には、血液、血清、血漿、尿、又は髄液等を挙げることができる。
【００１７】
なお、本発明の分析方法によって分析可能な分析対象酵素は、現在ｖＷＦ分解酵素として考えられているＡＤＡＭＴＳ１３をその代表と考えるが、ｖＷＦをその特異的部位［ｖＷＦのＡ２ドメインのチロシン（１６０５）とメチオニン（１６０６）の間］で切断可能な酵素である限り、特に限定するものではない。このことは、例えば、将来的にＡＤＡＭＴＳ１３以外のｖＷＦ分解酵素が発見された場合、あるいはＡＤＡＭＴＳ１３と複合体などを形成し切断活性を調整する制御因子などが発見された場合も、これらを含有するものとする。
【００１８】
本発明の分析方法で用いる酵素基質は、ｖＷＦのＡ２ドメインのチロシン（１６０５）とメチオニン（１６０６）の間で特異的にプロテアーゼにより切断可能な物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ｖＷＦの全長、あるいは、その基質となる部分の断片等を用いることができ、ｖＷＦの全長あるいはその特異的基質となる部分の最短領域を含むものが好ましい。前記基質は、周知方法により調製することができ、例えば、寄生生物の粗抽出品又は精製品をヒトや動物の体液より採集する方法、生物由来の粗抽出品又は精製品を人工的に養殖した生物から取得する方法、核酸又はタンパク質を遺伝子組換え技術や細胞培養技術により生産する方法、あるいは、ポリペプチドやハプテンを化学合成技術で合成する方法などが挙げられる。
【００１９】
本発明で使用するカチオン性水溶性多糖類は、基質と複合体を形成可能なもので、ＡＤＡＭＴＳ１３に切断されやすいフォームを形成させるものである限り、特に限定されるものではない。
カチオン性水溶性多糖類の水溶性多糖類部分は、その構成単位として、例えば、Glc（グルコース、Gal（ガラクトース)、Man（マンノース）、GlcUA（グルクロン酸）、IdoA（イズロン酸）、Fuc（フコース）、GlcN（D-glucosamine：グルコサミン、GlcNH2）、GlcNAc（N-アセチルグルコサミン）、GalNAc（N-アセチルガラクトサミン）、NeuAc（N-アセチルノイラミン酸）、NeuGc（N-グリコリルノイラミン酸）等を挙げることができ、グルコースであることが好ましい。水溶性多糖類部分は、これらの１種類の構成単位のみからなることもできるし、あるいは、２種類以上の構成単位からなることもできる。
【００２０】
水溶性多糖類としては、例えば、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース等）エーテル、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ヘパリン、ヒアルロン酸などを挙げることができ、本発明で用いるカチオン性水溶性多糖類としては、これらの水溶性多糖類の官能基に化学修飾を施しカチオン性を付与させたものを挙げることができる。なお、前記水溶性多糖類の内、元来カチオン性を有するキトサン又はＤＥＡＥ−デキストランについては、前記化学修飾を施すこともできるが、前記化学修飾を施すことなく、カチオン性水溶性多糖類としてそのまま使用することができる。水溶性多糖類としては、元来カチオン性を有する点で、キトサン又はＤＥＡＥ−デキストランが好ましい。
【００２１】
カチオン性水溶性多糖類は、その陽イオン性を発揮するための塩基性官能基として、例えば、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、第四級アンモニウム基、アミジノ基、グアニジノ基、イミダゾール基などが挙げられ、例えば、第三級アミノ基、第四級アンモニウム基であることが好ましい。更に本発明で使用する最も適した塩基性官能基としては、第三級アミノ基であるＤＥＡＥ基、あるいは、第四級アンモニウム基と第三級アミノ基が結合したタンデム構造であるＤＥＡＥ−ＤＥＡＥ基が好ましい。
【００２２】
本発明で用いるカチオン性水溶性多糖類としては、ＤＥＡＥ−デキストランが最も好ましい。なお、一般に市販されているＤＥＡＥ−デキストランは、ＤＥＡＥ基とＤＥＡＥ−ＤＥＡＥ基の両方を含んでおり、本明細書における「ＤＥＡＥ−デキストラン」は、塩基性官能基としてＤＥＡＥ基及び／又はＤＥＡＥ−ＤＥＡＥ基を含むデキストランを意味する。ＤＥＡＥ−デキストランの分子量は、構成単位であるグルコースの数によりその分子量が決定され、通常、１０，０００〜２，０００，０００であり、このうち１００，０００〜１，０００，０００が好ましく、３００，０００〜７００，０００が特に好ましい。また、Ｎ含有量は通常０．１〜２０％であり、このうち０．５〜１０％が好ましく、１〜５％のものが特に好ましい。
【００２３】
本発明方法において使用することのできる不溶性担体としては、酵素基質又は切断後の基質断片を捕捉可能であるものであればいかなる形態の不溶性担体でも利用可能であり、例えば、基質及び／又は切断後の基質断片に特異的なパートナーを物理的に吸着可能な材質や化学結合で担持させうる適当な官能基を有する材質［例えば、各種プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はポリテトラフルオロエチレン）からなるプレート、チュ−ブ、ビーズ、チップ、ガラス、磁性担体、ラテックス粒子、又は膜などを利用することができる。Ｂ／Ｆ分離する際の操作が簡便な点、また全自動化装置による測定へのアプリケーションのしやすさの観点からここでは不溶性磁性粒子を用いることが好ましい。
【００２４】
不溶性磁性粒子の粒径は、通常０．０５μｍ〜５μｍのものが用いられ、０．３μｍ〜３μｍの範囲の粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。物理的に吸着させる方法としては、不溶性磁性粒子に、タンパク質を直接固定化する方法が挙げられる。化学的に担持させる方法としては、例えば、磁性粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することによりタンパク質と結合させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒子と基質分子の間にスペーサー分子を化学結合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質を前記の方法で結合させた後、抗体などをその上から更に結合させる方法、又はアルブミンなどの他のタンパク質と抗体などを化学結合させた後、その複合タンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。一般的に担持されるタンパク質の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量等により適宜決定することができる。
【００２５】
本発明方法において使用することのできる標識化パートナーとして、前記基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、他の物質により認識されうる配列又は構造を有している場合、これを認識することができる性質を有しているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抗体若しくはその断片［例えば、Ｆａｂ’，ｓｃＦｖ，Ｖ−ドメインプロテイン（domain Proteins）等］又はアフィボディ（Affibody）、アプタマー等が挙げられる。抗体を使用する場合、前記抗体は、他の物質により認識されうる配列又は構造を有しているものにより適宜選択することができ、予めヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジなどに基質又はその断片を免疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体などを利用することができる。
【００２６】
本発明方法における使用することのできる標識化パートナーで、基質がＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合可能な物質であるものは、これを認識することができる性質を有しているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抗体若しくはその断片（例えば、Ｆａｂ’，ｓｃＦｖ，Ｖ−ドメインプロテイン等）又はアフィボディ、アプタマー等が挙げられる。標識化パートナーとして抗体を使用する場合、前記抗体は、使用する基質により適宜選択することができ、予めヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジなどに基質又はその断片を免疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体などを利用することができる。
【００２７】
本発明においてはパートナーへ標識する場合、ＡＤＡＭＴＳ１３による切断部位とは異なる部位に標識物質を結合させる。標識化基質（好ましくは酵素標識基質）又は標識化パートナー（好ましくは酵素標識パートナー物質、特には酵素標識抗体）の調製方法は周知であり、任意の方法を選択することができる。
【００２８】
本発明で用いる標識物質としては、公知の各種標識物質を用いることができ、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光物質（例えば、フルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、時間分解蛍光測定が可能な希土類若しくは希土類錯体（例えば、ユーロピウム、ユーロピウム錯体など）、化学発光物質（例えば、アクリジニウムエステル等）、ラジオアイソトープ（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐなど）、発色物質［例えば、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）］を用いることができる。すなわち、発色、蛍光、時間分解蛍光、化学発光、電気化学発光、放射活性等を測定する方法を用いることができる。
【００２９】
標識物質由来のシグナル強度の変化を検出する手段としては、標識物質の種類及び測定機器の特性によって適宜選択され、周知の方法、例えば、比色法、蛍光法、又は発光法などを利用することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを用いた場合、ルミノールを基質として化学発光法で検出することも可能で、特に微量測定に好適である（例えば、田中弘一郎、石川榮治：西洋ワサビペルオキシダーゼを標識とする酵素免疫測定法における蛍光法と発光法の比較、臨床検査機器・試薬、１１：５６７−５６９，１９８８）。また、標識物質としてアルカリホスファターゼを用いた場合、ジオキセタン系基質であるＡＭＰＰＤ［3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”phosphoroxy)phenyl-1,2-dioxetane］、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ［1,2-dioxetane（トロピックス社）］等の公知基質を用いると、より好感度に検出することができるため、好ましい。
【００３０】
以下、本発明の分析方法について、実施態様毎に、具体的な測定手順を示すことにより、更に詳細に説明する。
【００３１】
本発明の分析方法の一態様である、基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、他の物質により認識されうる配列又は構造を有しており、これを認識することができる標識化パートナーを用いる態様では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、
（Ａ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて液中で接触させる工程、
（Ａ２）前記液と不溶性担体と標識化パートナーとを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液とを分離する工程、並びに
（Ａ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含むことができる。
前記工程（Ａ２）で用いる前記不溶性担体には、前記基質の前記末端を特異的に認識するパートナーが担持されている。また、前記工程（Ａ２）で用いる前記標識化パートナーは、前記基質のもう一方の末端を特異的に認識することができるパートナーを標識化したものである。
【００３２】
前記工程（Ａ１）で用いる基質は、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質である。この基質は、ＡＤＡＭＴＳ１３の特異的切断部位を有しており、この切断部位とは明らかに異なる基質の両末端側が他の物質により認識されうる配列又は構造を有している。工程（Ａ１）において、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質と、被検試料とを同時に接触させると、ＡＤＡＭＴＳ１３が通常、基質単体で遊離している場合よりも、より効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。また、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質とを予め混合させておき、カチオン性水溶性多糖類と基質との複合体を形成させておき、これにＡＤＡＭＴＳ１３を含有する被検試料を接触させると、更に効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。本工程を通してＡＤＡＭＴＳ１３と基質との接触時間は特に限定されるものではないが、本発明方法では、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することにより、望ましい反応性（ＡＤＡＭＴＳ１３が健常人血中に存在する量の数％に相当する量を検出することができる）を保有した上で、非常に短時間、例えば、２０分以内、好ましくは３分〜１５分の接触時間での測定を可能とさせる。
【００３３】
前記工程（Ａ２）では、前記工程（Ａ１）を実施した後に、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性により切断された基質断片、及び切断されなかった基質のそれぞれが、他の物質により認識されうる配列又は構造を少なくとも片側の末端に有しているため、前記末端を特異的に認識するパートナーを担持する不溶性担体へ結合しうる。不溶性担体に結合した未切断基質は、標識化パートナーが認識可能な末端を有するため、更に、標識化パートナーが結合している。一方、不溶性担体に結合した切断基質断片は、標識化パートナーが認識可能な末端を有しないため、標識化パートナーは結合していない。それ以外の画分（すなわち、遊離している基質断片及び被検試料を含む液画分）は、工程（Ａ２）で分離される。この分離操作は、常法により実施することができ、例えば、不溶性担体として磁性粒子を用いる場合には、例えば、磁石を使用することにより、あるいは、遠心操作により分離することができる。不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合には、例えば、遠心操作又は濾過により分離することができる。次の工程（Ａ３）で不溶性担体に含まれる標識物質を分析する場合には、前記分離後に不溶性担体を洗浄することにより、遊離基質断片を充分に除去することが好ましい。
【００３４】
前記工程（Ａ３）では、切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、若しくは、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片、又はその両方を分析することができる。
切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する場合には、遊離基質断片を認識しうる標識化パートナーに含まれる標識物質の量を測定することにより、遊離基質断片の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が増加することとなる。
一方、不溶性担体に切断されずに捕捉される基質を分析する場合、結合している標識化パートナーに含まれる標識物質の量を測定することにより、切断されなかった基質の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。
【００３５】
本発明の分析方法の一態様である、基質が標識物質で直接標識化されている態様では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、
（Ｂ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、標識化された基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて液中で接触させる工程、
（Ｂ２）前記液と不溶性担体とを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液を分離する工程、並びに
（Ｂ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含む。
前記工程（Ｂ２）で用いる前記不溶性担体には、前記基質の標識化された末端と反対側の末端を特異的に認識するパートナーが担持されている。
【００３６】
前記工程（Ｂ１）で用いる基質は、末端を標識物質で標識された基質である。この基質はＡＤＡＭＴＳ１３の特異的切断部位を有しており、片方が標識物質で標識され、もう片方が他の物質により認識されうる配列又は構造を有している。工程（Ｂ１）において、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質と、被検試料とを同時に接触させると、ＡＤＡＭＴＳ１３が通常、基質単体で遊離している場合よりも、より効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。また、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質とを予め混合させておき、カチオン性水溶性多糖類と基質の複合体を形成させておき、これにＡＤＡＭＴＳ１３を含有する被検試料を接触させると、更に効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。本工程を通してＡＤＡＭＴＳ１３と基質との接触時間は特に限定されるものではないが、本発明方法では、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することにより、望ましい反応性（ＡＤＡＭＴＳ１３が健常人血中に存在する量の数％に相当する量を検出することができる）を保有した上で、非常に短時間、例えば、２０分以内、好ましくは３分〜１５分の接触時間での測定を可能とさせる。
【００３７】
前記工程（Ｂ２）では、前記工程（Ｂ１）を実施した後に、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性により切断された基質断片、及び切断されなかった基質のそれぞれが、他の物質により認識されうる配列又は構造を少なくとも片側の末端（すなわち、標識化された末端と反対側の末端）に有しているため、前記末端を特異的に認識するパートナーを担持する不溶性担体へ結合しうる。また、切断されずに不溶性担体へ結合した基質は、片方の末端が標識物質で標識されている。それ以外の画分（すなわち、遊離している基質断片及び被検試料を含む液画分）は、工程（Ｂ２）で分離される。この分離操作は、常法により実施することができ、例えば、不溶性担体として磁性粒子を用いる場合には、例えば、磁石を使用することにより、あるいは、遠心操作により分離することができる。不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合には、例えば、遠心操作又は濾過により分離することができる。次の工程（Ｂ３）で不溶性担体に含まれる標識物質を分析する場合には、前記分離後に不溶性担体を洗浄することにより、遊離基質断片を充分に除去することが好ましい。
【００３８】
前記工程（Ｂ３）では、切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、若しくは、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片、又はその両方を分析することができる。
切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する場合には、遊離基質断片に含まれる標識物質の量を測定することにより、遊離基質断片の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が増加することとなる。
一方、不溶性担体に切断されずに捕捉される基質を分析する場合、片方の末端に標識化された標識物質の量を測定することにより、切断されなかった基質の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。
【００３９】
本発明の分析方法の一態様である、ＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じる基質のネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いる態様では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、
（Ｃ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて液中で接触させる工程、
（Ｃ２）前記液と不溶性担体と前記標識化パートナーとを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液とを分離する工程、並びに
（Ｃ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含むことができる。前記工程（Ｃ２）で用いる前記不溶性担体には、切断後の基質断片におけるネオアンチゲンとは反対側の末端を特異的に認識するパートナーが担持されている。
【００４０】
本明細書において「ネオアンチゲン」とは、基質が分解酵素による切断を受けることにより新しく生じる配列又は構造を意味し、切断を受けたアミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側、又はその両方において適宜実施することが可能である。
【００４１】
例えば、（Ｃ２）の工程で標識化パートナーは、基質がＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するため、酵素切断前の基質とは結合せず、ＡＤＡＭＴＳ１３自身の酵素反応は、標識化パートナーの存在の有無と無関係に進行する。ここで、切断部位との反対側に他の物質により認識されうる配列又は構造を有しており、これを認識することができる物質を不溶性担体に結合させておけば、基質断片と標識化パートナー（好ましくは標識化抗体）との複合体（好ましくは免疫複合体）を不溶性担体に捕捉することができる。
【００４２】
この態様における工程（Ｃ３）では、不溶性担体に捕捉された切断基質断片に特異的に結合した標識化パートナーの標識物質の量を測定することにより、切断された基質の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が増加することとなる。
【００４３】
本発明の分析用キットは、少なくとも、フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含み、標識物質及び検出系などに応じて、例えば、基質、洗浄液、検体希釈液、及び／又は反応増幅剤を更に含むことができる。例えば、第一試薬に基質、第二試薬に基質を捕捉しうる固定化担体、第三試薬に標識化パートナー、第四試薬に標識物質の信号を発現させる物質を含ませることができる。具体的には、例えば、
第一試薬：基質及び水溶性ポリマーを含む溶液
第二試薬：基質を捕捉しうる表面処理が施された磁性粒子など
第三試薬：切断断片を特異的に認識する、あるいは基質を認識しうる標識化抗体など（例えば、標識をアルカリホスファターゼ）
第四試薬：化学発光用基質（例えば、ＡＭＰＰＤ）
からなる試薬構成を挙げることができ、標識物質、検出系により、適宜組成を変更し、種々の構成とすることが可能である。
【００４４】
各試薬添加後の混合は充分に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止め放置して反応させてもよい。反応は通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８にて行う。温度については、通常２〜５０℃の範囲で実施可能であるが、望ましくは室温あるいは３０〜４５℃で反応させる。反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意であるが、本発明では水溶性高分子ポリマーを添加することにより、望ましい反応性（ＡＤＡＭＴＳ１３が健常人血中に存在する量の数％に相当する量を検出できる）を保有した上で非常に短時間の測定を（基質と被検試料との接触時間として２０分以内、測定全てに必要な時間として３０分以内）実現することができる。
【００４５】
目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＭＥＳ（2-Morpholinoethansulphonic Acid）、リン酸等が用いられるが、弱酸性から中性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、塩類（例えば、塩化ナトリウム等）及びタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン等）が添加される。また、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性発現に必須の２価金属イオン（例えば、カルシウム、バリウムなど）を含み、更にはメタロプロテアーゼ以外の酵素活性を阻害する薬剤などを添加してもよい。これ以外にも免疫反応を増感する目的で添加物などを加えることも可能である。
【００４６】
不溶性磁性粒子は、反応液に対して通常０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．３重量％、酵素標識抗体等は反応液に対して通常０．００００１〜１０ｍＡｂｓ、好ましくは０．０１〜１ｍＡｂｓとなるように使用される。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動によるＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性の測定におけるＤＥＡＥ−デキストランの効果》
ＡＤＡＭＴＳ１３を含む正常ヒトプール血漿及びその希釈系列を、トリス緩衝液（ｐＨ７．４；１．５ｍｏｌ／Ｌ尿素及び０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化バリウム含有）と等量混合し、更に終濃度２．４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように４−［２−アミノエチル］−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（4-[2-Aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride, hydrochloride；Pefabloc；Roche社）を添加した。このように処理したサンプル溶液を、ｖＷＦ（非特許文献３に記載の方法により、ヒト血漿から精製したもの）３μｇ／ｍＬ及びＤＥＡＥ−デキストラン［Diethylaminoethyl-Dextran（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）］（終濃度０．１％又は０．２％）含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１．５ｍｏｌ／Ｌ尿素）と１：５の容量比で混合し、３７℃で２時間インキュベーションし、ｖＷＦをサンプル溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３で分解した。なお、本実施例で使用したＤＥＡＥ−デキストランは、平均分子量５００，０００で、Ｎ含有量は約３．２％であり、この値からおおよそグルコース３個に対して陽イオン性を発揮する置換基が１個導入されているものに相当する。分解反応は、終濃度４０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＤＴＡを添加することにより停止させた。このように調製したサンプルを非還元下のＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動（１．４％アガロースゲル）にて分離後、ウエスタンブロット法にて、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜にトランスファーした。市販のブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬）で室温にてブロッキングした後、トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。トリス緩衝液（ｐＨ７．４）／１０％ブロックエースで１／１０００希釈したＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗ｖＷＦ抗体（ＤＡＫＯ社）にて１時間室温で反応させた後、トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄後、市販の発色キット（イムノステインＨＲＰ−１０００；コニカ社）にて発色した。
【００４８】
電気泳動の結果を図１に示す。図１に示す各レーンのＮＨＰ（Normal human plasma：正常ヒトプール血漿）と数値は、正常ヒトプール血漿を１（＝１００％）とした場合の、正常ヒトプール血漿及びその希釈系列に含まれるプール血漿の含有割合である。サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３によりｖＷＦが分解され、そのマルチマーサイズに準じたｖＷＦバンドの長さとなって検出されている。ここで、ＤＥＡＥ−デキストランを添加した場合（０．１％及び０．２％）においては、これを添加しない場合（コントロール；記号「ctrl」）と比べて著しく、ｖＷＦマルチマーが分解し、そのｖＷＦバンドの長さが極端に短くなることが明らかとなった。
【００４９】
《実施例２：ＤＥＡＥ−デキストランとｖＷＦの相互作用解析》
実施例１にて使用したｖＷＦ及びＤＥＡＥ−デキストランの相互作用を観測するとともにその解離定数を測定した。測定にあたっては、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｊ（ビアコア社）を使用した。
【００５０】
ｖＷＦの固定化はセンサーチップＣＭ５（ビアコア社）に対して行った。固定化方法は、ＣＭデキストラン中のカルボキシル基をＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）／ＥＤＣ［1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride］混合液により活性化させ、ｖＷＦ中のアミノ基と結合させるアミンカップリング法で行った。ここでｖＷＦのチップへの固定化量は、約１０００ＲＵ（Resonance Unit）＝１ｎｇ／ｍｍ２とした。
【００５１】
次に、ｖＷＦ固定化チップを用い、ＤＥＡＥ−デキストランとの相互作用測定を行った。測定に使用するランニング緩衝液として、 ５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ−トリス（ｐＨ６）／２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むものを使用した。このランニング緩衝液にＤＥＡＥ−デキストランを、それぞれ数〜数十μｇ／ｍＬ程度の濃度になるように溶解し、流速３０μＬ／ｍｉｎでｖＷＦとＤＥＡＥ−デキストランの相互作用を測定した。ＤＥＡＥ−デキストランとvＷＦの相互作用結果を図２に示す。結合相は０〜１８０ｓｅｃ 、解離相は１８０〜３６０ｓｅｃである。ここで相互作用させるＤＥＡＥ−デキストランの濃度依存性が得られ、ここから得られた相互作用曲線を、解析プログラムBIAevaluation version 3.0（ビアコア社）を用い、線形あるいは非線形解析を行った。その結果算出されたＤＥＡＥ−デキストランとｖＷＦの解離定数は、３．２１×１０−９ｍｏｌ／Ｌであった。
【００５２】
この解離定数から、実施例１又は実施例３において基質とＤＥＡＥ−デキストランを共存させた条件下においては基質とＤＥＡＥ−デキストランは複合体を形成しうることが判明した。この結果により、ＤＥＡＥ−デキストランを添加した場合に得られた切断亢進効果は基質とＤＥＡＥ−デキストランが複合体を形成した際にＡＤＡＭＴＳ１３に切断されやすいフォームが形成されることが推察される。
【００５３】
《実施例３：ＤＥＡＥ−デキストラン存在下でのＡＤＡＭＴＳ１３活性の自動化測定》
（１）基質の調製
ＡＤＡＭＴＳ１３の基質として、ｖＷＦの部分断片（第１５９６番〜第１６６８番のアミノ酸からなる断片。以下、ｖＷＦ７３と称する）を、Koichi Kokame, Masanori Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata, VWF73, a region from D1596 to R1668 of von Willebrand factor, provides a minimal substrate for ADAMTS-13. Blood, Jan 2004; 103: 607 - 612に記載の方法に従って、調製した。ここにおいて、実際のアッセイに使用したものは７３アミノ酸のＮ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと称する）、そしてＣ末端に６ＸＨｉｓを導入したもの（以下、ＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈと称する）を用いた。
【００５４】
（２）磁性粒子への抗体の結合
２．４μｍの粒径の磁性ラテックス（ＪＳＲ製）の１％溶液と抗ＧＳＴ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）（約２００μｇ）とを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中で室温にて１時間反応させ、前記緩衝液で洗浄後、０．３％ウシアルブミン／０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）によるブロッキングを行い、抗ＧＳＴ抗体結合磁性粒子を調製した。
【００５５】
（３）ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定
小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて測定を行った。詳細には、健常ヒト血漿の希釈サンプル６０μＬとＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈを１ｍＡｂｓ及びＤＥＡＥ−デキストラン（０．０５％、０．１％、０．２％、０．４％）及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Complete Mini EDTA-free；Roche社）を適量含む緩衝液［５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ−トリス（ｐＨ６）／２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ社）：以下反応緩衝液と称する］５０μＬを３７℃で３．３分間反応させた。ここに更に（２）で調製した抗ＧＳＴ抗体結合磁性粒子が前記反応緩衝液に０．０３％懸濁された溶液６０μＬを加え、３７℃で２．５分間反応させた。ここに更にＨＲＰ標識抗６ＸＨｉ抗体（Roche社）が前記反応緩衝液に１／５００希釈された溶液６０μＬを加え、３７℃で４分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＬ／０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液［ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate（PIERCE社）溶液］１００μＬを混合し、３７℃で２分間反応させ、発光量をカウントした。ブランクとして、５６℃で非動化処理しＡＤＡＭＴＳ１３活性を失活させた健常ヒト血漿を使用した。
【００５６】
結果を図３に示す。この態様においては、その酵素量又は活性が高いほど分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。ここでは、ブランク（５６℃で非動化処理血漿サンプル）の発光カウント（Ｓ）と血漿サンプルを使用した場合の発光カウント（Ｎ）との比（Ｓ／Ｎ）をとることによって切断を受けた基質の量、すなわち、酵素活性の度合いを比較した。ＤＥＡＥ−デキストランを添加した場合（特には０．１％及び０．２％）においては、これを添加しない場合（ctrl）と比べて、前記比において１０倍以上の増加を認めた。これは先の結果と同様、ＤＥＡＥ−デキストランとＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈが複合体を形成した際にＡＤＡＭＴＳ１３に切断されやすいフォームを形成し、ＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈが効率よく切断された結果によるものと思われた。
【００５７】
（４）各種デキストラン添加条件下におけるＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定
前記実施例３（３）で実施したＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定と同一条件下で、ＤＥＡＥ−デキストランの代わりに、デキストラン又はデキストラン硫酸を含む条件下で測定を行った。結果を図４に示す。図４に示すように、前記と同様ブランクの発光カウント（Ｓ）と血漿サンプルを使用した場合の発光カウント（Ｎ）との比（Ｓ／Ｎ）を比較したところ、デキストラン及びデキストラン硫酸はその酵素活性の増加を認めるものではなかった。また、実施例２と同一条件下で行ったＢＩＡＣＯＲＥによる測定においても、デキストラン及びデキストラン硫酸はｖＷＦ固定化チップに相互作用することを認めなかった。
【００５８】
（５）ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定（公知法との相関）
ＤＥＡＥ−デキストラン存在下での自動化活性測定［小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）］がＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定として特異的であることを検証するために。前記方法にてＡＤＡＭＴＳ１３活性測定値が１５〜７５％（健常ヒトプール血漿を１００％とした）に分布する臨床検体を測定し、既存法により算出された値との整合性を比較検討した。既存のＡＤＡＭＴＳ１３活性測定法としてはＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３［（株）ペプチド研究所（非特許文献４）］を使用した。
【００５９】
結果を図５及び図６に示す。この態様においてはその酵素量又は活性が高いほど分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。健常ヒト血漿の希釈系列を調製し、これを測定することにより臨床検体を定量するための標準曲線を作成した（図５）。この標準曲線を用い、臨床検体を測定することにより得られた発光カウントを健常ヒトプール血漿が１００％としたときの％表示に算出し直し、臨床検体のＡＤＡＭＴＳ１３活性測定値とした。この結果、既存法と極めて良好な相関係数（ｒ＝０．８８４）となり、本法において測定されたものがＡＤＡＭＴＳ１３活性として特異的であると考えられた（図６及び表１）。
【００６０】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の分析方法は、臨床診断検査の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＤＥＡＥ−デキストラン存在下又は非存在下において、ＡＤＡＭＴＳ１３で分解した組換えｖＷＦの電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】ビアコアシステムで測定した、ＤＥＡＥ−デキストランとｖＷＦとの相互作用の結果を示すグラフである。
【図３】小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン存在下でのＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ＡＤＡＭＴＳ１３活性向上効果について、ＤＥＡＥ−デキストランと、デキストラン又はデキストラン硫酸とを比較した結果を示すグラフである。
【図５】小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて作成した標準曲線を示すグラフである。
【図６】小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）の測定結果と既存法による測定結果との相関関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中に含まれるフォンヴィルブランド因子（von Willebrand factor；以下、ｖＷＦと称する）分解酵素の分析方法及び分析用キットに関する。
近年、血小板血栓形成傾向の程度あるいは血栓症の検出等に際し、ｖＷＦ分解酵素［以下、ＡＤＡＭＴＳ１３（ｖＷＦ分解酵素の別称）と称する］の活性測定はその臨床的価値が認知されつつある。本発明方法によれば、簡便性、迅速性、及び感度に優れたＡＤＡＭＴＳ１３分析法を実現することができ、更には極めて短時間の測定によって全自動分析装置により酵素活性量を精細に定量化することができる。なお、本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭＴＳ１３は、元来、非常に重篤な致死率の高い血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura；以下、「ＴＴＰ」と称する）の発症に関与することが示唆され、血漿から精製され（非特許文献１）、ｃＤＮＡクローニングによりその遺伝子が決定された。実際、ＡＤＡＭＴＳ１３の遺伝子変異がｖＷＦ分解活性を著しく低下させることが明らかにされている（非特許文献２）。近年、ＡＤＡＭＴＳ１３に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を応用した酵素免疫測定法が開発され（特許文献１）、血小板凝集が関与した血栓症の原因及び血栓症の血栓形成傾向の検出法が確立された。これを使用し、各種血栓症患者の血漿中におけるＡＤＡＭＴＳ１３の濃度が健常人と比べて顕著に低下していることが見いだされている。
【０００３】
ＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定法は、従来より、ＳＤＳ−アガロース電気泳動とオートラジオグラフィー又はウエスタンブロット法とを組み合わせたｖＷＦ巨大マルチマーの検出法が用いられてきた（非特許文献３）。また近年、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｖＷＦの特異的分解部位であるＡ２ドメイン７３残基を用い、その周辺部位に蛍光基と消光基を導入したＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３が開発され、ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定が簡便に行われるようになった（非特許文献４）。
【０００４】
しかし、これら活性を測定する方法は操作が極めて煩雑であったり、またその測定に特殊な蛍光検出器を必要としたり、臨床検体の測定からその結果の出力までに多大な時間を要するために実際の臨床診断検査の現場での使用に堪えうるものではない。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２９２４２号パンフレット
【非特許文献１】ケー・フジカワ（K. Fujikawa）ら，「ブラッド（Blood）」,（米国），２００１年，第９８巻，ｐ．１６６２−６
【非特許文献２】ジー・ジー・レビー（G. G. Levy）ら，「ネイチャー（Nature）」，（英国），２００１年，第４１３巻，ｐ．４８８−４９４
【非特許文献３】エム・フルラン（M. Furlan）ら，「ブラッド（Blood）」，（米国），１９９６年，第８７巻，ｐ．４２２３−４２３４
【非特許文献４】コカメ・ケー（Kokame K）ら「ブリティッシュ ジャーナル オブ ヘマトロジー（British Journal of Haematology）」，（英国），２００５年，第１２９巻，９３−１００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のようにＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定は今後、臨床上、非常に有用で各種病態解明の中心となることが予想される。このような病態の診断においては簡便でかつ極めて迅速なＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定が求められることが予想される。これら求められる要素を実現するためには従来にない極めて短時間のＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定が必須となり、例えば測定者に極力負荷をかけない全自動化装置による短時間のＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定はその実例となり得ると考えられる。
【０００７】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、フォンヴィルブランド因子の基質となる断片を捕捉しうる磁性粒子及び、その断片を認識しうる酵素標識化パートナーを使用した全自動化装置によりＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定が行えることを示し、更にはＡＤＡＭＴＳ１３とその基質が接触する溶液中に、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することで、基質側にＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されやすい状況が発生し、その結果として酵素活性が著しく亢進し、従来にない極めて短時間でのＡＤＡＭＴＳ１３活性の定量測定を実現させることができ、ここに本発明を完成するに至った。
【０００８】
従って、本発明の課題は、従来にない極めて短時間でＡＤＡＭＴＳ１３活性量を正確に定量することができる分析方法及び分析用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、
［１］フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質を用いるフォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法において、被検試料と前記基質との液中での接触を、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下で実施することを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法；
［２］前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とする多糖類である、［１］の分析方法；
［３］前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とし、カチオン性を発揮する官能基として第３級アミノ基及び／又は第四級アンモニウム基を有する多糖類である、［１］の分析方法；
［４］前記カチオン性水溶性多糖類が、ＤＥＡＥ−デキストランである、［１］の分析方法；
［５］前記分析を全自動分析装置を用いて実施する、［１］〜［４］の分析方法；
［６］前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の基質を、捕捉することのできる不溶性担体を使用する、［１］〜［５］の分析方法；
［７］不溶性担体が粒子である、［６］の分析方法；
［８］粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である、［７］の分析方法；
［９］前記基質が、フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断され遊離する基質断片側において標識物質で標識されているか、あるいは、特異的に認識されうるアミノ酸配列を有している、［６］〜［８］の分析方法；
［１０］標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である、［９］の分析方法；
［１１］前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するパートナーを使用する、［６］〜［８］の分析方法；
［１２］（１）フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、（２）基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含むことを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析用キット
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することで、基質側にＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されやすい状況が発生し、ＡＤＡＭＴＳ１３の基質を切断する酵素活性が、これを共存させない場合と比較し、極めて向上することを発見した。この発見を応用することにより、従来行われてきたＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定法に必要とされた時間（特にＡＤＡＭＴＳ１３と基質との接触時間）を大幅に短縮することができた。これにより、全自動化装置による測定に代表されるような簡便でかつ極めて迅速な定量測定が達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の分析方法では、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質、すなわち、フォンヴィルブランド因子の全長又はその基質となる部分の断片を少なくとも用いる。本発明の分析方法は、例えば、
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて、液中で接触させる工程、
（２）前記基質がＡＤＡＭＴＳ１３により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の前記基質とを分離する工程、並びに
（３）分離した前記基質断片及び／又は前記基質を分析する工程
を含むことができる。
【００１２】
本発明の分析方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質又は切断後の基質断片と特異的に反応することのできるパートナー（好ましくは抗体）を使用せずに実施することもできるし、あるいは、前記パートナーを使用して実施することもできる。前記パートナーを使用せずに実施する態様としては、例えば、切断後の基質断片を電気泳動で確認する方法、基質として、例えば、基質の切断部位周辺に蛍光基と消光基が導入されており、その切断により蛍光を検出できる基質［例えば、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３（非特許文献４）］を使用する方法などを挙げることができる。
【００１３】
本発明の分析方法では、簡便で迅速な定量測定を行うことができる点で、不溶性担体を使用した測定が好適である。不溶性担体を使用する態様では、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質を、不溶性担体に予め結合させた状態で使用することもできるし、あるいは、被検試料と接触させた後の基質（ＡＤＡＭＴＳ１３により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の基質を含む）を、不溶性担体と接触させることもできる。
【００１４】
本発明の分析方法において、不溶性担体を用いる態様では、例えば、
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、ＡＤＡＭＴＳ１３により切断可能な基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて、液中で接触させる工程、
（２）前記工程（１）の後に、あるいは、同時に、前記基質又は切断後の基質断片を捕捉することのできる不溶性担体（所望により、更に標識化パートナー等）を接触させる工程、
（３）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに
（４）不溶性担体に残存する基質又は基質断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質又は基質断片を分析する工程
を含むことができる。
【００１５】
更に、本発明の分析方法には、用いる標識物質の標識化の態様に基づいて、例えば、
（ａ）基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、他の物質により認識されうる配列又は構造を有しており、これを認識することができる標識化パートナーを用いる態様、
（ｂ）基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、標識物質で直接標識化されている態様、又は
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じる基質のネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いる態様
が含まれる。
【００１６】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料としては、分析対象であるｖＷＦ分解酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む可能性のある試料であれば特に限定されないが、例えば、生物学的液体試料、特には、血液、血清、血漿、尿、又は髄液等を挙げることができる。
【００１７】
なお、本発明の分析方法によって分析可能な分析対象酵素は、現在ｖＷＦ分解酵素として考えられているＡＤＡＭＴＳ１３をその代表と考えるが、ｖＷＦをその特異的部位［ｖＷＦのＡ２ドメインのチロシン（１６０５）とメチオニン（１６０６）の間］で切断可能な酵素である限り、特に限定するものではない。このことは、例えば、将来的にＡＤＡＭＴＳ１３以外のｖＷＦ分解酵素が発見された場合、あるいはＡＤＡＭＴＳ１３と複合体などを形成し切断活性を調整する制御因子などが発見された場合も、これらを含有するものとする。
【００１８】
本発明の分析方法で用いる酵素基質は、ｖＷＦのＡ２ドメインのチロシン（１６０５）とメチオニン（１６０６）の間で特異的にプロテアーゼにより切断可能な物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ｖＷＦの全長、あるいは、その基質となる部分の断片等を用いることができ、ｖＷＦの全長あるいはその特異的基質となる部分の最短領域を含むものが好ましい。前記基質は、周知方法により調製することができ、例えば、寄生生物の粗抽出品又は精製品をヒトや動物の体液より採集する方法、生物由来の粗抽出品又は精製品を人工的に養殖した生物から取得する方法、核酸又はタンパク質を遺伝子組換え技術や細胞培養技術により生産する方法、あるいは、ポリペプチドやハプテンを化学合成技術で合成する方法などが挙げられる。
【００１９】
本発明で使用するカチオン性水溶性多糖類は、基質と複合体を形成可能なもので、ＡＤＡＭＴＳ１３に切断されやすいフォームを形成させるものである限り、特に限定されるものではない。
カチオン性水溶性多糖類の水溶性多糖類部分は、その構成単位として、例えば、Glc（グルコース、Gal（ガラクトース)、Man（マンノース）、GlcUA（グルクロン酸）、IdoA（イズロン酸）、Fuc（フコース）、GlcN（D-glucosamine：グルコサミン、GlcNH2）、GlcNAc（N-アセチルグルコサミン）、GalNAc（N-アセチルガラクトサミン）、NeuAc（N-アセチルノイラミン酸）、NeuGc（N-グリコリルノイラミン酸）等を挙げることができ、グルコースであることが好ましい。水溶性多糖類部分は、これらの１種類の構成単位のみからなることもできるし、あるいは、２種類以上の構成単位からなることもできる。
【００２０】
水溶性多糖類としては、例えば、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース等）エーテル、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ヘパリン、ヒアルロン酸などを挙げることができ、本発明で用いるカチオン性水溶性多糖類としては、これらの水溶性多糖類の官能基に化学修飾を施しカチオン性を付与させたものを挙げることができる。なお、前記水溶性多糖類の内、元来カチオン性を有するキトサン又はＤＥＡＥ−デキストランについては、前記化学修飾を施すこともできるが、前記化学修飾を施すことなく、カチオン性水溶性多糖類としてそのまま使用することができる。水溶性多糖類としては、元来カチオン性を有する点で、キトサン又はＤＥＡＥ−デキストランが好ましい。
【００２１】
カチオン性水溶性多糖類は、その陽イオン性を発揮するための塩基性官能基として、例えば、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、第四級アンモニウム基、アミジノ基、グアニジノ基、イミダゾール基などが挙げられ、例えば、第三級アミノ基、第四級アンモニウム基であることが好ましい。更に本発明で使用する最も適した塩基性官能基としては、第三級アミノ基であるＤＥＡＥ基、あるいは、第四級アンモニウム基と第三級アミノ基が結合したタンデム構造であるＤＥＡＥ−ＤＥＡＥ基が好ましい。
【００２２】
本発明で用いるカチオン性水溶性多糖類としては、ＤＥＡＥ−デキストランが最も好ましい。なお、一般に市販されているＤＥＡＥ−デキストランは、ＤＥＡＥ基とＤＥＡＥ−ＤＥＡＥ基の両方を含んでおり、本明細書における「ＤＥＡＥ−デキストラン」は、塩基性官能基としてＤＥＡＥ基及び／又はＤＥＡＥ−ＤＥＡＥ基を含むデキストランを意味する。ＤＥＡＥ−デキストランの分子量は、構成単位であるグルコースの数によりその分子量が決定され、通常、１０，０００〜２，０００，０００であり、このうち１００，０００〜１，０００，０００が好ましく、３００，０００〜７００，０００が特に好ましい。また、Ｎ含有量は通常０．１〜２０％であり、このうち０．５〜１０％が好ましく、１〜５％のものが特に好ましい。
【００２３】
本発明方法において使用することのできる不溶性担体としては、酵素基質又は切断後の基質断片を捕捉可能であるものであればいかなる形態の不溶性担体でも利用可能であり、例えば、基質及び／又は切断後の基質断片に特異的なパートナーを物理的に吸着可能な材質や化学結合で担持させうる適当な官能基を有する材質［例えば、各種プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はポリテトラフルオロエチレン）からなるプレート、チュ−ブ、ビーズ、チップ、ガラス、磁性担体、ラテックス粒子、又は膜などを利用することができる。Ｂ／Ｆ分離する際の操作が簡便な点、また全自動化装置による測定へのアプリケーションのしやすさの観点からここでは不溶性磁性粒子を用いることが好ましい。
【００２４】
不溶性磁性粒子の粒径は、通常０．０５μｍ〜５μｍのものが用いられ、０．３μｍ〜３μｍの範囲の粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。物理的に吸着させる方法としては、不溶性磁性粒子に、タンパク質を直接固定化する方法が挙げられる。化学的に担持させる方法としては、例えば、磁性粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することによりタンパク質と結合させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒子と基質分子の間にスペーサー分子を化学結合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質を前記の方法で結合させた後、抗体などをその上から更に結合させる方法、又はアルブミンなどの他のタンパク質と抗体などを化学結合させた後、その複合タンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。一般的に担持されるタンパク質の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量等により適宜決定することができる。
【００２５】
本発明方法において使用することのできる標識化パートナーとして、前記基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、他の物質により認識されうる配列又は構造を有している場合、これを認識することができる性質を有しているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抗体若しくはその断片［例えば、Ｆａｂ’，ｓｃＦｖ，Ｖ−ドメインプロテイン（domain Proteins）等］又はアフィボディ（Affibody）、アプタマー等が挙げられる。抗体を使用する場合、前記抗体は、他の物質により認識されうる配列又は構造を有しているものにより適宜選択することができ、予めヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジなどに基質又はその断片を免疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体などを利用することができる。
【００２６】
本発明方法における使用することのできる標識化パートナーで、基質がＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合可能な物質であるものは、これを認識することができる性質を有しているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抗体若しくはその断片（例えば、Ｆａｂ’，ｓｃＦｖ，Ｖ−ドメインプロテイン等）又はアフィボディ、アプタマー等が挙げられる。標識化パートナーとして抗体を使用する場合、前記抗体は、使用する基質により適宜選択することができ、予めヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジなどに基質又はその断片を免疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体などを利用することができる。
【００２７】
本発明においてはパートナーへ標識する場合、ＡＤＡＭＴＳ１３による切断部位とは異なる部位に標識物質を結合させる。標識化基質（好ましくは酵素標識基質）又は標識化パートナー（好ましくは酵素標識パートナー物質、特には酵素標識抗体）の調製方法は周知であり、任意の方法を選択することができる。
【００２８】
本発明で用いる標識物質としては、公知の各種標識物質を用いることができ、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光物質（例えば、フルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、時間分解蛍光測定が可能な希土類若しくは希土類錯体（例えば、ユーロピウム、ユーロピウム錯体など）、化学発光物質（例えば、アクリジニウムエステル等）、ラジオアイソトープ（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐなど）、発色物質［例えば、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）］を用いることができる。すなわち、発色、蛍光、時間分解蛍光、化学発光、電気化学発光、放射活性等を測定する方法を用いることができる。
【００２９】
標識物質由来のシグナル強度の変化を検出する手段としては、標識物質の種類及び測定機器の特性によって適宜選択され、周知の方法、例えば、比色法、蛍光法、又は発光法などを利用することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを用いた場合、ルミノールを基質として化学発光法で検出することも可能で、特に微量測定に好適である（例えば、田中弘一郎、石川榮治：西洋ワサビペルオキシダーゼを標識とする酵素免疫測定法における蛍光法と発光法の比較、臨床検査機器・試薬、１１：５６７−５６９，１９８８）。また、標識物質としてアルカリホスファターゼを用いた場合、ジオキセタン系基質であるＡＭＰＰＤ［3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”phosphoroxy)phenyl-1,2-dioxetane］、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ［1,2-dioxetane（トロピックス社）］等の公知基質を用いると、より好感度に検出することができるため、好ましい。
【００３０】
以下、本発明の分析方法について、実施態様毎に、具体的な測定手順を示すことにより、更に詳細に説明する。
【００３１】
本発明の分析方法の一態様である、基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断により遊離する基質断片側において、他の物質により認識されうる配列又は構造を有しており、これを認識することができる標識化パートナーを用いる態様では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、
（Ａ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて液中で接触させる工程、
（Ａ２）前記液と不溶性担体と標識化パートナーとを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液とを分離する工程、並びに
（Ａ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含むことができる。
前記工程（Ａ２）で用いる前記不溶性担体には、前記基質の前記末端を特異的に認識するパートナーが担持されている。また、前記工程（Ａ２）で用いる前記標識化パートナーは、前記基質のもう一方の末端を特異的に認識することができるパートナーを標識化したものである。
【００３２】
前記工程（Ａ１）で用いる基質は、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質である。この基質は、ＡＤＡＭＴＳ１３の特異的切断部位を有しており、この切断部位とは明らかに異なる基質の両末端側が他の物質により認識されうる配列又は構造を有している。工程（Ａ１）において、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質と、被検試料とを同時に接触させると、ＡＤＡＭＴＳ１３が通常、基質単体で遊離している場合よりも、より効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。また、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質とを予め混合させておき、カチオン性水溶性多糖類と基質との複合体を形成させておき、これにＡＤＡＭＴＳ１３を含有する被検試料を接触させると、更に効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。本工程を通してＡＤＡＭＴＳ１３と基質との接触時間は特に限定されるものではないが、本発明方法では、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することにより、望ましい反応性（ＡＤＡＭＴＳ１３が健常人血中に存在する量の数％に相当する量を検出することができる）を保有した上で、非常に短時間、例えば、２０分以内、好ましくは３分〜１５分の接触時間での測定を可能とさせる。
【００３３】
前記工程（Ａ２）では、前記工程（Ａ１）を実施した後に、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性により切断された基質断片、及び切断されなかった基質のそれぞれが、他の物質により認識されうる配列又は構造を少なくとも片側の末端に有しているため、前記末端を特異的に認識するパートナーを担持する不溶性担体へ結合しうる。不溶性担体に結合した未切断基質は、標識化パートナーが認識可能な末端を有するため、更に、標識化パートナーが結合している。一方、不溶性担体に結合した切断基質断片は、標識化パートナーが認識可能な末端を有しないため、標識化パートナーは結合していない。それ以外の画分（すなわち、遊離している基質断片及び被検試料を含む液画分）は、工程（Ａ２）で分離される。この分離操作は、常法により実施することができ、例えば、不溶性担体として磁性粒子を用いる場合には、例えば、磁石を使用することにより、あるいは、遠心操作により分離することができる。不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合には、例えば、遠心操作又は濾過により分離することができる。次の工程（Ａ３）で不溶性担体に含まれる標識物質を分析する場合には、前記分離後に不溶性担体を洗浄することにより、遊離基質断片を充分に除去することが好ましい。
【００３４】
前記工程（Ａ３）では、切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、若しくは、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片、又はその両方を分析することができる。
切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する場合には、遊離基質断片を認識しうる標識化パートナーに含まれる標識物質の量を測定することにより、遊離基質断片の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が増加することとなる。
一方、不溶性担体に切断されずに捕捉される基質を分析する場合、結合している標識化パートナーに含まれる標識物質の量を測定することにより、切断されなかった基質の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。
【００３５】
本発明の分析方法の一態様である、基質が標識物質で直接標識化されている態様では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、
（Ｂ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、標識化された基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて液中で接触させる工程、
（Ｂ２）前記液と不溶性担体とを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液を分離する工程、並びに
（Ｂ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含む。
前記工程（Ｂ２）で用いる前記不溶性担体には、前記基質の標識化された末端と反対側の末端を特異的に認識するパートナーが担持されている。
【００３６】
前記工程（Ｂ１）で用いる基質は、末端を標識物質で標識された基質である。この基質はＡＤＡＭＴＳ１３の特異的切断部位を有しており、片方が標識物質で標識され、もう片方が他の物質により認識されうる配列又は構造を有している。工程（Ｂ１）において、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質と、被検試料とを同時に接触させると、ＡＤＡＭＴＳ１３が通常、基質単体で遊離している場合よりも、より効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。また、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類と、前記基質とを予め混合させておき、カチオン性水溶性多糖類と基質の複合体を形成させておき、これにＡＤＡＭＴＳ１３を含有する被検試料を接触させると、更に効率的に特異的切断部位で基質を切断することができる。本工程を通してＡＤＡＭＴＳ１３と基質との接触時間は特に限定されるものではないが、本発明方法では、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類を添加することにより、望ましい反応性（ＡＤＡＭＴＳ１３が健常人血中に存在する量の数％に相当する量を検出することができる）を保有した上で、非常に短時間、例えば、２０分以内、好ましくは３分〜１５分の接触時間での測定を可能とさせる。
【００３７】
前記工程（Ｂ２）では、前記工程（Ｂ１）を実施した後に、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性により切断された基質断片、及び切断されなかった基質のそれぞれが、他の物質により認識されうる配列又は構造を少なくとも片側の末端（すなわち、標識化された末端と反対側の末端）に有しているため、前記末端を特異的に認識するパートナーを担持する不溶性担体へ結合しうる。また、切断されずに不溶性担体へ結合した基質は、片方の末端が標識物質で標識されている。それ以外の画分（すなわち、遊離している基質断片及び被検試料を含む液画分）は、工程（Ｂ２）で分離される。この分離操作は、常法により実施することができ、例えば、不溶性担体として磁性粒子を用いる場合には、例えば、磁石を使用することにより、あるいは、遠心操作により分離することができる。不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合には、例えば、遠心操作又は濾過により分離することができる。次の工程（Ｂ３）で不溶性担体に含まれる標識物質を分析する場合には、前記分離後に不溶性担体を洗浄することにより、遊離基質断片を充分に除去することが好ましい。
【００３８】
前記工程（Ｂ３）では、切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、若しくは、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片、又はその両方を分析することができる。
切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する場合には、遊離基質断片に含まれる標識物質の量を測定することにより、遊離基質断片の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が増加することとなる。
一方、不溶性担体に切断されずに捕捉される基質を分析する場合、片方の末端に標識化された標識物質の量を測定することにより、切断されなかった基質の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有されるＡＤＡＭＴＳ１３の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。
【００３９】
本発明の分析方法の一態様である、ＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じる基質のネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いる態様では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、
（Ｃ１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、他の物質により認識されうる配列又は構造を末端に有している基質とを、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下にて液中で接触させる工程、
（Ｃ２）前記液と不溶性担体と前記標識化パートナーとを混合し、更に不溶性担体とこれ以外の液とを分離する工程、並びに
（Ｃ３）切断されずに不溶性担体に捕捉される基質、及び／又は、切断を受けて不溶性担体に捕捉されずに遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含むことができる。前記工程（Ｃ２）で用いる前記不溶性担体には、切断後の基質断片におけるネオアンチゲンとは反対側の末端を特異的に認識するパートナーが担持されている。
【００４０】
本明細書において「ネオアンチゲン」とは、基質が分解酵素による切断を受けることにより新しく生じる配列又は構造を意味し、切断を受けたアミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側、又はその両方において適宜実施することが可能である。
【００４１】
例えば、（Ｃ２）の工程で標識化パートナーは、基質がＡＤＡＭＴＳ１３で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するため、酵素切断前の基質とは結合せず、ＡＤＡＭＴＳ１３自身の酵素反応は、標識化パートナーの存在の有無と無関係に進行する。ここで、切断部位との反対側に他の物質により認識されうる配列又は構造を有しており、これを認識することができる物質を不溶性担体に結合させておけば、基質断片と標識化パートナー（好ましくは標識化抗体）との複合体（好ましくは免疫複合体）を不溶性担体に捕捉することができる。
【００４２】
この態様における工程（Ｃ３）では、不溶性担体に捕捉された切断基質断片に特異的に結合した標識化パートナーの標識物質の量を測定することにより、切断された基質の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中にＡＤＡＭＴＳ１３が含まれる場合、その酵素量又は活性が高いほど、分析に持ち込まれる標識物質が増加することとなる。
【００４３】
本発明の分析用キットは、少なくとも、フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含み、標識物質及び検出系などに応じて、例えば、基質、洗浄液、検体希釈液、及び／又は反応増幅剤を更に含むことができる。例えば、第一試薬に基質、第二試薬に基質を捕捉しうる固定化担体、第三試薬に標識化パートナー、第四試薬に標識物質の信号を発現させる物質を含ませることができる。具体的には、例えば、
第一試薬：基質及び水溶性ポリマーを含む溶液
第二試薬：基質を捕捉しうる表面処理が施された磁性粒子など
第三試薬：切断断片を特異的に認識する、あるいは基質を認識しうる標識化抗体など（例えば、標識をアルカリホスファターゼ）
第四試薬：化学発光用基質（例えば、ＡＭＰＰＤ）
からなる試薬構成を挙げることができ、標識物質、検出系により、適宜組成を変更し、種々の構成とすることが可能である。
【００４４】
各試薬添加後の混合は充分に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止め放置して反応させてもよい。反応は通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８にて行う。温度については、通常２〜５０℃の範囲で実施可能であるが、望ましくは室温あるいは３０〜４５℃で反応させる。反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意であるが、本発明では水溶性高分子ポリマーを添加することにより、望ましい反応性（ＡＤＡＭＴＳ１３が健常人血中に存在する量の数％に相当する量を検出できる）を保有した上で非常に短時間の測定を（基質と被検試料との接触時間として２０分以内、測定全てに必要な時間として３０分以内）実現することができる。
【００４５】
目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＭＥＳ（2-Morpholinoethansulphonic Acid）、リン酸等が用いられるが、弱酸性から中性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、塩類（例えば、塩化ナトリウム等）及びタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン等）が添加される。また、ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性発現に必須の２価金属イオン（例えば、カルシウム、バリウムなど）を含み、更にはメタロプロテアーゼ以外の酵素活性を阻害する薬剤などを添加してもよい。これ以外にも免疫反応を増感する目的で添加物などを加えることも可能である。
【００４６】
不溶性磁性粒子は、反応液に対して通常０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．３重量％、酵素標識抗体等は反応液に対して通常０．００００１〜１０ｍＡｂｓ、好ましくは０．０１〜１ｍＡｂｓとなるように使用される。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動によるＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性の測定におけるＤＥＡＥ−デキストランの効果》
ＡＤＡＭＴＳ１３を含む正常ヒトプール血漿及びその希釈系列を、トリス緩衝液（ｐＨ７．４；１．５ｍｏｌ／Ｌ尿素及び０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化バリウム含有）と等量混合し、更に終濃度２．４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように４−［２−アミノエチル］−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（4-[2-Aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride, hydrochloride；Pefabloc；Roche社）を添加した。このように処理したサンプル溶液を、ｖＷＦ（非特許文献３に記載の方法により、ヒト血漿から精製したもの）３μｇ／ｍＬ及びＤＥＡＥ−デキストラン［Diethylaminoethyl-Dextran（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）］（終濃度０．１％又は０．２％）含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１．５ｍｏｌ／Ｌ尿素）と１：５の容量比で混合し、３７℃で２時間インキュベーションし、ｖＷＦをサンプル溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３で分解した。なお、本実施例で使用したＤＥＡＥ−デキストランは、平均分子量５００，０００で、Ｎ含有量は約３．２％であり、この値からおおよそグルコース３個に対して陽イオン性を発揮する置換基が１個導入されているものに相当する。分解反応は、終濃度４０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＤＴＡを添加することにより停止させた。このように調製したサンプルを非還元下のＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動（１．４％アガロースゲル）にて分離後、ウエスタンブロット法にて、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜にトランスファーした。市販のブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬）で室温にてブロッキングした後、トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。トリス緩衝液（ｐＨ７．４）／１０％ブロックエースで１／１０００希釈したＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗ｖＷＦ抗体（ＤＡＫＯ社）にて１時間室温で反応させた後、トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄後、市販の発色キット（イムノステインＨＲＰ−１０００；コニカ社）にて発色した。
【００４８】
電気泳動の結果を図１に示す。図１に示す各レーンのＮＨＰ（Normal human plasma：正常ヒトプール血漿）と数値は、正常ヒトプール血漿を１（＝１００％）とした場合の、正常ヒトプール血漿及びその希釈系列に含まれるプール血漿の含有割合である。サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３によりｖＷＦが分解され、そのマルチマーサイズに準じたｖＷＦバンドの長さとなって検出されている。ここで、ＤＥＡＥ−デキストランを添加した場合（０．１％及び０．２％）においては、これを添加しない場合（コントロール；記号「ctrl」）と比べて著しく、ｖＷＦマルチマーが分解し、そのｖＷＦバンドの長さが極端に短くなることが明らかとなった。
【００４９】
《実施例２：ＤＥＡＥ−デキストランとｖＷＦの相互作用解析》
実施例１にて使用したｖＷＦ及びＤＥＡＥ−デキストランの相互作用を観測するとともにその解離定数を測定した。測定にあたっては、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｊ（ビアコア社）を使用した。
【００５０】
ｖＷＦの固定化はセンサーチップＣＭ５（ビアコア社）に対して行った。固定化方法は、ＣＭデキストラン中のカルボキシル基をＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）／ＥＤＣ［1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride］混合液により活性化させ、ｖＷＦ中のアミノ基と結合させるアミンカップリング法で行った。ここでｖＷＦのチップへの固定化量は、約１０００ＲＵ（Resonance Unit）＝１ｎｇ／ｍｍ２とした。
【００５１】
次に、ｖＷＦ固定化チップを用い、ＤＥＡＥ−デキストランとの相互作用測定を行った。測定に使用するランニング緩衝液として、 ５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ−トリス（ｐＨ６）／２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むものを使用した。このランニング緩衝液にＤＥＡＥ−デキストランを、それぞれ数〜数十μｇ／ｍＬ程度の濃度になるように溶解し、流速３０μＬ／ｍｉｎでｖＷＦとＤＥＡＥ−デキストランの相互作用を測定した。ＤＥＡＥ−デキストランとvＷＦの相互作用結果を図２に示す。結合相は０〜１８０ｓｅｃ 、解離相は１８０〜３６０ｓｅｃである。ここで相互作用させるＤＥＡＥ−デキストランの濃度依存性が得られ、ここから得られた相互作用曲線を、解析プログラムBIAevaluation version 3.0（ビアコア社）を用い、線形あるいは非線形解析を行った。その結果算出されたＤＥＡＥ−デキストランとｖＷＦの解離定数は、３．２１×１０−９ｍｏｌ／Ｌであった。
【００５２】
この解離定数から、実施例１又は実施例３において基質とＤＥＡＥ−デキストランを共存させた条件下においては基質とＤＥＡＥ−デキストランは複合体を形成しうることが判明した。この結果により、ＤＥＡＥ−デキストランを添加した場合に得られた切断亢進効果は基質とＤＥＡＥ−デキストランが複合体を形成した際にＡＤＡＭＴＳ１３に切断されやすいフォームが形成されることが推察される。
【００５３】
《実施例３：ＤＥＡＥ−デキストラン存在下でのＡＤＡＭＴＳ１３活性の自動化測定》
（１）基質の調製
ＡＤＡＭＴＳ１３の基質として、ｖＷＦの部分断片（第１５９６番〜第１６６８番のアミノ酸からなる断片。以下、ｖＷＦ７３と称する）を、Koichi Kokame, Masanori Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata, VWF73, a region from D1596 to R1668 of von Willebrand factor, provides a minimal substrate for ADAMTS-13. Blood, Jan 2004; 103: 607 - 612に記載の方法に従って、調製した。ここにおいて、実際のアッセイに使用したものは７３アミノ酸のＮ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと称する）、そしてＣ末端に６ＸＨｉｓを導入したもの（以下、ＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈと称する）を用いた。
【００５４】
（２）磁性粒子への抗体の結合
２．４μｍの粒径の磁性ラテックス（ＪＳＲ製）の１％溶液と抗ＧＳＴ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）（約２００μｇ）とを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中で室温にて１時間反応させ、前記緩衝液で洗浄後、０．３％ウシアルブミン／０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）によるブロッキングを行い、抗ＧＳＴ抗体結合磁性粒子を調製した。
【００５５】
（３）ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定
小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて測定を行った。詳細には、健常ヒト血漿の希釈サンプル６０μＬとＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈを１ｍＡｂｓ及びＤＥＡＥ−デキストラン（０．０５％、０．１％、０．２％、０．４％）及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Complete Mini EDTA-free；Roche社）を適量含む緩衝液［５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ−トリス（ｐＨ６）／２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ社）：以下反応緩衝液と称する］５０μＬを３７℃で３．３分間反応させた。ここに更に（２）で調製した抗ＧＳＴ抗体結合磁性粒子が前記反応緩衝液に０．０３％懸濁された溶液６０μＬを加え、３７℃で２．５分間反応させた。ここに更にＨＲＰ標識抗６ＸＨｉ抗体（Roche社）が前記反応緩衝液に１／５００希釈された溶液６０μＬを加え、３７℃で４分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＬ／０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液［ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate（PIERCE社）溶液］１００μＬを混合し、３７℃で２分間反応させ、発光量をカウントした。ブランクとして、５６℃で非動化処理しＡＤＡＭＴＳ１３活性を失活させた健常ヒト血漿を使用した。
【００５６】
結果を図３に示す。この態様においては、その酵素量又は活性が高いほど分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。ここでは、ブランク（５６℃で非動化処理血漿サンプル）の発光カウント（Ｓ）と血漿サンプルを使用した場合の発光カウント（Ｎ）との比（Ｓ／Ｎ）をとることによって切断を受けた基質の量、すなわち、酵素活性の度合いを比較した。ＤＥＡＥ−デキストランを添加した場合（特には０．１％及び０．２％）においては、これを添加しない場合（ctrl）と比べて、前記比において１０倍以上の増加を認めた。これは先の結果と同様、ＤＥＡＥ−デキストランとＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈが複合体を形成した際にＡＤＡＭＴＳ１３に切断されやすいフォームを形成し、ＧＳＴ−ｖＷＦ７３−Ｈが効率よく切断された結果によるものと思われた。
【００５７】
（４）各種デキストラン添加条件下におけるＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定
前記実施例３（３）で実施したＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定と同一条件下で、ＤＥＡＥ−デキストランの代わりに、デキストラン又はデキストラン硫酸を含む条件下で測定を行った。結果を図４に示す。図４に示すように、前記と同様ブランクの発光カウント（Ｓ）と血漿サンプルを使用した場合の発光カウント（Ｎ）との比（Ｓ／Ｎ）を比較したところ、デキストラン及びデキストラン硫酸はその酵素活性の増加を認めるものではなかった。また、実施例２と同一条件下で行ったＢＩＡＣＯＲＥによる測定においても、デキストラン及びデキストラン硫酸はｖＷＦ固定化チップに相互作用することを認めなかった。
【００５８】
（５）ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定（公知法との相関）
ＤＥＡＥ−デキストラン存在下での自動化活性測定［小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）］がＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定として特異的であることを検証するために。前記方法にてＡＤＡＭＴＳ１３活性測定値が１５〜７５％（健常ヒトプール血漿を１００％とした）に分布する臨床検体を測定し、既存法により算出された値との整合性を比較検討した。既存のＡＤＡＭＴＳ１３活性測定法としてはＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３［（株）ペプチド研究所（非特許文献４）］を使用した。
【００５９】
結果を図５及び図６に示す。この態様においてはその酵素量又は活性が高いほど分析に持ち込まれる標識物質が減少することとなる。健常ヒト血漿の希釈系列を調製し、これを測定することにより臨床検体を定量するための標準曲線を作成した（図５）。この標準曲線を用い、臨床検体を測定することにより得られた発光カウントを健常ヒトプール血漿が１００％としたときの％表示に算出し直し、臨床検体のＡＤＡＭＴＳ１３活性測定値とした。この結果、既存法と極めて良好な相関係数（ｒ＝０．８８４）となり、本法において測定されたものがＡＤＡＭＴＳ１３活性として特異的であると考えられた（図６及び表１）。
【００６０】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の分析方法は、臨床診断検査の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＤＥＡＥ−デキストラン存在下又は非存在下において、ＡＤＡＭＴＳ１３で分解した組換えｖＷＦの電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】ビアコアシステムで測定した、ＤＥＡＥ−デキストランとｖＷＦとの相互作用の結果を示すグラフである。
【図３】小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン存在下でのＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ＡＤＡＭＴＳ１３活性向上効果について、ＤＥＡＥ−デキストランと、デキストラン又はデキストラン硫酸とを比較した結果を示すグラフである。
【図５】小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて作成した標準曲線を示すグラフである。
【図６】小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）の測定結果と既存法による測定結果との相関関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質を用いるフォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法において、被検試料と前記基質との液中での接触を、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下で実施することを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法。
【請求項２】
前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とする多糖類である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とし、カチオン性を発揮する官能基として第３級アミノ基及び／又は第四級アンモニウム基を有する多糖類である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記カチオン性水溶性多糖類が、ＤＥＡＥ−デキストランである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項５】
前記分析を全自動分析装置を用いて実施する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の基質を、捕捉することのできる不溶性担体を使用する、１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
不溶性担体が粒子である、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である、請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記基質が、フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断され遊離する基質断片側において標識物質で標識されているか、あるいは、特異的に認識されうるアミノ酸配列を有している、請求項６〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１０】
標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である、請求項９に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するパートナーを使用する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１２】
（１）フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、（２）基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含むことを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析用キット。
【請求項１】
フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質を用いるフォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法において、被検試料と前記基質との液中での接触を、基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類の存在下で実施することを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法。
【請求項２】
前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とする多糖類である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記カチオン性水溶性多糖類が、グルコースを構成単位とし、カチオン性を発揮する官能基として第３級アミノ基及び／又は第四級アンモニウム基を有する多糖類である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記カチオン性水溶性多糖類が、ＤＥＡＥ−デキストランである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項５】
前記分析を全自動分析装置を用いて実施する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じる基質断片、及び／又は、未切断の基質を、捕捉することのできる不溶性担体を使用する、１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
不溶性担体が粒子である、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である、請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記基質が、フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断され遊離する基質断片側において標識物質で標識されているか、あるいは、特異的に認識されうるアミノ酸配列を有している、請求項６〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１０】
標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である、請求項９に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記基質がフォンヴィルブランド因子分解酵素により切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するパートナーを使用する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１２】
（１）フォンヴィルブランド因子分解酵素により切断可能な基質と、（２）基質と相互作用し、複合体を形成可能なカチオン性水溶性多糖類とを含むことを特徴とする、フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１３１９０８（Ｐ２００８−１３１９０８Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３２１０７５（Ｐ２００６−３２１０７５）
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【出願人】（０００１３８２７７）株式会社三菱化学ヤトロン (30)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【出願人】（０００１３８２７７）株式会社三菱化学ヤトロン (30)
【Ｆターム（参考）】
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