フコイダン含量の測定方法及びフコイダン含有食品
【課題】食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定する方法を見出すことで、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を測定する方法を実現する。
【解決手段】フコースを含有するフコイダンの含量を測定する方法であり、まずフコイダン原料種を、フコイダンを構成する糖の種類と割合、フコイダンの分子量、または特異的に識別する物質を用いて特定するとともに、フコイダン原料種のフコース量を測定しフコイダン原料種に特有のフコイダンに対するフコースの含有量に基づき予め知られているフコイダン変換係数と、フコイダン原料種中のフコース量に基づいてフコイダン含量を測定する。
【解決手段】フコースを含有するフコイダンの含量を測定する方法であり、まずフコイダン原料種を、フコイダンを構成する糖の種類と割合、フコイダンの分子量、または特異的に識別する物質を用いて特定するとともに、フコイダン原料種のフコース量を測定しフコイダン原料種に特有のフコイダンに対するフコースの含有量に基づき予め知られているフコイダン変換係数と、フコイダン原料種中のフコース量に基づいてフコイダン含量を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコイダン含量の測定方法に関し、さらに該測定方法で測定されているフコイダン含有食品に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
水生生物由来の生理活性物質としてフコイダンが知られている。フコイダンとは藻
類、棘皮動物等（以下、「フコイダン原料」という）に含まれている硫酸化フコース
含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。
【０００３】
フコイダンは、抗血液凝固活性、抗腫瘍活性、血中コレステロール低下活性、抗ウィルス活性、抗ＨＩＶ活性、血圧上昇抑制活性、抗アレルギー活性などの効果を有し、健康志向食品および／または該素材としての用途開発が期待されている。
【０００４】
これらの効果を目的とした各種のフコイダン含有健康食品が製造、販売され、さらにはフコイダンの健康イメージを訴求した海草利用食品及び食品素材が数多く市販されている（特許文献１の海藻を原料とする飲料用食品の製造方法参照）。
【特許文献１】特開２００３−２５９８４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
モズクなどのフコイダンを含有する海草を利用する食品については、原材料の海草に塩蔵、凍結、加熱などの処理を施すと、その組織に損傷を生じやすく、そのような損傷の生じた原材料を水洗した場合、フコイダンは水溶性が高いため、フコイダンが流出してしまう。このため、最終製品中に含有されるフコイダンの量は原料である海草等に比べてかなり少ない量になってしまう。しかも、その減少の度合いも、水洗の条件により異なっており、一定ではないのが実態であった。
【０００６】
このために、食品中のフコイダン量を知るためには食品でフコイダン含量を測定する必要があった。しかしながら、食品中のフコイダンを定量する方法は確立していなかった。フコイダンは、フコースを含有する多糖類の総称であり、フコイダン原料の種類が異なるとその中のフコースの構成割合（フコイダン変換係数）も異なる。
【０００７】
言い換えれば、フコイダン変換係数はフコイダンの原材料別に固有であることから、フコイダン原料種が既知の場合には、食品中のフコース含量からフコイダン含量を換算し測定することが出来た。
【０００８】
逆に、食品に使用されたフコイダン原料種が未知の場合は、フコイダン含量を測定することは出来なかった。また、複数種のフコイダンを使用した場合で、かつ、各フコイダンの混合比が未知の場合、或いは複数種のフコイダンの混合比が既知であっても、使用したいずれかのフコイダン原料種のフコイダン変換係数が未知の場合は、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を測定することは出来なかった。
【０００９】
これらの状況から、健康維持のためにフコイダンを摂取しようとしても、食べようとしている食品中に実際にどれだけの量のフコイダンが含有されているのかがわからないため、有効な摂取が出来なかった。これらの問題を解決するためにはフコイダン含量の測定方法を確立し、この測定法を用いてフコイダン含量が管理、測定されている食品を製造する必要があった。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題を解決することを目的とするものであり、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を測定する方法を実現することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は上記課題を解決するために、フコイダン原料種とフコース量を特定し、フコイダン原料種に特有のフコイダンに対するフコースの含有率（フコイダン変換係数）と前記フコース量に基づいて、フコイダン含量を測定することを特徴とするフコイダン含量の測定方法を提供する。
【００１２】
前記フコイダン原料種の特定を、フコイダンを構成する糖の種類と割合から識別して行うことが好ましい。
【００１３】
前記フコイダン原料種の特定を、フコイダンの分子量の分布から識別して行うことが好ましい。
【００１４】
前記フコイダン原料種の特定を、特異的に識別する物質を用いて行うことが好ましい。
【００１５】
特異的に識別する物質は、抗体であることが好ましい。
【００１６】
本発明は上記課題を解決するために、上記方法でフコイダンの含量が特定されていることを特徴とするフコイダン含有食品を提供する。
【００１７】
フコイダン含有食品のフコイダンの原料として、オキナワモズクを利用してもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るフコイダン含量の測定方法によれば、従来なしえなかった食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定することができ、この結果、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を簡単且つ正確に測定することができ、フコイダンを、多方面の加工食品等の製品への適用に供することが可能である。
【００１９】
さらに、フコイダン原料としては、上述の海草や棘皮動物のみならず、精製フコイダン自体も含めることができ、これらの原料を含有する食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定することができ、この結果、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を簡単且つ正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に係るフコイダン含量の測定方法を実施するための最良の形態を、以下に説明し、さらに実施例を説明する。なお、以下の使用する比率関連の用語は、説明の明確化のために以下の通り定義する。
（１）「含有率」は、「各フコイダン原材料中のフコイダン含有率」に使われている。
（２）「含有比率」は、「加工食品中の複数種のフコイダン原材料自体の含有比率」、要するに、「食品中の異なる種類のフコイダン原材料自体の含有比率」に使われている。
（３）「含有比」は、「異なるフコイダン原材料由来の異なるフコイダンの含有比」に使われている。
【００２１】
（概要）
本発明に係るフコイダン含量の測定方法の基本的な原理を説明する。フコイダンを含有するフコイダン原料である海草等について、それぞれの種類毎にフコイダン中のフコースの含有率が分かっている。
【００２２】
今、フコイダン中のフコースの含有パーセント（％）がＫ％の時、ｋ＝１００／Ｋとすれば、フコース含量×ｋ＝フコイダン含量 となる。本明細書では、このｋを「フコイダン変換係数」という。
【００２３】
従って、フコイダン原料種が識別されて特定されれば、食品もしくは食品素材のフコース量を測定し、これにフコイダン変換係数を掛ければフコイダン含量を計算出来る。
【００２４】
しかし、フコイダン原材料が複数種の原料から構成される複合原料であると、各フコイダン原材料由来のフコイダンの含有比を考慮しなくてはならない。このフコイダン含有比は、食品に含まれるフコイダンを分析することで特定するか、或いは食品を構成する複数のフコイダン原料自体の含有比率を特定し且つ各フコイダン原料中のフコイダンの含有率から特定することができる。以下において、食品中のフコイダン含量の測定方法を説明する。
【００２５】
（フコイダン含量の測定方法）
測定方法１：
この測定方法１は、食品中のフコイダン原材料が１種（単一原料）である場合のフコイダン含量測定方法である。この測定方法１では、食品中のフコース含量を測定する。
【００２６】
そして、この海草等のフコイダン原材料種毎について知られているフコイダン変換係数ｋと食品中のフコース含量を乗じて、食品中のフコイダン含量を求めることができる。なお、海草等のフコイダン原料種が単一であるか否かが未知の場合は、後述するフコイダン原料種の識別方法で識別して特定すればよい。
【００２７】
測定方法２：
この測定方法２は、食品中のフコイダン原材料が複数種（複合原料）である場合のフコイダン含量測定方法である。この測定方法２では、測定方法１と同様に、まず食品中のフコース含量を測定する。
【００２８】
そして、食品中の複数のフコイダン原料種と、フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を特定する必要がある。複数のフコイダン原料種と、フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比の測定については、後述する。
【００２９】
ここで、各フコイダン原料種毎（ｎ＝１，２・・・・，Ｎ）にフコイダンの含量（Ｘｎ）を計算してそれらを総和（ΣＸｎ）すれば、食品中のフコイダン含量（Ｆ＝ΣＸｎ）を求めることができる。各フコイダン原料種のフコイダン含量の計算は、次の計算式により行う。
【００３０】
ここで、Ｘｎ、Ａｎ、ｋｎ、Ｒは、
［食品中の当該フコイダン原料種に由来するフコイダン量］：Ｘｎ
［食品中の当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比］：Ａｎ
［当該フコイダン原料毎のフコインダン変換係数］：ｋｎ
［食品中のフコース含量］：Ｒ
と定義したとき、
Ｋｎ＝１／ｋｎとすると、
Ｘ１ ＝Ａ１／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
Ｘ２ ＝Ａ２／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
Ｘ３ ＝Ａ３／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
・
・
・
Ｘｎ ＝Ａｎ／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
よって、
Ｆ（フコイダン含量）＝ΣＸｎ＝（Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋・・・・＋Ｘｎ）
＝（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋・・・＋Ａｎ）／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
【００３１】
この式を言い換えれば、
［食品中の当該フコイダン原材料由来のフコイダン含量］＝［食品中のフコイダン含量を元にした当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比］／［食品中のフコイダン原材料加工食品中の当該フコイダン原材料の変換係数の逆数と加工食品中のフコイダン含量を元にした各フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を掛け合わした数値の総和］×［加工食品中のフコース含量］
となり、
［食品中のフコイダン含量］＝［食品中のフコイダン含量を元にした全フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比の総和］／［加工食品中のフコイダン原材料加工食品中の当該フコイダン原材料の変換係数の逆数と加工食品中のフコイダン含量を元にした各フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を掛け合わした数値の総和］×［食品中のフコース含量］
となる。
【００３２】
なお、この計算式は、以下のように求めたものである。つまり、上記の定義より、
Ｘ１、Ｘ２・・・・Ｘｎを求めたい食品中のフコイダン原材料別のフコイダンの量としたとき、測定により求めた食品中のフコースの量がＲであり、食品中のフコイダン原材料別のフコイダンの含有比が、Ｘ１：Ｘ２：・・・：Ｘｎ＝Ａ１：Ａ２：・・・：Ａｎであり、食品中の各フコイダン原料種のフコイダン変換係数が、それぞれ、ｋ１、ｋ２、・・・、ｋｎのとき、
Ｋｎ＝１／ｋｎとおくと、
Ｒ＝Ｋ１Ｘ１＋Ｋ２Ｘ２＋・・・＋ＫｎＸｎより
含有比よりＸ１＝Ａ１ｂ、Ｘ２＝Ａ２ｂ、・・・、Ｘｎ＝Ａｎｂ（但し、ｂはゼロ以外の数値）とすることができ
よって、Ｒ＝Ｋ１Ｘ１＋Ｋ２Ｘ２＋・・・＋ＫｎＸｎ
＝Ｋ１Ａ１ｂ＋Ｋ２Ａ２ｂ＋・・・＋ＫｎＡｎｂ
＝（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）ｂ
よって、ｂ＝Ｒ／（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）
よって、Ｘｎ＝Ａｎｂ＝Ａｎ／（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）×Ｒ
となることから求められた。
【００３３】
なお、上記計算式では各フコイダン原料種のフコイダン含量を求めてその総和により算出したが、食品の全体のフコイダン変換係数（これをｋＴと定義する。）を求めて、これを加工食品中のフコース含量に掛け合わせても食品もしくは、食品素材中の全フコイダン含量を計算できる。
【００３４】
すなわち、食品に使用した複数のフコイダン原料種を特定するとともに、フコイダン原材料由来の各フコイダン種の含有比を測定し、当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を求め、各比率を当該フコイダン原料種のフコイダン変換係数（フコース量よりフコイダンの量を計算出来る変換係数：Ｋ）と掛け合わせた値を得て、それらの総和（複数のフコイダン原料種について計算した値の総和）で全当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比の総和を割ることで、食品のフコース量よりフコイダン量を計算できる全体の変換係数（ｋＴ）が定まる。
【００３５】
この全体の変換係数（ｋＴ）を、加工食品のフコース量に掛ければ、フコイダン含量（Ｆ）が求まる。なお、上記の定義によれば、
ｋＴ＝（Ａ１＋Ａ２＋・・・＋Ａｎ）／（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）
で表される。
【００３６】
例えば、食品の原材料として使用したフコイダン原料種が、ＡとＢの２種で、両者の比が、Ａ種含量：Ｂ種含量＝α：βであった場合、フコイダン変換係数がＡ種がａ、Ｂ種がｂの場合、全体の変換係数（ｋＴ）は、ｋＴ＝（α＋β）/（α×１／ａ+β×１／ｂ）となり、ここで、加工食品のフコース含量がＺの場合、求めるフコイダン含量Ｙは、Ｙ＝Ｚ×Ｋ＝Ｚ×［（α＋β）/（α×１／ａ+β×１／ｂ）］となる。
【００３７】
測定方法３：
この測定方法３は、食品中のフコイダン原料種が複数種であり、しかも複数種のフコイダン原料種の夫々のフコイダン含有率が既知の場合における食品中のフコイダン含量を測定する方法である。この測定方法３は、測定方法１と同様に、まず加工食品中のフコース含量を測定する。
【００３８】
そして、食品中の複数のフコイダン原種をそれぞれ特定するとともに、食品中のそれぞれのフコイダン原料種自体の含有比率を特定する。この複数のフコイダン原料種の特定及びその含有比率の測定については、後述する。前記測定方法２では、食品中の複数のフコイダン原料種由来の複数のフコイダンをそれぞれ特定するとともに、フコイダン原材料由来の複数のフコイダンの含有比を特定したが、この測定方法３では、フコイダン原料種自体の含有比率を特定する点で異なる。
【００３９】
各フコイダン原料種毎にフコイダンの含量を計算してそれらを総和すれば、食品中のフコイダン含量を求めることができる。各フコイダン種毎にフコイダンの含量を計算は、次の式により行う。
【００４０】
[加工食品中の当該フコイダン原材料由来のフコイダン含量]＝[当該フコイダン原材料中のフコイダン含有率]×[加工食品中の当該フコイダン原材料自体の含有比率]／[加工食品中の全フコイダン原材料加工食品中の当該フコイダン原材料の変換係数の逆数と当該フコイダン原材料中のフコイダン含有率と加工食品中の当該フコイダン原材料自体の含有比率を掛け合わした数値の総和］×[加工食品中のフコース含量]
【００４１】
本発明に係るフコイダン含量の測定方法を実施するためには、次の特定または測定のためのプロセスが必要となる。
（１）加工食品中のフコース量を測定する。
（２）加工食品中のフコイダン原材料の種類を特定する。
（３）加工食品が複数種のフコイダン原材料から構成される場合（測定方法２、３）については、食品検体中の複数種の原材料由来のフコイダンの含有比を特定する。この場合、測定方法２では、加工食品に含まれるフコイダンを分析することで複数種のフコイダンの含有比を特定し、測定方法３では、加工食品を構成する複数のフコイダン原材料自体の含有比率を特定し且つ各フコイダン原材料中のフコイダンの含有率から特定する。
【００４２】
（海草又はフコイダンの種類と含有比の識別）
以下において、上記（２）、（３）について、本発明者らが発明した、加工食品を構成するフコイダン原材料に含まれるフコイダンの種類とその含有比、又はフコイダン原材料種とその含有比率を特異的に識別する方法を説明する。
【００４３】
第１の識別方法：
第１の識別方法は、フコイダン原料の加水分解前のフコイダンの分子量分布が海草等のフコイダン原材料種別に特有（例えば、分子量２４万を示すフコイダンはイトモズクに特異的な分子量、分子量４万２千はひじきのフコイダンに特異的な分子量、分子量５０万はオキナワモズクのフコイダンに特異的な分子量）である点に着目し、この特有な分子量分布をゲル濾過法で調べることで、食品中のフコイダン原材料種とフコイダン含有比を決定する方法である。
【００４４】
この方法は、詳細には次のとおりである。食品検体を塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出する。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。
【００４５】
この溶液の分子量分布をゲル濾過により測定し、標準品の構成比と比較することで、食品中のフコイダン原材料種とフコイダンの含有比を決定することが出来る。
【００４６】
第２の識別方法：
第２の識別方法は、フコイダン原材料の構成糖の割合も、フコイダン原材料種によって特有である点に着目し、ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography：高速液体クロマトグラフィ）を用いた分析またはＴＬＣ（Thin-Layer Chromatgraphy：薄層クロマトグラフィー)を用いた分析で食品中のフコイダン原材料種とフコイダン含有比を決定する方法である。
【００４７】
この方法の詳細は次のとおりである。食品検体である海草粉末から塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出する。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。これを２．０Ｎの硫酸中で１００℃で２時間の加水分解に供した。
【００４８】
ここで、ＨＰＬＣを利用する場合は、加水分解に供した精製フコイダンを、ＨＰＬＣにより定量分析を行い、L-フコースとD-キシロース等の糖の構成比を標準品の構成比と比較する。これにより、海草等の原材料種やフコイダンの含有比を明らかにすることが出来た。ここでのＨＰＬＣは、カラム（カラム高温槽）はShimpak ISA-07(4.0 x 250 mm)を利用し、溶離液は０．１〜０．４Ｍホウ酸緩衝液を用い、溶離液の流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎで、温度は６５℃で行った。
【００４９】
また、ＴＬＣを利用する場合は、加水分解に供した精製フコイダンを、ＴＬＣにより定量分析を行い、L-フコースとD-キシロース等の糖の構成比を標準品のＴＬＣパターンと比較することで、フコイダン原材料種やフコイダン含有比を明らかにすることが出来る。
【００５０】
第３の識別方法：
第３の識別方法は、複数のフコイダン原材料由来のフコイダンが混合しているような場合には、まず、各フコイダン原材料由来のフコイダンに対する特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析法等の免疫学的測定法や、フコイダン原材料由来のフコイダンに特異的レクチンを用いた測定方法により、フコイダン原材料種およびフコイダン含有比を測定する。
【００５１】
第４の識別方法：
第４の識別方法は、複数の海草等由来のフコイダンが混合しているような場合について、製品に使用した個々のフコイダン原料（実際に使用する保存水洗後の原料バルク）のフコイダン含有率（％）が前もってわかっている場合は、フコイダン以外の各海草等のフコイダン原材料に特異な抗原を免役して得た、特異的抗体を使用した測定方法によりフコイダン原材料種や各フコイダン原材料の含有比率を測定し、これに、個々のフコイダン原料のフコイダン含有率（％）を掛け合わせることで、個々のフコイダン含有比を求めることは可能である。
【００５２】
第５の識別方法：
第５の識別方法は、複数のフコイダン原材料由来のフコイダンが混合しているような場合について、製品に使用した個々のフコイダン原材料のフコイダン含有率（％）が前もってわかっている場合は、各フコイダン原料に対し特異的ＤＮＡの含量をＰＣＲ等の種々のＤＮＡ定量法により使用した個々のフコイダン原料の混合比（各海草の含有比率）を測定し、これに、個々のフコイダン原料のフコイダン含有率（％）を掛け合わせることでも、個々のフコイダン含有比を求めることは可能である。
【００５３】
（加工食品中のフコース含量の測定）
以下において、上記（１）に挙げた、変換係数（ｋ）に掛け合わせる加工食品中のフコース含量（Ｒ）の測定について説明する。従来、種々の添加物の存在する加工食品中では、フコースの測定は難しく、特に、他の糖や硫酸基を有する物質などが混在した場合は難しかった。
【００５４】
例えば、従来フコイダンの純度の測定に使用されていたロジソン酸法（K.S.Dodgson, R.G.Price, Biochem. J., 84, 106 (1962)）は、糖を塩酸で加水分解後、塩酸を除去し、エタノールを加え沈殿を遠心除去した後、ＢａＣｌ２とロジソン酸ナトリウム溶液を加え混合し、室温暗所に置き、５２０ｎｍの吸光度で測定する方法である。
【００５５】
しかし、この方法では、硫酸基の量を測定するために、動物由来のコンドロイチン、海草由来のカラギーナン、無機化合物のミョウバンなど、その他多くの硫酸基を含有する食品素材も含んでしまい、加工食品中のフコイダンの測定には使用できないという問題があった。本発明に係るフコイダン含量の測定法では、以下の方法を行うことで、従来難しかった加工食品中でのフコースの測定を可能とした。
【００５６】
すなわち、本発明に係るフコイダン含量の測定法では、食品を塩酸処理後に、エタノール処理、更に、ここで、次の発色過程において、フコースと同様に発色するために障害となるオリゴ糖や単糖等を含有する低分子画分を限外濾過で除外し、次いで、加水分解する。
【００５７】
そして、得られたフコイダンをフコースに分解した際には、従来のフコイダンの測定に使用されているフェノール・硫酸法では、ショ糖やグルコースの混入が発色により影響するので、このフェノール・硫酸法を使用しない。本発明に係るフコイダン含量の測定法では、ショ糖やグルコースが発色せずに、この段階で、メチルペントースであるフコースの量のみが測定できるギボンズ法（Gibbons法：Gibbons, M.N.(1955)Analyst, 80, 268.）を使用する。
【００５８】
このGibbons法は、システイン−硫酸法の一種である。このシステイン−硫酸法の原理は、その正確な基本反応は不明であるが、大まかには、糖と硫酸との反応により生じる物質が、システインなどのＳＨ試薬と反応して呈色に変化するので、その呈色度から糖の定量を行うのが本法の原理である。
【００５９】
特にGibbons法は、上述したようにメチルペントースの定量法の一種であるが、ＳＨ試薬として、チオグリコール酸を用いる方法である。チオグリコール酸で発色した時の吸収スペクトルの４００ｎｍと４３０ｎｍにおける吸光度を測定し、差を算出し、フコースの量を計測した。これにより、加工食品中のフコースの量を把握することを可能とした。なお、ショ糖やグルコースの混入が問題ない場合は、フェノール・硫酸法を使用することも可能であった。
【００６０】
以上、本発明に係るフコイダン含量の測定方法について、フコイダン原料が海草である場合を中心として説明したが、フコイダン原料は、海草や棘皮動物のみならず、精製フコイダン自体も含めることができ、これらの原料を含有する食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定することができ、この結果、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を簡単且つ正確に測定することができる。
【００６１】
なお、本発明に係るフコイダン含量の測定方法の対象は、海草等のフコイダン原材料であるが、このようなフコイダン原材料を原料としたフコイダンを含有した食品としては、多くの食品類をあげることが出来る。
【００６２】
一例としては、酢の物やスープやサラダ等の惣菜類、コンニャクや豆腐類、ドレッシング類、薩摩揚げや天ぷら等の練り物類、海草含有飲料等の各種飲料類、海草含有ハムやソーセージやハンバーグやミートボール等の食肉加工製品類、パンやせんべいや餅やケーキやクッキーやキャンデーやガム等、海草を粉末にしたふりかけやお茶漬け類、ジャム類、バターやチーズやヨーグルト等の乳製品類、各種缶詰、レトルト食品類、冷凍食品類、乾物等の種々の食品をあげることが出来る。さらに、この方法の対象となるのは、食品だけに限らず、化粧品や医薬品に関しても適用することが出来る。
【実施例１】
【００６３】
（糖組成による識別）
実施例１として、前記識別方法２を特徴とする実施例を以下に挙げる。試験検体として、オキナワモズクのみよりなる海草粉末を作成した。この海草粉末から塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出した。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。これを２．０Ｎの硫酸中で１００℃で２時間の加水分解に供した。
【００６４】
これをＨＰＬＣ（カラム、Shimpak ISA-07(4.0 x 250 mm)； 溶離液、０．１〜０．４Ｍホウ酸緩衝液； 流速、０．６ｍｌ／ｍｉｎ； 温度６５℃）により定量分析を行ったところ、L-フコースとD-キシロースの構成比が９７：３であり、他の糖がほとんど含まれないというオキナワモズクに特異的な糖組成を示すことが明らかとなった。この結果から海草粉末はオキナワモズクのみを原料としていることが確認された。
【実施例２】
【００６５】
（糖組成による識別）
実施例２として、前記識別方法２と特徴とする別の実施例を以下に挙げる。海草としてひじきのみを添加した海草入りのさつま揚げに含まれるフコイダンの糖組成を実施例１と同様の方法で調べたところ、ひじき特異的な糖組成であるL-フコース：D-ガラクトース：D-グルコース：D-マンノース：D-キシロース：D-グルクロン酸が５：１：１：０．５：０．５：２を示すことが明らかとなった。この結果から使用されている海草はひじきのみであると確認された。
【実施例３】
【００６６】
（抗体による原料海草の識別）
実施例３として、前記識別方法３を特徴とする実施例を以下に挙げる。白色種ウサギに１．０ｍｇのオキナワモズク由来精製フコイダンの破砕物を（フロイント完全アジュバントとのエマルジョンとして）皮内投与し、一週間後にさらに等量のオキナワモズク由来精製フコイダンの破砕物を投与する（フロイント不完全アジュバントとのエマルジョンとして）、投与を４回繰り返した後４９日後に全血を採取し、抗血清を得た。この抗血清をアフィニティークロマトにより精製を行い、抗オキナワモズク由来精製フコイダンポリクローナル抗体を得た。
【００６７】
また、コンブにおいても同様に処置し抗コンブ由来精製フコイダンポリクローナル抗体を得た。ここで、フコイダン含量が２０％のオキナワモズク（飲料中６重量％）とフコイダン含量が１０％のコンブ（飲料中４重量％）を混ぜた海草飲料を作成し、この抗体を用いて海草飲料中のオキナワモズク由来のフコイダンの量をELISA法により測定した。
【００６８】
同じく、この抗体を用いて海草飲料中のコンブ由来のフコイダンの量をELISA法により測定した。その結果、オキナワモズク及びコンブのフコイダン含有比として、オキナワモズク由来フコイダン含量：コンブ由来フコイダン含量＝３：１を得ることが出来た。
【実施例４】
【００６９】
実施例４として、分子量分布による識別（前記識別方法１）及び加工食品中のフコース含量測定のプロセスにより、加工食品中のフコイダン含量を測定する実施例を以下に説明する。
【００７０】
第１のプロセス（分子量分布による識別）：
まず、試験検体として、海草として、ひじき、オキナワモズクを原料として海草スープを作成した。前もって、これらの原料中のフコイダンを精製し、各海草中のフコイダン含量を測定することで、本海草スープが、各海草由来のフコイダンの含有比が、ひじき由来のフコイダン：オキナワモズク由来のフコイダン＝２０：１０で、フコイダン含有量が５３ｍｇであることを確認しておいた。
【００７１】
この海草スープから塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出した。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。
【００７２】
ここで、分子量４万２千はひじきのフコイダンに特異的な分子量、分子量５０万はオキナワモズクのフコイダンに特異的な分子量であることから、この溶液の分子量分布をゲル濾過により測定したところ、分子量４万２千を示すフコイダン量：分子量５０万を示すフコイダン量＝２０：１０であった。
【００７３】
これより、検体スープ中には、ひじきのフコイダン含量：オキナワモズクのフコイダン含量＝２０：１０の比率で各フコイダン原料中のフコイダンが含有されていたことが確認された。
【００７４】
第２のプロセス（加工食品中のフコース含量測定）：
上記海草スープ５０ｍｌに塩酸を0.2N HCl（最終濃度）になるように添加し、室温で攪拌しながら一晩抽出した。２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで固形物を除き吸引ろ過 (ADVANTEC 5A)後、ＮａＯＨで中和（ｐＨ６〜７）し、30ml EtOHを添加し、遠心（5,000 rpm x 15 min）により沈殿を回収した。ついで、１５０ｍｌの純水に溶解、限外ろ過で分子量２０万以下を排除 (４℃)、１回洗った。
【００７５】
２．７ｍｌ濃硫酸を添加し５０ｍｌにメスアップし、加水分解（１００℃２時間）し、フコース定量を行った。フコース定量は、Gibbons法で行った。つまり、フコース標準液（１％溶液（１０ｍｇ／ｍｌ））を段階希釈し、サンプルを希釈し、キャップ付試験管に標準液またはサンプルを１ｍｌ入れ（サンプルは３組ずつ用意）、氷冷下で４．５ ｍｌ 硫酸（純水：濃硫酸＝１：６）を加えた。
【００７６】
フタをして室温に戻し、１０分ボイル後、氷冷した。チオグリコール酸（チオグリコール酸１ｍｌを純水で希釈して３０ｍｌにしたもの。）を０．１ｍｌずつ加えた。サンプルの内1組はチオグリコール酸の代わりに水を加えたものを作成しバックグランド値の測定に使用した。暗所で３〜２４時間放置した。４００ｎｍと４３０ｎｍにおける吸光度を測定し、差を算出した。測定結果として、フコース含量として、２０ｍｇを得た。
【００７７】
第３のプロセス（加工食品中のフコイダンの含量の算出）：
ここで、ひじきにおけるフコイダンのフコース含量は、３１．４％であるので、フコイダン換算係数は、１００／３１．４＝３．１８となる。また、オキナワモズクにおけるフコイダンのフコース含量は、５０．５％であるので、フコイダン換算係数は、１００／５０．５＝１．９８となる。
【００７８】
そして、ひじきのフコイダン含量：オキナワモズクのフコイダン含有量＝２０：１０であるので、全体の換算係数は、３０/（１／３．１８×２０＋１／１．９８×１０）＝２．６５となるので、本海草スープ５０ｍｌ中のフコイダン含量は、２０ｍｇ×２．６５＝５３ｍｇとなった。
【００７９】
以上、本発明に係るフコイダン含量の測定方法を実施するための最良の形態を実施例に基づいて説明したが、本発明はこのような実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的事項の範囲内でいろいろな実施例があることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上のとおり本発明は、食品中のフコイダンの量を測定しその数量を正確に評価できるから、フコイダンを利用する食品の目的に応じて、フコイダンの量を正確に含有させることができ、各種飲料類、食肉加工製品類、惣菜類、冷凍食品類等、いろいろな食品への含有により、それぞれの加工食品の付加価値を高めることができる。また、本発明は健康食品、化粧品中のフコイダン含量の測定にも適用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコイダン含量の測定方法に関し、さらに該測定方法で測定されているフコイダン含有食品に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
水生生物由来の生理活性物質としてフコイダンが知られている。フコイダンとは藻
類、棘皮動物等（以下、「フコイダン原料」という）に含まれている硫酸化フコース
含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。
【０００３】
フコイダンは、抗血液凝固活性、抗腫瘍活性、血中コレステロール低下活性、抗ウィルス活性、抗ＨＩＶ活性、血圧上昇抑制活性、抗アレルギー活性などの効果を有し、健康志向食品および／または該素材としての用途開発が期待されている。
【０００４】
これらの効果を目的とした各種のフコイダン含有健康食品が製造、販売され、さらにはフコイダンの健康イメージを訴求した海草利用食品及び食品素材が数多く市販されている（特許文献１の海藻を原料とする飲料用食品の製造方法参照）。
【特許文献１】特開２００３−２５９８４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
モズクなどのフコイダンを含有する海草を利用する食品については、原材料の海草に塩蔵、凍結、加熱などの処理を施すと、その組織に損傷を生じやすく、そのような損傷の生じた原材料を水洗した場合、フコイダンは水溶性が高いため、フコイダンが流出してしまう。このため、最終製品中に含有されるフコイダンの量は原料である海草等に比べてかなり少ない量になってしまう。しかも、その減少の度合いも、水洗の条件により異なっており、一定ではないのが実態であった。
【０００６】
このために、食品中のフコイダン量を知るためには食品でフコイダン含量を測定する必要があった。しかしながら、食品中のフコイダンを定量する方法は確立していなかった。フコイダンは、フコースを含有する多糖類の総称であり、フコイダン原料の種類が異なるとその中のフコースの構成割合（フコイダン変換係数）も異なる。
【０００７】
言い換えれば、フコイダン変換係数はフコイダンの原材料別に固有であることから、フコイダン原料種が既知の場合には、食品中のフコース含量からフコイダン含量を換算し測定することが出来た。
【０００８】
逆に、食品に使用されたフコイダン原料種が未知の場合は、フコイダン含量を測定することは出来なかった。また、複数種のフコイダンを使用した場合で、かつ、各フコイダンの混合比が未知の場合、或いは複数種のフコイダンの混合比が既知であっても、使用したいずれかのフコイダン原料種のフコイダン変換係数が未知の場合は、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を測定することは出来なかった。
【０００９】
これらの状況から、健康維持のためにフコイダンを摂取しようとしても、食べようとしている食品中に実際にどれだけの量のフコイダンが含有されているのかがわからないため、有効な摂取が出来なかった。これらの問題を解決するためにはフコイダン含量の測定方法を確立し、この測定法を用いてフコイダン含量が管理、測定されている食品を製造する必要があった。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題を解決することを目的とするものであり、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を測定する方法を実現することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は上記課題を解決するために、フコイダン原料種とフコース量を特定し、フコイダン原料種に特有のフコイダンに対するフコースの含有率（フコイダン変換係数）と前記フコース量に基づいて、フコイダン含量を測定することを特徴とするフコイダン含量の測定方法を提供する。
【００１２】
前記フコイダン原料種の特定を、フコイダンを構成する糖の種類と割合から識別して行うことが好ましい。
【００１３】
前記フコイダン原料種の特定を、フコイダンの分子量の分布から識別して行うことが好ましい。
【００１４】
前記フコイダン原料種の特定を、特異的に識別する物質を用いて行うことが好ましい。
【００１５】
特異的に識別する物質は、抗体であることが好ましい。
【００１６】
本発明は上記課題を解決するために、上記方法でフコイダンの含量が特定されていることを特徴とするフコイダン含有食品を提供する。
【００１７】
フコイダン含有食品のフコイダンの原料として、オキナワモズクを利用してもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るフコイダン含量の測定方法によれば、従来なしえなかった食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定することができ、この結果、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を簡単且つ正確に測定することができ、フコイダンを、多方面の加工食品等の製品への適用に供することが可能である。
【００１９】
さらに、フコイダン原料としては、上述の海草や棘皮動物のみならず、精製フコイダン自体も含めることができ、これらの原料を含有する食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定することができ、この結果、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を簡単且つ正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に係るフコイダン含量の測定方法を実施するための最良の形態を、以下に説明し、さらに実施例を説明する。なお、以下の使用する比率関連の用語は、説明の明確化のために以下の通り定義する。
（１）「含有率」は、「各フコイダン原材料中のフコイダン含有率」に使われている。
（２）「含有比率」は、「加工食品中の複数種のフコイダン原材料自体の含有比率」、要するに、「食品中の異なる種類のフコイダン原材料自体の含有比率」に使われている。
（３）「含有比」は、「異なるフコイダン原材料由来の異なるフコイダンの含有比」に使われている。
【００２１】
（概要）
本発明に係るフコイダン含量の測定方法の基本的な原理を説明する。フコイダンを含有するフコイダン原料である海草等について、それぞれの種類毎にフコイダン中のフコースの含有率が分かっている。
【００２２】
今、フコイダン中のフコースの含有パーセント（％）がＫ％の時、ｋ＝１００／Ｋとすれば、フコース含量×ｋ＝フコイダン含量 となる。本明細書では、このｋを「フコイダン変換係数」という。
【００２３】
従って、フコイダン原料種が識別されて特定されれば、食品もしくは食品素材のフコース量を測定し、これにフコイダン変換係数を掛ければフコイダン含量を計算出来る。
【００２４】
しかし、フコイダン原材料が複数種の原料から構成される複合原料であると、各フコイダン原材料由来のフコイダンの含有比を考慮しなくてはならない。このフコイダン含有比は、食品に含まれるフコイダンを分析することで特定するか、或いは食品を構成する複数のフコイダン原料自体の含有比率を特定し且つ各フコイダン原料中のフコイダンの含有率から特定することができる。以下において、食品中のフコイダン含量の測定方法を説明する。
【００２５】
（フコイダン含量の測定方法）
測定方法１：
この測定方法１は、食品中のフコイダン原材料が１種（単一原料）である場合のフコイダン含量測定方法である。この測定方法１では、食品中のフコース含量を測定する。
【００２６】
そして、この海草等のフコイダン原材料種毎について知られているフコイダン変換係数ｋと食品中のフコース含量を乗じて、食品中のフコイダン含量を求めることができる。なお、海草等のフコイダン原料種が単一であるか否かが未知の場合は、後述するフコイダン原料種の識別方法で識別して特定すればよい。
【００２７】
測定方法２：
この測定方法２は、食品中のフコイダン原材料が複数種（複合原料）である場合のフコイダン含量測定方法である。この測定方法２では、測定方法１と同様に、まず食品中のフコース含量を測定する。
【００２８】
そして、食品中の複数のフコイダン原料種と、フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を特定する必要がある。複数のフコイダン原料種と、フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比の測定については、後述する。
【００２９】
ここで、各フコイダン原料種毎（ｎ＝１，２・・・・，Ｎ）にフコイダンの含量（Ｘｎ）を計算してそれらを総和（ΣＸｎ）すれば、食品中のフコイダン含量（Ｆ＝ΣＸｎ）を求めることができる。各フコイダン原料種のフコイダン含量の計算は、次の計算式により行う。
【００３０】
ここで、Ｘｎ、Ａｎ、ｋｎ、Ｒは、
［食品中の当該フコイダン原料種に由来するフコイダン量］：Ｘｎ
［食品中の当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比］：Ａｎ
［当該フコイダン原料毎のフコインダン変換係数］：ｋｎ
［食品中のフコース含量］：Ｒ
と定義したとき、
Ｋｎ＝１／ｋｎとすると、
Ｘ１ ＝Ａ１／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
Ｘ２ ＝Ａ２／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
Ｘ３ ＝Ａ３／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
・
・
・
Ｘｎ ＝Ａｎ／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
よって、
Ｆ（フコイダン含量）＝ΣＸｎ＝（Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋・・・・＋Ｘｎ）
＝（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋・・・＋Ａｎ）／(Ｋ１×Ａ１＋Ｋ２×Ａ２＋Ｋ３×Ａ３＋・・・・・＋Ｋｎ×Ａｎ)×Ｒ
【００３１】
この式を言い換えれば、
［食品中の当該フコイダン原材料由来のフコイダン含量］＝［食品中のフコイダン含量を元にした当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比］／［食品中のフコイダン原材料加工食品中の当該フコイダン原材料の変換係数の逆数と加工食品中のフコイダン含量を元にした各フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を掛け合わした数値の総和］×［加工食品中のフコース含量］
となり、
［食品中のフコイダン含量］＝［食品中のフコイダン含量を元にした全フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比の総和］／［加工食品中のフコイダン原材料加工食品中の当該フコイダン原材料の変換係数の逆数と加工食品中のフコイダン含量を元にした各フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を掛け合わした数値の総和］×［食品中のフコース含量］
となる。
【００３２】
なお、この計算式は、以下のように求めたものである。つまり、上記の定義より、
Ｘ１、Ｘ２・・・・Ｘｎを求めたい食品中のフコイダン原材料別のフコイダンの量としたとき、測定により求めた食品中のフコースの量がＲであり、食品中のフコイダン原材料別のフコイダンの含有比が、Ｘ１：Ｘ２：・・・：Ｘｎ＝Ａ１：Ａ２：・・・：Ａｎであり、食品中の各フコイダン原料種のフコイダン変換係数が、それぞれ、ｋ１、ｋ２、・・・、ｋｎのとき、
Ｋｎ＝１／ｋｎとおくと、
Ｒ＝Ｋ１Ｘ１＋Ｋ２Ｘ２＋・・・＋ＫｎＸｎより
含有比よりＸ１＝Ａ１ｂ、Ｘ２＝Ａ２ｂ、・・・、Ｘｎ＝Ａｎｂ（但し、ｂはゼロ以外の数値）とすることができ
よって、Ｒ＝Ｋ１Ｘ１＋Ｋ２Ｘ２＋・・・＋ＫｎＸｎ
＝Ｋ１Ａ１ｂ＋Ｋ２Ａ２ｂ＋・・・＋ＫｎＡｎｂ
＝（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）ｂ
よって、ｂ＝Ｒ／（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）
よって、Ｘｎ＝Ａｎｂ＝Ａｎ／（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）×Ｒ
となることから求められた。
【００３３】
なお、上記計算式では各フコイダン原料種のフコイダン含量を求めてその総和により算出したが、食品の全体のフコイダン変換係数（これをｋＴと定義する。）を求めて、これを加工食品中のフコース含量に掛け合わせても食品もしくは、食品素材中の全フコイダン含量を計算できる。
【００３４】
すなわち、食品に使用した複数のフコイダン原料種を特定するとともに、フコイダン原材料由来の各フコイダン種の含有比を測定し、当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比を求め、各比率を当該フコイダン原料種のフコイダン変換係数（フコース量よりフコイダンの量を計算出来る変換係数：Ｋ）と掛け合わせた値を得て、それらの総和（複数のフコイダン原料種について計算した値の総和）で全当該フコイダン原料種に由来するフコイダンの含有比の総和を割ることで、食品のフコース量よりフコイダン量を計算できる全体の変換係数（ｋＴ）が定まる。
【００３５】
この全体の変換係数（ｋＴ）を、加工食品のフコース量に掛ければ、フコイダン含量（Ｆ）が求まる。なお、上記の定義によれば、
ｋＴ＝（Ａ１＋Ａ２＋・・・＋Ａｎ）／（Ｋ１Ａ１＋Ｋ２Ａ２＋・・・＋ＫｎＡｎ）
で表される。
【００３６】
例えば、食品の原材料として使用したフコイダン原料種が、ＡとＢの２種で、両者の比が、Ａ種含量：Ｂ種含量＝α：βであった場合、フコイダン変換係数がＡ種がａ、Ｂ種がｂの場合、全体の変換係数（ｋＴ）は、ｋＴ＝（α＋β）/（α×１／ａ+β×１／ｂ）となり、ここで、加工食品のフコース含量がＺの場合、求めるフコイダン含量Ｙは、Ｙ＝Ｚ×Ｋ＝Ｚ×［（α＋β）/（α×１／ａ+β×１／ｂ）］となる。
【００３７】
測定方法３：
この測定方法３は、食品中のフコイダン原料種が複数種であり、しかも複数種のフコイダン原料種の夫々のフコイダン含有率が既知の場合における食品中のフコイダン含量を測定する方法である。この測定方法３は、測定方法１と同様に、まず加工食品中のフコース含量を測定する。
【００３８】
そして、食品中の複数のフコイダン原種をそれぞれ特定するとともに、食品中のそれぞれのフコイダン原料種自体の含有比率を特定する。この複数のフコイダン原料種の特定及びその含有比率の測定については、後述する。前記測定方法２では、食品中の複数のフコイダン原料種由来の複数のフコイダンをそれぞれ特定するとともに、フコイダン原材料由来の複数のフコイダンの含有比を特定したが、この測定方法３では、フコイダン原料種自体の含有比率を特定する点で異なる。
【００３９】
各フコイダン原料種毎にフコイダンの含量を計算してそれらを総和すれば、食品中のフコイダン含量を求めることができる。各フコイダン種毎にフコイダンの含量を計算は、次の式により行う。
【００４０】
[加工食品中の当該フコイダン原材料由来のフコイダン含量]＝[当該フコイダン原材料中のフコイダン含有率]×[加工食品中の当該フコイダン原材料自体の含有比率]／[加工食品中の全フコイダン原材料加工食品中の当該フコイダン原材料の変換係数の逆数と当該フコイダン原材料中のフコイダン含有率と加工食品中の当該フコイダン原材料自体の含有比率を掛け合わした数値の総和］×[加工食品中のフコース含量]
【００４１】
本発明に係るフコイダン含量の測定方法を実施するためには、次の特定または測定のためのプロセスが必要となる。
（１）加工食品中のフコース量を測定する。
（２）加工食品中のフコイダン原材料の種類を特定する。
（３）加工食品が複数種のフコイダン原材料から構成される場合（測定方法２、３）については、食品検体中の複数種の原材料由来のフコイダンの含有比を特定する。この場合、測定方法２では、加工食品に含まれるフコイダンを分析することで複数種のフコイダンの含有比を特定し、測定方法３では、加工食品を構成する複数のフコイダン原材料自体の含有比率を特定し且つ各フコイダン原材料中のフコイダンの含有率から特定する。
【００４２】
（海草又はフコイダンの種類と含有比の識別）
以下において、上記（２）、（３）について、本発明者らが発明した、加工食品を構成するフコイダン原材料に含まれるフコイダンの種類とその含有比、又はフコイダン原材料種とその含有比率を特異的に識別する方法を説明する。
【００４３】
第１の識別方法：
第１の識別方法は、フコイダン原料の加水分解前のフコイダンの分子量分布が海草等のフコイダン原材料種別に特有（例えば、分子量２４万を示すフコイダンはイトモズクに特異的な分子量、分子量４万２千はひじきのフコイダンに特異的な分子量、分子量５０万はオキナワモズクのフコイダンに特異的な分子量）である点に着目し、この特有な分子量分布をゲル濾過法で調べることで、食品中のフコイダン原材料種とフコイダン含有比を決定する方法である。
【００４４】
この方法は、詳細には次のとおりである。食品検体を塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出する。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。
【００４５】
この溶液の分子量分布をゲル濾過により測定し、標準品の構成比と比較することで、食品中のフコイダン原材料種とフコイダンの含有比を決定することが出来る。
【００４６】
第２の識別方法：
第２の識別方法は、フコイダン原材料の構成糖の割合も、フコイダン原材料種によって特有である点に着目し、ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography：高速液体クロマトグラフィ）を用いた分析またはＴＬＣ（Thin-Layer Chromatgraphy：薄層クロマトグラフィー)を用いた分析で食品中のフコイダン原材料種とフコイダン含有比を決定する方法である。
【００４７】
この方法の詳細は次のとおりである。食品検体である海草粉末から塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出する。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。これを２．０Ｎの硫酸中で１００℃で２時間の加水分解に供した。
【００４８】
ここで、ＨＰＬＣを利用する場合は、加水分解に供した精製フコイダンを、ＨＰＬＣにより定量分析を行い、L-フコースとD-キシロース等の糖の構成比を標準品の構成比と比較する。これにより、海草等の原材料種やフコイダンの含有比を明らかにすることが出来た。ここでのＨＰＬＣは、カラム（カラム高温槽）はShimpak ISA-07(4.0 x 250 mm)を利用し、溶離液は０．１〜０．４Ｍホウ酸緩衝液を用い、溶離液の流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎで、温度は６５℃で行った。
【００４９】
また、ＴＬＣを利用する場合は、加水分解に供した精製フコイダンを、ＴＬＣにより定量分析を行い、L-フコースとD-キシロース等の糖の構成比を標準品のＴＬＣパターンと比較することで、フコイダン原材料種やフコイダン含有比を明らかにすることが出来る。
【００５０】
第３の識別方法：
第３の識別方法は、複数のフコイダン原材料由来のフコイダンが混合しているような場合には、まず、各フコイダン原材料由来のフコイダンに対する特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析法等の免疫学的測定法や、フコイダン原材料由来のフコイダンに特異的レクチンを用いた測定方法により、フコイダン原材料種およびフコイダン含有比を測定する。
【００５１】
第４の識別方法：
第４の識別方法は、複数の海草等由来のフコイダンが混合しているような場合について、製品に使用した個々のフコイダン原料（実際に使用する保存水洗後の原料バルク）のフコイダン含有率（％）が前もってわかっている場合は、フコイダン以外の各海草等のフコイダン原材料に特異な抗原を免役して得た、特異的抗体を使用した測定方法によりフコイダン原材料種や各フコイダン原材料の含有比率を測定し、これに、個々のフコイダン原料のフコイダン含有率（％）を掛け合わせることで、個々のフコイダン含有比を求めることは可能である。
【００５２】
第５の識別方法：
第５の識別方法は、複数のフコイダン原材料由来のフコイダンが混合しているような場合について、製品に使用した個々のフコイダン原材料のフコイダン含有率（％）が前もってわかっている場合は、各フコイダン原料に対し特異的ＤＮＡの含量をＰＣＲ等の種々のＤＮＡ定量法により使用した個々のフコイダン原料の混合比（各海草の含有比率）を測定し、これに、個々のフコイダン原料のフコイダン含有率（％）を掛け合わせることでも、個々のフコイダン含有比を求めることは可能である。
【００５３】
（加工食品中のフコース含量の測定）
以下において、上記（１）に挙げた、変換係数（ｋ）に掛け合わせる加工食品中のフコース含量（Ｒ）の測定について説明する。従来、種々の添加物の存在する加工食品中では、フコースの測定は難しく、特に、他の糖や硫酸基を有する物質などが混在した場合は難しかった。
【００５４】
例えば、従来フコイダンの純度の測定に使用されていたロジソン酸法（K.S.Dodgson, R.G.Price, Biochem. J., 84, 106 (1962)）は、糖を塩酸で加水分解後、塩酸を除去し、エタノールを加え沈殿を遠心除去した後、ＢａＣｌ２とロジソン酸ナトリウム溶液を加え混合し、室温暗所に置き、５２０ｎｍの吸光度で測定する方法である。
【００５５】
しかし、この方法では、硫酸基の量を測定するために、動物由来のコンドロイチン、海草由来のカラギーナン、無機化合物のミョウバンなど、その他多くの硫酸基を含有する食品素材も含んでしまい、加工食品中のフコイダンの測定には使用できないという問題があった。本発明に係るフコイダン含量の測定法では、以下の方法を行うことで、従来難しかった加工食品中でのフコースの測定を可能とした。
【００５６】
すなわち、本発明に係るフコイダン含量の測定法では、食品を塩酸処理後に、エタノール処理、更に、ここで、次の発色過程において、フコースと同様に発色するために障害となるオリゴ糖や単糖等を含有する低分子画分を限外濾過で除外し、次いで、加水分解する。
【００５７】
そして、得られたフコイダンをフコースに分解した際には、従来のフコイダンの測定に使用されているフェノール・硫酸法では、ショ糖やグルコースの混入が発色により影響するので、このフェノール・硫酸法を使用しない。本発明に係るフコイダン含量の測定法では、ショ糖やグルコースが発色せずに、この段階で、メチルペントースであるフコースの量のみが測定できるギボンズ法（Gibbons法：Gibbons, M.N.(1955)Analyst, 80, 268.）を使用する。
【００５８】
このGibbons法は、システイン−硫酸法の一種である。このシステイン−硫酸法の原理は、その正確な基本反応は不明であるが、大まかには、糖と硫酸との反応により生じる物質が、システインなどのＳＨ試薬と反応して呈色に変化するので、その呈色度から糖の定量を行うのが本法の原理である。
【００５９】
特にGibbons法は、上述したようにメチルペントースの定量法の一種であるが、ＳＨ試薬として、チオグリコール酸を用いる方法である。チオグリコール酸で発色した時の吸収スペクトルの４００ｎｍと４３０ｎｍにおける吸光度を測定し、差を算出し、フコースの量を計測した。これにより、加工食品中のフコースの量を把握することを可能とした。なお、ショ糖やグルコースの混入が問題ない場合は、フェノール・硫酸法を使用することも可能であった。
【００６０】
以上、本発明に係るフコイダン含量の測定方法について、フコイダン原料が海草である場合を中心として説明したが、フコイダン原料は、海草や棘皮動物のみならず、精製フコイダン自体も含めることができ、これらの原料を含有する食品中または食品素材中のフコイダン原料の種類とフコイダン含有比を特定することができ、この結果、食品中もしくは食品素材中のフコイダン含量を簡単且つ正確に測定することができる。
【００６１】
なお、本発明に係るフコイダン含量の測定方法の対象は、海草等のフコイダン原材料であるが、このようなフコイダン原材料を原料としたフコイダンを含有した食品としては、多くの食品類をあげることが出来る。
【００６２】
一例としては、酢の物やスープやサラダ等の惣菜類、コンニャクや豆腐類、ドレッシング類、薩摩揚げや天ぷら等の練り物類、海草含有飲料等の各種飲料類、海草含有ハムやソーセージやハンバーグやミートボール等の食肉加工製品類、パンやせんべいや餅やケーキやクッキーやキャンデーやガム等、海草を粉末にしたふりかけやお茶漬け類、ジャム類、バターやチーズやヨーグルト等の乳製品類、各種缶詰、レトルト食品類、冷凍食品類、乾物等の種々の食品をあげることが出来る。さらに、この方法の対象となるのは、食品だけに限らず、化粧品や医薬品に関しても適用することが出来る。
【実施例１】
【００６３】
（糖組成による識別）
実施例１として、前記識別方法２を特徴とする実施例を以下に挙げる。試験検体として、オキナワモズクのみよりなる海草粉末を作成した。この海草粉末から塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出した。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。これを２．０Ｎの硫酸中で１００℃で２時間の加水分解に供した。
【００６４】
これをＨＰＬＣ（カラム、Shimpak ISA-07(4.0 x 250 mm)； 溶離液、０．１〜０．４Ｍホウ酸緩衝液； 流速、０．６ｍｌ／ｍｉｎ； 温度６５℃）により定量分析を行ったところ、L-フコースとD-キシロースの構成比が９７：３であり、他の糖がほとんど含まれないというオキナワモズクに特異的な糖組成を示すことが明らかとなった。この結果から海草粉末はオキナワモズクのみを原料としていることが確認された。
【実施例２】
【００６５】
（糖組成による識別）
実施例２として、前記識別方法２と特徴とする別の実施例を以下に挙げる。海草としてひじきのみを添加した海草入りのさつま揚げに含まれるフコイダンの糖組成を実施例１と同様の方法で調べたところ、ひじき特異的な糖組成であるL-フコース：D-ガラクトース：D-グルコース：D-マンノース：D-キシロース：D-グルクロン酸が５：１：１：０．５：０．５：２を示すことが明らかとなった。この結果から使用されている海草はひじきのみであると確認された。
【実施例３】
【００６６】
（抗体による原料海草の識別）
実施例３として、前記識別方法３を特徴とする実施例を以下に挙げる。白色種ウサギに１．０ｍｇのオキナワモズク由来精製フコイダンの破砕物を（フロイント完全アジュバントとのエマルジョンとして）皮内投与し、一週間後にさらに等量のオキナワモズク由来精製フコイダンの破砕物を投与する（フロイント不完全アジュバントとのエマルジョンとして）、投与を４回繰り返した後４９日後に全血を採取し、抗血清を得た。この抗血清をアフィニティークロマトにより精製を行い、抗オキナワモズク由来精製フコイダンポリクローナル抗体を得た。
【００６７】
また、コンブにおいても同様に処置し抗コンブ由来精製フコイダンポリクローナル抗体を得た。ここで、フコイダン含量が２０％のオキナワモズク（飲料中６重量％）とフコイダン含量が１０％のコンブ（飲料中４重量％）を混ぜた海草飲料を作成し、この抗体を用いて海草飲料中のオキナワモズク由来のフコイダンの量をELISA法により測定した。
【００６８】
同じく、この抗体を用いて海草飲料中のコンブ由来のフコイダンの量をELISA法により測定した。その結果、オキナワモズク及びコンブのフコイダン含有比として、オキナワモズク由来フコイダン含量：コンブ由来フコイダン含量＝３：１を得ることが出来た。
【実施例４】
【００６９】
実施例４として、分子量分布による識別（前記識別方法１）及び加工食品中のフコース含量測定のプロセスにより、加工食品中のフコイダン含量を測定する実施例を以下に説明する。
【００７０】
第１のプロセス（分子量分布による識別）：
まず、試験検体として、海草として、ひじき、オキナワモズクを原料として海草スープを作成した。前もって、これらの原料中のフコイダンを精製し、各海草中のフコイダン含量を測定することで、本海草スープが、各海草由来のフコイダンの含有比が、ひじき由来のフコイダン：オキナワモズク由来のフコイダン＝２０：１０で、フコイダン含有量が５３ｍｇであることを確認しておいた。
【００７１】
この海草スープから塩酸抽出、ろ過、エタノール沈殿により粗フコイダンを抽出した。この粗フコイダン１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１晩の透析の後、２％セチルピリジニウムクロライドを加え、生成した沈殿を遠心分離で回収した後、蒸留水で洗浄し４Ｍ塩化カルシウム１００ｍｌに溶解し、ろ過の後透析を行い精製フコイダン溶液を得た。
【００７２】
ここで、分子量４万２千はひじきのフコイダンに特異的な分子量、分子量５０万はオキナワモズクのフコイダンに特異的な分子量であることから、この溶液の分子量分布をゲル濾過により測定したところ、分子量４万２千を示すフコイダン量：分子量５０万を示すフコイダン量＝２０：１０であった。
【００７３】
これより、検体スープ中には、ひじきのフコイダン含量：オキナワモズクのフコイダン含量＝２０：１０の比率で各フコイダン原料中のフコイダンが含有されていたことが確認された。
【００７４】
第２のプロセス（加工食品中のフコース含量測定）：
上記海草スープ５０ｍｌに塩酸を0.2N HCl（最終濃度）になるように添加し、室温で攪拌しながら一晩抽出した。２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで固形物を除き吸引ろ過 (ADVANTEC 5A)後、ＮａＯＨで中和（ｐＨ６〜７）し、30ml EtOHを添加し、遠心（5,000 rpm x 15 min）により沈殿を回収した。ついで、１５０ｍｌの純水に溶解、限外ろ過で分子量２０万以下を排除 (４℃)、１回洗った。
【００７５】
２．７ｍｌ濃硫酸を添加し５０ｍｌにメスアップし、加水分解（１００℃２時間）し、フコース定量を行った。フコース定量は、Gibbons法で行った。つまり、フコース標準液（１％溶液（１０ｍｇ／ｍｌ））を段階希釈し、サンプルを希釈し、キャップ付試験管に標準液またはサンプルを１ｍｌ入れ（サンプルは３組ずつ用意）、氷冷下で４．５ ｍｌ 硫酸（純水：濃硫酸＝１：６）を加えた。
【００７６】
フタをして室温に戻し、１０分ボイル後、氷冷した。チオグリコール酸（チオグリコール酸１ｍｌを純水で希釈して３０ｍｌにしたもの。）を０．１ｍｌずつ加えた。サンプルの内1組はチオグリコール酸の代わりに水を加えたものを作成しバックグランド値の測定に使用した。暗所で３〜２４時間放置した。４００ｎｍと４３０ｎｍにおける吸光度を測定し、差を算出した。測定結果として、フコース含量として、２０ｍｇを得た。
【００７７】
第３のプロセス（加工食品中のフコイダンの含量の算出）：
ここで、ひじきにおけるフコイダンのフコース含量は、３１．４％であるので、フコイダン換算係数は、１００／３１．４＝３．１８となる。また、オキナワモズクにおけるフコイダンのフコース含量は、５０．５％であるので、フコイダン換算係数は、１００／５０．５＝１．９８となる。
【００７８】
そして、ひじきのフコイダン含量：オキナワモズクのフコイダン含有量＝２０：１０であるので、全体の換算係数は、３０/（１／３．１８×２０＋１／１．９８×１０）＝２．６５となるので、本海草スープ５０ｍｌ中のフコイダン含量は、２０ｍｇ×２．６５＝５３ｍｇとなった。
【００７９】
以上、本発明に係るフコイダン含量の測定方法を実施するための最良の形態を実施例に基づいて説明したが、本発明はこのような実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的事項の範囲内でいろいろな実施例があることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上のとおり本発明は、食品中のフコイダンの量を測定しその数量を正確に評価できるから、フコイダンを利用する食品の目的に応じて、フコイダンの量を正確に含有させることができ、各種飲料類、食肉加工製品類、惣菜類、冷凍食品類等、いろいろな食品への含有により、それぞれの加工食品の付加価値を高めることができる。また、本発明は健康食品、化粧品中のフコイダン含量の測定にも適用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンの含量を測定する方法であって、フコイダン原料種とフコース量を特定し、該フコイダン原料種に特有のフコイダン変換係数と前記フコース量に基づいて、フコイダン含量を測定することを特徴とするフコイダン含量の測定方法。
【請求項２】
前記原料種の特定を、フコイダンを構成する糖の種類と割合から識別して行うことを特徴とする請求項１記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項３】
前記原料種の特定を、フコイダンの分子量から識別して行うことを特徴とする請求項１記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項４】
前記原料種の特定を、特異的に識別する物質を用いて行うことを特徴とする請求項１記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項５】
前記特異的に識別する物質が、抗体であることを特徴とする請求項４記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法でフコイダンの含量が特定されていることを特徴とするフコイダン含有食品。
【請求項７】
前記フコイダンの原料種がオキナワモズクであることを特徴とする請求項６記載のフコイダン含有食品。
【請求項１】
フコイダンの含量を測定する方法であって、フコイダン原料種とフコース量を特定し、該フコイダン原料種に特有のフコイダン変換係数と前記フコース量に基づいて、フコイダン含量を測定することを特徴とするフコイダン含量の測定方法。
【請求項２】
前記原料種の特定を、フコイダンを構成する糖の種類と割合から識別して行うことを特徴とする請求項１記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項３】
前記原料種の特定を、フコイダンの分子量から識別して行うことを特徴とする請求項１記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項４】
前記原料種の特定を、特異的に識別する物質を用いて行うことを特徴とする請求項１記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項５】
前記特異的に識別する物質が、抗体であることを特徴とする請求項４記載のフコイダン含量の測定方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法でフコイダンの含量が特定されていることを特徴とするフコイダン含有食品。
【請求項７】
前記フコイダンの原料種がオキナワモズクであることを特徴とする請求項６記載のフコイダン含有食品。
【公開番号】特開２００６−１８４１３１（Ｐ２００６−１８４１３１Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３７８３０４（Ｐ２００４−３７８３０４）
【出願日】平成１６年１２月２７日（２００４．１２．２７）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２７日（２００４．１２．２７）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]