フコシル化化合物の合成
フコシル化化合物を産生する能力を有する遺伝子組換え細胞を作製するための方法であって：フコースキナーゼを発現するように細胞を形質転換する工程、フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼを発現するようにその細胞を形質転換する工程、フコシルトランスフェラーゼを発現するようにその細胞を形質転換する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコシル化化合物およびそれに関連する細胞を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人乳は、炭水化物、タンパク質、脂質、ホルモン、および微量栄養素の複雑な混合物から構成されており、乳児の成長に必要なすべての栄養素を提供するものである。それに加えて、人乳はいくつかの保護物質（protective agents）を含有している。免疫グロブリンの他に、人乳は、保護特性を有する様々な数多くの複合オリゴ糖類（complex oligosaccharides）を含有している。人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）画分は、主たる炭水化物成分であるラクトースに加えて、１３０を超える種々の複合オリゴ糖類を含んでいる。複合オリゴ糖のこの構造的多様性、およびそれらの高い存在量は、ヒトに特有のものである。対照的に、ウシ乳では、非常に少ない種類の複合オリゴ糖がごく微量見られるだけであり、従って、一般的に用いられる乳児用調合乳にはこれらのオリゴ糖が欠落している。
【０００３】
臨床データから、母乳で育てられた乳児は、調合乳で育てられた乳児に比べて下痢症、呼吸器疾患、および中耳炎の発病率が低いことが示された。このような人乳の保護効果は分泌免疫グロブリンの存在に帰するものであると長い間考えられてきたが、現在では、母乳で育てられた乳児における病原体に対する主たる防御線はＨＭＯであり得ることが認識されてきた。
【０００４】
複合ＨＭＯの多くは、ルイスＸ（ＬｅＸ）組織‐血液型抗原Ｇａｌ（β１‐４）［Ｆｕｃ‐（α１‐３）］ＧｌｃＮＡｃ（β１）などの細胞表面複合糖質との相同性を示し（Newburg, 2001）、これらは、多くの場合、病原体受容体として作用する。従って、細胞表面複合糖質構造を模倣して可溶性デコイを排出することにより、自然はこのように感染を予防する効率的なメカニズムを発展させた。例えば、ＨＭＯは、病原性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）（Cravioto et al., 1991）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Coppa et al., 2006)、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Andersson et al., 1986）、またはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（Ruiz-Palacios et al., 2003）の毒性を激減させることができることが示され、また、大腸菌の熱安定性エンテロトキシン（Crane et al., 1994）などのトキシンを中和することができることも示された。上記の腸管における局所的効果に加えて、ＨＭＯは、体循環に進入することにより乳児における全身作用を誘発することもできる（Gnoth et al., 2001）。
【０００５】
ＨＭＯは、例えばセレクチン‐白血球結合などのタンパク質‐炭水化物相互作用に影響を与えることにより、免疫反応の調節および炎症反応の低減を行うことができる（Bode, 2006、Kunz & Rudloff, 2006）。
【０００６】
複合オリゴ糖は、人乳の成分の中で、ラクトースと脂肪に次いで３番目に多い成分である。これらのほぼ全ては、還元末端にラクトースを共通して有しており、非還元末端はフコースおよび／またはシアル酸で修飾されている。複合オリゴ糖は、３個〜３２個の単糖から構築されており、ほとんどは１個〜１５個のフコースユニットとしてフコースを含有している。従って、フコシル化オリゴ糖は、抗感染性およびプレバイオティック特性を有する生物活性食物成分として大きな可能性を示すものである。
【０００７】
供与体であるグアノシン‐二リン酸活性化Ｌ‐フコース（ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース）からいくつかの受容体分子へのフコース残基の転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）が、動物、植物、真菌、および細菌中で発現される（Ma et al., 2006）。これらは、フコース付加の部位に応じて分類されており、従って、α１，２、α１，３／４、およびα１，６ ＦｕｃＴが識別されている。ＨＭＯおよび血液型抗原の生合成を元来から担うヒトＦｕｃＴの他に、いくつかの細菌ＦｕｃＴが報告されている。ＦｕｃＴ活性は、そのリポ多糖（ＬＰＳ）をフコース含有ルイス抗原で修飾するヒト胃病原体であるピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関するものが最もよく記録されている（Wang et al., 2000）。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染におけるこれらのルイス抗原構造物の正確な役割は不明であるが、ホストの免疫系を回避するための分子擬態、接着、およびコロニー形成について検討されている（Bergman et al., 2006）。
【０００８】
ＨＭＯは、健康増進栄養補助食品として多大な可能性を有することから、費用対効果の高い、大スケールでの生産への関心が高まっている。細菌発酵プロセスを介する生物触媒による生産は、人乳からのＨＭＯの抽出、ならびに労力がかかり複数の保護および脱保護工程を必要とする化学合成よりも非常に有利である（Kretzschmar & Stahl, 1998）。ここ１０年の間に、遺伝子組換え大腸菌による発酵、またはインビトロでの酵素転換を用いてＨＭＯを合成する試みがいくつか報告されている（Albermann et al., 2001、Dumon et al., 2006、Dumon et al., 2001、Dumon et al., 2004、Koizumi et al., 2000）。しかし、フコシル化オリゴ糖の生産のボトルネックは、供与体であるヌクレオチド糖ＧＤＰ‐フコースの入手のし難さである。この高エネルギー分子は、現在のところ、化学合成または酵素合成を介しては効率的にも高費用対効果的にも得ることができない。フコシル化化合物の生産システムを報告している刊行物の多くは、大腸菌の内在性ＧＤＰ‐フコースプールに依存しているが、これは、極めて限られており、フコース含有菌体エキソ多糖類コラン酸の誘導合成に用いられるのみである（Grant et al., 1970）。
【０００９】
例えば、Albermann et al. (2001)は、酵素合成に遺伝子組換え酵素を用いている。ＧＤＰ‐β‐Ｌ‐フコースの合成は、ＧＤＰ‐Ｄ‐マンノースをＧＤＰ‐４‐ケト‐６‐デオキシ‐Ｄ‐マンノースへ転換することで行う。これをＧＤＰ‐４‐ケト‐６‐デオキシ‐Ｄ‐マンノース３，５エピメラーゼ‐４‐レダクターゼで処理することによりＧＤＰ‐β‐Ｌ‐フコースを合成し、これを分取用ＨＰＬＣで精製する。
【００１０】
Koizumiおよび共同研究者らによるＮ‐アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）からＬｅＸを合成する別の手法は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）による補充されたＧＭＰからのＧＴＰの産生、ＧＤＰ‐マンノースを介するＧＤＰ‐フコースの合成、および別の大腸菌株内でのピロリ菌α１，３‐ＦｕｃＴの過剰発現によるＬａｃＮＡｃのフコシル化の組み合わせを含むものであった（Koizumi et al., 2000）。この細菌カップリング（bacterial coupling）の手法では、透過処理、及びそれによる細胞の殺傷を用いる必要があったため、ここで選択された手法では、連続的な大スケールでの発酵プロセスは可能ではなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
先行技術の欠点の少なくともいくつかを克服するフコシル化化合物を生産するための方法が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの態様は、フコシル化化合物を産生する能力を有する遺伝子組換え細胞を作製するための方法であって、該方法は、
フコースキナーゼを発現するように細胞を形質転換する工程、
フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼを発現するように上記細胞を形質転換する工程、
フコシルトランスフェラーゼを発現するように上記細胞を形質転換する工程、
を含む。
【００１３】
本発明の方法によると、遺伝子組換え細胞が作製される。該細胞は、フコースキナーゼ、フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼを発現するように形質転換されたものである。
【００１４】
遺伝子を細胞へ導入する方法は当業者に公知である。
【００１５】
好ましい一態様では、遺伝子組換え細胞は、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）から成る群より選択される微生物である。
【００１６】
本発明の好ましい一態様では、フコースキナーゼおよびフコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼの活性が、二機能性酵素中にて組み合わされる。フコースキナーゼ、フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、および／または二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする形質転換に適する遺伝子は、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、レンチスファエラ属（Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ソリバクター属（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、オリザ属（Ｏｒｙｚａ）、フィスコミトレラ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、ビチス属（Ｖｉｔｉｓ）、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）、ウシ属（Ｂｏｓ）、ウマ属（Ｅｑｕｕｓ）、マカク属（Ｍａｃａｃａ）、チンパンジー属（Ｐａｎ）、ヒト属（Ｈｏｍｏ）、ラッタス属（Ｒａｔｔｕｓ）、ハツカネズミ属（Ｍｕｓ）、およびクセノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）から得ることができる。
【００１７】
好適なフコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヘリコバクター属、エスケリキア属、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バクテロイデス属、ディクチオステリウム属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）、アラビドプシス属、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒト属、ウシ属、ハツカネズミ属、ラッタス属、ヤケイ属（Ｇａｌｌｕｓ）、イヌ属（Ｃａｎｉｓ）、およびイノシシ属（Ｓｕｓ）からなる群より選択される生物から得ることができる。
【００１８】
発現に用いられる遺伝子源および細胞源によっては、コドン最適化が発現の増加に有用であり得る。
【００１９】
細胞の中には、フコースに対する異化経路を有するものもある。この場合、この異化経路を不活性化することが推奨される。好適な方法には、フコース‐１‐リン酸アルドラーゼ遺伝子、フコースイソメラーゼ遺伝子、およびフクロースキナーゼ遺伝子から成る群より選択される１又は複数の遺伝子を不活性化することが含まれる。
【００２０】
本発明の遺伝子組換え細胞によって作製可能である好適なフコース由来化合物は、フコシルラクトース類であり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオース（Ｌａｃｔｏｄｉｆｕｃｏｔｅｔｒａｏｓｅ）である。
【００２１】
本発明は、Albermann et al. (2001)に記載のＧＤＰ‐Ｄ‐マンノースを出発物質とする遺伝子組換え酵素を用いた調製的合成ではなく、フコースを出発物質とする細胞内での合成である。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法で得ることができる遺伝子組換え細胞である。フコシル化化合物を生産するために、本発明の遺伝子組換え細胞が、フコースおよび受容体基質を含む培地中にて適切な培養条件下で培養される。
【００２３】
好適な受容体基質としては、例えば、単糖、二糖、もしくはオリゴ糖、またはペプチドが挙げられ、例えば、ラクトース、２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトースが挙げられる。
【００２４】
この生産方法によって得られる好ましいフコシル化化合物は、フコシルラクトース類であり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオースである。
【００２５】
本願は、外部から供給されたＬ‐フコースからの大腸菌内における効率的なＧＤＰ‐フコース合成、従って大腸菌内におけるフコース「サルベージ経路（salvage pathway）」の確立を始めて報告するものである。しかし、この手法は、食品または医薬品業界で関心の高い、培養が容易であるその他の生物（例えば、ラクトバチルス属生物（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））に移転することもできる。この新たに発見された経路を用いることにより、高コストかつ労力のかかるＧＤＰ‐フコース提供（インビトロ）、または内在性の高度に制御されたＧＤＰ‐フコース生合成経路（インビボ）に依存する必要なしに、２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースに加えてオリゴ糖類の生産についてまったく新しい展望が得られる。
【００２６】
いわゆる「フコースサルベージ経路」では、フコースはまず、酵素であるフコースキナーゼによってリン酸化されてフコース‐１‐リン酸となる。次に、このフコース‐１‐リン酸は、酵素であるフコース‐１‐Ｐ‐グアニリルトランスフェラーゼの作用によってＧＤＰ‐フコースへと変換される。最近、フコースキナーゼおよびＬ‐フコース‐１‐Ｐ‐グアニリルトランスフェラーゼの両活性を有する初めての細菌酵素Ｆｋｐが報告された（Coyne et al., 2005）。腸内細菌であるバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）は、この酵素をＧＤＰ‐フコースの産生に用いており、これは、カプセル多糖および糖タンパク質をフコース残基で修飾するように作用する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】主要な複合人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースの構造を示す図である。
【図２】共役酵素反応によるＦｋｐ活性の測定、およびＮＡＤＨ酸化の測定のための光度分析のスキームを示す図である；Ｆｋｐ＝二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸‐グアニリルトランスフェラーゼ、ＰＫ＝ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨ＝Ｌ‐乳酸デヒドロゲナーゼ、ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸。
【図３】共役酵素反応によるＦｕｃＴ活性の測定、およびＮＡＤＨ酸化の測定のための光度分析のスキームを示す図である；ＦｕｃＴ＝フコシルトランスフェラーゼ、ＰＫ＝ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨ＝Ｌ‐乳酸デヒドロゲナーゼ、ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸。
【図４】誘導後のタンパク質形成を示す図である。 レーン１〜４：大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ（レーン１）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏ（レーン２）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＥＴｆｕｔＡｃｏ（レーン３）、および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＣＡＷ５５（レーン４）からの粗抽出物中における、可溶性Ｆｋｐ（１０５．７ｋＤａ）および／またはＦｕｔＡｃｏ（４９．３ｋＤａ）またはＦｕｃＴ２（３５．９ｋＤａ）の発現； レーン５：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）着色タンパク質ラダー（フェルメンタス（Fermentas），ドイツ）； レーン６〜９：大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ（レーン６）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏ（レーン７）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＥＴｆｕｔＡｃｏ（レーン８）、および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＣＡＷ５５（レーン９）からの６Ｍ尿素中に再懸濁させた細胞デブリ中における、不溶性Ｆｋｐおよび／またはＦｕｔＡｃｏまたはＦｕｃＴ２の発現。
【図５】ブタノール：アセトン：酢酸：水（３５：３５：７：２３）で発色させ、ラジオ‐ＴＬＣリーダーを用いて分析した３Ｈ‐フコースのラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオ‐ＴＬＣ）を示す図である。
【図６】大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１からの細胞抽出物のラジオ‐ＴＬＣを示す図であり、フコースおよびフクロースおよびフクロース‐１‐リン酸を示すが、フクロース‐１‐リン酸の分解は、フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼ遺伝子（ｆｕｃＡ）のゲノムノックアウトにより阻害されている。
【図７】大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰからの細胞抽出物のラジオ‐ＴＬＣを示す図であり、バクテロイデス・フラジリスからの二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐによって産生されたＧＤＰ‐フコース、ならびにフコース、および分解産物フクロースおよびフクロース‐１‐リン酸の蓄積を示す。
【図８】大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞抽出物のラジオ‐ＴＬＣを示す図であり、二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（Ｆｋｐ）によって提供されたＧＤＰ‐フコースを介して、コドンが最適化されたヘリコバクター・ピロリのフコシルトランスフェラーゼによって産生された３‐フコシルラクトースの蓄積を示す。フコースならびに分解産物フクロースおよびフクロース‐１‐リン酸は僅かに存在するだけであり、ＧＤＰ‐フコースの量は、３‐フコシルラクトースの産生によって大きく減少している。
【図９】ネガティブコントロールである大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１からの細胞溶解物のＨＰＡＥＤ分析を示す図であり、細胞内Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースのピークが見られるが、フコシルラクトースは見られない。
【図１０】３‐フコシルラクトースを産生する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏの細胞溶解物を示す図であり（保持時間は約１１分）、Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースのピークが見られる。
【図１１】大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＣＡＷ５５からの細胞溶解物のＨＰＡＥＤ分析を示す図であり、２’‐フコシルラクトースの産生を示した（保持時間は約２２分）。さらに、Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースが見られる。
【図１２】図１２ａおよび図１２ｂは、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ（図１２ａ）および大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ（図１２ｂ）内でのＧＤＰ‐フコース発現の電気化学的検出によるＨＰＬＣ分析を示す。
【実施例】
【００２８】
本発明を、以下の限定されない実施例によりさらに説明する：
【００２９】
実施例１
発現プラスミドの構築および産生株の開発
外部から供給したフコースの分解を良好に防止するためには、鍵となる異化酵素フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼをコードするｆｕｃＡ遺伝子を大腸菌株ＢＷ２５１１３のゲノムから欠失させる必要があった。ｆｕｃＡ欠失の構築には、（Datsenko & Wanner, 2000）の方法を適用した。Ｔ７プロモーターを用いた異種遺伝子発現については、λＤＥ３溶原化キット（ノバジェン（Novagen））を用いて、誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを欠失大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡに組み込んだ。ここで、得られた株を大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）と称した。プラスミドｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰおよびｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏは、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１およびｐＥＴＤｕｅｔ‐１発現ベクター（ノバジェン）を用いて構築した。構築に用いたすべてのプライマーを表２に挙げる。遺伝子ｆｋｐ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＹ８４９８０６）は、バクテロイデス・フラジリスのゲノムＤＮＡ ＡＴＣＣ２５２８５Ｄを用い、プライマーｆｋｐ‐ＮｃｏＩ‐フォワードおよびｆｋｐ‐ＮｏｔＩ‐リバースによるＰＣＲで増幅した。大腸菌Ｋ１２のｆｕｃＰ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＣＰ０００９４８）は、プライマーＦｕｃＰ‐ＮｄｅＩ‐フォワードおよびＦｕｃＰ‐ＸｈｏＩ‐リバースを用い、大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Invitrogen），米国）のゲノムＤＮＡから増幅した。ｆｋｐおよびｆｕｃＰの両方を、それぞれ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１の第一および第二のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）へ、示した制限部位を用いて挿入した。得られたプラスミドはｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰと称した。Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ株２６６９５のｆｕｔＡ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＥ０００５１１）に、大腸菌内での発現のためのコドン最適化を施し、ジェンスクリプトコーポレーション（GenScript Corporation）（ピスカタウェイ，ニュージャージー州，米国）による合成により調製した。この遺伝子を、プライマーＦｕｔＡｃｏ‐ＮｃｏＩ‐フォワードおよびＦｕｔＡｃｏ‐ＢａｍＨＩ‐リバースを用いて増幅し、ｐＥＴＤｕｅｔ‐１の第一のＭＣＳへ挿入してｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏを得た。クローン遺伝子が正しく挿入されていることを、Ｄｕｅｔベクターマニュアル（ノバジェン）に記載の推奨プライマーｐＡＣＹＣＤｕｅｔＵＰ１、ｐＥＴ‐Ｕｐｓｔｒｅａｍ、ＤｕｅｔＤＯＷＮ‐１、ＤｕｅｔＵＰ２、およびＴ７‐Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用い、制限分析およびシークエンシングによって確認した。ヘリコバクター・ピロリ ＮＣＴＣ３６４からのα１，２‐フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＴ２を含有するプラスミドｐＣＡＷ５５は、C. Albermann（シュトゥットガルト大学、微生物学研究所（Institute for Microbiology, University of Stuttgart））の寄贈によるものであり、ベクターｐＪＯＥ２７０２に基づいている（Stumpp et al., 2000）。遺伝子ｆｕｃＴ２は、制限部位ＮｄｅＩ／ＰｓｔＩを介して挿入され、Ｌ‐ラムノース誘導性プロモーターｒｈａＰＢＡＤの支配下にある。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）は、電気穿孔法により発現ベクターを持ち手形質転換を行った（Dower et al., 1988）。本研究で用いたすべての細菌株を表１に挙げる。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
実施例２
培養条件および細胞抽出物の調製
大腸菌株を、１００μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび／または５０μｇｍＬ−１のカナマイシンを含有する２ｘＹＴブロス（Sambrook & Russell, 2001）１０ｍＬ中に播種し、ロータリーシェーカー中で３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、適切な抗生物質を添加した新しい２ｘＹＴブロス３０ｍＬに、一晩培養物から１／１００にて播種し、十分に通気しながらロータリーシェーカー中で３７℃にてインキュベートした。培養物の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）が約０．５に達した時点で、誘導因子イソプロピル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および／またはＬ‐ラムノースを、それぞれ０．１ｍＭおよび０．１％の濃度で添加した。この培養物を、一定の振とう下にて２８℃でさらに一晩（約１５時間）インキュベートした。光度活性分析のために、細胞培養物のアリコートを取り出し、細胞をペレット化し、重量／体積で５倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。細胞ペレットの重量の４倍のガラスビーズを添加し、得られた懸濁液に５分間ずつ２回のボルテックス攪拌を施すと同時に、その間にさらに５分間氷上に静置した。細胞デブリを遠心分離（１３，２００ｒｐｍ、５分間、４℃）により除去し、得られた粗抽出物を４℃で保存した。
【００３３】
フコシルラクトースのインビボでの産生のために、細胞を１培養体積分のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）（Sambrook & Russell, 2001）で洗浄し、３０ｍＬの改変Ｍ９ミネラル培地中に再懸濁したが、これは、標準Ｍ９処方（Sambrook & Russell, 2001）に以下の物質：２０ｍＭ Ｌ‐フコース、２０ｍＭ ラクトース、０．５％ グリセロール、０．５ｍＭ グアノシン、および１× ＧＩＢＣＯ ＭＥＭビタミン溶液（１００×）（インビトロジェン，米国）、を添加したものである。どの菌株が培養されているかに関わらず、すべての培養物へ誘導因子Ｌ‐ラムノース（０．１％）およびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）の添加も行い、培養条件のばらつきを回避した。ここでも、培養物を一定の振とう下にて２８℃で一晩（約１５時間）インキュベートした。この培養物を遠心分離し、上清をデカントして−２０℃で保存した。続いて細胞をＰＢＳで洗浄し、蒸留水中に再懸濁し、オートクレーブによって透過処理した（１００℃、５分間）。細胞デブリを除去するために、サンプルを遠心分離し（８，５００ｒｐｍ、３０分間）、透明な細胞溶解物を−２０℃で保存した。
【００３４】
実施例３
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
異種タンパク質の発現を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（Sambrook & Russell, 2001）により確認した。タンパク質抽出物を１× ＳＤＳゲルローディングバッファー中に調製し、ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００３５】
実施例４
酵素光度計分析
【００３６】
実施例４ａ
Ｆｋｐ活性を測定するために、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の脱リン酸化の際にピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によって基質として用いられる、ＡＴＰから生じるＡＤＰの量により酵素のフコースキナーゼ活性を測定し、一方、得られたピルビン酸は次に、ＮＡＤＨを消費しながらＬ‐乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によりＬ‐乳酸へ変換された。対応する反応を図２にまとめる。各１，０００μＬの反応を、１０ｍＭのＬ‐フコース、１５ｍＭのＰＥＰ、５ｍＭのＭｇＳＯ４、各々０．２ｍＭのＡＴＰおよびＮＡＤＨ、ならびに各々５ＵのＰＫおよびＬＤＨを含有する６５ｍＭのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．５）中で実施した。２５μＬの粗抽出物の添加後、ＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化を、Ｖ‐６３０ Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ジャスコ社（JASCO GmbH），ドイツ）を用い、３４０ｎｍの吸光度の減少によってモニタリングした。
【００３７】
実施例４ｂ
同様に、ＦｕｃＴ活性を（図３に示すように）、ＰＥＰからピルビン酸への変換の下にてＰＫによってＧＴＰへとリン酸化されたＧＤＰ（供与体ＧＤＰ‐Ｌ‐フコースから）の発生によって測定した。ＬＤＨが、ＮＡＤＨの消費を伴うピルビン酸をＬ‐乳酸へ還元する最終反応を触媒した。細胞抽出物（２５μＬ）の試験は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）中に１０ｍＭ ラクトース、１００μＭ ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、各々０．２ｍＭのＡＴＰおよびＮＡＤＨ、ならびに各々５ＵのＰＫおよびＬＤＨを含有する反応液１，０００μＬ中にて行った。ＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍでモニタリングした。
【００３８】
実施例５
オリゴ糖の検出
ＨＰＬＣシステム（シマズ（Shimadzu），ドイツ）に接続したアンテックレイデン（Antec Leyden）（オランダ）製のＤｅｃａｄｅ ＩＩパルス式電気化学検出器（pulsed amperometric detector）、およびＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラム（ダイオネクス（Dionex），ドイツ）を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＤ）でサンプルを分析した。検出器の感度は、印加パルス電位０．０５‐Ｖにて５０μＡに設定した。単糖、二糖、およびオリゴ糖を、１０ｍＭ 水酸化ナトリウムを用いて流速０．４ｍＬ分−１で溶出した。１０ｍＭ ＮａＯＨによる３０分間の定組成溶出後、カラムを２００ｍＭ ＮａＯＨで２０分間洗浄して保持時間を一定とし、その後１０ｍＭ ＮａＯＨで２０分間の再生を行った。
【００３９】
実施例６
３Ｈ‐フコース供給実験
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）細胞を、ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１、ｐＥＴＤｕｅｔ‐１、ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ、およびｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏで形質転換し、以下の菌株を作出した：
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏ
【００４０】
大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１を、供給実験における空ベクターコントロールとした。次に、この３種類の菌株すべてを用いて、トリチウム標識フコース供給実験を行った。供給実験のために、２０μｌのＬ‐５，６‐３Ｈ‐フコース（４０〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌおよび１ｍＣｉ／ｍＬ）、５０ｍＭのラクトース、および１ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ｘＹＴ培地３ｍＬ中で細胞を培養した。用いた発現ベクターに応じて、２ｘＹＴ培地には、１００μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび／または５０μｇｍＬ−１のカナマイシンを添加した。３ｍＬの大腸菌培養物を室温にて一晩インキュベートした。次に、遠心分離により細胞を回収し、培地から分離して、得られた細胞ペレットを、２００μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、５分間煮沸した。氷上にて１０分間冷却した後、１３，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間施して細胞デブリを回収した。このようにして得られた大腸菌細胞上清から、それぞれ２０μＬの培養物をシリカゲルＴＬＣプレート（シリカゲル６０）に付与した。ＴＬＣプレートの発色には、ブタノール：アセトン：酢酸：水（３５：３５：７：２３）から成る溶媒混合物を用いた。次に、ラジオ‐ＴＬＣ分析をラジオ‐ＴＬＣリーダー（レイテスト（Raytest））を用いて実施した。非放射性参照物質のＲｆ値の測定のために、ＴＬＣプレートにアニスアルデヒド溶液（５ｍＬ 濃Ｈ２ＳＯ４、１００ｍＬ エタノール、１．５ｍＬ 酢酸、２ｍＬ アニスアルデヒド）を噴霧し、加熱した。
【００４１】
実施例７
大腸菌における効率的なＬ‐フコースサルベージ経路の確立
フコシルトランスフェラーゼの受容体基質としてラクトースが用いられたことから、β‐ガラクトシダーゼ欠損（ｌａｃＺ−）大腸菌株ＢＷ２５１１３を選択して、急速なラクトース分解の問題を回避した（Datsenko & Wanner, 2000）。Ｌ‐フコースもまた、野生型大腸菌により、フクロースへの異性化、フクロース‐１‐リン酸へのリン酸化、並びに、それに続くフクロース‐１‐リン酸のグリセリン‐３‐リン酸及びＬ‐ラクトアルデヒドへの逆アルドール開裂を介して効果的に分解され得る。供給されたフコースの分解を阻止するために、フコース分解経路の鍵となる異化酵素フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼ（ＦｕｃＡ）をコードする遺伝子ｆｕｃＡを、大腸菌株ＢＷ２５１１３のゲノムから欠失させた。得られた大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡは、フコースならびにラクトースを唯一の炭素源とするＭ９最小培地（minimal plates）上で成長することができなかった。遺伝子組換えファージλＤＥ３による溶原化により、Ｔ７プロモーターによって作動される発現ベクターの使用に適合する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）を得た。フコースからＧＤＰ‐フコースへのヌクレオチド活性化の能力は、自然界では非常に限られており、長い間いくつかの哺乳類（ヒト、ブタ、マウス）で知られるだけであった。フコースのヌクレオチド活性化は、ここで、２つの連続する酵素反応段階によって媒介され、それぞれ、第一は、フコースキナーゼの触媒によるフコースのフコース‐１‐リン酸へのリン酸化、およびこれに続くグアニリルトランスフェラーゼの触媒によるフコース‐１‐リン酸のＧＤＰ‐フコースへの変換である。哺乳類の場合、フコースサルベージ経路は２つの別個の酵素触媒反応を含むが、最近発見された細菌および植物のタンパク質は、両方の酵素活性を有する。大腸菌内におけるヒトフコースキナーゼの異種発現は、ほとんど検出されない活性が得られただけであった（Hinderlich et al., 2002）。生化学的研究から、哺乳類フコキナーゼは、高度に制御された酵素であることが示された（Park et al., 1998）。最近発見されたＢ．ｆｌａｇｉｌｉｓのＦｋｐ酵素がフコースの活性化により適しているかどうかを試験し、かつ大腸菌内でのフコシル化オリゴ糖の合成のために効率的にＧＤＰ‐フコースを提供するために、本発明者らは、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのゲノムＤＮＡからの遺伝子を増幅し、これを異種発現のために細菌発現ベクター中へクローニングした。
【００４２】
２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースの合成のために、以下のフコシルトランスフェラーゼを共発現のために選択した：α１，３‐フコシルトランスフェラーゼをコードするＨ．ｐｙｌｏｒｉ ２６６９５のｆｕｔＡ遺伝子（Appelmelk et al., 1999）、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＮＣＴＣ３６４のα１，２’‐フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｆｕｃＴ２（Albermann et al., 2001）。クローニングプロセスを始める前に、ｆｕｔＡのコドン使用頻度を大腸菌内での発現のために最適化し、次に、この遺伝子をジェンスクリプトコーポレーション（米国）によって合成した。得られた遺伝子ｆｕｔＡｃｏを発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ‐１中へ挿入し、ＦｋｐおよびＦｕｃＰの共発現の存在下および非存在下にて発現の試験を行った。標準的な誘導条件を用いて、Ｆｋｐ、ＦｕｃＰ、およびＦｕｔＡｃｏ、またはＦｕｃＴ２を共発現させた。ＩＰＴＧおよび／またはＬ‐ラムノースによる誘導の後、タンパク質形成をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで測定し（図４参照）、顕著なＦｋｐタンパク質の可溶性産物が示された一方、膜に局在化するフコースパーミアーゼタンパク質（ＦｕｃＰ）の誘導は、予想通り、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって細胞原形質中では検出することができなかった。しかし、ｆｕｔＡｃｏおよびｆｕｃＴ２の遺伝子産物は、僅かに少量の可溶性画分が検出可能であっただけで、主として封入体中に局在化されていることが示された。
【００４３】
実施例８
酵素活性の光度検出
誘導培養物由来の粗抽出物に、上述の共役酵素分析法において補助酵素（auxiliary enzymes）を用いることで、フコースキナーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性についての試験を施した。明らかに、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）内にてＮＡＤＨオキシダーゼおよび／またはホスファターゼ活性のバックグランドが大きく、これが、再現性のない結果、ならびに種々の菌株におけるフコースキナーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性の測定値が低いことの原因であった。従って、酵素活性は、細胞内産物の形成（ＧＤＰ‐フコースおよびフコシルラクトース）をモニタリングすることで測定することとした。
【００４４】
実施例９
遺伝子組換え大腸菌によるＧＤＰ‐フコースおよび３‐フコシルラクトース産生のための外部から供給された３Ｈ‐Ｌ‐フコースの利用についての試験
本実験は、バクテロイデス・フラジリスからのフコースサルベージ経路二機能性酵素Ｆｋｐによる、フコースおよびラクトースからＧＤＰ‐フコース産生を介する３‐フコシルラクトース産生の確認を目的としたものである。ネガティブコントロール大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１、さらには、Ｆｋｐおよびフコースパーミアーゼを発現する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ、ならびにＦｋｐ、フコース‐パーミアーゼ、およびα１，３‐フコシルトランスフェラーゼを発現する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏを、上述のようにして処理した。これらの菌株から得られた細胞抽出物をＴＬＣプレートに適用し、上述のようにして発色させ、ラジオ‐ＴＬＣリーダーで分析した。加えて、３Ｈ‐標識Ｌ‐フコース標準をＴＬＣプレートに適用し、発色させた（図５参照）。Ｌ‐フコースおよびＬ‐フクロース‐１‐リン酸、ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース、ならびに３‐フコシルラクトースに対する非放射性標準を、ＴＬＣおよびそれに続くアニスアルデヒド溶液による染色によって同様に分析した（データ示さず）。
【００４５】
ネガティブコントロール実験の結果（図６参照）からは、フコース代謝からの第一および第二の異化段階の産物、すなわちＬ‐フクロース（フコースイソメラーゼによってフコースから産生）およびＬ‐フクロース‐１‐リン酸（フクロースキナーゼによってフクロースから産生）が示された。フコースのさらなる分解は、フクロース‐１‐リン酸のＬ‐ラクトアルデヒド及びジヒドロキシアセトンリン酸への逆アルドール開裂反応を触媒する酵素フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＡのノックアウトにより、実質的に阻害される。
【００４６】
バクテロイデス・フラジリスからの二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐを共発現する大腸菌細胞は、ＧＤＰ‐フコースの産生を示し（図７参照）、ＧＤＰ‐フコースは明らかに細胞内に蓄積しており、また、他の代謝経路への転換がある場合はその産物がラジオ‐ＴＬＣ上に現れるはずであるため、他の代謝経路への転換はごく僅かであり得る。
【００４７】
大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞抽出物は、３‐フコシルラクトースおよびごく少量のＧＤＰ‐フコースの産生を示している（図８参照）。この結果は、この実験の最初の目的、すなわち、バクテロイデス・フラジリスからの二機能性サルベージ経路酵素Ｆｋｐによる、ＧＤＰ‐フコースの供給を介した３‐フコシルラクトースの産生を示すことと一致している。また、フコシルラクトース産生におけるＧＤＰ‐フコースの消費、ならびに、それに由来する、フクロース‐１‐リン酸およびフクロースから、ＧＤＰ‐フコース産生によって反応から常に引き抜かれるフコースへの反応平衡の移動に起因して、フコース分解産物であるフクロースおよびフクロース‐１‐リン酸の量も大きく減少している。
【００４８】
実施例１０
遺伝子組換え大腸菌による２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトース産生の試験
ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ、およびｆｕｔＡｃｏまたはｆｕｃＴ２遺伝子のいずれかを別個の発現ベクター中に有する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）、ならびに空ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１およびｐＥＴＤｕｅｔ‐１を有する大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）（ネガティブコントロール）を、２ｘＹＴブロス中で成長させ、ＩＰＴＧおよび／またはＬ‐ラムノースを用いて、２８℃にて１５時間、タンパク質発現を誘導した。続いて細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｌ‐フコース、ラクトースおよびグアノシン、ＩＰＴＧ、およびＬ‐ラムノースを添加した改変Ｍ９培地中に再懸濁させた。発酵フェーズの後（２８℃、１５時間）、細胞を採取し、上清を回収し、上述のようにして細胞溶解物を調製した。
【００４９】
ＨＰＡＥＤによる分析から、用いたＨＰＬＣカラム上での保持時間は、Ｌ‐フコース標準に対しては約３分、ラクトース標準に対しては約１７分、３‐フコシルラクトース標準に対しては約１１分、および用いた２’‐フコシルラクトース標準に対しては約２２分であることが示された（データ示さず）。培地の一部分であり炭素源であるグリセロールは、記録された保持時間が約１．５分であり、誘導因子Ｌ‐ラムノースの保持時間は５．５分であった。いずれの物質も、細胞溶解物の分析において細胞内で検出されている。
【００５０】
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１のネガティブコントロール株からの細胞溶解物は、細胞内Ｌ‐フコースおよびラクトースを示したが、予想通り、フコシルラクトースは示さなかった（図９参照）。上述の分子に加えて、培地に供給された炭素源であるグリセロールおよび転写誘導因子Ｌ‐ラムノースも、この分析で検出される。
【００５１】
コドン最適化を施されたヘリコバクター・ピロリのα１，３‐フコシルトランスフェラーゼ遺伝子と合わせて、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのｆｋｐ遺伝子および大腸菌のフコースパーミアーゼ遺伝子を共発現する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞溶解物のＨＰＡＥＤ分析は、３‐フコシルラクトースの細胞内産生を示した（約１１分の時点のピーク、図１０参照）。Ｌ‐フコースおよびラクトースもまた、グリセロールおよびＬ‐ラムノースと共に細胞溶解物の成分である。
【００５２】
大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＣＡＷ５５からの細胞溶解物は、α１，２‐フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ２の共発現に起因して、２’‐フコシルラクトースの細胞内産生を示した（図１１参照）。さらに、ネガティブコントロール、および３‐フコシルラクトース産生大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞溶解物とまったく同様に、Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースが細胞溶解物中に見られる。
【００５３】
これらの結果は、明らかに、遺伝子組換え大腸菌細胞内において、外部から供給されたＬ‐フコースおよびラクトースから３‐フコシルラクトースおよび２’‐フコシルラクトースが産生されたことを示している。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのＦｋｐタンパク質の異種発現により、フコースリン酸化およびフコース‐１‐リン酸グアニリル転移の２段階反応が触媒されることで、効率的にＧＤＰ‐フコースを産生することができた。元はヘリコバクター・ピロリ由来であるコドン最適化α１，３‐フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＡｃｏ、またはヘリコバクター・ピロリ由来のα１，２‐フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ２は、このように供給されたＧＤＰ‐フコースを、それぞれ、２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースへと変換することができる。
【００５４】
実施例１１
大腸菌ＪＭ１０９細胞内でのＧＤＰ‐フコースの発現
Ｆｋｐの発現に起因する細胞内ＧＤＰ‐フコース含有量の上昇が、プラスミドからのＦｋｐを発現する大腸菌株およびＦｋｐのコピーを持たない大腸菌株の平行培養によって示された。この場合、大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｆｕｃＡを、Ｆｋｐを持たないコントロール株として用いた。Ｆｋｐを発現する菌株は、同じ大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｆｕｃＡであるが、こちらはプラスミドｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰを含有し、従ってフコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐ、およびフコースパーミアーゼＦｕｃＰをコードする遺伝子を有していた。遺伝子は、ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１（ノバジェン，英国）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）１および２にてクローン化したが、いずれのＭＣＳもＴ７プロモーター／オペレーターの５’側に隣接することから、両方の遺伝子の発現はいずれもＩＰＴＧの添加によって誘導することができる。
【００５５】
両菌株共に、３０ｍｌの２ＹＴ培地中、３７℃および２２０ｒｐｍにて２つの反復サンプルとして培養し、ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰを持つ菌株の場合は、プラスミド維持のために培地にカナマイシンを添加した。Ｆｋｐ発現の誘導は、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によってＯＤ６６０＝０．５から開始し、２０ｍＭ フコースを両菌株に供給し、続いて３７℃および２２０ｒｍｐにてさらに３時間培養した。細胞を遠心分離でペレット化し、５体積／重量（ｖ／ｗ）の蒸留水中にペレットを再懸濁した。これらの細胞懸濁液を９５℃にて１０分間インキュベートし、細胞を溶解した。遠心分離により細胞デブリを除去し、上清をＨＰＬＣで分析した。
【００５６】
Ｄｅｃａｄｅ ＩＩパルス式電気化学検出器（アンテックレイデン，オランダ）を用いた電気化学的検出によってＨＰＬＣ分析を実施した。ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラム（ダイオネクス，米国）上にて、２０ｍＭ水酸化ナトリウム＋８２５ｍＭ酢酸ナトリウムを溶出液として用いた。ＧＤＰ‐フコースは、１６．０分の保持時間で溶出された。
【００５７】
【表３】
【００５８】
図１２ａは、ＦＫＰタンパク質の発現のない大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ細胞のＧＤＰ‐フコース発現についてのＨＰＬＣ分析を示す。
【００５９】
図１２ｂは、フコースインポーターＦｕｃＰと共にＦｋｐタンパク質を共発現する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ細胞の分析である。真正標準で確認されるように、１６．０分の時点でのピークが、ＧＤＰ‐フコースに対応している。
【００６０】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコシル化化合物およびそれに関連する細胞を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人乳は、炭水化物、タンパク質、脂質、ホルモン、および微量栄養素の複雑な混合物から構成されており、乳児の成長に必要なすべての栄養素を提供するものである。それに加えて、人乳はいくつかの保護物質（protective agents）を含有している。免疫グロブリンの他に、人乳は、保護特性を有する様々な数多くの複合オリゴ糖類（complex oligosaccharides）を含有している。人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）画分は、主たる炭水化物成分であるラクトースに加えて、１３０を超える種々の複合オリゴ糖類を含んでいる。複合オリゴ糖のこの構造的多様性、およびそれらの高い存在量は、ヒトに特有のものである。対照的に、ウシ乳では、非常に少ない種類の複合オリゴ糖がごく微量見られるだけであり、従って、一般的に用いられる乳児用調合乳にはこれらのオリゴ糖が欠落している。
【０００３】
臨床データから、母乳で育てられた乳児は、調合乳で育てられた乳児に比べて下痢症、呼吸器疾患、および中耳炎の発病率が低いことが示された。このような人乳の保護効果は分泌免疫グロブリンの存在に帰するものであると長い間考えられてきたが、現在では、母乳で育てられた乳児における病原体に対する主たる防御線はＨＭＯであり得ることが認識されてきた。
【０００４】
複合ＨＭＯの多くは、ルイスＸ（ＬｅＸ）組織‐血液型抗原Ｇａｌ（β１‐４）［Ｆｕｃ‐（α１‐３）］ＧｌｃＮＡｃ（β１）などの細胞表面複合糖質との相同性を示し（Newburg, 2001）、これらは、多くの場合、病原体受容体として作用する。従って、細胞表面複合糖質構造を模倣して可溶性デコイを排出することにより、自然はこのように感染を予防する効率的なメカニズムを発展させた。例えば、ＨＭＯは、病原性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）（Cravioto et al., 1991）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Coppa et al., 2006)、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Andersson et al., 1986）、またはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（Ruiz-Palacios et al., 2003）の毒性を激減させることができることが示され、また、大腸菌の熱安定性エンテロトキシン（Crane et al., 1994）などのトキシンを中和することができることも示された。上記の腸管における局所的効果に加えて、ＨＭＯは、体循環に進入することにより乳児における全身作用を誘発することもできる（Gnoth et al., 2001）。
【０００５】
ＨＭＯは、例えばセレクチン‐白血球結合などのタンパク質‐炭水化物相互作用に影響を与えることにより、免疫反応の調節および炎症反応の低減を行うことができる（Bode, 2006、Kunz & Rudloff, 2006）。
【０００６】
複合オリゴ糖は、人乳の成分の中で、ラクトースと脂肪に次いで３番目に多い成分である。これらのほぼ全ては、還元末端にラクトースを共通して有しており、非還元末端はフコースおよび／またはシアル酸で修飾されている。複合オリゴ糖は、３個〜３２個の単糖から構築されており、ほとんどは１個〜１５個のフコースユニットとしてフコースを含有している。従って、フコシル化オリゴ糖は、抗感染性およびプレバイオティック特性を有する生物活性食物成分として大きな可能性を示すものである。
【０００７】
供与体であるグアノシン‐二リン酸活性化Ｌ‐フコース（ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース）からいくつかの受容体分子へのフコース残基の転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）が、動物、植物、真菌、および細菌中で発現される（Ma et al., 2006）。これらは、フコース付加の部位に応じて分類されており、従って、α１，２、α１，３／４、およびα１，６ ＦｕｃＴが識別されている。ＨＭＯおよび血液型抗原の生合成を元来から担うヒトＦｕｃＴの他に、いくつかの細菌ＦｕｃＴが報告されている。ＦｕｃＴ活性は、そのリポ多糖（ＬＰＳ）をフコース含有ルイス抗原で修飾するヒト胃病原体であるピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関するものが最もよく記録されている（Wang et al., 2000）。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染におけるこれらのルイス抗原構造物の正確な役割は不明であるが、ホストの免疫系を回避するための分子擬態、接着、およびコロニー形成について検討されている（Bergman et al., 2006）。
【０００８】
ＨＭＯは、健康増進栄養補助食品として多大な可能性を有することから、費用対効果の高い、大スケールでの生産への関心が高まっている。細菌発酵プロセスを介する生物触媒による生産は、人乳からのＨＭＯの抽出、ならびに労力がかかり複数の保護および脱保護工程を必要とする化学合成よりも非常に有利である（Kretzschmar & Stahl, 1998）。ここ１０年の間に、遺伝子組換え大腸菌による発酵、またはインビトロでの酵素転換を用いてＨＭＯを合成する試みがいくつか報告されている（Albermann et al., 2001、Dumon et al., 2006、Dumon et al., 2001、Dumon et al., 2004、Koizumi et al., 2000）。しかし、フコシル化オリゴ糖の生産のボトルネックは、供与体であるヌクレオチド糖ＧＤＰ‐フコースの入手のし難さである。この高エネルギー分子は、現在のところ、化学合成または酵素合成を介しては効率的にも高費用対効果的にも得ることができない。フコシル化化合物の生産システムを報告している刊行物の多くは、大腸菌の内在性ＧＤＰ‐フコースプールに依存しているが、これは、極めて限られており、フコース含有菌体エキソ多糖類コラン酸の誘導合成に用いられるのみである（Grant et al., 1970）。
【０００９】
例えば、Albermann et al. (2001)は、酵素合成に遺伝子組換え酵素を用いている。ＧＤＰ‐β‐Ｌ‐フコースの合成は、ＧＤＰ‐Ｄ‐マンノースをＧＤＰ‐４‐ケト‐６‐デオキシ‐Ｄ‐マンノースへ転換することで行う。これをＧＤＰ‐４‐ケト‐６‐デオキシ‐Ｄ‐マンノース３，５エピメラーゼ‐４‐レダクターゼで処理することによりＧＤＰ‐β‐Ｌ‐フコースを合成し、これを分取用ＨＰＬＣで精製する。
【００１０】
Koizumiおよび共同研究者らによるＮ‐アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）からＬｅＸを合成する別の手法は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）による補充されたＧＭＰからのＧＴＰの産生、ＧＤＰ‐マンノースを介するＧＤＰ‐フコースの合成、および別の大腸菌株内でのピロリ菌α１，３‐ＦｕｃＴの過剰発現によるＬａｃＮＡｃのフコシル化の組み合わせを含むものであった（Koizumi et al., 2000）。この細菌カップリング（bacterial coupling）の手法では、透過処理、及びそれによる細胞の殺傷を用いる必要があったため、ここで選択された手法では、連続的な大スケールでの発酵プロセスは可能ではなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
先行技術の欠点の少なくともいくつかを克服するフコシル化化合物を生産するための方法が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの態様は、フコシル化化合物を産生する能力を有する遺伝子組換え細胞を作製するための方法であって、該方法は、
フコースキナーゼを発現するように細胞を形質転換する工程、
フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼを発現するように上記細胞を形質転換する工程、
フコシルトランスフェラーゼを発現するように上記細胞を形質転換する工程、
を含む。
【００１３】
本発明の方法によると、遺伝子組換え細胞が作製される。該細胞は、フコースキナーゼ、フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼを発現するように形質転換されたものである。
【００１４】
遺伝子を細胞へ導入する方法は当業者に公知である。
【００１５】
好ましい一態様では、遺伝子組換え細胞は、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）から成る群より選択される微生物である。
【００１６】
本発明の好ましい一態様では、フコースキナーゼおよびフコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼの活性が、二機能性酵素中にて組み合わされる。フコースキナーゼ、フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、および／または二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする形質転換に適する遺伝子は、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、レンチスファエラ属（Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ソリバクター属（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、オリザ属（Ｏｒｙｚａ）、フィスコミトレラ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、ビチス属（Ｖｉｔｉｓ）、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）、ウシ属（Ｂｏｓ）、ウマ属（Ｅｑｕｕｓ）、マカク属（Ｍａｃａｃａ）、チンパンジー属（Ｐａｎ）、ヒト属（Ｈｏｍｏ）、ラッタス属（Ｒａｔｔｕｓ）、ハツカネズミ属（Ｍｕｓ）、およびクセノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）から得ることができる。
【００１７】
好適なフコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヘリコバクター属、エスケリキア属、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バクテロイデス属、ディクチオステリウム属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）、アラビドプシス属、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒト属、ウシ属、ハツカネズミ属、ラッタス属、ヤケイ属（Ｇａｌｌｕｓ）、イヌ属（Ｃａｎｉｓ）、およびイノシシ属（Ｓｕｓ）からなる群より選択される生物から得ることができる。
【００１８】
発現に用いられる遺伝子源および細胞源によっては、コドン最適化が発現の増加に有用であり得る。
【００１９】
細胞の中には、フコースに対する異化経路を有するものもある。この場合、この異化経路を不活性化することが推奨される。好適な方法には、フコース‐１‐リン酸アルドラーゼ遺伝子、フコースイソメラーゼ遺伝子、およびフクロースキナーゼ遺伝子から成る群より選択される１又は複数の遺伝子を不活性化することが含まれる。
【００２０】
本発明の遺伝子組換え細胞によって作製可能である好適なフコース由来化合物は、フコシルラクトース類であり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオース（Ｌａｃｔｏｄｉｆｕｃｏｔｅｔｒａｏｓｅ）である。
【００２１】
本発明は、Albermann et al. (2001)に記載のＧＤＰ‐Ｄ‐マンノースを出発物質とする遺伝子組換え酵素を用いた調製的合成ではなく、フコースを出発物質とする細胞内での合成である。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法で得ることができる遺伝子組換え細胞である。フコシル化化合物を生産するために、本発明の遺伝子組換え細胞が、フコースおよび受容体基質を含む培地中にて適切な培養条件下で培養される。
【００２３】
好適な受容体基質としては、例えば、単糖、二糖、もしくはオリゴ糖、またはペプチドが挙げられ、例えば、ラクトース、２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトースが挙げられる。
【００２４】
この生産方法によって得られる好ましいフコシル化化合物は、フコシルラクトース類であり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオースである。
【００２５】
本願は、外部から供給されたＬ‐フコースからの大腸菌内における効率的なＧＤＰ‐フコース合成、従って大腸菌内におけるフコース「サルベージ経路（salvage pathway）」の確立を始めて報告するものである。しかし、この手法は、食品または医薬品業界で関心の高い、培養が容易であるその他の生物（例えば、ラクトバチルス属生物（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））に移転することもできる。この新たに発見された経路を用いることにより、高コストかつ労力のかかるＧＤＰ‐フコース提供（インビトロ）、または内在性の高度に制御されたＧＤＰ‐フコース生合成経路（インビボ）に依存する必要なしに、２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースに加えてオリゴ糖類の生産についてまったく新しい展望が得られる。
【００２６】
いわゆる「フコースサルベージ経路」では、フコースはまず、酵素であるフコースキナーゼによってリン酸化されてフコース‐１‐リン酸となる。次に、このフコース‐１‐リン酸は、酵素であるフコース‐１‐Ｐ‐グアニリルトランスフェラーゼの作用によってＧＤＰ‐フコースへと変換される。最近、フコースキナーゼおよびＬ‐フコース‐１‐Ｐ‐グアニリルトランスフェラーゼの両活性を有する初めての細菌酵素Ｆｋｐが報告された（Coyne et al., 2005）。腸内細菌であるバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）は、この酵素をＧＤＰ‐フコースの産生に用いており、これは、カプセル多糖および糖タンパク質をフコース残基で修飾するように作用する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】主要な複合人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースの構造を示す図である。
【図２】共役酵素反応によるＦｋｐ活性の測定、およびＮＡＤＨ酸化の測定のための光度分析のスキームを示す図である；Ｆｋｐ＝二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸‐グアニリルトランスフェラーゼ、ＰＫ＝ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨ＝Ｌ‐乳酸デヒドロゲナーゼ、ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸。
【図３】共役酵素反応によるＦｕｃＴ活性の測定、およびＮＡＤＨ酸化の測定のための光度分析のスキームを示す図である；ＦｕｃＴ＝フコシルトランスフェラーゼ、ＰＫ＝ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨ＝Ｌ‐乳酸デヒドロゲナーゼ、ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸。
【図４】誘導後のタンパク質形成を示す図である。 レーン１〜４：大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ（レーン１）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏ（レーン２）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＥＴｆｕｔＡｃｏ（レーン３）、および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＣＡＷ５５（レーン４）からの粗抽出物中における、可溶性Ｆｋｐ（１０５．７ｋＤａ）および／またはＦｕｔＡｃｏ（４９．３ｋＤａ）またはＦｕｃＴ２（３５．９ｋＤａ）の発現； レーン５：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）着色タンパク質ラダー（フェルメンタス（Fermentas），ドイツ）； レーン６〜９：大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ（レーン６）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏ（レーン７）、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＥＴｆｕｔＡｃｏ（レーン８）、および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ＋ｐＣＡＷ５５（レーン９）からの６Ｍ尿素中に再懸濁させた細胞デブリ中における、不溶性Ｆｋｐおよび／またはＦｕｔＡｃｏまたはＦｕｃＴ２の発現。
【図５】ブタノール：アセトン：酢酸：水（３５：３５：７：２３）で発色させ、ラジオ‐ＴＬＣリーダーを用いて分析した３Ｈ‐フコースのラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオ‐ＴＬＣ）を示す図である。
【図６】大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１からの細胞抽出物のラジオ‐ＴＬＣを示す図であり、フコースおよびフクロースおよびフクロース‐１‐リン酸を示すが、フクロース‐１‐リン酸の分解は、フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼ遺伝子（ｆｕｃＡ）のゲノムノックアウトにより阻害されている。
【図７】大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰからの細胞抽出物のラジオ‐ＴＬＣを示す図であり、バクテロイデス・フラジリスからの二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐによって産生されたＧＤＰ‐フコース、ならびにフコース、および分解産物フクロースおよびフクロース‐１‐リン酸の蓄積を示す。
【図８】大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞抽出物のラジオ‐ＴＬＣを示す図であり、二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（Ｆｋｐ）によって提供されたＧＤＰ‐フコースを介して、コドンが最適化されたヘリコバクター・ピロリのフコシルトランスフェラーゼによって産生された３‐フコシルラクトースの蓄積を示す。フコースならびに分解産物フクロースおよびフクロース‐１‐リン酸は僅かに存在するだけであり、ＧＤＰ‐フコースの量は、３‐フコシルラクトースの産生によって大きく減少している。
【図９】ネガティブコントロールである大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１からの細胞溶解物のＨＰＡＥＤ分析を示す図であり、細胞内Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースのピークが見られるが、フコシルラクトースは見られない。
【図１０】３‐フコシルラクトースを産生する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏの細胞溶解物を示す図であり（保持時間は約１１分）、Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースのピークが見られる。
【図１１】大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＣＡＷ５５からの細胞溶解物のＨＰＡＥＤ分析を示す図であり、２’‐フコシルラクトースの産生を示した（保持時間は約２２分）。さらに、Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースが見られる。
【図１２】図１２ａおよび図１２ｂは、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ（図１２ａ）および大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ（図１２ｂ）内でのＧＤＰ‐フコース発現の電気化学的検出によるＨＰＬＣ分析を示す。
【実施例】
【００２８】
本発明を、以下の限定されない実施例によりさらに説明する：
【００２９】
実施例１
発現プラスミドの構築および産生株の開発
外部から供給したフコースの分解を良好に防止するためには、鍵となる異化酵素フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼをコードするｆｕｃＡ遺伝子を大腸菌株ＢＷ２５１１３のゲノムから欠失させる必要があった。ｆｕｃＡ欠失の構築には、（Datsenko & Wanner, 2000）の方法を適用した。Ｔ７プロモーターを用いた異種遺伝子発現については、λＤＥ３溶原化キット（ノバジェン（Novagen））を用いて、誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを欠失大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡに組み込んだ。ここで、得られた株を大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）と称した。プラスミドｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰおよびｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏは、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１およびｐＥＴＤｕｅｔ‐１発現ベクター（ノバジェン）を用いて構築した。構築に用いたすべてのプライマーを表２に挙げる。遺伝子ｆｋｐ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＹ８４９８０６）は、バクテロイデス・フラジリスのゲノムＤＮＡ ＡＴＣＣ２５２８５Ｄを用い、プライマーｆｋｐ‐ＮｃｏＩ‐フォワードおよびｆｋｐ‐ＮｏｔＩ‐リバースによるＰＣＲで増幅した。大腸菌Ｋ１２のｆｕｃＰ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＣＰ０００９４８）は、プライマーＦｕｃＰ‐ＮｄｅＩ‐フォワードおよびＦｕｃＰ‐ＸｈｏＩ‐リバースを用い、大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Invitrogen），米国）のゲノムＤＮＡから増幅した。ｆｋｐおよびｆｕｃＰの両方を、それぞれ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１の第一および第二のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）へ、示した制限部位を用いて挿入した。得られたプラスミドはｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰと称した。Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ株２６６９５のｆｕｔＡ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＥ０００５１１）に、大腸菌内での発現のためのコドン最適化を施し、ジェンスクリプトコーポレーション（GenScript Corporation）（ピスカタウェイ，ニュージャージー州，米国）による合成により調製した。この遺伝子を、プライマーＦｕｔＡｃｏ‐ＮｃｏＩ‐フォワードおよびＦｕｔＡｃｏ‐ＢａｍＨＩ‐リバースを用いて増幅し、ｐＥＴＤｕｅｔ‐１の第一のＭＣＳへ挿入してｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏを得た。クローン遺伝子が正しく挿入されていることを、Ｄｕｅｔベクターマニュアル（ノバジェン）に記載の推奨プライマーｐＡＣＹＣＤｕｅｔＵＰ１、ｐＥＴ‐Ｕｐｓｔｒｅａｍ、ＤｕｅｔＤＯＷＮ‐１、ＤｕｅｔＵＰ２、およびＴ７‐Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用い、制限分析およびシークエンシングによって確認した。ヘリコバクター・ピロリ ＮＣＴＣ３６４からのα１，２‐フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＴ２を含有するプラスミドｐＣＡＷ５５は、C. Albermann（シュトゥットガルト大学、微生物学研究所（Institute for Microbiology, University of Stuttgart））の寄贈によるものであり、ベクターｐＪＯＥ２７０２に基づいている（Stumpp et al., 2000）。遺伝子ｆｕｃＴ２は、制限部位ＮｄｅＩ／ＰｓｔＩを介して挿入され、Ｌ‐ラムノース誘導性プロモーターｒｈａＰＢＡＤの支配下にある。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）は、電気穿孔法により発現ベクターを持ち手形質転換を行った（Dower et al., 1988）。本研究で用いたすべての細菌株を表１に挙げる。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
実施例２
培養条件および細胞抽出物の調製
大腸菌株を、１００μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび／または５０μｇｍＬ−１のカナマイシンを含有する２ｘＹＴブロス（Sambrook & Russell, 2001）１０ｍＬ中に播種し、ロータリーシェーカー中で３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、適切な抗生物質を添加した新しい２ｘＹＴブロス３０ｍＬに、一晩培養物から１／１００にて播種し、十分に通気しながらロータリーシェーカー中で３７℃にてインキュベートした。培養物の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）が約０．５に達した時点で、誘導因子イソプロピル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および／またはＬ‐ラムノースを、それぞれ０．１ｍＭおよび０．１％の濃度で添加した。この培養物を、一定の振とう下にて２８℃でさらに一晩（約１５時間）インキュベートした。光度活性分析のために、細胞培養物のアリコートを取り出し、細胞をペレット化し、重量／体積で５倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。細胞ペレットの重量の４倍のガラスビーズを添加し、得られた懸濁液に５分間ずつ２回のボルテックス攪拌を施すと同時に、その間にさらに５分間氷上に静置した。細胞デブリを遠心分離（１３，２００ｒｐｍ、５分間、４℃）により除去し、得られた粗抽出物を４℃で保存した。
【００３３】
フコシルラクトースのインビボでの産生のために、細胞を１培養体積分のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）（Sambrook & Russell, 2001）で洗浄し、３０ｍＬの改変Ｍ９ミネラル培地中に再懸濁したが、これは、標準Ｍ９処方（Sambrook & Russell, 2001）に以下の物質：２０ｍＭ Ｌ‐フコース、２０ｍＭ ラクトース、０．５％ グリセロール、０．５ｍＭ グアノシン、および１× ＧＩＢＣＯ ＭＥＭビタミン溶液（１００×）（インビトロジェン，米国）、を添加したものである。どの菌株が培養されているかに関わらず、すべての培養物へ誘導因子Ｌ‐ラムノース（０．１％）およびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）の添加も行い、培養条件のばらつきを回避した。ここでも、培養物を一定の振とう下にて２８℃で一晩（約１５時間）インキュベートした。この培養物を遠心分離し、上清をデカントして−２０℃で保存した。続いて細胞をＰＢＳで洗浄し、蒸留水中に再懸濁し、オートクレーブによって透過処理した（１００℃、５分間）。細胞デブリを除去するために、サンプルを遠心分離し（８，５００ｒｐｍ、３０分間）、透明な細胞溶解物を−２０℃で保存した。
【００３４】
実施例３
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
異種タンパク質の発現を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（Sambrook & Russell, 2001）により確認した。タンパク質抽出物を１× ＳＤＳゲルローディングバッファー中に調製し、ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００３５】
実施例４
酵素光度計分析
【００３６】
実施例４ａ
Ｆｋｐ活性を測定するために、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の脱リン酸化の際にピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によって基質として用いられる、ＡＴＰから生じるＡＤＰの量により酵素のフコースキナーゼ活性を測定し、一方、得られたピルビン酸は次に、ＮＡＤＨを消費しながらＬ‐乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によりＬ‐乳酸へ変換された。対応する反応を図２にまとめる。各１，０００μＬの反応を、１０ｍＭのＬ‐フコース、１５ｍＭのＰＥＰ、５ｍＭのＭｇＳＯ４、各々０．２ｍＭのＡＴＰおよびＮＡＤＨ、ならびに各々５ＵのＰＫおよびＬＤＨを含有する６５ｍＭのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．５）中で実施した。２５μＬの粗抽出物の添加後、ＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化を、Ｖ‐６３０ Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ジャスコ社（JASCO GmbH），ドイツ）を用い、３４０ｎｍの吸光度の減少によってモニタリングした。
【００３７】
実施例４ｂ
同様に、ＦｕｃＴ活性を（図３に示すように）、ＰＥＰからピルビン酸への変換の下にてＰＫによってＧＴＰへとリン酸化されたＧＤＰ（供与体ＧＤＰ‐Ｌ‐フコースから）の発生によって測定した。ＬＤＨが、ＮＡＤＨの消費を伴うピルビン酸をＬ‐乳酸へ還元する最終反応を触媒した。細胞抽出物（２５μＬ）の試験は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）中に１０ｍＭ ラクトース、１００μＭ ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、各々０．２ｍＭのＡＴＰおよびＮＡＤＨ、ならびに各々５ＵのＰＫおよびＬＤＨを含有する反応液１，０００μＬ中にて行った。ＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍでモニタリングした。
【００３８】
実施例５
オリゴ糖の検出
ＨＰＬＣシステム（シマズ（Shimadzu），ドイツ）に接続したアンテックレイデン（Antec Leyden）（オランダ）製のＤｅｃａｄｅ ＩＩパルス式電気化学検出器（pulsed amperometric detector）、およびＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラム（ダイオネクス（Dionex），ドイツ）を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＤ）でサンプルを分析した。検出器の感度は、印加パルス電位０．０５‐Ｖにて５０μＡに設定した。単糖、二糖、およびオリゴ糖を、１０ｍＭ 水酸化ナトリウムを用いて流速０．４ｍＬ分−１で溶出した。１０ｍＭ ＮａＯＨによる３０分間の定組成溶出後、カラムを２００ｍＭ ＮａＯＨで２０分間洗浄して保持時間を一定とし、その後１０ｍＭ ＮａＯＨで２０分間の再生を行った。
【００３９】
実施例６
３Ｈ‐フコース供給実験
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）細胞を、ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１、ｐＥＴＤｕｅｔ‐１、ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ、およびｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏで形質転換し、以下の菌株を作出した：
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏ
【００４０】
大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１を、供給実験における空ベクターコントロールとした。次に、この３種類の菌株すべてを用いて、トリチウム標識フコース供給実験を行った。供給実験のために、２０μｌのＬ‐５，６‐３Ｈ‐フコース（４０〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌおよび１ｍＣｉ／ｍＬ）、５０ｍＭのラクトース、および１ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ｘＹＴ培地３ｍＬ中で細胞を培養した。用いた発現ベクターに応じて、２ｘＹＴ培地には、１００μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび／または５０μｇｍＬ−１のカナマイシンを添加した。３ｍＬの大腸菌培養物を室温にて一晩インキュベートした。次に、遠心分離により細胞を回収し、培地から分離して、得られた細胞ペレットを、２００μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、５分間煮沸した。氷上にて１０分間冷却した後、１３，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間施して細胞デブリを回収した。このようにして得られた大腸菌細胞上清から、それぞれ２０μＬの培養物をシリカゲルＴＬＣプレート（シリカゲル６０）に付与した。ＴＬＣプレートの発色には、ブタノール：アセトン：酢酸：水（３５：３５：７：２３）から成る溶媒混合物を用いた。次に、ラジオ‐ＴＬＣ分析をラジオ‐ＴＬＣリーダー（レイテスト（Raytest））を用いて実施した。非放射性参照物質のＲｆ値の測定のために、ＴＬＣプレートにアニスアルデヒド溶液（５ｍＬ 濃Ｈ２ＳＯ４、１００ｍＬ エタノール、１．５ｍＬ 酢酸、２ｍＬ アニスアルデヒド）を噴霧し、加熱した。
【００４１】
実施例７
大腸菌における効率的なＬ‐フコースサルベージ経路の確立
フコシルトランスフェラーゼの受容体基質としてラクトースが用いられたことから、β‐ガラクトシダーゼ欠損（ｌａｃＺ−）大腸菌株ＢＷ２５１１３を選択して、急速なラクトース分解の問題を回避した（Datsenko & Wanner, 2000）。Ｌ‐フコースもまた、野生型大腸菌により、フクロースへの異性化、フクロース‐１‐リン酸へのリン酸化、並びに、それに続くフクロース‐１‐リン酸のグリセリン‐３‐リン酸及びＬ‐ラクトアルデヒドへの逆アルドール開裂を介して効果的に分解され得る。供給されたフコースの分解を阻止するために、フコース分解経路の鍵となる異化酵素フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼ（ＦｕｃＡ）をコードする遺伝子ｆｕｃＡを、大腸菌株ＢＷ２５１１３のゲノムから欠失させた。得られた大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡは、フコースならびにラクトースを唯一の炭素源とするＭ９最小培地（minimal plates）上で成長することができなかった。遺伝子組換えファージλＤＥ３による溶原化により、Ｔ７プロモーターによって作動される発現ベクターの使用に適合する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）を得た。フコースからＧＤＰ‐フコースへのヌクレオチド活性化の能力は、自然界では非常に限られており、長い間いくつかの哺乳類（ヒト、ブタ、マウス）で知られるだけであった。フコースのヌクレオチド活性化は、ここで、２つの連続する酵素反応段階によって媒介され、それぞれ、第一は、フコースキナーゼの触媒によるフコースのフコース‐１‐リン酸へのリン酸化、およびこれに続くグアニリルトランスフェラーゼの触媒によるフコース‐１‐リン酸のＧＤＰ‐フコースへの変換である。哺乳類の場合、フコースサルベージ経路は２つの別個の酵素触媒反応を含むが、最近発見された細菌および植物のタンパク質は、両方の酵素活性を有する。大腸菌内におけるヒトフコースキナーゼの異種発現は、ほとんど検出されない活性が得られただけであった（Hinderlich et al., 2002）。生化学的研究から、哺乳類フコキナーゼは、高度に制御された酵素であることが示された（Park et al., 1998）。最近発見されたＢ．ｆｌａｇｉｌｉｓのＦｋｐ酵素がフコースの活性化により適しているかどうかを試験し、かつ大腸菌内でのフコシル化オリゴ糖の合成のために効率的にＧＤＰ‐フコースを提供するために、本発明者らは、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのゲノムＤＮＡからの遺伝子を増幅し、これを異種発現のために細菌発現ベクター中へクローニングした。
【００４２】
２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースの合成のために、以下のフコシルトランスフェラーゼを共発現のために選択した：α１，３‐フコシルトランスフェラーゼをコードするＨ．ｐｙｌｏｒｉ ２６６９５のｆｕｔＡ遺伝子（Appelmelk et al., 1999）、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＮＣＴＣ３６４のα１，２’‐フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｆｕｃＴ２（Albermann et al., 2001）。クローニングプロセスを始める前に、ｆｕｔＡのコドン使用頻度を大腸菌内での発現のために最適化し、次に、この遺伝子をジェンスクリプトコーポレーション（米国）によって合成した。得られた遺伝子ｆｕｔＡｃｏを発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ‐１中へ挿入し、ＦｋｐおよびＦｕｃＰの共発現の存在下および非存在下にて発現の試験を行った。標準的な誘導条件を用いて、Ｆｋｐ、ＦｕｃＰ、およびＦｕｔＡｃｏ、またはＦｕｃＴ２を共発現させた。ＩＰＴＧおよび／またはＬ‐ラムノースによる誘導の後、タンパク質形成をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで測定し（図４参照）、顕著なＦｋｐタンパク質の可溶性産物が示された一方、膜に局在化するフコースパーミアーゼタンパク質（ＦｕｃＰ）の誘導は、予想通り、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって細胞原形質中では検出することができなかった。しかし、ｆｕｔＡｃｏおよびｆｕｃＴ２の遺伝子産物は、僅かに少量の可溶性画分が検出可能であっただけで、主として封入体中に局在化されていることが示された。
【００４３】
実施例８
酵素活性の光度検出
誘導培養物由来の粗抽出物に、上述の共役酵素分析法において補助酵素（auxiliary enzymes）を用いることで、フコースキナーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性についての試験を施した。明らかに、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）内にてＮＡＤＨオキシダーゼおよび／またはホスファターゼ活性のバックグランドが大きく、これが、再現性のない結果、ならびに種々の菌株におけるフコースキナーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性の測定値が低いことの原因であった。従って、酵素活性は、細胞内産物の形成（ＧＤＰ‐フコースおよびフコシルラクトース）をモニタリングすることで測定することとした。
【００４４】
実施例９
遺伝子組換え大腸菌によるＧＤＰ‐フコースおよび３‐フコシルラクトース産生のための外部から供給された３Ｈ‐Ｌ‐フコースの利用についての試験
本実験は、バクテロイデス・フラジリスからのフコースサルベージ経路二機能性酵素Ｆｋｐによる、フコースおよびラクトースからＧＤＰ‐フコース産生を介する３‐フコシルラクトース産生の確認を目的としたものである。ネガティブコントロール大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１、さらには、Ｆｋｐおよびフコースパーミアーゼを発現する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ、ならびにＦｋｐ、フコース‐パーミアーゼ、およびα１，３‐フコシルトランスフェラーゼを発現する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏを、上述のようにして処理した。これらの菌株から得られた細胞抽出物をＴＬＣプレートに適用し、上述のようにして発色させ、ラジオ‐ＴＬＣリーダーで分析した。加えて、３Ｈ‐標識Ｌ‐フコース標準をＴＬＣプレートに適用し、発色させた（図５参照）。Ｌ‐フコースおよびＬ‐フクロース‐１‐リン酸、ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース、ならびに３‐フコシルラクトースに対する非放射性標準を、ＴＬＣおよびそれに続くアニスアルデヒド溶液による染色によって同様に分析した（データ示さず）。
【００４５】
ネガティブコントロール実験の結果（図６参照）からは、フコース代謝からの第一および第二の異化段階の産物、すなわちＬ‐フクロース（フコースイソメラーゼによってフコースから産生）およびＬ‐フクロース‐１‐リン酸（フクロースキナーゼによってフクロースから産生）が示された。フコースのさらなる分解は、フクロース‐１‐リン酸のＬ‐ラクトアルデヒド及びジヒドロキシアセトンリン酸への逆アルドール開裂反応を触媒する酵素フクロース‐１‐リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＡのノックアウトにより、実質的に阻害される。
【００４６】
バクテロイデス・フラジリスからの二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐを共発現する大腸菌細胞は、ＧＤＰ‐フコースの産生を示し（図７参照）、ＧＤＰ‐フコースは明らかに細胞内に蓄積しており、また、他の代謝経路への転換がある場合はその産物がラジオ‐ＴＬＣ上に現れるはずであるため、他の代謝経路への転換はごく僅かであり得る。
【００４７】
大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞抽出物は、３‐フコシルラクトースおよびごく少量のＧＤＰ‐フコースの産生を示している（図８参照）。この結果は、この実験の最初の目的、すなわち、バクテロイデス・フラジリスからの二機能性サルベージ経路酵素Ｆｋｐによる、ＧＤＰ‐フコースの供給を介した３‐フコシルラクトースの産生を示すことと一致している。また、フコシルラクトース産生におけるＧＤＰ‐フコースの消費、ならびに、それに由来する、フクロース‐１‐リン酸およびフクロースから、ＧＤＰ‐フコース産生によって反応から常に引き抜かれるフコースへの反応平衡の移動に起因して、フコース分解産物であるフクロースおよびフクロース‐１‐リン酸の量も大きく減少している。
【００４８】
実施例１０
遺伝子組換え大腸菌による２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトース産生の試験
ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ、およびｆｕｔＡｃｏまたはｆｕｃＴ２遺伝子のいずれかを別個の発現ベクター中に有する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）、ならびに空ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１およびｐＥＴＤｕｅｔ‐１を有する大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）（ネガティブコントロール）を、２ｘＹＴブロス中で成長させ、ＩＰＴＧおよび／またはＬ‐ラムノースを用いて、２８℃にて１５時間、タンパク質発現を誘導した。続いて細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｌ‐フコース、ラクトースおよびグアノシン、ＩＰＴＧ、およびＬ‐ラムノースを添加した改変Ｍ９培地中に再懸濁させた。発酵フェーズの後（２８℃、１５時間）、細胞を採取し、上清を回収し、上述のようにして細胞溶解物を調製した。
【００４９】
ＨＰＡＥＤによる分析から、用いたＨＰＬＣカラム上での保持時間は、Ｌ‐フコース標準に対しては約３分、ラクトース標準に対しては約１７分、３‐フコシルラクトース標準に対しては約１１分、および用いた２’‐フコシルラクトース標準に対しては約２２分であることが示された（データ示さず）。培地の一部分であり炭素源であるグリセロールは、記録された保持時間が約１．５分であり、誘導因子Ｌ‐ラムノースの保持時間は５．５分であった。いずれの物質も、細胞溶解物の分析において細胞内で検出されている。
【００５０】
大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１ ｐＥＴＤｕｅｔ‐１のネガティブコントロール株からの細胞溶解物は、細胞内Ｌ‐フコースおよびラクトースを示したが、予想通り、フコシルラクトースは示さなかった（図９参照）。上述の分子に加えて、培地に供給された炭素源であるグリセロールおよび転写誘導因子Ｌ‐ラムノースも、この分析で検出される。
【００５１】
コドン最適化を施されたヘリコバクター・ピロリのα１，３‐フコシルトランスフェラーゼ遺伝子と合わせて、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのｆｋｐ遺伝子および大腸菌のフコースパーミアーゼ遺伝子を共発現する大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞溶解物のＨＰＡＥＤ分析は、３‐フコシルラクトースの細胞内産生を示した（約１１分の時点のピーク、図１０参照）。Ｌ‐フコースおよびラクトースもまた、グリセロールおよびＬ‐ラムノースと共に細胞溶解物の成分である。
【００５２】
大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＣＡＷ５５からの細胞溶解物は、α１，２‐フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ２の共発現に起因して、２’‐フコシルラクトースの細胞内産生を示した（図１１参照）。さらに、ネガティブコントロール、および３‐フコシルラクトース産生大腸菌株ＢＷ２５１１３ ΔｆｕｃＡ（ＤＥ３）ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ ｐＥＴ‐ｆｕｔＡｃｏからの細胞溶解物とまったく同様に、Ｌ‐フコース、ラクトース、グリセロール、およびＬ‐ラムノースが細胞溶解物中に見られる。
【００５３】
これらの結果は、明らかに、遺伝子組換え大腸菌細胞内において、外部から供給されたＬ‐フコースおよびラクトースから３‐フコシルラクトースおよび２’‐フコシルラクトースが産生されたことを示している。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのＦｋｐタンパク質の異種発現により、フコースリン酸化およびフコース‐１‐リン酸グアニリル転移の２段階反応が触媒されることで、効率的にＧＤＰ‐フコースを産生することができた。元はヘリコバクター・ピロリ由来であるコドン最適化α１，３‐フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＡｃｏ、またはヘリコバクター・ピロリ由来のα１，２‐フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ２は、このように供給されたＧＤＰ‐フコースを、それぞれ、２’‐フコシルラクトースおよび３‐フコシルラクトースへと変換することができる。
【００５４】
実施例１１
大腸菌ＪＭ１０９細胞内でのＧＤＰ‐フコースの発現
Ｆｋｐの発現に起因する細胞内ＧＤＰ‐フコース含有量の上昇が、プラスミドからのＦｋｐを発現する大腸菌株およびＦｋｐのコピーを持たない大腸菌株の平行培養によって示された。この場合、大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｆｕｃＡを、Ｆｋｐを持たないコントロール株として用いた。Ｆｋｐを発現する菌株は、同じ大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｆｕｃＡであるが、こちらはプラスミドｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰを含有し、従ってフコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐ、およびフコースパーミアーゼＦｕｃＰをコードする遺伝子を有していた。遺伝子は、ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ‐１（ノバジェン，英国）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）１および２にてクローン化したが、いずれのＭＣＳもＴ７プロモーター／オペレーターの５’側に隣接することから、両方の遺伝子の発現はいずれもＩＰＴＧの添加によって誘導することができる。
【００５５】
両菌株共に、３０ｍｌの２ＹＴ培地中、３７℃および２２０ｒｐｍにて２つの反復サンプルとして培養し、ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰを持つ菌株の場合は、プラスミド維持のために培地にカナマイシンを添加した。Ｆｋｐ発現の誘導は、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によってＯＤ６６０＝０．５から開始し、２０ｍＭ フコースを両菌株に供給し、続いて３７℃および２２０ｒｍｐにてさらに３時間培養した。細胞を遠心分離でペレット化し、５体積／重量（ｖ／ｗ）の蒸留水中にペレットを再懸濁した。これらの細胞懸濁液を９５℃にて１０分間インキュベートし、細胞を溶解した。遠心分離により細胞デブリを除去し、上清をＨＰＬＣで分析した。
【００５６】
Ｄｅｃａｄｅ ＩＩパルス式電気化学検出器（アンテックレイデン，オランダ）を用いた電気化学的検出によってＨＰＬＣ分析を実施した。ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラム（ダイオネクス，米国）上にて、２０ｍＭ水酸化ナトリウム＋８２５ｍＭ酢酸ナトリウムを溶出液として用いた。ＧＤＰ‐フコースは、１６．０分の保持時間で溶出された。
【００５７】
【表３】
【００５８】
図１２ａは、ＦＫＰタンパク質の発現のない大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ細胞のＧＤＰ‐フコース発現についてのＨＰＬＣ分析を示す。
【００５９】
図１２ｂは、フコースインポーターＦｕｃＰと共にＦｋｐタンパク質を共発現する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３） ΔｆｕｃＡ ｐＣＯＬＡ‐ｆｋｐ‐ｆｕｃＰ細胞の分析である。真正標準で確認されるように、１６．０分の時点でのピークが、ＧＤＰ‐フコースに対応している。
【００６０】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコシル化化合物を産生する能力を有する遺伝子組換え細胞を作製するための方法であって、
フコースキナーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
フコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝子組換え細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属から成る群より選択される微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フコースキナーゼおよび前記フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼが、二機能性酵素として組み合わされている、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｖｉｔｉｓ属、Ｄａｎｉｏ属、Ｂｏｓ属、Ｅｑｕｕｓ属、Ｍａｃａｃａ属、Ｐａｎ属、Ｈｏｍｏ属、Ｒａｔｔｕｓ属、Ｍｕｓ属、およびＸｅｎｏｐｕｓ属から成る群より得られる二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記フコシルトランスフェラーゼが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｈｏｍｏ属、Ｂｏｓ属、Ｍｕｓ属、Ｒａｔｔｕｓ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｃａｎｉｓ属、およびＳｕｓ属から成る群より選択される生物から得られる、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞のフコースに対する異化経路が不活性化される、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フコースに対する前記異化経路の不活性化が、フコース‐１‐リン酸アルドラーゼ遺伝子、フコースイソメラーゼ遺伝子、およびフクロースキナーゼ遺伝子から成る群より選択される１もしくは複数の遺伝子を不活性化することによって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フコシル化化合物が、フコシルラクトースであり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオースである、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法で得られる、遺伝子組換え細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞を、フコースおよび受容体基質を含む培地中にて適切な培養条件下で培養する工程を含む、フコシル化化合物を作製するための方法。
【請求項１１】
前記受容体基質が、単糖、二糖、もしくはオリゴ糖、またはペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記受容体基質が、ラクトース、２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトースである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フコシル化化合物が、フコシルラクトースであり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオースである、請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
フコシル化化合物を産生する能力を有する遺伝子組換え細胞を作製するための方法であって、
フコースキナーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
フコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を形質転換する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝子組換え細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属から成る群より選択される微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フコースキナーゼおよび前記フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼが、二機能性酵素として組み合わされている、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｖｉｔｉｓ属、Ｄａｎｉｏ属、Ｂｏｓ属、Ｅｑｕｕｓ属、Ｍａｃａｃａ属、Ｐａｎ属、Ｈｏｍｏ属、Ｒａｔｔｕｓ属、Ｍｕｓ属、およびＸｅｎｏｐｕｓ属から成る群より得られる二機能性フコースキナーゼ／フコース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記フコシルトランスフェラーゼが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｈｏｍｏ属、Ｂｏｓ属、Ｍｕｓ属、Ｒａｔｔｕｓ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｃａｎｉｓ属、およびＳｕｓ属から成る群より選択される生物から得られる、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞のフコースに対する異化経路が不活性化される、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フコースに対する前記異化経路の不活性化が、フコース‐１‐リン酸アルドラーゼ遺伝子、フコースイソメラーゼ遺伝子、およびフクロースキナーゼ遺伝子から成る群より選択される１もしくは複数の遺伝子を不活性化することによって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フコシル化化合物が、フコシルラクトースであり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオースである、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法で得られる、遺伝子組換え細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞を、フコースおよび受容体基質を含む培地中にて適切な培養条件下で培養する工程を含む、フコシル化化合物を作製するための方法。
【請求項１１】
前記受容体基質が、単糖、二糖、もしくはオリゴ糖、またはペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記受容体基質が、ラクトース、２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトースである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フコシル化化合物が、フコシルラクトースであり、好ましくは２’‐フコシルラクトース、または３‐フコシルラクトース、またはラクトジフコテトラオースである、請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５１２６４３（Ｐ２０１２−５１２６４３Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１４７６（Ｐ２０１１−５４１４７６）
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７５３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７０１０４
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１１１４９７５１）イェネヴァイン ビオテヒノロギー ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７５３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７０１０４
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１１１４９７５１）イェネヴァイン ビオテヒノロギー ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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