フジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法
【課題】北方海域に存在し得る北方系フジツボであるミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボについて、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定する。その個体数を定量的に分析する。
【解決手段】各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識するプライマー対を用いて被験試料をＰＣＲし、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにした。また、各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識するプライマー対を用いて被験試料をリアルタイムＰＣＲすることによりＣｔ値を得て、フジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し上記プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を利用することによって、被験試料に存在するフジツボ幼生種の個体数の定量を行うようにした。
【解決手段】各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識するプライマー対を用いて被験試料をＰＣＲし、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにした。また、各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識するプライマー対を用いて被験試料をリアルタイムＰＣＲすることによりＣｔ値を得て、フジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し上記プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を利用することによって、被験試料に存在するフジツボ幼生種の個体数の定量を行うようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する海水域から採集した被験試料に含まれる北方系フジツボ（ミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボ）幼生の種を判定し、その個体数の定量を行うのに好適なフジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フジツボは、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へ付着することにより生物汚損を引き起こす代表的汚損生物として知られている。例えば、火力・原子力発電所の冷却水路系にフジツボが付着すると、流動抵抗の増大により冷却水の流量が低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボが詰まることにより管壁の腐食が生じる。そこで、各発電所では、付着したフジツボを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制するための様々な防除対策が実施されている。
【０００３】
フジツボの付着を抑制する対策としては、冷却水路系や復水器管等に防汚塗料を塗布したり、あるいは塩素を注入してフジツボ幼生の付着を防ぐ手法がとられている。しかしながら、フジツボの付着時期を正確に予測することはできないことから、結果的には長期間にわたって塩素注入を継続することによりフジツボの付着を抑制しているのが現状であり、環境負荷が非常に大きいという問題がある。したがって、環境負荷を低減し、また、防除対策のコストダウンを図るためにも、フジツボが付着する直前にピンポイントで塩素注入を行うことが好ましい。そこで、フジツボの付着時期を正確に予測する技術の確立が望まれている。
【０００４】
ところで、海洋等の環境中には様々な種のフジツボが存在していることから、フジツボの付着時期を正確に予測するためには、どのような種のフジツボ幼生がどのようなタイミングで発生するのかを十分に調査する必要がある。
【０００５】
フジツボの種を幼生の段階で判定する方法としては、顕微鏡観察による手法が挙げられるが、プランクトンサンプル中に存在する複数種のフジツボ幼生から形態分類学上の差異のみを頼りにフジツボ幼生の種を判定することは極めて困難である。
【０００６】
そこで、付着期のフジツボ幼生の種を判定する技術として、特許文献１のような方法が提案されている。具体的には、海水から採集されたタテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボおよびヨーロッパフジツボを含むフジツボ種の付着期幼生（キプリス幼生）に対して、波長が４００〜４４０ｎｍの励起光を照射し、発光した波長４７５ｎｍ以上の蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに入力し、この情報をコンピュータに予め登録された種に固有の体内蛍光分布パターン認識情報と比較して、これらの蛍光分布パターンがマッチングしたフジツボ類の種を判定するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１２４６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１記載のフジツボ幼生の種判定方法では、成長初期段階にあるノープリウス幼生期のフジツボ種の判定を行うことができない。したがって、フジツボの付着時期の予測が遅れて付着抑制対策を確実に実行できなくなる虞がある。また、蛍光パターンが類似している種が存在する結果、種の判定を高精度に行うことができないという問題も有している。さらに、キプリス幼生が死んでしまうと、励起光を照射してもキプリス幼生からの蛍光発光が生じなくなり、種の判定ができなくなることから、キプリス幼生を生きたまま種の判定に供する必要があるという煩雑さが伴う。
【０００９】
また、フジツボの付着時期を正確に予測するためには、フジツボ幼生の高精度な種判定手法と共に、その個体数を定量的に分析する手法を確立する必要がある。このことは、同一海域に存在し得るフジツボ幼生に対して特に要請される。
【００１０】
そこで、本発明は、北方海域に存在し得る北方系フジツボであるミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボについて、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、北方海域に存在し得る北方系フジツボであるミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボについて、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定すると共に、その個体数を定量的に分析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチにより各種フジツボを分子レベルで種々検討した。その結果、各種フジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報に基づき、ミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボをそれぞれ分子レベルで特異的に認識するプライマー対を開発することに成功し、本願発明に至った。
【００１３】
即ち、本発明のフジツボ種判定用プライマーセットは、下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミネフジツボ（Balanus rostratus）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むチシマフジツボ（Semibalanus cariosus）検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むハナフジツボ（Balanus crenatus）検出用プライマー対
【００１４】
（１）のプライマー対は、ミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、ミネフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ、ハナフジツボ、キタアメリカフジツボ、サンカクフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、ココポーマアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（１）のプライマー対によれば、ミネフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１５】
（２）のプライマー対は、チシマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、チシマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、チシマフジツボと比較的近縁と考えられるミネフジツボ、ハナフジツボ、キタアメリカフジツボ、サンカクフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、ココポーマアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（２）のプライマー対によれば、チシマフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１６】
（３）のプライマー対は、ハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、ハナフジツボと比較的近縁と考えられるミネフジツボ、チシマフジツボ、キタアメリカフジツボ、サンカクフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、ココポーマアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（３）のプライマー対によれば、ハナフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１７】
次に、本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、被験試料に対し、上記（１）〜（３）のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにしている。
【００１８】
例えば、被験試料にミネフジツボ幼生が存在している場合には、上記（１）のプライマー対がミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりミネフジツボ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にミネフジツボ幼生が含まれていない場合には、上記（１）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料に存在しているフジツボ幼生の種がミネフジツボであるか否かを判定することができる。つまり、遺伝子増幅の有無を検出することによって、被験試料に存在しているフジツボ幼生種がＰＣＲに使用したプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種であるか否かがわかるので、これによりフジツボ幼生の種を判定できる。
【００１９】
次に、本発明のフジツボ幼生個体数の定量分析方法は、被験試料に対し、上記（１）〜（３）のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種（ＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種）の個体数の定量を行うようにしている。
【００２０】
例えば、上記（１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、被験試料に存在するミネフジツボ幼生個体数に対応して遺伝子が増幅する。したがって、ミネフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、上記（１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりミネフジツボ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いることで、被験試料の遺伝子増幅量から被験試料に存在するミネフジツボ幼生個体数を定量することができる。つまり、ＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数を定量することができる。
【００２１】
ここで、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとし、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００２２】
また、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、被験試料を分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００２３】
次に、本発明のフジツボ種判定用キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００２４】
例えば、配列番号１または２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーをプローブとして含む場合、このプローブがミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）する。したがって、本発明のフジツボ種判定用キットにより、被験試料に存在するフジツボ幼生の種がミネフジツボであるか否かを判定することができる。つまり、プローブとのハイブリッドの形成の有無によって、被験試料に存在しているフジツボ幼生種がプローブとして使用したプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種であるか否かがわかるので、これによりフジツボ幼生の種を判定できる。
【発明の効果】
【００２５】
請求項１記載のフジツボ種判定用プライマーセットによれば、ミネフジツボ、チシマフジツボまたはハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、このプライマーセットをＰＣＲに供することで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００２６】
請求項２記載のフジツボ幼生種判定方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、ＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種を特異的に検出して、フジツボ幼生の種を判定することができる。
【００２７】
請求項３記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、ＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種のみを特異的に検出して定量することができる。
【００２８】
請求項４記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、リアルタイムＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種のみを特異的に検出して定量することができる。しかも、請求項１に記載のフジツボ種判定用プライマーセットにより増幅されるＤＮＡ断片長は１５０ｂｐ以内に収まることから、リアルタイムＰＣＲを行うためのＤＮＡ断片長として好適な長さとなり、リアルタイムＰＣＲによるＣｔ値の測定を精度良く行うことが可能になる。
【００２９】
請求項５に記載のフジツボ幼生個体数の定量分析方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、例えば、初期ノープリウス幼生期にあるフジツボ幼生と、後期ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期にあるフジツボ幼生とを分画して定量することにより定量精度を高めることが可能となる。
【００３０】
請求項６記載のフジツボ種判別用キットによれば、配列番号１〜６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一つのプライマーをプローブとして含んでいるので、プローブとして含まれるプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ種について、そのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、被験試料に存在するフジツボ幼生種の種判定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いて各種フジツボ成体の鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いて各種フジツボ成体の鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図３】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いて各種フジツボ成体の鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図４】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いてプランクトンサンプルの鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いてプランクトンサンプルの鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図６】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いてプランクトンサンプルの鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図７】反応液のミネフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図８】反応液のチシマフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図９】反応液のハナフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１０】ミネフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示す図である。
【図１１】チシマフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示す図である。
【図１２】ハナフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示す図である。
【図１３】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００３３】
本発明のフジツボ種判定用プライマーセットは、下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
【００３４】
（１）ミネフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号７で示されるミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３６〜１４８番目の１１３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３５】
（２）チシマフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号８で示されるチシマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、９８〜２４７番目の１５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３６】
（３）ハナフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号９で示されるハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、９７〜２４４番目の１４８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３７】
尚、各プライマーの塩基配列は、配列番号１〜６で示される塩基配列に限定されるものではなく、プライマーの一端または両端が延長されたプライマーであって、対応するフジツボ種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は最大でも４０塩基とすることが好ましい。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こり易くなり、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、プライマーの一端または両端を短縮してもよいが、プライマー長は最小でも１８塩基とすることが好ましい。１８塩基未満とすると、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００３８】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００３９】
次に、本発明のフジツボ幼生の種判定方法について説明する。
【００４０】
本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、被験試料に対し、上記のプライマー対のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにしている。
【００４１】
被験試料としては、フジツボ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含有している海水等の環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
被験試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好ましい。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなり、被験試料の長期保存が可能となると共に、ＰＣＲに悪影響を及ぼす虞のある塩分の析出を防ぐことができる。エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存してもよいが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。尚、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００４３】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、滅菌水等で被験試料中のプランクトンを十分に洗浄して塩分を除いた後、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。
【００４４】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にフジツボ幼生の種の判別を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００４５】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記プライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。ＰＣＲを行うことにより、被験試料中にフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。より詳細には、使用したプライマー対に対応するフジツボ種のミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が被験試料中に含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。
【００４６】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることができる。増幅産物が検出された場合には、ＰＣＲに使用したプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ種が被験試料に存在していることになる。したがって、ＰＣＲに使用したプライマーに応じて、被験試料に存在しているフジツボ種を判定することができる。
【００４７】
ここで、本発明のフジツボ幼生種の判定方法は、上記プライマーセットのうちの一組のプライマー対毎にＰＣＲを行って、被験試料に存在するフジツボ幼生の種判定を行うようにしてもよいが、上記プライマーセットのうち複数組のプライマー対を被験試料に投入してＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡの分子量の差異から、被験試料に存在するフジツボ幼生の種判定を行うようにしてもよい。
【００４８】
次に、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法について説明する。本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しこのプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種の個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００４９】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットのうちの一組のプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種（リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種）の個体数の定量を行うようにしている。
【００５０】
即ち、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、フジツボ種毎にフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を作成する。そして、この検量線を利用して、被験試料のＣｔ値から、被験試料に含まれるフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００５１】
このように、フジツボ種毎にフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を予め作成しておくことで、被験試料に対し、上記プライマーセットのうち一組のプライマー対毎にリアルタイムＰＣＲを行うことにより、ミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボの幼生個体数の定量分析を行うことができる。そして、被験試料に上記フジツボ種の幼生が存在していない場合には、フジツボ幼生の個体数が０という結果が得られるので、被験試料に存在しているフジツボ幼生種の判定と個体数の定量とを同時に実施できることになる。
【００５２】
ここで、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、本発明のフジツボ幼生種判定方法を行った後に実施するようにしてもよい。例えば、上記プライマーセットのうちの一組または２組以上のプライマー対を用いて被験試料に存在するフジツボ幼生種を絞り込んだ後に、被験試料に存在するフジツボ幼生種に対応するプライマー対を用いて幼生個体数の定量分析を実施することで、定量分析を無駄なく効率的に実施することができる。また、フジツボ種の判定と定量を同時に行うようにしてもよい。例えば、上記プライマーセットのうちの二組以上のプライマー対を用いて被験試料に存在するフジツボ幼生種を絞り込む際に、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置からフジツボ幼生種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、フジツボ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００５３】
尚、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料中の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などを適宜採用することもできる。
【００５５】
ここで、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号３７で示される塩基配列からなる分子を用いたサイクリングプローブ法により実施するのが特に好ましい。
【００５６】
サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号３７で示される塩基配列からなる分子を用いることで、このプローブが、ミネフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、上記（１）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位中の特定領域を特異的に認識する。したがって、被験試料にミネフジツボが含まれている場合には、サイクリングプローブが、ＰＣＲにより増幅されたミネフジツボのＤＮＡの特定領域とハイブリッドを形成する。尚、チシマフジツボについても上記（２）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位に基づき、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として使用可能な分子の設計が可能である。また、ハナフジツボについても上記（３）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位に基づき、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として使用可能な分子の設計が可能である。尚、インターカレータ法やＴａｑＭａｎプローブ法などによる検出を行っても良い。
【００５７】
サイクリングプローブには、ＲＮＡ部（配列番号３７に示される塩基配列においては、３番目のＡがＲＮＡである）を挟んで５’端に蛍光物質が結合し、３’端にこの蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）が標識されている。サイクリングプローブは、インタクトな状態にある場合には、クエンチャーの作用により強い蛍光を発することは無い。しかし、増幅ＤＮＡの相補的な配列とハイブリッドを形成した後にＲＮＡ切断酵素であるＲＮａｓｅＨを作用させると、サイクリングプローブがＲＮＡ部で切断され、クエンチャーが作用しなくなって強い蛍光を発するようになる。したがって、この蛍光強度を測定することで、仮に被験試料に存在するプランクトン等の遺伝子がＰＣＲによって増幅されてしまうケースが生じたとしても、目的のフジツボ幼生種の遺伝子増幅のみを選択的に検出することが可能となり、目的のフジツボ幼生個体数の定量を確実且つ精度良く行うことができる。尚、蛍光物質及び消光物質については、リアルタイムＰＣＲ装置で検出可能なものを適宜選択することができる。
【００５８】
尚、リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００５９】
本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法に用いる検量線は、フジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、このフジツボ幼生が有する遺伝子を認識するプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生個体数とＣｔ値の関係を調べて予め作成される。
【００６０】
試料の処理方法に関しては、上記と同様、試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、試料中のフジツボ幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好ましい。
【００６１】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知または新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出方法、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳ（フジフイルム社）、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）等を用いることが好適である。特に、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳ（フジフイルム社）を用いた場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、フジツボ幼生の定量をより正確に実施し易くなる。また、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）を用いた場合には、サンプル中の泥や砂の影響を抑えてリアルタイムＰＣＲに適したＤＮＡ抽出サンプルを得ることができ、より好適である。
【００６２】
また、特にキプリス幼生においては、クチクラの殻（甲皮）の堅さがサンプルにより異なる場合があり、これが原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、クチクラの殻の破砕処理を行うことが好適である。例えば、エタノールを除いて乾燥させた試料の入ったエッペンドルフチューブにジルコニアボール（直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個）入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。
【００６３】
ここで、フジツボ幼生は、Ｉ期ノープリウス幼生として孵化後すぐにＩＩ期ノープリウスとなり、その後は、海水中の植物プランクトンを餌として取り込んで成長する。そしてＶＩ期ノープリウス幼生を経て摂餌をしない付着期のキプリス幼生となる。成長に伴い、個体サイズ、細胞数が増加するため、標的となる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することになる。したがって、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の発生段階で異なってくる。
【００６４】
本願発明者の実験によると、フジツボのキプリス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数は初期（Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数の５倍であることが確認されている。この値はキプリス幼生と初期ノープリウス幼生の体積差を反映している。
【００６５】
したがって、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、キプリス幼生のみが含まれている試料を用いれば、キプリス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、初期ノープリウス幼生のみが含まれている試料を用いれば、初期ノープリウス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００６６】
また、幼生個体数が既知の複数の試料は、上記とは別の方法でも得ることができる。即ち、成体試料等から鋳型ＤＮＡを抽出し、これを幼生個体数と同等の遺伝子コピー数となるように段階希釈することによって、幼生個体数が既知の複数の試料を得るようにしてもよい。
【００６７】
被験試料の種類や処理方法に関しては、上記と同様である。但し、ＤＮＡ抽出処理方法に関しては、検量線作成時と同様の方法を採用することが定量値のばらつきを抑える上で好ましい。また、被験試料に対して行うリアルタイムＰＣＲ条件は検量線作成時のリアルタイムＰＣＲ条件と同様とする。
【００６８】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することにより、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。即ち、フジツボ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、篩を通過した体積の小さいフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているフジツボの幼生個体数を初期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているフジツボの初期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。また、篩を通過しなかった体積の大きいフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているフジツボ幼生の個体数をキプリス幼生個体数とＶＩ期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているフジツボのキプリス幼生とＶＩ期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。したがって、どの成長段階にあるフジツボ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。尚、分画方法は篩によるものには限定されず、例えば遠心分離処理を用いてもよい。また、分画処理により、例えば初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生のみを被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれている初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の個体数を高精度に定量することも可能であるし、ＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生を被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれているＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生の個体数を高精度に定量することも可能である。
【００６９】
本発明のフジツボ幼生の定量方法により、実海域でのフジツボの付着時期を予測することが可能になる。即ち、Ｃｔ値から換算される幼生個体数の発生段階による相違は最大でも５倍である。これは、実海域での幼生出現ピーク時の個体数増加に比べれば小さい値であり、付着時期予測には大きな問題点とはならないと考えられる。これまでに実海域でフジツボ幼生の個体数変動と付着時期を詳細に調査した報告、例えば、志津川湾におけるフジツボ幼生および付着板の調査（電力中央研究所報告Ｖ０５０３３）や、柳井・三隅火力発電所前面海域での付着板を用いた調査（中国電力 技研時報１０１、ｐ７５−８３）によると、フジツボの付着盛期は１ヶ月以内に集中し、この期間内に急激に付着個体が増加すると報告されている。また、飼育実験からフジツボの幼生は、孵化後１〜２週間で付着期幼生になり、基盤に付着すると考えられる。したがって、付着期前の比較的短期間に幼生の出現ピークがあり、その際の幼生数の増加率は５倍という値に比較して圧倒的に大きな値、例えば、３日〜１週間毎に被験試料をサンプリングした場合、サンプリング量にもよるが、数十倍〜数百倍、あるいはそれ以上の増加率となることが予想される。よって、本発明の定量方法によりフジツボ幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、実海域でのフジツボの付着時期を確実に予測することが可能になる。
【００７０】
次に、本発明のフジツボ種判定用キットについて説明する。
【００７１】
本発明のフジツボ種判定用キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００７２】
即ち、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうち一つのプライマーのみをプローブとして含むことによって、このプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ種のみを検出するキットとすることができる。また、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうち２つ以上のプライマー（但し、異なるプライマー対由来の２つ以上のプライマー）をプローブとして含むことによって、２種以上のフジツボを検出するキットとすることができる。
【００７３】
本発明のフジツボ種判定用キットの一例として、図１３に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００７４】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１〜６のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーである。例えば、スポット３にはそれぞれ異なるフジツボ種を検出するプライマーをプローブとして固定しておく。
【００７６】
ＤＮＡチップ１を用いて、フジツボ幼生の種判定を行う。被験試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のフジツボ幼生の検出を行うことができる。
【００７７】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００７８】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いてフジツボ幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量をモニタリングすることによって、フジツボ幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、フジツボ幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、フジツボ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中のフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００７９】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とするフジツボ幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、フジツボ幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【００８０】
また、本発明の定量方法は、上記のプライマー対の２組以上を同時に使用してＰＣＲを行うことにより実施するようにしてもよい。例えば、上記（１）と（２）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置からフジツボ幼生の種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、フジツボ幼生の個体数の定量を行うようにしてもよい。
【実施例】
【００８１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００８２】
（実施例１）
各種フジツボ成体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいて各種フジツボに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供したフジツボ種を表１に示す。アカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ココポーマアカフジツボは採集後に室内でアルテミア、珪藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）などを餌として与えて飼育されたものを９９．５％エタノール（和光純薬製）に浸して固定し、実験に使用するまで４℃で保存した。なお、エタノール浸漬前は、数日間餌を与えずアルテミア由来のＤＮＡの影響を排除した。その他のフジツボは採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。尚、オオアカフジツボは伊豆半島にて採集したものを使用した。
【００８３】
【表１】
【００８４】
大型のフジツボ成体であるアカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、クロフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ココポーマアカフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、オニフジツボ、オオアカフジツボ、Cryptolepas rhachianechi、ミミエボシ、スジエボシは、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、キアゲン社のDNeasy Blood Tissue Kitを使用して総ＤＮＡの抽出を行った。ＤＮＡ抽出はDNeasy Blood Tissue Kitに付属のマニュアルに準じて行った。得られたＤＮＡは、１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡバッファー（ＴＥバッファー、ｐＨ８．０）に溶解した。
抽出用組織が小さい場合は適宜溶解バッファー量を減らした。また小型のフジツボであるイワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、ハナフジツボ、Semibalanus balanoides、Elminius modestus、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、また、上記大型のフジツボ成体に属するタテジマフジツボの中でも小型の個体に関しては、１個体の軟体部全体をそのまま同様の方法で抽出に供した。
【００８５】
ＴＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、ほとんどのサンプルで５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認されたが、イワフジツボなど非常に小型のフジツボにおいては１個体から得られるＤＮＡ量が少なかった。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＴＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００８６】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、フジツボミトコンドリアの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーとして文献１〜４で報告されているものを用いた。
（文献１: R.A.Begum,T.Yamaguchi and S.Watabe(2004).Molecular phylogeny of thoracican barnacles based on the mitochondrial 12S and 16S rRNA genes.Sessile organisms,21,47-54.
文献２: T.D.Kocher, W.K.Thomas, A.Meyer, S.V.Edwards, S.Paabo, F.X.Villablansca and A.C.Wilson(1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6196-6200.
文献３: O.Mokady, S.Rozenblatt, D.Graur and Y.Loya(1994). Coral-host specificity of red sea Lithophaga bivalves: interspecific and intraspecific variation in 12S mitochondrial ribosomal RNA.Mol.Mar.Biol.Biotech.,3,158-164.
文献４: S.R.Palumbi(1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Molecular Systematics,ed. D.M.Hillis, C.Mortiz and B.K.Mable, Sinauer Associates, Sunderland, pp.205-248.）
【００８７】
表２と配列番号７及び８に使用したプライマーの配列を示す。なお、これらのプライマーは、合成（シグマジェノシス）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑポリメラーゼとしてジーンタック（ニッポンジーン）またはアドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、各プライマー溶液１μＬ（１０ｐｍｏｌ）を２０μＬの反応液に加えた。反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのＴａｑポリメラーゼに添付された方法に従った。具体的には、ジーンタックに関しては、滅菌水１３．２０μＬ、１０ｘＰＣＲバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．６０μＬ、ジーンタックポリメラーゼ０．２０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。クローンテックアドバンテージ２に関しては、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００８８】
【表２】
【００８９】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応７２℃（ジーンタック）または６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３５サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００９０】
その結果、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲにおいては、ニッポンジーンのジーンタックを用いた場合、アニーリング温度は５３℃が最適であり、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適ではあったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片はいずれのフジツボにおいても約３５０ｂｐの長さであった。
【００９１】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号７及び８に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００９２】
各種フジツボ総ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び配列番号８に記載された塩基配列からなるプライマーを用いて得られた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号９〜３６に示す。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である２９７ｂｐ〜３０５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号２３〜５０に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。以下に、配列表の配列番号９〜３６に対応するフジツボ種を明記する。
【００９３】
・配列番号９ ：ミネフジツボ
・配列番号１０：チシマフジツボ
・配列番号１１：ハナフジツボ
・配列番号１２：アカフジツボ
・配列番号１３：キタアメリカフジツボ
・配列番号１４：アメリカフジツボ
・配列番号１５：タテジマフジツボ
・配列番号１６：サラサフジツボ
・配列番号１７：シロスジフジツボ
・配列番号１８：サンカクフジツボ
・配列番号１９：ケハダカイメンフジツボ
・配列番号２０：イワフジツボ
・配列番号２１：クロフジツボ
・配列番号２２：ムツアナヒラフジツボ
・配列番号２３：カメノテ
・配列番号２４：エボシガイ
・配列番号２５：オオアカフジツボ
・配列番号２６：キタイワフジツボ
・配列番号２７：ミミエボシ
・配列番号２８：オニフジツボ
・配列番号２９：コウダカキクフジツボ
・配列番号３０：ヨーロッパフジツボ
・配列番号３１：ドロフジツボ
・配列番号３２：Cryptolepas rhachianechi
・配列番号３３：Elminius modestus
・配列番号３４：Semibalanus balanoides
・配列番号３５：スジエボシ
・配列番号３６：ココポーマアカフジツボ
【００９４】
なお、同一の鋳型ＤＮＡから１２Ｓ ｒＲＮＡ用プライマーを用いてジーンタック、アドバンテージ２の２種類のＴａｑポリメラーゼにより増幅した場合、得られた塩基配列データは全く同じであった。
【００９５】
配列表の配列番号９〜３６の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、ミネフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１１３ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【００９６】
また、配列表の配列番号９〜３６の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、チシマフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１５０ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号３及び４に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【００９７】
さらに、配列表の配列番号９〜３６の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、チシマフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１４８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号５及び６に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【００９８】
（１）ミネフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたミネフジツボ成体、ミネフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ成体、ハナフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、サンカクフジツボ成体、イワフジツボ成体、シロスジフジツボ成体、ココポーマアカフジツボ成体、ケハダカイメンフジツボ成体、アメリカフジツボ成体、タテジマフジツボ成体及びサラサフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対の有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。
【００９９】
電気泳動写真を図１に示す。図１において、ａがミネフジツボ、ｂがチシマフジツボ、ｃがハナフジツボ、ｄがキタアメリカフジツボ、ｅがサンカクフジツボ、ｆがイワフジツボ、ｇがシロスジフジツボ、ｈがココポーマアカフジツボ、ｉがケハダカイメンフジツボ、ｊがアメリカフジツボ、ｋがタテジマフジツボ、ｌがサラサフジツボの電気泳動結果である。
【０１００】
アニーリング温度の検討を行った結果、５９℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行なうこととした。ミネフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対により増幅した１１３ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ミネフジツボ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１０１】
以上の結果から、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対は、ミネフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１０２】
（２）チシマフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたチシマフジツボ成体、チシマフジツボと比較的近縁と考えられるシロスジフジツボ成体、ドロフジツボ成体、サラサフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、ミネフジツボ成体、ココポーマアカフジツボ成体、アカフジツボ成体、クロフジツボ成体、オオアカフジツボ成体、タテジマフジツボ成体及びヨーロッパフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いて上記（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１０３】
電気泳動写真を図２に示す。図２において、ａがチシマフジツボ、ｂがシロスジフジツボ、ｃがドロフジツボ、ｄがサラサフジツボ、ｅがキタアメリカフジツボ、ｆがミネフジツボ、ｇがココポーマアカフジツボ、ｈがアカフジツボ、ｉがクロフジツボ、ｊがオオアカフジツボ、ｋがタテジマフジツボ、ｌがヨーロッパフジツボの電気泳動結果である。
【０１０４】
チシマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対により増幅した１５０ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、チシマフジツボ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１０５】
以上の結果から、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対は、チシマフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１０６】
（２）ハナフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたハナフジツボ成体、ハナフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ成体、ドロフジツボ成体、ミネフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、サラサフジツボ成体、ケハダカイメンフジツボ成体、サンカクフジツボ成体、オオアカフジツボ成体、イワフジツボ成体、シロスジフジツボ成体及びタテジマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いて上記（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１０７】
電気泳動写真を図３に示す。図３において、ａがハナフジツボ、ｂがチシマフジツボ、ｃがドロフジツボ、ｄがミネフジツボ、ｅがキタアメリカフジツボ、ｆがサラサフジツボ、ｇがケハダカイメンフジツボ、ｈがサンカクフジツボ、ｉがオオアカフジツボ、ｊがイワフジツボ、ｋがシロスジフジツボ、ｌがタテジマフジツボの電気泳動結果である。
【０１０８】
ハナフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対により増幅した１４８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ハナフジツボ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１０９】
以上の結果から、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対は、ハナフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１１０】
（実施例２）
本発明のプライマー対の混合プランクトン中での有効性について検討した。
【０１１１】
混合プランクトンは以下のようにして得た。即ち、2006年9月5日に東京湾内で、また2006年8月3日に宮城県志津川湾内でプランクトンネット（ノルパック、口径５０ｃｍ）を用いて約８ｍの鉛直曳きによりプランクトンサンプルの採集を行った。これにより約１６００Ｌ分の海水中のプランクトンが採集されたことになる。採集したプランクトンは実験室に持ち帰った後、１００μｍ（１３ＸＸ）と１ｍｍ（２０ＧＧ）の目開きのメッシュを用いてフジツボ幼生が含まれる画分を得た。つまり、フジツボ幼生は、１ｍｍのメッシュを素通りし、１００μｍのメッシュでトラップされるので、１ｍｍ以上の大型プランクトンはあらかじめ除去して解析に供した。得られたプランクトンサンプルは海水を除いた後、９９．５％エタノールを加えて固定し、４℃で保存した。
【０１１２】
尚、上記プランクトン採集時期には、ミネフジツボ幼生、チシマフジツボ幼生、ハナフジツボ幼生が採集されることはないので、採集したプランクトンサンプルにこれらのフジツボ幼生が含まれることは無い。
【０１１３】
東京湾にて採集した混合プランクトンサンプルと志津川湾にて採集した混合プランクトンサンプルのそれぞれについて、ＤＮＡ抽出処理を行った。ＤＮＡ抽出には、フジフィルム社のＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳを用い、基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＭＤＴ）と２０μＬのＥＤＴとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに１８０μＬのバッファー（ＬＤＴ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２４０μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＭｉｎｉ８０のカートリッジに全量処理サンプルを供した。このカートリッジに添加後に、加圧処理と７５０μＬのＷＤＴを加える操作を３回繰り返した（洗浄処理）。洗浄後、フィルターに吸着したＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー（ＣＤＴ）によりＤＮＡを溶出し、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡと志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡをそれぞれ回収して、以下の実験に供した。
【０１１４】
（１）ミネフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対について、実施例１で得られたミネフジツボ成体の鋳型ＤＮＡ、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡ、志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡを用いて、実施例１（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１１５】
電気泳動写真を図４に示す。図４において、Ａがミネフジツボ、Ｂが東京湾混合プランクトン、Ｃが志津川湾混合プランクトンの電気泳動結果である。ミネフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できたのに対し、プランクトンサンプルから調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１１６】
以上の結果から、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対は、実海域に一般的に存在するプランクトンを認識することなく、ミネフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１１７】
（２）チシマフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対について、実施例１で得られたチシマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡ、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡ、志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡを用いて、実施例１（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１１８】
電気泳動写真を図５に示す。図５において、Ａがチシマフジツボ、Ｂが東京湾混合プランクトン、Ｃが志津川湾混合プランクトンの電気泳動結果である。チシマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できたのに対し、プランクトンサンプルから調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１１９】
以上の結果から、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対は、実海域に一般的に存在するプランクトンを認識することなく、チシマフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２０】
（３）ハナフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対について、実施例１で得られたハナフジツボ成体の鋳型ＤＮＡ、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡ、志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡを用いて、実施例１（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１２１】
電気泳動写真を図６に示す。図６において、Ａがハナフジツボ、Ｂが東京湾混合プランクトン、Ｃが志津川湾混合プランクトンの電気泳動結果である。ハナフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できたのに対し、プランクトンサンプルから調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１２２】
以上の結果から、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対は、実海域に一般的に存在するプランクトンを認識することなく、ハナフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２３】
（実施例３）
本発明のプライマー対を用いた定量分析について検討した。
【０１２４】
ミネフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、図７に示すように、０．４〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１２５】
次に、チシマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、図８に示すように、０．２〜１０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１２６】
次に、ハナフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、図９に示すように、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１２７】
このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるフジツボ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、フジツボ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【０１２８】
（実施例４）
本発明のプライマー対を用いたリアルタイムＰＣＲによる定量分析について検討した。
【０１２９】
実施例１で得られたミネフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを各種濃度で含む反応液を調製し、これをリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。
【０１３０】
反応液は、純水９．５μＬ、配列番号１に記載のプライマー（１０μＭ）、配列番号２に記載のプライマー（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合し、これに実施例１で得られたミネフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを各種濃度となるように混合して調製した。
【０１３１】
装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【０１３２】
ミネフジツボのＤＮＡ濃度とＣｔ値の関係を図１０に示す。図１０に示すように、ＤＮＡ濃度とＣｔ値との間には高い相関が見られ、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。したがって、推定されたＤＮＡ量とミネフジツボ幼生の遺伝子コピー数との関係に基づいて、ミネフジツボ幼生個体数の推定が可能であることが明らかとなった。
【０１３３】
上記と同様の実験をチシマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡと配列番号３及び４に記載のプライマー対を用いて実施し、チシマフジツボのＤＮＡ濃度とＣｔ値の関係について得られた結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＤＮＡ濃度とＣｔ値との間には高い相関が見られ、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。したがって、推定されたＤＮＡ量とチシマフジツボ幼生の遺伝子コピー数との関係に基づいて、チシマフジツボ幼生個体数の推定が可能であることが明らかとなった。
【０１３４】
また、上記と同様の実験をハナフジツボ成体の鋳型ＤＮＡと配列番号５及び６に記載のプライマー対を用いて実施し、チシマフジツボのＤＮＡ濃度とＣｔ値の関係について得られた結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＤＮＡ濃度とＣｔ値との間には高い相関が見られ、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。したがって、推定されたＤＮＡ量とハナフジツボ幼生の遺伝子コピー数との関係に基づいて、ハナフジツボ幼生個体数の推定が可能であることが明らかとなった。
【符号の説明】
【０１３５】
１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する海水域から採集した被験試料に含まれる北方系フジツボ（ミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボ）幼生の種を判定し、その個体数の定量を行うのに好適なフジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フジツボは、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へ付着することにより生物汚損を引き起こす代表的汚損生物として知られている。例えば、火力・原子力発電所の冷却水路系にフジツボが付着すると、流動抵抗の増大により冷却水の流量が低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボが詰まることにより管壁の腐食が生じる。そこで、各発電所では、付着したフジツボを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制するための様々な防除対策が実施されている。
【０００３】
フジツボの付着を抑制する対策としては、冷却水路系や復水器管等に防汚塗料を塗布したり、あるいは塩素を注入してフジツボ幼生の付着を防ぐ手法がとられている。しかしながら、フジツボの付着時期を正確に予測することはできないことから、結果的には長期間にわたって塩素注入を継続することによりフジツボの付着を抑制しているのが現状であり、環境負荷が非常に大きいという問題がある。したがって、環境負荷を低減し、また、防除対策のコストダウンを図るためにも、フジツボが付着する直前にピンポイントで塩素注入を行うことが好ましい。そこで、フジツボの付着時期を正確に予測する技術の確立が望まれている。
【０００４】
ところで、海洋等の環境中には様々な種のフジツボが存在していることから、フジツボの付着時期を正確に予測するためには、どのような種のフジツボ幼生がどのようなタイミングで発生するのかを十分に調査する必要がある。
【０００５】
フジツボの種を幼生の段階で判定する方法としては、顕微鏡観察による手法が挙げられるが、プランクトンサンプル中に存在する複数種のフジツボ幼生から形態分類学上の差異のみを頼りにフジツボ幼生の種を判定することは極めて困難である。
【０００６】
そこで、付着期のフジツボ幼生の種を判定する技術として、特許文献１のような方法が提案されている。具体的には、海水から採集されたタテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボおよびヨーロッパフジツボを含むフジツボ種の付着期幼生（キプリス幼生）に対して、波長が４００〜４４０ｎｍの励起光を照射し、発光した波長４７５ｎｍ以上の蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに入力し、この情報をコンピュータに予め登録された種に固有の体内蛍光分布パターン認識情報と比較して、これらの蛍光分布パターンがマッチングしたフジツボ類の種を判定するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１２４６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１記載のフジツボ幼生の種判定方法では、成長初期段階にあるノープリウス幼生期のフジツボ種の判定を行うことができない。したがって、フジツボの付着時期の予測が遅れて付着抑制対策を確実に実行できなくなる虞がある。また、蛍光パターンが類似している種が存在する結果、種の判定を高精度に行うことができないという問題も有している。さらに、キプリス幼生が死んでしまうと、励起光を照射してもキプリス幼生からの蛍光発光が生じなくなり、種の判定ができなくなることから、キプリス幼生を生きたまま種の判定に供する必要があるという煩雑さが伴う。
【０００９】
また、フジツボの付着時期を正確に予測するためには、フジツボ幼生の高精度な種判定手法と共に、その個体数を定量的に分析する手法を確立する必要がある。このことは、同一海域に存在し得るフジツボ幼生に対して特に要請される。
【００１０】
そこで、本発明は、北方海域に存在し得る北方系フジツボであるミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボについて、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、北方海域に存在し得る北方系フジツボであるミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボについて、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定すると共に、その個体数を定量的に分析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチにより各種フジツボを分子レベルで種々検討した。その結果、各種フジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報に基づき、ミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボをそれぞれ分子レベルで特異的に認識するプライマー対を開発することに成功し、本願発明に至った。
【００１３】
即ち、本発明のフジツボ種判定用プライマーセットは、下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミネフジツボ（Balanus rostratus）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むチシマフジツボ（Semibalanus cariosus）検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むハナフジツボ（Balanus crenatus）検出用プライマー対
【００１４】
（１）のプライマー対は、ミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、ミネフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ、ハナフジツボ、キタアメリカフジツボ、サンカクフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、ココポーマアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（１）のプライマー対によれば、ミネフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１５】
（２）のプライマー対は、チシマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、チシマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、チシマフジツボと比較的近縁と考えられるミネフジツボ、ハナフジツボ、キタアメリカフジツボ、サンカクフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、ココポーマアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（２）のプライマー対によれば、チシマフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１６】
（３）のプライマー対は、ハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、ハナフジツボと比較的近縁と考えられるミネフジツボ、チシマフジツボ、キタアメリカフジツボ、サンカクフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、ココポーマアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（３）のプライマー対によれば、ハナフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１７】
次に、本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、被験試料に対し、上記（１）〜（３）のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにしている。
【００１８】
例えば、被験試料にミネフジツボ幼生が存在している場合には、上記（１）のプライマー対がミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりミネフジツボ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にミネフジツボ幼生が含まれていない場合には、上記（１）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料に存在しているフジツボ幼生の種がミネフジツボであるか否かを判定することができる。つまり、遺伝子増幅の有無を検出することによって、被験試料に存在しているフジツボ幼生種がＰＣＲに使用したプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種であるか否かがわかるので、これによりフジツボ幼生の種を判定できる。
【００１９】
次に、本発明のフジツボ幼生個体数の定量分析方法は、被験試料に対し、上記（１）〜（３）のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種（ＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種）の個体数の定量を行うようにしている。
【００２０】
例えば、上記（１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、被験試料に存在するミネフジツボ幼生個体数に対応して遺伝子が増幅する。したがって、ミネフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、上記（１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりミネフジツボ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いることで、被験試料の遺伝子増幅量から被験試料に存在するミネフジツボ幼生個体数を定量することができる。つまり、ＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数を定量することができる。
【００２１】
ここで、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとし、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００２２】
また、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、被験試料を分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００２３】
次に、本発明のフジツボ種判定用キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００２４】
例えば、配列番号１または２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーをプローブとして含む場合、このプローブがミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）する。したがって、本発明のフジツボ種判定用キットにより、被験試料に存在するフジツボ幼生の種がミネフジツボであるか否かを判定することができる。つまり、プローブとのハイブリッドの形成の有無によって、被験試料に存在しているフジツボ幼生種がプローブとして使用したプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種であるか否かがわかるので、これによりフジツボ幼生の種を判定できる。
【発明の効果】
【００２５】
請求項１記載のフジツボ種判定用プライマーセットによれば、ミネフジツボ、チシマフジツボまたはハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、このプライマーセットをＰＣＲに供することで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００２６】
請求項２記載のフジツボ幼生種判定方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、ＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種を特異的に検出して、フジツボ幼生の種を判定することができる。
【００２７】
請求項３記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、ＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種のみを特異的に検出して定量することができる。
【００２８】
請求項４記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、リアルタイムＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種のみを特異的に検出して定量することができる。しかも、請求項１に記載のフジツボ種判定用プライマーセットにより増幅されるＤＮＡ断片長は１５０ｂｐ以内に収まることから、リアルタイムＰＣＲを行うためのＤＮＡ断片長として好適な長さとなり、リアルタイムＰＣＲによるＣｔ値の測定を精度良く行うことが可能になる。
【００２９】
請求項５に記載のフジツボ幼生個体数の定量分析方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、例えば、初期ノープリウス幼生期にあるフジツボ幼生と、後期ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期にあるフジツボ幼生とを分画して定量することにより定量精度を高めることが可能となる。
【００３０】
請求項６記載のフジツボ種判別用キットによれば、配列番号１〜６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一つのプライマーをプローブとして含んでいるので、プローブとして含まれるプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ種について、そのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、被験試料に存在するフジツボ幼生種の種判定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いて各種フジツボ成体の鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いて各種フジツボ成体の鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図３】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いて各種フジツボ成体の鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図４】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いてプランクトンサンプルの鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いてプランクトンサンプルの鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図６】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いてプランクトンサンプルの鋳型ＤＮＡに対しＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図７】反応液のミネフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図８】反応液のチシマフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図９】反応液のハナフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１０】ミネフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示す図である。
【図１１】チシマフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示す図である。
【図１２】ハナフジツボの鋳型ＤＮＡ濃度とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示す図である。
【図１３】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００３３】
本発明のフジツボ種判定用プライマーセットは、下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
【００３４】
（１）ミネフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号７で示されるミネフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３６〜１４８番目の１１３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３５】
（２）チシマフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号８で示されるチシマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、９８〜２４７番目の１５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３６】
（３）ハナフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号９で示されるハナフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、９７〜２４４番目の１４８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３７】
尚、各プライマーの塩基配列は、配列番号１〜６で示される塩基配列に限定されるものではなく、プライマーの一端または両端が延長されたプライマーであって、対応するフジツボ種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は最大でも４０塩基とすることが好ましい。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こり易くなり、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、プライマーの一端または両端を短縮してもよいが、プライマー長は最小でも１８塩基とすることが好ましい。１８塩基未満とすると、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００３８】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００３９】
次に、本発明のフジツボ幼生の種判定方法について説明する。
【００４０】
本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、被験試料に対し、上記のプライマー対のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにしている。
【００４１】
被験試料としては、フジツボ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含有している海水等の環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
被験試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好ましい。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなり、被験試料の長期保存が可能となると共に、ＰＣＲに悪影響を及ぼす虞のある塩分の析出を防ぐことができる。エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存してもよいが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。尚、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００４３】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、滅菌水等で被験試料中のプランクトンを十分に洗浄して塩分を除いた後、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。
【００４４】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にフジツボ幼生の種の判別を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００４５】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記プライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。ＰＣＲを行うことにより、被験試料中にフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。より詳細には、使用したプライマー対に対応するフジツボ種のミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が被験試料中に含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。
【００４６】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることができる。増幅産物が検出された場合には、ＰＣＲに使用したプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ種が被験試料に存在していることになる。したがって、ＰＣＲに使用したプライマーに応じて、被験試料に存在しているフジツボ種を判定することができる。
【００４７】
ここで、本発明のフジツボ幼生種の判定方法は、上記プライマーセットのうちの一組のプライマー対毎にＰＣＲを行って、被験試料に存在するフジツボ幼生の種判定を行うようにしてもよいが、上記プライマーセットのうち複数組のプライマー対を被験試料に投入してＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡの分子量の差異から、被験試料に存在するフジツボ幼生の種判定を行うようにしてもよい。
【００４８】
次に、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法について説明する。本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しこのプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種の個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００４９】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットのうちの一組のプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種（リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種）の個体数の定量を行うようにしている。
【００５０】
即ち、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、フジツボ種毎にフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を作成する。そして、この検量線を利用して、被験試料のＣｔ値から、被験試料に含まれるフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００５１】
このように、フジツボ種毎にフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を予め作成しておくことで、被験試料に対し、上記プライマーセットのうち一組のプライマー対毎にリアルタイムＰＣＲを行うことにより、ミネフジツボ、チシマフジツボ、ハナフジツボの幼生個体数の定量分析を行うことができる。そして、被験試料に上記フジツボ種の幼生が存在していない場合には、フジツボ幼生の個体数が０という結果が得られるので、被験試料に存在しているフジツボ幼生種の判定と個体数の定量とを同時に実施できることになる。
【００５２】
ここで、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、本発明のフジツボ幼生種判定方法を行った後に実施するようにしてもよい。例えば、上記プライマーセットのうちの一組または２組以上のプライマー対を用いて被験試料に存在するフジツボ幼生種を絞り込んだ後に、被験試料に存在するフジツボ幼生種に対応するプライマー対を用いて幼生個体数の定量分析を実施することで、定量分析を無駄なく効率的に実施することができる。また、フジツボ種の判定と定量を同時に行うようにしてもよい。例えば、上記プライマーセットのうちの二組以上のプライマー対を用いて被験試料に存在するフジツボ幼生種を絞り込む際に、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置からフジツボ幼生種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、フジツボ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００５３】
尚、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料中の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などを適宜採用することもできる。
【００５５】
ここで、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号３７で示される塩基配列からなる分子を用いたサイクリングプローブ法により実施するのが特に好ましい。
【００５６】
サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号３７で示される塩基配列からなる分子を用いることで、このプローブが、ミネフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、上記（１）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位中の特定領域を特異的に認識する。したがって、被験試料にミネフジツボが含まれている場合には、サイクリングプローブが、ＰＣＲにより増幅されたミネフジツボのＤＮＡの特定領域とハイブリッドを形成する。尚、チシマフジツボについても上記（２）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位に基づき、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として使用可能な分子の設計が可能である。また、ハナフジツボについても上記（３）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位に基づき、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として使用可能な分子の設計が可能である。尚、インターカレータ法やＴａｑＭａｎプローブ法などによる検出を行っても良い。
【００５７】
サイクリングプローブには、ＲＮＡ部（配列番号３７に示される塩基配列においては、３番目のＡがＲＮＡである）を挟んで５’端に蛍光物質が結合し、３’端にこの蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）が標識されている。サイクリングプローブは、インタクトな状態にある場合には、クエンチャーの作用により強い蛍光を発することは無い。しかし、増幅ＤＮＡの相補的な配列とハイブリッドを形成した後にＲＮＡ切断酵素であるＲＮａｓｅＨを作用させると、サイクリングプローブがＲＮＡ部で切断され、クエンチャーが作用しなくなって強い蛍光を発するようになる。したがって、この蛍光強度を測定することで、仮に被験試料に存在するプランクトン等の遺伝子がＰＣＲによって増幅されてしまうケースが生じたとしても、目的のフジツボ幼生種の遺伝子増幅のみを選択的に検出することが可能となり、目的のフジツボ幼生個体数の定量を確実且つ精度良く行うことができる。尚、蛍光物質及び消光物質については、リアルタイムＰＣＲ装置で検出可能なものを適宜選択することができる。
【００５８】
尚、リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００５９】
本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法に用いる検量線は、フジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、このフジツボ幼生が有する遺伝子を認識するプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生個体数とＣｔ値の関係を調べて予め作成される。
【００６０】
試料の処理方法に関しては、上記と同様、試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、試料中のフジツボ幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好ましい。
【００６１】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知または新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出方法、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳ（フジフイルム社）、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）等を用いることが好適である。特に、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳ（フジフイルム社）を用いた場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、フジツボ幼生の定量をより正確に実施し易くなる。また、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）を用いた場合には、サンプル中の泥や砂の影響を抑えてリアルタイムＰＣＲに適したＤＮＡ抽出サンプルを得ることができ、より好適である。
【００６２】
また、特にキプリス幼生においては、クチクラの殻（甲皮）の堅さがサンプルにより異なる場合があり、これが原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、クチクラの殻の破砕処理を行うことが好適である。例えば、エタノールを除いて乾燥させた試料の入ったエッペンドルフチューブにジルコニアボール（直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個）入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。
【００６３】
ここで、フジツボ幼生は、Ｉ期ノープリウス幼生として孵化後すぐにＩＩ期ノープリウスとなり、その後は、海水中の植物プランクトンを餌として取り込んで成長する。そしてＶＩ期ノープリウス幼生を経て摂餌をしない付着期のキプリス幼生となる。成長に伴い、個体サイズ、細胞数が増加するため、標的となる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することになる。したがって、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の発生段階で異なってくる。
【００６４】
本願発明者の実験によると、フジツボのキプリス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数は初期（Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数の５倍であることが確認されている。この値はキプリス幼生と初期ノープリウス幼生の体積差を反映している。
【００６５】
したがって、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、キプリス幼生のみが含まれている試料を用いれば、キプリス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、初期ノープリウス幼生のみが含まれている試料を用いれば、初期ノープリウス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００６６】
また、幼生個体数が既知の複数の試料は、上記とは別の方法でも得ることができる。即ち、成体試料等から鋳型ＤＮＡを抽出し、これを幼生個体数と同等の遺伝子コピー数となるように段階希釈することによって、幼生個体数が既知の複数の試料を得るようにしてもよい。
【００６７】
被験試料の種類や処理方法に関しては、上記と同様である。但し、ＤＮＡ抽出処理方法に関しては、検量線作成時と同様の方法を採用することが定量値のばらつきを抑える上で好ましい。また、被験試料に対して行うリアルタイムＰＣＲ条件は検量線作成時のリアルタイムＰＣＲ条件と同様とする。
【００６８】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することにより、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。即ち、フジツボ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、篩を通過した体積の小さいフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているフジツボの幼生個体数を初期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているフジツボの初期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。また、篩を通過しなかった体積の大きいフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているフジツボ幼生の個体数をキプリス幼生個体数とＶＩ期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているフジツボのキプリス幼生とＶＩ期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。したがって、どの成長段階にあるフジツボ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。尚、分画方法は篩によるものには限定されず、例えば遠心分離処理を用いてもよい。また、分画処理により、例えば初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生のみを被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれている初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の個体数を高精度に定量することも可能であるし、ＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生を被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれているＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生の個体数を高精度に定量することも可能である。
【００６９】
本発明のフジツボ幼生の定量方法により、実海域でのフジツボの付着時期を予測することが可能になる。即ち、Ｃｔ値から換算される幼生個体数の発生段階による相違は最大でも５倍である。これは、実海域での幼生出現ピーク時の個体数増加に比べれば小さい値であり、付着時期予測には大きな問題点とはならないと考えられる。これまでに実海域でフジツボ幼生の個体数変動と付着時期を詳細に調査した報告、例えば、志津川湾におけるフジツボ幼生および付着板の調査（電力中央研究所報告Ｖ０５０３３）や、柳井・三隅火力発電所前面海域での付着板を用いた調査（中国電力 技研時報１０１、ｐ７５−８３）によると、フジツボの付着盛期は１ヶ月以内に集中し、この期間内に急激に付着個体が増加すると報告されている。また、飼育実験からフジツボの幼生は、孵化後１〜２週間で付着期幼生になり、基盤に付着すると考えられる。したがって、付着期前の比較的短期間に幼生の出現ピークがあり、その際の幼生数の増加率は５倍という値に比較して圧倒的に大きな値、例えば、３日〜１週間毎に被験試料をサンプリングした場合、サンプリング量にもよるが、数十倍〜数百倍、あるいはそれ以上の増加率となることが予想される。よって、本発明の定量方法によりフジツボ幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、実海域でのフジツボの付着時期を確実に予測することが可能になる。
【００７０】
次に、本発明のフジツボ種判定用キットについて説明する。
【００７１】
本発明のフジツボ種判定用キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００７２】
即ち、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうち一つのプライマーのみをプローブとして含むことによって、このプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ種のみを検出するキットとすることができる。また、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうち２つ以上のプライマー（但し、異なるプライマー対由来の２つ以上のプライマー）をプローブとして含むことによって、２種以上のフジツボを検出するキットとすることができる。
【００７３】
本発明のフジツボ種判定用キットの一例として、図１３に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００７４】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１〜６のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーである。例えば、スポット３にはそれぞれ異なるフジツボ種を検出するプライマーをプローブとして固定しておく。
【００７６】
ＤＮＡチップ１を用いて、フジツボ幼生の種判定を行う。被験試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のフジツボ幼生の検出を行うことができる。
【００７７】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００７８】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いてフジツボ幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量をモニタリングすることによって、フジツボ幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、フジツボ幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、フジツボ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中のフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００７９】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とするフジツボ幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、フジツボ幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【００８０】
また、本発明の定量方法は、上記のプライマー対の２組以上を同時に使用してＰＣＲを行うことにより実施するようにしてもよい。例えば、上記（１）と（２）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置からフジツボ幼生の種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、フジツボ幼生の個体数の定量を行うようにしてもよい。
【実施例】
【００８１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００８２】
（実施例１）
各種フジツボ成体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいて各種フジツボに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供したフジツボ種を表１に示す。アカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ココポーマアカフジツボは採集後に室内でアルテミア、珪藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）などを餌として与えて飼育されたものを９９．５％エタノール（和光純薬製）に浸して固定し、実験に使用するまで４℃で保存した。なお、エタノール浸漬前は、数日間餌を与えずアルテミア由来のＤＮＡの影響を排除した。その他のフジツボは採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。尚、オオアカフジツボは伊豆半島にて採集したものを使用した。
【００８３】
【表１】
【００８４】
大型のフジツボ成体であるアカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、クロフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ココポーマアカフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、オニフジツボ、オオアカフジツボ、Cryptolepas rhachianechi、ミミエボシ、スジエボシは、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、キアゲン社のDNeasy Blood Tissue Kitを使用して総ＤＮＡの抽出を行った。ＤＮＡ抽出はDNeasy Blood Tissue Kitに付属のマニュアルに準じて行った。得られたＤＮＡは、１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡバッファー（ＴＥバッファー、ｐＨ８．０）に溶解した。
抽出用組織が小さい場合は適宜溶解バッファー量を減らした。また小型のフジツボであるイワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、ハナフジツボ、Semibalanus balanoides、Elminius modestus、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、また、上記大型のフジツボ成体に属するタテジマフジツボの中でも小型の個体に関しては、１個体の軟体部全体をそのまま同様の方法で抽出に供した。
【００８５】
ＴＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、ほとんどのサンプルで５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認されたが、イワフジツボなど非常に小型のフジツボにおいては１個体から得られるＤＮＡ量が少なかった。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＴＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００８６】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、フジツボミトコンドリアの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーとして文献１〜４で報告されているものを用いた。
（文献１: R.A.Begum,T.Yamaguchi and S.Watabe(2004).Molecular phylogeny of thoracican barnacles based on the mitochondrial 12S and 16S rRNA genes.Sessile organisms,21,47-54.
文献２: T.D.Kocher, W.K.Thomas, A.Meyer, S.V.Edwards, S.Paabo, F.X.Villablansca and A.C.Wilson(1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6196-6200.
文献３: O.Mokady, S.Rozenblatt, D.Graur and Y.Loya(1994). Coral-host specificity of red sea Lithophaga bivalves: interspecific and intraspecific variation in 12S mitochondrial ribosomal RNA.Mol.Mar.Biol.Biotech.,3,158-164.
文献４: S.R.Palumbi(1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Molecular Systematics,ed. D.M.Hillis, C.Mortiz and B.K.Mable, Sinauer Associates, Sunderland, pp.205-248.）
【００８７】
表２と配列番号７及び８に使用したプライマーの配列を示す。なお、これらのプライマーは、合成（シグマジェノシス）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑポリメラーゼとしてジーンタック（ニッポンジーン）またはアドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、各プライマー溶液１μＬ（１０ｐｍｏｌ）を２０μＬの反応液に加えた。反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのＴａｑポリメラーゼに添付された方法に従った。具体的には、ジーンタックに関しては、滅菌水１３．２０μＬ、１０ｘＰＣＲバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．６０μＬ、ジーンタックポリメラーゼ０．２０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。クローンテックアドバンテージ２に関しては、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００８８】
【表２】
【００８９】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応７２℃（ジーンタック）または６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３５サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００９０】
その結果、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲにおいては、ニッポンジーンのジーンタックを用いた場合、アニーリング温度は５３℃が最適であり、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適ではあったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片はいずれのフジツボにおいても約３５０ｂｐの長さであった。
【００９１】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号７及び８に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００９２】
各種フジツボ総ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び配列番号８に記載された塩基配列からなるプライマーを用いて得られた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号９〜３６に示す。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である２９７ｂｐ〜３０５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号２３〜５０に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。以下に、配列表の配列番号９〜３６に対応するフジツボ種を明記する。
【００９３】
・配列番号９ ：ミネフジツボ
・配列番号１０：チシマフジツボ
・配列番号１１：ハナフジツボ
・配列番号１２：アカフジツボ
・配列番号１３：キタアメリカフジツボ
・配列番号１４：アメリカフジツボ
・配列番号１５：タテジマフジツボ
・配列番号１６：サラサフジツボ
・配列番号１７：シロスジフジツボ
・配列番号１８：サンカクフジツボ
・配列番号１９：ケハダカイメンフジツボ
・配列番号２０：イワフジツボ
・配列番号２１：クロフジツボ
・配列番号２２：ムツアナヒラフジツボ
・配列番号２３：カメノテ
・配列番号２４：エボシガイ
・配列番号２５：オオアカフジツボ
・配列番号２６：キタイワフジツボ
・配列番号２７：ミミエボシ
・配列番号２８：オニフジツボ
・配列番号２９：コウダカキクフジツボ
・配列番号３０：ヨーロッパフジツボ
・配列番号３１：ドロフジツボ
・配列番号３２：Cryptolepas rhachianechi
・配列番号３３：Elminius modestus
・配列番号３４：Semibalanus balanoides
・配列番号３５：スジエボシ
・配列番号３６：ココポーマアカフジツボ
【００９４】
なお、同一の鋳型ＤＮＡから１２Ｓ ｒＲＮＡ用プライマーを用いてジーンタック、アドバンテージ２の２種類のＴａｑポリメラーゼにより増幅した場合、得られた塩基配列データは全く同じであった。
【００９５】
配列表の配列番号９〜３６の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、ミネフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１１３ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【００９６】
また、配列表の配列番号９〜３６の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、チシマフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１５０ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号３及び４に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【００９７】
さらに、配列表の配列番号９〜３６の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、チシマフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１４８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号５及び６に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【００９８】
（１）ミネフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたミネフジツボ成体、ミネフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ成体、ハナフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、サンカクフジツボ成体、イワフジツボ成体、シロスジフジツボ成体、ココポーマアカフジツボ成体、ケハダカイメンフジツボ成体、アメリカフジツボ成体、タテジマフジツボ成体及びサラサフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対の有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。
【００９９】
電気泳動写真を図１に示す。図１において、ａがミネフジツボ、ｂがチシマフジツボ、ｃがハナフジツボ、ｄがキタアメリカフジツボ、ｅがサンカクフジツボ、ｆがイワフジツボ、ｇがシロスジフジツボ、ｈがココポーマアカフジツボ、ｉがケハダカイメンフジツボ、ｊがアメリカフジツボ、ｋがタテジマフジツボ、ｌがサラサフジツボの電気泳動結果である。
【０１００】
アニーリング温度の検討を行った結果、５９℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行なうこととした。ミネフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対により増幅した１１３ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ミネフジツボ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１０１】
以上の結果から、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対は、ミネフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１０２】
（２）チシマフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたチシマフジツボ成体、チシマフジツボと比較的近縁と考えられるシロスジフジツボ成体、ドロフジツボ成体、サラサフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、ミネフジツボ成体、ココポーマアカフジツボ成体、アカフジツボ成体、クロフジツボ成体、オオアカフジツボ成体、タテジマフジツボ成体及びヨーロッパフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いて上記（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１０３】
電気泳動写真を図２に示す。図２において、ａがチシマフジツボ、ｂがシロスジフジツボ、ｃがドロフジツボ、ｄがサラサフジツボ、ｅがキタアメリカフジツボ、ｆがミネフジツボ、ｇがココポーマアカフジツボ、ｈがアカフジツボ、ｉがクロフジツボ、ｊがオオアカフジツボ、ｋがタテジマフジツボ、ｌがヨーロッパフジツボの電気泳動結果である。
【０１０４】
チシマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対により増幅した１５０ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、チシマフジツボ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１０５】
以上の結果から、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対は、チシマフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１０６】
（２）ハナフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたハナフジツボ成体、ハナフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ成体、ドロフジツボ成体、ミネフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、サラサフジツボ成体、ケハダカイメンフジツボ成体、サンカクフジツボ成体、オオアカフジツボ成体、イワフジツボ成体、シロスジフジツボ成体及びタテジマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いて上記（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１０７】
電気泳動写真を図３に示す。図３において、ａがハナフジツボ、ｂがチシマフジツボ、ｃがドロフジツボ、ｄがミネフジツボ、ｅがキタアメリカフジツボ、ｆがサラサフジツボ、ｇがケハダカイメンフジツボ、ｈがサンカクフジツボ、ｉがオオアカフジツボ、ｊがイワフジツボ、ｋがシロスジフジツボ、ｌがタテジマフジツボの電気泳動結果である。
【０１０８】
ハナフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対により増幅した１４８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ハナフジツボ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１０９】
以上の結果から、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対は、ハナフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１１０】
（実施例２）
本発明のプライマー対の混合プランクトン中での有効性について検討した。
【０１１１】
混合プランクトンは以下のようにして得た。即ち、2006年9月5日に東京湾内で、また2006年8月3日に宮城県志津川湾内でプランクトンネット（ノルパック、口径５０ｃｍ）を用いて約８ｍの鉛直曳きによりプランクトンサンプルの採集を行った。これにより約１６００Ｌ分の海水中のプランクトンが採集されたことになる。採集したプランクトンは実験室に持ち帰った後、１００μｍ（１３ＸＸ）と１ｍｍ（２０ＧＧ）の目開きのメッシュを用いてフジツボ幼生が含まれる画分を得た。つまり、フジツボ幼生は、１ｍｍのメッシュを素通りし、１００μｍのメッシュでトラップされるので、１ｍｍ以上の大型プランクトンはあらかじめ除去して解析に供した。得られたプランクトンサンプルは海水を除いた後、９９．５％エタノールを加えて固定し、４℃で保存した。
【０１１２】
尚、上記プランクトン採集時期には、ミネフジツボ幼生、チシマフジツボ幼生、ハナフジツボ幼生が採集されることはないので、採集したプランクトンサンプルにこれらのフジツボ幼生が含まれることは無い。
【０１１３】
東京湾にて採集した混合プランクトンサンプルと志津川湾にて採集した混合プランクトンサンプルのそれぞれについて、ＤＮＡ抽出処理を行った。ＤＮＡ抽出には、フジフィルム社のＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳを用い、基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＭＤＴ）と２０μＬのＥＤＴとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに１８０μＬのバッファー（ＬＤＴ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２４０μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＭｉｎｉ８０のカートリッジに全量処理サンプルを供した。このカートリッジに添加後に、加圧処理と７５０μＬのＷＤＴを加える操作を３回繰り返した（洗浄処理）。洗浄後、フィルターに吸着したＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー（ＣＤＴ）によりＤＮＡを溶出し、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡと志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡをそれぞれ回収して、以下の実験に供した。
【０１１４】
（１）ミネフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対について、実施例１で得られたミネフジツボ成体の鋳型ＤＮＡ、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡ、志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡを用いて、実施例１（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１１５】
電気泳動写真を図４に示す。図４において、Ａがミネフジツボ、Ｂが東京湾混合プランクトン、Ｃが志津川湾混合プランクトンの電気泳動結果である。ミネフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できたのに対し、プランクトンサンプルから調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１１６】
以上の結果から、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対は、実海域に一般的に存在するプランクトンを認識することなく、ミネフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１１７】
（２）チシマフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対について、実施例１で得られたチシマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡ、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡ、志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡを用いて、実施例１（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１１８】
電気泳動写真を図５に示す。図５において、Ａがチシマフジツボ、Ｂが東京湾混合プランクトン、Ｃが志津川湾混合プランクトンの電気泳動結果である。チシマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できたのに対し、プランクトンサンプルから調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１１９】
以上の結果から、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対は、実海域に一般的に存在するプランクトンを認識することなく、チシマフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２０】
（３）ハナフジツボ検出用プライマー対の特異性
配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対について、実施例１で得られたハナフジツボ成体の鋳型ＤＮＡ、東京湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡ、志津川湾混合プランクトンの鋳型ＤＮＡを用いて、実施例１（１）と同様の条件でＰＣＲと電気泳動を行い、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
【０１２１】
電気泳動写真を図６に示す。図６において、Ａがハナフジツボ、Ｂが東京湾混合プランクトン、Ｃが志津川湾混合プランクトンの電気泳動結果である。ハナフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供することで、シングルバンドが確認できたのに対し、プランクトンサンプルから調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【０１２２】
以上の結果から、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対は、実海域に一般的に存在するプランクトンを認識することなく、ハナフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２３】
（実施例３）
本発明のプライマー対を用いた定量分析について検討した。
【０１２４】
ミネフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号１及び２のミネフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、図７に示すように、０．４〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１２５】
次に、チシマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号３及び４のチシマフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、図８に示すように、０．２〜１０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１２６】
次に、ハナフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号５及び６のハナフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。その結果、図９に示すように、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１２７】
このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるフジツボ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、フジツボ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【０１２８】
（実施例４）
本発明のプライマー対を用いたリアルタイムＰＣＲによる定量分析について検討した。
【０１２９】
実施例１で得られたミネフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを各種濃度で含む反応液を調製し、これをリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。
【０１３０】
反応液は、純水９．５μＬ、配列番号１に記載のプライマー（１０μＭ）、配列番号２に記載のプライマー（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合し、これに実施例１で得られたミネフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを各種濃度となるように混合して調製した。
【０１３１】
装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【０１３２】
ミネフジツボのＤＮＡ濃度とＣｔ値の関係を図１０に示す。図１０に示すように、ＤＮＡ濃度とＣｔ値との間には高い相関が見られ、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。したがって、推定されたＤＮＡ量とミネフジツボ幼生の遺伝子コピー数との関係に基づいて、ミネフジツボ幼生個体数の推定が可能であることが明らかとなった。
【０１３３】
上記と同様の実験をチシマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡと配列番号３及び４に記載のプライマー対を用いて実施し、チシマフジツボのＤＮＡ濃度とＣｔ値の関係について得られた結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＤＮＡ濃度とＣｔ値との間には高い相関が見られ、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。したがって、推定されたＤＮＡ量とチシマフジツボ幼生の遺伝子コピー数との関係に基づいて、チシマフジツボ幼生個体数の推定が可能であることが明らかとなった。
【０１３４】
また、上記と同様の実験をハナフジツボ成体の鋳型ＤＮＡと配列番号５及び６に記載のプライマー対を用いて実施し、チシマフジツボのＤＮＡ濃度とＣｔ値の関係について得られた結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＤＮＡ濃度とＣｔ値との間には高い相関が見られ、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。したがって、推定されたＤＮＡ量とハナフジツボ幼生の遺伝子コピー数との関係に基づいて、ハナフジツボ幼生個体数の推定が可能であることが明らかとなった。
【符号の説明】
【０１３５】
１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むことを特徴とするフジツボ種判定用プライマーセット。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミネフジツボ（Balanus rostratus）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むチシマフジツボ（Semibalanus cariosus）検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むハナフジツボ（Balanus crenatus）検出用プライマー対
【請求項２】
被験試料に対し、請求項１に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記被験試料の遺伝子増幅の有無により前記被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定することを特徴とするフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項３】
被験試料に対し、請求項１に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、前記プライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し前記プライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより前記フジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、前記被験試料に存在する前記フジツボ幼生種の個体数の定量を行うことを特徴とするフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲとし、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項３記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項５】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項３または４に記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むフジツボ種判定用キット。
【請求項１】
下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むことを特徴とするフジツボ種判定用プライマーセット。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミネフジツボ（Balanus rostratus）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むチシマフジツボ（Semibalanus cariosus）検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むハナフジツボ（Balanus crenatus）検出用プライマー対
【請求項２】
被験試料に対し、請求項１に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記被験試料の遺伝子増幅の有無により前記被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定することを特徴とするフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項３】
被験試料に対し、請求項１に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、前記プライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し前記プライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより前記フジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、前記被験試料に存在する前記フジツボ幼生種の個体数の定量を行うことを特徴とするフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲとし、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項３記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項５】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項３または４に記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むフジツボ種判定用キット。
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−３９９４５（Ｐ２０１２−３９９４５Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８４１４８（Ｐ２０１０−１８４１４８）
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]