フマル酸の製造方法
【課題】 糖質を原料として微生物を用いて培養することにより、副生物の発生を抑えつつ、フマル酸を効率よく、安価に得ることができる製造方法を提供する。
【解決手段】 糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させ、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法において、微生物を生育させるのに必要な時間、培養する培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物を用い、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させる。
【解決手段】 糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させ、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法において、微生物を生育させるのに必要な時間、培養する培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物を用い、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させ、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フマル酸などの有機酸を発酵により生産する場合、カルシウムやナトリウムなどのアルカリ性のｐH調節物質を用いて中和しながら発酵させて、フマル酸塩の形で培養液中に蓄
積させていた。このような培養液からフマル酸を得るにはアルカリを除く操作が必要であると共に、副生物の発生を伴うため、コストの上昇をもたらすものであった。また、アルカリ性のｐH調節物質などで中和せずに発酵させることも考えられるが、発酵が進むに従
って培養液のｐHが低下するため、発酵速度の著しい低下がおこり、実用的ではなく、よ
り優れた方法の確立が望まれていた（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Ningjun CAO, Jianxin DU, C.S.Gong, G. T. Tasano: Applied and Environmental Microbiology, Vol.62, pp.2926-2931 (1996)
【非特許文献２】E, Riscaldai., M, Moresi., F, Federici., M, Petruccioli.: Journal of Chemical Technology & Biotechnology, Vol.77, No.9, pp.1013-1024 (2002)
【非特許文献３】Se-Kwon, Moon., Young-Jung, Wee., Jung-sun, Yun., Hwa-won, Ryu.: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.115, pp.843-856 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、糖質を含有する培養液に微生物等を反応させて、副生物の生成を抑えつつ、発酵効率の高いフマル酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、微生物菌体が生育している期間はアルカリ性のｐH調節物質等で培養液を中和しつつ微生物菌体の生育に適した
ｐＨに制御しながら培養し、微生物菌体が十分に生育した後はアルカリ性ｐH調節物質の
添加を行わずにフマル酸生成反応させることにより、培養液へのアルカリ性のｐH調節物
質の添加を最小限に抑えつつフマル酸を効率的に生成することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、糖質を原料として微生物菌体反応によりフマル酸を製造するに当たり、菌体の生育に必要な時間は培養液のｐＨを４〜８に制御し、その後、アルカリ性ｐH
調節物質の添加を減らす、あるいは、停止することにより、培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御してフマル酸生成反応を行わせることを特徴とするフマル酸の製造方法に存する。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させる工程と、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法であって、該微生物が、微生物を生育させるのに必要な時間、培養する培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物であって、かつ、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させることを特徴とするフマル酸の製造方法。
（２）微生物を生育させるのに必要な時間が、６時間以上であることを特徴とする、（１）に記載のフマル酸の製造方法。
（３）糖質を含有する培養液のｐＨが４〜８の範囲になるようにアルカリ性のｐＨ調節物質により制御して微生物を培養し、次いで、微生物の生育した培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御してフマル酸の生成反応を行うことを特徴とするフマル酸の製造方法（４）糖質が、グルコースである（１）〜（３）のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
（５）微生物が、リゾプス属に属する微生物であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によって、糖質、糖蜜、あるいは農業廃棄物の加水分解液を原料としてカビを用いて培養することにより、副生物の発生を抑えつつ、フマル酸を効率よく、安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、発明を詳細に説明する。
本願発明の要旨は、糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させ、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法であって、該微生物が、微生物を生育させるのに必要な時間、培養する培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物であって、かつ、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させることを特徴とするフマル酸の製造方法である。
【０００９】
（１）本発明に用いる微生物について
本発明に使用される微生物は、糖質を原料としてフマル酸を生成する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、通常はカビが好ましく、このうち、リゾプス属、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌が好ましい。
上記糸状菌のうち、好ましくはリゾプス属に属する糸状菌であり、更に好ましくはリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）に属する糸状菌が挙げられ、特に好ましい具体例と
してはリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）ATCC9363株（ATCC9363株は、American Type Culture Collectionに寄託されている。）が挙げられる。
本発明の製造方法において用いられる微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような糸状菌を宿主とするのが好ましい。
【００１０】
（２）本発明のフマル酸生成反応に用いる微生物の調製について
本発明のフマル酸生成反応に用いる微生物は、微生物を生育させるのに必要な時間、培地のｐHが４〜８の範囲になるように制御して培養することによって調製する。
本発明のフマル酸生成反応に用いる微生物の培養に当たっては、微生物を寒天培地等の固体培地で斜面培養等することにより調製したものを直接培養液に植菌して培養しても良いが、上記微生物を予め少量の液体培地で培養（種培養）したものを大量の培地に植菌して培養（本培養）することが好ましい。本培養の培地は液体培地であっても固体培地であってもよいが、ｐH調節が容易であることから液体培地（培養液）であることが好ましい。
【００１１】
培養液のｐＨは、特に調節しない場合、菌体の増殖により下がる傾向にあるため、アルカリ性のｐＨ調節物質を添加すること等によりｐHを制御する。
培地のｐH制御は、アルカリ性のｐＨ調節物質を添加すること等によりｐＨ4以上、好ま
しくはｐH5以上に調製し、また、ｐH８以下、好ましくはｐＨ7以下に調整する。アルカリ性のｐＨ調節物質としては、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム）の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属（バリウム、マグネシウム、カルシウム）の水酸化物、アルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニア、アンモニア水、炭酸アンモニア塩、尿素等を用いることができる。
【００１２】
微生物を生育させるのに必要な時間は、微生物が増殖を開始し、対数増殖期を経て菌体量が増加し、定常期を迎えるまでの期間であり、対数増殖期以降にフマル酸生成反応に移るのが好ましい。微生物を生育させるのに必要な時間は、具体的には微生物の種類に異なるが、通常のカビ、酵母、細菌の場合は、種培養の開始時点から6時間以上、好ましくは
、12時間以上であり、さらに好ましくは、本培養の開始時点から6時間以上、特に好まし
くは、12時間以上である。
【００１３】
これらの微生物を培養するために使用される培養液の主炭素源としては、本願発明に用いる微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましく用いられる。
【００１４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、あるいは農業廃棄物の加水分解液なども、培養液の主炭素源として使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用することができる。
上記炭素源の培養液への添加濃度は特に限定されないが、微生物の増殖を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。
【００１５】
また、微生物の増殖に伴う上記炭素源の減少にあわせ、培養液に炭素源の追加添加を行っても良い。
培養液に添加される窒素源としては、本願発明に用いる微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。
【００１６】
培養液に添加される無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて培養液に添加することができる。
【００１７】
また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
微生物を用いて本反応を行う場合、菌体の生育に酸素が必要となる。本反応においては、培養液と菌体を接触させた後、まず菌体が対数増殖した後に定常期を迎える。従って、対数増殖期か定常期かで必要とする酸素量も変化するので、反応のスケールや羽形状の違いによる攪拌効率の違いを考慮した上で、通気量や攪拌量を調整する必要がある。
【００１８】
本発明の方法においては、培養する温度は菌体が速やかに生育する温度が好ましく、20℃〜40℃、より好ましくは25℃〜35℃である。
【００１９】
（３）本発明におけるフマル酸生成反応について
上記（２）で調製した微生物又はその処理物を、糖質を含有する培養液中で反応させてフマル酸を生成する。
本発明のフマル酸生成反応に用いる培養液は上記（２）で説明したものと同様の培地組成からなる培養液を用いることができる。
上記（２）で調製した微生物は、液体培養液で調製した場合は、そのままフマル酸生成反応に用いることもできるし、一度、遠心分離、ろ過等により集菌した後、あらたに培養液を加えフマル酸生成反応に用いることもできる。固体培地で調製した場合は、そのまま培養液に添加して反応に用いることもできるし、菌体を掻き取る等して集菌した後、培養液に添加して反応に用いることもできる。
【００２０】
本発明の製造方法において、糖質を含有する培養液に、微生物を作用させるにあたっては、微生物をそのまま用いることもできるが、微生物処理物、例えば、微生物をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等の微生物処理物を用いても良い。
【００２１】
フマル酸生成反応中の培養液のｐＨは、特に調節しない場合、発酵の進捗により低下する傾向にあるが、菌体が充分に増殖した後、あるいは、調製された後は、アルカリ性のｐＨ調整物質の添加量を減少させる、あるいは、停止することにより低いｐＨ下でフマル酸生成反応（培養）を行なうことができる。フマル酸生成反応を行なうｐＨは低いほうが、副生物発生抑制の観点から好ましいが、反応速度が遅くならない程度はアルカリ性のｐＨ調整物質を添加することが好ましい。フマル酸生成反応中の培養液のｐＨは５以下、好ましくは４以下に制御し、また、ｐH１以上、好ましくは2以上に制御しながら行う。
【００２２】
水溶液中のフマル酸１ｍｏｌを中和するのに必要なアルカリ性中和物質の添加量は、水酸化ナトリウムの場合、ｐＨ６において約２ｍｏｌ、ｐＨ５において約１．８ｍｏｌ必要とするのに対し、ｐＨ３においては約０．２５ｍｏｌを必要とするだけである。従って、反応時のｐＨを４以下に制御した状態でフマル酸を生成することにより、添加するアルカリ性中和物質の添加量を、削減することができると共に、培養液からアルカリ性中和物質を除去する操作にかかる負担が低減し、アルカリ性中和物質添加に起因する副生物の発生を抑えることができる。
【００２３】
アルカリ性のｐＨ調節物質は、必要に応じて、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム）の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属（バリウム、マグネシウム、カルシウム）の水酸化物、アルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニア、アンモニア水、炭酸アンモニア塩、尿素等を用いることができる。
培養液の主炭素源としては、本願発明に用いる微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましく用いられる。
【００２４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、あるいは農業廃棄物の加水分解液なども、培養液の主炭素源として使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用することができる。
上記炭素源の培養液への添加濃度は特に限定されないが、微生物によるフマル酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、
好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。
【００２５】
また、反応の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、培養液に炭素源の追加添加を行っても良い。
培養液に添加される窒素源としては、本願発明に用いるカビが資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。
【００２６】
培養液に添加される無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて培養液に添加することができる。
【００２７】
また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
微生物を用いて本反応を行う場合、菌体の生育に酸素が必要となる。本反応においては、培養液と菌体を接触させた後、まず菌体が対数増殖した後に定常期を迎える。従って、対数増殖期か定常期かで必要とする酸素量も変化するので、反応のスケールや羽形状の違いによる攪拌効率の違いを考慮した上で、通気量や攪拌量を調整する必要がある。
本発明の方法においては、フマル酸生成反応する温度は、好ましくは20℃〜40℃、より好ましくは25℃〜35℃である。
【００２８】
（４）培養液からのフマル酸の回収
このようにして培養液中に蓄積したフマル酸は常法に従って、培養液より分離・精製される。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記載に制限されるものではない。
＜実施例１＞
グルコース:１０ｇ、硫酸アンモニウム：２．２ｇ、リン酸１カリウム：０．３ｇ、硫
酸マグネシウム・７水和物：０．２５ｇ、硫酸亜鉛・７水和物：６６ｍｇ、寒天：１ｇ、コーンスティープリカー：３ｍｌ、コーンスターチ：３０ｇを蒸留水に溶かし９００ｍｌとし、この培地９０ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ除菌フィルターを通した０．０５M炭酸カリウ
ム溶液を１０ｍｌ添加し、リゾプス・オリザエATCC9363株を植菌した。これを３２℃、220rpmの条件で18時間培養し、種とした（種培養）。グルコース:２００ｇ、硫酸アンモニウム：２．６ｇ、リン酸１カリウム：０．６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．４ｇ、硫酸亜鉛・７水和物：８０ｍｇを蒸留水に溶かし２Lとし、この培地２Lを３Lのエアーリフト方バイオリアクターにいれ、１２０℃、20分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、先述の種を植菌し、32℃の温度、通気１VVMの条件で培養した。初期pＨは６に設定し、培養開始後、27時間までは２N-水酸化ナトリウム溶液でｐH６以下にならないよう調整し、ｐH５以下にならないように制御した。その後はアルカリの添加を止め培養を続けた。培養開始後、84時間でフマル酸が２８ｇ蓄積していた。そのときのｐHは３であった。本実施例の培養経過を図１に示す。
＜比較例１＞
培養開始後27時間までの２N-水酸化ナトリウム溶液でのｐH調整を行わない以外は実施
例１と同じように培養した。培養開始後、84時間でフマル酸の蓄積は見られなかった。本比較例の培養経過を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実地例1において培養液の初期pHを６に調製し、27時間目までpＨ6に制御した後、ｐＨの制御は何ら行わず自律的に培養を行ったときの培養経過である。図中、上段図のひし形は培養液のｐHの変化を示す。下段図の四角形は培養液中の残存グルコース濃度を示し、ひし形は培養液中のフマル酸生成濃度を示し、三角形は培養液中の菌体量の変化を体積当たりの乾燥菌体重量により示す。
【図２】比較例1において培養開始から終了まで培養液のpＨを制御せずに培養を行ったときの培養経過である。図中、丸形は培養液のｐHの変化を示し、四角形は培養液中の残存グルコース濃度を示し、ひし形は培養液中のフマル酸生成濃度を示し、三角形は培養液中の菌体量の変化を体積当たりの乾燥菌体重量により示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させ、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フマル酸などの有機酸を発酵により生産する場合、カルシウムやナトリウムなどのアルカリ性のｐH調節物質を用いて中和しながら発酵させて、フマル酸塩の形で培養液中に蓄
積させていた。このような培養液からフマル酸を得るにはアルカリを除く操作が必要であると共に、副生物の発生を伴うため、コストの上昇をもたらすものであった。また、アルカリ性のｐH調節物質などで中和せずに発酵させることも考えられるが、発酵が進むに従
って培養液のｐHが低下するため、発酵速度の著しい低下がおこり、実用的ではなく、よ
り優れた方法の確立が望まれていた（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Ningjun CAO, Jianxin DU, C.S.Gong, G. T. Tasano: Applied and Environmental Microbiology, Vol.62, pp.2926-2931 (1996)
【非特許文献２】E, Riscaldai., M, Moresi., F, Federici., M, Petruccioli.: Journal of Chemical Technology & Biotechnology, Vol.77, No.9, pp.1013-1024 (2002)
【非特許文献３】Se-Kwon, Moon., Young-Jung, Wee., Jung-sun, Yun., Hwa-won, Ryu.: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.115, pp.843-856 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、糖質を含有する培養液に微生物等を反応させて、副生物の生成を抑えつつ、発酵効率の高いフマル酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、微生物菌体が生育している期間はアルカリ性のｐH調節物質等で培養液を中和しつつ微生物菌体の生育に適した
ｐＨに制御しながら培養し、微生物菌体が十分に生育した後はアルカリ性ｐH調節物質の
添加を行わずにフマル酸生成反応させることにより、培養液へのアルカリ性のｐH調節物
質の添加を最小限に抑えつつフマル酸を効率的に生成することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、糖質を原料として微生物菌体反応によりフマル酸を製造するに当たり、菌体の生育に必要な時間は培養液のｐＨを４〜８に制御し、その後、アルカリ性ｐH
調節物質の添加を減らす、あるいは、停止することにより、培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御してフマル酸生成反応を行わせることを特徴とするフマル酸の製造方法に存する。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させる工程と、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法であって、該微生物が、微生物を生育させるのに必要な時間、培養する培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物であって、かつ、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させることを特徴とするフマル酸の製造方法。
（２）微生物を生育させるのに必要な時間が、６時間以上であることを特徴とする、（１）に記載のフマル酸の製造方法。
（３）糖質を含有する培養液のｐＨが４〜８の範囲になるようにアルカリ性のｐＨ調節物質により制御して微生物を培養し、次いで、微生物の生育した培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御してフマル酸の生成反応を行うことを特徴とするフマル酸の製造方法（４）糖質が、グルコースである（１）〜（３）のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
（５）微生物が、リゾプス属に属する微生物であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によって、糖質、糖蜜、あるいは農業廃棄物の加水分解液を原料としてカビを用いて培養することにより、副生物の発生を抑えつつ、フマル酸を効率よく、安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、発明を詳細に説明する。
本願発明の要旨は、糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させ、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法であって、該微生物が、微生物を生育させるのに必要な時間、培養する培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物であって、かつ、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させることを特徴とするフマル酸の製造方法である。
【０００９】
（１）本発明に用いる微生物について
本発明に使用される微生物は、糖質を原料としてフマル酸を生成する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、通常はカビが好ましく、このうち、リゾプス属、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌が好ましい。
上記糸状菌のうち、好ましくはリゾプス属に属する糸状菌であり、更に好ましくはリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）に属する糸状菌が挙げられ、特に好ましい具体例と
してはリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）ATCC9363株（ATCC9363株は、American Type Culture Collectionに寄託されている。）が挙げられる。
本発明の製造方法において用いられる微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような糸状菌を宿主とするのが好ましい。
【００１０】
（２）本発明のフマル酸生成反応に用いる微生物の調製について
本発明のフマル酸生成反応に用いる微生物は、微生物を生育させるのに必要な時間、培地のｐHが４〜８の範囲になるように制御して培養することによって調製する。
本発明のフマル酸生成反応に用いる微生物の培養に当たっては、微生物を寒天培地等の固体培地で斜面培養等することにより調製したものを直接培養液に植菌して培養しても良いが、上記微生物を予め少量の液体培地で培養（種培養）したものを大量の培地に植菌して培養（本培養）することが好ましい。本培養の培地は液体培地であっても固体培地であってもよいが、ｐH調節が容易であることから液体培地（培養液）であることが好ましい。
【００１１】
培養液のｐＨは、特に調節しない場合、菌体の増殖により下がる傾向にあるため、アルカリ性のｐＨ調節物質を添加すること等によりｐHを制御する。
培地のｐH制御は、アルカリ性のｐＨ調節物質を添加すること等によりｐＨ4以上、好ま
しくはｐH5以上に調製し、また、ｐH８以下、好ましくはｐＨ7以下に調整する。アルカリ性のｐＨ調節物質としては、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム）の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属（バリウム、マグネシウム、カルシウム）の水酸化物、アルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニア、アンモニア水、炭酸アンモニア塩、尿素等を用いることができる。
【００１２】
微生物を生育させるのに必要な時間は、微生物が増殖を開始し、対数増殖期を経て菌体量が増加し、定常期を迎えるまでの期間であり、対数増殖期以降にフマル酸生成反応に移るのが好ましい。微生物を生育させるのに必要な時間は、具体的には微生物の種類に異なるが、通常のカビ、酵母、細菌の場合は、種培養の開始時点から6時間以上、好ましくは
、12時間以上であり、さらに好ましくは、本培養の開始時点から6時間以上、特に好まし
くは、12時間以上である。
【００１３】
これらの微生物を培養するために使用される培養液の主炭素源としては、本願発明に用いる微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましく用いられる。
【００１４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、あるいは農業廃棄物の加水分解液なども、培養液の主炭素源として使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用することができる。
上記炭素源の培養液への添加濃度は特に限定されないが、微生物の増殖を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。
【００１５】
また、微生物の増殖に伴う上記炭素源の減少にあわせ、培養液に炭素源の追加添加を行っても良い。
培養液に添加される窒素源としては、本願発明に用いる微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。
【００１６】
培養液に添加される無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて培養液に添加することができる。
【００１７】
また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
微生物を用いて本反応を行う場合、菌体の生育に酸素が必要となる。本反応においては、培養液と菌体を接触させた後、まず菌体が対数増殖した後に定常期を迎える。従って、対数増殖期か定常期かで必要とする酸素量も変化するので、反応のスケールや羽形状の違いによる攪拌効率の違いを考慮した上で、通気量や攪拌量を調整する必要がある。
【００１８】
本発明の方法においては、培養する温度は菌体が速やかに生育する温度が好ましく、20℃〜40℃、より好ましくは25℃〜35℃である。
【００１９】
（３）本発明におけるフマル酸生成反応について
上記（２）で調製した微生物又はその処理物を、糖質を含有する培養液中で反応させてフマル酸を生成する。
本発明のフマル酸生成反応に用いる培養液は上記（２）で説明したものと同様の培地組成からなる培養液を用いることができる。
上記（２）で調製した微生物は、液体培養液で調製した場合は、そのままフマル酸生成反応に用いることもできるし、一度、遠心分離、ろ過等により集菌した後、あらたに培養液を加えフマル酸生成反応に用いることもできる。固体培地で調製した場合は、そのまま培養液に添加して反応に用いることもできるし、菌体を掻き取る等して集菌した後、培養液に添加して反応に用いることもできる。
【００２０】
本発明の製造方法において、糖質を含有する培養液に、微生物を作用させるにあたっては、微生物をそのまま用いることもできるが、微生物処理物、例えば、微生物をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等の微生物処理物を用いても良い。
【００２１】
フマル酸生成反応中の培養液のｐＨは、特に調節しない場合、発酵の進捗により低下する傾向にあるが、菌体が充分に増殖した後、あるいは、調製された後は、アルカリ性のｐＨ調整物質の添加量を減少させる、あるいは、停止することにより低いｐＨ下でフマル酸生成反応（培養）を行なうことができる。フマル酸生成反応を行なうｐＨは低いほうが、副生物発生抑制の観点から好ましいが、反応速度が遅くならない程度はアルカリ性のｐＨ調整物質を添加することが好ましい。フマル酸生成反応中の培養液のｐＨは５以下、好ましくは４以下に制御し、また、ｐH１以上、好ましくは2以上に制御しながら行う。
【００２２】
水溶液中のフマル酸１ｍｏｌを中和するのに必要なアルカリ性中和物質の添加量は、水酸化ナトリウムの場合、ｐＨ６において約２ｍｏｌ、ｐＨ５において約１．８ｍｏｌ必要とするのに対し、ｐＨ３においては約０．２５ｍｏｌを必要とするだけである。従って、反応時のｐＨを４以下に制御した状態でフマル酸を生成することにより、添加するアルカリ性中和物質の添加量を、削減することができると共に、培養液からアルカリ性中和物質を除去する操作にかかる負担が低減し、アルカリ性中和物質添加に起因する副生物の発生を抑えることができる。
【００２３】
アルカリ性のｐＨ調節物質は、必要に応じて、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム）の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属（バリウム、マグネシウム、カルシウム）の水酸化物、アルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニア、アンモニア水、炭酸アンモニア塩、尿素等を用いることができる。
培養液の主炭素源としては、本願発明に用いる微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましく用いられる。
【００２４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、あるいは農業廃棄物の加水分解液なども、培養液の主炭素源として使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用することができる。
上記炭素源の培養液への添加濃度は特に限定されないが、微生物によるフマル酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、
好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。
【００２５】
また、反応の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、培養液に炭素源の追加添加を行っても良い。
培養液に添加される窒素源としては、本願発明に用いるカビが資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。
【００２６】
培養液に添加される無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて培養液に添加することができる。
【００２７】
また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
微生物を用いて本反応を行う場合、菌体の生育に酸素が必要となる。本反応においては、培養液と菌体を接触させた後、まず菌体が対数増殖した後に定常期を迎える。従って、対数増殖期か定常期かで必要とする酸素量も変化するので、反応のスケールや羽形状の違いによる攪拌効率の違いを考慮した上で、通気量や攪拌量を調整する必要がある。
本発明の方法においては、フマル酸生成反応する温度は、好ましくは20℃〜40℃、より好ましくは25℃〜35℃である。
【００２８】
（４）培養液からのフマル酸の回収
このようにして培養液中に蓄積したフマル酸は常法に従って、培養液より分離・精製される。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記載に制限されるものではない。
＜実施例１＞
グルコース:１０ｇ、硫酸アンモニウム：２．２ｇ、リン酸１カリウム：０．３ｇ、硫
酸マグネシウム・７水和物：０．２５ｇ、硫酸亜鉛・７水和物：６６ｍｇ、寒天：１ｇ、コーンスティープリカー：３ｍｌ、コーンスターチ：３０ｇを蒸留水に溶かし９００ｍｌとし、この培地９０ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ除菌フィルターを通した０．０５M炭酸カリウ
ム溶液を１０ｍｌ添加し、リゾプス・オリザエATCC9363株を植菌した。これを３２℃、220rpmの条件で18時間培養し、種とした（種培養）。グルコース:２００ｇ、硫酸アンモニウム：２．６ｇ、リン酸１カリウム：０．６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．４ｇ、硫酸亜鉛・７水和物：８０ｍｇを蒸留水に溶かし２Lとし、この培地２Lを３Lのエアーリフト方バイオリアクターにいれ、１２０℃、20分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、先述の種を植菌し、32℃の温度、通気１VVMの条件で培養した。初期pＨは６に設定し、培養開始後、27時間までは２N-水酸化ナトリウム溶液でｐH６以下にならないよう調整し、ｐH５以下にならないように制御した。その後はアルカリの添加を止め培養を続けた。培養開始後、84時間でフマル酸が２８ｇ蓄積していた。そのときのｐHは３であった。本実施例の培養経過を図１に示す。
＜比較例１＞
培養開始後27時間までの２N-水酸化ナトリウム溶液でのｐH調整を行わない以外は実施
例１と同じように培養した。培養開始後、84時間でフマル酸の蓄積は見られなかった。本比較例の培養経過を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実地例1において培養液の初期pHを６に調製し、27時間目までpＨ6に制御した後、ｐＨの制御は何ら行わず自律的に培養を行ったときの培養経過である。図中、上段図のひし形は培養液のｐHの変化を示す。下段図の四角形は培養液中の残存グルコース濃度を示し、ひし形は培養液中のフマル酸生成濃度を示し、三角形は培養液中の菌体量の変化を体積当たりの乾燥菌体重量により示す。
【図２】比較例1において培養開始から終了まで培養液のpＨを制御せずに培養を行ったときの培養経過である。図中、丸形は培養液のｐHの変化を示し、四角形は培養液中の残存グルコース濃度を示し、ひし形は培養液中のフマル酸生成濃度を示し、三角形は培養液中の菌体量の変化を体積当たりの乾燥菌体重量により示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させる工程と、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法であって、該微生物が、微生物を生育させるのに必要な時間、培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物であって、かつ、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させることを特徴とするフマル酸の製造方法。
【請求項２】
微生物を生育させるのに必要な時間が、６時間以上であることを特徴とする、請求項１に記載のフマル酸の製造方法。
【請求項３】
糖質を含有する培養液のｐＨが４〜８の範囲になるようにアルカリ性のｐＨ調節物質により制御して微生物を培養し、次いで、微生物の生育した培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御してフマル酸の生成反応を行うことを特徴とするフマル酸の製造方法。
【請求項４】
糖質が、グルコースである請求項１〜３のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
【請求項５】
微生物が、リゾプス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
【請求項１】
糖質を含有する培養液中で微生物又はその処理物を反応させてフマル酸を生成させる工程と、該フマル酸を回収する工程を含むフマル酸の製造方法であって、該微生物が、微生物を生育させるのに必要な時間、培地のｐＨが４〜８の範囲になるように制御して培養された微生物であって、かつ、該微生物又はその処理物を反応させる培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御して反応させることを特徴とするフマル酸の製造方法。
【請求項２】
微生物を生育させるのに必要な時間が、６時間以上であることを特徴とする、請求項１に記載のフマル酸の製造方法。
【請求項３】
糖質を含有する培養液のｐＨが４〜８の範囲になるようにアルカリ性のｐＨ調節物質により制御して微生物を培養し、次いで、微生物の生育した培養液のｐＨが２〜４の範囲になるように制御してフマル酸の生成反応を行うことを特徴とするフマル酸の製造方法。
【請求項４】
糖質が、グルコースである請求項１〜３のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
【請求項５】
微生物が、リゾプス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のフマル酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２３０２３２（Ｐ２００６−２３０２３２Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４６７１７（Ｐ２００５−４６７１７）
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年８月２５日 社団法人日本生物工学会発行の「日本生物工学会平成１６年度大会 プログラム・講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年８月２５日 社団法人日本生物工学会発行の「日本生物工学会平成１６年度大会 プログラム・講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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